PROCEDIMIENTO RECUENTO DE MICROORGANISMOS HETEROTROFOS EN PLACA.

METODO STANDARD METHODS FOR EXAMINATION OF WATER AND WASTEWATER Seccin Microbiologa de Alimentos 1. 1.1 1.2 OBJETIVO PRT-712.02-072

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Conocer el nmero de microorganismos heterotrficos viables que contiene una muestra de agua. Verificar la calidad bacteriolgica del agua de dilisis especificada en el Decreto Supremo N 2357/94 del MINSAL. CAMPO DE APLICACIN Y ALCANCE

2.

Aplicar este procedimiento a matrices aguas, incluidas las aguas de dilisis que sean recepcionadas para anlisis microbiolgico. 3. FUNDAMENTO

El mtodo de anlisis puede ser en placa en profundidad, en superficie o por membrana filtrante. Para recuento en placa en profundidad o superficie se puede utilizar un agar de alta calidad nutritiva como el agar Plate Count o un agar de baja calidad nutritiva como el agar R2A que tambin es aplicable al mtodo de membrana filtrante. Para membrana filtrante se recomienda el agar m-HPC. Los resultados de este anlisis permiten para las aguas en general: Medir los cambios durante el tratamiento y distribucin Control de piscinas Verificar efectividad de los procedimientos de limpieza y desinfeccin. Determinar el origen de la contaminacin durante el proceso de dilisis. Verificar condiciones ptimas de almacenamiento y transporte del agua utilizada para alimentar el sistema de dilisis.

En cuanto a las aguas de dilisis los resultados permiten:

El Decreto Supremo N 2357/94 especifica que la calidad bacteriolgica del agua a usar en dilisis " cada centro de dilisis debe realizar un cultivo semestral del agua teniendo como recuentos mximos aceptables 200 UFC/mL en agua tratada y 2000 UFC/mL del lquido de dilisis post dializador. 4. 4.1 REFERENCIAS Standard Methods for Examination of Water and Wastewater 21th Ed 2005 pag. 9-34 a 938.

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5. 5.1 6. 6.1

TERMINOLOGA Heterotroficos: Organismos que se alimentan de sustancias orgnicas. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS MATERIALES Y EQUIPOS

6.1.1 Placas Petri estriles de vidrio o de plstico de 90 -100 mm de dimetro. 6.1.2 Tubos de 16 x 160 mm marcados en 9 y 10 mL, que contengan 9 mL de solucin diluyente estril. 6.1.3 Pipetas bacteriolgicas estriles de 1 mL. 6.1.4 Incubadora regulada a 25 1C (rango 20C a 28C) o incubadora a 35C 1C 6.1.5 Bao de agua termorregulado a 47 C 2 C. 6.1.6 Agitador de tubos 6.1.7 Contador de colonias, tipo Quebec de campo oscuro o equivalente. 6.2 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS Para preparar medios de cultivo, reactivos y blancos de dilucin slo se debe usar agua que ha sido tratada por desionizador, para dejar libre de trazas de metales disueltos y componentes bactericidas e inhibitorios. 6.2.2 DILUYENTE: Agua peptonada estril 0.1 %, (Straka and Stokes, 1957) pH 7 0.1 o agua buffer fosfato, distribuida en volmenes de 9 0,2 mL en tubo tapa rosca marcado en 9 y 10 mL o en frascos con 99 2 mL. 6.2.3 AGAR PARA RECUENTO EN PLACA: Es recomendable usar un agar pobre en nutrientes como el agar R2A pH 7.2 con el cual se obtienen recuentos mas altos que con agar Plate Count. En caso de no contar con este agar se puede usar Agar Plate Count Agar o Standard Methods Agar estril, pH 70.1, distribuido en frasco Schott con 200 mL. La formulacin de Merck cdigo 1.00416 es idntica a la descrita en Standard Methods for Examination of Water and Wastewater 21th Ed 2005. (Frmula agar R2A: extracto de levadura 0,5 g, proteosa peptona 0,5 g, casamino cido 0,5 g, glucosa 0,5 g, almidn soluble 0,5 g, dipotasio hidrgeno fosfato 0,3 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,05 g, piruvato de sodio 0,3 g, agar 15 g, agua 1 L pH 7.2, esterilizar a 121 C por 15 minutos).

6.2.1 AGUA RECOMENDADA PARA USO EN MICROBIOLOGIA

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7. 7.1 7.1.1

DESARROLLO PROCEDIMIENTO RECUENTO EN PLACA EN PROFUNDIDAD Recibir en el Laboratorio de Recuentos, las muestras enumeradas en el Laboratorio de Recepcin de Muestras de esta seccin. Estas muestras son procesadas segn el PRT712.01-001 de "Procedimiento de Recepcin de las muestras" y el PRT-712.01-002 de "Procedimiento de procesamiento de muestras de alimentos y agua". Es importante que una vez recolectada la muestra el anlisis se inicie lo ms pronto posible para minimizar los cambios en la poblacin bacteriana. Se recomienda que el tiempo mximo entre la recoleccin de muestras y el anlisis no supere las 8 h (tiempo mximo de transporte 6 h y tiempo mximo para el proceso de anlisis 2 h). Si no se puede analizar dentro de las 8 h mantener refrigerado a < 4C sin congelar. En estas condiciones el tiempo mximo entre la recoleccin de muestra y el anlisis no debe superar las 24 h. Anotar en cuaderno de inscripcin el nmero que identifica las muestras a sembrar. Verificar que el volumen de cada tubo de dilucin marcado, contengan 9 mL. Agitar la muestra 25 veces en arco de 30 cm por 7 segundos o en vrtex por 15 segundos. Preparar diluciones decimales de 101, 10, 10 , etc. a partir de la muestra lquida directa 1 mL a un tubo con 9 mL de diluyente o 1 mL en 99 mL de diluyente (dil 10). Agitar y proceder de igual forma para las diluciones siguientes. Identificar las placas Petri con lpiz azul las que se incubarn a temperatura entre el rango 20 C y 28 por 5 a 7 das o a 35C por 48 h, dependiendo del propsito del anlisis. Para el monitoreo de los cambios de la calidad del agua, los ms altos recuentos sern obtenidos de incubaciones entre 5 a 7 das y entre 20 a 28 C. Colocar, nmero de la muestra y dilucin a cada una de ellas. Sembrar 1 mL por duplicado de la muestra directa y cada dilucin en placas estriles previamente identificadas. Sembrar como mnimo dos diluciones consecutivas.

7.1.2 7.1.3

7.1.4 7.1.5 7.1.6 7.1.7

7.1.8

7.1.9

7.1.10 Tambin se pude sembrar 1 mL en duplicado de la muestra directa y 0,1 mL en duplicado de la muestra directa. A continuacin diluir 10 tomando 1 mL de la muestra directa en 99 mL de diluyente y sembrar de esta dilucin 1 mL en duplicado y 0,1 mL en duplicado. Sembrar como mnimo 2 diluciones consecutivas.

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7.1.11 Utilizar una pipeta para cada dilucin y para remover las alcuotas tanto de la muestra directa como en las diluciones no inserte la pipeta ms de 2 a 3 cm debajo de la superficie. 7.1.12 Al descartar la alcuota a sembrar en la placa mantener la pipeta en un ngulo de 45 con la punta tocando el fondo de la placa o en el interior del cuello del tubo de dilucin. 7.1.13 Levantar la tapa de la placa lo suficientemente alto para insertar la pipeta. 7.1.14 En una pipeta de 1mL el tiempo estimado para drenar o vaciar el contenido desde una marca a la punta es de 2 a 4 segundos. 7.1.15 Si la pipeta no es de vaciado completo, tocar una vez la punta de la pipeta en una zona seca en el fondo de la placa Petri y drenar el volumen restante. 7.1.16 En muestras turbias o aguas residuales remover volmenes de muestra de 0,1mL o menor a partir de las diluciones. No utilice 0,1 mL de muestra directa pero prepare apropiadas diluciones. Y utilice siembra en duplicado para cada dilucin. 7.1.17 Verter en cada placa Petri aproximadamente 15 mL de agar R2A o Plate Count. previamente fundido y mantenido en bao de agua a 47 2 C. La eleccin del agar es conforme al objetivo el anlisis, es decir el agar Plate Count se recomienda si el laboratorio desea hacer comparaciones del medio o continuar con datos anteriores de anlisis realizados con Plate Count. El agar R2A se recomienda para anlisis que requieren un valor ms exigente en la enumeracin. 7.1.18 Mezclar el inculo con el medio fundido, inclinando y girando las placas. La forma adecuada de llevar a cabo esta operacin sera la siguiente: 7.1.18.1 7.1.18.2 7.1.18.3 7.1.18.4 7.1.18.5 Mover la placa con movimientos de vaivn 5 veces en una direccin, Hacerla girar 5 veces en el sentido de las agujas del reloj, Mover con movimientos de vaivn en una direccin que forme ngulo recto con la primera y Hacerla girar 5 veces en el sentido contrario a las agujas del reloj. El tiempo estimado entre el comienzo del anlisis y el vertido del agar no debe sobrepasar los 20 minutos.

7.1.19 Una vez solidificado el agar, invertir las placas rpidamente para prevenir el crecimiento de colonias invasivas por acumulacin de humedad. Incubar a temperatura entre el rango de 20C a 28C durante 6 das 1 da o a 35C por 48 h dependiendo del propsito del anlisis.

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7.1.20 Durante la incubacin mantener la humedad dentro de la incubada de tal menera que las placas no pierdan ms del 15% de humedad en peso. Para impedir la prdida de humedad ubicar un recipiente con agua al fondo de la incubadora pero para evitar la oxidacin de las paredes por dentro y bandejas stas deberan ser acero inoxidable de alta calidad o de aluminio anodizado. Para incubaciones por largo perodo en incubadoras no humedificadas, sellar las placas en bolsas plsticas. 7.1.21 Con el fin de validar los resultados se recomienda realizar controles de ambiente, control de esterilidad del medio de cultivo y diluyente y registrar esta informacin en los registros respectivos.

7.2 7.2.1 7.2.2 7.2.3 7.2.4 7.2.5 7.2.6 7.2.7

LECTURA Luego de cumplir el perodo de incubacin, realizar la lectura de las placas Si no es posible leerlas prontamente, guardarlas a 4C por no ms de 24 horas, pero esto no hay que hacerlo de rutina. Realizar el recuento con un contador de colonias modelo Quebec de campo oscuro u otro equivalente que de un aumento e iluminacin equivalente. Examinar las muestras dudosas con mayor aumento para distinguir las colonias de materias extraas. Evitar la fatiga ocular que puede causar imprecisiones. Anotar la dilucin usada y el nmero de colonias contadas en cada placa. Registrar los resultados en el registro RG-712.00-068 y los controles realizados en los registros especificados en el punto 8. de este procedimiento RECUENTO DE COLONIAS Y REGISTRO Para el recuento de hetertrofos se sugiere indicar el mtodo usado, tiempo y temperatura de incubacin y el medio de cultivo seleccionado. Para el clculo de recuento de colonias en placa se realiza de acuerdo al siguiente esquema:

7.3

7.3.1 7.3.1.1 7.3.1.2 7.3.1.3

Placas normales (30 - 300 colonias): Seleccionar las placas libres de crecimiento invasivo. Contar todas las colonias incluyendo aquellas de tamao muy pequeo. Anotar por dilucin, el nmero de colonias contadas en cada placa.

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Realizar el clculo para recuento de microorganismos hetertrofos en placa, dividiendo el nmero total de colonias por placa por el volumen de muestra o calcular el promedio (duplicado de palcas de la misma dilucin) multiplicado por el factor de dilucin correspondiente. Casos especiales Placas sobrepobladas (mas de 300 colonias) : Anotar los recuentos de placas sobrepobladas como muy numerosos para contar (MNPC) cuando disponga de placas normales. Si una o ms placas presentan ms de 300 colonias, para el clculo utilice las placas ms cercanas a 300 colonias. Ccalcular el promedio e informar como recuento estimado. Si no dispone de placas normales en las diluciones sembradas y el nmero de colonias lejos excede 300 colonias contar las colonias en porciones de la placa si su distribucin es homognea y calcular el recuento estimado en placa (RPES) como sigue: Si hay menos de 10 colonias por cm, contar las colonias en 13 cuadrados, seleccionar 7 cuadrados consecutivos horizontales de la placa y 6 cuadrados consecutivos verticales formando ngulo recto, contar cada cuadrado slo una vez.La suma de las colonias de los 13 cuadrados multiplicar por 5 para calcular el nmero de colonias por placa correspondiente a un rea de 65 cm2 o bien calcular el promedio de los 13 cuadrados y multiplicar por 65, multiplicar el valor final por el factor de dilucin respectivo. Para placas de rea 57 cm2 calcular el promedio, multiplicar por 57 y por el factor de dilucin respectivo. Si hay ms de 10 colonias por cm contar las colonias en cuatro de tales porciones. En ambos casos, multiplicar el nmero promedio de las colonias contadas por cm por el rea de la placa usada para estimar el nmero de colonias por placa. Cada laboratorio debe determinar el rea en cm de las placas usadas. Si hay mas de 100 colonias por cm, registrar como >100 ufc / cm y calcule el valor estimado multiplicado por el factor de dilucin respectivo y por el rea correspondiente a la placa utilizada o bien calcule el valor estimado como > 100 ufc/ cm multiplicado por el rea correspondiente a la placa utilizada y divida por el volumen menor de muestra sembrada.

7.3.2 7.3.2.1 7.3.2.1.1 7.3.2.1.2

Si no se tienen placas que cumplan con el requisito anterior, proceder de la siguiente manera:

7.3.2.1.3

7.3.2.1.3.1

7.3.2.1.3.2

7.3.2.1.3.3

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7.3.2.2 7.3.2.2.1

Placas con menos de 30 colonias (< 30 colonias) Comnmente no se siembra ms de 2,0 mL de muestra, sin embargo cuando el nmero de colonias desarrollado en 2,0 mL es inferior a 30 registre el resultado observado e informe como recuento en placa estimado (RPES) < 30 ufc/ mL. Si fuese necesario realizar el clculo, promediar el recuento de la misma dilucin de las placas en duplicado e informar como recuento en placa estimado (RPES). Placas sin desarrollo de colonias Cuando ninguna de las placas presente desarrollo de colonias, registrar como sin desarrollo en la dilucin correspondiente (SD) e informar como < 1 ufc /mL. Crecimiento invasivo El primer tipo son las colonias en cadenas, que al parecer son causadas por desintegracin de un grupo de bacterias cuando la placa Petri es rotada para mezclar el agar con la alcuota analizada. Si solamente existe una de tales cadenas contar como una colonia. Si una o mas cadenas parecieran originarse de fuentes distintas, contar cada fuente como una colonia. No contar cada crecimiento individual de tal cadena como una colonia. El segundo tipo de colonia invasora es la que se desarrolla en una pelcula de agua entre el agar y el fondo de la placa Petri. El tercer tipo es la que se forma en una pelcula de agua en el costado o en la superficie del agar. Estos dos ltimos tipos revelan una acumulacin de humedad en el punto en el cual se origina el crecimiento invasivo. Cuando la alcuota de siembra es uniformemente distribuda en el medio, las bacterias raramente desarrollan colonias invasivas. Si en las placas seleccionadas se presenta invasin, realizar recuento de colonias solamente: Si el rea invadida no excede la mitad de la placa. Si las colonias estn bien distribuidas fuera del rea invadida, donde las colonias individuales aparecen prximas pero no se tocan a una distancia al menos igual al dimetro de la colonia ms pequea. Contar las colonias que difieren en apariencia como morfologa y color como colonias individuales.

7.3.2.3 7.3.2.3.1 7.3.2.4 7.3.2.4.1

Las colonias invasivas son generalmente de tres tipos:

7.3.2.4.2 7.3.2.4.3 7.3.2.4.4

7.3.2.4.5 7.3.2.4.5.1 7.3.2.4.5.2

7.3.2.4.5.3

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Si no se cumple lo anterior, registrar como crecimiento invasivo o accidente de laboratorio. Los laboratorios con un 5 % de placas cubiertas con ms de 1/4 de las placas con crecimiento invasivo, deberan tomar medidas inmediatas, para eliminar este problema (reducir la humedad ambiente en la cmara o estufa de incubacin y mezclar cuidadosamente el agar con la siembra). Accidente de laboratorio o inhibidores de crecimiento bacteriano: Cuando una placa presenta contaminacin u otra condicin insatisfactoria registrar como "Accidente de Laboratorio". Especificar. El analista puede sospechar la presencia de sustancias inhibidoras en las muestras que estn siendo analizadas, cuando las placas no tienen crecimiento o tienen proporcionalmente menos crecimiento en las diluciones mas bajas. Tal resultado no debera ser interpretado como evidencia de inhibidores hasta confirmar la presencia de ellos en el producto.

7.3.2.5

7.3.2.5.1.1 7.3.2.5.1.2

7.4 7.4.1

EXPRESION DE RESULTADOS Clculo y registro de resultados Para los clculos del Recuento Standard en placa considerar slo los dos primeros dgitos. Si el tercer dgito es 6, 7, 8 o 9 adicionar una unidad al segundo dgito. Si el tercer dgito es 1, 2, 3 o 4 considerar solamente los dos primeros dgitos. Cuando el tercer dgito es 5, agregar una unidad al segundo dgito si este es impar y mantener el segundo dgito si este es par. Usar ceros para los dems dgitos hacia la derecha. Rto Heterotroficos 13.000 12.000 16.000 14.000

7.4.1.1 7.4.1.2

7.4.1.3

Ejemplo: Lectura calculada 12.700 12.400 15.500 14.500

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7.4.2 7.4.2.1 7.4.2.1.1 7.4.2.1.2 7.4.2.2

Placas normales Cuando los recuentos de los duplicados de placas de slo una de las diluciones caen dentro del rango 30 a 300 colonias : Utilizar para el clculo los recuentos obtenidos en placas normales. Sacar promedio y multiplicar por el factor de dilucin. Si los recuentos de las placas de dos diluciones consecutivas caen dentro del rango 30-300 colonias calcular el RAM segn la siguiente frmula: C [ ( 1 x n1 ) + ( 0.1 x n2 ) ] x d

N= donde : N n1 n2 d

= nmero de colonias por ml o g de producto = nmero de placas contadas de la menor dilucin. = nmero de placas contadas de la dilucin consecutiva. = dilucin de la cul fue obtenido el primer recuento 1 : 100 1 :1000 33 y 28

C = suma de todas las colonias contadas en todas las placas

Ejemplo 232 y 244

N = 232 + 244 + 33 + 28 [( 1 x 2 )+( 0.1 x 2 )] x 0,01 = 537 0.022 = 24.409 = 24000

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7.4.2.3

Cuando los recuentos de las placas en duplicado caen tanto dentro como fuera del rango 30-300 colonias, usar slo aquellos recuentos que estn dentro de este rango. Todas las placas con menos de 30 colonias Cuando las placas de ambas diluciones tienen menos de 30 colonias cada una, informar el recuento como menor de 30 por el recproco del factor de dilucin menor. 1 : 1.000 2 0 Rto ( mL o g ) < 3.000 < 3.000

7.4.3 7.4.3.1 Ejemplo 1 : 100 18 0 7.4.4 7.4.4.1

Todas las placas con mas de 300 colonias Cuando las placas de ambas diluciones tienen ms de 300 colonias cada una (pero menos de 100 por cm) contar las placas ms cercanas a 300, sacar promedio y multiplicar por el recproco de la dilucin. 1 : 1.000 640 Rto ( mL o g ) 640.000 estimado ( RPES )

Ejemplo 1 :100 MNPC

( MNPC = Muy numeroso para contar ) 7.4.5 7.4.5.1 Ejemplo 1 : 100 TNPC TNPC * 1 : 1.000 7.150* 6.490** R A M ( mL o g ) > 6.500.000 * ( RPES ) >5.700.000 **( RPES ) Todas las placas con mas de 100 colonias promedio por cm Estimar que el Rto es mayor de 100 veces la mayor dilucin sembrada, por el rea de placa utilizada y por el recproco de la dilucin.

basado en un rea de placa de 65 cm ( 9 cm )

** basado en un rea de placa de 57 cm ( 8,5 cm )

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7.4.6 7.4.6.1 7.5 7.5.1 7.5.2

Todas las placas con crecimiento invasivo, presencia de inhibidores o accidente de laboratorio. Informar segn corresponda.

INFORME DE RESULTADOS Informar el recuento de heterotrficos en unidades formadoras de colonias (UFC) por mililitro (UFC/mL). Expresar el Resultado con slo un nmero entero y un decimal multiplicado por 10 elevado a la potencia correspondiente. Ej 2.400 2,4 x 103 UFC/mL. REPRODUCIBILIDAD Y ERROR PERSONAL El resultado obtenido al contar por segunda vez las colonias de una placa determinada debe presentar: Una diferencia mxima del 5% en el caso de que este recuento lo realice la misma persona. Una diferencia mxima del 10% en el caso de que este recuento lo haya realizado otra u otras personas. Cuando la diferencia entre ambos es superior a estos lmites, puede deberse a defectos visuales, a la dificultad de reconocer las colonias muy pequeas o lo que es mas frecuente, a la incapacidad para diferenciar las colonias de las partculas ms pequeas.

7.6 7.6.1

7.6.1.1 7.6.1.2 7.6.1.3

7.7 7.7.1

CONTROLES Chequear esterilidad de: Agua de dilucin Agar para recuento en placa ( Plate Count o agar Standard Methods) Pipetas Placas Petri

7.7.1.1 7.7.1.2 7.7.1.3 7.7.1.4

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Control de ambiente por mtodo de sedimentacin en placa: Mesn de siembra Flujo laminar Control de temperatura Control de temperatura de incubadora diariamente a 1 hora de la maana y a ltima hora en la tarde. Control de temperatura del bao termorregulado para mantener agar cada da que se siembren muestras.

8. 8.1

REGISTROS Registro anlisis de recuento de hetertrofos

9. ANEXOS No Aplica