Relatrio da disciplina de Biologia Celular 2011/12 Faculdade de Cincias da Universidade do Porto

Influncia da concentrao inicial de etanol na fermentao alcolica de leveduras Saccharomyces cerevisae

Joana Marques1, Joo Oliveira2, Miguel Oliveira3, Sara Paulo4
1 3

joana.amc.marques@gmail.com, 2 johny_eduardex@hotmail.com, miguel_ferreira_oliveira@sapo.pt, 4 sara.lnp@gmail.com

Introduo
Uma grande variedade de organismos vivos pode utilizar vias metablicas fermentativas para produzir e obter energia (sob a forma de ATP). Estes processos ocorrem em meios anaerbios e provocam a degradao de glicose ou outros compostos orgnicos em molculas mais simples, obtendo energia. O tipo de produto resultante destes processos depende no s do tipo de organismo como tambm do ambiente em que esto inseridos. Consoante o principal produto obtido, podemos destacar dois tipos de fermentao: a fermentao lctica (produo de cido lctico), que ocorre, por exemplo, em organismos eucariontes e a fermentao alcolica (produo de etanol e libertao de CO2), como acontece nas leveduras e em algumas bactrias. No caso da fermentao alcolica, a partir da quebra de uma molcula de glicose em duas molculas de piruvato (gliclise), ocorre libertao de energia, sendo parte desta
conservada sob a forma de ATP e NADH. As molculas de piruvato sofrem ento

descarboxilao, libertando-se dixido de carbono, e de seguida reduo, originando etanol e levando oxidao de NADH a NAD+, que pode ser novamente utilizado na gliclise.[1] Equao geral da gliclise: Glucose + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi 2 Piruvato + 2 NADH + 2 H+ + 2 ATP + 2 H2O [1] Equao geral da fermentao alcolica: C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 [2]

Influncia da concentrao inicial de etanol na fermentao alcolica

Figura 1: Esquema representativo da fermentao alcolica. [3] As leveduras degradam a glicose em duas molculas de piruvato, durante a gliclise, ocorrendo a fosforilao de duas molculas de ADP em ATP e a reduo de duas molculas de NAD+ a NADH. Cada molcula de piruvato depois convertida, via acetaldedo, numa molcula de etanol e outra de dixido de carbono, ocorrendo a regenerao de NAD+ a partir da oxidao de NADH.

O mecanismo de fermentao alcolica um processo bastante importante para o Homem, pois tem diversas aplicaes no dia-a-dia e a nvel industrial, como o caso do fabrico de po e a produo de bebidas alcolicas. Conhecem-se vrios factores que podem limitar este processo, entre eles a temperatura, o tipo e a concentrao de substrato e a concentrao de etanol. Sabe-se que um ambiente com elevadas concentraes de etanol tem um impacto negativo na actividade da fermentao alcolica, quer pela inibio desta, quer pela sua toxicidade para as leveduras, pois ataca e interfere na estrutura lipdica das membranas. [4] Pretende-se ento estudar e determinar especificamente a forma como a variao da concentrao de etanol poder influenciar a actividade da fermentao alcolica em leveduras Saccharomyces cerevisae, presentes em fermento de padeiro.

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Material e Mtodos
Material Biolgico
Leveduras desidratadas Saccharomyces cerevisae, provenientes de Maizena.

Determinao da actividade da fermentao alcolica

A determinao da actividade de fermentao alcolica foi feita atravs da medio do volume de dixido de carbono (um dos produtos da reaco) libertado e acumulado dentro de cada tubo graduado (Figura 2). Para tal, procedeu-se pesagem da mesma quantidade de leveduras para cada um dos cinco tubos utilizados e sua ressuspenso numa pequena quantidade de gua. De seguida, foi adicionado, a cada tubo, uma soluo de Sacarose 20% (p/v) de forma a que a concentrao final de substrato fosse 2% e ainda diferentes volumes de Etanol 60% (p/v) a quatro dos cinco tubos, de forma a obter as seguintes concentraes de etanol em cada um: tubo 1 - 0%; tubo 2 - 6%; tubo 3 - 12%; tubo 4 - 18%; tubo 5 - 24%. Preencheram-se os tubos com gua, e inverteram-se, aps terem sido selados com parafilme, de forma a se misturar o substrato e as leveduras. Posteriormente, procedeu-se montagem dos tubos como esquematizado na Figura 2, depois de se ter retirado o parafilme do tubo graduado e se inverter cuidadosamente ambos os tubos. Incubaram-se os cinco tubos durante 45 minutos, a uma temperatura de 37o C. As condies experimentais de cada tubo so apresentadas na Tabela 1, em anexo.

Figura 2 Esquema da montagem dos tubos.[2] O aparato permite medir o volume de dixido de carbono libertado durante a fermentao alcolica que se acumulou no topo do tubo graduado invertido, contendo a levedura na presena de substrato.

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Resultados
Os resultados que obtivemos nesta experincia foram organizados no grfico seguinte:

Grfico 1 Variao do volume de CO2 libertado durante a fermentao alcolica em leveduras Saccharomyces cerevisae em funo da concentrao inicial de etanol. Tempo de incubao: 45 min.; Temperatura: 37oC; Substrato: Sacarose 2%. Nota: Todos os valores numricos so fornecidos na Tabela 2, em anexo. Atravs da observao do grfico, verifica-se que, no geral, a actividade da fermentao alcolica nas leveduras Saccharomyces cerevisae vai diminuindo medida que a concentrao inicial de etanol aumenta, ocorrendo uma diminuio abrupta da actividade da fermentao do tubo 2 para o tubo 3. Contudo, deu-se um ligeiro aumento do tubo 3 para o 4, voltando a decrescer do 4 para o 5 tubo.

Discusso
Na experincia realizada, seria de esperar que existisse uma produo de etanol cada vez mais baixa pelas leveduras medida que se usavam concentraes iniciais de etanol mais elevadas, por dois motivos: primeiro, porque o etanol apresenta um grau de toxicidade para as leveduras e segundo, porque sendo a fermentao fundamentalmente uma reaco qumica, obedece aos mesmos princpios e uma concentrao inicial do produto da reaco (neste caso, o etanol) diferente de zero, diminui necessariamente a quantidade formada desse mesmo produto.

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Assim, os resultados obtidos vo de encontro ao esperado. No tubo 2, existiu j um decrscimo significativo na produo de etanol em relao ao tubo de controlo (tubo 1) e, tanto no tubo 3 como no tubo 5, a produo foi praticamente nula. O valor obtido no tubo 4 inesperado dado que, sendo todas as condies iguais excepto a concentrao inicial de etanol, o valor partida, deveria ser mais baixo que no tubo 3. Este valor deve-se provavelmente a algum erro no decorrer da preparao do tubo, pelo que teria sido til repetir a experincia para comparar resultados e assim confirmar o erro. Para averiguar qual dos motivos inicialmente citados teria um papel mais relevante, seria interessante transferir as leveduras em questo, com os devidos procedimentos laboratoriais, para tubos com meio igual ao de controlo para averiguar se as leveduras foram mortas, se sofreram inibio por parte do etanol em algum tubo ou se o factor reaccional o mais preponderante. De qualquer forma, possvel concluir que uma concentrao inicial de etanol diferente de zero afectou negativamente o rendimento da fermentao alcolica.

Bibliografia
[1] Nelson DL & Cox MM, 2008. Glycolysis, Gluconeogenesis, and the Pentose Phosphate Pathway. In Lehninger Principles of Biochemistry, New York, USA: W.H. Freeman & Company, pp. 527-568 [2] Guia das aulas prticas Biologia Celular, FCUP, 2011/12 [3] Lodish H [et al.], 2004. Cellular Energetics. In Molecular Cell Biology, New York, USA: W.H. Freeman & Company, pp 301-351 [4] Pgina de Internet 1, 10/05/2012. Genome-Wide Identification of Saccharomyces cerevisiae Genes Required for Maximal Tolerance to Ethanol, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2747848/?tool=pmcentrez [5] Alberts B [et al.], 2008. Cell Chemistry and Biosynthesis. In Molecular Biology of The Cell, New York, USA: Garland Science, Taylor & Francis Group, pp. 45-124 [6] Pgina de Internet 2, 10/05/2012. Influence of the rate of ethanol production and accumulation on the viability of Saccharomyces cerevisiae in "rapid fermentation, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC169741/ [7] Pgina de Internet 3, 08/05/2012. Glycolysis and Alcoholic Fermentation,

http://www.icr.org/article/glycolysis-alcoholic-fermentation/

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Anexos

Tubos 1 (controlo) 2 3 4 5

[Etanol] (%) 0 6 12 18 24

Vol. Etanol (ml) 0 1,7 3,4 5,1 6,8

Vol. H2O (ml) 15,3 13,6 11,9 10,2 8,5

Vol. Sol. Sacarose 20% (ml) 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7

Leveduras (g) 0,12 0,12 0,12 0,12 0,12

Tabela 1 Composio dos tubos utilizados na experincia. Tempo de incubao: 45 min.; Temperatura: 37oC; Substrato: Sacarose 2%.

Tubos 1 (controlo) 2 3 4 5

[Etanol] (%) 0 6 12 18 24

Vol. Inicial (ml) 1,2 1,4 1,9 1,0 1,7

Vol. Final (ml) 4,0 3,3 2,1 1,7 2,0

CO2 libertado (ml) 2,8 1,9 0,2 0,7 0,3

Tabela 2 Influncia da concentrao inicial de etanol na fermentao alcolica em leveduras Saccharomyces cerevisae. Tempo de incubao: 45 min.; Temperatura: 37oC; Substrato: Sacarose 2%.

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