Espermiograma.

Segn los criterio de OMS 2012

Prof. MSc. Luis Sarabia Villar. e mail: lsarabia@med.uchile.cl: Si es un paciente o profesional solicite su hora o curso al mismo correo. Programa de Anatoma y Biologa del Desarrollo. Facultad de Medicina. Universidad de Chile. Documento en preparacin. Introduccin El presente texto busca simplificar y ayudar a la comunidad hispano parlante a implementar las recomendaciones realizadas por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) en su reciente manual WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen (fifth edition). En este caso indicaremos las recomendaciones de la OMS y comentaremos estas indicaciones con la experiencia del autor. En la dcada del 50 aparecen las importantes contribuciones de Mac Leod donde comparaba los resultados obtenidos del anlisis seminal de personas frtiles con los obtenidos de pacientes con problemas para concebir un hijo. Se comprob una fuerte correlacin entre la movilidad y fertilidad potencial y que la probabilidad de la concepcin dependa del porcentaje de clulas activas y de la calidad de la movilidad, Mac Leod (1951) encontr que por encima de 20 millones por mililitro (mL.) no haba aumento de la fertilidad potencial. De sus trabajos surgen las condiciones mnimas que debe reunir un esperma para ser considerado con capacidad fecundante. Sin embargo, en base a estos valores lmites, debe tenerse en cuenta que si algn resultado es inferior al valor mnimo correspondiente, debe compensarse con un aumento correlativo de otro y que siempre se habla en trmino de probabilidad para que un apareja conciba un hijo, sin embargo, en vista de la nueva evidencia, estos valores han cambiado a lo largo del tiempo, lo que se aprecia al comparar los manuales de la OMS en sus versiones, primera edicin (1982), segunda edicin (1987), tercera edicin (1992), cuarta edicin (1999) y por ltimo la quinta edicin WHO laboratory manual for the Examination and proccessing of human semen (2010), al cual simplemente nos referiremos como el manual OMS 2010.

Figura 1 a: Sistema Reproductor masculino (SRM)

Figura 1 b: Epiddimo extrado despus de una

orquiectoma, con la finalidad de recuperar El semen normal es una mezcla de espermatozoides suspendidos en las secreciones espermatozoides. (Foto L. Sarabia) que provienen del testculo y epiddimo (fotografa), las que se combinan al momento de la 1

eyaculacin con las secreciones de la prstata, vesculas seminales y glndulas bulbouretrales. Por lo tanto, el anlisis del semen provee informacin sobre la produccin de espermatozoides en los tbulos seminferos y condicin fisiolgica de estos tejidos.

Recoleccin de la muestra y entrega.

Las indicaciones se deben entregar al paciente en forma escrita y oral, de una forma clara, en lo referente a la recoleccin y transporte del semen. El manejo de la muestra debe ser muy cuidadoso en el laboratorio, ya que toda muestra biolgica puede ser potencialmente peligrosa por la presencia de virus y bacterias patgenas. La muestra debe ser recolectada por masturbacin. El eyaculado se recoge en un frasco limpio, estril, de boca ancha (fig. 4), cerca del laboratorio para as, limitar el tiempo de exposicin del semen a las fluctuaciones de la temperatura y mantener el control entre coleccin de la muestra y su anlisis. Debe mantener la temperatura entre los 20 y 37 C a temperaturas inferiores a 5 C los espermatozoides experimentan el Schock trmico que se caracteriza por la disminucin de la movilidad de manera irreversible. Sin embargo, excepcionalmente una muestra puede ser colectada en casa despus de una demostrada inhabilidad del paciente de producir una muestra por masturbacin cerca del laboratorio. b) La movilidad espermtica declina con el tiempo y las variaciones de temperatura. En estos casos hay que ser muy claros y dar las instrucciones por escrito y oralmente al paciente.
a)

Instrucciones para el paciente (Se entregan por escrito) 1.- La muestra debe estar completa. (Esto es esencial para un correcto anlisis), oralmente se le puede explicar al paciente que la primera porcin de l lquido seminal contiene la mayor cantidad de espermatozoides. 2.-Deber rotular el frasco con el nombre del paciente y hora de emisin del eyaculado. 3.-Deber entregar la muestra al laboratorio mximo dentro de una hora de emitida. 4.-Durante el transporte al laboratorio, la muestra debe ser mantenida entre 20 C y 37 C. El laboratorio por su parte indicar la hora de recepcin y anlisis de la muestra junto a la especificacin que la muestra fue obtenida fuera del laboratorio. b) Cuando la muestra no se puede recolectar por masturbacin se debe utilizar un condn especial para recoleccin de semen. Ningn otro tipo de condn es recomendable. El coitus interruptus no es un medio adecuado para recolectar la muestra. c) El paciente debe tener un mnimo de 2 das de abstinencia sexual, pero no ms all de los 7 das de abstinencia (ojala con una abstinencia constante en cada muestra del mismo paciente). Se debe procurar que el tiempo de abstinencia sea registrado en das para estandarizar los protocolos de trabajo. La abstinencia debe ser valorada de acuerdo a la frecuencia de las relaciones sexuales en la pareja. Con un menor perodo de abstinencia a la media sexual, se puede producir una disminucin en la densidad espermtica o del volumen seminal. Con una abstinencia mayor a los 7 das, se puede ver incrementado el nmero de espermatozoides inmviles y morfolgicamente alterados. Episodios febriles, intervenciones quirrgicas o tratamientos farmacolgicos recientes deberan aplazar el espermiograma hasta despus de 70 das despus (ciclo espermatognico).
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d) Dos muestras como mnimo son necesarias para la evaluacin inicial, si los resultados entre ambas muestras son marcadamente diferentes, muestras adicionales deben ser evaluadas. e) El intervalo entre cada toma de muestra no debe ser menor a 7 das ni mayor a 3 semanas. f) La recoleccin de la muestra debe ser completa. Es importante sealar que la primera porcin del eyaculado emitido es la que contiene la mayor concentracin de espermatozoides (75 % aproximadamente), y por esta razn es importante que no se pierda, de lo contrario se pide una nueva muestra para realizar el anlisis con el mismo rango de abstinencia antes sealada, las ltimas porciones eyaculadas se caracterizan porque predominan los espermatozoides inmviles y de mala morfologa, en donde la segunda fraccin es predominantemente de origen prosttico y la tercera (ltima) fraccin es predominantemente de origen de las glndulas seminales. g) El frasco de recoleccin debe ser adecuadamente rotulado con los datos del paciente, con la fecha y la hora de recoleccin de la muestra y en presencia del paciente para evitar posteriores errores de rotulacin. Recoleccin de la muestra para reproduccin asistida o microbiologa. La finalidad es disminuir al mximo la posibilidad de contaminacin principalmente de bacterias comensales que estn en la piel y que podran contaminar la muestra. Por lo tanto, todo el material a utilizar debe ser estril. En estos casos el paciente debera 1.-Orinar 2.-Lavar sus manos y el pene con jabn. 3.-Secar sus manos y pene con toallas desechables. 4.-Eyacular dentro del frasco. Recoleccin de la muestra mediante condn. Una muestra puede ser colectada en condn durante una relacin sexual solo bajo circunstancias excepcionales, tal como demostrada incapacidad de producir una muestra por masturbacin. Condiciones a tomar en cuenta. 1.- Solo condones no txicos diseados especialmente para no daar a los espermatozoides se podrn entregar al paciente por el laboratorio. 2.- Se deber entregar al paciente las instrucciones precisas para usar el condn, cerrarlo y transportarlo hasta el laboratorio. 3.- Durante el transporte hasta el laboratorio, la muestra deber mantenerse entre 20 C y 37 C. 4.- El examen deber consignar que la obtencin de la muestra fue por condn y fuera del laboratorio (fig 2). Nota: No se debern usar condones de ltex comunes ya contiene agentes que interfieren con la movilidad espermtica. El coito interruptus no es indicado para la recoleccin de semen ya que la primera porcin del eyaculado, contiene la mayor concentracin espermtica, y esta puede perderse, Adems, se puede producir la contaminacin de la muestra y
3 Figura 2: Condn para espermiograma.

una baja del pH debido a la acides de los fluidos vaginales que podran adems afectar a la movilidad espermtica. Nota: Hay que tomar en cuenta que si el hombre no puede obtener una muestra seminal por masturbacin, se recomienda la obtencin con condn apropiado y entregado por el laboratorio o en ltimo caso por el test post coital que entregara la informacin de sus espermatozoides, teniendo en consideracin el efecto de los fluidos vaginales sobre los espermatozoides

Los pasos bsicos en el anlisis del semen son los siguientes: 1.- A los 0-5 minutos despus de emitida la muestra, se registran los datos del paciente y se coloca en una incubadora a 37 C. hasta que licu. 2.- A los 20-25 minutos, se evala la licuefaccin, la apariencia visual y se toma nota del olor si este esta alterado. 3.- A los 30-60 minutos, se evala la viscosidad, la movilidad espermtica, la agregacin/aglutinacin espermtica, otros tipos celulares y el debris. Se realizan los test para anticuerpos, se evala la vitalidad espermtica. Se hacen las diluciones para determinar la concentracin espermtica, se separan 100 L de semen para evaluar clulas inflamatorias, se tien las lminas para evaluar la morfologa espermtica, se recupera y centrifuga el semen para el anlisis bioqumico posterior si corresponde. 4.- Mas tarde, se hace el recuento de espermatozoides en una cmara Neubauer. Si hay un nmero > a 1 x 106 clulas redondas/mL en el semen, se hace una evaluacin de clulas inflamatorias, se tien los frotis para evaluacin de la morfologa espermtica y de clulas redondas. 5.- En el mismo da o despus si la muestra es congelada, se realiza el anlisis bioqumico de las secreciones de la prstata (zinc), vescula seminal (fructuosa) y epiddimo (glucosidasa).

MANIPULACIN INICIAL DE LA MUESTRA. Las muestras de semen pueden tener agentes infecciosos peligrosos (VIH, hepatitis, herpes, gonorrea, sfilis, etc.). La utilizacin de vestimenta adecuada, guantes, as como evitar cualquier contacto directo con la muestra por parte del personal debe ser de estricto cumplimiento. EXAMEN MACROSCOPICO El anlisis debe ser hecho mediante inspeccin simple inmediatamente despus de la liquefaccin, preferiblemente antes de los 30 minutos, pero no ms all de una hora, para
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prevenir la deshidratacin o cambios en la temperatura que afectan la calidad del lquido seminal. (Espinoza-Navarro, O. and Sarabia, L. 2011) Rango de Valores Normales Segn O.M.S, 2010 WHO laboratory manual for the Examination and proccessing of human semen Entre parntesis se indica el rango de valores limites inferiores. LICUEFACCIN: (Tiempo normal entre 5-60 minutos a 37 C). Inmediatamente despus de la eyaculacin la muestra es tpicamente una masa gelatinosa y coagulada. Dentro de unos pocos minutos, a temperatura ambiente, la muestra de semen comienza a licuarse, Hacia los 15 minutos la muestra debera estar licuada. Hay que tener presente que la presencia de moco puede interferir en el anlisis y rara vez la muestra no licua antes de una hora, si esto no ocurriese dentro de la hora se debe registrar como licuefaccin incompleta a la hora. Una vez licuada la muestra, se debe mezclar suavemente el semen con un movimiento rotatorio para reducir el error en la determinacin de la concentracin espermtica. El semen normal puede contener cuerpos gelatinosos de origen prostticos normales que no se licuan pero que no parecen tener importancia clinica. Sin embargo, los hilos de moco pueden interferir con la movilidad y recuento espermtico. Licuefaccin retardada: Ocasionalmente algunas muestras no licuan a la hora y en estos casos, un tratamiento adicional debe ser realizada, mezclando mecnicamente o por digestin enzimtica, en estos casos, sin embargo en base a nuestra experiencia no hemos conocido un laboratorio en Latinoamrica que utilice la digestin enzimtica y en la ltima encuesta del Programa para la estandarizacin del anlisis seminal que involucro a 30 expertos latinoamericanos realizadas en Santiago de Chile el 2010, todos indicaron usar en sus laboratorios solo la licuefaccin obtenida con jeringa y aguja (licuefaccin mecnica), haciendo pasar la muestra a travs de una guja 18G o 19G de 6 a 10 veces Figura (Sarabia et al., 2010). Sin embargo, 2: Lquido seminal con viscosidad aumentada. sabemos que al libera a los espermatozoides del impedimento mecnico que influye sobre la movilidad de los espermatozoides, la movilidad espermtica si es que aumenta no representar necesariamente lo que ocurre in vivo. CONSISTENCIA: La viscosidad, est en relacin a cmo fluye la muestra desde una pipeta. La muestra debe caer en forma de pequeas gotas. Si se forma un hilo al caer la muestra desde la pipeta, se dice que hay una viscosidad anormal (filancia). Cuando el hilo que se forma es > de 2 cm., se dice que hay una viscosidad elevada. La viscosidad elevada se reconoce rpidamente ya que al intentar pipetear la muestra, esta se adhiere fuertemente
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a la punta de pipeta. Los mtodos para bajar la viscosidad son los mismos que para lograr la licuefaccin de la muestra. APARIENCIA, COLOR, OLOR: Deben ser evaluados a temperatura ambiente, dentro de la primera hora despus de emitida la muestra. Una muestra normal tiene una apariencia homognea, un color blanco opalescente a gris amarillento y un olor caracterstico. (Se informa como normal). Un aspecto translucido se relaciona con una baja concentracin espermtica y con ausencia de clulas de la espermatognesis, leucocitos hemates o grmenes y un aspecto heterogneo se observa cuando queda material sin licuar. Un Color Amarillo intenso en los casos que hay leucocitos (piospermia), herrumbre indica presencia de sangre hemolizada (vesiculitis o prostatitis), rojo indica presencia de sangre (hemospermia por traumatismo o neoplasia de las vas seminales). Casi siempre se debe a una afeccin banal denominada hemosperma crnica y un color verdoso se correlaciona con infeccin de pseudomonas algunas vitaminas y frmacos pueden alterar el color del lquido seminal. Olor: Un olor fecal indica la presencia de E. coli. VOLUMEN: ( 1.5 mL): El volumen del eyaculado es principalmente aportado por las vesculas seminales y glndula prosttica, con un pequeo aporte de las glndulas bulbouretrales y el epiddimo. El volumen del lquido seminal es esencial para obtener el nmero total de espermatozoides y clulas no espermticas en el eyaculado. OMS recomienda el clculo por simple pesada del frasco sin muestra y luego con muestra tomando en cuenta que la densidad del lquido seminal es aproximadamente de 1 g/mL (Auger et al., 1995) y pesando cada frasco por separado ya que estos por fabricacin pueden tener diferentes pesos. Cuando el volumen es muy pequeo se informa sin medirlo, como menor de 0.5 mL. Es frecuente el hallazgo de volmenes aumentados sobre 6 mL sin embargo solo se informa el volumen sin hacer un comentario adicional. Alternativamente OMS recomienda que se puede medir directamente el volumen de la muestra si esta la coloca directamente en un frasco graduado tipo probeta de 0.1 mL de precisin, con boca ancha, pero en lo personal no hemos visto laboratorios latinoamericanos que utilicenFigura 3: Lquido seminal con apariencia normal. este medio. No se recomienda la medicin de la muestra pasndola desde el frasco original a una jeringa, probeta o tubo graduado ya que se sabe que se pierde entre 0,3 y 0,9 mL de liquido seminal (Cooper et al., 2007). En nuestro laboratorio hemos encontrado pacientes con volmenes entre 9 y 13 mL. y dos casos de pacientes con 18 y 19 mL de eyaculado que podran deberse a procesos inflamatorios de alguna glndula accesoria. Al contrario, bajos niveles de lquido seminal son caractersticos en obstrucciones del conducto eyaculador, ausencia bilateral del conducto deferente o pobre desarrollo de las vesculas seminales. (Weiske et al., 2000), eyaculacin retrograda o ausencia funcional de los conductos eyaculadores. Este ltimo sndrome fue descrito en 1972 y lo presentan hasta el 15 % de los pacientes azoospermicos,
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los signos que sugieren este sndrome adems del volumen disminuido (< 1 mL) son: azoospermia, pH disminuido (< 7.0) fructosa disminuida (Marcador de funcionalidad de las vesculas seminales), fosfatasa cida o cido ctrico aumentados (marcadores de funcionalidad prosttica). Otros trastornos que pueden dar origen a un volumen disminuido son el sndrome de Klinefelter y el hipogonadismo hipogonadotrofico, por la baja estimulacin de las glndulas sexuales. pH: 7.2 El pH del semen refleja el balance entre diferentes valores de pH de diferentes secreciones de las glndulas accesorias, principalmente alcalino de las vesculas seminales y acida de la prstata. El pH puede ser ms alcalino y no necesariamente significa anormalidad. A medida que transcurre el tiempo la muestra se va alcalinizando por prdida de anhdrido carbnico. Se mide en tanto licua la muestra preferiblemente dentro de los primeros 30 minutos post eyaculacin y en algunos casos se puede medir a lo ms una hora post eyaculacin. La exactitud y calidad del papel se puede verificar con sustancias de pH conocido. Para muestras viscosas, el pH puede ser medido usando un phmetro diseado para medir soluciones viscosas. (Haugen and Grotmol, 1998). Si el pH es menor de 7.0 con un bajo volumen y bajo recuento espermtico, puede deberse a una obstruccin del conducto eyaculador o ausencia bilateral del conducto deferente (Daudin et al., 2000). El pH del semen vara normalmente en un rango muy estrecho (7,2 - 8,0), pocos son los trastornos capaces de alterarlo. Es importante asegurarse que el laboratorio est usando el papel de pH adecuado pues de otra manera las lecturas pueden ser falsas; el mejor es el papel con rango 6,4 - 8,0, que es el que ms se ajusta al pH del semen, pero en su defecto puede usarse el de rango 6,1 - 10,0. Nosotros hemos visto estudios de otros laboratorios donde se ha informado valores de hasta 11,0 lo que desde el punto de vista biolgico es totalmente imposible. Se ha sugerido que un pH elevado (> 8,0) puede considerarse un signo de infeccin seminal si se asocia a otros sntomas y signos de sospecha, mientras que un pH disminuido (< 7,2) se observa cuando existe un dficit de la funcin de las vesculas seminales, en especial en pacientes con el sndrome de ausencia funcional de los conductos eyaculadores.

Figura 4: Medicin de pH con tiras Merck.

PREPARACIN DE LA MUESTRA PARA EL ANLISIS DEL SEMEN

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EXAMEN DENTRO DE LA HORA. La muestra debe ser colocada inmediatamente a una temperatura de 37 C hasta la licuefaccin. Un volumen de 10 l. de semen es adecuado para ser colocado en una lmina portaobjeto y cubierto con una lmina cubreobjeto de 22 mm x 22 mm de esta manera el cubreobjeto queda perfectamente adherido al porta y se forma una profundidad de lquido de 20 m suficientes para asegurar el movimiento rotacional de los espermatozoides durante su avance ya que una profundidad menor interfiere con el avance espermtico y una profundidad mayor nos obligara a obtener diferentes planos focales para observar adecuadamente a todos los espermatozoides del campo. Otras alternativas incluyen cubre objetos de 18 mm x 18 mm en este caso se agregan 6.5 l de lquido seminal para asegurar una profundidad de 20 um. Se determina una aproximacin sobre la concentracin de espermatozoides, la calidad de movimiento, la presencia de clulas redondas, aglutinacin y el debris (que corresponde generalmente a desechos de fragmento celulares). Esto nos dar una idea de cmo proceder con respecto a las diluciones para los anlisis, que incluye recuento en cmara, viabilidad espermtica, con qu volumen hacer el frotis etc. Si la temperatura ambiente es inferior a 22 C debe colocarse previamente los portaobjetos y cubreobjeto a 37 C durante 15 minutos. (OMS 2010; Sarabia et al., 2011) Si la muestra no esta bien mezclada nos resultarn valores totalmente diferentes entre nuestros duplicados de movilidad, vitalidad, concentracin y morfologa espermtica. Para lograr una buena homogeneizacin de la muestra se mezcla la muestra en el mismo recipiente original con movimientos rotacionales suaves y con pipetas desechables, nunca se debe utilizar vortex a altas velocidades debido al dao que genera el movimiento brusco sobre los espermatozoides. Si en el primer anlisis no se observan espermatozoides ni clulas de la espermatognesis, se procede a centrifugar el semen y con el sedimento se hacen preparados para teir e identificar la presencia de espermatozoides o clulas de la espermatognesis. Idealmente se centrfuga a 3.000 g durante 15 minutos y si an as no se encuentran estas clulas se informa de la siguiente manera: En el sedimento de la muestra centrifugada a 3000g durante 15 minutos, no se observaron espermatozoides o clulas de la espermatognesis. AGREGACIN. La adherencia entre espermatozoides inmviles o espermatozoides mviles con hilos de mucus, clulas no espermticas o debris se considera agregacin no especfica y debe ser registrada como tal. AGLUTINACION ESPERMATICA. La aglutinacin se refiere especficamente a espermatozoides mviles y pegados entre ellos, esta aglutinacin puede ser de tipo A: (cabeza-cabeza), B: (cola-cola), C: (solo la punta de la cola), D: Se aglutina las cabezas con las cabezas y a la vez las colas con las colas) y E: Se produce una maraa de aglutinacin. Al mismo tiempo se registra el grado de aglutinacin como Grado 1: Menos del 10 % de los espermatozoides esta aglutinado, Grado 2: entre el 10 y 50 % de los espermatozoides esta aglutinado, Grado 3: Ms del 50 % de los espermatozoides esta aglutinado pero algunos permanecen libres, Grado 4: Todos los espermatozoides estn aglutinados e interconectados. Espermatozoides mviles y pegados a clulas, debris o a espermatozoides inmviles (agregacin) no deben ser informados como aglutinacin. La presencia de aglutinacin no es suficiente para deducir infertilidad por causa inmunolgica, pero es sugestiva de la presencia de anticuerpos anti espermticos que debern investigarse.
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Figura 5: Grados y tipos de aglutinacin espermtica. Pgina 20 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen.

OTROS ELEMENTOS EN EL LQUIDO SEMINAL CELULAS REDONDAS: ( 5x 106 clulas/mL) CELULAS GERMINALES INMADURAS: 1-3% con respecto a 100 espermatozoides. LEUCOCITOS: 1 x 106 leucocitos/mL El eyaculado adems de poseer espermatozoides, posee otros elementos y clulas que pueden tener importancia clinica. Esto incluye clulas epiteliales del tracto genitourinario, leucocitos y clulas inmaduras de la espermatogenesis. Estas clulas llamadas en general clulas redondas. Pueden ser identificadas en el frotis de la muestra y tambin con ayuda de la determinacin de la enzima peroxidasa presente en los neutrfilos o indirectamente cuantificadas, determinando la tasa entre espermatozoides y las clulas redondas que encontremos en el frotis correlacionando esta tasa con la concentracin espermtica. Detallaremos ms adelante. ANLISIS DE LA MOVILIDAD: (> 32 %). La movilidad debe ser determinada tan pronto como sea posible despus de licuada la muestra y preferiblemente dentro de los
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primeros 30 minutos de emitida, pero en ningn caso despus de una hora de la eyaculacin, para evitar el deterioro por efecto del cambio de pH, deshidratacin o cambios de la temperatura. Se pueden trabajar con un volumen de 10 L para cubre objetos de 22 x 22 mm. Se debe evitar que haya demasiado volumen entre las lminas para que el desplazamiento de los espermatozoides sea homogneo y en lo posible en una monocapa segn lo recomendado al inicio en examen dentro de la hora. La temperatura de evaluacin puede ser de 37 C pero al elegir esta temperatura se deber pre temperar los portas y cubre objetos y trabajar en microscopio acondicionado con platina termo regulada, pero se puede trabajar a temperatura ambiente, entre 20 y 24 C. Es importante estandarizar las condiciones de temperatura para el trabajo, mezclar bien la muestra, se deben contar no menos de 200 espermatozoides y por duplicado en otra alcuota de la muestra y solo incluir en este parmetro a espermatozoides intactos (que presentan cabeza y cola). Los tipos de movilidad a evaluar son los siguientes: Movilidad Progresiva (MP): Los espermatozoides se mueven activamente, ya sea de manera lineal o en un gran crculo, independiente de la velocidad. Movilidad No Progresiva: (MNP) Incluye todos los patrones de movilidad pero con ausencia de progresin como el avance en pequeos crculos. Inmviles (IM): Sin movimiento. En los manuales anteriores de OMS se indicaba una separacin entre espermatozoides rpidos tipo A > 25 um/s y los progresivos lentos o tipo B con una velocidad inferior a esta, sin embargo, es muy difcil eliminar el grado de subjetividad y diferenciar las velocidades. En muy pocas oportunidades hemos observado hipercinesis, que se caracteriza por movimientos sumamente enrgicos y desordenados de los espermatozoides. Valores inferiores al 32 % pueden deberse a perdida de fracciones seminales, cambios bruscos de temperatura, pH sobre o bajo 7.2-8.0, leucocitosis que puede producir un aumento de la concentracin de especies reactivas del oxigeno, anticuerpos antiespermaticos, recipientes contaminados aunque esto ltimo cada vez es ms improbable ya que se recomienda que el frasco estril sea entregado por el laboratorio y que sea en base a polipropileno neutro. Movilidad entre 0 y 5 % probablemente se deban al sndrome de cilias inmviles lo que se correlaciona con sntomas respiratorios en el paciente al ser los cilios esenciales para la depuracin del lumen respiratorio. Recomendaciones para la determinacin correcta de movilidad: -Observar ordenadamente diferentes campos evitando evaluar el mismo campo dos veces y evitar buscar un campo en base al numero de espermatozoides mviles, la eleccin del primer campo y de los sucesivos debe ser al azar). -Comenzar instantneamente una vez determinado el campo a evaluar, no esperar que el espermatozoide comienza a moverse para comenzar. -Determinar la movilidad espermtica dentro de un rea definida, esto es ms fcilmente realizable cuando se utiliza un retculo instalable en el ocular. -Revisar y contar rpidamente para evitar la sobre estimacin del nmero o espermatozoides mviles y el conteo de espermatozoides que recin entran al campo de la grilla. -Inicialmente se recomienda que se evalen primero los espermatozoides progresivos rpidos (PR), luego los No progresivos o motilidad in situ (NP) y finalmente los inmviles (IM), sin embargo, con experiencia el observador podr evaluar los tres parmetros simultneamente. -Contar los espermatozoides y registrar el nmero con ayuda de un multicontador.
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-Evaluar a lo menos 200 espermatozoides en total en al menos cinco campos en cada replica, con el objetivo de lograr el menor error de muestra. -Calcular el porcentaje promedio de las tres categoras de movilidad (PR, NP, IM) VITALIDAD ESPERMTICA: Se considera normal un valor 58% de espermatozoides vivos para las tcnicas descritas a continuacin. Esta prueba debe ser utilizada si el porcentaje de espermatozoides inmviles excede el 60 % aunque la mayora de los laboratorios la realizan de rutina debido a su facilidad y rapidez en entregar el resultado. ANLISIS DE LA VITALIDAD: La vitalidad espermtica se evala dentro de los primeros 30 minutos inmediatamente despus de licuada la Figura 6: Espermatozoides muertos muestra, pero en algunos casos se puede evaluar hasta teidos de rojo y los vivos no se tien. dentro de una hora cuando la muestra no a licuado completamente, nunca despus de la hora para evitar encontrar un elevado numero de espermatozoides muertos por efectos de deshidratacin o cambios de pH o temperatura que puedan afectar a la muestra. i) Tcnica eosina pura: La proporcin de espermatozoides vivos puede ser determinada utilizando tcnicas de tincin las que se basan en el principio de que las clulas muertas con una membrana plasmtica daada toman ciertos colorantes. Para esta evaluacin se utiliza una solucin de eosina (C.I. 45380) al 0.5% en Buffer fosfato Salino (PBS pH 7.1) o NaCl 0,9 %. Se mezcla una alcuota de eosina (5 L.) con una muestra de semen (5 L), se cubre con un cubreobjeto de 22 x 22 mm., se deja reposar 30 segundos y se evala inmediatamente al microscopio. Se deben contar 200 espermatozoides diferenciando los espermatozoides vivos (no teidos) de los espermatozoides muertos (teidos). ii) Una segunda forma de realizar el examen de vitalidad corresponde a la tcnica con la tincin de Eosina-Nigrosina (E-N) cuya ventaja con respecto al test de Eosina es que nos permite almacenar las muestras para re-evaluacin y propsitos de control de calidad o re chequeos por otros investigadores en casos de evaluacin cientfica, con esta tincin los espermatozoides muertos se tien de Rojo o rosado oscuro y los vivos se tien de rosado claro o no se tien. Para esta tcnica se agrega 10 g de negrosina a la eosina 0,5 % en PBS o NaCl 0,9 % se hierve, luego se enfra y filtra y guarda en frasco de vidrio oscuro. El procedimiento consiste en remover 50 L de semen y mezclar con igual cantidad de E-N, esperar 30 segundos mezclar y realizar un frotis (todo se realiza en duplicado real) se deja secar al aire y se cubre de manera permanente con medio de montaje para examinar a x 1000
Figura 7: Espermatozoides teidos con Eosina-Nigrosoina observados a x1000 con microscopia de luz. Pgina 28 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen.

iii) Por ltimo, una tercera manera de realizar el test de vitalidad consiste en el conocido test Hipoosmtico en donde espermatozoides con membranas intactas se hinchan y su forma flagelar cambia dentro de 30 minutos de exposicin al medio hiposmotico.
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Figura 8: Representacin esquemtica de los cambios morfolgicos en espermatozoides humanos sujetos a estrs hiposmotico. Pgina 32 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen.

Brevemente, se disuelve 0.735 g de citrato de sodio dihidrato y 1.351 g de D-fructosa en 100 mL de agua, se congelan alicuotas de 1 mL a -20 C. Para realizar el test, se descongela 1 mL de medio hipo osmtico y se estabiliza por 5 minutos a 37 C luego se agregan 100 L. de semen bien mezclado y se incuba 5 minutos para fines teraputicos como la inyeccin intracitoplasmtica ovocitaria conocida comnmente como ICSI o 37 minutos para fines diagnsticos. Posteriormente se transfieren 10 L. de la mezcla a un portaobjeto y se cubre para la observacin de 200 espermatozoides por duplicado con un aumento de 40 x se calcula el promedio y se informa segn corresponde (ver tabla 4). La disminucin de la movilidad espermtica con un porcentaje normal de espermatozoides vivos, sugiere la presencia de anomalas en la ultraestructura del flagelo del espermatozoide como el sndrome de cilios inmviles cuya causa es a nivel gentico y su diagnstico definitivo se realiza mediante microscopia electrnica, de diagnosticarse esta patologa es de muy mal pronostico quedando como nica opcin la inyeccin intracitoplasmtica del ovocito con un espermatozoide de la pareja. RECUENTO DE ESPERMATOZOIDES Limite inferior normal 15 x 106 espermatozoides/mL. o 39 x 106 espermatozoides por eyaculado o ms (OMS, 2010). Principio: El nmero total de espermatozoides por eyaculado y la concentracin espermtica se encuentran directamente relacionadas con el tiempo en que tarda la pareja en conseguir la preez (Slama et al., 2002) y con la tasa de preez (Zinaman et al., 2000) y como predictor de la concepcin (Larsen et al., 2000). El nmero total de espermatozoides por eyaculado se correlaciona en condiciones normales con el volumen testicular con tiempos de abstinencia normales.

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La primera observacin nos orientar para determinar la dilucin de trabajo (ver Observacin dentro de la hora) teniendo en cuenta que siempre las muestra debe estar perfectamente y recin homogeneizada para comenzar las diluciones.

Figura 9: Frasco con solucin de formalina para recuento.

La concentracin espermtica solo incluye a espermatozoides completos con cabeza y cola y si existen anormalmente muchos cabezas o colas sueltas, estas se cuantificarn por separado o se puede cuantificar en el frotis y consignar como una observacin, aunque estos casos no son frecuentes. Se cuantifica utilizando un hemocitmetro de Neubauer, (ltima recomendacin de OMS 2010) o en cmara Makler que no requiere dilucin. Procedimiento: Las diluciones para la cmara de Neubauer pueden ser 1:5, 1:10, 1:20, 1:50 (lo importante para evitar errores es tomar al menos 50 L. de muestra para las diferentes diluciones, fig 9b). El diluyente es preparado adicionando a 1 Litro de agua destilada, 50 g de bicarbonato de sodio, 10 mL 35% (v/v) de formalina y 0.25 g de azul tripn o 5 mL de una solucin saturada de violeta de genciana. (Se almacena a 4 C. Si se forman cristales se filtra con papel de 0.45 m antes de usar). Se deben transferir entre 10 a 15 L. de la dilucin hacia la cmara de recuento de Neubauer, pero lo ms importante es que la cmara quede completamente llena pero no en exceso para evitar que la lmina que la cubre se mueva por accin de la dilucin transferida. La muestra se debe dejar sedimentar (2 a 3 minuto), y debe ser conservada en una cmara hmeda y evaluadas dentro de 10 a 15 minutos para prevenir la evaporacin, hasta el momento de realizar el recuento. El recuento debe ser de cabezas de espermatozoides y no de colas para evitar el doble recuento. Tabla de dilucin:

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Figura 9 b: Esta tabla recomienda los volmenes de muestra y fijador necesarios para la dilucin dependiendo la concentracin nativa de espermatozoides y la cantidad de grillas a evaluar que por lo general sern tres grillas y en duplicado real. (Pg. 39, OMS 2010). Pgina 39 WHO laboratory manual fort he Examination and processing of human semen.

Clculos y resultados. Tipos de cmara de conteo recomendados por OMS 2010. El hemocitmetro de Neubauer: Cada hemocitmetro posee dos cmaras de conteo por separado, con un rea de 3 mm x 3 mm. (9 cuadrantes de 1 mm2 conteniendo 100 nL de volumen cada uno) y ambas cmaras se cubren con un cubre cmara n 4 que es de 0.44 milimetros de grosor, este cubre cmara queda levantado 100 m por medio de pilares de vidrio pertenecientes a la misma cmara de Neubauer (fig. 10). El cuadrante 5 de la figura 11 tiene 25 cuadrculas menores que se denomina en conjunto retculo de Thomas, cada una de estas 25 cuadriculas menores a su vez tiene 16 cuadrculas ms pequeas (fig. 11 derecha). Metodologa para el recuento: Si un espermatozoide se ubica sobre la lnea que divide dos cuadrculas adyacentes, debe ser contado solamente si est en la lnea inferior o hacia la lnea del lado izquierdo de la cuadrcula a ser evaluada, si las retculas tienen lneas triples la misma regla se conserva pero para la lnea central (fig 11). Con la finalidad de simplificar los clculos de los resultados, explicaremos una metodologa que difiere de la metodologa recomendada por OMS, sin embargo, entrega el mismo grado de confiabilidad. A fin de determinar la concentracin de los espermatozoides en la muestra original de semen en millones/mL, el nmero promedio de espermatozoides (2 recuentos) es multiplicado por el factor de conversin apropiado. Para mayor claridad de lo expuesto tenemos el siguiente ejemplo: Si la dilucin es 1/5 (200 uL de semen y 800 uL de solucin de solucin), y se han contado las 25 cuadrculas (retculo de Tomas completo), entonces se multiplica el nmero de espermatozoides en las 25 cuadrculas, por 5 (dilucin) y por 10.000 (x 50.000). Segundo ejemplo, si la dilucin es 1/5, y se han contado solo 5 cuadrculas, entonces se multiplica el nmero de espermatozoides registrados en las 5 cuadrculas por 5 (representa los 25 cuadrantes), por 5 (dilucin) y por 10.000 (10.000 corresponde al factor de conversin propio de la cmara por sus dimensiones obtenidos al dividir el equivalente a 1 mL (1.000.000 nL) por el volumen promedio contado en un cuadrante de los 9 enumerados en la figura 11, de esta manera tenemos 1.000.000 nL/100 nL = 10.000). Hay que tener presente que el mnimo recomendado de espermatozoides a contar son 200 por lo que si la muestra no tiene suficientes espermatozoides para llegar a 200 en el retculo de Tomas se deber
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continuar con los cuadrantes vecinos numerados en la figura 11 de tal manera de obtener un error de muestra calculado en solo un 5 % (tabla 5). Y una diferencia aceptable de 39 espermatozoides como mximo entre ambos recuentos (tabla 6). Si la diferencia fuese mayor se repite el procedimiento desde la mezcla del liquido seminal en adelante. (Replicas nuevas y duplicados reales).

Figura 10: Cmara de Neubauer Izquierda: Vista desde arriba, Derecha vista de perfil mostrando la separacin entre la cmara y el cubrecamara.

Figura 11 Ampliaciones sucesivas de la cmara de Neubauer, el recuadro 5 (retculo de Tomas) se ve amplificado en el esquema central (1 mm 2) que a su vez indica un circulo que se amplifica nuevamente a la derecha para realizar el recuento (0,2 mm 2). Pgina 34 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen.

1 mm. 0.2 mm.

0.05 mm = 50 um.
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Figura 12: Fotografas equivalentes a los esquemas central y derecha de la figura 11.

Figura 13: Los crculos blancos indican espermatozoides que se cuentan en el campo indicado y los crculos negros indican espermatozoides que no se cuentan: Esta tcnica evita contar al espermatozoide 2 veces. Pgina 34 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen.

En los casos en que no se alcancen a contar los 200 espermatozoides en el retculo de Tomas (cuadricula 5, figura 11) se continuara el recuento en las otras cuadriculas de la cmara de Neubauer, desde la 1 a la 9 y el resultado se divide por el nmero de cuadriculas contadas, as por ejemplo si fue necesario contar las cuadriculas 1, 2, 3, 4, 5 y 6 para alcanzar los 200 espermatozoides el resultado final se divide en 6 ya que el rea abarcada fue seis veces ms que el retculo de tomas completo. Recuento en cmara Makler La cmara Makler no es recomendada por OMS en el ltimo manual del 2010, sin embargo, presenta la ventaja de trabajar con muestra sin diluir lo que evita este factor de error y adems se puede determinar los distintos grados de movilidad a la vez, lo que ahorra tiempo al personal del laboratorio. Para determinar la concentracin, se cuenta las 100 cuadrculas y se multiplica el resultado por 100.000, para expresar la concentracin espermtica en millones/mL.

Figura 14: Cmara de Makler Izquierda: Vista desde arriba, Derecha vista de perfil mostrando la separacin entre la cmara y el cubrecamara. 16

Figura 15: Izquierda: Vista a bajo aumento de la grilla casi completa de la cmara de Makler: posee 100 cuadrantes en total. Derecha: Esquema de la grilla en cmara de Makler.

Hay que tener en cuenta que la centrifugacin en muestras con criptozoospermia (concentracin espermtica menor de 1 x 106/mL), disminuir la movilidad espermtica en los pocos espermatozoides que se pudieran encontrar y en algunos caso la movilidad se puede perder en su totalidad. Si el numero de espermatozoides es < 4 por campo con aumento de x400 esto representara aproximadamente a 1 x 106/mL de espermatozoides y para la mayora de los propsitos clnicos se informara una concentracin espermtica < 2 x 106/mL ya sea se encuentren o no espermatozoides mviles. Al finalizar el trabajo de recuento se dejara la cmara en solucin desinfectante preferiblemente durante toda la noche para eliminar posibles agentes infecciosos del semen. La siguiente tabla explica que al contar un total de 400 espermatozoides tendremos un error de muestra de solo un 5 %.

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Pgina 37 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen. Tanto el recuento, morfologa, motilidad y vitalidad espermtica consideran contar en duplicado al menos 200 espermatozoides para tener un error de muestra menor o igual al 5 %

OLIGOZOOSPERMIA: Se define como el recuento de espermatozoides inferior a 15 x 106 /mL esta puede ser, ligera (entre 10 - <15 x 10 6 /mL), oligozoospermia moderada (entre 5 y < 10 x 106 /mL) y oligozoospermia severa cuando la concentracin espermtica es inferior a 5 x 106 /mL). Algunas causas son; Obstruccin epididimaria, eyaculacin retrograda, diabetes mellitus, factores congnitos, estrs y periodos febriles intensos, e hipogonadismo hipogonadotrofico entre otros. CRIPTOZOOSPERMIA: Se define como una concentracin de espermatozoides inferior a 1 x 106 /mL. AZOOSPERMIA: Se define como la ausencia de espermatozoides en el lquido seminal y puede indicar un dao severo del epitelio germinal con aplasia germinal o sndrome de Sertoli solo (azoospermia secretora) y la detencin de la maduracin espermtica (arresto de la espermtogenesis). La zoospermia tambin puede deberse a una obstruccin de las vas seminales (azoospermia obstructiva). En estos casos se deber centrifugar toda la muestra a 3000 g durante 15 minutos y revisar en 2 portaobjetos todo el pellet para informar, revisado preferiblemente con aumento de x 20 para abarcar toda el rea del cubreobjeto de 22 x 22 mm. Si se encuentra al menos 1 espermatozoide se informa como criptozoospermia, de lo contrario solo se sugiere la azoospermia ya que existe la posibilidad que en el resto de la muestra si se encuentren espermatozoides ya que e ha demostrado que no todos los espermatozoides bajan al pellet a ese tiempo y velocidad. (Corea et al., 2005) Debemos tener presente que casi en todos los casos, esta centrifugacin afectar negativamente la movilidad de los escasos espermatozoides que pudiera tener la muestra. Conclusin: A pesar que estos protocolos se sigan con exactitud, tenemos que considerar varios factores relacionados con posibles errores, entre ellos tenemos solo como algunos
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ejemplo ms frecuentes, el uso de pipetas de aire en vez de pipetas de presin positiva, errores en la mezcla y dilucin de las muestras, pipetas descalibradas, cmaras y contadores defectuosos entre otros factores por lo que siempre se recomendara el uso de control de calidad tanto interno como externo para asegurar la confiabilidad de nuestros resultados. RECUENTO DE OTRAS ESPERMATOZOIDES: CELULAS DIFERENTES A LOS

El semen eyaculado contiene otras clulas adems de los espermatozoides, entre ellas se incluyen clulas epiteliales de la uretra, leucocitos, clulas germinales. La concentracin de estas clulas se puede estimar de la siguiente manera. Se cuentan las clulas en los cuadrados que estn ubicados en las esquinas del retculo de Thomas (Cuadrantes 1, 3, 7 y 9). Cada cuadrado tiene un volumen de 0.1mL3 pero representan un valor de 1 mL. El conteo que resulta en los 4 cuadrados se divide entre 4 y se multiplica por el factor de dilucin para obtener el nmero de clulas por mL de muestra. Lo mnimo que hay que contar son 200 clulas redondas, si este valor no se alcanza se cuentan el resto de los cuadrantes y el resultado se divide por el nmero de cuadrantes contados OMS adems recomienda que este anlisis se haga por duplicado real en la cmara contra lateral.

Otra manera de estimar el nmero de clulas redondas especificando el detalle de estas es directamente en el mismo frotis utilizado para determinar la morfologa espermtica, lo cual obviamente requerir un anlisis de un experto en citologa para poder discriminar entre clulas de origen sanguneo y de origen espermtico, de esta manera si N es el nmero de un tipo celular dado por 100 espermatozoides y S es la concentracin de espermatozoides en millones/mL, entonces la concentracin C de un tipo celular dado en millones/mL. puede ser calculada con la siguiente frmula: C=(NxS)/200 As, si el nmero de clulas germinales inmaduras o leucocitos contados es 5 por 200 espermatozoides y el recuento de espermatozoides es 120 x 106/mL la concentracin de dichas clulas es 5 x 120x106 /200 = 3 millones /mL. Con el mismo ejemplo pero ahora determinado el nmero de neutrfilos, si encontramos 2 neutrfilos por cada 200 espermatozoides tendremos que: C= 2 x 120x106 /200 = 1,2 millones/mL

Figura 16: De izquierda a derecha, 1.- Neutrfilos, 2.- epitlio descamativo, 3.-epitlio descamativo plano, 4.Espermtidas.

Determinacin qumica de Leucocitos.

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Los leucocitos pueden daar la movilidad y el DNA espermtico a travs de un ataque oxidativo, sin embargo, este dao depender de varios factores entre ellos, el lugar de infiltracin leucocitaria, naturaleza de los leucocitos encontrados (Macrfagos, Neutrfilos y excepcionalmente Linfocitos) y el estado de activacin leucocitaria. Aunque la leucocitoespermia no nos asegura el diagnstico de infeccin, si se considera un signo de sospecha si se asocia a otros signos seminales y clnicos que confirman dicho diagnstico. Algunos sntomas clnicos podran ser: dolor al eyacular, antecedentes de infecciones de transmisin sexual o genitourinarias, exmenes anormales de alguna glndula del sistema reproductor y alteraciones fsico qumicas del plasma seminal lo que confirma el diagnstico es el examen bacteriolgico positivo. Hay que tomar en cuenta que un segundo grupo de anlisis de espermiograma solo podr realizarse solo despus de transcurridos al menos 90 das despus de la ltima dosis de antibiticos ya que estos afecta a la concentracin espermtica. Dentro de la poblacin de leucocitos, predominan los Neutrfilos. Sin embargo, estas clulas podran ser confundidas por un evaluador inexperto con espermticas multinucleadas. Algunas caractersticas morfolgicas que los diferencia a ambos, por ejemplo, son: los puentes de cromatina que solo estn presentes en el Neutrofilo, los linfocitos tiene un ncleo en promedio de 9 m a diferencia de un macrfago que posee un tamao nuclear promedio de 15 m En nuestro laboratorio determinamos leucocitos peroxidasa positivos en base a una solucin de agua oxigenada 100 L a 10-30% mezclada con 900 L de una solucin de ortotoluidina 0.15% (relacin agua oxigenada: Toluidina de 1:10). De esta mezcla, se toman 900 L a los que se agregan 100 L de muestra de semen (relacin 1:10). La solucin final se incuba por 30 minutos a temperatura ambiente. Los leucocitos peroxidasa positivos dan una coloracin marrn, y se registran como positivos para la reaccin. Este recuento es til para diferenciar los leucocitos peroxidasa positiva (Neutrfilos) de otros tipos de clulas redondas y se cuentan en cmara de Neubauer o Makler, sin embargo, esta tcnica no detecta a Macrfagos o Neutrfilos que ya hayan exocitado sus grnulos. Un mtodo similar pero ms complejo se detalla en el Manual OMS 2010 aunque varias otras tcnicas para identificar la poblacin leucocitaria en semen, como son en base a inmunocitoqumica, tambin pueden ser utilizadas aunque estas son mas costosas y demandan un tiempo de procesamiento y anlisis mayor por lo que tendr que evaluarse el real aporte que puede entregar esta tcnica al diagnstico en cada caso en particular. La agencia internacional de investigacin del cncer (IARC, 1982) ha declarado que la ortho-toluidina presenta riesgo carcinognico para humanos.

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Figura 17: Clulas Peroxidas positivas: Se marcan de caf claro hasta marrn intenso.

Determinacin de clulas inmaduras: Las clulas germinales o clulas inmaduras incluyen espermtidas y espermatocitos pero rara vez incluyen a espermatogonias debido a que estas estn unidas mediante hemidesmosomas a la lamina basal lo que previene su liberacin al lumen y la que se libera tras una mitosis generalmente alcanza a transformarse en un elemento celular ms diferenciado, estas clulas generalmente son detectadas en los preparados (frotis) pero son difcilmente diferenciadas de clulas inflamatorias cuando estas clulas se encuentran en degeneracin.

El siguiente grafico y tabla muestras cual es la diferencia aceptable entre dos recuentos ya sea en cmara o frotis y aplica para las clulas redondas en funcin de los espermatozoides.

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Pgina 255 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen.

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ANTICUERPOS ANTIESPERMTICOS. Se ha sabido desde hace mucho tiempo que los animales de experimentacin podra ser infrtiles mediante la inmunizacin con el esperma. Los espermatozoides estn
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normalmente aislados del resto del cuerpo en los tbulos seminferos. Si hay ruptura de los tbulo y los espermatozoides quedan expuestos al sistema inmune, estas clulas sern reconocidas como extraas y provocaran una respuesta de anticuerpos. Los anticuerpos anti-espermticos se encuentran en un 8-10% de los hombres. En los hombres con antecedentes de infeccin, traumatismo o ciruga, los anticuerpos se pueden encontrar hasta un 60% de los casos, tambin aumenta la posibilidad de presentar anticuerpos antiespermticos en pacientes con torsin o cncer testicular, varicocele y sometidos a biopsia testicular, tambin los pacientes sometidos a la reversin de la vasectoma en un 70 % de los casos presentan anticuerpos antiespermticos. A menudo, sin embargo, no hay causa conocida para su presencia. Cuando el anticuerpo se une a los espermatozoides, que pueden alterar la capacidad de los espermatozoides de nadar (si esta unido a la cola) o fertilizar un vulo (si esta unido a la cabeza). Cuando hay un gran porcentaje de espermatozoides con anticuerpos unidos a ellos, hay una buena probabilidad de fracaso de la fertilizacin, incluso con la FIV el ICSI es la eleccin en casos graves de anticuerpos antiespermticos. Para determinar la presencia de anticuerpos antiespermticos, especialmente cuando se detecta aglutinacin espermtica (anticuerpos unidos entre si y con motilidad) ya sea cabeza-cabeza, cola-cola o una mezcla de ambas, en estos casos la presencia de anticuerpos podra ser la causa, aunque los anticuerpos pueden estar presentes sobre los espermatozoides sin generar aglutinacin y la aglutinacin tambin puede ser causada por una causa diferente a la presencia de anticuerpos. La mera presencia de anticuerpos es insuficiente para el diagnstico de autoinmunidad espermtica. Es necesario demostrar que los anticuerpos interfieren severamente con la funcin espermtica; esto es usualmente hecho por el test de penetracin de espermatozoides en moco. Los anticuerpos pueden interferir con la unin del espermatozoide a la zona y con la reaccin acrosmica. Los anticuerpos antiespermticos en semen pertenecen casi exclusivamente a dos clases de inmunoglobulinas: IgA y IgG. Los anticuerpos de clase IgM , debido a su gran tamao, son raramente encontrados en semen. Los anticuerpos del tipo IgA pueden tener gran importancia clnica e incluso ms que los anticuerpos IgG (Kremer and Jager, 1980). Ambas clases pueden ser detectadas sobre los espermatozoides o en fluidos biolgicos. Test Directo: test para detectar anticuerpos sobre los espermatozoides. Describiremos dos test, el primero llamado MAR Test (mixed antiglobulina reaction). (Bronson et al., 1984). Y los inmunobead (IB) o inmunoperlas. (Bronson et al., 1982). El MAR test es realizado en una muestra de semen fresco mientras que el IB es realizado en espermatozoides lavados. Los resultados de ambos test no siempre concuerdan pero los resultados de IB estn siempre correlacionados con los resultados de los test de inmovilizacin de anticuerpos detectados en suero. Los protocolos experimentales para IB y MAR test varan, pero para ambos las preparaciones son examinadas bajo el microscopio. Las inmunoperlas se adhieren a los anticuerpos que estn unidos sobre la superficie de espermatozoides motiles e inmtiles; Se informa el porcentaje de espermatozoides motiles con perlas. PROCEDIMIENTO PARA MAR test. MAR test es rpido y sensible (Rajah et al., 1992), este reactivo con anticuerpos anti IgG o IgA se unen a los anticuerpos del tipo IgG o IgA que estn sobre los espermatozoides. El reactivo que contiene el anticuerpo se mezcla con semen nativo y se observa la presencia de espermatozoides motiles con perlas unidas a este. En nuestra experiencia, esta tcnica es la
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prueba inmunolgica ms utilizada para detectar anticuerpos antiespermticos, por lo que nos referiremos a ella con ms detalles. Tcnica: Mezclar muy bien la muestra de semen y toma 3.5 L de semen para cada determinacin (para IgG e IgA), tambin se debe incluir muestras de semen positivas y negativas como control provenientes de individuos controles". Alternativamente controles positivos pueden ser producidos por incubacin de espermatozoides con suero que contiene tales anticuerpos antiespermticos. Lego se agrega 3.5 L de IgG cubierta por perlas de latex (beads) a cada muestra y mezclar con una punta de micropipeta, luego se agregan 3.5 Lde antisuero contra la IgG a cada mezcla de semen bead y volver a mezclar, posteriormente se cubre con un cubre objetos de 22 x 22 mm para proporcionar una profundidad entre portaobjeto y cubre de 20m, se deja reposar por 3 minutos a temperatura ambiente en cmara hmeda para prevenir el secado y posteriormente se examina de preferencia en microscopio con contraste de fases a los 3 y 10 minutos. Repetir el procedimiento para IgA. Expresin de los resultados: Se determina el porcentaje en 200 espermatozoides motiles que presenta la unin de 2 o ms partculas de ltex unidas, ignorando a los espermatozoides que tiene unidas las partculas en la punta de la cola (se realiza en duplicado). Se consigna el tipo de anticuerpo unido y la zona del espermatozoide afectado (cabeza, pieza media, pieza principal). Notas: Si el 100 % de los espermatozoides motiles presenta perlas unidas a los 3 minutos, se toma como resultado final de lo contrario se lee nuevamente a los 10 minutos, pero si a los 10 minutos los espermatozoides estn inmviles se toma como resultado el determinado a los 3 minutos. Valor de referencia: Positivo hasta 50 % de los espermatozoides motiles, ya que la tasa de penetracin espermtica en moco cervical es severamente daada cuando 50 % o ms de los espermatozoides presentas MAR es positivo. Esquema.

PROCEDIMIENTO PARA Inmunobead (IB). Este procedimiento consume ms tiempo que el MAR test pero entrega informacin acerca de anticuerpos sobre los espermatozoides que podran haber sido enmascarados por componentes del plasma seminal. En este test (IB) el reactivo esta formado por perlas de ltex cubierta con anticuerpos anti IgA o IgG que se mezclan directamente con espermatozoides lavados y la unin de las perlas a los espermatozoides indica la presencia de IgG o IgA en la superficie del espermatozoide. Procedimiento descrito en el 5 manual de OMS pg 111 y 112. Valor de referencia: Positivo hasta 50 % de los espermatozoides motiles.
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Test Indirecto: Test para detectar anticuerpos antiespermticos en fluidos libres de espermatozoides. Como el plasma seminal, sangre, suero y moco cervical solubilizado. En estos test, los fluidos inactivados por calor son incubados con espermatozoides lavados y libres de anticuerpos de un donante. Cualquier anticuerpo antiespermticos del paciente se unir a los espermatozoides lavados del donante, el cual es tratado luego con un test directo como el indicado anteriormente. Para permitir resultados seguros, es importante permitir un tiempo suficiente de interaccin ya que puede tardar hasta 10 minutos para que la mezcla y aglutinacin sea visible. Sin embargo, hay que tener en cuenta que la motilidad declina con el tiempo, y el test depende de espermatozoides motiles. Procedimiento descrito en el 5 manual de OMS pg 113 y 114. Valor de referencia: Positivo hasta 50 % de los espermatozoides motiles. Estos test estn disponibles comercialmente y ambos dependen de la presencia de espermatozoides motiles. Si hay insuficientes espermatozoides motiles se pueden utilizar los test indirectos sobre plasma seminal, sangre o suero pueden ser usados. Tambin hay que considerar que anticuerpos citotxicos pueden matar a todos los espermatozoides o inhibir por completo la motilidad.

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ANLISIS ESPERMTICO ASISTIDO POR COMPUTADORA Computer-assisted semen analysis (CASA). Los actuales avances en la tecnologa nos han permitido contar eficientemente espermatozoides marcando el DNA y algoritmo que detectan la cola del espermatozoide, de esta manera se descarta el detritus o clulas redondas propias del lquido seminal. El uso de sistemas computacionales para la determinacin de la motilidad espermtica depende de la concentracin espermtica, del debris de la muestra ya que este ltimo puede ser confundido con espermatozoides motiles, tasa de imgenes obtenidas por segundo, aunque la mayora de las compaias fabricantes recomiendas una adquisicin de imgenes que varia entre 50 y 60 Hz (Morris et al., 1996). y actualmente esa tasa de adquisicin es mayor
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y se recomienda especialmente para muestras con espermatozoides de baja linearidad y/o hiperactivados e incluso para los espermatozoides ms rpidos conocidos como son los espermatozoides del pez Zebra, se requieren tasas de adquisicin de 290 Hz para describir la motilidad espermtica con confiabilidad (Wilson_Leedy et al., 2007). Sin embargo, el sistema entrega resultados bastante reproducibles. OMS recomienda que al menos 200 espermatozoides sean analizados y en l posible sean 400, as tambin el sistema debe estar unido a un software que permita el anlisis estadstico de los resultados, en general tambin es necesario estandarizar las condiciones de grabacin de los videos que determinaran la motilidad de los espermatozoides como son la temperatura a 37 C ya que la motilidad es sensible a la temperatura y de preferencia realizar la determinacin en muestra si diluir. Tambin se ha determinado que la motilidad de la muestra se puede realizar sin dificultad con muestras que tienen una concentracin espermtica de entre 2 x 106 y 50 x 106 por mL (Garret et al., 2003). En muestras que superan los 50 x 106 por mL las colisiones pueden ocurrir con una alta frecuencia y es probable que eso induzca a errores, tales muestras deben ser diluidas con plasma seminal del mismo paciente obtenido de una alicuota centrifugada a 16.000 g por 6 minutos, tambin deben disponerse de cmaras dobles que del sistema generalmente hace las recomendaciones para una adecuada grabacin en cuento a intensidad de luz, contraste y aumento. Un dato importante a considerar es que en Estados Unidos solo un 2 % de los laboratorios que realizan mediciones de motilidad espermtica para fines clnicos utilizan un sistema CASA (Amann 2004).

Tabla 1: Resumen de Lmites de Referencia Inferiores (LRI), con un percentil de 5 e intervalo de confianza de un 95 %.

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Pgina 224 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen.

Tabla 2: Forma para registrar el anlisis del espermiograma y moco cervical, segn el manual de la OMS 2010.

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Pgina 252 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen.

Tabla 3: Nomenclatura para algunas variables seminales WHO 2010 y Sarabia et al, 2010 TERMINO Normozoospermia: Oligozoospermia: DEFINICIN Eyaculado normal definido por los valores de referencia. Concentracin espermtica menor a los
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Astenozoospermia: Teratozoospermia Oligoastenoterato zoospermia: Azoospermia: Aspermia Cryptozoospermia: Hemospermia: Leucospermia:

valores de referencia. (< 15 millones de espermatozoides por mL) Movilidad menor al valor de referencia. (< 32 % de espermatozoides progresivos) Morfologa menor al valor de referencia. (< 4 % de espermatozoides de morfologa normal) Significa alteraciones en tres variables. (Tambin se usar la combinacin de 2 prefijos). Ausencia de espermatozoides en el Eyaculado. Ausencia de eyaculado. Espermatozoides ausentes en el preparado examinado al fresco pero presentes en el pellet. Hematospermia; Presencia de eritrocitos en el eyaculado. Leucocitospermia, Piospermia; Presencia de leucocitos en el eyaculado por sobre el valor de referencia. Porcentaje de espermatozoides vivos menor al valor de referencia. (< 58 % espermatozoides vivos).

Necrozoospermia:

El sufijo espermia se refiere al eyaculado y zoospermia al espermatozoide. Por lo tanto, los siguientes trminos NO deben ser usados: astenospermia, astenoteratospermia, criptospermia, oligoastenospermia, oligoteratospermia, oligospermia, teratospermia.

Las siguientes tablas nos resuelven el problema que tenan los laboratorios al obtener diferentes valores en las variables determinadas en duplicados reales. Tabla 4: Diferencias aceptables entre dos porcentajes promedios provenientes de la misma muestra, al evaluar 200 clulas en cada placa, total 400 clulas. Ejemplo 1:
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Si la vitalidad en la placa 1 nos da un valor del 60 % y en la placa 2 un valor de 68 % tenemos que: Promedio, 64 % para lo cual la mxima diferencia aceptable observada en esta tabla corresponde a 10, entonces como 68-60 es 8 la vitalidad espermtica que informaremos es de 68 % de lo contrario si la diferencia fuese mayor a la diferencia aceptable, se tendr que analizar un nuevo set de preparados.

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Tabla 5: Error de muestreo en porcentaje (%) de acuerdo al nmero total de clulas contadas. Ejemplo 2: El valor mnimo a evaluar para todas las variables, ser de 200 clulas y por duplicado, lo que nos entrega un valor total de 400 clulas analizadas y con esto aseguramos un error de muestra del 5 %.

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Pgina 37 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen. Tabla 6: Diferencia aceptable entre dos recuentos que entregan una suma Ejemplo 3: Si el recuento de clulas redondas en la placa 1 nos entrega un valor del 100 y en la placa 2 un valor de 120 tenemos que: La suma es 220 para lo cual la mxima diferencia aceptable observada en esta tabla corresponde a 29, entonces como 120-100 es 20, Se acepta la suma de 220 y se proceden a hace los clculos para determinar la concentracin de las clulas, determinadas segn dilucin.

Pgina 42 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen.

Tabla 7: Diferencia aceptable entre dos bajos recuentos que entregan una suma Ejemplo 4: Idntico al ejemplo 3 y se incluye el calculo para bajas concentraciones.

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Pgina 50 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen.

Normograma: De especial utilidad para extrapolar la fuerza centrifuga a las revoluciones por minutos (rpm) y viceversa. En este ejemplo una fuerza de rotacin centrifuga (RCF) de 550 g para una centrifuga con un radio de rotor de 8 cm. Corresponder a 2500 rpm.
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Pgina 231 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen.

INFORME DE ESPERMOGRAMA
NUMERO DE BOLETA: __________ FECHA: _____________ NOMBRE DEL PACIENTE: _______________________________________________ EDAD: ______ NOMBRE DE LA PAREJA: ________________________________________________ MEDICO QUE REFIERE AL PACIENTE: ____________________________________

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RECOLECCION DE MUESTRA
Recipiente suministrado por el laboratorio: _____ SI _____ NO Das de Abstinencia _______ ____________________ Muestra colectada en: ____ Laboratorio ____ Casa Dificultades en la obtencin de muestra: __________________Medicamentos y antecedentes: ___________________________________________ Hora de entrega al laboratorio: _______ Hora de Inicio del anlisis: __________ Hora de Recoleccin:

PARAMETROS A EVALUAR EXAMEN MACROSCOPICO

Licuefaccin Total Volumen Viscosidad Color pH

RESULTADOS

VALORES DE REFERENCIA SEGN OMS 2010

5 - 60 minutos a 37 C 1.5 mL Normal: < 2 cm; Aumentada: > 2 cms Blanco Opalescente o Gris amarillento 7.2

EXAMEN MICROSCOPICO
Aglutinacin espermtica: Negativo Grado 1: < 10%; Grado 2: 10 50 %; Grado 3: > 50%; Grado 4: 100% Tipo A: cabeza/cabeza; Tipo B: pieza media/pieza media; Tipo C: cola/cola; Tipo D: cabeza/cabeza y cola/cola; Tipo E: Maraa de aglutinacin. 39 x 106 / Volumen Total 15 x 106 espermatozoides / mL 58 % espermatozoides vivos 40 % 32 %

Recuento Total de espermatozoides Concentracin Espermtica Vitalidad Movilidad total (MP + MNP) Movilidad Progresiva / MP Movilidad No progresiva / MNP Inmviles Morfologa Normal Anormal Defecto de cabeza Defecto de cuello y pieza media Defecto de pieza principal Exceso de citoplasma residual

4%

PRUEBAS DIVERSAS
Clulas Redondas Clulas peroxidasa positivo Test de MAR Test Inmunobead Zinc Fructosa Glucosidasa Neutra OTROS
NOTAS: Un solo anlisis de lquido seminal o un parmetro fuera de los rangos de referencia segn el Manual de la OMS 2010, puede ser un evento aleatorio y no indican subfertilidad, para esto est indicado un segundo anlisis seminal tres o ms semanas ms tarde. As mismo los valores por fuera de los rangos de referencia pueden reflejar desrdenes mdicos, urolgicos y/o subfertilidad, que pueden ayudar al diagnstico mdico. No se recomienda hacer un diagnstico de subfertilidad o de disfunciones reproductivas en base a un anlisis seminal, estos resultados deben ser interpretados en conjunto con una historia clnica completa.

No debe superar el 5 % relativo al recuento espematico. 1 x 106 leucocitos / mL < 50 % de espermatozoides mviles con partculas adheridas < 50 % de espermatozoides mviles con gotas adheridas 2.4 mol / volumen total de semen 13 mol / volumen total de semen 13 mol / volumen total de semen

____________________________________________ FIRMA

Bibliografa.

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