UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CHIAPAS FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS CAMPUS IV TAPACHULA

MATERIA: DIAGNOSTICO MOLECULAR

CATEDRATICO: LUIS MIGUEL CANSECO A.

TRABAJO FINAL
ALUMNOS:
CAROLINA MICHELLI GONZALES CASILLAS ANA DOMINGUEZ LOPEZ ANDREA FABIOLA RODAS COSSIO LEONARDO MENDOZA VILLATORO PAOLA HERNNDEZ ARZETA

SEMESTRE: 6

GRUPO: B

TAPACHULA CHIAPAS A 23 DE MAYO, 2012.

Introduccin
Salmonella Salmonella es un gnero de bacterias que pertenece a la familia Enterobacteriaceae, formado por bacilos gramnegativos, anaerobios facultativos, con flagelos pertricos y que no desarrollan cpsula (excepto la especie S. typhi[cita requerida]) ni esporas. Son bacterias mviles que producen cido sulfhdrico (H2S). Fermentan glucosa por poseer una enzima especializada, pero no lactosa, y no producen ureasa. Es un agente productor de zoonosis de distribucin universal. Se transmite por contacto directo o contaminacin cruzada durante la manipulacin, en el procesado de alimentos o en el hogar, tambin por va sexual. Algunas salmonellas son comunes en la piel de tortugas y de muchos reptiles, lo cual puede ser importante cuando se manipulan a la vez este tipo de mascotas y alimentos. Taxonoma El gnero Salmonella es de taxonoma difcil, modificada en estos ltimos aos por el aporte de estudios moleculares de homologa de ADN que han clarificado el panorama taxonmico de las enterobacterias. Para la bacteriologa clnica, Salmonella es un bacilo patgeno primario (como Shigella, Yersinia y ciertas cepas de E. coli), anaerobio facultativo, algunos mviles y no fermentan la lactosa. S. typhi es la nica serovariedad que no produce gas en la fermentacin de los azcares. Clsicamente se distinguan tres nicas especies patgenas primarias: S. typhy, S. cholerae-suis y S. enteritidis. A su vez, segn la serotipificacin de Kauffman y White, eran clasificadas en ms de 2000 serotipos con base en los antgenos flagelares H (proteicos) y antgenos somticos O (fraccin polisacrida del lipopolisacrido bacilar). S. typhi posee adems un antgeno de virulencia (Vi). El tratamiento taxonmico actual de Salmonella ha simplificado el espectro, reagrupando todas las cepas (patgenas o no) en dos nicas especies: S. enterica y S. bongori. sta ltima (previamente subespecie V) no es patgena para el ser humano. La especie S. enterica tiene seis subespecies (a veces presentadas como subgrupos bajo numeracin romana): I enterica II salamae IIIa arizonae IIIb diarizonae

IV houtenae V S. bongori, ya incluida en una especie distinta VI indica Cada subespecie a su vez, est conformada por diversos serotipos, habindose identificado hasta la fecha ms de 2500. Una de ellas es S. enterica subsp. enterica (o subgrupo I), se divide en cinco serogrupos: A, B, C, D y E. Cada serogrupo comprende mltiples componentes, son las serovariedades (serotipos). Esta clasificacin implica una terminologa de uso poco prctico en la clnica bacteriolgica, por lo tanto, en trminos mdicos, la nomenclatura es diferente y simplificada, pues se consideran los nombres de los serotipos (serovaridades) de Salmonella como si fuesen nombres de especies. Por ejemplo, "Salmonella enterica subgrupo entrica serotipo Typhimurium", se refiere como "Salmonella typhimurium". Estas denominaciones, aunque menos correctas desde el punto de vista taxonmico estricto, son de aceptacin mundial. Importancia clnico epidemiolgica, las ms de 2000 serovariedades de Salmonella pueden agruparse en tres divisiones ecolgicas (spp. son subespecies): Salmonella spp. adaptadas a vivir en el ser humano, entre ellas, S. typhi, S. paratyphi A, B y C; Salmonella spp. adaptadas a hospederos no humanos, que circunstancialmente pueden producir infeccin en el hombre, entre ellas, S. dublin y S. cholerae-suis; Salmonella spp. sin adaptacin especfica de hospedero, que incluye a unas 1800 serovariedades de amplia distribucin en la naturaleza, las cuales causan la mayora de las salmonelosis en el mundo. Epidemiologa La Salmonella recibe su nombre por Daniel Elmer Salmon, un patlogo veterinario estadounidense, aunque fue su colega y contemporario Theobald Smith (conocido por su trabajo con anafilaxis) quien descubri la bacteria en 1885, aislndola de cerdos con clera.1 2 La salmonelosis entrica est habitualmente causada por Salmonella enterica subespecie enterica, con ms de 2.000 cepas descritas,3 es de importancia en pases en desarrollo, donde su incidencia est en aumento, y en algunos pases, la enfermedad es endmica.4 La salmonelosis es una enfermedad de transmisin alimentaria, en especial por alimentos de origen animal y pueden aparecer en brotes en escuelas, guarderas, restaurantes y residencias de ancianos. El perodo de incubacin es por lo general entre 12 a 36 horas, a veces hasta 6 y 48 horas. El tamao del inculo de Salmonella requerido para causar enfermedad sintomtica en adultos sanos no est bien establecido. En general, es necesaria una inoculacin relativamente grande, entre y organismos.5 En un humano voluntario, apenas 25 organismos fueron suficientes para

producir la enfermedad. En otro estudio con 12 voluntarios, que ingirieron entre 17 y organismos, en ms de la mitad de los casos menos de 1000 organismos fueron suficientes.6 Al ser estas bacterias muy poco resistentes a los medios cidos, no sobreviven en el estmago. Sin embargo, un pH estomacal artificialmente elevado, poco cido, reduce enormemente el nmero de organismos necesario para provocar sntomas. Los organismos que llegan hasta el intestino se topan con otras dos defensas: la rapidez del trnsito intestinal, y la flora bacteriana normal. Los que logran vencer estas defensas, se adhieren a la mucosas y producen, bien un patrn secretor (diarrea aguda acuosa), bien un patrn invasor (enfermedad clnica conocida como fiebre entrica, fiebre tifoidea o fiebre paratifoidea).5 6 La salmonella habita normalmente en la superficie de los huevos, la piel de tomates y de aquellos frutos y verduras que tienen contacto con la tierra. La fiebre tifoidea es otra de las enfermedades que pueden ser ocasionadas por bacterias del gnero Salmonella. Habitualmente esta enfermedad est provocada por cepas de Salmonella enterica susp. enterica serotipo Typhi (Salmonella Typhi). El nico reservorio de la Salmonella Typhi es el hombre, de modo que se transmite de una persona a otra.7 La fiebre paratifoidea tiene ciertas similitudes con la fiebre tifoidea, pero tiene un curso ms benigno. Esta enfermedad est habitualmente ocasionada por los serotipos Paratyphi A, Paratyphi B y Paratyphi C. Las infecciones por S. Paratyphi A son comunes en frica, la paratifoidea B es ms frecuente en Europa que se presenta como una gastroenteritis severa y la paratifoidea C es una infeccin rara, generalmente vista en el Extremo Oriente que se presenta como una septicemia. Microbiologa Salmonella crece con facilidad en agar sangre formando colonias de 2 a 3 milmetros. En laboratorios de microbiologa clnica se asla con medios selectivos, Selenito, Hektoen, SS o XLD para inhibir el crecimiento de otras bacterias patgenas y de la flora intestinal saprfita. Tienen los siguientes antgenos: Somtico O, del lipopolisacrido en la pared celular, termoestable y es la base de la clasificacin en subgrupos. Flagelar H, de la protena flagelina, termolbil, es la base de la clasificacin de especies. Envoltura Vi, termolbil, responsable de la virulencia de varias especies patognicas. Patogenia Produce salmonelosis con un perodo de incubacin de entre 5 horas y 5 das, diarrea y dolor abdominal. A travs de las heces (excremento) del enfermo se elimina un gran nmero de esta bacteria y se observa fiebre entrica con un periodo de incubacin de 7 a 28 das, causante de dolor de cabeza, fiebre, dolor abdominal y diarrea, erupcin mculo-papulosa en pecho y espalda. Los enfermos presentan un perodo de convalecencia entre 1 y 8 semanas y las personas curadas

eliminan Salmonella. Tambin puede ocasionar fiebres entricas o infeccin intestinal por intoxicacin con algunos alimentos. Virulencia Salmonella, al igual que otras bacteria Gram negativas, usa un sistema secretor especializado (denominado tipo III) para inyectar dentro de clulas eucariotas ciertas protenas efectoras que manipulan las vas de sealizacin celular y de la bacteria. Se ha observado la entrega de la protena SipA a clulas que debilitan la maquinaria intracelular del husped y promueven la virulencia en mamferos en aproximadamente 10 minutos, dejando la bacteria virtualmente deprovista de SipA, efectivamente estableciendo un nicho para la multiplicacin intracelular de la bacteria.

Objetivos
Encontrar el mtodo de Dx mas adecuado para salmonella typhi. Se demostrara apartir de la utilizacin de bancos de datos genticos y sofwares vitiales de PCR la especificidad de los primers utilizados.

Se utilizara una enzima de restriccin para observar el comportamiento del gen amplificado en un gel de agarosa al 2% en el sofwer NEBcutter

Mtodo de Dx de Salmonella Typhi por PCR anidada.

En un estudio realizado se demostr que esta mezcla de primers aumenta la sensibilidad de encontrar solo cepas de salmonella mviles que son patgenas para el hombre y animales por lo que se opto por realizar una PCR multipe con el objeto de obtener dichas cepas dentro deuna muestra en humanos con la finalidad de obtener un estudio mas especifico para salmonella typhi.

A continuacin mostramos como funcionan los primer por separado, teniendo sobreentendido k es posible que no sean, por si solos especficos para salmonella de tipo mvil. Primer phoP 337-L

Primer pho 338-R

Primer Hin 1750-L

Primer Hin 1751-R

Primer H-li

Primer H-li 1788- L

Primer 1789-R

Debe de tomarse en cuenta que la combinacin de estos tres pares de primers es lo que va a dar un resultado especifico para la bacteria de salmonela de la clase mvil, adems es importante tomar en cuenta que las especificaciones de estadarizacion de la pcr son las que se marcan en el articulo y son:

The PCR mixture contained the reaction buffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8.3], 1.5 mM MgCl2, 0.01% [wt/vol] gelatin), 200 ,uM (each) deoxynucleoside triphosphates, 50 ng of phoP primers, 1.25 U of Taq polymerase, template DNA, and deionized water for a final volume of 50 ,ul. For multiplex PCR, 100 ng (each) of Hin and H-li primers was used. The reaction mixture was subjected to PCR under the following conditions: heat denaturation at 94C for 2 min and then an additional 30 cycles with heat denaturation at 94C for 1.5 min, primer annealing at 62C for 30 s, and DNA extension at 72C for 1.5 min. After the last cycle, samples were maintained at 72C for 7 min to complete synthesis of all strands.

Posteriormente logramos obtener un primer que es especfico para salmonella typhi el cual usaremos en el siguiente paso de PCR anidada.

Demostrando la especificiad del primer por el mtodo informatico.

Se puede observar que por separado pueden amplificar para otras cepas de bacterias con un porcentaje bajo de posibilidades, sin embargo en conjunto y despus de la primera PCR multiple hacemos a un lado esas posibilidades dejando un alto grado de especificidad para salmonella typhi. A continuacin se adjunta las secuencias amplificadas.

> gb|U04734.1|STU04734 Salmonella typhi Rawlings 5S ribosomal RNA gene, complete sequence and 23S ribosomal RNA gene, partial sequence Length=2326 Sort alignments for this subject sequence by: E value Percent identity Query start position Subject start position Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.54 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Minus Query Sbjct 17 479 GGTTGTCATGCCAATGCACT |||||||||||||||||||| GGTTGTCATGCCAATGCACT 36 460 Score

Score = 32.2 bits (16), Expect = 131 Identities = 16/16 (100%), Gaps = 0/16 (0%) Strand=Plus/Plus Query Sbjct 1 177 TGCCGGAAACGAATCT |||||||||||||||| TGCCGGAAACGAATCT 16 192

Forward
TGCCGGAAACGAATCT tgcc ggaaacgaat ct

Revers
GGTTGTCATGCCAATGCACT a gtgcattggc atgacaacc

ORIGIN
1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 gaattctttt ttccctactc gagttcggca ggaaacgaat tcatccgcca tagctcaacg ccttcaggag gctttcagca gaacaccagt ccagcgccca accactttaa gccgacatcg tatcccggag acaaccactg tcgcatgggg tggggtcagg cttttatctt aaacatcttc catcgctgcg acctaaagtc cttatctctt gatgcgtcca cggcagatag atggcgaaca aggtgccaaa taccttttat atttttacat agaccccaca tgggaccacc tcgttcccga ggcgttgtaa cttacacacc tcagggagaa ccgcatttag ctccggtcct ggaccgaact gcataccctt caccgccgtc ccgttgagcg caatttactg ctaccatcgg gcgctagtgc aaatccggaa ggttaagcct cggcctatca ctcatctcgg ctaccgggca ctcgtactag gtctcacgac gggacctact gatatgaact atggcccttc cttaatttga cgctacggcg cgccaggaaa tcagtgctga cacggttcat acgtcgtcgt ggcaagtttc gtgcattggc gagcagcccc gttctaaacc tcagccccag cttgggcggt cattcagaac tgcctggcag tttcacttct ttctgttgcc aaatcgtctc tagtaccggt cttcaacgtt gtgcttagat atgacaaccc cctcagttct cagctcgcgt gatgtgatga atcagcctgt caccggatca

781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 //

ctatgacctg ttgcactaac tttaggagga ggtccacgtt tggcgtccac caagctatag cagcgagttc gtgcaggtcg ccgccgttta tccggcaccg tttttaataa tcacttcacc ccttcacccg ggggtacgat gcttcagcac ggaacacata cgtcccccct cctttcggcc cttggtcttc acttctgata tacccaacaa cttccgcgca ctaagccaac tgggacctta gtgtgtctcc gatggccccc

ctttcgcacc ctcctgatgt gaccgcccca agaacatcaa acttcaaagc taaaggttca aatttcactg gaacttaccc ccggggcttc ggcaggcgtc acagttgcag tacgtgtcag agttctctca ttgatgttac cgtagtgcct cctacacgct tcgcagtaac tcgccttagg cggcgagcgg cctccagcat cacacggtgt ggccgactcg atcctggctg gctggcggtc cgtgataaca tagccgaaac

tgctcgcgcc ccgaccagga gtcaaactac acattaaagg ctcccaccta cggggtcttt agtctcgggt gacaaggaat gatcaggagc acaccgtata ccagctggta cgtgccttct agcgccttgg ctgatgctta cgtcgtcacg taaaccggga accaagtacg ggtcgactca gcttttcacc gcctcacagc cgctgccgca accagtgagc tctgggcctt tgggttgttt ttctccggta agtgctctac

gtcacagtcg ttagccaacc ccaccagaca gtggtatttc tcctacacat ccgtcttgcc ggagacagcc ttcgctacct ttcgcttgcg cgtccacttt tcttcggctg cccgaagtta tattctctac gaggcttttc cctcagtgtt caaccgtcgc ggaatattaa ccctgccccg cgctttatcg acaccttcac gcttcggtgc tattacgctt cccacatcgt ccctcttcac ttcgcagttt ccccggagat

cagtcaagct ttcgtgctcc ctgtccgcaa aaggtcggct caaggctcaa gcgggtacac tggccatcat taggaccgtt ctgaccccat cgtgtttgca acttcagctc cggcaccatt ctgaccacct ctggaagcag aaagtgaacc ccggccaaca cccgtttccc attaacgttg ttacttatgt aggcttacag atggtttagc tctttaaatg ttcccactta gacggacatt gcatcgggtt gaattc

ggcttatgca tccgttactc cccggatcac ccatgcagac tgttcagtgt tgcatcttca tacgccattc atagttacgg caattaacct cagtgctgtg cgtgagtaaa ttgcctagtt gtgtcggttt ggcatttgtt ggatttacct tagccttctc atcgactacg gacaggaacc cagcattcgc aacgctcccc cccgttacat atggctgctt accatgactt agcacccgcc ggtaagccgg

Por ultimo tambien es necesario especificar la optimizacion de la PCR la cual es:

We therefore concluded that the optimum MgCl2 was from 2.0 to 3.0 mM for Salmonella Typhi We found the optimum primer pair concentrations to be: 0.2 M for ST11/ST15, 1.2 M for Fli15/Typ 04 and 1.2 M for sty-1/sty-2.

The thermal cycling conditions were tested at different concentrations of MgCl2. The annealing temperature that yielded the greatest amount of amplicons was 50C or 53C for both Salmonella Typhi and Salmonella Typhimurium

The optimized thermocycling conditions were: initial denaturation at 94C for 2 min; followed by 35 cycles: denaturation at 94C for 1 min, primer annealing at 53C for 1 min and extension at 72C for 1 min; an additional cycle at 72C for 7 min; and maintenance at 4C until analysis.

The DNA template for Salmonella Typhi amplified 300-bp fragments.

Adems se realizo en el programa de NEB cutter el corte con la enzima EcoR1 para poder observar de esta manera cuantos fragmentos se libera en nuestro gen de salmonella typhi y posteriormente se corri el gel de agarosa al 2% de forma virtual y los resultados fueron los siguientes: En el gel de agarosa se observo que esta enzima realiza dos cortes liberando 3 fragmentos del gen amplifiado, los cuales son de los siguientes tamaos 1. 2. 3. 2320bp 5bp 1bp

Conclusiones
Tomando en cuenta que hasta la fecha no se conoce un mtodo Dx 100% especifico para salmonella typhi el supuesto hipottico presentado en este trabajo plantea dicha posibilidad. Hasta la fecha se conocen mtodos de Dx por medios de cultivo, pruebas serolgicas, pruebas de inmunofluorecencia, pruebas enzimticas, pruebas con quimioluminicencia e incluso pruebas de PCR, todos ellos carentes de un 100% de especificidad, por lo cual se opto por la ms sensible que es una combinacin de PCR Multiplex con PCR Anidada lo que nos plantea la posibilidad de un 100% de especicicidad y efectividad para el mtodo Dx planteado. Como se menciono al en el presente trabajo es de suma importancia tomar en cuenta la optimizacin y estandarizacin sin lo cual la Rx se vera comprometida. Es de gran ayuda no solo para el principiante de Dx molecular sire no para investigadores de alto renombre la utilizacin de sofwares como los utilizados en el presente protocolo para la realizacin de hiptesis de investigacin y el mejoramiento de las tcnicas de Dx.