Universidade Estadual de Campinas Instituto de Qumica Laboratrio ThoMSon de Espectrometria de Massas

Caracterizao de Matrias-Primas e Produtos Derivados de Origem Graxa por Espectrometria de Massas

Dissertao de Mestrado

Aluno: Sergio Adriano Saraiva Orientador: Prof. Dr. Marcos Nogueira Eberlin

Campinas 2008
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No basta ensinar ao homem apenas uma especialidade, porque ele se tornar assim, uma mquina utilizvel e no uma personalidade. necessrio que ele adquira um sentimento, um senso prtico daquilo que vale a pena ser empreendido, daquilo que belo, do que correto. Albert Einstein.

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Agradecimentos Agradeo a Deus, sempre presente na minha vida, iluminando e me orientando, pela realizao deste trabalho. Aos meus pais e irmos, pelo carinho e estmulo. Ao professor Marcos Eberlin, pela orientao, confiana, ensinamentos e contribuio ao meu desenvolvimento pessoal. A minha famlia, que mesmo de longe, sempre me incentivou. A todos do grupo ThoMSon que direta ou indiretamente me ajudaram ao longo desta caminhada (um agradecimento especial a Dra. Regina Sparrapan) . Ao professor e amigo Rodrigo Catharino, pela co-orientao informal, alm dos momentos de descontrao e amizade. Ao Grupo IP2H/TTH A.G, pelo suporte e apoio, representado por Jrg Arnold, Adrian Dilo e Shiro Sonoda. Ao pessoal da CPG, pela prestatividade e ateno com que sempre me tratararam. Ao Instituto de Qumica da UNICAMP, pela infra-estrutura oferecida. s empresas Naturais da Amaznia, Crodamazon, Beraca-Sabara Ingredientes e Campestre leos (gentilmente forneceram as amostras de leos e gorduras vegetais amaznicos). Ao George, que me ajudou a decifrar o mundo dos amaciantes. Aos amigos, que estiveram comigo em todos os momentos. A todos, muito obrigado !

Curriculum Vitae Srgio Adriano Saraiva Informaes Pessoais: Nascimento: 18/10/1977 em So Paulo-SP. Residncia: Rua Amrico Brasiliense no 65, apt. 51, So Vicente - SP E-mail: sergio_saraiva01@yahoo.com.br Formao Acadmica: Instituio: Instituto de Qumica da USP. Curso: graduao em Bacharelado de Qumica com Atribuies Industriais e Biotecnolgicas. Concluso do curso: dezembro/1999. Qualificaes Pessoais: Idiomas: Ingls (nvel avanado). Espanhol (nvel bsico). Alemo (nvel bsico). Prmio Lavoisier: concedido pelo Conselho Regional de Qumica-IV Regio (1999), por melhor desempenho acadmico durante graduao (1995-1999). Experincia Profissional TTH (Technologien & Transfer Helvetia) Mitsubishi International (Alemanha). Perodo: de abril/2005 a dezembro/2007. Cargo: Pesquisador. rea: Desenvolvimento de novos produtos e processos. Oxiteno Indstria e Comrcio S.A. Perodo: de julho/2001 a fevereiro/2005. Cargo: Qumico Pleno. rea: Pesquisa e desenvolvimento de mtodos analticos por cromatografia lquida e gasosa; apoio analtico a projetos de pesquisa e assistncia tcnica a clientes. Fundao de Desenvolvimento da Unicamp FUNCAMP.

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Perodo: de julho/2000 a junho/2001. Cargo: Qumico Jr. rea: Identificao e caracterizao de diferentes produtos, atravs de anlises qumicas, testes fsico-qumicos e testes de aplicao. Instituto de Qumica da USP Perodo: julho/1997 a dezembro/1998. Cargo: Estagirio rea: Sntese e estudo das propriedades de compostos quimiluminescentes; Participaes em Congressos 56 Congresso da Sociedade Americana de Espectrometria de Massas, Denver, 2008. 2 Congresso Brasileiro de Espectrometria de Massas, Campinas, 2007. XXX Congresso da Sociedade Brasileira de Qumica, guas de Lindia, 2007. 1 Congresso Brasileiro de Espectrometria de Massas, Campinas, 2005. 1 Simpsio Internacional de Iniciao Cientfica da USP, So Paulo, 1999. XXI Congresso da Sociedade Brasileira de Qumica, Poos de Caldas, 1998. 6 Simpsio de Iniciao Cientfica da USP, So Paulo, 1998. Artigos Publicados Saraiva S.A., Catharino R.R., Abdelnur P.V., Nunes G., Eberlin M.N., Rapid Comm. Mass Spectrom. (in press) Saraiva S.A., Catharino R.R., Cabral E.C., Eberlin M.N. J. Agricultural and Food Chem. (submetido) Saraiva S.A., Milagre H.M.S., Catharino R.R., Garcia C.M., Schuchardt U., Eberlin M.N., et. al. Energy & Fuels, 2007, 21, p. 3698-3791. Coichev N., Saraiva S.A., Nakamura M.M., Analytical Letters, 2000, 33, p.391-404. Coichev N., Saraiva S.A., Nakamura M.M., Analytical Letters, 1999, 32, p.24712487.

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RESUMO CARACTERIZAO DE MATRIAS-PRIMAS E PRODUTOS DERIVADOS DE ORIGEM GRAXA POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS. As matrias-primas graxas (leos e gorduras vegetais e animais) e os produtos sintetizados a partir destes insumos so misturas complexas, com aplicaes e valores agregados variados. As tcnicas disponveis para caracterizar a composio graxa destas matrizes so muitas vezes restritas, exigindo a necessidade de procedimentos laboriosos. Este trabalho engloba a aplicao de tcnicas avanadas de espectrometria de massas (MALDI-MS e ESI-MS) na caracterizao de leos e gorduras vegetais amaznicos (matrias-primas graxas) e surfactantes catinicos (produtos sintetizados a partir de matria-prima graxa), sem o emprego de processos de derivatizao qumica ou separao cromatogrfica. Espectrometria de massas com ionizao por MALDI (MALDI-MS) foi empregada na anlise dos leos de andiroba (Carapa guianensis), castanha do Par (Bertholletia excelsa), maracuj (Passiflora spp.), buriti (Mauritia flexuosa) e das gorduras das sementes de cupuau (Theobroma grandiflorum), murumuru (Astrocaryum murumuru) e ucuba (Virola sebifera), que foram caracterizados atravs da composio dos triglicerdeos (TAGs). Obtiveram-se perfis distintos de TAGs para cada leo e gordura amaznico. Conseqentemente, a tcnica se mostrou adequada para tipificao dos leos e gorduras estudados, podendo ser adotada como um mtodo rpido e confivel para controle de qualidade destas importantes matrias-primas amaznicas. Em relao aos surfactantes catinicos, foi desenvolvido um procedimento simples e rpido para identificao e caracterizao destas molculas (incluindo a distribuio de homlogos) em produtos amaciantes txteis por espectrometria de massas com ionizao por electrospray (ESI-MS). medida que diferentes surfactantes catinicos podem ser utilizados em amaciantes txteis, a tcnica empregada permite identificar o tensoativo que foi adotado na formulao do produto, sem emprego de padres de referncias. Tambm possvel verificar casos de falsificao e utilizao de molculas catinicas que conferem propriedades amaciantes inferiores.

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ABSTRACT CHARACTERIZATION OF RAW MATERIALS AND MANUFACTURATED PRODUCTS FROM FATTY SOURCES BY MASS SPECTROMETRY. Fatty raw materials (animal, vegetable oils and fats) and synthesized products from these sources are complex mixtures with diverse applications and added values. Available techniques to characterize the fatty composition of these matrixes are many times restricted and require laborious procedures. This work reports the application of advanced mass spectrometry techniques (MALDI-MS and ESI-MS), without employment of chemical derivatization or chromatographic separation, for characterizing Amazonian rain forest fats and oils (fatty raw materials) and cationic surfactants (products made from fatty raw materials). MALDI-mass spectrometry (MALDI-MS) was applied to characterize the triacylglycerol composition from oils of Andiroba (Carapa guianensis), Brazil Nut (Bertholletia excelsa), Passion Fruit (Passiflora spp.), Buriti (Mauritia flexuosa) and fats from seeds of Cupuau (Theobroma grandiflorum), Murumuru (Astrocaryum murumuru) and Ucuba (Virola sebifera). Characteristic profiles of triacylglycerols (TAG) were obtained for each oil and fat, confirming that the technique is appropriated for the typification of studied samples and can be applied as a reliable and fast method to quality control of these important Amazonian rain forest raw materials. With regard to cationic surfactants, a simple and fast procedure was developed to identify and characterize these molecules (including the homologue distribution) in liquid fabric softeners by electrospray-mass spectrometry (ESI-MS). As different cationic surfactants can be used in fabric softeners, the applied technique allows the identification of the specific tensoative adopted in every formulation, without using reference standards. Also, it is possible to check counterfeit samples and use of some cationic surfactants that confer lower softness.

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NDICE LISTA DE ABREVIATURAS..................................................................................XII LISTA DE TABELAS.............................................................................................XIII LISTA DE FIGURAS.............................................................................................XIV CAPTULO 1 INTRODUO GERAL.................................................................01 1.1. leos, Gorduras e Produtos Sintetizados a partir destas Matrias-Primas.....02 1.2. Espectrometria de Massas..............................................................................05 1.2.1. Espectrometria de Massas com ionizao por electrospray.......................07 1.2.2. Espectrometria de Massas com ionizao por MALDI.................................08 CAPTULO 2 CARACTERIZAO E TIPIFICAO DE LEOS E GORDURAS VEGETAIS AMAZNICOS POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS MALDI-TOF............................................................................................................11 1. INTRODUO....................................................................................................12 1.1. Importncia dos leos e Gorduras Vegetais Amaznicos..............................12 1.2. Mtodos Empregados na Caracterizao de leos e Gorduras.....................14 2. MATERIAIS E MTODO....................................................................................16 2.1. Reagentes e Amostras....................................................................................16 2.2. Procedimento Experimental.............................................................................16 3. RESULTADOS E DISCUSSO..........................................................................18 3.1. Aspectos Gerais..............................................................................................18 3.2. Caracterizao dos leos Vegetais................................................................23 3.3. Caracterizao das Gorduras Vegetais...........................................................25 3.4. Anlise Exploratria dos Dados.......................................................................29 4. CONCLUSO.....................................................................................................31

CAPTULO 3 CARACTERIZAO DE SURFACTANTES CATINICOS EM PRODUTOS AMACIANTES TXTEIS POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS COM IONIZAO POR ELECTROSPRAY (ESI-MS)...........................................32 1. INTRODUO....................................................................................................33 1.1. Utilizao e Mecanismo de Ao dos Amaciantes..........................................35 1.2. Sais Quaternrios de Amnio com Propriedades Amaciantes........................36 1.3. Composio dos Amaciantes de Roupas........................................................39 1.4. Identificao e Caracterizao de Surfactantes Catinicos.............................41 2. MATERIAIS E MTODO....................................................................................43 2.1. Reagentes e Amostras....................................................................................43 2.2. Procedimento Experimental.............................................................................43 3. RESULTADOS E DISCUSSO..........................................................................45 3.1. Produtos Amaciantes de Baixa Qualidade ou Falsificados.............................52 4. CONCLUSO......................................................................................................56 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS........................................................................57

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Lista de Abreviaturas
ABIPLA CID DHB DHTDMAC ESI-MS ESI-MS/MS FID FIPE GC GC-FID GC-MS HPLC MALDI MS PC PCA QUACs TAGs TOF Associao Brasileira de Produtos de Limpeza e Afins Dissociao induzida por coliso cido 2.5 di-hidrxi benzico Cloreto de di-alquil di-metil amnio Espectrometria de massas com ionizao por electropray Ionizao por electropray acoplado a espectrometria de massas seqencial Detector de ionizao de chama Fundao Instituto de Pesquisas Econmicas Cromatografia gasosa Cromatografia gasosa acoplada ao detector de ionizao de chama Cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas Cromatografia lquida de alta eficincia Ionizao/dessoro a laser assistida por matriz Espectrometria de massas Componentes principais Anlise por Componentes Principais Sais quaternrios de amnio Triglicerdeos Analisador de massas por tempo de vo

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Lista de Tabelas
CAPTULO 2 Tabela 1. Atribuio e abundncias relativas dos principais ons observados nos espectros de massas MALDI-TOF dos leos e gorduras amaznicos...................21 CAPTULO 3 Tabela 1. Consumo mundial de amaciantes...........................................................33 Tabela 2. Consumo e informalidade no mercado de domissanitrios brasileiro....34 Tabela 3. Identificao dos ons da amostra de amaciante contendo

DHTDMAC..............................................................................................................46 Tabela 4. Identificao dos ons das amostras de amaciante contendo esterquat.................................................................................................................48 Tabela 5. Identificao dos ons da amostra de amaciante contendo di-alquil imidazolnio.............................................................................................................49

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Lista de Figuras
CAPTULO 1 Figura 1. Produo e uso mundial de leos e gorduras em 2002 (quantidades expressas em milhes de toneladas).......................................................................3 Figura 2. Exemplo de uma molcula de triglicerdeo (TAG), derivado da reao do glicerol com trs molculas de cido dodecanico....................................................3 Figura 3. Esquema simplificado de uma fonte de ionizao por electrospray..........7 Figura 4. Esquema geral de um espectrmetro de massas MALDI-TOF...............10 CAPTULO 2 Figura 1. Espectro de massas por MALDI-TOF do leo de castanha do Par.......19 Figura 2. Mecanismo de fragmentao proposto para uma molcula de triacilglicerdeo protonada.......................................................................................20 Figura 3. Espectros de massas por MALDI-TOF dos leos vegetais

amaznicos.............................................................................................................23 Figura 4. Espectro de massas por MALDI-TOF das gorduras vegetais amaznicas.............................................................................................................25 Figura 5. Espectros de massas MALDI-TOF das gorduras vegetais amaznicas: A) murumuru (in natura) B) murumuru (dopada com LiCl) C) cupuau (in natura) D) cupuau (dopada com LiCl)................................................................................27

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Figura 6. Espectro de massas MALDI-TOF da gordura de cupuau: A) in natura B) com adio de cloreto de ltio..................................................................................28 Figura 7. PCA dos dados de MALDI-TOF MS dos leos (Buriti, Castanha do Par, Maracuj) e da gordura de Cupuau .....................................................................30 CAPTULO 3 Figura 1. Micrografia eletrnica das fibras de uma toalha de algodo: (a) com uso de amaciante de roupas (b) sem amaciante de roupas..........................................35 Figura 2. Principais quaternrios de amnio utilizados em amaciantes de roupas; A) Di-alquil dimetil amnio B) Di-alquil imidazolina C) Di-amida amina etoxilada quaternizada D) Esterquat. R1 e R2 = cadeias alqulicas graxas............................37 Figura 3. Reao de eliminao de Hoffman para um QUAC................................41 Figura 4. Esquema do espectrmetro de massas Q-TOF Micromass....................43 Figura 5. ESI(+)-MS de amaciantes de roupa formulados com A) di-alquil dimetil amnio B) esterquat de sebo hidrogenado C) esterquat de sebo D) di-alquil imidazolina;. R1 e R2 = cadeias alqulicas graxas...................................................45 Figura 6. Rota sinttica para obteno do cloreto de di-estearil dimetil amnio....47 Figura 7. ESI(+)-MS/MS de ons dos surfactantes: A) di-alquil dimetil amnio (m/z 522) B) esterquat (m/z 640) C) di-alquil imidazolnio (m/z 628)..............................50 Figura 8. ESI(+)-MS de amaciantes de roupa formulados com monoalquil trimetil amnio. Grupos alquilas: C16= cadeia cetlica; C18= cadeia esterica; C18:1= cadeia oleica...........................................................................................................52

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Figura 9. ESI(+)-MS de um amaciante de roupa falsificado formulado com alquil amida propil dimetil benzil amnio e alquil amida propil dimetil amina......................................................................................................................53 Figura 10. ESI(+)-MS/MS dos surfactantes A) Octadecilamida propil dimetil amnio (m/z 459) B) Octadecilamida propil dimetil amina (m/z 369) detectados no amaciante falsificado..............................................................................................55

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CAPTULO 1:

INTRODUO GERAL

1. Introduo Geral
O primeiro captulo desta dissertao de mestrado descreve conceitos bsicos sobre oleoqumica, e tambm sobre as tcnicas de espectrometria de massas utilizadas para caracterizar os materiais avaliados neste trabalho, que aborda a caracterizao de leos e gorduras vegetais amaznicos (captulo 2) e surfactantes catinicos que so manufaturados a partir de fontes graxas (captulo 3).

1.1. leos, Gorduras e Produtos Sintetizados a partir destas Matrias-primas

leos e gorduras so extrados a partir de diferentes fontes vegetais, (como soja, canola, girassol, palma) e animais (como banha, sebo, etc). Em 2002, foram produzidas quase 120 milhes de toneladas de leos e gorduras, sendo que a maior parte (81,7%) foi destinada para a nutrio humana (Figura 1).1 leos e gorduras tm um papel fundamental na alimentao humana, pois alm de fornecerem calorias, agem como veculo para as vitaminas lipossolveis, como A, D, E e K, so fontes de cidos graxos essenciais como o linoleico, linolnico, araquidnico e contribuem para o sabor dos alimentos.2 Eles tambm so utilizados como matrias-primas em diferentes aplicaes industriais na produo de lubrificantes, biodiesel, plasticidas, surfactantes, etc.3

Figura 1. Produo e uso mundial de leos e gorduras em 2002 (quantidades expressas em milhes de toneladas).1 leos e gorduras so constitudos principalmente por uma mistura complexa de triglicerdeos (aproximadamente 95-98%), que atuam como fonte de reserva energtica para animais e plantas. Os leos tambm atuam como solvente para os demais componentes minoritrios como esteris, vitaminas lipossolveis (principalmente diglicerdios.4 Os triglicerdeos so steres formados a partir da reao do glicerol com trs unidades de cidos graxos, como mostra o exemplo na Figura 2. tocoferis/tocotrienis), pigmentos incluindo clorofila e carotenides, compostos fenlicos, fosfolipdios, cidos graxos livres e mono-e

Figura 2. Exemplo de uma molcula de triglicerdeo (TAG), derivado da reao do glicerol com trs molculas de cido dodecanico.

De acordo com o leo ou gordura, os cidos graxos que originam as molculas de TAGs variam, normalmente, de quatro a vinte e quatro tomos de carbono, e na maioria das vezes, so lineares e possuem nmero par de carbonos. Os leos so lquidos temperatura ambiente, pois possuem principalmente TAGs derivados de cidos graxos insaturados que diminuem o ponto de fuso, enquanto as gorduras esto no estado slido, devido a maior presena de TAGs com cadeias graxas saturadas. 5 Do ponto de vista qumico, a hidrlise dos TAGs permite a obteno de glicerol e cidos graxos, importantes intermedirios na indstria oleoqumica; outros intermedirios obtidos a partir de cidos graxos so steres metlicos, alcois e amidas graxas.6 O uso de leos e gorduras em aplicaes no-comestveis tem crescido nos ltimos anos, pois representam uma fonte de cidos graxos, que por serem matrias-primas renovveis, substituem intermedirios de origem petroqumica em snteses industriais. Cada tipo de leo e gordura possui uma composio de cidos graxos, que determina qual tipo de produto pode ser manufaturado a partir destas matrias-primas graxas. Por exemplo, leos e gorduras, abundantes em triglicerdeos derivados dos cidos lurico e mirstico, so utilizados na produo de detergentes, como os sais de lauril sulfato.3 Dentre os produtos que podem ser manufaturados a partir de matriasprimas graxas, um destaque dever ser dado aos surfactantes, pois cerca de 90% dos intermedirios oleoqumicos so usados na produo de molculas tensoativas O consumo estimado de surfactantes foi de 7,14 milhes de toneladas nos mercados europeu, japons e norte-americano em 2000.1 Os surfactantes so molculas anfiflicas constitudas de uma poro hidrofbica e uma poro hidroflica. A poro apolar freqentemente uma cadeia alqulica, enquanto a poro polar pode ser inica (aninica ou catinica), no-inica ou anftera. O tamanho da cadeia alqulica (poro apolar) determina o carter hidrofbico da molcula. Alguns exemplos de surfactantes inicos

utilizados comercialmente incluem alcois graxos sulfatados (aninicos) e sais de amnio quaternrio (catinicos).6,7 Em funo da presena de grupos hidroflicos e hidrofbicos na mesma molcula, os surfactantes tendem a se distribuir nas interfaces entre fases fluidas com diferentes graus de polaridade (leo/gua e gua/leo). A formao de um filme molecular, ordenado nas interfaces, reduz a tenso interfacial e superficial, sendo responsvel industriais pelas propriedades nicas dos surfactantes. Estas propriedades fazem os surfactantes serem adequados para uma ampla gama de aplicaes envolvendo: detergncia, emulsificao, lubrificao, solubilizao e disperso de fases. A maior utilizao dos surfactantes se concentra na indstria de produtos de limpeza (sabes e detergentes), na indstria de petrleo, na indstria alimentcia e na indstria de cosmticos e produtos de higiene.3,7

1.2. Espectrometria de massas

A espectrometria de massas uma ferramenta analtica utilizada para a medida da massa molecular de substncias qumicas (que devem estar eletricamente carregadas). Permite tambm identificar, quantificar e elucidar as propriedades estruturais de molculas e atualmente uma tcnica indispensvel em diferentes reas, como qumica, biologia, cincias mdicas, tecnolgicas e inmeras outras. O princpio bsico da espectrometria de massas consiste em gerar ons a partir de compostos (orgnicos ou inorgnicos) atravs de um mtodo de ionizao apropriado, separ-los atravs de sua relao massa-carga (m/z) em um analisador de massas, e detectar quali e/ou quantitativamente os compostos a partir da relao massa-carga dos ons (m/z) e suas respectivas abundncias por meio de um detector, que conta os ons e transforma o sinal em corrente eltrica. A magnitude do sinal eltrico em funo da relao m/z convertida por um processador de dados, que gera o espectro de massas correspondente.8

Inicialmente, a aplicao da espectrometria de massas era restrita a anlise de gases, substncias volteis e termicamente estveis, pois as primeiras tcnicas de ionizao empregadas (impacto de eltrons e qumica) so processos constitudos por duas etapas, nas quais o analito vaporizado com aquecimento e a ionizao ocorre uma vez que a molcula esteja na fase gasosa.9 O desenvolvimento de novas tcnicas de ionizao foi uma mudana fundamental, pois permitiu a produo de ons a partir de compostos de alta massa molecular e no volteis. Destacam-se a partir da dcada de 80, o aparecimento das tcnicas de ionizao ESI (Ionizao por electrospray)10-12 e MALDI (Ionizao/Dessoro a laser assistida por matriz)13 que estenderam a espectrometria de massas quase todos os tipos de molculas. Nestas tcnicas de ionizao, ons so obtidos atravs da protonao ou desprotonao, ou ainda pela adio de outros ons, como Na+, K+, NH4+ e Cl-, formando adutos. As espcies observadas so chamadas protonadas [M+H]+, desprotonadas [M-H]- ou de ons adutos de sdio [M+Na]+ ou potssio [M+K]+ por exemplo.14 Enquanto na ionizao por eltrons, formam-se ons com energia interna elevada, que se fragmentam e fornecem informaes sobre caractersticas estruturais das molculas, ESI e MALDI so tcnicas brandas de ionizao, que formam ons com baixa energia interna, permitindo a observao do on molecular, entretanto com muito pouca ou nenhuma fragmentao. Esta ausncia de informao estrutural impulsionou o desenvolvimento de tcnicas de fragmentao induzidas, e com isso surgiu a espectrometria de massas tandem ou sequencial (MS/MS), onde geralmente os fragmentos so gerados por dissociao induzida por coliso (CID), ou seja, pela coliso do on gerado na fonte de ionizao com uma molcula de gs (tipicamente argnio) em uma cmara de coliso. Alm destes desenvolvimentos, outro impulso para a espectrometria de massas foi a possibilidade de acoplamento com tcnicas de separao como cromatografia lquida, gasosa e eletroforese capilar.

1.2.1. Espectrometria de massas com ionizao por electrospray (ESI-MS)

A ionizao por ESI realizada sob presso atmosfrica e utilizada para a anlise de molculas polares com massa molecular entre 100 e 105 u. importante que a molcula a ser analisada tenha um stio cido ou bsico para que ela adquira carga. No modo positivo de ionizao, adiciona-se freqentemente cido frmico para protonar as molculas, conferindo a elas uma carga positiva, enquanto no modo negativo, utiliza-se hidrxido de amnio para desproton-las. Uma caracterstica da tcnica de ESI, que molculas at

aproximadamente 1000 u so observadas na sua forma mono-carregadas. ons multi-carregados so detectados em molculas com massas moleculares maiores. A Figura 3 ilustra o esquema simplificado de uma fonte de ESI, onde ons so gerados e transferidos para a fase gasosa a partir de uma soluo da amostra proveniente de uma bomba seringa ou de um sistema HPLC (fluxo entre 520 L.min-1).

Figura 3. Esquema simplificado de uma fonte de ionizao por electrospray.15

Esta soluo nebulizada atravs de um capilar de pequeno dimetro, no qual uma tenso eltrica elevada aplicada (2-4 kV), produzindo um campo eltrico suficientemente forte para dispersar a soluo emergente em um fino spray de gotas carregadas eletricamente com auxilio de gs nitrognio. As gotas dotadas de carga eltrica se movem em direo ao contra-eletrodo (tambm denominado cone) e durante esta etapa, a evaporao do solvente reduz o tamanho das gotas at que elas fiquem com excesso de carga, e devido a foras de repulso, ocorre a fisso da gota em gotculas menores. Neste processo empregado o fluxo de gs aquecido tipicamente nitrognio para auxiliar a evaporao do solvente. O ciclo de evaporao e fisso das gotas se repete at que se tenha a on completamente dessolvatado. Os ons so transferidos da regio de presso atmosfrica para a regio de vcuo do analisador de massas via uma regio de transporte intermediria a baixa presso, que consiste de duas ou mais cmaras dotadas de bombas de vcuo. As fontes de ESI so oferecidas em combinao com todos os tipos de analisadores de massas. Os filtros de massas do tipo quadrupolo tm sido os analisadores mais empregados na maioria dos trabalhos que utilizam ESI-MS. A combinao adotada se deve ao fato de que os quadrupolos tm um custo menor, so fceis de usar, capazes de prover excelente exatido de massa, alm de serem relativamente fceis de acoplar com fontes em alta presso. Eles apresentam como desvantagem, uma faixa de varredura de massas limitada (m/z 10 at m/z 2000).16

1.2.2. Espectrometria de massas com ionizao MALDI

A tcnica de ionizao/dessoro a laser assistida por matriz, usualmente chamada de MALDI foi descrita por Karas e Hillenkamp
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em 1988. Nesta tcnica,

a amostra contendo a espcie de interesse e uma matriz (composto necessrio para a ionizao da amostra) so solubilizadas em solvente orgnico e/ou gua e uma pequena quantidade de cada soluo (normalmente 1L) depositada sobre

uma placa. Com a evaporao do solvente, a matriz cristaliza e as molculas da amostra se encontram inclusas nestes cristais. A matriz utilizada (geralmente cidos orgnicos aromticos) deve absorver no comprimento de onda utilizado no experimento. Deste modo, um pulso de laser, com comprimento de onda na regio do ultravioleta, incide sobre essa mistura e a energia do laser absorvida pela matriz, o que promove a sua sublimao. As molculas do analito, que estavam inclusas na matriz, so arrastadas para a fase gasosa e a formao dos ons ocorre atravs da transferncia de carga (ex: transferncia de prtons) das molculas da matriz para o composto analisado que detectado na forma protonada [M+H]+. Observaes similares so feitas para ons quasi-moleculares gerados por cationizao, como por exemplo, os adutos do tipo [M+metal alcalino]+, no caso de analitos ricos em oxignio. Na maioria dos casos, se formam espcies mono-carregadas.8 Em grande parte das aplicaes, a tcnica de MALDI est acoplada com analisadores de massas do tipo tubo de vo, denominados TOF (time-of-flight), conforme mostrado na Figura 4. Os ons formados e dessorvidos durante o pulso de laser so continuamente extrados e acelerados em direo ao analisador de massas (tubo de vo) por um campo eltrico (tipicamente entre 10-30 kV)8 aplicado entre a placa de amostragem e a grade de acelerao. Quando deixam esta regio de acelerao, os ons de diferentes m/z so separados de acordo com o seu tempo de vo em um tubo, cujo caminho percorrido tem comprimento conhecido. Sob a condio que todos os ons iniciaram a sua jornada ao mesmo tempo ou no mnimo, dentro de um intervalo de tempo suficientemente curto, os ons mais leves chegaro mais rapidamente ao detector do que os mais pesados, uma vez que a energia cintica das espcies ionizadas a teoricamente a mesma.

Laser Placa de Amostras Detector modo reflectron Reflectron Detector modo linear

Sistema de vcuo

Figura 4. Esquema geral de um espectrmetro de massas MALDI-TOF.

O analisador TOF pode operar em dois modos: linear e reflectron. O modo linear utilizado para molculas de massa molecular elevada, como as protenas, peptdeos e polmeros e o modo reflectron para molculas de massa de at aproximadamente 5000 u. O reflectron um espelho eletrosttico composto por uma srie de lentes com diferena de potencial crescente e utilizado para corrigir disperses de energia e posio dos ons formados que ocorrem no campo de acelerao do TOF. Essas disperses resultam numa falta de homogeneidade de energia cintica, de maneira que ons com mesma relao massa/carga tenham energias iniciais diferentes. Deste modo, aps atravessarem a primeira regio do tubo de vo, os ons penetram na regio do reflectron e so desacelerados at atingirem energia cintica nula, quando so expelidos em direo oposta. Os ons com excesso de energia cintica penetram mais no campo eltrico de desacelerao e gastam mais tempo na regio do reflectron do que os ons com menos energia. O emprego do reflectron promove uma correo no tempo de vo, de modo que os ons com mesma relao massa/carga (m/z) cheguem simultaneamente no detector e acarreta no aumento de resoluo.

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CAPTULO 2:

Caracterizao e Tipificao de leos e Gorduras Vegetais Amaznicos por Espectrometria de Massas MALDI-TOF

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1. Introduo 1.1. Importncia dos leos e Gorduras Vegetais Amaznicos

A busca por alternativas que garantam o desenvolvimento sustentvel , sem dvida, uma das grandes preocupaes atuais, tornando mais freqentes os questionamentos sobre as possibilidades de substituio de tecnologias baseadas em fontes esgotveis e que exeram impacto sobre o meio ambiente. Neste contexto, a biodiversidade tem sido cada vez mais reconhecida como um dos elementos centrais para o desenvolvimento e bem-estar da humanidade e grande responsvel pelo equilbrio ambiental global. Com uma das maiores reas de biodiversidades do mundo, a floresta Amaznica (que ocupa uma rea aproximada de 3,6 milhes de km2 no territrio brasileiro) abriga uma das mais ricas variedades de espcies animais e vegetais. A floresta representa 23% da biodiversidade global e contm 70% de todas as espcies de fauna e flora presentes em florestas tropicais de todo o mundo.17,18 A Amaznia, como floresta tropical, apresenta-se como um ecossistema extremamente complexo e delicado. Todos os elementos (clima, solo, fauna e flora) esto estreitamente relacionados, de modo que no se pode considerar nenhum deles como principal. A busca de alternativas, que promovam a preservao e o uso sustentvel deste patrimnio natural, do interesse do Brasil e da humanidade. Um bom exemplo consiste na criao e no fortalecimento de diferentes modelos de unidades de conservao, dentre as quais se incluem as reservas extrativistas para a explorao de produtos florestais no madeireiros (em geral frutos comestveis, leos, ltex, fibras e plantas medicinais) que servem de matria-prima para vrias indstrias.19 Dentre os produtos florestais no madeireiros, as espcies oleaginosas amaznicas apresentam grande potencial para explorao econmica, principalmente por serem abundantes e renovveis, desde que manejadas e processadas racionalmente.

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Andiroba (Carapa guianensis), babau (Orbignya oleifera), buriti (Mauritia flexuosa), castanha do Par (Bertholletia excelsa), cupuau (Theobroma grandiflorum), murumuru (Astrocaryum murumuru), pracaxi (Pentaclethra spp.), tucum (Astrocaryum tucuma), ucuba (Virola spp.) e urucum (Bixa orellana) so exemplos representativos de muitas das espcies vegetais amaznicas de importncia econmica, devido extrao de leo ou gordura da semente ou polpa que apresentam diversas aplicaes, sendo as mais importantes encontradas nos setores alimentcio, farmacutico e cosmtico. 20-22 Um destaque deve ser dado a indstria cosmtica que aderiu a tendncia de utilizao de produtos naturais e estabeleceu como metas: 20 Substituio dos cosmticos de base sinttica por produtos naturais; Reduo de matrias-primas oriundas de recursos naturais no renovveis por renovveis; Substituio de leos graxos de origem animal por aqueles de origem vegetal. Estas exigncias vm principalmente dos consumidores dos pases mais desenvolvidos, como Alemanha, Japo e EUA e aos poucos vem sendo adotada no Brasil. Quando so avaliadas as opes de leos provenientes da flora amaznica, os benefcios vo alm do forte apelo de marketing e da oportunidade de preservar o meio ambiente. Nesta rea existe a necessidade de transformar o conhecimento popular dos povos nativos da Amaznia em conhecimento cientfico, e neste sentido, atravs de estudos recentes,23 vem-se comprovando benefcios de alguns leos vegetais tornando-os excelentes ativos e auxiliares nas formulaes cosmticas. Contudo necessrio conhecer as propriedades e composio dos leos e gorduras vegetais amaznicos para o desenvolvimento de novos produtos, alm de estabelecer protocolos de controle a fim de garantir um padro de qualidade.

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Por se tratarem de matrias prima de origem natural, importante que haja um controle de qualidade rigoroso realizado por meio de tcnicas analticas modernas, como a espectrometria de massas, para avaliar a constncia e uniformidade na composio, garantindo a padronizao do material vegetal em escala industrial, podendo ainda auxiliar no reconhecimento e na compreenso dessas variaes, ampliando os conhecimentos sobre interaes ecolgicas do vegetal com seu ambiente.24

1.2. Mtodos Empregados na Caracterizao de leos e Gorduras

Determinar a composio da mistura de triglicerdeos uma tarefa complexa, devido variedade de cidos graxos, que diferem quanto ao tamanho da cadeia graxa e grau de insaturao, bem como a distribuio destes na estrutura do glicerol. Cromatografia gasosa (GC) com detector de ionizao de chama (FID)25-26 ou acoplada a um espectrmetro de massas (GC-MS)27 a tcnica mais utilizada para caracterizar leos e gorduras, atravs da determinao da composio de cidos graxos. Neste procedimento, as amostras devem ser hidrolisadas (saponificao dos leos e gorduras) em meio alcalino, e os cidos graxos so extrados da frao insaponificvel. Estes cidos so transformados em steres metlicos (espcies mais volteis), atravs de uma reao de derivatizao com metanol, para poderem ser injetados e separados em uma coluna cromatogrfica capilar. Obtm-se como resultado, a distribuio graxa, isto , os cidos graxos que compem os TAGs e suas porcentagens relativas. Apesar de ser bastante utilizado, trata-se de um procedimento que consome tempo e recursos, uma vez que necessita de tratamento da amostra e separao cromatogrfica. Quando se emprega GC-FID, os cidos graxos da amostra (convertidos em steres metlicos) so identificados por meio da comparao com tempo de reteno de uma mistura padro de steres graxos metlicos.

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Os leos e gorduras tambm podem ser caracterizados atravs de cromatografia lquida (HPLC) sem a necessidade de derivatizao. medida que os TAGs no absorvem na regio do visvel e ultravioleta, recorre-se a cromatografia lquida acoplada a detector de espalhamento de luz evaporativo (light-scattering)28 ou espectrometria de massas (utilizando principalmente a tcnicas de ionizao qumica a presso atmosfrica).29-33 Infravermelho34 e ressonncia qualidade). A anlise direta de leos e gorduras por espectrometria de massas vem tambm sendo empregada. Destaca-se a infuso direta de leos vegetais (anlise dos TAGs) ou de sua frao polar (anlise de cidos graxos livres) em espectrmetros de massas, utilizando electrospray como modo de ionizao (ESIMS).36-39 A tcnica de MALDI-TOF MS40-43 foi incorporada recentemente ao arsenal de tcnicas analticas para a determinao de TAGs em leos comestveis. Suas principais vantagens so simplicidade, velocidade e possibilidade de determinar e identificar os triglicerdeos diretamente. Em relao aos trabalhos publicados que investigaram leos da Amaznia, verificou-se que Mlayah et al.25 analisaram a composio e propriedades fsicas de diferentes leos de palma (fraes saponificvel e insaponificvel) por GC-FID, enquanto Jandera et al.30 identificaram os principais TAGs presentes no leo de castanha do Par por HPLC-MS. Contudo, no foram detectados na literatura, trabalhos comparativos entre os principais leos fixos da Amaznia, quanto composio graxa (identificao dos TAGs). Portanto, o objetivo do trabalho, apresentado neste captulo da dissertao, consiste em desenvolver um procedimento direto para a avaliao da composio de TAGs atravs da tcnica MALDI-TOF MS e adot-lo como um mtodo para tipificao e controle de qualidade para os principais leos e gorduras vegetais amaznicos. magntica nuclear35 tambm so utilizados como tcnicas complementares no estudo de leos (principalmente quanto a autenticidade e

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2. Materiais e Mtodo 2.1. Reagentes e Amostras

Todos os reagentes utilizados, cido 2,5 di-hidrxi-benzico (Sigma-Aldrich), cloreto de ltio (Sigma-Aldrich), metanol (Merck) foram de grau analtico. Foram adquiridas amostras comerciais de leo de semente de andiroba (Carapa guianensis), castanha do Par (Bertholletia excelsa), maracuj (Passiflora spp.), buriti (Mauritia flexuosa) e gorduras das sementes de cupuau (Theobroma grandiflorum), murumuru (Astrocaryum murumuru) e ucuba (Virola sebifera) das empresas Naturais da Amaznia (Belm, Brasil), Crodamazon (Campinas, Brasil), Beraca-Sabar Ingredientes (So Paulo, Brasil) e Campestre leos (So Paulo, Brasil). As amostras estavam dentro do prazo de validade e todas eram provenientes de reservas extrativistas da regio amaznica.

2.2. Procedimento Experimental

As anlises foram realizadas em um espectrmetro de massas MALDI-TOF (Micromass, Manchester, Reino Unido). Os espectros foram adquiridos no modo reflectron e positivo de aquisio de ons com as seguintes voltagens: tenso de pulso 2500V, tenso do reflectron 2000 V, tenso da fonte 15000 V e tenso do MCP 1800 V. A dessoro/ionizao foi realizada atravs de um laser de nitrognio ( = 337 nm). O equipamento foi calibrado com uma mistura de polietilenoglicol no intervalo das massas moleculares dos triglicerdeos (m/z 500-1500). O protocolo adotado na preparao das amostras de leos e gorduras seguiu o procedimento descrito por Trimpin e Deinzer,44 que analisaram membrana protica sem o emprego de solvente. A matriz utilizada (cido 2,5-dihidrxibenzico) foi misturada com a amostra na proporo 10:1 em um pequeno frasco de vidro e homogeneizada atravs de moinho de bolas por 1 minuto, aps a adio de trs pequenas esferas de ao no frasco. Foi aplicada e fixada uma quantidade mnima da mistura no spot da placa de amostragem, com auxlio de 16

uma esptula. A placa de MALDI foi limpa com um fluxo reduzido de gs nitrognio antes de ser inserida no espectrmetro de massas, para remover o possvel excesso de partculas slidas. Foram realizados experimentos no quais as amostras foram dopadas com soluo saturada de cloreto de ltio em metanol; neste caso era adicionado 1L de soluo mistura amostra /matriz, antes da homogeneizao. Os espectros foram adquiridos no intervalo de m/z 5001500. Todos os dados obtidos por MALDI-TOF foram extrados e tratados atravs do software Masslynx 4.0 (Waters, Manchester, Reino Unido). Cada espectro de massas foi acumulado por 30 s. Para classificar as amostras de leos aps a obteno dos espectros de massas por MALDI-TOF, foi realizada anlise por componentes principais (PCA Principal Compounds Analysis) nos respectivos dados atravs do programa Piroutte v.4 (Infometrix, Seattle, EUA).

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3. Resultados e Discusso 3.1. Aspectos Gerais

Conforme descrito na parte experimental, as anlises foram conduzidas sem o uso de solventes. O mtodo de MALDI livre de solvente vem sendo aplicado para a anlise de protenas e polmeros e foi desenvolvida inicialmente para a caracterizao de compostos insolveis.44,45 Contudo, quando se aplicou para leos e gorduras neste projeto, alm da vantagem de evitar solventes, outro fator a se destacar uma maior reprodutibilidade das anlises, como resultado de maior homogeneidade da mistura matriz/amostra no spot da placa de MALDI. Quando a amostra e matriz so preparadas atravs da solubilizao e transferncia de uma alquota de ambas as solues para a placa de amostragem, de modo a formar uma camada de amostra e matriz ou matriz-amostra-matriz (modo sanduche), a amostra tende a se cristalizar no centro do spot, enquanto a matriz (DHB) se cristaliza nas bordas do spot, quando seca a presso ambiente, o que acarreta na formao de um filme heterogneo que prejudica a obteno de espectros de massas por MALDI-TOF. O emprego da tcnica de MALDI sem solvente uma maneira de se evitar este problema. Os espectros de massas de leos e gorduras vegetais amaznicos obtidos por MALDI-TOF MS mostram perfis tpicos de TAGs, e apresentam sinais em duas regies distintas, conforme ilustrado pelo espectro de massas do leo de Castanha do Par na Figura 1.

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Figura 1. Espectro de massas por MALDI-TOF do leo de castanha do Par. Os ons no intervalo de m/z 800-1000 correspondem a TAGs detectados principalmente como adutos de sdio [TAG+Na]+. Adutos de potssio [TAG+K]+ tambm foram detectados, porm bem menos intensos. Os ons na faixa de m/z 500-650 correspondem aos produtos de fragmentao dos TAGs, devido a perda de cido graxo, conforme observado em trabalhos anteriores na anlise de leos comestveis.43,46 Hill et al.43 sugerem que os fragmentos observados provem de triglicerdeos protonados [TAG+H]+, que se dissociam imediatamente aps se formarem, devido a natureza covalente da protonao que promove a deslocalizao da carga positiva e desestabiliza a espcie [TAG+H]+. No mecanismo de fragmentao, que mostrado na Figura 2, o carter covalente da ligao entre o prton a um dos oxignios dos grupos carboxilas reduz ainda mais a densidade eletrnica da ligao C-O, levando a perda de uma unidade de cido graxo (RCOOH). Esta fragmentao pode ser assistida por um ataque nucleoflico do par de eltrons livre do oxignio pertencente a outro grupo acila lateral.

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R1 O CH2 R2 O O CH CH2 O O O

R1

O
O O

O C

H R3

O R2

+
O

R1

+
O

R2

Figura 2. Mecanismo de fragmentao proposto para uma molcula de triacilglicerdeo protonada.43

A identificao dos principais TAGs [TAG+Na]+ presentes nos espectros das amostras de leos e gorduras se encontra sumarizada na Tabela 1.

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Tabela 1. Atribuio e abundncias relativas dos principais ons observados nos espectros de massas MALDI-TOF dos leos e gorduras amaznicos.
m/z + [M+Na] 633 661 689 717 743 745 771 773 799 801 825 827 829 851 853 855 857 877 879 881 883 885 899 901 903 905 Frmula Molecular C37H70O6 C39H74O6 C41H78O6 C43H82O6 C45H84O6 C45H86O6 C47H88O6 C47H90O6 C49H92O6 C49H94O6 C51H94O6 C51H96O6 C51H98O6 C53H96O6 C53H98O6 C53H100O6 C53H102O6 C55H98O6 C55H100O6 C55H102O6 C55H104O6 C55H106O6 C57H96O6 C57H98O6 C57H100O6 C57H102O6 TAGs
a

NC/DL 34:0 36:0 38:0 40:0 42:1 42:0 44:1 44:0 46:1 46:0 48:2 48:1 48:0 50:3 50:2 50:1 50:0 52:4 52:3 52:2 52:1 52:0 54:7 54:6 54:5 54:4

Castanha ----------------------------23 23 5 57 85 92 41 ----42 70 87

Buriti ----------------------------3 24 5 ----97 22 -----------

Andiroba ----------------------9 21 --18 58 9 --35 100 45 21 ------17

Maracuj ----------------------------8 4 --68 45 17 ------100 74 41

Murumuru 25 99 100 59 5 27 7 9 6 3 5 4 ----3 2 -3 3 2 ------5 4 3

Ucuba --3 13 95 --100 2 14 2 3 --------3 ----3 2 1 ------7 5 3

Cupuau ------------------------------5 ------18 39 8 ---------

LaLaCa LaLaLa, LaLaM, LaLaP, LaLaO LaLaS, MMPo MMP MMO MMS PPoPo PPPo PPP PPLn PPL PPO PPS PLL PLO POO POS PSS LLLn LLL LLO, OOLn OOL, LLS

21

m/z + [M+Na] 907 909 911 913 933 935 937 939 941 965 967 969

Frmula Molecular C57H104O6 C57H106O6 C57H108O6 C57H110O6 C59H106O6 C59H108O6 C59H110O6 C59H112O6 C59H114O6 C61H114O6 C61H116O6 C61H118O6

TAGs

NC/DL 54:3 54:2 54:1 54:0 56:4 56:3 56:2 56:1 56:0 58:2 58:1 58:0

Castanha 100 60 21 5 6 5 4 -----------

Buriti 100 30 5 -------------------

Andiroba 44 32 14 -------------------

Maracuj 17 -----------------------

Murumuru 2 -----------------------

Ucuba -------------------------

Cupuau 17 65 100 25 --4 27 45 11 4 7 2

OOO, SOL OOS, SSL SSO SSS ALL AOL ASL, AOO ASO ASS AAL AAO AAS

a) Abreviaes utilizadas para os cidos graxos: cprico (Ca, C10:0), larico (La, C12:0), mirstico (M, C14:0), palmtico (P, C16:0), palmitoleico (Po, C16:1), esterico (S, C18:0), oleico (O, C18:1), linoleico (L, C18:2), linolnico (Ln, C18:3) e araqudico (A, C20:0); b) NC/DL = nmero de carbonos/nmero de duplas ligaes das trs unidades de cido graxo; c) abundncia relativa: relao entre a intensidade do on observado e o on mais intenso (normalizado para 100%).

22

3.2. Caracterizao dos leos Vegetais

A Figura 3 compara os espectros de massas por MALDI-TOF MS dos leos de Castanha do Par, Buriti, Andiroba e Maracuj.

Figura 3. Espectros de massas por MALDI-TOF dos leos vegetais amaznicos. interessante notar que cada leo apresenta um espectro de massas com um perfil tpico de TAGs que permite sua caracterizao rpida e fcil, conforme descrito a seguir. O fingerprint do leo de castanha do Par (Figura 3A) possui TAGs derivados principamente dos cidos oleico e linoleico, caracterizado atravs dos ons de m/z 877 (PLL), m/z 879 (PLO), m/z 881 (OOP), m/z 901 (LLL), m/z 903 (LLO ou/e OOLn), m/z 905 (OOL ou/e LLS), m/z 907 (OOO e/ou SOL) e m/z 909 (OOS ou/e SSL). Este resultado est de acordo com a tpica composio do leo de castanha do Par que contem entre 31-56% de cido oleico, 26-46% de cido linolico e 14-16% de cido palmtico.22,47 23

O leo de buriti (Figura 3B) tem entre 73-76% de cido oleico;22 conseqentemente se verificou que este leo caracterizado atravs dos TAGs derivados do referido cido, visto que o seu espectro de massas apresentou os ons de m/z 881 (OOP) e m/z 907(OOO) como os mais intensos. O leo de andiroba (Figura 3C), por sua vez, constitudo principalmente por TAGs dos cidos oleico (50-60%) e palmtico (19-28%),22,23 e exibe os ons de m/z 855 (PPO), m/z 881 (OOP) e m/z 907 (OOO) como os mais abundantes. Observa-se que leo de andiroba apresenta os mesmos ons diagnsticos do leo de buriti, e desta maneira, a diferenciao entre eles se promove atravs da anlise das abundncias relativas. medida que o leo de buriti mais rico em cido oleico do que o andiroba, o on de m/z 907 (OOO) mais intenso no buriti. O mesmo ocorre em relao ao cido palmtico que mais abundante no leo de andiroba, de modo que o espectro de massas mostra os ons m/z 855 (PPO) e m/z 829 (PPP) mais abundantes no leo de andiroba. O leo de maracuj (Figura 3D) caracterizado por TAGs do cido linoleico, como os ons de m/z 901 (LLL), m/z 903 (LLO) e m/z 877 (LLP), uma vez que o cido linoleico o principal componente do leo de maracuj (aproximadamente 77%).23

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3.3. Caracterizao das Gorduras Vegetais

Em relao s gorduras amaznicas, observa-se que estas tambm possuem perfis distintos por MALDI-TOF MS, que permitem uma tipificao rpida e simples (Figura 5).

Figura 4. Espectro de massas por MALDI-TOF das gorduras vegetais amaznicas. O espectros de massas das gorduras amaznicas apresentam ons [TAG+Na]+ na faixa de m/z 600-1000, sendo que gordura de cupuau possui um espectro mais similar ao dos leos. As gorduras de murumuru e ucuba (Figuras 4A e 4B) so constitudas, principalmente, por TAGs derivados dos cidos lurico e mirstico. Os ons de m/z 661 (LaLaLa) e m/z 689 (LaLaM) so mais abundantes na gordura de murumuru, enquanto na ucuba, os mais intensos so os ons de m/z 717 (MMLa) e 745

25

(MMM), sendo que em ambas, a relao entre os ons mais abundantes de aproximadamente 1:1. Estes resultados esto de acordo com a literatura,21,22,47 que descreve a gordura de ucuba como sendo formada por uma alta porcentagem de cido mirstico (64-73%), mas tambm apresenta em sua composio cido lurico (13-15%). Por outro lado, ocorre o inverso na gordura de murumuru, onde o cido graxo mais abundante o lurico (43-51%), seguido pelo mirstico (26-37%). O espectro de massas da gordura de ucuba exibe tambm ons que foram identificados como adutos de potssio dos TAGs com m/z 705 [C41H78O6+K]+, m/z 733 [C43H82O6+K]+, m/z 761 [C45H84O6+K]+ e m/z 789 [C45H86O6+K]+. O fingerprint da gordura de cupuau (Figura 4C) muito caracterstico, pois os TAGs se encontram no intervalo de m/z 850-1000. Nota-se que os TAGs identificados so derivados principalmente dos cidos esterico e oleico, como SSO (m/z 911), OOS e SSL (m/z 909), OOO e SOL (m/z 907), SSS (m/z 913), alm daqueles que possuem uma unidade de cido palmtico em sua cadeia: OOP (m/z 881), POS (m/z 883) e SSP (m/z 885). Destaca-se tambm a presena de triglicerdeos com uma unidade de cido araqudico, como OOA e ASL (m/z 937); ASO (m/z 939) e ASS (m/z 941) ou duas unidades, como AAL (m/z 965), AAO (m/z 967), AAS (m/z 969) que auxiliam na tipificao da gordura de cupuau. Embora a gordura de cupuau e os leos amaznicos estudados exibam ons na mesma faixa de m/z, verifica-se que estes ltimos possuem um perfil diferente da gordura de cupuau que caracterizada principalmente por TAGs derivados de cidos graxos saturados, como o esterico e araqudico.47 Outro ponto a ser abordado, refere-se identificao dos ons de m/z 633 e 635 no espectro de massas da gordura de cupuau. Eles foram identificados como fragmentos dos triglicerdeos com massas moleculares superiores, conforme ficou demonstrado pelo experimento de dopagem com ltio (Figura 5).

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Figura 5. Espectros de massas MALDI-TOF das gorduras vegetais amaznicas: A) murumuru (in natura) B) murumuru (dopada com LiCl) C) cupuau (in natura) D) cupuau (dopada com LiCl). Neste experimento, as gorduras de murumuru e cupuau foram analisadas com e sem a adio de cloreto de ltio, percebendo-se claramente que na gordura de murumuru (Figuras 6A e 6B), o sinal do on de m/z 633 (atribudo como aduto de sdio do TAG C37H70O6 - LaLaCa) diminui drasticamente na presena de ltio, devido a formao do on de m/z 617, que corresponde ao aduto de ltio do referido TAG. O mesmo no ocorre com a gordura de cupuau, que ao ser dopada com cloreto de ltio, no apresenta modificao no espectro de massas na regio observada das Figuras 5C e 5D. Entretanto, verifica-se que neste mesmo

27

experimento, os sinais atribudos como TAGs (entre m/z 850-1000) na gordura de cupuau sofrem um deslocamento de m/z (menos 16 u), como ocorreu nos sinais correspondentes aos TAGs da gordura de murumuru, ao ser adicionado cloreto de ltio na amostra, como pode ser observado na Figura 6.

Figura 6. Espectro de massas MALDI-TOF da gordura de cupuau: A) in natura B) com adio de cloreto de ltio. Conseqentemente, confirma-se a hiptese de que na gordura de cupuau, o on de m/z 633 um fragmento com frmula molecular [C41H77O4]+ proveniente da dissociao de um triglicerdeo de massa molecular superior, contendo em sua estrutura uma unidade de cido araqudico e oleico, enquanto o on de m/z 635, tambm um fragmento que contem uma unidade de cido araqudico e esterico e de frmula molecular [C41H79O4]+. Esta afirmao tambm reforada pelo fato de que a gordura de cupuau no apresenta cido lurico em sua composio graxa.47

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3.4. Anlise Exploratria dos Dados

Para testar o desempenho da tcnica MALDI-TOF na classificao de leos amaznicos, os dados foram tratados por meio da anlise de componentes principais (PCA). A anlise de PCA uma metodologia empregada na caracterizao de amostras, onde necessrio extrair informao de um grande nmero de variveis. Trata-se de uma ferramenta til na anlise e classificao de um grupo de amostras, pois permite visualizar os dados obtidos a partir das amostras em um grfico bi ou tridimensional.48 Os componentes principais (PC) so obtidos em ordem decrescente de varincia, onde o componente principal (PC1) detm mais informao estatstica que o PC2, e assim por diante. Portanto a janela PC1 x PC2 a mais importante estatisticamente (scores). PCA tambm pode ser usada para ver quais variveis (loadings) tm maior importncia no agrupamento das amostras.49 Quando h um nmero grande de variveis, o uso do PCA tri-dimensional, onde visualizamos a janela PC1 x PC2 x PC3, pode ser mais adequado. Figura 7 mostra o grfico de PC1 (Fator 1) versus PC2 (Fator 2) para os espectros MALDI-TOF das amostras de leos e da gordura de cupuau (cujos ons esto na mesma regio de m/z observada para os leos). Os fingerprints foram expressos como as intensidades relativas dos principais ons [TAG+Na]+ de cada amostra.

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Figura 7. PCA dos dados de MALDI-TOF MS dos leos (Buriti, Castanha do Par, Maracuj) e da gordura de Cupuau. Atravs do grfico bidimensional PC1 versus PC2 (Figura 7), verifica-se que cada um dos quatro tipos de leos foi claramente agrupado e separado. Os leos de buriti e andiroba que apresentam um fingerprint bem similar foram agrupados separadamente e a gordura de cupuau est mais isolada dos leos, porque formada principalmente por TAGs de cidos graxos saturados, enquanto os leos contem principalmente cidos graxos insaturados.

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4. Concluso
A tcnica MALDI-TOF permite a anlise direta de triglicerdeos nos leos e gorduras vegetais amaznicos estudados. Os espectros de massas por MALDI-TOF mostram que cada leo e gordura amaznico possui um padro caracterstico de triglicerdeos, de maneira que foi possvel elaborar um banco de dados das amostras avaliadas, de acordo com os ons diagnsticos e suas abundncias relativas. necessrio destacar tambm as vantagens da espectrometria de massas MALDI-TOF aplicada neste trabalho, na caracterizao de leos e gorduras, pois complementa as informaes obtidas pelas tcnicas cromatogrficas, a partir de um procedimento direto, rpido e simples. Enfim, o procedimento desenvolvido dispensa o emprego de solvente e permite a obteno de resultados mais reprodutveis. A tcnica se mostra aplicvel para a identificao, caracterizao e controle de qualidade de leos e gorduras amaznicos. Existe a perspectiva futura de estender a tcnica para caracterizao de outros leos e gorduras amaznicos.

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CAPTULO 3:

Caracterizao de Surfactantes Catinicos em Produtos Amaciantes Txteis por Espectrometria de Massas com Ionizao por Electrospray (ESI-MS)

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1. Introduo
O amaciante de tecidos para uso domstico pode ser definido como um produto que confere maciez (sensao de toque agradvel) a artigos de vesturio, proporciona frescor e odor agradvel e promove a reduo da eletricidade esttica (que prejudica o conforto no uso e a manipulao de tecidos).50 Ele pertence categoria dos produtos domissanitrios ou produtos de limpeza, que so indispensveis para a manuteno da limpeza, sade e higiene. De acordo com a ABIPLA (Associao Brasileira de Produtos de Limpeza e Afins), os amaciantes esto presentes em 81,9% dos lares brasileiros.51 Os amaciantes foram introduzidos inicialmente nos Estados Unidos por volta de 1950 e dez anos depois na Europa, quando as mquinas de lavar e secar roupas se tornaram populares.52 O mercado de amaciantes de roupas est em crescimento, com um aumento na taxa de consumo anual entre 3-8% ao redor do mundo,53 conforme mostra a Tabela 1: Tabela 1. Consumo Mundial de Amaciantesa Regio/Ano Europa Estados Unidos Amrica Latina sia Total 1995 115 72 24 50 261 2000 130 86 33 50-75 +300 2005 140 104 46 70-100 +350 Crescimento Anual b (%) 2,5 3,5 6,5 4-10 4

a) consumo expresso em milhes de toneladas por ano. b) crescimento baseado no consumo do perodo de 1995-2005.

Um grande problema do setor de produtos de limpeza no Brasil a existncia de um mercado informal que comercializa produtos clandestinos a granel em veculos ou pequenos estabelecimentos comerciais. Um estudo

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realizado pela FIPE (Fundao Instituto de Pesquisas Econmicas) em 2001 mostra as dimenses da informalidade, resumidas na Tabela 2.51 Tabela 2. Consumo e informalidade no mercado de domissanitrios brasileiro. Produto gua Sanitria Desifentante Amaciante Detergente Lquido Consumo estimado (mil R$) 559.286 541.510 726.716 603.107 42,1 30,6 15,2 7,7 Informalidade (%)

Estes produtos representam um problema populao que os consome, uma vez que eles so produzidos sem a adoo de boas prticas de fabricao (conjunto de medidas que devem ser adotadas pelas indstrias a fim de garantir a qualidade sanitria e a conformidade dos produtos com os regulamentos tcnicos), e no so submetidos a um controle de qualidade. Logo, podem conter substncias em quantidade inferiores ou diferentes daquelas previstas, para que proporcione o resultado esperado pelo consumidor. Outra questo relativamente comum so os acidentes envolvendo crianas que ingerem estes produtos clandestinos, pois geralmente so coloridos e vendidos em garrafas plsticas de refrigerante. O mais grave neste caso, que o socorro fica prejudicado, medida que eles no apresentam rtulo com a composio detalhada. A venda de produtos de limpeza falsificados e adulterados traz prejuzos sade pblica, s indstrias do setor, ao governo e ao consumidor.

34

1.1. Utilizao e Mecanismo de Ao dos Amaciantes

A necessidade de utilizar amaciantes foi induzida devido introduo de detergentes sintticos no lugar do sabo e pelo uso de mquinas de lavar automticas, que modificaram as condies de lavagem dos tecidos. Na era pr-detergente, as roupas eram lavadas somente com sabo e as fibras do tecido eram cobertas com uma fina camada de sabo insolvel, na forma de sais de clcio e magnsio formados em decorrncia da dureza da gua. Este filme promovia uma lubrificao suficiente das fibras para manter uma sensao agradvel nas roupas. Porm, esta percepo foi alterada, pois o processo de lavagem com mquina realizado com uma frico mecnica muito alta, o que causa efeito de desarranjo e emaranhamento das fibras, alm do emprego de detergentes mais eficazes que removem as manchas presentes, mas tambm o acabamento original dos tecidos.54 A Figura 1 exemplifica o estado das fibras de uma toalha de algodo, depois de 12 ciclos de lavagem com e sem o uso de amaciantes.

(a)

(b)

Figura 1. Micrografia eletrnica das fibras de uma toalha de algodo: (a) com uso de amaciante de roupas (b) sem amaciante de roupas.50 O principal componente de uma formulao amaciante o surfactante catinico, mais especificamente, sal quaternrio de amnio (QUACs) que apresenta a propriedade denominada substantividade, que definida como a

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capacidade da molcula se adsorver em superfcies carregadas negativamente, como metais, fibras txteis e minerais.55 Os amaciantes so utilizados durante a etapa de enxge no ciclo de lavagem e funcionam atravs da deposio do ativo catinico na superfcie do tecido, formando um filme protetor de material graxo que age como lubrificante. Essa lubrificao cria menos frico na superfcie e entre as fibras, originando a sensao de maciez nos tecidos. Outra contribuio se d no processo de secagem automtica. Quando se empregam mquinas de secar roupas, a frico dos tecidos (principalmente os sintticos) faz com que eles acumulem eletricidade esttica e conseqentemente as peas de vesturio se tornam desconfortveis ao toque e vestimenta. A lubrificao das fibras promovida pelo amaciante reduz a frico entre elas e deste modo minimiza o acmulo de eletricidade esttica. O uso contnuo ou demasiado pode promover acmulo de surfactante catinico no substrato, e deste modo, a absoro de gua neste substrato pode ser afetada.56 Portanto, uma importante caracterstica que deve ser verificada nos produtos txteis, aps o emprego de amaciantes, a molhabilidade, ou seja, a capacidade do substrato (como toalhas, por exemplo) de absorver gua.

1.2. Sais quaternrios de amnio com propriedades amaciantes

Os QUACs utilizados em formulaes amaciantes devem conter dois grupos lipoflicos (duas cadeias graxas) para exibirem efeito de amaciamento do tecido adequado. Os grupos lipoflicos presente nestes tensoativos so derivados de cidos graxos de sebo, na maior parte das vezes, sebo hidrogenado (cujos cidos mais abundantes so o hexa e octadenico). Cadeias alqulicas mais curtas (cidos dodecanico e tetradecanico) no so empregadas, pois no exibem propriedades amaciantes.52,56

36

Os principais surfactantes utilizados em produtos de mercado (Figura 2) e que representam mais de 95% dos ativos catinicos adotados em amaciantes txteis lquidos no mundo atual 54 so descritos a seguir:

Figura 2. Principais quaternrios de amnio utilizados em amaciantes de roupas; A) Di-alquil dimetil amnio B) Di-alquil imidazolnio C) Di-amida amina etoxilada quaternizada D) Esterquat. R1 e R2 = cadeias alqulicas graxas Surfactantes catinicos produzidos a partir de sebo hidrogenado tm temperaturas de fuso e armazenagem mais elevadas (e usualmente requerem mais solvente pra facilitar o manuseio), mas oferecem em contrapartida excelente desempenho de amaciamento e lubrificao dos tecidos. A formulao de produtos mais concentrados dificultada devido alta viscosidade inerente destas molculas dispersas em gua. Quando se utilizam cidos graxos insaturados, o efeito de amaciamento reduzido, mas se torna possvel formular produtos mais concentrados, uma vez que ocorre reduo da viscosidade.54

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A) Cloreto de di-aquil dimetil amnio: Os primeiros amaciantes de roupa desenvolvidos na dcada de 50 empregavam cloreto de di-alquil dimetil amnio (Figura 2A) como surfactante catinico. Este tensoativo manufaturado a partir de cidos graxos provenientes de sebo hidrogenado, e normalmente designado pela sigla DHTDMAC (di-hard tallow dimethyl ammonium chloride). O consumo deste ativo catinico diminuiu bastante no fim da dcada de 90, quando a Unio Europia decidiu desencorajar seu uso como ingrediente ativo. A principal razo se baseia na busca de matrias-primas mais biodegradveis e atualmente o cloreto de di-alquil dimetil amnio mais utilizado em mercados emergentes.50,54 B) Sal Quaternrio de di-alquil imidazolnio. Os sais quaternrios de imidazolnio do tipo 1-(alquil amidoetil)-2-alquil-3metil imidazolnio, cuja estrutura apresentada na Figura 2B, tambm comearam ser utilizados em produtos amaciantes na mesma poca que o DHTDAC foi desenvolvido. Os sais quaternrios de imidazolnio contendo cadeias graxas saturadas apresentam efeito de amaciamento um pouco menor que o DHTDMAC, entretanto, apresentam melhor caracterstica de molhabilidade.57 Por conseguinte, sais quaternrios de imidazolnio so freqentemente misturados com DHTDMAC para que o amaciante obtenha um melhor desempenho final. C) Sal Quaternrio de di-amida amina etoxilada. Os QUACs derivados de di-amida aminas etoxiladas (Figura 3C) so produzidos atravs da reao de triglicerdeos ou cidos graxos com

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dietilenotriamina, seguida pelo processo de etoxilao e quaternizao com dimetil sulfato. A maior vantagem desta classe de produtos menor custo de produo. O custo e o desempenho do produto podem ser ajustados pela mistura de triglicerdeos de diferentes fontes. Por exemplo, amaciantes concentrados com at 25% de ativos podem ser facilmente formulados com esta classe de quaternrio de amnio (contendo cadeias alqulicas graxas insaturadas).54 A partir de cadeias graxas saturadas, obtm-se surfactantes cuja performance de amaciamento comparvel aos sais quaternrios de di-alquil imidazolnio. D) Esterquats Esterquat o termo utilizado para a famlia de molculas catinicas produzidas a partir da reao de esterificao de cidos graxos com alcanolaminas e quaternizadas com dimetil sulfato. Em formulaes amaciantes, as molculas de esterquat so sintetizadas a partir da trietanolamina (TEA). Este ativo catinico corresponde a um dister de trietanolamina com cidos graxos do sebo (Figura 2D). Atualmente, esterquat-TEA utilizado em amaciantes na Europa e Estados Unidos, por ser mais biodegradvel que o cloreto de dialquil dimetil amnio, uma vez que a presena de ligaes ster em sua estrutura qumica aumenta significativamente a cintica de biodegradao, diminuindo os nveis de exposio ambiental.58 Esterquats representam uma nova gerao de ativos catinicos para amaciantes, pois combina o bom perfil ambiental exigido pelos consumidores com as caractersticas estruturais necessrias para o condicionamento de tecidos.

1.3. Composio dos Amaciantes de Roupas

Uma formulao amaciante uma disperso aquosa, pois o tensoativo catinico no totalmente solvel em gua.

39

O poder de amaciamento est diretamente relacionado com o teor de ativos catinicos no produto e a incorporao do quaternrio de amnio em concentraes acima de 3% promove espessamento e a maciez dentro das necessidades do consumidor. No Brasil, o tensoativo mais utilizado o cloreto de di-alquil dimetil amnio, cuja concentrao se encontra na faixa de 5-7% (produtos premium), 3-4% (produtos intermedirios) e 1-2% (produtos populares). As formulaes tambm so compostas por gua (veculo), perfume, corante (apelo esttico) e conservante (em geral, 0,1% de formaldedo ou glutaraldedo). Algumas formulaes podem conter ainda agente opacificante (cido esterico), espessante (mistura dos lcoois hexa e octadeclico ou monoestearato de glicerila) e agente protetor de cores (octilmetoxicinamato).59 Atualmente existe a tendncia de amaciantes de roupa concentrados na Amrica do Norte, Europa e Japo, no qual a concentrao do ativo catinico est entre 15-25%. O objetivo reduzir o consumo de embalagens que tem impacto direto nos custos de transporte, armazenamento e tambm no preo final ao consumidor. Diferentes surfactantes catinicos podem ser adotados em formulaes amaciantes comerciais, que muitas vezes no contem a composio detalhada e declaram no rtulo somente como: contendo tensoativo catinico. Tambm, conforme foi descrito inicialmente, existe no comrcio produtos falsificados e de baixa qualidade, que no atendem as necessidades do consumidor. Logo, de fundamental importncia ter um mtodo simples e confivel para determinar os surfactantes catinicos que so empregados em produtos amaciantes comerciais. Este trabalho apresenta um mtodo para identificar e caracterizar surfactantes catinicos em amaciantes de roupas, empregando espectrometria de massas e que atenda os quesitos propostos (rapidez e confiabilidade), alm de ser vivel na deteco de fraudes. Antes, porm ser descrito os mtodos mais empregados para identificar e caracterizar surfactantes catinicos.

40

1.4. Identificao e Caracterizao de Surfactantes Catinicos.

Devido ausncia de volatilidade, tensoativos catinicos no podem ser analisados diretamente por cromatografia gasosa. necessrio convert-los em derivados volteis, por exemplo, atravs da eliminao de Hofmann, onde por aquecimento em meio alcalino, um quaternrio de amnio se decompe em uma amina terciria e um alceno (Figura 3). Normalmente, os surfactantes so refluxados com metxido de sdio em N,N-dimetilformamida por 1 hora. O extrato da mistura reacional contendo os produtos de degradao desta maneira, analisado por cromatografia gasosa acoplada a um detector FID ou espectrmetro de massas.60,61

R CH2CH2

CH3 + N CH3 + CH3OCH3

R CH CH2 +

H3C

CH3

CH3OH

CH3

Figura 3. Reao de eliminao de Hofmman para um QUAC. A caracterizao de surfactantes tambm realizada atravs de diferentes tcnicas, como ressonncia magntica nuclear e infravermelho.61,62 Apesar de valiosas, se tornam tcnicas limitadas, quando se pretende identificar tensoativos em formulaes comerciais, pois necessrio extrair e isolar a molcula, alm de no ser possvel obter a distribuio de homlogos (diferentes cadeias alqulicas que compem um tensoativo). Para se obter a distribuio de molculas homlogas, cromatografia lquida e eletroforese capilar so empregadas como tcnicas de separao, acopladas a detectores ultravioleta (com utilizao de reao ps-coluna para formar um par inico que absorva em comprimento de onda adequado, no caso de catinicos que no possuam grupo cromforo)63-65, quimiluminescente (detector de nitrognio)66 ou de espalhamento de luz evaporativo.67 Entretanto esta separao e a identificao pode ser tornar uma tarefa complexa e demorada em produtos comerciais, devido diversidade de surfactantes e a complexidade da amostra. 41

Atualmente, a aplicao de tcnicas avanadas de espectrometria de massas se mostra uma poderosa ferramenta na identificao de surfactantes em diferentes matrizes (principalmente ambientais).68-71 Embora grande parte dos trabalhos utilize a espectrometria de massas acoplada cromatografia lquida, os surfactantes podem ser analisados diretamente, sem a necessidade de acoplamento com tcnicas de separao e/ou pr-tratamento da amostra.70-73 Em produtos comerciais, Ayorinde et al e Ogura et al no inicos
73 72

analisaram QUACs em produtos de enxge bucal e desinfetantes por MALDI-MS, identificaram e quantificaram surfactantes aninicos, catinicos, diferentes produtos de limpeza (detergente, xampus, em

condicionadores) por ESI-MS; contudo o maior enfoque foi a quantificao de linear alquil benzeno sulfonado em sabo em p.

42

2. Materiais e Mtodo 2.1. Reagentes e Amostras

Os reagentes utilizados foram de grau analtico: metanol e cido frmico (Merck). gua deionizada foi obtida atravs da unidade de purificao MilliQ (Millipore). Analisaram-se um total de 15 amostras de amaciantes de diferentes marcas comerciais, incluindo amostras que foram adquiridas no comrcio formal (8 amostras) e informal (5 amostras) da Grande So Paulo e em supermercados da Alemanha (2 amostras).

2.2. Procedimento Experimental

As anlises foram realizadas em modo positivo no espectrmetro de massas Q-TOF hbrido com um quadrupolo e um analisador de massas por tempo de vo (Micromass, Manchester, Reino Unido).

Figura 4. Esquema do espectrmetro de massas Q-TOF Micromass.

43

As cone 30V.

condies

experimentais

foram:

temperatura

do

bloco

100 C,

temperatura de dessolvatao 100 voltagem do capilar 3,0 kV e voltagem do C, Para confirmar as estruturas qumicas propostas, foi realizado ESI-MS/MS dos ons selecionados por dissociao induzida por coliso (CID) com gs argnio e energia de coliso entre 20-60 eV. O volume de 1L das amostras de amaciantes foi diluda em 1,0 mL de soluo metanol/gua (1:1) contendo 0,1% (v/v) de cido frmico. Essas solues foram injetadas na interface do electrospray a uma vazo de 10 L.min-1 com o auxlio de uma bomba peristltica automtica (Havard Apparatus). Os espectros de massas foram adquiridos no intervalo de m/z 100-1000 e os dados obtidos foram tratados com o software MassLynx 4.0 (Waters, Manchester, Reino Unido).

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3. Resultados e Discusso
A Figura 5 apresenta o fingerprint por ESI(+)-MS de amaciantes de roupas formulados com diferentes surfactantes catinicos.

Figura 5. ESI(+)-MS de amaciantes de roupa formulados com A) di-alquil dimetil amnio B) esterquat de sebo hidrogenado C) esterquat de sebo D) di-alquil imidazolnio;. R1 e R2 = cadeias alqulicas graxas

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Como pode ser observado, possvel identificar o surfactante catinico que foi adotado no amaciante atravs da presena de ons diagnsticos caractersticos para cada classe de quaternrio de amnio. Os quaternrios de amnio detectados nas amostras da Figura 5 so constitudos por molculas catinicas mono carregadas com diferentes cadeias alqulicas, separadas por 28u (C2H4). A presena de diferentes combinaes de cadeias alqulicas se deve ao fato de que cidos graxos de sebo (hidrogenado ou no), so utilizados como matria-prima inicial na sntese.52,54 No sebo, os cidos palmtico (20-37%), esterico (25-40%) e oleico (31-50%) so os mais abundantes.47 Na Figura 5A, encontra-se o espectro de massas de um produto comercial que foi formulado com di-alquil dimetil amnio (DHTDMAC), produzido a partir de sebo hidrogenado. A identificao dos ons correspondentes a esta molcula se encontra na Tabela 3. Tabela 3. Identificao dos ons da amostra de amaciante contendo DHDTMAC . Grupo m/z 466 494 522 550 Frmula molecular C32H68N+ C34H72N+ C36H76N+ C38H80N+ Alquilas R1 C14 C16 C14 C16 C18 R2 C16 C16 C18 C18 C18 Tetradecil hexadecil dimetil amnio Di-hexadecil dimetil amnio Tetradecil hexadecil dimetil amnio Hexadecil octadecil amnio Di-octadecil dimetil amnio Nome

Verifica-se que outros compostos foram detectados, alm do di-alquil dimetil amnio. interessante relatar a sntese deste quaternrio de amnio para compreender e justificar a presena destes outros compostos. A rota clssica empregada para a produo desta classe de catinico envolve a reao inicial de cidos graxos com amnia para produzir amidas que so posteriormente convertidas em nitrilas por desidratao (Figura 6).

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O C OH

+ NH3 - H2O
C N

[H2]
NH2

- NH3
NH

+ 2 CH3Cl
+ N CH3 CH3

Figura 6. Rota sinttica para obteno do cloreto de di-estearil dimetil amnio.52 As nitrilas graxas so submetidas hidrogenao sob catalisador de nquel (temperatura 120-180 presso 20-40 atmosferas), onde atravs de uma reao C, de condensao, se produz aminas secundrias; entretanto um pr-requisito a remoo da amnia que tambm se forma, pois o seu acmulo no reator favorece a formao de aminas primrias. O ltimo passo consiste na quaternizao da amina secundria com 2 moles de cloreto de metila. Alternativamente, essa ltima etapa tambm pode ser realizada atravs uma alquilao redutiva com formaldedo, produzindo di-alquil metil amina que quaternizada com cloreto de metila.74 Conforme descrito, aminas primrias (com somente uma cadeia graxa) so formadas durante o processo e ao serem quaternizadas geram mono alquil trimetil amnio, como subproduto, presente no amaciante analisado, como pode ser observado no espectro de massas atravs dos m/z 284 (hexadecil trimetil amnio) e 312 (octadecil trimetil amnio). 47

Outras impurezas so aminas tercirias que no reagiram com cloreto de metila para formar o surfactante, no caso, dioctadecil metil amina (m/z 536), hexadecil octadecil amina (m/z 508), di-hexadecil amina e tetradecil octadecil metil amina (m/z 480). Essas aminas so detectadas na forma protonada [M+H]+. Conseqentemente, alm de caracterizar o tensoativo, a tcnica se mostrou til para o emprego no controle do processo de sntese, atravs da deteco dos subprodutos. As figuras 5B e 5C apresentam o fingerprint que caracterizam duas amostras de amaciantes alemes que empregam esterquat como quaternrio de amnio. Esterquats so misturas de mono e disteres graxos de trietanolamina quaternizados com di-metil sulfato e a identificao dos ons se encontra na Tabela 2. Tabela 4. Identificao dos ons das amostras de amaciante contendo esterquat. cidos Graxos a C14 Monoster Quaternizado C16 C18:1 C18 C14 C14 C14 Dister Quaternizado C16 C16 C16 C18:1 C18 C18
a

m/z --------374 402 428 430 612 638 640 640 666 668 692 694 696

C16 C18:1 C18 C16 C18:1 C18 C18:1 C18:1 C18

C14= cido mirstico; C16=cido palmtico; C18=cido esterico; C18:1=cido oleico

48

 interessante observar que embora o ativo catinico seja o mesmo nas duas amostras de amaciante, existem diferenas na composio do tensoativo. No amaciante da Figura 5C, foi utilizado um surfactante sintetizado a partir de cidos graxos no hidrogenados, como pode ser visto pela presena de molculas de esterquat contendo cido oleico em sua estrutura (ons de m/z 428, 692 e 694). possvel tambm detectar as espcies qumicas precursoras deste tipo de tensoativo, ou seja, os steres de trietanolamina que no foram quaternizados (ons detectados entre as sries homlogas de QUACs). Como exemplo, os ons de m/z 654 e 652 que correspondem, respectivamente aos steres de cadeias graxas C16/C18 e C16/C18:1 . Outra informao que pode ser obtida por meio dos espectros de massas das amostras de origem alem o fato de que alm de serem formuladas com esterquat, elas tambm possuem outro tensoativo catinico coadjuvante, no caso, di-alquil dimetil amnio, como pode ser observado pela presena dos ons com m/z 522 e 550. A figura 5D ilustra o fingerprint de um amaciante formulado com di-alquil imidazolnio, cujos principais ctions so identificados na Tabela 5: Tabela 5. Identificao dos ons da amostra de amaciante contendo di-alquil imidazolnio cidos Graxos a C16 C16 C16:1 Quaternrio de Amnio C16 C16 C18:1 C18 C18
a

m/z 574 576 602 602 604 628 630 632

C16:1 C16 C18 C18:1 C18 C18:1 C18:1 C18

C16=cido palmtico; C18=cido esterico; C18:1=cido oleico

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Como no caso anterior, o espectro de massas mostra que o surfactante empregado foi produzido a partir de matria-prima insaturada (ons de m/z 630, 628, 602 e 574 que possuem cadeia alqulica derivada do cido oleico ou palmitoleico). Informaes estruturais de surfactantes catinicos tambm foram obtidas por experimentos ESI-MS/MS e so mostradas na Figura 7.

Figura 7. ESI(+)-MS/MS de ons dos surfactantes: A) di-alquil dimetil amnio (m/z 522) B) esterquat (m/z 640) C) di-alquil imidazolnio (m/z 628).

50

A fragmentao por CID de di-alquil dimetil amnio (Figura 7A) ocorre atravs da perda neutra de um alceno e a formao de amina terciria protonada. Este fato auxilia na identificao das cadeias graxas que compem a molcula; como por exemplo, o on de m/z 522 apresenta como produtos de fragmentao os ons de m/z 298 (octadecil dimetil amina) e 270 (hexadecil dimetil amina), formados pelas perdas de hexadeceno e octadeceno, respectivamente. As molculas de esterquat, quando fragmentadas, originam ons dioxolanlios graxos (Figura 7B), atravs da perda neutra de uma amina terciria, que auxiliam na caracterizao das cadeias graxas que compem cada on. Deste modo, os fragmentos de m/z 255, 283 e 311 indicam que o on precursor de m/z 640 constitudo por uma mistura de duas molculas de esterquat: uma contendo duas molculas de cido palmtico (R1=R2= C15H31) e outra constituda pelos cidos esterico (R1 = C17H35) e mirstico (R2 = C13H26). Os experimentos de ESI-MS/MS dos ons de di-alquil imidazolnio tambm so elucidativos, pois a dissociao destes ons ocorre atravs de dois mecanismos paralelos com a formao de ons cclicos caractersticos. Conforme mostra a Figura 7C, o on precursor de m/z 628 (formado por duas cadeias graxas derivadas do cido oleico), ao ser fragmentado, produz o on 1-metil 2-alquil imidazolnico (m/z 321), com a perda do grupo amida lateral e o on azodioxolanlio (m/z 308), com formao de uma amina graxa neutra do tipo, 1-metil 2-alquil imidazolina Uma molcula contendo cadeias graxas derivadas dos cidos esterico (C18) e linolico (C18:2) apresentaria a mesma razo massa/carga (m/z) de 628. Contudo, atravs do espectro de massas (Figura 7C) se observa a ausncia deste composto, visto que os produtos de fragmentao so provenientes de uma molcula de di-alquil imidazolina derivada de duas cadeias de cido oleico.

51

3.1. Produtos Amaciantes de Baixa Qualidade ou Falsificados

A Figura 6 demonstra que o fingerprint por ESI(+)-MS tambm til na identificao de amaciantes de baixa qualidade que foram adquiridos no comrcio informal.

Figura 8. ESI(+)-MS de amaciantes de roupa formulado com mono alquil trimetil amnio. Grupos alquilas: C16= cadeia cetlica; C18= cadeia esterica; C18:1= cadeia oleica. Basicamente, identifica-se como principal tensoativo catinico nestas formulaes, mono alquil trimetil amnio, atravs do on de m/z 284 (hexadecil trimetil amnio), denominado comercialmente cetil trimetil amnio. Foram tambm identificados os ons de m/z 310 (octadecenil trimetil amnio) e 312 (octadecil trimetil amnio).

52

Nota-se que possvel diferenciar a matria-prima adotada na formulao dos amaciantes clandestinos, uma vez que existem diferenas nos espectros de massas entre as amostras, em relao composio graxa dos sais de mono alquil trimetil amnio. Na amostra da Figura 8B, detectaram-se tambm traos de di-alquil dimetil amnio (ons de m/z 522 e 550), provavelmente adicionado pelo formulador para melhorar a desempenho do produto. Cabe ressaltar que a molcula catinica deve conter duas cadeias graxas, a fim de que ela exiba propriedades amaciantes satisfatrias nos tecidos.50,52,56 O cloreto de cetil trimetil amnio utilizado como agente lubrificante e antiesttico em produtos condicionadores de cabelo,75 e o seu emprego em formulaes para amaciante txtil em produtos clandestinos se justifica pelo fato de ser mais barato que o cloreto de di-alquil dimetil amnio. A Figura 9 ilustra um exemplo de amaciante de roupas falsificado, pois o rtulo da amostra indica cloreto de di-alquil imidazolina como tensoativo catinico da formulao; entretanto foi identificado outro surfactante, com ons moleculares de m/z 403, m/z 431 e m/z 459. Esta afirmao foi confirmada atravs dos experimentos de ESI-MS/MS, exemplificado na Figura 10, onde se verificou que o surfactante presente o cloreto de alquil amida propil dimetil benzil amnio, sendo que a cadeia alqulica derivada de sebo hidrogenado.

Figura 9. ESI(+)-MS de um amaciante de roupa falsificado formulado com alquil amida propil dimetil benzil amnio e alquil amida propil dimetil amina.

53

O on de m/z 403 corresponde ao tensoativo com a cadeia alqulica derivada da tetradecil amida, o on de m/z 431 derivada da hexadecil amida, enquanto o on de m/z 459 da octadecil amida. No se encontrou relato da aplicao deste tipo de surfactante em amaciante de tecidos; sabe-se somente que este quaternrio de amnio empregado como agente anti-esttico em formulaes cosmticas.76 O espectro de massas do produto na Figura 9 tambm apresenta os ons de m/z 313, m/z 341 e m/z 369 que correspondem a alquil amida propil dimetil aminas, precursores do quaternrio de amnio utilizado na formulao. Neste caso, as molculas so detectadas na forma protonada, de modo que o on de m/z 313 corresponde a tetradecilamida propil dimetil amina, o on de m/z 341 a hexadecilamida propil dimetil amina e o on de m/z 369 a octadecilamida propil dimetil amina que no processo de obteno do surfactante so quaternizadas com cloreto de benzila. As alquil amida propil dimetil aminas possuem um efeito de amaciamento muito pequeno, menor que os quaternrios de amnio com uma cadeia graxa e so empregados em condicionadores capilares.77 Alquil amida propil dimetil benzil amnio e alquil amida propil dimetil amina (com cadeias graxas similares) formam o mesmo produto de fragmentao por ESI-MS/MS (Figura 10).

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Figura 10. ESI(+)-MS/MS dos surfactantes A) Octadecilamida propil dimetil amnio (m/z 459) B) Octadecilamida propil dimetil amina (m/z 369) detectados no amaciante falsificado. Como pode ser observado no espectro de massas, os ons de m/z 459 (octadecilamida propil dimetil amnio) e 369 (octadecilamida propil dimetil amina) so molculas com cadeia graxa derivada do cido esterico e ambas ao serem fragmentadas formam o on de m/z 324. Entretanto, o quaternrio de amnio tem uma perda neutra de dimetil benzil amina, enquanto a amida-amina perde dimetil amina pela fragmentao.

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4. Concluso
possvel identificar os surfactantes catinicos utilizados em formulaes amaciantes txtil atravs da tcnica ESI(+)-MS. O procedimento desenvolvido rpido e eficiente, medida que no necessita de extrao da amostra, nem o emprego de padres para caracterizar os tensoativos. Alm de identificar, tambm foi possvel obter a distribuio de homlogos (diferentes molculas que compem o surfactante). Ressalta-se que cada categoria de surfactante catinico apresenta um fingerprint diferenciado, ou seja, possui ons diagnsticos caractersticos que permitem a identificao precisa do tensoativo utilizado no produto. Os resultados mostram que se pode aplicar a tcnica como uma ferramenta no controle do processo de produo dos surfactantes catinicos, uma vez que subprodutos e compostos intermedirios utilizados como matria-prima para obteno do quaternrio de amnio foram detectados. Outra vantagem reside no fato de que o procedimento se mostra vivel na deteco de falsificaes de amaciantes comerciais, como foi verificado por meio do uso de outro tensoativo (cloreto de alquil amida propil dimetil benzil amnio) e de produtos de baixa qualidade (a base de cloreto de cetil trimetil amnio) que no possuem propriedades que conferem amaciamento satisfatrio aos tecidos. A aplicao da tcnica no se restringe somente a caracterizao de surfactantes em produtos amaciantes, mas pode ser estendida a outras matrizes que adotam tensoativos catinicos, como desifentantes, condicionadores capilares, produtos de enxge bucal, bem como outras classes de surfactantes.

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