CINTICA ENZIMTICA SEMINARIOS

1. Para un enzima que sigue la cintica de Michaelis-Menten, qu valor de velocidad inicial, expresado en funcin de Vmx, se obtendra en un ensayo en el que se utilice: a. [S] = de Km, b. [S] = Km, c. [S] = 2 Km y d. [S] = 102 Km
a. b. c. d.

[S] = de Km Vo = 1/3 de Vmx [S] = Km Vo = 1/2 de Vmx [S] = 2 Km Vo = 2/3 de Vmx d. [S] = 102 Km Vo = 102/101 de Vmx, es decir, el 99% de Vmx

Por mucho que aumente la concentracin de soluto [S], La velocidad inicial Vo nunca alcanzar la Vmx. La relacin entre Vo y [S] no es lineal, sino hiperblica.

2. La penicilinasa o -lactamasa, un enzima presente en algunas bacterias, inactiva la penicilina hidrolizndola. La masa molecular de este enzima es de 29.6 kD. Se midi la cantidad de penicilina hidrolizada en 1 minuto en 10 mL de una solucin de 10-9g de penicilinasa purificada en funcin de la concentracin de penicilina. En el tiempo de reaccin la concentracin de penicilina no vari significativamente (es decir, que estamos en condiciones de V0). Resultados del ensayo: a) Representar V0 frente a la [S] y hacer la representacin doble recproca. Presenta la penicilinasa una cintica de Michaelis-Menten? Si es as, calcule grficamente Km, y Vmx. S, la presenta. Al representar grficamente y V0 frente a la [S] obtenemos una hiprbola, que vemos en la primera grfica. Posteriormente calculamos los inversos y representamos la cintica de la penicilinasa (los dobles recprocos):

Extrapolamos: La pendiente es constante, con lo que la recta es infinita. Extrapolamos y prolongamos la recta, que se cruza con la ordenada, y obtenemos el valor de 1/Vmx. La recta se cruza adems con las abscisas, y el punto de corte se corresponde en este caso con el valor de -1/Km. Nos olvidamos del signo de -1/Km, y tomamos el valor absoluto de esa fraccin. Grficamente, Km = 1/0.19 = 5.2 M Vmx = 1/1.46 = 0.084 nmoles/min = 6.84 * 10-10 moles/min.

a) Cul es el nmero de recambio de la penicilinasa en estas condiciones experimentales? Suponga un centro activo por molcula El nmero de recambio es el nmero de molculas de sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo por una molcula de enzima cuando esta est saturada de sustrato. La Vmx revela el nmero de recambio de una enzima si se conoce la concentracin de centros activos [E]T. El nmero de recambio se obtiene dividiendo la Vmx entre [E]T. [E]T = 10-9gr * (1mol/29.6 x 103gr) = 3.38 x 10-4 moles, en 10 ml. Considerando el centro activo por molcula de penicilinasa y que el ensayo se realiza en 10ml: N de recambio = (6.84) x 10-10 moles/min / 3.38 x 10-4moles) / 60seg/min = 337 s-1 = Vmx/[E]

b) Las bacterias que posean penicilinasa sern sensibles o resistentes a la penicilina? Las bacterias son resistentes a la penicilina.

3. En general, la sensibilidad de los orientales a las bebidas alcohlicas es mayor que la de los occidentales. La cantidad de etanol necesaria para provocar taquicardia y enrojecimiento facial es muy inferior para algunos asiticos que para los europeos. Los efectos fisiolgicos son provocados por el acetaldehdo procedente de la deshidrogenacin del alcohol etlico en una reaccin catalizada por la alcohol deshidrogenasa del hgado.

CH3-CH2OH + NAD+ CH3-CHO + H+ + NADH A su vez, el acetaldehdo debe se eliminado. a. Explique el proceso fisiolgico de eliminacin del acetaldehdo b. Seale la diferencia metablica observada en la poblacin caucsica con respecto a la oriental. El acetaldehdo es normalmente eliminado por una aldehdo deshidrogenasa mitocondrial, que lo convierte en acetato. En algunos asiticos, la forma normal de la aldehdo deshidrogenasa, con una Km para acetaldehdo baja, est ausente. Estos individuos poseen nicamente la forma citoslica de Km alta (menor afinidad) del enzima, la cual conlleva un nivel estacionario elevado de acetaldehdo en la sangre tras el consumo de alcohol. Esta es la causa del incremento de la sensibilidad al alcohol.

4. Supongamos que la Km de la hexoquinasa (HK) es 0.1mM para la glucosa y que la de la glucoquinasa (GK) es 15mM para el mismo sustrato. Calcule con cada enzima la V0 expresada como % Vmx para concentraciones de glucosa de 3, 5, 10 y 25mM. Qu repercusin cintica pueden tener los cambios fisiolgicos de concentracin de glucosa sobre las actividades de los dos enzimas?

La hexoquinasa (HK) tiene una Km de 0.1mM para la glucosa. La glucoquinasa (GK) tiene una Km de 15mM para el mismo sustrato. V0 expresada como % Vmx para concentraciones de glucosa de 3, 5, 10 y 25mM. [Glucosa] =3mM V0 para la HK: 96,7% de Vmx. V0 para la GK: 16,6% de Vmx. [Glucosa] = 5mM V0 para la HK: 98% de Vmx. V0 para la GK: 25% de Vmx. [Glucosa] =10mM V0 para la HK: 99% de Vmx. V0 para la GK: 40% de Vmx. [Glucosa] = 25mM V0 para la HK: 99,6% de Vmx. V0 para la GK: 62,5% de Vmx.

A partir de los 3mM de glucosa, la HK est permanentemente saturada (su Km es 0,1mM). Para la GK, de las concentraciones de sustrato dadas, tan solo la ltima supera mnimamente la Km, y trabaja por debajo de su saturacin. La HK est saturada desde la primera concentracin de glucosa (3mM) dada.

La Glucoquinasa (Hexoquinasa IV) se expresa especficamente en el hgado. Que su Km sea mucho mayor que la de la Hexoquinasa presente en el cerebro por eritrocitos, y que sea menos sensible a la inhibicin por la Glucosa 6 Fosfato, posibilita la funcin heptica de reservorio.

El valor de la glucosa en sangre durante el ayuno entre comidas oscila entre los 70 y los 100 mg/dl. Valores por debajo de 70 son indicadores de una hipoglucemia, y por encima de 125 lo son de una hiperglucemia.

5. Se realiz un experimento de cintica enzimtica en el que se midi la velocidad V0 frente a la concentracin de sustrato, primero en ausencia de la sustancia A y seguidamente en su presencia. Se obtuvieron los siguientes datos:

La sustancia A es un activador o un inhibidor? Si es un inhibidor, indique de qu clase se trata. Calcule Vmx y Km en ausencia y presencia de A. Tenemos dos reacciones, una de ellas en presencia de A y otra en ausencia de la misma. Debemos obtener la grfica de los dobles inversos, de todos los valores de la tabla: 1/[S] 0.4 0.3 0.2 0.1 1/V0 (-A) 3.13 2.50 1.92 1.45 1/V0 (+A) 5.0 3.85 2.78 1.79 Ambas rectas tienen comn el punto de corte con las ordenadas, que representa 1/V0, con lo que tienen el mismo valor de Vmx, y Km es mayor en presencia de la sustancia A.

En ausencia de A: Km: 7.1 M Vmx: 1.25 moles/min.

En presencia de A: Km: 12.5 M Vmx: 1.25 moles/min.

Mantiene la Vmx, pero la Km se ve modificada, de forma que estaremos hablando de una sustancia A inhibidora reversible competitiva. Si aumenta el valor de Km, disminuye la afinidad por el sustrato.

6. Una preparacin enzimtica tiene una actividad especfica de 150 U.I./mg de protena y contiene 5 mg de protena/ml. a) Calcule la Vmx de la reaccin en un ensayo en el que se han utilizado 10L de dicha preparacin enzimtica. Por acuerdo internacional, se define una unidad de actividad enzimtica (U.I. = Unidad Internacional de actividad) como la cantidad de enzima que produce la transformacin de 1.0 mol de sustrato / min. a 25 C en condiciones ptimas de reaccin y medida. N de U.I. = Vmx expresada en mol de sustrato/min. La actividad especfica es el nmero de unidades de actividad enzimtica por mg de protena presente en la mezcla de reaccin. La actividad especfica constituye una medida de la pureza enzimtica, ya que aumenta a medida que se va purificando el enzima. Actividad especfica: (U.I.)/mg de protena Actividad especfica: 150 U.I. /mg protena

La preparacin enzimtica (de 10L = 0,01 ml) contiene 5mg de protena por ml. En un ml de solucin hay 5gr, por lo que en la preparacin enzimtica de 0,01 ml habr 0,05 mg de protena. Si la actividad especfica es de 150 U.I. por mg de protena, por 0,05 mg de protena hay 7,5 U.I. (o lo que es lo mismo, 7.5 mol/min).

b) En otro ensayo en el que se utiliz la misma cantidad de enzima, en presencia de un inhibidor reversible a una concentracin final de 2M, la Vmx obtenida fue de 3.5 moles/min, no modificndose el valor de Km. Indicar qu tipo de inhibidor es y calcular su Ki.

La Km no se ve modificada, pero s la Velocidad mxima, por lo que estamos ante un inhibidor reversible no competitivo. Vmx = 7.5 mol/min Vmx = 3.5 moles/min Vmx > Vmx Km = Km

3,5 = [1 / 1+ (2/Ki)] * Vmx Ki = 1,75 M

7. Cuando se produce un dao severo del tejido heptico se libera a la sangre un isoenzima (E1). Despus de un intenso ejercicio se libera a la sangre un isoenzima E2 que cataliza la misma reaccin que E1. Los dos isoenzimas E1 y E2 se pueden diferenciar fcilmente porque tienen valores muy distintos de Km sobre el mismo sustrato. La afinidad por el sustrato es mayor para el isoenzima E2 con una Km de 20 M. Utilizando los siguientes datos experimentales obtenidos de una muestra de sangre de un paciente, que ingres inconsciente en urgencias, decida cual sera el diagnstico ms probable: sufre el paciente una enfermedad heptica o est extenuado fsicamente? Los datos experimentales permiten obtener directamente los valores de Vmx y Km sin necesidad de representacin grfica. La Vmx es de 30 mol/min. Si aadimos sustrato, esta velocidad se mantiene constante. La Km = [S] cuando la velocidad inicial es igual a la mitad de la Vmx, es decir, cuando es igual a 15 mol/min. De modo que la E1 tiene una Km de 300, y la E2 una Km de 20. Asumimos pues que en la tabla estamos midiendo E1, luego E2, al tener una Km ms baja que E1, muestra una mayor afinidad por el sustrato. Al presentar el paciente E1 en sangre, lo ms probable es que el paciente sufra de una enfermedad heptica.

8. En los hemates de un paciente de gota se hallan niveles anormalmente altos de fosforribosil pirofosfato (PRPP). Por otra parte, los valores de Vmx y Km para la PRPP sintetasa eran normales. Sabiendo que la PRPP sintetasa es un enzima alostrico y conocido su mecanismo de accin, sugiera dnde puede presentar la anomala.

La gota puede resultar de una sobreproduccin de nucletidos de purina, lo cual lleva a un exceso de sntesis de cido rico. Aumentan los niveles de PRPP sintetasa, y esto es lo que produce la biosntesis aumentada de nucletidos de purina y pirimidina, tanto por ser sustrato de las reacciones como por efectos alostricos. Anormalidades metablicas son resultado de la baja solubilidad del cido rico en un medio acuoso, por eso forma cristales de urato sdico en las articulaciones de las extremidades y en el tejido intersticial renal. La PRPP sintetasa es la que crea el PRPP que despus dar lugar a nucletidos de purina. Esta enzima se inhibe con GMP y AMP. Los niveles aumentados de PRPP y la hiperuricemia son debidos a que los productos formados de la ruta AMP/ADP y GMP/GDP no han sido capaces de inhibir la PRPP unindose al centro inhibidor alostrico. Se sugieren dos posibilidades:

Mutacin en el centro inhibidor, lo que provoca una dificultad de unin con el inhibidor. Mutacin en el mecanismo de acoplamiento del centro inhibidor (unido al inhibidor) y al centro cataltico.