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CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN POR TAMAO

La cromatografa de exclusin por tamao, que tambin se ha denominado cromatografa de penetrabilidad sobre geles o de filtracin sobre geles, es una tcnica muy valiosa que se aplica particularmente a especies de elevado peso molecular. Los rellenos para la cromatografa de exclusin por tamao estn constituidos por pequeas partculas (10um) polimricas o de slice que contienen una red de poros uniforme en los que puede difundir las molculas del soluto y del disolvente. Las molculas del soluto y del disolvente. Las molculas son atrapadas eficazmente en los poros y eliminadas del flujo de la fase mvil. El tiempo de residencia medio en los poros depende del tamao efectivo de las molculas de los analitos. Las molculas que son ms grandes que el tamao medio de poro del relleno son excluidas y de esta forma, esencialmente no se retienen y, por tanto, son las primeras que son significativamente menores que los poros, pueden penetrar a travs del laberinto de poros y as resultan atrapadas durante ms tiempo; stas son las ultimas en eluir. Entre estos dos extremos, estn las molculas de tamao intermedio cuya penetracin media en los poros depende de su dimetro. Dentro de este grupo, tienen lugar el fraccionamiento, que est directamente relacionado con el tamao molecular y en cierto modo con la forma molecular. Obsrvese que las separaciones por exclusin por tamao difieren de los otros procedimientos que se han considerado, en que no implican una interaccin qumica o fsica entre los analitos y la fase estacionaria. De hecho, se procura evitar este tipo de interacciones dado que originan una mala eficacia de la columna. Obsrvese tambin que a diferencia de otros tipos cromatografa, hay un lmite superior para el tiempo de retencin, ya que ningn analito es retenido ms que aquel para el cual la penetracin en la fase estacionaria es total. RELLENOS DE COLUMNA. En cromatografa de exclusin por tamao se encuentran dos tipos de relleno: partculas polimricas y partculas de slice en ambos casos los dimetros oscilan de 5 a 10 um. Los de slice tienen la ventaja de gran rigidez, lo que facilita el relleno y permite el empleo de presiones ms elevadas; una mayor estabilidad, lo que permite el uso de una gran variedad de disolventes incluyendo el agua; una equilibracin ms rpida al cambiar el disolvente; y una buena estabililidad a elevadas temperaturas. Los inconvenientes de las partculas de slice son su tendencia a retener solutos por adsorcin de las molculas del soluto. En un principio, la cromatografa de exclusin por tamao se llev a cabo fundamentalmente utilizando como copolmeros estireno-divinilbenceno entrecruzados de estructura semejante (excepto en que los grupos de cido sulfnico estn ausentes). El tamao de poro es estos polmeros se controla por el grado de entrecruzamiento entre las cadenas polimricas y por tanto con la cantidad relativa de divenilbenceno presente en la produccin. Como consecuencia, los rellenos polimricos se han comercializado con distintos tamaos promedio de poro. Los geles de estireno-divinilbenceno son hidrofbicos

y de este modo slo pueden utilizarse con fase mvil no acuosas. Sin embargo, en la actualidad se dispone de geles hidrofilicos, que hacen posible el uso de disolventes acuosos para la separacin de molculas grandes solubles en agua como los azcares. Estos geles hidroflicos son por lo general polmeros sulfonados de divinilbenceno, o poliacrilamidas. Las partculas de vidrio y de slice porosas, que se comercializan actualmente, tienen tamaos promedio de poro que oscilan entre 40 A y 2.500. A fin de reducir la adsorcin, las superficies de estas partculas se modifican por reaccin con sustituyentes orgnicos. Por ejemplo, la superficie de relleno hidroflico tiene la estructura siguiente:

La Tabla 28-6 indica las propiedades de algunos rellenos comerciales tpicos de la exclusin por tamao. TEORA DE LA CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN POR TAMAO El volumen total Vt, de una columna rellena con gel de slice o con un polmero poroso viene dado por:

Donde Vg, es el volumen ocupado por la matriz slida del gel, Vi es el volumen del disolvente retenido

en sus poros, y VO. es el volumen libre exterior a las partculas del gel. Suponiendo que no hay mezcla ni difusin, Vo, tambin representa el volumen terico de disolvente que es

necesario para transportar a travs de la columna a los componentes que son demasiado grandes para entrar en los poros del gel. Sin embargo, de hecho tiene lugar algo de difusin y de mezcla, y como consecuencia de ello los componentes que no son retenidos aparecen originando una banda de forma gaussiana con una concentracin mxima a Vo. Los mximos de banda de los componentes que son suficientemente pequeos para entrar libremente en los potos del gel, aparecern al final de la columna con un volumen de elucin que corresponder a (Vl + Vo). Por lo general. Vi, Vo y Vg son del mismo orden de magnitud y, por tanto, una columna de gel permite separar con un volumen mnimo de eluyente los componentes grandes de los pequeos en una muestra. Las molculas de tamao intermedio pueden transferirse a una fraccin K del disolvente que ocupa los poros; el volumen de elucin Ve, para esas molculas retenidas es Ve=Vo + KVi La ecuacin se aplica a todos los solutos que pasan por la columna. Para las molculas que son demasiado grandes para entrar en los poros, K=0 y Ve = Vo: para las molculas que pueden entrar en los poros libremente, K = 1 y Ve = (Vo + Vi). Al deducir la ecuacin se comidera que no existe interaccin alguna, como la adsorcin. entre las mol- culas del soluto y la superficie del gel. Si hubiera adsorcin, la cantidad de soluto retenido intersticialmente aumentara; con las molculas pequeas. K tendr un valor de mayor que la unidad. La ecuacin anterior puede reordenarse como K = (Ve Vo)/Vi= Cs/CM donde K es el coeficiente de distribucin del soluto. Los valores de K oscilan entre cero, para las molculas grandes totalmente excluidas y la unidad en el caso de las molculas pequeas. El coeficiente de distribucin es un parmetro que puede ser til para comparar distintos rellenos. Adems esto hace posible la aplicacin de todas las ecuaciones de la Tabla 26-5 a la cromatografa de exclusin por tamao. El intervalo til de pesos moleculares para un determinado relleno de exclusin por tamao, se una curva de calibrado como la que se muestra en la parte superior de la Figura 28- 27a. En este caso, se representa el peso molecular, que est directamente relacionado con el tamao de las molculas de soluto, frente al volumen de retencin VR, donde es el producto del tiempo de retencin y el caudal volumtrico. Obsrvese que la escala ordenadas es logartmica. El lmite de exclusin define el peso molecular de una especie por encima del cual no existe retencin. Todas las especies que tengan pesos moleculares mayores que el limite de exclusin, son tan grandes que no se retienen, y eluyen conjuntamente para dar el pico A en el cromatograma que muestra la Figura 28-27b. El lmite de penetracin corresponde al peso molecular por debajo del cual las molculas del soluto pueden pueden penetrar en los poros. Por debajo de este peso molecular, todas las molculas del soluto son tan pequeas que eluyen dando una sola banda, la indicada como D. A medida que los pesos moleculares disminuyen con respecto al lmite de exclusin, las molculas del soluto pasan cada vez ms y ms tiempo, en promedio, en los poros de las partculas y de este modo se mueven progresivamente con mayor lentitud. Es en la regin de penetracin selectiva en la que tiene lugar el fraccionamiento, dando lugar a picos de soluto individuales tales como los picos B y C del cromatograma. Las curvas de calibrado experimentales, semejantes a las tericas de la figura 28-27a.

se obtienen fcilmente por medio de patrones. En muchas ocasiones, estas curvas las suministran los propios fabricantes de los materiales de relleno. Aplicacin de la cromatografa de exclusin por tamao Los mtodos de exclusin por tamao se dividen en cromatografa de filtracin sobre gel y la cromatografa de penetrabilidad sobre gel. En el primer tipo se utilizan disolventes acuosos y rellenos hidrofilicos En el ltimo, se emplean disolventes orgnicos no polares y los rellenos son hidrofobicos. Los mtodos son complementarios en el sentido que en un caso se aplican a muestras hidrosolubles, y en el otro a sustancias solubles en disolventes orgnicos menos polares. Una de las aplicaciones ms tiles del procedimiento de exclusin por tamao consiste en sepa-

Figura 28-27 (a) curva de calibracin en una columna de exclusin por tamao. (b) cromatografa mostrando pico A que contiene todos los compuestos con pesos moleculares mayores que el limite de exclusin, los picos B y C corresponden a los compuestos dentro de la regin de permeabilidad selectiva y el pico D contiene todos los compuestos de peso inferior al limite de penetracin. racin de las molculas de alto peso molecular de productos naturales de las especies de bajo peso molecular y de las sales. Por ejemplo, un gel con un limile de exclusin de varios miles, puede separar bien Un protenas de los aminocidos y de los pptidos de bajo peso molecular. Otra aplicacin til de la cromatografa de penetrabilidad en gel es la separacin de homlogos, y oligmeros. Estas aplicaciones se ilustran en los ejemplos que se muestran en la figura 28-28. El primero que muestra la separacin de una serie de cidos grasos con pesos moleculares entre 116 y 344 mediante un relleno de poliestireno con un lmite de exclusin por tamao de 1.000. El segundo es el cromatograma de una resina epoxi comercial de nuevo mediante un relleno de poliestireno; en este caso. n se refiere al numero de unidades monomricas (Pm = 264) en las molculas de resina.

La Figura 28-29 ilustra una aplicacin de la cromatografa de exclusin por tamao a la determinacin de glucosa, sacarosa y fructosa en cuatro tipos de zumos de fruta. El relleno con un lmite de exclusin de 1.000, era un polmero de poliestireno entrecruzado de caractersticas hidrofilicas por la incorporacin de grupos sulfnicos. Una columna de 25 cm con este relleno tena 7.600 platos a una temperatura de trabajo de 80 C. Otra gran aplicacin de la cromatografa de exclusin por tamao es a la determinacin rpida de los pesos moleculares, o de la distribucin de pesos moleculares en los grandes polmeros o en los productos naturales. En este cuso, se comparan los vo-

Figura 28-28. Aplicaciones de la cromatografa de exclusin por tamao. (a) separacin de cidos grasos. Columna: de poliestireno, de 7.5 x 600mm, un limite de exclusin de 1 x 103. Fase mvil: tetrahidrofurano. Caudal: 1,2mL/min. Detector: ndice de refraccin. (b) anlisis de una resina epoxi comercial (n = numero de unidades monomericas en un polmero). Columna: de slice porosa, 6,2 x 250mm. Fase mvil: tetrahidrofurano. Caudal: 1,3 mL/min. Detector: absorcin UV. lmenes de elucin de la muestra con los volmenes de elucin de compuestos estndar que tengan las mismas caractersticas, qumicas. Las ventajas mas importantes de los procedimientos de exclusin por (amao son. (I) tiempos de separacin cortos y bien definidos (todos los solutos sales de la columna entre Vo y (Vo + Vi) vase la Figura 28-27; (2) batidas estrechas, que conducen a una buena sensibilidad; (3) no hay prdida de muestra, porque los solutos no

Figura 28-29 determinacin de glucosa (G), fructosa (F) y sacarosa (S) en zumos enlatados.

interaccionan con la fase estacionaria; (4) no se desactiva la columna debido a la ausencia de interaccin del soluto con el relleno. Las desventajas son: (1) solo se pueden acomodar un numero limitado de bandas en el cromatograma debido a que la escala de tiempos es corta y (2) no es aplicable a muestras de componentes de tamao semejante, como las mezclas de ismeros. Por lo general, para que la resolucin sea aceptable se necesita que la diferencia sea de al menos un 10 por 100 en los pesos moleculares.

Mtodos que dependen del tamao o la masa. CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR La cromatografa de exclusin molecular o gel- filtracin permite separar a las protenas en funcin de su tamao. Esta tcnica se realiza en una columna que est rellena con un gel poroso insoluble en forma de esferas, cuyos tamaos de poro son conocidos. Las molculas proteicas de menor tamao penetran por los poros, por lo que el recorrido que han de hacer realiza a travs de la disolucin es mayor que el de las molculas de gran tamao, que no penetran en los poros por impedimento estrico; esto hace que las molculas de gran tamao eluyan antes que las pequeo tamao. Por lo tanto, una mezcla de protenas se separarn en funcin del tamao, primero eluirn las de mayor tamao y en ltimo lugar las de menor tamao, las protenas de tamaos intermedios eluirn entre ambos extremos en funcin de su masa. Para poder saber la masa molecular de una protena, previamente ha de hacerse un calibrado de la columna con protenas cuya masa molecular se conoce, y cuyo volumen de elucin se determina experimentalmente La cromatografa se basa en un conjunto de tcnicas asociadas al principio de retencin selectiva. Permite separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.

Posee:
Fase mvil: consiste en un fluido (gas, lquido o fluido supercrtico). Fase estacionaria: se trata de un slido o un lquido fijado en un slido. Cromatografa significa

"Escribir en Colores. El qumico F.F.Runge, que trabajaba con tintas, descubre que los cationes orgnicos se podan separar por migracin cuando se colocaba una solucin que los contena sobre un material poroso, como papel. Biografias SKOOG.HOLLER.NIMEN. Principios de ANLISIS INSTRUMENTAL. MC GRAW HILL. QUINTA EDICIN FUNDAMENTOS TERCERA EDICIN. DE BIOQUMICA ESTRUCTURAL. Protenas.

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