Manual de Procedimientos

Diagnstico y caracterizacin de Salmonella spp.

2008

AUTORES
Mara Ins Caffer Raqurel Terragno Norma Binsztein

Departamento Bacteriologa Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. Dr. Carlos G. Malbrn Centro Regional de Referencia del WHO Global Salm Surv para Amrica del Sur

INDICE CAPTULO I- INTRODUCCIN 5

CAPTULO II- AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN DE SAMONELLA spp. 9 1.-EPECMENES 2.-PROCESAMIENTO 2.1.-AISLAMIENTO Flujograma de aislamiento e identificacin bioqumica de Salmonella spp a partir de heces 2.2.-IDENTIFICACIN Y CARACTERIZACIN BIOQUIMICA DE SALMONELLA spp. 2.2.1.- Pruebas Bioqumicas Agar Hierro Tres Azcares y Agar Kligler Prueba de la -Galactosidasa Agar Lisina Hierro Agar SIM Test de Utilizacin de Azcares Test de Decarboxilasa-Dehidrolasa Prueba del Malonato Ensayo del Rojo de Metilo Ensayo de Voges-Proskauer Prueba de la Urea Prueba del Indol 2.2.2.- Problemas de Diagnstico Diferencial 2.3.-SEROTIPIFICACIN DE SALMONELLA spp. Antgenos Somticos Antgenos Flagelares Antgeno Capsular Descripcin del Esquema de Kauffmann-White 2.3.1. SEROTIPIFICACION SOMTICA O 2.3.2. SEROTIPIFICACION FLAGELAR H Flujograma para Serotipificacin de Salmonella spp. 15 22 22 23 25 26 27 29 32 33 35 36 38 40 42 43 44 45 45 49 51 56 14 9 10 10

CAPTULO III- PRECAUCIONES DE BIOSEGURIDAD 1.- NIVEL DE LABORATORIOS 2.-ELEMENTOS DE PROTECCIN. 3.- INSTRUCCIONES PARA EL TRABAJO. 4.- ACCIONES A REALIZAR EN CASO DE INCENDIO 5.- CENTROS PARA REQUERIR AYUDA 6.- TRANSPORTE DE MUESTRAS

59 59 60 61 61 62 62

CAPTULO IV- MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES Caldo Selenito Caldo Tetrationato Caldo Flagelar Solucin Salina Agar Movilidad (Swarm Agar) Agar Nutritivo Agar Mueller-Hinton Agar EMB Agar McConkey Agar SS Agar Hektoen Agar Verde Brillante Agar XLD CAPTULO V- PLANILLAS DE RESULTADOS

64 64 64 65 65 65 65 66 66 66 67 68 69 69 71

CAPTULO I - INTRODUCCIN
El gnero Salmonella pertenece a la tribu Salmonelleae, de la familia Enterobacteriaceae. Los miembros del gnero Salmonella son bacilos gram-negativos, de 0,7-1,5 x 2,0-5m, generalmente mviles por flagelos pertricos (excepto S. Gallinarum), anaerobios facultativos, no esporulados. El gnero Salmonella fue objeto de sucesivas modificaciones, a travs de los aos, en lo que respecta a su nomenclatura y taxonoma. Sin embargo, todava siguen vigentes las ideas desarrolladas por P.R. Edwards y H.W. Ewing, en la dcada del 40, cuando definieron e identificaron las primeras cepas del gnero Salmonella y de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae. Estudios del DNA mediante tcnicas de hibridacin mostraron que el gnero Salmonella est constitudo por 2 especies: Salmonella enterica y Salmonella bongori. Salmonella enterica est compuesta por 6 subespecies: Salmonella enterica subespecie enterica, Salmonella enterica subespecie salamae, Salmonella enterica subespecie arizonae, Salmonella enterica subespcie diarizonae, Salmonella enterica subespespecie houtenae y Salmonella enterica subespecie indica. A su vez las subespecies de Salmonella enterica y la especie Salmonella bongori se dividen en ms de 2400 serovariedades, que estn definidas en funcin de diferentes asociaciones de factores antignicos somticos O y flagelares H. La mayora de las serovariedades aisladas del hombre y de los animales de sangre caliente pertenecen a la subespecie enterica (subespecie I) y llevan un nombre por lo general relacionado con el lugar geogrfico donde se la aisl por primera vez. Como las serovariedades no tienen nivel taxonmico de especie, sus nombres no siguen las reglas del International Code of Nomenclature of Bacteria, de manera que sus nombres se deben escribir en letras romanas (no itlicas) y con mayscula; por ejemplo el nombre completo de Salmonella Typhimurium es Salmonella enterica subesp. enterica serovariedad Typhimurium. Como este nombre es muy largo, a los fines prcticos se usa directamente Salmonella Typhimurium

Las serovariedades pertenecientes a las subespecies restantes y a Salmonella bongori, de baja incidencia en patologa humana o animal, se designan con el nombre de la subespecie, seguido de la frmula antignica, por ej: Salmonella subesp. IV 50: b : - (Salmonella enterica subesp. houtenae 50:b : -) Los nombres de todas las serovariedades estn contenidos en el Esquema de KauffmannWhite, publicado por el Centro Colaborador de la OMS de Referencia e Investigacin de Salmonella, del Instituto Pasteur de Pars (1). Los miembros del gnero Salmonella estn ampliamente distribuidos en la naturaleza, se los encuentra como comensales y como patgenos en el tracto gastrointestinal de mamferos domsticos y salvajes, reptiles, aves e insectos, causando un amplio espectro de enfermedades en el hombre y los animales. Los miembros del gnero se pueden clasificar en tres grupos: a) Los que no tienen preferencia por algn husped en especial, por lo que infectan tanto al hombre como a los animales. En este grupo se encuentran la mayora de las serovariedades responsables de las salmonelosis. b) Los que infectan slo al hombre: Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A y Salmonella Paratyphi C c) Los que estn adaptados a un husped animal: S. Abortusovis, a los ovinos; S. Abortusequi, a los equinos y S. Gallinarum, a las aves La salmonelosis es una zoonosis de distribucin mundial. La tasa de incidencia de la infeccin es mayor en los lactantes y en nios de corta edad. Epidemiologicamente, las infecciones por Salmonella pueden causar pequeos brotes en la poblacin en general, sin embargo el 60 80% de los casos son espordicos; a veces se producen grandes brotes en hospitales, jardines maternales, geritricos, restaurantes. Es una enfermedad fundamentalmente de origen alimentario, la fuente ms frecuente de infeccin son los alimentos contaminados, incluido agua. Tambin puede ocurrir la transmisin de persona a persona. A pesar de todos los controles que se han puesto en prctica, las infecciones por Salmonella debidas al consumo de alimentos contaminados contina siendo un problema serio con millones de casos que ocurren anualmente en todo el mundo, provocando grandes prdidas

econmicas. En el 2003, se estim que solamente en los Estados Unidos, el costo de las salmonelosis producidas por alimentos contaminados llegaba a la cifra de 3.000.000.000 dlares. La vigilancia de Salmonella spp. en todas las etapas de la cadena de procesamiento de los alimentos constituye un elemento importante en la investigacin de la epidemiologa de la salmonelosis transmitida por alimentos y en el desarrollo e implementacin de estrategias eficientes de control de la misma. En programas de monitoreo y control es esencial contar con mtodos de laboratorio eficientes para el aislamiento, identificacin y tipificacin de Salmonella spp. Se debe destacar que hay muchos procedimientos distintos para el aislamiento de Salmonella. El mtodo ideal debe tener una alta sensibilidad y especificidad, y ser al mismo tiempo simple, rpido y econmico. Ningn mtodo cumple con todos criterios y ninguno es ptimo para todas las condiciones. Por lo tanto es aconsejable consultar la literatura antes de elegir un mtodo para un determinado propsito y es recomendable la comparacin frecuente de los mtodos de cada laboratorio con los nuevos mtodos que surjan. Los criterios para la identificacin bioqumica de Salmonella spp. estn ampliamente descritos, sin embargo estas pruebas dependen de la expresin fenotpica de las caractersticas analizadas y pueden verse afectadas por variaciones en los medios de cultivo y en las condiciones de incubacin. Como una alternativa se estn introduciendo cada vez ms los mtodos moleculares; que permiten un diagnstico ms rpido y pueden ser ms simples de realizar, pero tienen la desventaja que son caros. El sistema de serotipificacin de Salmonella spp. es probablemente el mejor sistema de tipificacin fenotpica bacteriano. Tiene un alto poder discriminatorio y provee informacin con significado epidemiolgico, desde el punto de vista de la vigilancia basada en laboratorio. La disponibilidad y el costo de antisueros de alta calidad es un problema en algunos pases y regiones. La subtipificacin molecular da informacin adicional, de mayor discriminacin sin embargo no es un sustituto de la serotipificacin. Los microorganismos del gnero Salmonellae son bacilos Gram negativos (0.7 a 1.5 x 5 m), no fermentadores de lactosa. Son mviles por medio de flagelos peritricos, con la excepcin de Salmonella Pullorum y Salmonella Gallinarum. Fermentan glucosa con produccin de
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cido y gas (excepto S. Typhi). Tambin fermentan L-arabinosa, maltosa, D-manitol, Dmanosa, L-ramnosa, D-sorbitol, trehalosa, D-xilosa y D-dulcita. positivo, urea negativo y producen SH2. Los procedimientos siguientes servirn como gua para realizar los pasos necesarios para aislar adecuadamente Salmonella spp. de heces, efectuar la identificacin bioqumica de Salmonella spp. y serotipificar los aislamientos utilizando antisueros somticos y flagelares adecuados. Recoleccin y transporte de muestras Aislamiento de Salmonella spp. de heces. Identificacin bioqumica de Salmonella spp. Serotipificacin de Salmonella spp. Son oxidasa negativo, catalasa positivo, indol y Voges-Proskauer (VP) negativo, rojo de metilo y citrato de Simmons

Bioseguridad Los procedimientos de laboratorio se realizan de acuerdo con las recomendaciones establecidas en Biosefety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 4 th. CDC/NIH (Ver Captulo III - Precauciones de Bioseguridad)

CAPTULO II AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN DE SALMONELLA spp.

1.-. ESPECMENES Para el diagnstico de Salmonella spp. se pueden usar muestras de materia fecal y fluidos (sangre, orina, bilis y pus de abscesos). a) Materia fecal: La muestra debe obtenerse en el perodo agudo de la enfermedad, antes de iniciar el tratamiento con antimicrobianos. Con un hisopo estril, se recoge una pequea cantidad de una evacuacin espontnea reciente, seleccionando las partes mucosas o sanguinolentas. En caso de no poder obtener esta muestra, se hace un hisopado rectal. Las muestras que no se pueden procesar dentro de las dos horas, se deben colocar en medio de transporte. Como medio de transporte se usa Cary Blair, que tiene la ventaja de ser estable hasta 18 meses despus de su preparacin, cuando las condiciones de almacenamiento son correctas. En este medio de transporte se puede conservar la muestra hasta 5 das, siempre en refrigeracin. b) Sangre: La muestra se toma en el momento del pico de fiebre. Se siembran 10 ml de sangre en un frasco de hemocultivo de 100 ml (relacin 1:10). Se incuba a 35 - 37C, durante 7 das, haciendo un control (en medio de agar sangre) a ciegas a las 8 horas de incubacin y controles peridicos de acuerdo a la turbidez observada. El hemocultivo reviste un inters especial en el caso de fiebre tifoidea y paratifoidea; pero no es constantemente positivo. Los porcentajes de positividad, en ausencia de tratamiento antibitico, son: 90% durante la primera semana de evolucin, 75% en la segunda, 40% en la tercera y 10% en la cuarta. Los hemocultivos son negativos en los sindromes de infecciones transmitidas por alimentos por serovariedades como S. Typhimurium S. Enteritidis, sin embargo estas serovariedades causan septicemia en los inmunocomprometidos. c) Material de abscesos y orina: El pus y la orina se recogen en recipientes estriles y una alcuota se siembra directamente en los medios de cultivo.

2.- PROCESAMIENTO 2.1.- AISLAMIENTO Materiales y equipamiento Ansas descartables (10 l) Placas de Petri descartables (9 cm dimetro) estriles Balanza Estufas a 37oC Mechero bunsen Hisopos de algodn

Medios Caldo nutritivo Caldo selenito Agar hierro tres azcares (TSI) Agar lisina hierro (LIA) Estras de agar tripticas de soja (TSA) Placas de agar Salmonella Shigella (SS) Placas de agar MacConkey (MC) Comentarios

Procedimiento Da 1 Cultivo primario en placas de agar (Camino I) y enriquecimiento selectivo (Camino II) (Figura 1) Resuspender el hisopo en 1 ml de

Para estas muestras se recomiendan dos caminos simultneos: Cultivo directo en medios slidos, aislamiento e identificacin de las colonias

caldo nutritivo de manera de tener una suspensin homognea de la materia fecal. Sembrar con ansa una muestra de la suspensin de materia fecal, en placas de agar MC y SS (o XLD) (Camino I- Cultivo directo) Subcultivar el hisopo en un tubo de

Enriquecimiento en caldo selectivo,

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caldo selenito, (Camino II - Enrequicimiento para la deteccin de Salmonella spp)

se usa para favorecer el aislamiento de los microorganismos cuando se encuentran en muy bajo nmero en la muestra. La eleccin del mtodo depende del nmero de microorganismos presentes en la materia fecal, que est en relacin con el proceso diarreico o el estado de portador. Si en el camino de aislamiento directo (Camino I) se identifica y confirma Salmonella spp., no es necesario continuar la va del enriquecimiento (Camino II)

Incubar las placas del Camino I y el

tubo (con el hisopo incluido) del Camino II, a 37C, 18-24 horas Da 2 Subcultivo de las colonias sospechosas de ser Salmonella Observar la morfologa y En la placa de agar MC las colonias tpicas son lactosa negativas e incoloras, y en las de agar SS: las colonias tpicas son incoloras, translcidas con un centro negro debido a la produccin de SH2. (Ver Tabla 1: Caractersticas de las colonias en medios selectivos y diferenciales )

caractersticas fenotpicas de las colonias aisladas en las placas de agar MC y de agar SS (Camino I). Anotar los resultados en la Planilla 1 Registro de Resultados: Aislamiento de Salmonella spp. Morfologa en placas de agar selectivo (Camino I)

Subcultivar 2 colonias sospechosas

El subcultivo de colonias sospechosas

de ser Salmonella de las placas de agar MC y SS en estras de agar TSA, agar TSI y agar LIA (Camino I).

de Salmonella en estras de agar TSA al mismo tiempo que la inoculacin en TSI y LIA permite ganar un da en la

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identificacin y serotipificacin

Sembrar con ansa una muestra del caldo

Si se obtienen resultados por el Camino I, no continuar adelante por el Camino II.

selenito en placas de agar MC y SS. Incubar todos los medios a 37C, 18-24 horas. (Camino II) Da 3 Confirmacin bioqumica y

serotipificacin de Salmonella (Camino I) y subcultivo de colonias sospechosas de Salmonella provenientes del camino de enriquecimiento (Camino II) spp., Leer las reacciones bioqumicas TSI realizar las y y pruebas la bioqumicas

y LIA, si son compatibles con Salmonella complementarias Identificacin serotipificacin de

somtica (Camino I). [Ver Procedimiento caracterizacin Salmonella spp (2.2) y Serotipificacin de Salmonella spp. (2.3) ] Subcultivar 2 colonias sospechosas Si se obtienen resultados por el

de Salmonella de las placas de agar MC y SS provenientes del enriquecimiento en caldo selenito (Camino II), en estras de agar TSA, agar TSI y agar LIA.

Camino I, no continuar adelante por el Camino II

Da 4 Leer los resultados de las pruebas bioqumicas complementarias y realizar la serotipificacin flagelar de Salmonella spp.

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(Camino I) y/ o los resultados confirmacin bioqumica

de la y

preliminar

realizar la serotipificacin somtica de Salmonella spp. (Camino II).

TABLA 1. Caractersticas de las colonias en medios selectivos y diferenciales

Medio de cultivo Agar MC Agar EMB Agar SS Agar XLD Agar HK Agar BGA Selectividad Baja Baja Alta Alta Alta Alta Aspecto de las colonias Incoloras Incoloras Incoloras con centro negro Rojas con centro negro Verdes-azuladas con centro negro Rosadas plidas

Ver Flujograma de aislamiento e identificacin bioqumica (Figura 1)

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FIGURA 1.- FLUJOGRAMA DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN BIOQUMICA DE SALMONELLA spp. A PARTIR HECES Camino II
1er. da MATERIA FECAL (HISOPO)

Camino I
Suspensin en solucin fisiolgica

Caldo de enriquecimiento (1) 18-24 hs, 37C Aislamiento en medios selectivos y diferenciales (2)

Aislamiento en medios selectivos y diferenciales (2)

Colonias tpicas (3)

2do. da
TSI LIA Estra

18-24 hs, 37C

3er. da
Colonias tpicas (3) Lectura (4) Serotip. O (6)

P. bioq. (5) TSI LIA Estra 18-24 hs, 37C

Caldo Flagelar

Lectura (4)

Serotip. O (6)

Lectura

Serotip. H

4to. da
P. bioq. (5)

(1) Caldo selenito (2) Agar MacConkey y agar SS, o agar Hektoen, o agar xilosa lisina desoxicolato, o agar verde brillante. (3) Se seleccionan de 2 a 3 colonias. (4) Si TSI y LIA dan resultados compatibles con Salmonella, se siembran Pruebas bioqumicas complementarias (P.bioq.) y se realiza la serotipificacin O (Serotip. O) (5) Pruebas bioqumicas complementarias: RM-VP, decarboxilasas, dulcita, malonato. (6) Serotip: Serotipificacin. Si la serotipificacin somtica O de las colonias obtenidas por ambos procedimientos de aislamiento diera igual, la serotipificacin flagelar H debe hacerse en una sola de ellas.

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2.2.- IDENTIFICACIN Y CARACTERIZACIN BIOQUIMICA DE SALMONELLA spp.

Las probables colonias de Salmonella spp. en los medios de aislamiento utilizados se confirman mediante pruebas bioqumicas recomendadas por Le Minor y Richard: desarrollo en agar hierro-tres- azcares (TSI), utilizacin de urea de Christensen, determinacin de lisina y ornitina decarboxilasa y de arginina dehidrolasa, prueba de la beta-galactosidasa (ONPG), prueba del rojo de metilo, reaccin de Voges-Proskauer, prueba de fermentacin de la dulcita y utilizacin del malonato. La mayora de las serovariedades (99,8%) de Salmonella aisladas del hombre y de los animales de sangre caliente pertenecen a Salmonella enterica subesp. enterica (I) y tienen propiedades bioqumicas caractersticas (Tabla 2), siendo excepciones las serovariedades S. Typhi y S. Paratyphi A.
TABLA 2. Pruebas bioqumicas de Salmonella enterica subesp. enterica (I)

Pruebas bioqumicas Lactosa *** ONPG Produccin de SH2 Glucosa (fermentacin) *** Dulcita (fermentacin) *** Adonita (fermentacin) *** Lisina decarboxilasa ** Ornitina decarboxilasa** Arginina dihidrolasa ** Urea (hidrlisis)** Indol Rojo de Metilo * Voges Proskauer * Citrato de Simmons ** Malonato (utilizacin)*

Salmonella enterica subep. enterica (I) + +/con gas + + + + + + -

*Lectura a los 2 das; ** Lectura hasta los 4 das; *** Lectura hasta los 7 das; **** Lectura hasta los 30 das

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Las caractersticas bioqumicas que permiten diferenciar las distintas subespecies dentro de la especie S. enterica y la diferenciacin con la especie S. bongori se indican en la Tabla 3.
TABLA 3. Propiedades bioqumicas diferenciales de las subespecies de Salmonella spp.

S. enterica Pruebas subesp. bioqumicas Enterica (I) Dulcita + ONPG Malonato Gelatina Sorbita + KCN L(+) tartrato + Mucato + Salicina Lactosa Habitat de Animales las cepas de sangre caliente

S. enterica subesp. salamae (II) + + + + + -

S. enterica subesp. arizonae (IIIa) + + + + + - (75%)

S. S. S. enterica enterica enterica S. subesp. bongori subesp. subesp. diarizonae houtenae indica (V) (IIIb) (VI) (IV) d + + d + + + + + + + + + + - (70%) + + + + (75%) d -

Animales de sangre fra y medio ambiente

+ 90% ms de los resultados positivos; - 90% ms de los resultados negativos; d: diferentes reacciones

Es importante tener en cuenta la posibilidad de aislar ms de una serovariedad de Salmonella de un alimento de un material patolgico. Si bien esto no ocurre con frecuencia, hay que tenerlo presente cuando se trabaja con muestras de materia fecal o de ganglios mesentricos y sobre todo en el caso de ciertos alimentos para consumo humano o animal, como huevos a granel, embutidos, harinas de carnes o huesos. Es por ello que se recomienda estudiar varias colonias simultneamente. Materiales y equipamiento Ansas descartables (1 l) Ansa aguja Mechero Bunsen Estufa a 37oC

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Medios Medio para la prueba de urea Medio para la prueba de fenilalanina Medio Citrato de Simmons Medio para la prueba de la lisina decarboxilasa (LDC) Medio para la prueba de la ornitina decarboxilasa (ODC) Medio para la prueba de la arginina dihidrolasa (ADH) Medio control para las pruebas con aminocidos. Vaselina estril Medio base para azcares Solucin madre de dulcita al 5% Solucin madre de salicina al 10% Solucin madre de sorbita al 10% Solucin madre de lactosa al 10% Solucin madre de adonita al 10% Solucin madre de glicerol al 10% Slucin madre de manita al 10% Solucin madre de glucosa al 10% Solucin madre de dulcita al 10% Solucin madre de ramnosa al 10% Solucin madre de silosa al 10% Caldo Malonato Discos de o-nitrofenil--D-galactopiransido (ONPG) o reactivo para la prueba de la

-galactosidasa Agar SIM Reactivo de Erlich para la prueba de indol Medio RM/VP para la prueba de Voges-Proskauer Solucin de KOH 40% para la prueba de Voges-Proskauer Solucin alcohlica de alfa-naftol para la prueba de Voges Proskauer

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Cepas bacterianas Cepas de referencia para el control de calidad de los medios. Comentarios

Procedimiento Da 3 Siembra de las pruebas bioqumicas complementarias Inocular a partir de un cultivo en estras de agar TSA, los medios para las siguientes pruebas: Medio para la prueba urea. Medio para la prueba de LDC, ADH y ODC y el medio control. Cubrir con una capa de vaselina estril. Medio para ONPG. Medio RM/VP. Agar SIM. Dulcita Caldo Malonato Incubar todas las pruebas bioqumicas a 37C por 18-24 horas.

Test de la -galactosidasa: Resuspender un ansa del cultivo proveniente del TSI en un tubo que contiene 0.5 ml de medio de ONPG e incubar a 37C. Se debe ver una reaccin positiva dentro de los 20 minutos pero usualmente la prueba se lee a las 3-4 horas o ms. Tambin se pueden usar discos de ONPG siguiendo las indicaciones del fabricante

La

-galactosidasa

es

una

enzima

inducible, y como la lactosa, presente en el TSI, es uno de los inductores del opern lactosa, la prueba se realiza a partir del desarrollo en este medio.

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Da 4 Lectura de las pruebas bioqumicas complementarias Prueba de urea. Prueba de LDC, ADH y ODC. Prueba de ONPG. Prueba de RM/VP. Prueba de SIM. Fermentacin de Dulcita Utilizacin de Malonato Si se presentan resultados no concordantes con los esperados para la identificacin bioqumica de Salmonella spp. se deben realizar pruebas diferenciales. Ver Problemas de Diagnstico Diferencial, donde se presentan pruebas bioqumicas comparativas con otros gneros de la familia Enterobacteriaceae

Agregar los reactivos correspondientes a las siguientes pruebas: RM: agregar a 0,5 ml del caldo RM/VP 1 gota de rojo de metilo VP: agregar a 1 ml del caldo RM/VP, 0,6 ml de la solucin alcohlica de naftol y 0,2 ml de la solucin de KOH. Indol: agregar 1 ml del reactivo de . Erlich al medio SIM. Leer los resultados de acuerdo a las Tablas 4, 5 y ver Pruebas Bioqumicas Propiedades Resultados. Anotar los resultados en las planillas de registro. e Interpretacin de los Agitar muy bien luego de la adicin de cada reactivo

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TABLA 4. Pruebas bioqumicas: interpretacin de los resultados

Medio
TSI

Reacciones/enzimas
Produccin de cido (si el fondo es amarillo y la estra es roja, (la produccin de cido es slo a partir de glucosa). Produccin de cido a partir de lactosa y/o sacarosa. Produccin de gas Produccin de H2S La decarboxilacin de la lisina produce una reaccin alcalina (color violeta) a travs del medio. Los organismos que no decarboxilan la lisina producen una estra alcalina y un fondo cido (color amarillo). Produccin de H2S Ureasa Lisina decarboxilasa Ornitina decarboxilasa Arginina dihidrolasa

Resultados Negativo
Fondo rojo

Positivo
Fondo amarillo

TSI TSI TSI LIA

Estra roja No hay burbujas en el fondo No hay color negro Botn purpura/Superficie amarilla

Estra amarilla Burbujas de aire en el fondo Color negro Botn prpura/Superficie prpura

LIA Urea LDC ODC test ADH test ONPG Voges Proskauer Indol SIM agar SIM agar SIM agar

No hay color negro Amarillo Color amarillo/marrn Color amarillo/marrn Color amarillo/marrn Permanece incoloro Permanece incoloro anillo amarillo No color negro Anillo amarillo Desarrollo solo a lo largo de la lnea de puncin

-Galactosidasa Produccin de acetona Produccin de Indol Produccin de H2S Produccin de indol Movilidad

Color negro Rosa/Cereza Color prpura y color amarillo/marrn en el medio control. Color prpura y color amarillo/marrn en el medio control Color prpura y amarillo/marrn en el medio control Amarillo Color rojo/rosado anillo rojo/rosado Color negro anillo rojo/rosado Muestra un crecimiento difuso que se disemina a partir del punto de inoculacin

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TABLA 5. Resultados de las pruebas bioqumicas para Salmonella spp. Prueba1) TSI glucosa (cido) TSI glucosa (gas) TSI lactosa TSI sacarosa TSI sulfuro de hidrgeno LIA agar SIM agar (H2S) SIM agar (indol) SIM agar (movilidad) Utilizacin de urea Lisina decarboxilasa Ornitina decarboxilasa Arginina dihidrolasa Reaccin de -galactosidasa Reaccin de Voges-Proskauer Reaccin de indol Utilizacin del Malonato Fermentacin de Dulcita
1)

Reaccin positiva o negativa + + + + + + + + + +

% de aislamientos de Salmonella que muestran la reaccin2) 100 91.93) 99.24) 99.5 91.6 98 97 98.9 97 99 94.65) 97 70 98.44) 100 98.9 100 96

Ewing W. H. and Ball M. M., The biochemical reactions of members of the genus Salmonella. National Communicable Disease Center, Atlanta, Georgia, USA (1966). 2) Estos porcentajes indican solo que no todas las cepas de Salmonella muestran las reacciones marcadas + o -. 3) Salmonella Typhi es anaerognica. 4) Salmonella (subgnero) subespecie III (Arizona) da reacciones + o para lactosa pero es siempre galactosidasa positiva. Salmonella (subgnero) subespecie II da una reaccin negativa para lactosa y una reaccin negativa para -galactosidasa, (Antigenic Formulas of the Salmonella serovars, 2001). Para el estudio de las cepas, puede ser til realizar pruebas bioqumicas complementarias. 5) S. Paratyphi A es negativa.

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2.2.1.- PRUEBAS BIOQUMICAS

Agar Hierro Tres Azcares (TSI) y Agar Kligler I. Principio El medio fue diseado para determinar la habilidad de las bacterias de fermentar hidratos de carbono y producir sulfuro de hidrgeno (SH2). El medio contiene 1 parte (0.1%) de glucosa y 10 partes (1.0%) de lactosa y sacarosa. El indicador de pH es el rojo fenol y el sulfato ferroso pone en evidencia la formacin de SH2. Si el microorganismo fermenta glucosa, tanto la puncin como la estra aparecern de color amarillo. Si el organismo fermenta lactosa y/o sacarosa, la estra permanecer cida (amarilla). Si no fermenta lactosa, la estra se vuelve alcalina (roja). Los organismos que no fermentan glucosa no producen cambios en el pH del medio o producirn productos alcalinos y el medio TSI permanecer rojo. La produccin de SH2 se manifiesta por un ennegrecimiento del medio. El agar de Kligler contiene dos azcares: lactosa (1%) y glucosa (0.1%). Este medio puede reemplazar al TSI, la diferencia entre ambos es la ausencia de sacarosa. Los fundamentos bioqumicos y la interpretacin de los resultados son los mismos para ambos medios. II. Materiales El medio est disponible comercialmente. Disolver en agua destilada y dispensar volumenes de 5.0 ml en tubos con tapa a rosca; autoclavar a 121C por 15 minutos y enfriar inclinado dejando un fondo de 5 a 10 mm. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular indicando fecha de preparacin y de expiracin. Guardar en heladera; si hay cambio de color no usar. II. Resultados A. Estra cida/fondo cido (amarillo/amarillo): fermentacin de glucosa, sacarosa y/o lactosa (E. coli). B. Estra alcalina/fondo cido (rojo/amarillo): fermentacin de glucosa solamente (Shigella spp.). C. Estra alcalina/fondo alcalino (rojo/rojo): no fermentador (Pseudomonas aeruginosa). D. Precipitado negro en el fondo: produccin de SH2 (Salmonella spp).
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E. Burbujas o roturas: produccin de gas (E. coli, Salmonella spp.). III. Control de Calidad Bacteria Salmonella Typhi Ac Puncin Estria Alc Alc Alc Alc Ac Ac Ac Ac Ac Ac Alc Alc Sh2 + (*) + + +(sucio) + (sucio) -

Salmonella Paratyphi A Ac/g Salmonella spp. Shigella spp. Ac Ac

Enterobacter aerogenes Ac/g Enterobacter cloacae Escherichia coli Citrobacter Klebsiella Proteus vulgaris Proteus mirabilis Klebsiella pneumoniae Ac/g Ac/g Ac/g Ac/g Ac/g o Ac Ac/g o Ac Ac/g o Ac

(*) slo en la parte superior de la puncin o formacin de un anillo. Para el control de calidad selecionar entre aquellos microorganismos disponibles.

Prueba de la -galactosidasa I. Principio La fermentacin de la lactosa requiere dos enzimas; mientras la permeasa facilita la

penetracin de la molcula de lactosa dentro de la clula bacteriana, la -galactosidasa hidroliza la lactosa para formar galactosa y glucosa. Las bacterias no fermentadoras de lactosa carecen de ambas enzimas, sin embargo hay bacterias que tienen -galactosidasa pero no permeasa. El o-nitrofenil--D-galactsido (ONPG) es un compuesto incoloro estructuralmente similar a la lactosa. En presencia de -galactosidasa, ONPG se rompe en galactosa y onitrofenil, un compuesto color amarillo. Como la familia Enterobacteriaceae se agrupan de acuerdo a su habilidad de fermentar lactosa, este test es til en la identificacin de fermentadores de lactosa.

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II. Materiales A. Solucin de ONPG Disolver 80.0 mg de ONPG en 15.0 ml de agua destilada a 37 C, agregar 5.0 ml del buffer fosfato, ajustar a pH 7.0 y esterilizar por filtracin. La solucin es estable por 6 meses. Guardar refrigerada (4 a 8 C), en recipientes de color caramelo o envueltos en papel de aluminio. Rotular la solucin, indicando fecha de preparacin y de expiracin. B. Buffer fosfato de sodio 1M (pH 7.0) Disolver 6,9 gr de NaHPO4.H2O en 45.0 ml de agua destilada. Agregar 3.0 ml de una solucin de NaOH al 30% (w/v) y ajustar el pH a 7.0. Llevar el volumen a 50.0 ml con agua destilada y guardar a 4 C.III. Procedimiento A. A partir de un cultivo en TSI, hacer una suspensin espesa del organismo a ensayar en 0.5 ml de solucin salina. El volumen no tiene mayor importancia porque es una prueba basada en la observacin de un cambio de color. B. Agregar un disco o dos gotas de solucin de ONPG. C. Incubar la mezcla a 37C y examinar cambio de color hasta 24 horas. IV. Resultados Ensayo positivo: desarrollo de color amarillo. Ensayo negativo: no hay desarrollo de color. V. Control de calidad Escherichia coli (+) Salmonella (-) VI. Consideraciones A. Se puede partir de estras de agar nutritivo con 1% de lactosa, cuando no se dispone de TSI. B. La solucin de ONPG preparada debe ser incolora antes de su empleo.

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Agar Lisina Hierro (LIA) I. Principio La decarboxilacin de la lisina a cadaverina produce una alcalinizacin del medio y un viraje al violeta del indicador prpura de bromocresol. Como la reaccin tiene lugar en medio cido, es necesaria la fermentacin previa de la glucosa. Los microorganismos que no decarboxilan lisina, pero fermentan la glucosa producen un viraje al amarillo en todo el medio. La formacin de SH2 produce una coloracin negra debido al sulfuro de hierro producido. Las bacterias del grupo Proteus-Providencia, con excepcin de Morganella morganii, desaminan la lisina a cido -cetocarbnico que forma compuestos pardo-rojizos en el medio de cultivo con la sal de hierro y en aerobiosis. II. Materiales El medio est disponible comercialmente. Disolver el polvo en agua destilada y dispensar en volmenes de 3 ml en tubos con tapa a rosca. Esterilizar a 121C por 15 minutos. Enfriar de manera de tener estra y fondo. Guardar en heladera. II. Resultados Los microorganismos que descarboxilan la lisina producen un viraje al violeta. Los microorganismos que no descarboxilan la lisina y fermentan glucosa producen un viraje al amarillo. La formacin de SH2 se indica por la aparicin de una coloracin negra.

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III. Control de Calidad Bacteria Salmonella sp. Proteus mirabilis Proteus vulgaris Morganella morganii Prov. rettgeri Providencia spp. Citrobacter spp. Escherichia coli Shigella spp. Klebsiella Puncin Violeta Amarilla Amarilla Amarilla Amarilla Amarilla Amarilla Amarilla Amarilla Violeta Estria Violeta Pardo-rojiza Pardo-rojiza Pardo-rojiza Pardo-rojiza Pardo-rojiza Violeta Violeta Violeta Violeta + + + + Sh2

Para el control de calidad seleccionar entre aquellos microorganismos disponibles. Agar SIM I. Principio Es un medio que se usa para determinar la formacin de sulfuro de hidrgeno, la produccin de indol y la movilidad en el diagnstico de Enterobacterias. II. Materiales El medio est disponible comercialmente. Disolver en agua destilada, calentar suavemente hasta su disolucin y dispensar en volumenes de 5 ml en tubos con tapa a rosca. Autoclavar a 121C, 15 minutos; enfriar en posicin vertical y guardar en heladera. III. Procedimiento A.Con un ansa tomar material de una colonia y sembrar por puncin. B.Incubar a 37C por 18 a 24 horas. IV. Resultados A. Para la produccin de SH2 Ensayo positivo: ennegrecimiento del medio.
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Ensayo negativo: no hay ennegrecimiento. B. Para la movilidad Ensayo positivo: hay una turbidez difusa del medio. Ensayo negativo: slo hay crecimiento a lo largo de la puncin. C. Para la produccin de indol Ensayo positivo: aparicin de color rojo cuando se agrega el reactivo de Erlich. Ensayo negativo: no hay aparicin de color. V. Control de Calidad Escherichia coli: SH2 -, indol +, movilidad + Klebsiella pneumoniae: SH2 -, indol -, movilidad Proteus vulgaris: SH2 +, indol +, movilidad + VI. Consideraciones Un organismo que produce sulfuro de hidrgeno puede mostrar ennegrecimiento en SIM pero no en TSI por la presencia de sacarosa en este ltimo medio. La utilizacin de la sacarosa puede suprimir los mecanismos enzimticos responsables de la produccin del sulfuro de hidrgeno. Test de Utilizacin de Azcares I. Principio Es un ensayo para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar un hidrato de carbono con produccin de cido o cido y gas. El patrn de utilizacin de azcares ayuda en la diferenciacin e identificacin de muchas bacterias. En este ensayo, determinados azcares se agregan a un medio basal estril. La produccin de cido se manifiesta por un cambio de color del indicador. La eleccin del medio y del indicador depende del camino metablico del organismo y de la claridad visual del cambio de pH. II. Materiales A. Medio base Peptona Extracto de carne 10.0 g 1.0 g
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Cloruro de sodio Azul de bromotimol Indicador de Andrade Agua destilada

5.0 g 10.0 ml 5.0 ml 1000 ml

Rehidratar los ingredientes con agua destilada, calentando suavemente si es necesario; ajustar el pH a 7.1-7.2 (7.4). Autoclavar a 121C por 15 minutos y enfriar en bao de agua a 50C. Fraccionar el medio base en alcuotas y agregar los azcares esterilizados por filtracin en concentraciones de: 0.5% para dulcita y salicina y 1.0% para los otros azcares. Dispensar en volumenes de 4-5 ml en tubos con tapa a rosca, estriles. El medio se guarda en heladera y es estable por 3 meses. Para la glucosa y glicerol, el medio base se dispensa en tubos con campanita de Durham antes de autoclavar. La campanita se llenar con el medio y luego se agrega el azcar en forma estril despus de enfriar a 50 C. B. Indicador de Andrade Disolver 0.5 gr de fucsina cida en 100 ml de agua destilada, agregar 15.0 ml de NaOH 1N (4%); mezclar bien y dejar descansar a temperatura ambiente durante 24 horas, agitando frecuentemente. El color rojo se debe transformar en un color castao. Si no se produce una decoloracin suficiente agregar 1.0 ml de NaOH 1N (4%). III. Procedimiento 1) Con un ansa estril tomar material de un cultivo en medio slido. 2) Sumergir el ansa en cada tubo de hidrato de carbono. Para una batera de 8 a 10 azcares, es suficiente un nico inculo, no hay necesidad de flamear el ansa entre tubo y tubo. La posibilidad de transportar el hidrato de carbono de tubo a tubo es infinitesimal y no afectar los resultados. Para una batera grande (15 a 20) de azcares, puede ser necesario emplear 2 a 3 inculos, flameando el ansa antes de tomar nueva muestra. 3) Incubar a 37 C y examinar da por da por 4 a 5 das. Para algunos microorganismos puede ser necesario una incubacin ms prolongada (7 das), registrando los resultados da por da. 4) En laboratorios de referencia las lecturas se deben prolongar hasta 30 das.

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IV. Resultados Ensayo positivo: viraje del indicador al rojo-rosado por acidificacin del medio. Ensayo negativo: no hay cambio de color. V. Control de calidad Con distintos microorganismos que fermenten los azcares, como por ejemplo: Escherichia coli: glucosa + Klebsiella: lactosa + Yersinia enterocolitica: sacarosa + VI. Consideraciones A. Inocular un medio basal sin azcar para cada microorganismo. B. La campanita de Durham se usa en el tubo con glucosa. C. Como cualquier indicio de gas, an una burbuja pequea, es evidencia de produccin de gas, observar cuidadosamente la campanita antes de inocular. D. La campanita de Durham se agrega nicamente al medio con glucosa porque si el microorganismo produce gas con glucosa producir gas con los otros azcares. No obstante, si se sabe que el microorganismo en estudio no fermenta glucosa, es aconsejable agregar campanita a otros azcares, pero hay que tener en cuenta que todas las Enterobacterias son fermentadoras de glucosa por definicin, entonces slo se pone campanita al medio con glucosa.

Test de Decarboxilasa-Dehidrolasa I. Principio La descarboxilacin es un proceso en el cual las decarboxilasas atacan el extremo carboxilo de los aminocidos, formando la correspondiente amina. Los tres aminocidos que se ensayan en la identificacin de Enterobacterias son arginina, lisina y ornitina. La decarboxilacin de lisina y ornitina da cadaverina y putrescina (diaminas), mientras que arginina da citrulina por accin de una dihidrolasa. El test se debe acompaar con un tubo control que contiene el medio base sin aminocido. Como la decarboxilacin es una reaccin anaerbica, se debe cubrir el medio con una capa de aceite mineral estril. El proceso ocurre en dos etapas: por fermentacin de la glucosa se produce una acidificacin del medio (pH < 6.0), apareciendo color amarillo. La
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acidificacin es necesaria para que ocurra la decarboxilacin. Este ltimo proceso de lugar a la formacin de las aminas que elevan el pH con el consiguiente viraje del indicador al color violeta. La prueba de la lisina ayuda en la diferenciacin de Edwardsiella (+), y Salmonella (+) de Citrobacter (-); de Enterobacter aerogenes (+) de Enterobacter cloacae (-) y Enterobacter agglomerans (-) La prueba de ornitina ayuda a diferenciar Klebsiella (-), Proteus mirabilis (+) de Proteus vulgaris (-); Morganella morganii (+) de Providencia rettgeri (-); Yersinia enterocolitica (+) de Yersinia pestis y Yersinia pseutuberculosis (-). II. Materiales El medio basal ms utilizado es el medio de decarboxilasa de Moeller. El medio contiene peptona 5.0 g, extracto de carne 5.0 g, glucosa 0.5 g, bromocresol prpura 0.01 g, rojo cresol 0.005 g piridoxal 0.005 g pero est disponible comercialmente. Las concentraciones de aminocidos a usar son: 1% para la forma L y 2% para la forma DL. Fraccionar el medio base en 4 porciones de 250 ml cada una. Agregar los aminocidos a 3 porciones del medio. El pH de la fraccin que lleva ornitina se debe reajustar despus de agregar el aminocido y antes de esterilizar. Fraccionar en volumenes de 3 a 4 ml en tubos con tapa a rosca y autoclavar a 121C por 10 minutos. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular los tubos, indicando fecha de preparacin y de expiracin y guardar en heladera. Al aceite mineral se le agrega 1 ml de agua por cada 100 ml de vaselina, y se autoclava a 121C por 45 minutos. III. Procedimiento A. Tomar material con un ansa e inocular el tubo control y los tubos con los aminocidos. B. Cubrir todos los tubos con una capa de vaselina estril. C. Incubar a 37C D. Efectuar las lecturas da por da hasta 4 das, registrando los resultados da por da. IV. Resultados Ensayo positivo: medio turbio y prpura a prpura amarillento.

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Ensayo negativo: color amarillo Tubo control: permanece con su color original o se vuelve amarillo si el organismo es un fermentador de glucosa (se debe ver turbidez en el tubo). V. Control de calidad Bacteria Proteus vulgaris Morganella morganii Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes S. Typhimurium Klebsiella VI. Consideraciones A. Inocular siempre un tubo control. B. Debe haber desarrollo para que el resultado sea vlido. C. Si se observan capas de color amarillo y violeta, agitar suavemente el tubo antes de interpretar la reaccin. D. Comparar todos los tubos positivos con el tubo control. Un color grisceo puede indicar reduccin del indicador ms que formacin de productos alcalinos. Se debe agregar ms indicador antes de interpretar el resultado. E. Si la reaccin es difcil de interpretar, comparar el tubo con un tubo sin inocular. Luego de 24 horas cualquier traza de color prpura indica un resultado postivo. F. Si se usa el medio de Moeller, se debe incubar por lo menos 18 horas ante de interpretar los resultados. G. Si no se agrega el aceite mineral, las reacciones se deben leer slo a las 24 horas. H. Un pequeo precipitado floculento en la ornitina no interfiere con su uso. + + + + + Arginina + Lisina + + + Ornitina

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Prueba del Malonato I. Principio El ensayo pone en evidencia la capacidad de las bacterias de utilizar malonato como fuente de carbono. Las cantidades mnimas de glucosa del medio, permiten el desarrollo de organismos que no pueden usar malonato o sales de amonio, sin embargo esos organismos no pueden mantener un pH alcalino. La produccin de cido por la fermentacin de la glucosa impide una posible alcalinizacin. Solamente los microorganismos que pueden usar simultneamente malonato de sodio como fuente de carbono y sulfato de amonio como fuente de nitrgeno son capaces de ejercer una accin buffer produciendo hidrxido de sodio. El aumento de la alcalinidad resultante hace que el azul de bromotimol cambie de verde a azul. Los microorganismos malonato negativos que fermentan glucosa hacen que el indicador cambie de verde a amarillo. La mayora de las especies de Enterobacter y Klebsiella utilizan malonato de sodio. El ensayo tambin sirve para separar Salmonella arizonae (+) de otras especies de Salmonella (-). II. Materiales El medio contiene: extracto de lavadura 1.0g, sulfato de amonio 2.0g, fosfato dipotsico 0.6g, fosfato monopotsico 0.4g, ClNa 2.0g, malonato de sodio3.0g, glucosa 0.25g, azul de brotimol (1g/500ml) 12.5g . Disolver en 1000 ml de agua destilada, dispensar 3 ml en tubos con tapa a rosca y autoclavar a 121C por 15 minutos. Enfriar antes de usar; el sustrato es estable por 2 a 3 meses. Rotular los tubos, indicando fecha de preparacin y de expiracin y guardar en heladera. Si hay cambio de color en el medio no usar. III. Procedimiento A. Con ansa estril tomar material e inocular el medio. B. Incubar a 37C por 24 a 48 horas. C. Continuar incubando los tubos negativos hasta 4 das, registrando los resultados da por da.

IV. Resultados Ensayo positivo: reaccin alcalina (azul).

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Ensayo negativo: no hay cambio de color (verde). Ensayo negativo: reaccin cida, slo fermentacin de glucosa (amarillo). V. Control de Calidad Enterobacter aerogenes + Escherichia coli VI. Consideraciones A. Algunos organismos malonato (+) producen una ligera alcalinidad, que hace la interpretacin difcil. Cuando hay duda comparar con un tubo sin inocular. Cualquier vestigio de color azul denota una prueba positiva luego de una incubacin de 48 horas. No se debe hacer una interpretacin final negativa hasta no haber incubado los tubos durante 48 horas. B. A veces es necesario agregar extracto de levadura y glucosa para estimular el crecimiento de algunos organismos. C. Algunas cepas malonato (-) dan color amarillo por la fermentacin de la glucosa solamente. Esto produce una disminucin del pH y el viraje del indicador al amarillo. Ensayo del Rojo de Metilo I. Principio El test se usa para determinar la presencia de iones hidrgeno cuando un microorganismo fermenta glucosa. Todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae convierten glucosa en cido pirvico por el camino de Embden-Meyerhof. Los organismos que metabolizan cido pirvico producen cido y bajan el pH a menos de 4.4. Los organismos que utilizan, en cambio, el camino del butilenglicol producen acetona y butanodiol (diacetilo). El indicador del medio, rojo de metilo, es rojo a pH < 5.0 y amarillo a pH > 5.8. El test es til para la diferenciacin de Escherichia coli (rojo metilo positivo) de Klebsiella (rojo metilo negativo). La mayora de las Enterobacteriaceae tienen uno u otro camino metablico, pero raramente ambos. II. Materiales A. Preparacin del medio

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El medio est disponible comercialmente. Disolver en agua destilada, dispensar 5 ml en tubos con tapa a rosca y autoclavar a 121C por 15 minutos. El sustrato es estable por 2 a 3 meses. Rotular los tubos, indicando fecha de preparacin y de expiracin. Guardar en heladera. B. Preparacin del reactivo Disolver 0.1 gr de rojo de metilo en 300 ml de etanol y diluir con 200 ml de agua destilada, para alcanzar un volumen total de 500 ml. El reactivo es estable por 1 ao. Rotular indicando fecha de preparacin y de expiracin. Guardar en heladera. III. Procedimiento A. Con un ansa estril tomar material e inocular un tubo con caldo RM/VP. B. Incubar a 35 C por un mnimo de 48 horas. C. Transferir 2.5 ml de la suspensin a un tubo. D. Agregar 5 gotas del indicador y observar si hay cambio de color. IV. Resultados Ensayo positivo: el reactivo permanece rojo. Ensayo negativo: el reactivo se torna amarillo-naranja. Si el resultado es negativo continuar la incubacin de la bacteria por 24 horas ms. V. Control de Calidad Escherichia coli + Enterobacter aerogenes VI. Consideraciones A. Variaciones en la cantidad de peptona del medio puede afectar el resultado. B. Aumentando la concentracin de glucosa en el medio no se acelera la reaccin del rojo de metilo. C. No sobreinocular, el crecimiento bacteriano se inhibe cuando el inculo es grande. D. Una incubacin de 48 horas es suficiente para la mayora de los cultivos; pero el ensayo no se debe realizar con cultivos que tengan menos de 48 horas de incubacin.

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Ensayo de Voges-Proskauer I. Principio El piruvato es un intermediario en el metabolismo de la glucosa. A partir del cido pirvico un microorganismo puede seguir varios caminos. Algunos lo rompen para formar como productos finales cidos lctico, actico o frmico. Otros metabolizan el piruvato por el camino del butilenglicol para formar como productos finales acetona (acetilmetilcarbinol) y 2,3-butanodiol (diacetilo). El ensayo de Voges-Proskauer (VP) detecta estos productos metablicos. En presencia de oxgeno e KOH, la acetona se oxida a diacetilo, que da un complejo rojo. La sensibilidad del ensayo se aumenta por el agregado de -naftol antes del agregado de KOH. II. Materiales A.Preparacin del medio El medio est disponible comercialmente. Para la preparacin del caldo RM/VP, ver el procedimiento indicado para el test de rojo de metilo. B. Preparacin de solucin de -naftol Disolver 5.0 gr de - naftol en una pequea cantidad de alcohol absoluto y luego llevar el volumen a 100 ml. La solucin debe ser incolora. El reactivo es estable por 1 ao. Rotular indicando fecha de preparacin y de expiracin. Guardar en heladera en frascos color caramelo. C. Preparacin de la solucin de KOH Disolver los pellets de KOH en agua destilada y luego llevar el volumen final a 100 ml (trabajar sobre bao de agua fra para evitar recalentamiento). El reactivo es estable por 1 ao. Rotular indicando fecha de preparacin y de expiracin. III. Procedimiento A. Con un ansa estril tomar material e inocular un tubo de caldo RM/VP. B. Incubar a 37C por un mnimo de 48 horas. C. Transferir 2.5 ml de la suspensin a otro tubo. D. Agregar 0.6 ml del reactivo de -naftol.

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E. Agregar 0.2 ml del reactivo de KOH. F. Agitar el tubo y dejar descansar 10 a 15 minutos. G. Observar la formacin de un color rosado a rojo. IV. Resultados Ensayo positivo: desarrollo de color rojo dentro de los 15 minutos. Ensayo negativo: no hay desarrollo de color. V. Control de Calidad Klebsiella pneumoniae Escherichia coli + VI. Consideraciones A. Cuando hay una incubacin prolongada (ms de 3 das) algunos organismos VP + pueden producir un aumento de la acidez del medio, dando reacciones positivas dbiles o falsas reacciones negativas. B. La mayora de los miembros de la familia Enterobacteriaceae dan reacciones opuestas entre el rojo de metilo y VP, sin embargo algunos organismos como Hafnia alvei pueden dar ambas reacciones positivas. C. Los reactivos se deben agregar en el orden indicado. Una inversin del orden puede dar un resultado positivo dbil o un falso negativo. D. No se debe agregar KOH en exceso, porque se puede enmascarar una reaccin positiva dbil por la formacin de un color cobrizo por la reaccin del KOH con el -naftol. No leer el ensayo despus de 1 hora; puede aparecer una coloracin cobriza dando un resultado falso positivo. Prueba de la Urea I. Principio La urea es una diamida del cido carbnico, cuya hidrlisis por accin de la ureasa da 2 molculas de amonaco. La ureasa es una enzima constitutiva que se sintetiza independientemente de la presencia o no de la urea. La prueba determina la capacidad de la bacteria de desdoblar la urea, con la consiguiente alcalinizacin del medio. Es una actividad

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caracterstica de especies de Proteus y se usa para diferenciar Klebsiella (+) de Escherichia (-) y Proteus (+ rpido) de Providencia (-); Yersinia pseudotuberculosis (+) de Yersinia pestis (-) II. Materiales El medio base est disponible comercialmente, es el medio base de urea de Christensen, que contiene peptona 1.0 g, glucosa 1.0 g cloruro de sodio 5.0 g, fosfato monopotsico 5.0 g, solucin de rojo fenol al 0.2% 6 ml. Se disuelve medio en agua destilada y esterilizar a 121C por 15 minutos. Enfriar a 50C y agregar 5 ml de una solucin de urea al 40% por cada 100 ml de medio. Mezclar y fraccionar en volumenes de 2.5 ml en tubos estriles. Guardar en heladera. La urea se pesa asepticamente, se disuelve en agua y se calienta a 70C por 20 minutos, se guarda en frascos estriles con cloroformo (igual que para los azcares). III. Procedimiento A) Con un ansa estril se toma abundante material y se inocula por puncin B) Se incuba a 37C y se efectan lecturas a las 2, 4, 6 y 18 horas. Los tubos negativos se observan diariamente por 4 a 7 das para detectar reacciones tardas que dan ciertos miembros de la familia, registrando los resultados da por da. IV. Resultados Ensayo positivo: aparicin de color rojo en el medio por una alcalinizacin del mismo. Ensayo negativo: no hay cambio de color. V. Control de Calidad Enterobacter aerogenes Escherichia coli Proeus vulgaris +

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Prueba del Indol I. Principio El indol es uno de los productos del metabolismo del aminocido triptofano. Con un medio rico en triptofano, el indol se puede detectar por su habilidad para combinarse con ciertos aldehidos para formar un compuesto coloreado. El ensayo constituye un mtodo rpido para detectar organismos productores de indol. Como indicador de la presencia del aldehdo se usa el reactivo de Erlich. Es especialmente til en la identificacin preliminar de Escherichia coli, y para diferenciar Edwardsiella (+) de Salmonella (-). II. Materiales A. Caldo triptofano Peptona Cloruro de sodio Agua destilada 20.0 gr 5.0 gr 1000 ml

A este caldo se le incorpora triptofano en una concentracin del 1%. El medio se esteriliza a 121C durante 15 minutos y luego se ajusta el pH a 7.5. Dejar enfriar antes de su empleo y guardar a 4-10C para su conservacin. B. Reactivo de Erlich p-dimetilaminobenzaldehido alcohol etlico, 95% cido clorhidrco, concentrado 1.0 g 95.0 ml 20.0 ml

Se disuelve el aldehdo en el alcohol (puede requerir un calentamiento suave), luego se agrega lentamente el cido. El reactivo de color amarillo es estable por un ao. Identificar el reactivo con una etiqueta donde conste la fecha de preparacin y de expiracin. Guardar refrigerado en botellas color caramelo. III. Procedimiento 1) Con un ansa tomar material de una colonia aislada e inocular el caldo que contiene triptofano. 2) Incubar a 37C por 18 a 24 horas.

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3) Transferir 2 ml de la suspensin de caldo a un segundo tubo. 4) Agregar 5 gotas del reactivo de Erlich por la pared del tubo. 5) Agitar el tubo y observar un color rosado en la interfase entre el caldo y el reactivo. 6) Si el ensayo es negativo, el cultivo se debe reincubar otras 24 horas. IV. Resultados Ensayo positivo: desarrollo de un color rojo en la interfase del reactivo y el caldo, segundos despus de agregar el reactivo. Ensayo negativo: no hay cambio de color o hay un color amarillo en la interfase. V. Control de Calidad Cualquiera de los reactivos debe ser controlado con cultivos positivos y negativos conocidos, antes de su empleo general. Como controles resultan convenientes cepas de fcil obtencin y que su conservacin en cultivos madre no ofrezca problemas. Escherichia coli + Enterobacter aerogenes Klebsiella pneumoniae VI. Consideraciones 1) El pH ptimo para la actividad de la triptofanasa es ligeramente alcalino (7.4-7.8). La disminucin del pH provoca una reduccin en la produccin de indol y una reaccin falsamente negativa o dbilmente positiva. 2) Los cultivos a los cuales se les efecta la prueba del indol deben ser incubados aerobicamente. El descenso en la tensin de oxgeno disminuye la produccin de indol. 3) No debe emplearse un medio de peptona que contenga glucosa porque la elevada acidez producida por la fermentacin del azcar puede inhibir la actividad de la triptofanasa. El agregado de triptofano estimula la produccin de indol, mientras que la glucosa la inhibe.

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2.2.2.-PROBLEMAS DEL DIAGNSTICO DIFERENCIAL

A) Salmonella Typhi y Salmonella Paratyphi A, pueden diferenciarse de otras Salmonella spp, por las siguientes pruebas bioqumicas:
TABLA 6. Pruebas bioqumicas diferenciales entre Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A y Salmonella spp. P. Bioqumicas SH2 (TSI) Lisina decarboxilasa Ornitina decarboxilasa Arginina dihidrolasa Glucosa (gas) Citrato Simmons S. Typhi Trazas + S. Paratyphi A + + Salmonella spp. + + + + + +

+ 90% ms de los resultados positivos; - 90% ms de los resultados negativos

B) Algunas cepas de Salmonella spp.

se pueden confundir con otras enterobacterias

productoras de SH2 como Proteus mirabilis y Citrobacter freundii que son comensales del aparato digestivo del hombre y de los animales de sangre caliente, pero que no son enteropatgenos.
TABLA 7. Caracteres bioqumicos diferenciales entre Salmonella subesp. enterica (I) Proteus mirabilis y Citrobacter freundii

Pruebas bioqumicas SH2 (TSI) Urea (hidrlisis) Fenilalanina deaminasa Lisina decarboxilasa Ornitina decarboxilasa Lactosa (fermentacin) Dulcita (fermentacin) ONPG

Salmonella enterica subesp. enterica (I) + + + + -

Citrobacter freundii + d d d d +

Proteus mirabilis + + + + -

+ 90% ms de los resultados positivos; - 90% ms de los resultados negativos; d: diferentes reacciones

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C) Las cepas de Citrobacter freundii suelen ser identificadas por error como S. enterica subesp. arizonae (IIIa) (serovariedades monofsicas) y S.enterica subesp. diarizonae (IIIb) (serovariedades difsicas), (ex-gnero Arizona), en razn de compartir caracteres bioqumicos tales como: SH2 (TSI) +, ONPG + y un perfil de fermentacin de hidratos de carbono muy parecido.
TABLA 8. Caracteres bioqumicos diferenciales entre Salmonella subesp. enterica IIIa y IIIb y Citrobacter freundii Pruebas bioqumicas Lisina decarboxilasa Ornitina decarboxilasa Glicerol (fermentacin) Malonato (utilizacin) Gelatina (hidrlisis) Salmonella subesp. enterica IIIa y IIIb + + + + (lenta) - (con excepciones) + Citrobacter freundii

+ 90% ms de los resultados positivos; - 90% ms de los resultados negativos

D) Muy raramente Salmonella pueden confundirse con otras entrobacterias productoras de SH2, como E. coli SH2 + o Edwardsiella tarda
TABLA 9. Caracteres bioqumicos diferenciales entre Salmonella enterica subesp. enterica (I), Edwarsiella tarda y Esherichia coli SH2 + P. Bioqumicas Indol Citrato Simmons Lisina decarboxilasa Arginina dihidrolasa Manita (fermentacin) Dulcita (fermentacin) Ramnosa (fermentacin) Xilosa (fermentacin) ONPG S. enterica subesp. enterica (I) + + + + + + + E. tarda + + E. coli SH2 + + + -/+ + +/+ + +

+ 90% ms de los resultados positivos; - 90% ms de los resultados negativos

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E) Puede suceder que dos o ms serovares tengan la misma frmula antignica global, por lo que su diferenciacin se hace en base a pruebas bioqumicas.
TABLA 10. Caracteres diferenciales de las serovariedades S.Cholerasuis, S. Typhisuis y S. Paratyphi C. Pruebas Bioqumicas SH2 Citrato deSimmons Arginina dihidrolasa Lisina decarboxilasa Ornitina decarboxilasa Tartrato de Jordan Arabinosa Dulcita Sorbita Cholerasuis + o (+) + + +o+ o (+) Paratyphi C + + +o+ + + + + + Typhisuis + + + -

+ 90% o ms de los resultados positivos; - 90% o ms de los resultados negativos; (+) reacciones positivas despus de 3 o ms das.

2.3.- SEROTIPIFICACIN DE SALMONELLA spp. La serotipificacin constituye un importante complemento de la identificacin bioqumica y desde el punto de vista epidemiolgico permite determinar la prevalencia de una serovariedad en distintas zonas geogrficas, como as tambin es de utilidad para el estudio de brotes y para conocer la fuente de infeccin y las vas de transmisin. El uso de reacciones antgeno anticuerpo para la serotipificacin de las bacterias se basa en que los microorganismos presentan diferencias en su constitucin antignica, an entre grupos de microorganismos relacionados. Los microorganismos expresan una gran variedad de antgenos (Ags): componentes estructurales de la clula (pared, cpsula, fimbrias); productos de excrecin (exotoxinas, enzimas extracelulares). Qumicamente, los Ags pueden ser protenas, hidratos de carbono y complejos de polipptidos y carbohidratos. Como son molculas complejas tienen ms de una subestructura que puede servir como determinante antignico. Debido a esto en los sueros inmunes se encuentran anticuerpos que reaccionan contra distintos determinantes antignicos de la misma molcula.

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La base de la serotipificacin para todas las enterobacterias es similar: se pone en evidencia la presencia de antgenos somticos, flagelares y capsulares. La serotipificacin de cepas de Salmonella enterica involucra la identificacin de antgenos somticos de superficie (LPS, antgenos O) y antgenos flagelares (protenas, antgenos H). La mayora de las cepas de Salmonella expresan dos fases flagelares pero tambin se conocen variantes afsicas, monofsicas y trifsicas. La identificacin de las serovariedades surge como consecuencia de la combinacin antignica de factores somticos O y flagelares H, con el agregado del antigeno capsular Vi para unas pocas serovariedades y se presenta en el Esquema de Kauffmann-White (Popoff, M.Y., 8 Ed, WHO Centre for Referente and Research on Salmonella, Instituto Pasteur, Pars, Francia, 2001). A) Antgenos somticos (Ags O) Estn compuestos por complejos de fosfolpidos y polisacridos; su composicin es aproximadamente: 60% polisacridos, 20-30% lpidos y 3,5-4% hexosamina. Son cadenas laterales de polisacridos del lipopolisacrido de envoltura (LPS) que se encuentra en todos los microorganismos gram-negativos. La cadena de polisacridos del Ag O es un polmero de unidades repetidas de oligosacridos (de 3 a 5 azcares) lineales o ramificados. La naturaleza de los grupos terminales y el orden en que se encuentran las unidades repetidas de la cadena determina la especificidad antignica somtica de la bacteria. Como esta estructura difiere ampliamente entre las distintas serovariedades, hay diferencias en la especificidad antignica O. Estos antgenos son termoestables y resistentes a cidos diluidos y alcohol. La estructura somtica se denomina con la letra O seguida de nmeros arbigos separados por comas, por ej. S. Typhimurium O:1,4,5,12; S. Enteritidis O:1,9,12

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Los Ags O se pueden clasificar de la siguiente manera: 1) Factores mayores, que identifican el grupo antignico O; por ej., el factor O:4, el factor O:9 2) Factores menores, que pueden ser: a) Los que tienen poco o ningn valor discriminativo porque siempre estn asociados a otro factor; por ej., O:12 que siempre est asociado con O:2, O:4 y O:9, como se presenta en S. Paratyphi A O: 1,2,12; S. Typhimurium O: 1,4,5,12 y S. Enteritidis O: 1,9,12 b) Los que surgen como consecuencia de una modificacin qumica de los Ags mayores; por ej., O:5 resulta de la acetilacin de la abecuosa presente en las unidades repetidas del polisacrido responsable de la especificidad O:4,12; O:1 resulta de la insercin de un residuo de glucosa en la galactosa de la cadena de polisacrido, como es el caso de la serovariedad S. Typhimurium O:1,4,5,12 B) Antgenos Flagelares (Ags H) El flagelo es una estructura compleja que consiste en un cuerpo basal, un segmento de unin (hook) y un filamento. El cuerpo basal ancla el flagelo a la envoltura de la clula y el hook une el cuerpo basal con el filamento. En la serotipificacin flagelar de Salmonella se usa solamente la especificidad antignica del filamento. El filamento esta constituido por flagelina, protena de alto peso molecular. En Salmonella se han encontrado ms de 60 especificidades antignicas flagelares. Las diferencias antignicas surgen debido a variaciones en la estructura primaria (contenido en aminocidos y orden de ubicacin) de las distintas molculas de flagelina. Estos antgenos son sensibles al calor. Unas pocas serovariedades de Salmonella poseen una sola fase flagelar, esas cepas se llaman monofsicas, por ej. Salmonella Enteritidis (9,12:g,m:-), Salmonella Typhi (9,12 [VI]:d:-); pero la gran mayora de las serovariedades tienen dos fases flagelares o sea son cepas difsicas; por ej., Salmonella Typhimurium (1,4,5,12:i:1,2) y Salmonella Hadar (6,8:z10:e,n,x), que expresan la fase 1 (constituida en los ejemplos por los antgenos: i z10 ) y la fase 2 ( por los antigenos: 1,2 y e,n,x respectivamente).

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C) Antgeno Capsular (Ag Vi) El antgeno capsular es un polisacrido, constituido por cido N-acetilglucosaminournico. Entre los antgenos capsulares de las Enterobacterias, el Vi es el ms importante en el gnero Salmonella. Se encuentra en slo tres serovariedades: S. Typhi, S. Paratyphi C y en algunas cepas de S. Dublin. Descripcin del Esquema de Kauffmann - White Sobre la base de los componentes antignicos somticos O y flagelares H se ha establecido lo que se denomina el Esquema de Kauffmann-White, que agrupa a todas las serovariedades conocidas. El esquema est conformado por cuatro columnas: Primera columna: indica el nombre de la serovariedad, si la misma pertenece a S. enterica subesp. enterica (I) las siglas S. II, S. IIIa, S. IIIb, S. IV, S. V, S. VI; indicando que la serovariedad considerada pertenece a la subespecie II III a, etc. Segunda columna: Antgenos somticos (O). Los nmeros indican el los factores del antgeno O y se escriben, separados por una coma. Las serovariedades son agrupadas en grupos somticos, cada uno de ellos caracterizado por un factor O mayor. As se determinan los grupos A, B, C, etc. Por ej. el grupo O:2 (A) est integrado por S. Paratyphi A (1,2,12:a:-) entre otras, el grupo O:4 (B) por S. Typhimurium (1,4,5,12:i:1,2); S. Agona (1,4,12:f,g,s:- ); S. Saintpaul (1,4,5,12:e,h:1,2), entre otras, etc. El Esquema de Kauffmann-White presenta 67 grupos O, desde el grupo A hasta el Z y luego contina con nmeros, desde el O:51 hasta el O:67 Tercera y cuarta columna: Antgenos flagelares (H). Se indican los factores de las fases 1 y 2, del antgeno H, respectivamente. Para la fase 1 los factores se denominan con letras minsculas, seguidas algunas veces por un nmero que figura como subndice y para la fase 2 se emplean en general nmeros arbigos, aunque tambin se utilizan letras minsculas. Un signo "negativo" indica que la fase considerada est ausente y por lo tanto la serovariedad es monofsica.

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Los smbolos para los factores somticos determinados por conversin fgica estn subrayados (por ej. 1,2,12) [ ] = los factores O o H entre corchetes, no subrayados, pueden estar presentes o ausentes sin relacin con la conversin fgica. Por ej. factor [5] del grupo O:4 (B). Cuando los factores H estn entre corchetes significa que ellos se encuentran excepcionalmente en cepas salvajes. Ejemplos: Salmonella Enteritidis 1, 9,12:g,m:El Ag O es 1, 9,12; el Ag H (fase 1) es g,m; El Ag H (fase 2)es -; la fase 2 est ausente, por lo tanto la serovariedad es monofsica. Salmonella Typhimurium 1, 4,5,12:i:1,2 El Ag O es 1,4,5,12 ; el Ag H (fase 1) es i ; el Ag H (fase 2) es 1,2; las dos fases flagelares estn presentes, por lo tanto la serovariedad es difsica. Salmonella Hadar Salmonella Typhi 6,8:z10:e,n,x 1, 9,12[Vi]:d:-

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ESQUEMA DE KAUFFMANN-WHITE (*)

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Materiales y equipamiento
Medios

Estufa de cultivo a 37C Heladera a 4C Bao de agua a 50C Ansas Tubos de ensayo Tubos de 13x100 mm con tapa a rosca Tubos de Craigie Cajas de Petri Lminas de vidrio de 20x20 cm Pipetas de 5 ml Gradillas Mecheros Lmparas para leer aglutinaciones Palillos de madera

Estras de agar tripticasa de soja (TSA) Agar movilidad al 0,7% (para inversin de fase) Agar movilidad al 0,5% (para Craigie) Caldo flagelar

Reactivos y Soluciones Antisueros diagnsticos O y H Solucin salina al 2% Solucin fisiolgica formolada al 1%

Cepas bacterianas Cepas de Salmonella spp. en agar TSA, cultivos de 18 horas a 37C Esquema de Kauffmann-White (Poppof, M.Y., 8 Ed, WHO Centre for Referente and Research on Salmonella, Instituto Pasteur, Pars, Francia, 2001).

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2.3.1- SEROTIPIFICACIN SOMTICA O Procedimiento Dia 1 Serotipificacin somtica O La determinacin del antgno O de Salmonella spp. se hace en lmina a partir de un cultivo en agar TSA, incubado a 37C por 18-24 horas La deteccin de los antgenos somticos se realiza por aglutinacin en lmina. Los anticuerpos en el suero especfico aglutinan con la bacteria cuando est el antgeno Es correspondiente lisa. La aglutinacin con solucin salina al 2% debe dar negativa presente. Comentario

importante que el aislamiento est en forma

Verificar que el cultivo se encuentre en forma lisa: - Mezclar una ansada de cultivo puro se mezcla con una gota de solucin salina al 2%, cuiadosammente con un palillo. Rotar suavemente la lmina, durante 2 minutos. Observar la presencia o ausencia de grumos: a) Si hay grumos la cepa est rugosa.

Para revertir la rugosidad se deben realizar subcultivos de la cepa en agar sangre o en agar Mueller Hinton, de manera de recuperar la forma lisa y poder continuar con la serotipificacin somtica O. Si no es posible la reversin de la forma rugosa a la lisa, se debe confirmar su identificacin bioqumica y realizar la seropitificacin flagelar H.

b) Si no presenta grumos se realiza la serotipificacin somtica O

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 Enfrentar sobre una lmina de vidrio una ansada del cultivo en agar TSA, con una gota de los antisueros polivantes OS-A y OS-B. Mezclar cuidadosamente con un palillo. Mover suavemente la lmina, observar durante 2 minutos, para favorecer la reaccin antgeno-anticuerpo y indirecta. presencia o ausencia de aglutinacin, con luz

Estos polivalentes comprenden el 98% de las serovariedades aisladas del hombre y de los animales. Estos antisueros cumplen la funcin de una primera seleccin en grandes grupos. Si la aglutinacin no ocurre con los polivalentes OS-A y OS-B puede ser: a) Una serovariedad no comprendida en dichos antisueros, en tal caso remitir la cepa al Laboratorio de Referencia b) Una serovariedad que presente antgeno de envoltura Vi (S. Typhi, S. Paratyphi C y algunas cepas de S. Dublin). En este caso se debe enfrentar el cultivo con el antisuero Vi

Si hay aglutinacin con alguno de los dos antisueros polivalentes, probar los antisueros de grupo O correspondientes. Si hay aglutinacin con un antisuero de grupo O, probar los antisueros de factores O

Lectura e interpretacin de resultados Registrar el grado de aglutinacin de la siguiente manera: 4+: 75 a 100% de microorganismos aglutinados 3+: 75% aproximadamente de

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microorganismos aglutinados 2+: 50% aproximadamente de microorganismos aglutinados 1+: menos de 2% de microorganismos aglutinados Negativo: ausencia de aglutinacin. Se observa una suspensin homognea. Registrar los resultados tanto negativos como positivos para los antgenos O estudiados, en la Planilla 3 - Registro de Resultados: Serotipificacin Somtica de Cepas de Salmonella. 2.3.2- SEROTIPIFICACIN FLAGELAR H Procedimiento Da 1 Serotipificacin flagelar H Sembrar la cepa de Salmonella spp. en 5 ml de caldo flagelar e incubar a 37C, durante 18-24 horas. La deteccin de los antgenos flagelares H se realiza por aglutinacin en tubo o en placa dependiendo de las caractersticas de los antisueros. En este protocolo se describe la aglutinacin en tubo, ya que los antisueros estn preparados por el productor para realizar la aglutinacin en tubo. Da 2 Separar del caldo flagelar una alcuota de 0.5 ml en un tubo estril de 13x100 con tapa a rosca. Agregar al caldo flagelar restante 5 ml de solucin fisiolgica formolada al 1% (caldo Comentario

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formolado) y dejar reposar durante 1 hora a temperatura ambiente Colocar en 4 tubos de ensayo una gota de cada uno de los antisueros flagelares polivalentes (HS-1, HS-A, HS-B y HS-C) y agregar a cada tubo 0.5 ml del caldo formolado. Incubar 1 hora a 50C en bao de agua y registrar la presencia o ausencia de flculos con luz indirecta. La aglutinacin flagelar Su tiene una

apariencia flocular, menos compacta que la aglutinacin somtica. estructura tridimensional no es estable, por lo tanto no se deben agitar los tubos luego de la incubacin a fin de no disgregar los flculos. Si la cepa de Salmonella spp., de la cual se ha identificado el antgeno O, no reacciona con ninguno de los antisueros flagelares polivalentes, hay que tener en cuenta: a) La cepa puede presentar un no incluido en los antgeno

Si hay aglutinacin, con uno o dos de los antisueros flagelares polivalentes, enfrentar el caldo formolado, con los antisueros de fase H correspondientes (una gota del antisuero ms 0,5 ml del caldo formolado) Si el antisuero de fase flagelar est compuesto por ms de un factor (por ej. 1,2), determinar los factores H correspondientes, utilizando especficos los antisueros de factores

antisueros polivalentes, en este caso debe ser remitida al Laboratorio de Referencia, para completar su serotipificacin b) Se puede tratar de una cepa inmvil, por la ausencia de flagelos c) Se puede tratar de una cepa con movilidad reducida. En este caso se debe exaltar la movilidad por

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pasajes sucesivos en tubos Craigie o en tubo en U con agar movilidad al 0.5% Si el cultivo aglutina con un solo antisuero polivalente flagelar, puede ser: a) b) Que se trate de una serovariedad monofsica Que sea una serovariedad por los difsica, de acuerdo al Esquema de Kauffmann-White, resultados de la aglutinacin O y nicamente se expresa una sola fase H, por lo tanto hay que poner en evidencia la fase no detectada, usando el Mtodo de inversin de fase.

Mtodo de Inversin de Fase Fundir 10 ml de agar movilidad al 0.7%, dejar enfriar a 50C. Mezclar en una caja de Petri dos gotas del antisuero de la fase flagelar predeterminada con el agar movilidad al 0.7%, homogenizar con movimientos de rotacin y dejar solidificar. Es un mtodo que permite poner en evidencia, ello se en caso de la serovariedades fase flagelar difsicas, la fase que no se expres. Para inmoviliza establecida previamente con el antisuero correspondiente a esa fase flagelar. Se trata de un mtodo de seleccin de los microorganismos que presentan la fase flagelar no expresada hasta ese momento.

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 Sembrar una ansada del cultivo sin formolar en el centro de la superficie del agar Incubar a 37C, durante 18-24 horas. Da 3 Tomar el desarrollo bacteriano de la periferia de la placa y enfrentar con el antisuero de la fase sospechada. Lectura e interpretacin de resultados Registrar el grado de aglutinacin de la siguiente manera: 4+: 75 a 100% de microorganismos aglutinados y el sobrenadante es un lquido claro 3+: 75% aproximadamente aglutinados y de el microorganismos turbio 2+: 50% aproximadamente aglutinados y de el microorganismos turbio 1+: menos de 2% de microorganismos aglutinados y el sobrenadante es turbio Negativo: caracterizada homognea. ausencia por de una aglutinacin, suspensin

sobrenadante es un lquido ligeramente

sobrenadante es un lquido moderamente

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 Registrar los resultados tanto negativos como positivos para los antgenos H estudiados, en la Planilla 4 - Registro de Resultados: Serotipificacin Flagelar de Cepas de Salmonella spp. Identificacin de la serovariedad Combinando los antgenos O y H identificados se determina la serovaridad de acuerdo con el Esquema de KauffmannWhite.

Ver Tubos de Craigie y en U (Figura 2) Ver Flujograma de Serotipificacin (Figura 3)

FIGURA 2.- TUBOS DE CRAIGIE Y EN U

Tubo de Craigie

Siembra del inculo Recoleccin del desarrollo

Siembra del Inculo

Recoleccin del desarrollo

Tubo en U

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FIGURA 3.- FLUJOGRAMA DE SETROTIPIFICACIN DE SALMONELLA

Cepa con caractersticas bioqumicas de Salmonella

Serotipificacin somtica (aglutinacin en lmina) Aglutinacin con solucin salina al 2%

Estra en TSA

Serotipificacin flagelar (aglutinacin en tubo) Caldo flagelar

Negativa

Positiva

Aglutinacin c/ antisueros poliv. flagelares H (4)

Aglutinacin c/ antisueros poliv. somticos (1) Negativa (3) Positiva

Cepa Rugosa (2) Negativa (5) Positiva

Aglutinacin c/ antisueros de fases H / factores H (6) Positiva

Aglutinacin c/ antisueros de grupo O Positiva Aglutinacin c/ antisueros de factores O Positiva RESULTADO FINAL

(1) Antisueros polivalentes somticos: OS-A y OS-B (2) Para revertir una cepa de la forma rugosa a lisa, se realizan subcultivos en agar sangre o Mueller Hinton. Si no es posible revertir la rugosidad, se debe confirmar la identificacin por pruebas bioqumicas y realizar la serotipificacin flagelar H. (3) Ver Consideraciones a tener en cuenta en "Serotipificacin somtica" (4) Antisueros polivalentes flagelares: HS-1; HS-A; HS-B; HS-C (5) Ver Consideraciones a tener en cuenta en "Serotipificacin flagelar. (6) Si la serovariedad de Salmonella es difsica y slo expresa una fase, realizar "Mtodo de inversin de fases"

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Referencias
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12. Manual de Laboratorio de Infecciones Entricas Agudas (1983). Organizacin Panamericana de la Salud. Oficina Regional dela OMS. Ed. Espaola,. 13. Miller, S.I., Hohmann, E.L., Pegues, D.A. (1995). Salmonella (Including Salmonella Typhi) En Principles and Practice of Infectious Diseases. Mandell, G.L., Douglas and Bennetts (ed.) 4th Edition. Chapter 200. De. By Mandell, G.L. M.D.; Bennet,J.E. MD.; Dollin, R. M.D. 14. Peluffo, C. (1973). Salmonella: Mtodo simplificado de diagnstico serolgico. Oficina Sanitaria Panamericana. Oficina Regional de la OMS. 15. Wray, C., Wray, A. (2000). Salmonella in domestic animals. CABI Publishing 16. Popoff M.Y., (2001). Antigenic formulas of the Salmonella serovars, 8th edition. World Health Organization, Centre for Reference and Research on Salmonella. Institut Pasteur, Paris.

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CAPTULO III PRECAUCIONES DE BIOSEGURIDAD

Los laboratorios de microbiologa son ambientes de trabajo que pueden presentar riesgos de adquirir enfermedades infecciosas para las personas que trabajan en ellos. Los accidentes en el laboratorio ocurren por ausencia de entrenamiento, desconocimiento, experiencia escasa, cansancio, trabajar muy rpido, no seguir prcticas seguras y subestimar la peligrosidad del trabajo. Frente a estas situaciones se introdujo el concepto de bioseguridad que es el conjunto de mtodos tendientes a minimizar el riesgo asociado al manejo de microorganismos, mediante la proteccin de los operadores, personas del entorno, productos y medio ambiente. Define las condiciones de contencin provistas por el uso de equipos de seguridad. Los microorganismos se han clasificado en grupos de riesgo en funcin de su patogenicidad, forma y facilidad de transmisin, la dosis infecciosa, y la existencia de tratamiento. Los microorganismos con los cuales se trabajar Salmonella, Shigella y otros miembros de la Familia Enterobacteriaceae, pertenecen al Grupo de Riesgo II, donde el riesgo individual es moderado y el riesgo comunitario limitado. Estos microorganismos pueden provocar enfermedades en humanos y animales, pero con pocas probabilidades de riesgo grave para el personal de laboratorio, animales o medio ambiente. La exposicin en el laboratorio puede provocar una infeccin pero se dispone de medidas de tratamiento y de prevencin y el riesgo de propagacin es limitado. 1.- NIVEL DE LABORATORIO El laboratorio donde se trabaja con estos microorganismos es de Nivel de Bioseguridad 2. En este nivel el personal debe contar con una capacitacin especfica para el manejo de los agentes patgenos y el director es un profesional competente. El acceso al laboratorio est restringido cuando se estn desarrollando actividades y la puerta de entrada debe tener el smbolo indicador. Se toman precauciones especiales cuando se manejan elementos cortopunzantes y se utilizan elementos de proteccin (ambos, delantales, guantes, mscaras faciales) con los procedimientos que pueden representar un riesgo para el operador. Las mesadas de trabajo tienen que ser impermeables al agua, resistentes al calor moderado y a los productos qumicos empleados en la desinfeccin.

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El laboratorio debe disponer de un lavatorio para el lavado de manos y de adecuados sistemas de decontaminacin del material. En los laboratorios est prohibido comer, beber, fumar, manipular lentes de contacto, maquillarse. 2.- ELEMENTOS DE PROTECCION a) Ambos, delantales o uniformes de laboratorio durante la permanencia en el mismo; esta vestimenta no debe salir del laboratorio y el personal no puede llevarla a su casa para el lavado. b) Guantes cuando es posible que las manos entren en contacto con materiales infecciosos o superficies contaminadas. Los guantes se descartan luego de su uso, no se lavan ni se reusan y no se deben usar fuera del laboratorio. c) Proteccin facial se requiere su uso cuando existe la posibilidad que algn procedimiento genere gotas o aerosoles La proteccin facial esta dada por anteojos, mscaras faciales, barbijos. d) Gabinete de seguridad biolgica, cuando existe la posibilidad de generacin de gotas o aerosoles. El gabinete que se utiliza es Clase II que protege al operador, los productos y el medio ambiente. El aire externo no entra directamente a la mesa de trabajo sino que previamente pasa por un filtro HEPA para luego ingresar al rea de trabajo, y tambin sale al ambiente a travs de otro filtro, (Fig. 1). Es obligatorio que los gabinetes se evalen y certifiquen en el momento de la instalacin en el laboratorio, cuando se trasladan y por lo menos una vez por ao a partir de ese momento.

FIGURA 1

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Dentro del gabinete debe ingresar solamente el material indispensable para trabajar para perturbar lo menos posible la circulacin del aire dentro del gabinete. 3.- INSTRUCCIONES PARA EL TRABAJO 1. Leer cuidadosamente todas las instrucciones antes de comenzar con los protocolos de trabajo. 2. Considerar POTENCIALMENTE CONTAMINADO a todo material de vidrio, plstico, pipetas, esptulas, que est en contacto con las suspensiones bacterianas. 3. Todo material contaminado potencialmente infeccioso se tratar en autoclave. No efectuar ninguna limpieza del mismo en el laboratorio. 4. Descartar los residuos plsticos potencialmente infecciosos en recipientes resistentes a la perforacin, que contienen hipoclorito de sodio al 1%. Estos NO SE DEBEN LLENAR COMPLETAMENTE. 5. Descartar los materiales con cultivos microbianos en recipientes con bolsas plsticas de color rojo, para su posterior eliminacin. 6. Descartar material de vidrio en recipientes de acero inoxidable con tapa de seguridad para su posterior descontaminacin en autoclave. 7. Cada mesada debe tener propipetas, guantes, alcohol 70% y una solucin de hipoclorito de sodio al 10%. 8. Notificar a las personas responsables del rea o instructores de trabajos prcticos cuando se produzcan derrames, quienes tomarn las medidas adecuadas segn el caso. 9. Descartar el material de vidrio roto envolviendo los trozos en papel, colocarlo en bolsa plstica y finalmente en un recipiente resistente y rotulado con claridad vidrios rotos. 4.- ACCIONES A REALIZAR EN CASO DE INCENDIO 1. Mantener la calma y avisar al resto de las personas. 2. Dar aviso al Departamento de Seguridad e Higiene. 3. Si el fuego es pequeo y sabe utilizar un extintor, selo. Si el fuego es de consideracin no se arriesgue y evacue el laboratorio. 4. No corra, camine rpido, cerrando a su paso la mayor cantidad de puertas. 5. No lleve objetos ya que pueden entorpecer su salida.

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6. Si pudo salir del laboratorio, por ninguna causa vuelva a entrar. Deje que los equipos especializados se encarguen. 5.- CENTROS PARA REQUERIR AYUDA Se deben tener disponibles los nmeros telefnicos correspondientes. 6.- TRANSPORTE DE MUESTRAS El acondicionamiento seguro de muestras para diagnstico bacteriolgico es responsabilidad de todos los involucrados en el proceso: el profesional, el responsable del laboratorio y el personal de la empresa de transporte. El embalaje de los materiales infecciosos debe evitar la fuga de los mismos por rotura o mal empaque del envo. Los materiales para diagnstico se deben enviar en el sistema de triple envase de acuerdo a las recomendaciones de la Organizacin Mundial de la Salud WHO/EMC/97.3. (Fig. 2) El sistema consiste de: a) Recipiente primario, a prueba de prdidas, con cierre hermtico (tubo pequeo o vial), en el cual se coloca la muestra. b) Recipiente secundario, resistente, a prueba de fugas, impermeable, donde se incluye el recipiente primario. c) Envoltorio externo, para proteger el envase secundario de influencias externas, como dao fsico o agua. El espacio entre los recipientes primario y secundario se debe llenar con material absorbente, para retener el contenido del recipiente primario en caso que ocurra una prdida durante el transporte. Los formularios con datos de la muestra, notas y todo otro tipo de informacin que identifiquen o describan a la muestra, al remitente y al destinatario, se deben colocar alrededor del recipiente secundario.

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FIGURA 2 REFERENCIAS
Laboratory Biosafety Manual, 3rd ed., World Health Organization Geneva, 2004 www.who.int

Biological Safety. Principles and Practices, 3rd ed. Fleming, D.O., Hunt, D.L. Ed. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 4th ed., Richmond J., McKinney Ed. CDC/NIH, 2001. www.cdc.gov. Safety in Health-Care Laboratories. World Health Organization Geneva, 1997. www.who.int/.

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CAPTULO IV - MEDIOS DE CULTIVOY SOLUCIONES

Descripcin y Preparacin La mayora de los medios de cultivo se encuentran disponibles comercialmente Caldo Selenito Para el enriquecimiento selectivo de Salmonella en materia fecal, orina y tejidos infectados, includa Salmonella Typhi, pero no sirve para Shigella. El selenito inhibe el crecimiento de coliformes intestinales y enterococos, principalmente en las primeras 6 a 12 horas de incubacin. No son inhibidos Salmonella, Proteus, Pseudomonas. Los componentes del medio son: peptona o triptona 5.0 g, lactosa 4.0 g, selenito de sodio 4.0 g, fosfato dipotsico (K2HPO4) 3.5 g, fosfato monopotsico (KH2PO4) 6.5 g. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada calentando hasta 60C si es necesario y esterilizar por filtracin. NO AUTOCLAVAR Si se observa un color rojo ladrillo de selenito precipitado, el medio no se debe utilizar. El material slido se inocula directamente en el caldo, el material lquido se debe mezclar en una relacin 1:1 con caldo a doble concentracin. Se incuba 24 horas a 37C. El pasaje a medios selectivos se puede hacer al cabo de 6 a 12 horas. Caldo Tetrationato Es un caldo que se usa para el enriquecimiento selectivo de Salmonella, excepto para S. Typhi, S. Pullorum y S. Gallinarum. El tetrationato junto con el tiosulfato inhibe los coliformes, mientras que las bacterias reductoras de tetrationato como Salmonella y Proteus pueden crecer sin dificultad. Las sales biliares inhiben a todos los micoorganismos intestinales acompaantes y el verde brillante inhibe la flora gram positiva. Solucin de verde brillante: se disuelve 0.1 g del colorante en 100 ml de agua destilada estril. Solucin de iodo-ioduro de potasio: se disuelven en 16 g de yodo y 20 g de yoduro de potasio en 80 ml de agua destilada estril.

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Los componentes del medio son: extracto de carne 0.9g, peptona 4.5 g, extracto de levadura 1.8 g, cloruro de sodio 4.5 g, carbonato de calcio 25.0 g, tiosulfato de sodio 40.7 g, sales biliares 4.75 g, solucin de verde brillante 1:1000 10 ml, solucin de iodo-ioduro de potasio 20 ml. Se disuelven los componentes 1000 ml de agua destilada estril con agitacin. Se agrega en forma asptica la solucin de verde brillante y luego la solucin de iodo-ioduro de potasio. Se ajusta el pH a 7.4-7.8 a 25C. El caldo se guarda en heladera. NO AUTOCLAVAR. El caldo preparado y listo para usar debe ser utilizado el mismo da de su preparacin. Caldo Flagelar Es un caldo que se usa para la determinacin de antgenos flagelares. Los componentes del medio son: caldo tripticasa de soja 15.0 g, caldo triptosa 13.0 g. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada con ebullicin hasta disolucin completa. Se fracciona en volmenes de 5 ml en tubos de 16x150 con tapa a rosca y se autoclava a 121C por 15 minutos. Solucin Salina Se disuelve 8.5 g de cloruro de sodio en 1000 ml de agua destilada, ajustar a pH 7.0 y autoclavar a 121C por 20 minutos. Agar Movilidad (Swarm Agar) Los componentes del medio son: extracto de levadura 1,0g, extracto de carne 5,0g, caldo tripticasa de soja 30g, agar-agar de 5 a 10g dependiendo de la dureza deseada. Los componentes se disuelven en 1000 ml de agua destilada calentando si es necesario. Se ajusta el pH a 7.4 y se autoclava a 121C por 15 minutos. Agar Nutritivo Los componentes del medio son: extracto de carne 3.0 g, peptona 5.0 g, agar 12.0 a 18.0 g. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada con ebullicin si es necesario, autoclavar a 121C por 20 minutos, ajustar el pH a 7.0 luego de esterilizar.

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Agar Mueller-Hinton El medio contiene: extracto de carne 2.0 g, hidrolizado cido de casena 17.5 g, almidn 1.5 g, agar 17.0. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada calentando si fuera necesario, ajustar el pH a 7.2-7.4 y autoclavar a 110C por 20 minutos. Agar EMB Es un medio selectivo y diferencial para el aislamiento de bacterias patgenas intestinales Gram (-). El contenido de lactosa y sacarosa hace posible la diferenciacin de Salmonella y Shigella lac/sac (-), de la flora acompaante lac (-)/lac (+) (Proteus vulgaris, Citrobacter, Aeromonas hydrophila). La combinacin de colorantes es la que permite diferenciar entre los fermentadores y no fermentadores de lactosa. La sacarosa se incluye porque algunos coliformes la fermentan ms rpido que a la lactosa. El desarrollo de las bacterias Gram (+) est inhibido por los colorantes del medio (eosina amarilla y azul de metileno). Agar EMB Levine contiene solamente lactosa. Los componentes del medio son: peptona 10.0 g, fosfato dipotsico (K2HPO4) 2.0 g, lactosa 5.0 g, sacarosa 5.0 g, eosina amarilla 0.4 g, azul de metileno 0.07 g. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada y autoclavar a 121C por 15 minutos. Aspecto de las colonias Salmonella, Shigella Escherichia Enterobacter, Klebsiella Bacterias lac (+) Bacterias lac (+) o sac (-) Agar MacConkey Es un medio selectivo y diferencial para aislar microorganismos fermentadores y no fermentadores de lactosa. transparentes, mbar rosado violceas con brillo metlico y centro negro azulado ms grandes que las anteriores, mucosas sin brillo metlico y centro oscuro. negras o centro oscuro, halo transparente incoloras

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Sirve para aislar Salmonella, Shigella, y coliformes de materia fecal, orina, alimentos y aguas residuales. Es un medio de baja selectividad para usar con inculos pequeos. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben microorganismos Gram (+). La presencia de lactosa permite el desarrollo de las cepas lac (+) que se manifiesta por el viraje del indicador debido a la produccin de cido; luego se absorbe el rojo neutro dando color rojo a la colonia y un halo turbio por la precipitacin de las sales biliares por la acidez del medio. Las bacterias no fermentadoras de lactosa (S. Typhi, S. Paratyphi, Shigella dysentariae) no alteran el medio, dando colonias incoloras y transparentes. Para detectar S. Typhi hay que usar medio MacConkey con agar SS y agar bismuto sulfito. Los componentes del medio son: peptona 1.7 g, proteosa-peptona 3.0 g, lactosa 10.0 g sales biliares 1.5 g, rojo neutro 0.03 g, cristal violeta 0.001g, cloruro de sodio 5.0 g. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada, calentando si es necesario, ajustar a pH 7.1 y esterilizar a 121C, durante 15 minutos. Aspecto de las colonias Salmonella, Shigella Escherichia Enterobacter, Klebsiella Proteus Agar SS Es un medio selectivo para Salmonella y Shigella a partir de materia fecal, alimentos y animales; pero no es el ideal para Sh. dysenteriae y Sh. boydii. Sirve tambin para Y. enterocolitica y para diferenciar fermentadores de lactosa de los no fermentadores. La presencia de verde brillante, bilis de buey, alta concentracin de tiosulfato y el citrato inhiben la flora acompaante. El tiosulfato y la sal de hierro ponen en evidencia la formacin de sulfuro de hierro. La degradacin de la lactosa a cido provoca el viraje del indicador rojo neutro a rojo. incoloras, medio amarillo rojas, halo turbio grandes, rosadas a rojo, mucosas Incoloras

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Los componentes del medio son: extracto de carne 5.0 g, proteosa-peptona 5.0 g, lactosa 10.0 g, citrato de hierro amoniacal 1.0 g, tiosulfato de sodio 8.5 g, sales biliares 8.5 g, verde brillante 0.003 g, rojo neutro 0.025 g, agar 13.5 g. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada calentando hasta disolucin de los mismos. NO AUTOCLAVAR Aspecto de las colonias Salmonella Shigella Proteus Escherichia coli Enterobacter aerogenes Bacterias lactosa+ incoloras, transparentes, centro negro incoloras, transparentes, medio amarillo transparentes, centro rojo, medio amarillo rosadas a rojo, medio rojo rosadas a crema, opacas, mucosas rojizas, mucoides, centro negro

Agar Hektoen Es un medio selectivo para bacterias intestinales, includas algunas shigellas. No tiene efecto inhibidor sobre Salmonella y Shigella pero si sobre flora acompaante. Debido a los dos indicadores (azul de bromotimol y fucsina), las colonias lac+ tienen una diferencia cromtica con las colonias lac-; lo mismo ocurre con bacterias fermentadoras de sacarosa y salicina. El tiosulfato con el hierro dan coloracin negra a las colonias sulfdrico+. Las sales biliares inhiben a la flora acompaante. Puede agregarse novobiocina para inhibir Citrobacter y Proteus. Los componentes del medio son: peptona 15.0 g, extracto de levadura 3.0 g, sacarosa 14.0 g, lactosa 14.0 g, salicina 2.0 g, tiosulfato de sodio 5.0 g, citrato de hierro amoniacal 1.5 g, sales biliares 2.0 g, azul de bromotimol 0.05 g, fucsina cida 0.08 g, agar 13.5 g. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada estril. NO AUTOCLAVAR. Aspecto de las colonias Shigella, Providencia verdes, planas, transparentes Salmonella, Proteus Pseudomonas Coliformes verde-azuladas, c/s centro negro verde-azuladas, planas, borde irregular salmn, halo de precipitacin

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Agar Verde Brillante Excelente medio de gran selectividad para el aislamiento de Salmonella a partir de materia fecal; pero no puede usarse para aislar S. Typhi. Los fermentadores de lactosa o sacarosa que pueden crecer en este medio se diferencian rpidamente debido a la formacin de colonias verde-amarillentas, rodeadas de una zona de igual color. Esto se debe a la fermentacin de los azcares que produce acidez, haciendo virar el indicador (rojo fenol) a amarillo. En medio alcalino se observa un color rojo intenso. El verde brillante inhibe microorganismos Gram (+), S. Typhi y Shigella. Para inhibir Proteus se recomienda agregar 0,2% de desoxicolato de sodio. La selectividad del medio permite usar inculos densos. Si se exceden los 15 minutos de esterilizacin a 121C, disminuye la selectividad del medio. Los componentes del medio son: proteosa-peptona 10.0 g, lactosa 10.0 g, sacarosa 10.0 g extracto de levadura 3.0 g, rojo fenol 0.09 g, verde brillante 0.0047 g, agar 12.0 g. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada hasta ebullicin y mantener por 1 minuto; ajustar a pH 6.7-7.1. NO AUTOCLAVAR Aspecto de las colonias Salmonella a veces Proteus y Citrobacer rosa plido, transparentes E. coli, Enterobacter Klebsiella, Bacterias lactosa + Agar XLD Es un medio de selectividad moderada a alta que permite ser usado con Salmonella y Shigella. La degradacin de xilosa, lactosa y sacarosa produce acidez que hace virar el indicador al amarillo. El tiosulfato y la sal de hierro ponen en evidencia la produccin de sulfdrico. La decarboxilacin de la lisina a cadaverina se visualiza por la presencia de un color rojo prpura por aumento del pH. El desoxicolato inhibe Gram (+). La diferenciacin de Salmonella/Shigella de otras enterobacterias se basa en tres reacciones: fermentacin de xilosa, decarboxilacin de lisina y produccin de sulfdrico. La xilosa diferencia Shigella de Providencia que no fermenta xilosa o lo hace muy lentamente; la lisina diferencia Salmonella verde-amarillo opacas, halo verde-amarillo

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de los fermentadores de xilosa no patgenos. La lactosa y la sacarosa en exceso evitan que los coliformes lis+ reviertan la condicin alcalina de los microorganismos consumidores rpidos de xilosa/lisina. La produccin de sulfdrico ocurre en condiciones alcalinas dando colonias con centro negro; en condiciones cidas la precipitacin negra se inhibe. Los componentes del medio son: extracto de levadura 3.0 g, xilosa 3.75 g, lactosa 7.5 g, sacarosa 7.5 g, l-lisina hidrocloruro 5.0 g, desoxicolato de sodio 1.0 g, tiosulfato de sodio 6.8 g, citrato de hierro amoniacal 0.8 g, rojo fenol 0.08 g,cloruro de sodio 5.0 g, agar 15.0 g. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada. Calentar hasta que comience a hervir (no sobrecalentar); llevar a un bao de 50C siempre con agitacin. Ajustar el pH a 7.40.2 a 25C. Guardar a 4C por 14 das, en la oscuridad. El precipitado que ocasionalmente presenta el medio no perjudica su rendimiento, puede eliminarse por filtracin. Aspecto de las colonias E. coli, Enterobacter Aeromonas Klebsiella Citrobacter Serrati, Hafnia P. vulgaris, P. mirabilis Salmonella Shigella, Providencia S. Typhi amarilla, opacas, con precipitado amarilla, opacas, con precipitado amarilla, opacas, mucosas, c/precipitado amarilla, opacas, centro negro amarilla, opacas amarilla, translcidas, centro negro igual color del medio, centro negro igual color del medio, translcidas amarilla, ligeramente opacas

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CAPITULO V - PLANILLA DE RESULTADOS

PLANILLA 1 REGISTRO DE RESULTADOS: AISLAMIENTO DE SALMONELLA spp. MORFOLOGIA EN PLACAS DE AGAR SELECTIVO

Fecha: Nombre: Muestra: ____________ Color

Morfologa en MC Morfologa en SS Morfologa en XLD De Selenito: Morfologa en MC Morfologa en SS

Resultados

Comentarios

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PLANILLA 2 REGISTRO DE REDULTADOS: AISLAMIENTO DE SALMONELLA spp. PRUEBAS BIOQUIMICAS Fecha: Nombre: Muestra: Color
TSI Botn TSI Estra TSI Gas TSI H2S LIA Botn LIA Estra LIA H2S Hidrlisis de urea Lisina decarboxilasa Ornitina decarboxilasa Arnina dehidrolasa Reaccin de-galactosidasa Reaccin de Voges-Proskauer Reaccin de indol Agar SIM (H2S) Agar SIM (Indol) Agar SIM (Movilidad) Fermentacin de Dulcita Utilizacin del Molonato Resultado general: _______________________________________

Resultados

Comentarios

72

PLANILLA 3 REGISTRO DE RESULTADOS: SEROTIPIFICACION SOMATICA DE CEPAS DE SALMONELLA spp.

Fecha: Nombre: Muestra: ________________

OSA

OMB

OMC

OMD

OME

OMF

Control

OSA

1,2,12

4,5,12

9,12

9,46

3,10

3,15

1,3,19

21

OSB

6,7,8

6,7

6,8

13,22

13,23

6,14,24

6,14

8,20

11

OSC

16

17

18

28

30

OSD

35

38

39

40

41

42

43

44

45

OSE

47

48

50

51

52

OSF

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PLANILLA 4 REGISTRO DE RESULTADOS: SEROTIPIFICACION FLAGELAR DE CEPAS DE SALMONELLA spp.

Fecha: Nombre: Muestra: ______________

HSA HSB HSC HS1 Control

HSA

z10

Z29

HSB

e,h

e,n,x

e,n,z15

f.g

g,m

g,p

m,t

HSC

l,v

l,w

z4,z23

HS1

1,2

1,5

1,6

1,7

z6

HSA

HSB

HSC

HSD

HS1

Control

HSA

z10

z29

HSB

e,h

E,n,x

e,n,z15

f.g

g,m

g,p

m,t

HSC

l,v

l,w

z4,z23

HS1

1,2

1,5

1,6

1,7

z6

74

PLANILLA 5 REGISTRO DE RESULTADOS: SEROTIPIFICACION DE CEPAS DE SALMONELLA spp.

Fecha: Nombre: Muestra: ________________ Antgeno O A-67 A-I Gr. A Gr. B Gr. C Gr. D Gr. E

Gr. A

O:1

O:2

O:12

Gr. B

O:1

O:4

O:5

O:12

O:27

Gr. C

O:6

O:7

O:8

O:14

O:20

Gr. D

O:1

O:9

O:12

O:46

Gr. E

O:1

O:10

O:15

O:19

O:34

Antgeno H

H:H(a-z)

H:L

H:G

H: no especfico

H:L

H:lv

H:v

H:w

H:z13

H:z28

H:G

H:f

H:g

H:s

H:t

H:m

H:p

H:q

H: no especfico

H:2

H:5

H:6

H:7

H:z6

Gr. B

H:a

H:b

H:c

H:d

H:eh

H:i

Gr. C

H:a

H:b

H:c

H:eh

H:r

H:h

H:x

H:z15

H:z23

H:z24

H:z32

Frmula Antigncia: ___________________________ Serovariedad: _____________________

75

PLANILLA 6 REGISTRO DE RESULTADOS: SEROTIPIFICACION DE CEPAS DE SALMONELLA spp.

Fecha: Nombre:

Muestra: ________________

O:5

O:9

O:10

O:15

O:19

O:27

O:34

O:46

O:7

O:8

O:20

O:22

O:23

H:h

H:x

H:z15

H:m

H:p

H:s

H:t

H:f

H:q

H:u

H:v

H:w

H:z23

H:z24

H:z32

H:z13

H:z28

H:2

H:5

H:6

H:7

Frmula Antigncia: ___________________________ Serovariedad: _____________________

76