Introduccin

La transferencia de protenas o 'blotting' supone la inmovilizacin de las protenas sobre membranas sintticas, seguido de la deteccin empleando sistemas especialmente diseados para la tincin de 'blots'. El mtodo ms potente es el denominado 'Western blot' en el que las protenas son separadas en primer lugar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y posteriormente se transfieren mediante la aplicacin de un campo elctrico perpendicular al gel a una membrana. El procedimiento es anlogo al desarrollado por el Prof. E. Southern ('Southern blotting') y por ello se le denomin 'Western'. Hay sin embargo otros mtodos de transferir o aplicar protenas sobre una membrana. El ms sencillo es aplicarlas directamente en forma de una pequea gota de una solucin concentrada sobre la membrana. La absorcin de la gota provoca la adhesin de la protena a la membrana, quedando en forma de una mancha o 'dot' (es el caso del 'dot blot'. Existen dispositivos que facilitan la aplicacin de las protenas directamente a la membrana, aplicando una succin que facilita la penetracin de la solucin, y reciben los nombres de 'dot blot' o 'slot blot' en funcin de que la protena quede aplicada en forma de una gota circular o de una lnea. En la imagen puedes ver dos de estos dispositivos.

Western Blot
El western blot es un mtodo en biologa molecular/bioqumica/inmunogentica para la deteccin de protenas en una muestra de un tejido homogeneizado o extracto. Implementa gel electroforesis para separar protenas desnaturalizadas de la masa. Las protenas son transferidas desde el gel hacia la membrana (originalmente de nitrocelulosa), donde son examinadas utilizando anticuerpos especficos para la protena. Como resultado, los investigadores pueden examinar la cantidad de protenas en una muestra y comparar los niveles de presencia entre varios grupos. Otras tcnicas, tambin usando anticuerpos, permiten la deteccin de protenas en tejidos (inmunohistoqumica) y clulas (inmunocitoqumica). Mtodo originado en los laboratorios de George Stark en Stanford. El nombre de "western blot" fue dado a la tcnica por W. Neal Burnette (Bioqumico Analtico, 112:195-203, 1981) en base a "Southern blot", tcnica para la deteccin de ADN desarrollada con anterioridad por Edwin Southern. La deteccin de ARN es denominada Northern blotting.

Western Blot: PASOS

1. Preparacin de las muestras:
A) Extracto celular total Tomar aprox. 0.5x106 cl/pto. Lavar con PBS y resuspender en 15 l de PBS. Medir cantidad de protena, coger 20-100 g y aadir Laemmli Sample Buffer 4x: 12.5 ml 4x Tris-ClH/SDS, pH 6.8(6.05 g Tris base en 40 ml H2O, ajustar pH, aadir 0.4 g de SDS, completar hasta 100 ml H2O) 10 ml glicerol 2 g SDS 1 ml 2-ME o 3.1 g DTT 0.5 mg azul de bromofenol H2O hasta 25 ml Guardar a -80C en alcuotas de 1 ml. Las muestras se pueden guardar a -20C varias semanas. B) Extracto citoslico Tomar 2.106 cl/punto Centrifugar segn volumen: 5 min a 4500rpm, 4 en minfuga 5 min a 1500rpm,4 en centrfuga Quitar el sobrenadante y aadir 0.5 ml de buffer de lisis fro: Para 5 ml: 50 mM Hepes pH 7.4 150 mM NaCl Este tampn se puede preparar 2x y guardar a temperatura ambiente, y aadir el resto de los componentes antes de usar. Usar 2.5 ml para 5 ml de buffer de lisis.

10 mM NaF

10 mM Iodoacetamida 1% NP-40 200 mM Na3VO4 (Aadir antes de usar) 1 mM PMSF 50 ml NP-40 10 ml Na3VO4 100mM 25 ml PMSF 200mM

Dejar 10 min en hielo Centrifugar 10 min en minfuga a 4 Recoger el sobrenadante y aadir 0.7 ml acetona en fro.

Precipitar a -20 C mnimo de media a una hora. Mejor toda la noche Centrifugar 5 min en minfuga Quitar el sobrenadante y resuspender el pellet en 20 ml de sample buffer (receta explicada arriba)

2. ELECTROFORESIS
Correr un gel de acrilamida entre el 7.5 y el 15% (140v, aprox. una hora) Lower 7.5% Acril/bis Agua bidest Buffer Tris 4XL Buffer Tris 4XU 7.5% 2 ml 4 ml 2ml 10% 2.64 ml 3.36 ml 2 ml 12% 3.2ml 2.8ml 2ml 1.25ml 4micl 40micl 4micl 40micl 5micl 25micl Upper 0.64ml 3.05ml

Temed APS 10%

Geles acrilamida:

Buffer Tris Lower 4X: Para 100ml : 1.5M Tris pH 8.8 SDS Agua 18.17g 4ml de SDS 10% Hasta 100ml

Buffer Tris Upper 4X: Para 100ml:

0.5M Tris pH6.8 SDS Agua

6.06g 4ml de SDS 10% Hasta 100ml

Correr en una cubeta con aprox. 400ml de Running Buffer: Running Buffer 5X Tris base Glicina SDS Agua pH8.3(no ajustar) 9g 43.2 g 3g Hasta 600ml 15 g 72 g 5g 1litro

3 TRANSFERENCIA
A) HUMEDA Dejar el gel en CAPS 1X mientras se prepara la membrana Lavar la membrana (PVDF) con: a) metanol b) Agua c) CAPS 1X Transferir a 300mA (0.3 A) 3 horas, con CAPS 1X en fro y con agitacin Teir con Pounceau y lavar con PBS para quitrselo y ver si se ha transferido Orden de montaje del sandwich: Lado blanco arriba Esponjilla empapada en CAPS 2 papeles 3M Membrana Gel (invertido de izq. a dcha) 2 papeles 3M Esponjilla empapada en CAPS Lado negro abajo

Cerrar bien el sandwich y ponerlo en la cubeta con el lado negro siempre unido al lateral negro de sta Llenar con CAPS hasta los bordes internos de la cubeta

B) SEMI-SECA Dejar el gel en tampn de transferencia semi-seca: Para 1 L: Tris 48 mM Glicina 39 mM Metanol 20 % SDS 0.035% 5.8 g 2.92 g 200 ml 1.75 ml del 20%

Lavar la membrana con Metanol (1 min)-Agua (2 min)-Buffer transferencia Colocar en el blot: 3 papeles 3M; Gel; Membrana; 3 papeles 3M Humedecer cada parte con buffer Transferir a: Lmite amperaje 50 mA (0.05) por membrana Voltaje: 5 vol Tiempo: 45 min Seguir el protocolo de la otra transferencia

4) BLOQUEO
Bloquear con PBS + 0.5-1% Tween + 5% leche 1 hora a T.A. o toda la noche a 4 Incubar con el anticuerpo primario preparado en buffer de bloqueo (aprox 1 hora).

Lavar 3 X con PBS-Tween (o con solucin de bloqueo) durante 5 min cada vez. Incubar con el anticuerpo secundario preparado en solucin de bloqueo 1 hora a temperatura ambiente. Lavar 3X con PBS Tween, 5 min cada vez

5. FLUOROGRAFA
Incubar la membrana con ECL durante 1 min Exponer un chasis con la membrana envuelta en plstico y una pelcula

6. REUTILIZACIN DE UNA MEMBRANA YA PROCESADA

MTODO 1 Lavar la membrana con buffer stripping 30 min a 50 con agitacin:

Para 50 ml: 100mM b-mercaptoetanol 2% SDS 62.5 mM Tris pH 6.7 H2O bidestilada 347 ml del stock 5 ml del 20% 3.125 ml de 1M Hasta 50 ml

Lavar con PBS-Tween durante 60 min en agitacin, cambiando el buffer cada 15 min Bloquear de nuevo con PBS-Tween-Leche al menos 1 hora Incubar con los anticuerpos

METODO 2 (Recomendado) Lavar 10 min con una solucin cida: 10mM Tris 150 mM NaCl pH 2.3

Lavar 3 X,10 min con PBS_ Tween Volver a bloquear la membrana con PBS-Tween-Leche