A GENTICA MOLECULAR EM anlises clinicas

Doutor Jos M. B. Cabeda Dr Alexandra Estevinho Dr Maria Luis Amorim

Porto, 1999

1 A GENTICA MOLECULAR DA CLULA NO PATOLGICA.....................................................................................................1.1 1.1 1.1.1

1.1.1.1 1.1.1.2 1.1.1.3 1.1.1.4 1.1.1.5

CONCEITOS BSICOS DE GENTICA MOLECULAR...................1.3 O material gentico.....................................................................1.3

cidos Nucleicos (DNA e RNA) ................................................1.3
A estrutura do DNA....................................................................1.5 A estrutura do RNA..................................................................1.16 1.1.1.1.1 1.1.1.1.2

A ORGANIZAO DOS GENES NO GENOMA..................1.17 Estrutura de um Gene ................................................................1.19 O CDIGO GENTICO...........................................................1.27 Mutaes e Polimorfismos ........................................................1.29

1.1.2
1.1.2.1 1.1.2.2 1.1.2.3 1.1.2.4

- A FISIOLOGIA DO GENE...................................................1.31
Transcrio e transcrio reversa...............................................1.31 Traduo ....................................................................................1.36 Replicao..................................................................................1.42 Mecanismos de Mutao do DNA.............................................1.46

1.1.2.4.1 Erros na replicao do DNA ......................................................1.46 1.1.2.4.2 Leses espontneas...................................................................1.48 1.1.2.4.3 Recombinao gentica.............................................................1.49 1.1.2.4.3.1 Recombinao por crossing-over.........................................1.49 1.1.2.4.3.2 Recombinao somtica.....................................................1.52 1.1.2.4.4 Mutaes mediadas por elementos de transposio.......................1.52

1.1.2.5

Mecanismos de reparao do DNA...........................................1.60

Mecanismos no excisativos......................................................1.61 Mecanismos excisativos............................................................1.63 Mecanismos ps-replicativos.....................................................1.65 O CICLO CELULAR......................................................................1.66

1.1.2.5.1 1.1.2.5.2 1.1.2.5.3

1.2 1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.3 1.3.1 1.3.2 1.3.3 1.3.4

Diviso celular e anomalias genticas..................................1.66 Ciclinas e CDK...........................................................................1.68 Apoptose......................................................................................1.75 A CTIVIDADE CELULAR..............................................................1.77 Componentes dos sistemas de sinalizao............................1.77 Regulao da sinalizao por modulao da conformao proteica ......................................................................................1.78 A Superfamilia dos receptores das hormonas esterides...1.78 Receptores transmembranares; vias de transduo de sinal1.79

2 REAS DE INTERVENO DA GENTICA MOLECULAR EM IMUNOLOGIA .....................................................................................................2.2 2.1 O RECEPTOR DA CLULA T (TCR) .............................................................2.3 2.1.1 Estrutura somtica dos genes do TCR........................................... 2.4 2.1.2 Mecanismo de rearranjo somtico dos genes do TCR............... 2.4 2.1.3 POLIMORFISMOS DO TCR........................................................... 2.8 2.1.4 O TCR EM SITUAES PATOLGICAS..................................2.10 2.2 A S IMUNOGLOBULINAS (IG) .......................................................................2.12 2.3 O MHC..........................................................................................................2.14 2.4 O COMPLEMENTO ........................................................................................2.19 2.4.1 As cascatas do complemento.........................................................2.20 2.4.2 O MHC III .........................................................................................2.23 2.4.2.1 A protena................................................................................2.23 2.4.2.2 O gene ......................................................................................2.25

2.1

3 REAS DE INTERVENO DA GENTICA MOLECULAR EM MICROBIOLOGIA ...................................................................................................3.1 3.1 A GENTICA NA VIROLOGIA................................................................... 3.2 3.1.1 - O genoma viral.................................................................................3.3 3.1.2 - O ciclo de vida Viral......................................................................3.5
3.1.2.1 3.1.2.2 3.1.2.3 Passos iniciais da multiplicao viral ............................................... 3.5 Fase da Multiplicao viral .............................................................. 3.6 O ciclo de vida dos retrovrus......................................................... 3.14

3.1.3
3.1.3.1 3.1.3.2 3.1.3.3 3.1.3.4

- Virologia em Medicina Transfusional....................................... 3.21

- O vrus da Hepatite B (HBV)....................................................... 3.21 - O Vrus da Hepatite C (HCV)...................................................... 3.24 - O vrus Linfotrpico Humano (HTLV-I e HTLV-II) ................. 3.25 - O vrus do sndroma da imunodeficincia adquirida (HIV) ........ 3.27

3.1.4
3.1.4.1 3.1.4.2 3.1.4.3

- Papel dos vrus em oncologia..................................................... 3.32

Oncogenes virais ............................................................................ 3.34 Converso de proto-oncogenes celulares em oncogenes ............... 3.37 A translocao t(8;14)(q24;q32) e o EBV...................................... 3.38

4 REAS DE INTERVENO DA GENTICA MOLECULAR EM HEMATO-ONCOLOGIA ........................................................................................4.1 4.1 O CANCRO: UMA DOENA GENTICA DE CLULAS SOMTICAS.............4.3 4.1.1 A origem gentica dos tumores ........................................................4.3
4.1.1.1 Proto-oncogenes e oncogenes .............................................................4.5

Factores de crescimento...............................................................................4.6 4.1.1.1.2 Receptores para factores de crescimento..............................4.7 4.1.1.1.3 Transdutores intracelulares de sinal......................................4.7 4.1.1.1.4 Factores de transcrio nuclear............................................4.10 4.1.1.1.5 Protenas de controlo do ciclo celular.................................4.11
4.1.1.2 Genes de Supresso tumoral.............................................................4.11

4.1.2 4.1.3
4.1.3.1 4.1.3.2

Os carcinognios como mutagnios..............................................4.13 Agentes virais na origem dos tumores ..........................................4.15

Oncogenes virais ...............................................................................4.15 Converso de proto-oncogenes celulares em oncogenes ..................4.18

4.1.3.2.1 Activao de proto-oncogenes .............................................4.18 4.1.3.2.2 Amplificao de proto-oncogenes .......................................4.19 4.1.4 A "estatstica" na origem dos tumores: mutaes espontneas4.19 4.2 A NOMALIAS GENTICAS EM DOENAS HEMATO-ONCOLGICAS .........4.20 4.2.1 Translocaes cromossmicas em hemato-oncologia ...............4.20
4.2.1.1 Translocaes envolvendo genes das Ig ou TCR .............................4.20

4.2.1.1.1 4.2.1.1.2
4.2.1.2

translocao t(8;14)(q24;q32) e o EBV..............................4.22 A t(14;18) - BCL2/IgH..........................................................4.23

Translocaes que originam genes hibridos .....................................4.25

4.2.1.2.1 t(9;22) - bcr/abl .......................................................................4.25 4.2.1.2.2 t(15;17) - pml/rar ....................................................................4.27 4.2.2 Deleces cromossmicas em hemato-oncologia.......................4.30 4.2.3 Mutaes pontuais em hemato-oncologia ....................................4.30
4.2.3.1 mutaes no gene p53.......................................................................4.30

4.3 PATOLOGIAS HEMATO-ONCOLGICAS......................................................4.30 4.3.1 LMC.....................................................................................................4.30 4.3.2 LMA.....................................................................................................4.30 4.3.3 LLA ......................................................................................................4.30 4.3.4 LLC ......................................................................................................4.30 4.4 UTILIDADE CLNICA DA GENTICA MOLECULAR EM HEMATOONCOLOGIA................................................................................................................4.30 4.4.1 Aprofundamento de conhecimentos...............................................4.31 4.4.2 Escolha de tratamentos especficos...............................................4.31 4.4.3 Monitorizao da doena................................................................4.31

5 REAS DE INTERVENO DA GENTICA MOLECULAR EM HEMATOLOGIA .......................................................................................................5.1 5.1 - DOENAS GENTICAS DO GLBULO RUBRO ..........................5.3 5.1.1 - Anemias No esferocticas Congnitas.............................................5.3
5.1.1.1 - Deficincia em Glucose-6-fosfato desidrogenase...........................5.3 5.1.1.2 - Deficincia em piruvato quinase......................................................5.4 5.1.1.3 - Deficincia em -aminolevulinato sintetase (Anemia sideroblstica).......................................................................................................5.5

5.1.2 5.1.3 5.1.4

- Talassmias (anomalias das e -globinas) ..................................5.6 Drepanocitose........................................................................................5.11 Anemias Hemoliticas esferociticas.................................................5.12

- Esferocitose Hereditria (HS) .......................................................5.13 - Deficincia grave de protena 4.2...................................................5.14 - Eliptocitose e poiquilocitose Hereditria ......................................5.15

5.1.4.1 5.1.4.2 5.1.4.3

5.2 DOENAS GENTICAS EM HEMOSTASE.....................................5.16 5.2.1 - Resistncia protena C Activada (mutao FV-Leiden)..........5.16 5.2.2 Mutaes no gene da Protrombina.................................................5.18 5.2.3 - Doena de von Willebrandt (Mutaes no gene do vWF)..........5.19 5.2.4 - Trombose familiar (Mutaes nos genes da Antitrombina III, Protena C e Protena S)...................................................................................5.19 5.2.5 - Hemofilias (Mutaes nos genes dos factores VIII e IX)............5.21 5.3 - HEMOCROMATOSE.............................................................................5.22 5.3.1 - Estudos de marcadores genticos no locus do HLA.....................5.23 5.3.2 - Estudos dos IRE e IRP .......................................................................5.24 5.3.3 - Estudos Genticos do Repertrio da Clula T ..............................5.26

MTODOS DE ESTUDO EM GENTICA MOLECULAR..........6.1 6.1 MTODOS NO COMERCIAIS ..................................................... 6.3 6.1.1 Preparao de DNA e RNA........................................................6.3 6.1.2 ELECTROFORESE .....................................................................6.4
6.1.2.1 6.1.2.2 Gis de Agarose .......................................................................... 6.5 Gis de acrilamida....................................................................... 6.5

6.1.3
6.1.3.1 6.1.3.2

Reaco de polimerase em cadeia (PCR)................................6.6

Princpios do mtodo .................................................................. 6.6 RT-PCR....................................................................................... 6.8

6.1.4
6.1.4.1 6.1.4.2

Southern Blot................................................................................6.9
Princpios do mtodo .................................................................. 6.9 Endonucleases de restrio ....................................................... 6.10

6.1.4.2.1 6.1.4.2.2 6.1.4.2.3 6.1.4.2.4

6.1.4.3

Funes biolgicas dos sistemas R-M ........................ 6.10 Sistemas R-M tipo II...................................................... 6.11 Sistemas R-M tipo IIs .................................................... 6.12 Montar uma reaco de restrio................................. 6.12

Mtodos de marcao da sonda ................................................ 6.14

6.1.4.3.1 RADIOISTOPOS........................................................ 6.14 6.1.4.3.2 POLIMERASES DO DNA .......................................... 6.16 6.1.5 Dot-Blot ...................................................................................... 6.16 6.2 M TODOS COMERCIAIS....................................................................... 6.17 6.2.1 Amplicor ..................................................................................... 6.18 6.2.2 "Branched DNA"....................................................................... 6.19 6.2.3 NASBA/Nuclisens...................................................................... 6.21 6.2.4 Ligase Chain Reaction ............................................................. 6.23 6.2.5 DEIA ............................................................................................ 6.25

Captulo 1
1 A gentica Molecular da Clula no Patolgica

1.2

1.1 Conceitos bsicos de Gentica Molecular 1.1.1 O material gentico

1.1.1.1 cidos Nucleicos (DNA e RNA)

Foi apenas em 1944 que Griffith demonstrou que a hereditariedade era transmitida pelos cidos nucleicos. A experincia realizada demonstrou que a capacidade de matar um ratinho era conferida a uma estirpe bacteriana no virulenta, pelo DNA de uma outra estirpe bacteriana virulenta (fig.1.1).

Figura 1.2 Experincia de Hershley e Chase demonstrando que a transmisso gentica nos fagos T2 estava associada ao DNA. Em 1952, Hershley e Chase demonstraram que o fago T2 (um vrus que infecta bactrias) transmite os seu cdigo gentico bactria infectada, atravs da injeco do seu DNA na bactria, alargando assim o nmero de organismos que demonstradamente utilizam o DNA como registo gentico (fig.1.2). Sabemos hoje que com a excepo de alguns tipos de vrus, todos os organismos utilizam o DNA como portador da sua informao gentica. Os vrus que fogem a esta regra utilizam o RNA para o mesmo efeito.

Fig. 1.1 Experincia de Griffith demonstrando que a virulncia bacteriana era uma caracterstica gentica transmitida pelos cidos nucleicos.

1.3

1.4

4 das cinco bases: o DNA contm Adeninas (A), Timidinas (T), Guaninas (G) e Citosinas (C); enquanto o RNA contm Adeninas (A), Uracilos (U), Guaninas (G) e Citosinas (C). As pentoses encontradas nos cidos nucleicos so de 2 tipos: 2-desoxirriboses e riboses (Fig. 1.4) dando origem ao cido Desoxirribonucleico (DNA) e ao cido Ribonucleico (RNA).

Figura 1.3 - As bases azotadas que entram na composio dos nucletidos.

1.1.1.1.1 A estrutura do DNA

Figura 1.4 - As pentoses so o componente dos cidos nucleicos que definem o seu tipo. A desoxirribose entra na composio do DNA, enquanto a ribose compe o RNA

Com a aceitao generalizada por volta dos anos 50 de que a informao gentica residia no DNA, a grande questo passou a ser o mecanismo de armazenamento dessa informao. Com efeito, nesta altura no se compreendia como que um polmero to simples (apenas constitudo por 4 tipos de unidades diferentes) e que se pensava ser homogneo em toda a sua extenso podia codificar a enorme variedade de protenas que compunham os organismos. Para tal, houve necessidade de elucidar de forma precisa a estrutura dos cidos nucleicos. Sabemos hoje que os cidos nucleicos so polmeros de nucletidos. Cada nucletido contm um anel heterocclico de carbono com 5 tomos de azoto (a base nitrogenada), 1 anel de 5 carbonos (uma pentose) e um grupo fosfato. As bases nitrogenadas so de 2 tipos: purinas e pirimidinas, sendo o nmero total de bases disponvel de cinco (fig. 1.3). No entanto, cada tipo de cido nucleico utiliza apenas 1.5 1.6

Figura 1.5 - Os nuclesidos so compostos por uma base e uma pentose.

Em 1953, uma importante descoberta realizada por Watson & Crick transformou a viso do material gentico. Dados de difraco de raios X mostraram que o DNA tem a forma de uma hlice regular. Das dimenses obtidas para a hlice na difraco de raios X, e da densidade do DNA, inferiu-se ento que a hlice era composta por duas cadeias polinucleotdicas, com as bases de cada cadeia viradas para o interior da hlice. As bases de cada hlice emparelham de tal modo que uma purina se ope sempre a uma pirimidina. Estes dados, conjugados com a observao anterior de Chargaff indicando que independentemente da quantidade de cada base, a proporo G:C e A:T sempre a mesma no DNA, indicam que G emparelha com C e A com T na dupla hlice do DNA. Watson & Crick propuseram que o emparelhamento no se realizava por ligao covalente, mas por pontes de hidrognio entre as bases nitrogenadas (Fig. 1.7). Para tal, as 2 cadeias devem orientar-se de modo antiparalelo (Fig. 1.7). Obteve-se assim para o DNA o modelo ilustrado na figura 1.8.

Figura 1.6 - Os nucletidos unem-se por ligaes fosfodiester para dar origem aos cidos nucleicos.

Os nuclesidos so compostos por uma base nitrogenada e uma pentose (fig. 1.5). Um nuclesido com um grupo fosfato no carbono 5 chama-se nucletido. Os nucletidos so as unidades de construo dos cidos nucleicos, sendo unidas por uma ligao 5-3: o carbono 5 da pentose de um nucletido une-se ao carbono 3 da pentose do nucletido seguinte por uma ponte fosfodiester, ficando a base nitrogenada exterior ao esqueleto da ligao (Fig.1.6). 1.7 1.8

Figura 1.8 - Estruturas possveis para a dupla hlice do DNA. O modelo da esquerda o da forma A, o do meio o da forma B e do da direita o da forma Z. A estrutura do DNA identificada por Watson & Crick, e ilustrada na figura 1.8B (forma B) a que em situaes fisiolgicas mais frequente. No entanto nem todo o DNA da clula se encontra nesta estrutura, e certamente in vitro possvel manipular as condies do meio, favorecendo outras conformaes. Na tabela 1 encontram-se sumariadas as caractersticas das 4 conformaes teoricamente possveis para a conformao dos cidos nucleicos, podendo na figura 1.8 ver-se comparativamente a conformao prevista.

Figura 1.7 - O DNA formado por duas cadeias com orientao antiparalela, com as bases de cada uma das cadeias a hibridizarem entre si.

1.9

1.10

Tabela 1.1 - Caractersticas dos tipos de hlice que o DNA pode tomar Tipo de N. Bases Rotao por Hlice por Volta par de Bases A 11 +32.7 B 10 +36 C 9.33 +38.6 Z 12 -30 Elevao por par de bases 2.56 3.38 3.32 3.71 Dimetro da hlice 23 19 19 18

A dimenso do material gentico no Homem coloca o problema de como conseguir compactar 1,8m de DNA num ncleo que pode ser to pequeno como 6m (6x10-6 m). Este empacotamento tem ainda que ser flexvel j que deve mudar ao longo do ciclo celular, aumentando durante as mitoses de tal modo que os cromossomas se tornam individualizados e visveis ao microscpio ptico.

Durante a maior parte do ciclo celular a cromatina pode ser dividida em dois tipos de material gentico (Fig. 1.9): a eucromatina a que ocupa a maior regio do ncleo, sendo composta por material muito menos compactado que os cromossomas; a heterocromatina composta por material muito compactado, formando fibras (encontrase num estado intermdio entre a compactao dos cromossomas e a relativa descompactao da eucromatina). A heterocromatina e a eucromatina no representam fibras de DNA diferentes, j que as mesmas fibras passam pelas duas zonas do ncleo. Constituem assim partes das fibras com diferentes estados de condensao: a heterocromatina constituda por regies do DNA que no so habitualmente expressas na clula em causa, enquanto os genes expressos se localizam na eucromatina (muito embora os genes na eucromatina no estejam todos a ser expressos). Em 1974, foi descoberta a estrutura bsica de organizao da cromatina em todos os eucariotas.

Figura 1.10 - A dupla hlice de DNA d duas voltas ao ncleo central de protenas do nucleosoma

Figura 1.9 Tipos de cromatina observveis em interfase. 1.11 1.12

Figura 1.11 - A organizao do DNA nos nucleosomas coloca prximas sequncias de DNA distantes na sequncia linear

Esta subunidade organizativa bsica (nucleosoma) contm cerca de 200 bp de DNA, organizados por um octmero de protenas pequenas e bsicas (histonas) numa estrutura tipo rosrio em que o DNA se localiza no exterior das contas, e as protenas no seu interior (Fig.1.10). Esta organizao explica porque os l cais de ligao a o protenas se encontram por vezes to espaados na sequncia do DNA (Fig. 1.11). O octmero de histonas constitudo por 2 cadeias de cada uma das histonas H1, H2A, H2B e H3, existindo ainda, por vezes, uma 5 histona (H1) a estabilizar as 2 voltas de DNA ao octmero (Fig. 1.12).

Figura 1.12 Vista de cima da organizao das histonas no nucleosoma. Existe ainda um par H2A/H2B por baixo, e por vezes uma histona H1 exterior ao nucleosoma

Figura 1.13 - A compactao das histonas na fibra de DNA de 10nm

1.13

1.14

A anlise da cromatina ao microscpio electrnico revelou a existncia de 2 tipos de fibras: a fibra de 10nm e a 30nm. A fibra de 10nm essencialmente 1 sequncia continua de nucleosomas (Fig. 1.13). Esta fibra ocorre em condies de baixa fora inica, e na ausncia de histonas H1. Em condies de alta fora inica e na presena da histona H1, forma-se a fibra de 30nm, a qual essencialmente um enrolamento de 6 nucleosomas por volta (Fig. 1.14). A transcrio (cpia dos genes em mRNA), como veremos no captulo 1.1.2.1, envolve a deslocao no DNA de uma complexa maquinaria enzimtica, e inclui a abertura da dupla cadeia do DNA. Este facto, no compatvel com um elevado grau de empacotamento das fibras do DNA, pelo que se compreende que os genes transcripcionalmente activos se localizem na eucromatina. No entanto, os resultados experimentais indicam que a estrutura dos genes transcripcionalmente activos envolve o empacotamento em nucleosomas, ainda que seja necessrio admitir que durante a

transcrio estes sejam temporariamente desmontados pela maquinaria enzimtica.

1.1.1.1.2 A estrutura do RNA

Na clula existem vrias formas de RNA, as quais possuem estruturas e funes diferentes: mRNA - O mRNA ou RNA mensageiro, a espcie de RNA que transporta a informao para a sntese das protenas no ribossoma. O m RNA formado no ncleo na transcrio do DNA, passando ainda por uma fase de processamento antes de atingir o citoplasma na forma madura (mRNA). O processamento efectuado inclui o Splicing, isto a remoo das sequncias no codificantes ou introns. Outras alteraes introduzidas no processamento que ocorre no ncleo consistem na adio de uma cauda poli-adenina extremidade 3, e metilao CAP da extremidade 5. A estrutura CAP resulta da ligao de um G purina com que a transcrio habitualmente se inicia, ficando este G na orientao inversa, e ligado pelo trifosfato deixado livre pela purina: Gppp + pppApNpNp GpppApNpNp G sofre ento uma ou mais metilaes. tRNA - o tRNA ou RNA de transporte um tipo de RNA que se encontra covalentemente ligado a um aminocido, tendo como funo o transporte do aminocido para o ribossoma, onde este vai ser posicionado com preciso, sempre que o ribossoma estiver a ler um codo complementar do tripleto que o tRNA possui (anticodo). As 64 espcies de tRNA (correspondentes aos 64 codes), possuem uma estrutura bsica semelhante.

Figura 1.15 hierarquia de condensao do DNA na cromatina. Figura 1.14 - A organizao dos nucleosomas na fibra de DNA de 30nm.

1.15

1.16

que estas sequncias tm sido utilizados como marcadores no mapeamento gentico. Sequncias moderadamente repetitivas: Nos genomas eucariticos, os genes que existem em cpia nica so poucos. Na maior parte dos casos, existem sequncias com alguma similaridade, algumas das quais no funcionais (os pseudogenes). A vantagem da existncia de mais que uma cpia dos genes bvia j que assim os organismos podem conservar uma cpia intacta do gene, mutando a outra, numa tentativa de evoluir. Neste processo de evoluo, algumas cpias ficam com a sua funcionalidade comprometida, tornando-se pseudogenes. No entanto, uma vez que uma outra cpia funcional existe, nenhum efeito nefasto da ocorre para o organismo. Um conjunto de genes que descende por duplicao e variao de um gene ancestral chamado de famlia gnica. Os seus membros podem estar arranjados em grupos sequenciais (gene clusters), dispersos no genoma (muitas vezes mesmo em cromossomas diferentes), ou numa combinao de ambos os arranjos. Os gene clusters podem conter desde 2 at centenas de genes idnticos, alinhados em sequncia. A disperso dos genes ocorre por translocao de um gene aps a duplicao. Os m embros de um gene cluster tm funo similar, mas podem ser expressos em tipos celulares diferentes ou em diferentes condies (Ex. Gene da globina). Em alguns casos, o gene cluster responde grande necessidade de protenas ou de RNA (ex.: rRNA e histonas). Sequncias altamente repetitivas: As sequncias altamente repetitivas tomam a forma de sequncias muito curtas, repetidas muitas vezes em sequncia. Formam-se assim blocos de material genmico, consistindo cada bloco em longas repeties de uma unidade. Em alguns casos as unidades so rigorosamente iguais, noutros so relacionadas. A repetio sequencial de unidades de sequncia forma blocos de DNA com caractersticas fsicas distintas do resto do genoma, o que pode ser utilizado para as isolar. Uma das 1.18

Figura 1.16 Estrutura do tRNA rRNA - trata-se do RNA ribossomal, o qual como o nome indica um dos componentes dos ribossomas. O rRNA constitui a maior parte da massa do ribossoma, e provavelmente todas as protenas do ribossoma se associam ao rRNA. Assim, o rRNA forma como que o esqueleto do ribossoma, determinando a posio das vrias subunidades proteicas.
A ORGANIZAO DOS GENES NO GENOMA

1.1.1.2

O genoma pode, de uma forma genrica, ser classificado em DNA no repetitivo e DNA repetitivo. A abundncia relativa dos dois tipos de DNA podem ser experimentalmente determinados, tendo por base a diferente cintica de re-hibridao (DNA repetitivo encontra mais rapidamente uma sequncia complementar com quem pode hibridar). O DNA no repetitivo representa sequncias nicas, ou seja genes de cpia nica no genoma. O DNA repetitivo constitudo por DNA moderadamente repetitivo, representando genes com vrias cpias no genoma, e DNA altamente repetitivo. A funo do DNA altamente repetitivo permanece at ao momento uma incgnita. Como j vimos, um exemplo deste tipo de DNA o que existe nos telmeros, onde provavelmente tem a funo de estabilizar o cromossoma. Existem no entanto, repeties de pequenas unidades de sequncias espalhadas pelo genoma (mini e microssatlites), os quais constituem em pequenas sequncias, repetidas um determinado nmero de vezes. O nmero de repeties em muitos casos altamente polimrfico, pelo 1.17

propriedades fsicas do DNA que depende da sequncia a densidade, a qual depende do contedo GC. A densidade e habitualmente determinada mediante a centrifugao do DNA num gradiente de Cloreto de Csio (CsCl). O DNA forma assim bandas correspondentes a sua prpria densidade. Quando este procedimento realizado para DNA genmico eucariota, forma um pico algo largo, consistindo numa mistura de sequncias com densidades prximas (a banda principal). Por vezes forma-se ainda um ou mais picos adicionais, de menor intensidade. A este material chama-se o DNA satlite. O DNA satlite existe no genoma de varias espcies eucariotas, pode ter uma densidade superior ou inferior banda principal, mas representa habitualmente menos de 5% do genoma total. O DNA satlite encontra-se frequentemente localizado na heterocromatina, no sendo habitualmente possvel encontrar as suas sequncias entre o RNA. Nos mamferos, as sequncias que compem cada satlite mostram divergncia aprecivel entre as repeties de cada. Habitualmente existem sequncias curtas predominantes, mas outras relacionadas com estas, mas contendo adies, substituies e deleces formam o restante satlite. Frequentemente, pode observar-se uma hierarquia nas repeties dos satlites, com uma sequncia base a repetir-se, a qual por vezes sofre modificaes, as quais por sua vez se repetem tambm de forma mais ou menos cclica. Este facto originou uma hierarquia de nomenclatura: DNA satlite, minisatelites, microsatelites.
1.1.1.3 Estrutura de um Gene

vrus, a equivalncia perfeita: cada gene contm uma sequncia continua de nucletidos, cuja sequncia e comprimento est directamente relacionada com a da protena. Quando falamos em correspondncia entre o gene e a protena, estamos no entanto a simplificar o que realmente se passa. Como veremos mais tarde, um gene no codifica directamente uma protena, j que a informao tem que passar por um estado intermdio: o RNA. Assim, mesmo o mais simples dos genes tem que conter sequncias de vrios tipos: sequncias reguladoras ou no codificantes: sequncias que permitem clula controlar que genes esto activos em cada momento, possibilitando assim uma resposta diferenciada dependente das necessidades de cada momento. As sequncias reguladoras podem existir em cada extremidade do gene, e em alguns casos estar mesmo bastante distanciadas das sequncias codificantes. sequncias codificantes: sequncias que so directamente transcritas para RNA, e deste codificadas em protenas. Note-se que enquanto o DNA de cadeia dupla, o RNA de cadeia simples, pelo que apenas uma das cadeias do DNA pode ser idntica a do RNA (codificante ou +), sendo a outra cadeia complementar do RNA (-). Como acima foi dito, o gene no no entanto to simples nos eucariotas. Ao contrario das bactrias e vrus, nos organismos eucariotas, os genes e as protenas no so colineares, isto , a regio codificante dos genes (exons) interrompida a espaos irregulares por sequncias no codificantes (introns). Este facto faz com que nos eucariotas, a expresso genica envolva um passo adicional: o splicing do RNA, ou processamento do RNA (com exons e introns) em mRNA.

A comparao directa entre a sequncia do DNA de um gene, e a sequncia da protena respectiva, permite determinar se o gene e a protena so ou no colineares: se a sequncia do gene corresponde exactamente a sequncia de aminocidos da protena. Nas bactrias e 1.19

1.20

Um promotor uma sequncia de DNA, habitualmente na extremidade 5' de um gene, com a funo de se ligar a protenas, e controlar a iniciao da transcrio. As protenas a que um promotor se deve ligar, so vrias, disso dependendo a sua dinmica funcional. Genericamente pode falar-se de protenas repressoras, protenas activadoras, e da RNA polimerase. As protenas repressoras, ao ligarse ao promotor impedem a ligao da RNA polimerase, impedindo assim o iniciar da transcrio, enquanto a ligao das protenas activadoras tem o efeito inverso. As propriedades do promotor que lhe conferem afinidade para as diversas protenas dependem da sua sequncia, pelo que esta varia de gene para gene, conferindo aos diversos genes caractersticas de regulao diferentes. No entanto, a ligao a polimerase do RNA universalmente necessria, pelo que deve ser possvel encontrar uma sequncia "consenso" para os promotores. Esta sequncia consenso consiste na sequncia mnima comum entre os vrios promotores, e deve incluir a sequncia absolutamente necessria para a ligao a polimerase do RNA. Para os procariotas foi possvel definir a regio 44-50bp "upstream" do ponto de iniciao at 20bp "downstream" com sendo a regio que interactua com a polimerase do RNA, tendo sido definida uma sequncia consenso consistindo de vrios padres: Pribnow box ou sequncia -10- imediatamente upstream do ponto de iniciao (-18 a -12) existe uma regio com a sequncia T80A95T45A60A50T96 (os nmeros representam a frequncia com que as bases ocorrem). A funo desta sequncia parece ser a de permitir que aps a ligao da polimerase do RNA esta possa iniciar a sua evoluo ao longo do gene, possivelmente por permitir a iniciao da abertura da cadeia do DNA (o facto de ter alto contedo AT facilita a abertura da dupla hlice). Sequncia de reconhecimento ou Sequncia -35 - O seu nome deriva do facto de esta ser parte da sequncia que a polimerase tem que reconhecer, mas que no fica fortemente ligada a esta. A 1.21

sequncia consenso : T82T84G78A65C54A45. A funo desta regio parece ser a de conferir a capacidade de ligao a polimerase do RNA. No caso de organismos eucariotas, o estudo dos promotores bem mais complexo, j que existem no uma RNA polimerase, mas trs. A acrescentar a esta dificuldade, est o facto de no se conhecer com preciso todos os componentes da maquinaria de transcrio eucariota, pelo que os estudos In viro ficam comprometidos. partida 2 particularidades existem nos eucariotas, relativamente ao que se passa nos procariotas: 1) o promotor da polimerase III fica localizado downstream do gene; 2) no possvel conhecer as particularidades do promotor da polimerase I, j que esta transcreve apenas os genes dos rRNA os quais so todos idnticos. No entanto o promotor da RNA polimerase II, a responsvel pela transcrio da maioria dos genes nos eucariotas so conhecidos com alguma profundidade. As principais sequncias consenso identificadas nos promotores da RNA polimerase II dos eucariotas so:

A63 A A83 50 Tambm T37 T37 conhecida por Hogness box. Trata-se de uma sequncia quase universalmente presente em mamferos, aves, anfbios e insectos. Posiciona-se a uma distncia do ponto de iniciao entre 19 e 27bp. Como pode ver-se da sequncia consenso, a TATA Box constituda quase exclusivamente por AT, sendo as mutaes que inserem um GC muito raras. Esta sequncia habitualmente rodeada por sequncias ricas em GC, o que pode ser importante para a sua funo.
TATA BOX - sequncia consenso: T82 A97

1.22

T CAATCT . Esta sequncia C esta presente em alguns promotores, mas no em todos. A sua distancia ao ponto de iniciao ronda os 70 a 80bp.
CAAT BOX - sequncia consenso GG As anlises In vitro identificaram uma estrutura semelhante ao promotor bacteriano, imediatamente upstream do ponto de iniciao. No entanto, estudos In vivo revelaram a dependncia de zonas ainda mais upstream da TATA box. Este componente pode consistir em duas regies, uma entre -80 e -110 e a outra entre -50 e -70. Esta ltima pode ou no conter a CAAT box. Juntos, estas duas regies tm uma forte influncia na frequncia de iniciao, possivelmente por influnciar a ligao da RNA polimerase II. Junto ao ponto de iniciao, em redor da TATA box existe um componente que parece no ter influncia na frequncia de iniciao, antes de terminando o ponto de iniciao. Na ausncia deste elemento, a transcrio tem uma iniciao errtica. Os promotores eucariticos so bem mais complexos que os procariotas. Ao contrrio dos promotores procariticos, e contrariamente ao que at agora assumimos, um promotor eucaritico no funciona s. A sua actividade enormemente aumentada de acordo com a regulao efectuada por outro tipo de sequncias reguladoras: os enhancers. Estas sequncias so distinguveis dos promotores devido a duas caractersticas essenciais: a sua posio relativamente ao promotor muito varivel, podendo ser considervel, e funcionando em qualquer sentido (upstream ou downstream) e orientao. Um enhancer no actua apenas num promotor, podendo interactuar com qualquer promotor colocado na sua rea de influncia.

Vrios vrus contm enhancers. Destes, os mais perigosos para a clula que o vrus infecta so os enhancers presentes nos retrovrus. Como estes vrus se integram no genoma da clula infectada, a presena de enhancers pode levar activao de um ou mais genes celulares que de outra forma estariam silenciosos. Desta forma, os retrovrus podem de forma indirecta, originar patologias, mesmo no seu estado dormente, j que mesmo na ausncia de transcrio viral, podem induzir alteraes no programa gentico da clula infectada. O modo de funcionamento dos enhancers permanece desconhecido. Foram no entanto colocadas vrias possibilidades, entre as quais: Formao de estrutura no DNA em cadeia Z (ver figura 5). Os enhancers contm habitualmente uma sequncia alternada de pirimidinas-purinas. Esta sequncia tem elevada probabilidade de formar uma estrutura em z-DNA. Se, por um lado, o modo como esta estrutura poderia afectar a transcrio no est esclarecido, por outro lado, este mecanismo poderia explicar porque os enhancers funcionam independentemente da sua orientao. Ligao do DNA a uma estrutura como a matriz nuclear ligao directa polimerase Quando a polimerase do RNA inicia a transcrio, esta prossegue com o complexo enzimtico a percorrer o DNA, at que a enzima encontra um sinal para cessar a actividade. Neste ponto, a enzima pra de adicionar nucletidos, liberta a cadeia de RNA nascente e dissocia-se do DNA. Assim, a terminao envolve a quebra de todas as pontes de hidrognio entre o DNA e o RNA, e a reassociao da dupla hlice do DNA. A sequncia de DNA que d o sinal para que este processo ocorra chama-se terminador (ou abreviadamente t). Em alguns genes procariticos, existem factores denominados anti1.24

1.23

terminadores, que permitem polimerase continuar a transcrio passando por um terminador, num processo chamado de readthrough). Assim, a terminao no constitui simplesmente uma forma de terminar a transcrio, mas tambm uma forma de controlar esta, j que a existncia dos anti-terminadores pode determinar a transcrio ou no de determinados genes que se encontrem aps o terminador. Pouco se sabe dos terminadores dos genes eucariticos. A principal dificuldade no estudo dos terminadores em eucariticos a incerteza quanto ao local de terminao da transcrio. Ainda que a maior parte das espcies de mRNA eucariticas conhecidas possuam extremidades 3 bem definidas, muito difcil saber se esta extremidade foi produzida por terminao ou por processamento. No caso dos produtos da polimerase II, o problema exacerbado pelo extenso processamento que ocorre com a adio da cauda poli-A. Pelo menos em alguns casos foi possvel determinar que a extremidade 3 observada no RNA de facto originada por corte de uma cadeia de RNA mais longa. Estudos efectuados com sequncias de histonas (no poliadeniladas), permitiram verificar que o mRNA termina numa estrutura semicircular (stem-loop). Com efeito, mutaes que impeam a formao desta estrutura, impedem a terminao, enquanto que outras mutaes que revertam a mesma estrutura, embora com uma sequncia diferente, restauram a terminao. Assim, a estrutura parece mais importante que a sequncia que a determina. Os genes eucariticos e procariticos diferem numa caracterstica essencial. Ao contrrio dos genes procariticos, os gene dos organismos eucariticos no so contnuos, mas interrompidos. Significa isto, que no meio das sequncias codificantes, surgem sequncias que tm que ser retiradas do RNA, antes de este poder servir de molde construo das protenas. Este processo de transformao que o RNA sofre nos organismos eucariticos 1.25

chamado de processamento, ocorre no ncleo, e como veremos envolve no apenas a remoo das sequncias extra (splicing) como outras transformaes qumicas. Os genes eucariticos so assim formados por dois tipos de sequncias transcritas (isto copiveis para RNA) os exons e os introns (tambm chamados de intervening sequences). Os primeiros compem as sequncias que estaro presentes no RNA maduro, sendo os segundos as sequncias que sero removidas durante o splicing. A comparao das sequncias nucleotdicas nas extremidades dos exons permite descrever as suas caractersticas: No existe homologia extensa entre as duas extremidades de um intron, o que exclui a possibilidade da formao de uma estrutura secundria que determine os pontos de corte. As junes possuem uma sequncia consenso conservada mas curta, a qual pode estar envolvida no processo de splicing:
Exon-----------------------Intron------------------------------------Exon

A 64 G73 G100 T100 A 62 A 68 G84 T63 . . . 6Py 74-87 N C65 A 100 G100 N

1.26

1.1.1.4

O CDIGO GENTICO

A descoberta do cdigo gentico pretendeu responder questo j por ns formulada (Cap. 1.1) sobre o mecanismo que permite aos cidos nucleicos, com uma estrutura baseada em apenas quatro tipos de nucletidos, conter a informao que codifica um enorme nmero de protenas, as quais possuem 20 tipos de aminocidos. A elucidao do cdigo gentico pretendeu ainda explicar como que a expresso gnica regulada. No entanto, antes de esta questo poder ser estudada, era necessrio estabelecer definitivamente a veracidade do dogma central da gentica: Um gene - uma cadeia polipptidica. Uma caracterstica essencial do DNA que a sua estrutura bsica independente da sequncia (ao contrrio das protenas cuja conformao directamente dependente da sequncia). Assim, a sequncia do DNA no parece ser importante devido conformao, mas porque codifica uma sequncia bem definida de aminocidos. Note-se que o prprio conceito de que uma protena contm sequncias bem definidas de aminocidos data dos anos 50 (a caracterizao da insulina por Sanger), e portanto estabelecida sensivelmente na mesma altura que se estuda a informao g entica. A esta relao entre a sequncia do DNA e a sequncia proteica correspondente chamou-se cdigo gentico. Como vimos, a sequncia nucleotdica tem que conter informao suficiente para codificar aminocidos diferentes. Como s h quatro tipos de nucletidos no DNA, um clculo simples indica que so necessrios 3 nucletidos (um tripleto ou codo) para codificar um aminocido. As combinaes possveis com trs nucletidos so 43 =64, pelo que o cdigo gentico degenerado, isto , mais do que um tripleto deve codificar o mesmo aminocido (tabela 1.2). Tabela 1.2 - Cdigo gentico: significado dos 64 codons

U U
UUU Phe UUC UUA Leu UUG
CUU CUC Leu CUA CUG
AUU AUC Ile AUA AUG Met

SEGUNDA BASE C A
UCU UCC Ser UCA UCG CCU CCC Pr o CCA CCG AAU AAC Thr AAA AAG

G
UGU Cys UGC UGA STOP UGG Trp

UAU Tyr UAC UAA STOP UAG CAU His CAC CAA G ln CAG AAU Asn AAC AAA Lys AAG GAU Asp GAC GAA Glu GAG

CGU CGc Arg CGA CGG

AGU Ser AGC AGA Arg AGG

GGU GGC Gly GGA GGG

GUU GUC Val GUA GUG

GCU GCC Ala GCA GCG

Podem agrupar-se os codes segundo o aminocido que codificam (tabela 1.2). Quando tal realizado, pode observar-se que com frequncia, a base na 3 posio no significante, porque os 4 codes com as mesmas 1 e 2 bases codificam o mesmo aminocido (Tabela 1.2). Por vezes apenas distingue entre uma pirimidina e uma purina a 3 posio. A esta especificidade reduzida na 3 base chamase degenerncia da 3 base. Esta caracterstica, em conjunto com a tendncia para aminocidos semelhantes (isto polares, hidrofbicos, etc.) serem codificados por codes relacionados minimiza o efeito das mutaes.

1.27

1.28

Trs codes no codificam aminocidos. Como se pode observar na tabela 2, estes codes (UUA, UAG e UGA) indicam o fim da sequncia gnica, sendo por isso chamados de codes stop. O cdigo gentico foi inicialmente estudado na bactria E.Coli, pelo que a universalidade deste n ecessitou de extenso estudo. Sabemos hoje, que genericamente o cdigo gentico similar em todos os organismos vivos estudados. As excepes conhecidas so representadas por pequenas alteraes em algumas espcies de microorganismos, e no cdigo gentico mitocondrial, o qual possui algumas particularidades em alguns organismos (Tabela 1.3). Tabela 1.3 - Exemplos de excepes universalidade do cdigo gentico Organismo Codon Significado Provvel Significado na mitocndria habitual Todos UGA Triptofano Terminao Levedura CUA Treonina Leucina Mosca da fruta AGA Serina Arginina Mamferos AGA Terminao Arginina AUA Metionina Isoleucina
1.1.1.5 Mutaes e Polimorfismos

As mutaes pontuais so mutaes que ocorrem devido substituio de um nucletido por outro. A forma mais frequente de mutaes pontuais a transio, a qual ocorre quando uma pirimidina substituda por outra, ou uma purina por outra. A transverso menos frequente, e implica a substituio de uma pirimidina por uma purina, ou vice-versa. As mutaes pontuais podem ser de 3 tipos, de acordo com o efeito que provocam no aminocido codificado. Se no afectam o aminocido codificado so chamadas silenciosas, se mudam o aminocido codificado so chamadas missense, e se transformam o codo num codo stop so chamadas nonsense. As mutaes pontuais foram durante muito tempo consideradas as principais causas de mutaes. Sabe-se no entanto hoje, que as deleces so tambm muito frequentes, representando uma significativa poro das mutaes identificadas.
Selvagem GCU GCU GCU GCU GCU GCU GCU GCU GCU Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Insero (+) GCU GCU AGC UGC UGC UGC UGC UGC UGC U Ala Ala Ser Cys Cys Cys Cys Cys Cys Deleco (-) GCU GCU GCU GCU GCU _ CUG CUG CU Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Duplo mutante GCU GCU AGC UGC UGC _ UCU GCU GCU (+ -) Ala Ala Ser Cys Cys Ser Ala Ala triplo mutante GCU GAC UGC AUG CUG CAU GCU GCU GCU (+ + +) Ala Asp Cys Met Leu His Ala Ala Ala triplo mutante GCU _CUG CU_C UGC U_CU GCU GCU (- - -) Ala Leu Leu Cys Ser Ala Ala Figura 1.17 - Mutaes frameshift e seus efeitos. Note-se que as inseres e as deleces podem anular-se mutuamente, fora da zona entre as duas mutaes

Uma vez que o cdigo gentico lido em tripletos no sobreponveis, a insero ou remoo de um nucletido causa uma alterao na fase de leitura, alterando os codes subsequentes. Este tipo de mutao denominado em Ingls frameshift. Mutaes deste tipo so susceptveis de reverterem atravs da mutao inversa, isto , se a primeira mutao foi uma insero e a segunda uma deleco, ou vice-versa, apenas a zona do gene situada entre as duas mutaes se encontra mutada. A segunda mutao, denominada supressora, j que suprime o efeito da primeira, limitando a zona atingida (fig. 1.17) 1.29

As mutaes podem ser vantajosas, desvantajosas ou neutras, segundo as consequncias funcionais que provocam. As mutaes neutras, apesar de causarem alterao na sequncia no ocasionam 1.30

mudana funcional. Neste caso, deve falar-se em polimorfismo e no em mutao. 1.1.2 - A FISIOLOGIA DO GENE
1.1.2.1 Transcrio e transcrio reversa

da expresso gnica. A deciso principal na regulao de um gene, habitualmente a deciso de transcrever ou no esse mesmo gene. O que se traduz possivelmente numa necessidade de economia de energia e materiais por parte da clula. A transcrio catalisada pela RNA polimerase, e envolve a sntese de uma cadeia de RNA complementar da cadeia molde do DNA (a outra cadeia do DNA a imagem do RNA, isto a sua sequncia equivalente do RNA, excepto no facto de em vez de possuir Uracilos possui Timidinas). A transcrio ocorre pelo processo habitual de emparelhamento de bases num processo altamente regulado e encadeado. Em primeiro lugar, a polimerase deve ligar-se ao DNA de cadeia dupla num processo complexo que envolve cofactores (fig. 1.18). Em seguida, as duas cadeias do DNA devem ser separadas (fig.1.19), para tornar a cadeia complementar acessvel maquinaria de transcrio. A abertura da hlice do DNA um processo localizado, e medida que a transcrio prossegue, novas zonas do DNA vo ficando acessveis, enquanto as zonas j transcritas se vo emparelhando de novo, por forma a preservar a dupla hlice. A fase de iniciao da transcrio envolve assim, o reconhecimento do DNA pela polimerase, a abertura da hlice do DNA, e a incorporao do primeiro nucletido na cadeia do RNA nascente. O local do gene onde se processa todo este processo naturalmente o promotor (fig. 1.19). O local da incorporao do

O RNA a espcie de cido nucleico com um papel mais alargado na gentica molecular dos organismos. No s o RNA tem o papel mais meditico de mensageiro, mas tambm a espcie que assegura a descodificao da informao gentica ( o rRNA e o tRNA). Para alm destes papeis centrais em todos os organismos, existem ainda vrus que utilizam o RNA como material de armazenamento de informao gentica (os retrovrus). A produo do RNA tem habitualmente uma origem comum: a transcrio do DNA. No caso do mRNA, o produto formado um intermedirio cuja funo requer ainda a traduo. No caso do tRNA e do rRNA, o produto formado o efector da funo a que se destina. A transcrio talvez o passo por excelncia para a regulao Figura 1.18 Passos da iniciao 1.31 da transcrio

Figura 1.19 Elementos reguladores da iniciao da transcrio eucaritica 1.32

primeiro nucletido designado start site ou startpoint (fig.1.19). Depois da fase de iniciao inicia-se a fase de elongao, a qual produz a extenso da cadeia de RNA nascente, originando um hbrido de emparelhamento DNA-RNA. No entanto, medida que a elongao se processa, a polimerase caminha para novas regies do DNA, abrindo a hlice noutras zonas do gene, e fechando nas regies j transcritas, o que implica o desemparelhamento DNA-RNA. A terminao envolve o reconhecimento de um sinal indicando que no devem ser adicionados mais nucletidos. Nesta fase, termina a ligao DNA-RNA da cadeia nascente, com libertao da polimerase e da molcula de RNA. Desta descrio se pode inferir que a polimerase do RNA ( a enzima que catalisa a adio de nucletidos cadeia de RNA nascente) no funciona s, necessitando de um conjunto de outros componentes com funes essencialmente reguladoras e assessrias. Assim, quer a iniciao quer a abertura do DNA, quer a terminao so exemplos de processos em que intervm outros factores para a progresso organizada e controlada da expresso gnica. A maquinaria de transcrio das clulas eucariticas mais complexa e menos bem definida que a dos procariotas. Existem 3 polimerases nucleares, as quais ocupam diferentes locais do ncleo, e so cada qual composta por vrias subunidades. Para complicar ainda mais o problema, existem ainda outras polimerases do RNA em mitocondrias e cloroplastos. A maior parte da actividade de polimerase do RNA realizada, nos eucariotas, pela RNA polimerase I, a qual se encontra no nuclolo, e responsvel pela transcrio dos genes codificando os rRNA (cerca de 50-70% do RNA total sintetizado). A segunda enzima, a RNA polimerase II (20-40% da actividade total de sntese de RNA), e responsvel pela sntese do RNA heterogneo (hnRNA), o percursor 1.33

do mRNA. A RNA Polimerase III responsvel pela restante actividade de produo de RNA (at 10% do total), tem localizao nucleoplasmtica e responsvel pela produo dos tRNA e muitos dos small nuclear RNA (snRNA). Nenhum mecanismo de controlo da transcrio pode ser uma forma eficaz de controlar a expresso gnica, se o produto da transcrio (o mRNA) no tivesse uma vida curta. Se assim no fosse, previsivelmente ocorreria uma acumulao de mensageiro, ou pelo menos o mensageiro formado permaneceria activo tanto tempo que no seria possvel parar de sintetizar a respectiva protena. Na realidade, a instabilidade do mRNA muito acentuada. As duas formas de determinar a instabilidade do DNA baseiam-se ambas no bloquear da sntese de novo do mRNA (transcrio), medindo ento a sua capacidade para servir na sntese proteica (semi-vida funcional), ou a sua capacidade para hibridar com uma sonda (semi-vida qumica). De modo geral, a semi-vida funcional ligeiramente inferior semi-vida qumica, o que sugere que pequenas degradaes como um simples corte podero ser suficientes para a inactivao biolgica do mRNA. Verifica-se que este primeiro passo inicial seguido da degradao do mRNA nos seus nucletidos componentes, de forma mais ou menos sequencial na direco 53. O dogma central da gentica molecular afirma que os genes so unidades que se perpetuam a si prprios, e que funcionam atravs da sua expresso em protenas, atravs de um intermedirio de RNA. Note-se que o dogma, na sua v erso original define um paradigma que considera que a informao gentica transmitida unidirecionalmente: DNARNAProtena. Hoje em dia, sabemos que a restrio do dogma central no absoluta. Efectivamente, a informao gentica pode ser transmitida de forma diferente da acima prevista. Alguns vrus de RNA, utilizam o RNA para a propagao da sua informao gentica. Se esta pode parecer uma extenso relativamente pequena do dogma central, j a 1.34

existncia nos retrovrus (vrus de RNA de cadeia simples que utilizam o DNA de cadeia dupla como intermediria na sua replicao) de transcriptases reversas constitui uma grande mudana no paradigma da gentica molecular. As transcriptases reversas so enzimas que catalisam a sntese de um DNA de cadeia simples a partir de uma cadeia de RNA. Esta cadeia de DNA pode ento ser utilizada para sintetizar DNA de cadeia dupla, utilizando a maquinaria habitual da clula, efectivamente revertendo um dos passos acima indicado: RNADNA. Este facto tem implicaes profundas no s na forma de pensar a gentica, mas tambm na biologia da infeco viral, j que este DNA de cadeia dupla formado, e que uma cpia do RNA viral, vai agora integrar-se no genoma da clula, fazendo com que a infeco se propague de forma mais ou menos inofensiva progenia da clula infectada ( a integrao no genoma celular uma parte normal do ciclo de vida do vrus sendo necessria transcrio dos genes virais). Uma outra implicao deste mecanismo a possibilidade de uma infeco de vrus deste tipo poder mediar a insero de mRNA celular no genoma, como se de RNA viral se tratasse, originando duplicao gnica, e/ou insero de uma cpia do gene sob a aco de um promotor diferente, efectivamente alterando o programa gentico da clula. Uma outra implicao da infeco por este tipo de vrus, foi j por ns abordada aquando da discusso da existncia de enhancers, e constitui na possibilidade de colocar genes celulares sob a aco de enhancers virais, uma vez mais alterando o programa gentico da clula infectada. Os tipos de retrovrus de que existe mais informao disponvel so os que originam as partculas tipo C em aves e mamferos. Estes vrus contm duas cpias de RNA em cada virio. Assim, quando uma clula infectada por dois viries diferentes, podem-se originar viries heterozigticos, o que pode ser importante na aquisio de sequncias celulares por parte do vrus, j que mesmo que em contrapartida perca algumas sequncias do seu genoma, a restante 1.35

cpia do RNA viral permite-lhe continuar a ser capaz de efectuar uma infeco eficaz.
1.1.2.2 Traduo

A sntese proteica efectua-se no citoplasma, envolvendo uma complexa maquinaria gentica centrada no ribossoma (fig. 1.20). Esta maquinaria gentica pode ser vista como migrando ao longo do mRNA, lendo-o e utilizando a informao nele contida para alinhar com preciso cada aminoaciltRNA, promovendo a ligao peptdica entre este e a cadeia peptdica nascente.

Figura 1.20 O ribossoma interactuando com o mRNA, o tRNA e a cadeia polipeptdica nascente.

O ribossoma assim um altamente elaborado e preciso complexo enzimtico com diversificados componentes e vrios centros activos, que requer vrios cofactores para a sua actividade, e que obtm a energia qumica que necessita com a hidrlise de GTP. Um ribossoma composto por duas unidades (60S e 40S nos eucariotas) as quais, apesar de funcionarem em conjunto medeiam reaces diferentes na sntese proteica. O mRNA associa-se subunidade menor, ficando associado a este por cerca de 30-40 nucletidos. Apenas 2 molculas de tRNA se podem associar ao ribossoma em cada momento, pelo que apenas 2 dos cerca de 30 codons associados ao ribossoma se encontram a ser processados em cada momento. Cada tRNA liga-se ao ribossoma num local diferente deste, tendo cada um dos dois locais de ligao propriedades diferentes. Apenas o 1.36

Local A (local de entrada) pode receber um aminoacil-tRNA. Antes da entrada do aminoacil-tRNA, este local expe o codon a ser descodificado. O ltimo dos codons j descodificados encontra-se no local P (local dador), sendo este local ocupado pelo peptidil-tRNA (um tRNA contendo o aminocido j covalentemente ligado por uma ligao peptdica restante cadeia polipeptdica nascente). Quando estes locais (A e P) esto ambos ocupados ocorre a formao da ligao peptdica com transferncia do polipptido nascente para o tRNA do local A. O ribossoma desloca-se ento no mRNA libertando o tRNA do local P e transferindo para este local o peptidil-tRNA do local A, e expondo um novo codon no local A. A sntese proteica pode ser dividida em vrias fases: Iniciao: envolve as reaces que precedem a formao da ligao peptdica. Requer a ligao do ribossoma ao mRNA, a formao de um complexo de iniciao contendo o primeiro aminoacil-tRNA. Trata-se de um processo relativamente lento em comparao com as restantes fases da sntese proteica.

extremidade 5 do mRNA (na qual se encontra a estrutura conhecida como CAP) por parte da subunidade 40S do ribossoma. A subunidade 40S migra ento no mRNA at encontrar um codon de iniciao. Neste ponto, liga-se a subunidade 60S, aps a remoo de eIF-2 do complexo de iniciao.

Figura 1.22 Passos da fase de elongao da traduo eucaritica Figura 1.21 Passos da fase de iniciao e respectivos co-factores envolvidos Resumidamente pode dizer-se que nos eucariotas a iniciao comea com a ligao de GTP a um factor de iniciao denominado eIF-2 (eucariotic iniciation factor 2). De seguida efectua-se a ligao de um N-formil-metionil-tRNA a este complexo. o conjunto de factores assim formado que se liga ento subunidade 40S do ribossoma, a qual com o auxilio de outros factores de iniciao reconhece ento a 1.37

Elongao: inclui todas as reaces desde a sntese da primeira ligao peptdica, at adio do ltimo aminocido da cadeia polipeptdica. Os aminocidos so adicionados um a um, naquele que constitui o processo mais rpido da sntese proteica. 1.38

Assim que a subunidade 60S se liga ao complexo de iniciao, o ribossoma fica pronto a iniciar a elongao. Para tal necessita de aminoaciltRNA, o qual entra o local A, num processo mediado pelo factor eEF-1 (eucariotic elongation factor 1). Assim que o aminoaciltRNA se encontra correctamente posicionado no local A, a peptidil transferase (uma funo da subunidade 60S) catalisa a formao da ligao peptdica entre os aminocidos dos locais P e A. O ltimo passo na elongao a translocao, processo em que o ribossoma avana trs nucletidos de forma concertada( e que requer o factor adicional eEF-2). Este processo envolve a libertao do tRNA do

local P, a passagem do peptidil-tRNA do local A para o local P, e a exposio do prximo codon no local A agora vazio. Terminao: inclui todos os passos necessrios para a libertao da cadeia polipeptdica formada, bem como a dissociao do ribossoma do mRNA. Este um processo lento, em comparao com o tempo necessrio para adicionar um aminocido na fase de elongao. Dos 64 tripletos, apenas 61 codificam para aminocidos, sendo os restantes trs codons stop, ou de terminao. Qualquer destes trs codons (UAG, UAA e UGA) suficiente para terminar a sntese proteica. Aos codons de terminao no corresponde nenhum tRNA, sendo estes reconhecidos directamente pelo factor proteico eRF (eucariotic release factor). A reaco de terminao envolve a libertao do polipptido do ltimo tRNA, a expulso do tRNA do ribossoma, e a dissociao deste do mRNA. A clula eucaritica uma estrutura finamente organizada, cujas funes so efectuadas em locais celulares definidos. A sntese proteica no constitui excepo, podendo os polirribossomas ser classificados em 2 tipos (livres e ligados a m embranas), aos quais corresponde a sntese de diferentes grupos de protenas . Os polirribossomas livres sintetizam protenas que no interagem com membranas, enquanto os que se encontram associados s membranas sintetizam protenas cuja futura localizao depende da sua capacidade para se ligarem s membranas. Note-se no entanto que a denominao polirribossomas livres no significa que estes se encontrem livres em soluo no citoplasma. Estes polirribossomas encontram-se associados ao citoesqueleto para o que provavelmente dependem do mRNA. Figura 1.23 Passos da fase de terminao da traduo eucaritica 1.39 Os polirribossomas tendem a estar localizados perto de ncleos, nos locais de entrada do mRNA no citoplasma. A maior parte das 1.40

protenas sintetizadas so solveis, e uma vez libertadas rapidamente difundem para longe do local de sntese. As protenas que iro compor o citoesqueleto, tendem a integrar-se neste num local no muito distante do ponto de sntese. As protenas sintetizadas pelos ribossomas ligados a membranas tm vrios destinos. Algumas so sequestradas em compartimentos celulares , outras so componentes membranares, e outras ainda so protenas que se destinam a ser secretadas. Na maior parte dos casos das protenas de membrana, a sua futura localizao no depende da sequncia da protena madura, mas antes de uma sequncia denominada leader, e que se localiza na zona terminal da cadeia polipeptdica nascente. Esta sequncia, depois de ter determinado o destino da protena ser excisada do resto da protena, originando a protena madura.

1.1.2.3

Replicao

A descoberta da natureza de dupla hlice do DNA foi o ponto de partida para a compreenso do mecanismo de duplicao deste cido nucleico, o qual designado por replicao. Com efeito, o princpio bsico do emparelhamento dos nucletidos, em que assenta a estrutura do DNA tambm o princpio essencial para a compreenso da replicao do DNA, j que esta assenta na noo de que cada cadeia Figura 1.25 A replicao contnua de nucletidos funciona numa cadeia (cadeia "leading") e como padro na sntese da descontnua na outra (Cadeia uma nova cadeia (fig. 1.24). "lagging"). Assim, a replicao do DNA semiconservativa, isto , aps a duplicao, cada molcula de DNA tem uma cadeia original, e uma cadeia sintetizada de novo (fig. 1.24). Como a sntese se processa sempre no mesmo sentido (53) e as cadeias de DNA tm orientao invertida, numa das cadeias, a sntese contnua, sendo na cadeia complementar descontnua, a partir de vrios pontos de iniciao. Forma-se assim, em cada ponto de replicao uma estrutura em forma de Y (Forks). Como a replicao bidireccional (excepto nos vrus de DNA linear), cada ponto de iniciao da replicao d origem a dois Forks invertidos ( ). Para que a mesma polimerase possa sintetizar ambas as cadeias, forma-se uma estrutura local em loop na cadeia de sntese descontnua (fig. 1.26). 1.42

Figura 1.24 A replicao semiconservativa, tendo como base o emparelhamento de nucletidos

1.41

Em bactrias de DNA circular, habitualmente apenas um ponto de iniciao suficiente para replicar todo o genoma, mas em eucariotas, cada cromossoma possui Figura 1.26 Estrutura em loop que permite que uma polimerase sintetize mltiplos pontos de iniciao, que cooperam as duas cadeias de DNA. para a rpida replicao do DNA. Estes pontos possuem uma sequncia semelhante entre si. Conhecem-se 3 tipos principais destas sequncias: a OriC da E.coli a sequncia do vrus SV40, e a sequncia de replicao autnoma em leveduras. A OriC (bem como a maior parte das sequncias equivalentes em bactrias) composta por repeties de sequncias com 9 e 13 pares de bases (9-mers e 13-mers) ao longo de uma sequncia com cerca de 240bp, sendo estes 9-mers e 13-mers locais de ligao da protena DnaA, a qual inicia a replicao. A origem de replicao do SV40 possui cerca de 65bp. Os 17 cromossomas da levedura S.cerevisiae possuem mais de 400 sequncias de iniciao da replicao. Cada uma destas sequncias (denominadas ARS de autonomously replicating sequence) confere a um plasmdeo a capacidade de se dividir na levedura. Estudos mutagnicos efectuados ao ARS1 (cerca de 180bp) revelaram a existncia de apenas uma regio essencial, com cerca de 15bp, designada elemento A. Trs outros elementos (B1 ,B2 e B3 ) so necessrios para o funcionamento efectivo do ARS11. Um complexo de protenas chamado ORC (origin recognition complex) liga-se ao ARS1 de modo dependente do ATP. Adicionalmente a estas sequncias, uma sequncia a elas adjacente, rica em Adenosinas e Timidinas facilita a abertura da dupla hlice. 1.43

A replicao eucaritica (aqui descrita para o SV40 o modelo mais

Figura 1.27 A sntese descontnua da cadeia "lagging" exige primers de RNA sintetizados pela primase, formando-se temporariamente uma molcula mista RNA/DNA (fragmento de okasaki). bem conhecido) inicia-se com a ligao de uma protena viral chamada T antigen ao DNA. Esta protena multifuncional desenrola o DNA com a sua actividade de helicase, com a ajuda de ATP e um factor denominado RFA (replicating factor A), o qual uma 1.44

protena que se liga a DNA de cadeia simples. A replicao inicia-se ento bidirecionalmente a partir de primers de RNA produzidos por uma primase. Duas polimerases distintas ( e ) trabalham no fork eucaritico: a pol produz a cadeia leading, cuja sntese contnua; a sntese da cadeia lagging, realizada de modo descontnuo da responsabilidade da pol , a qual se encontra fortemente associada a uma primase. Na realidade, a sntese da cadeia leading na realidade o trabalho sequencial das polimerases e . O complexo

topoisomerases executam o importante trabalho de libertar as tenses de torso introduzidas pelo desenrolar da hlice do DNA padro. No final de cadeias de DNA linear, existe o risco de em cada sntese, a cadeia lagging se tornar progressivamente mais curta, pois a sntese descontnua necessita sempre de um template maior que a sequncia a amplificar. Para obviar a este risco, a clula possui nas extremidades do cromossoma estruturas especiais denominadas telmeros e compostas por repeties de sequncias oligomricas (ex. na levedura : 5-G1-3 T-3). Os telmeros so sintetizados por um processo diferente do acima descrito por enzimas especializadas: as telomerases. Estas enzimas so transcriptases reversas modificadas, produzindo DNA a partir de um template de RNA que a elas se encontra associado, e que determina portanto a sequncia do telmero. Finalmente um outro aspecto da sntese do DNA deve ser alvo da nossa ateno: a reparao de erros. As polimerases, no so enzimas isentas de erros, e a incorporao de nucletidos incorrectos por vezes ocorre. Vrios mecanismos de reparao destes erros existem, e deles depende a transmisso do patrimnio gentico, sem mutaes. O primeiro mecanismo de reparao do DNA est incorporado nas prprias polimerases. Estas enzimas, no s sintetizam DNA (actividade polimerase 53) como exercem uma actividade de verificao (proofreading) das bases recentemente adicionadas, removendo as bases incorrectas (actividade de exonuclease (35).
1.1.2.4 1.1.2.4.1 Mecanismos de Mutao do DNA Erros na replicao do DNA

Figura 1.28 Representao esquemtica dos vrios componentes que intervm na replicao eucaritica. primase-pol sintetiza o primer de RNA, e inicia a extenso do DNA, numa actividade estimulada pelo factor de replicao C. A ligao de PCNA (proliferating cell nuclear antigen) liberta a pol . A pol liga-se ento ao PCNA que activa a polimerase a qual sintetiza ento a cadeia leading. Finalmente enzimas chamadas 1.45

Quando, durante a replicao do DNA a polimerase incorpora nucletidos errados, produz-se uma mutao. Na maior parte dos casos, tal no se verifica, apenas porque a maioria das polimerases, possuem no apenas actividade de sntese na direco 53, mas tambm actividade de proofreading na direco 35. Assim, se o 1.46

nucletido incorporado for o errado, a polimerase usa a sua actividade exonucleolitica, e volta a tentar. Cada base do DNA existe em uma de vrias formas possveis, chamadas tautmeros. Trata-se de ismeros, em que a posio relativa e as ligaes entre os tomos variam. Normalmente apenas a forma ceto aparece no DNA, enquanto as formas enol e imino so raras. No entanto, os tautmeros enol e imino tm a capacidade de emparelhar com bases diferentes das que a forma ceto emparelha, levando a erros na replicao. Assim, por exemplo a forma imino da citosina pode emparelhar com a adenina, a forma enol da timina pode emparelhar com a guanina, a forma imino da adenina pode emparelhar com a citosina e a forma enol da guanina pode emparelhar com a timina. Uma outra forma de incorporao estvel de bases erradas ocorre com a replicao de bases ionizadas, a qual possivelmente mais frequente do que a mediada pelos tautmeros, e justifica os efeitos mutagneos das radiaes ionizantes. Os emparelhamentos de purinas com purinas e pirimidinas com pirimidinas, ocasionam distores na dupla hlice, j que foram alteraes na dimenso exterior da hlice. No entanto, mesmo este tipo de mutaes (transverses) ocorrem, tendo inclusivamente sido observado por difraco de raios X estruturas de DNA albergando este tipo de emparelhamentos. Tambm mutaes frameshift podem originar-se por erros de replicao. este tipo de erros ocorre preferencialmente em zonas de repetio de nucletidos (ex: AAAAA AAAA; CTCTCTCTCT), e pensa-se ser o resultado de um deslizar excessivo da polimerase, sem que este provoque uma desestabilizao do emparelhamento imediatamente adjacente ao local de polimerizao. Com o mesmo mecanismo se pode explicar 1.47

mutaes frameshift causadas por inseres, bastando para tal admitir que a cadeia que desliza a cadeia nascente.
1.1.2.4.2 L eses espontneas

As duas mais frequentes leses espontneas causando mutaes so a despurinao e desaminao. A mais comum a despurinao, a qual envolve a interrupo da ligao glicosidica entre a base e a desoxirribose, com a consequente perda de uma base de guanina ou adenina da molcula de DNA. Uma clula de mamfero perde espontaneamente cerca de 104 purinas do seu DNA num perodo de 20 horas a 37C. Assim se compreende a grande necessidade de mecanismos de reparao do DNA, para a manuteno do cdigo gentico, garantindo a viabilidade celular e a da progenia. Em certas condies, uma base pode ser adicionada ao nucletido apurnico (como um ltimo recurso de reparao), existindo neste processo 3 hipteses em 4 de o resultado se traduzir numa mutao. A desaminao de uma citosina origina um uracilo. Se a base assim alterada no for reparada, numa replicao posterior ela vai emparelhar com uma adenina, originando a substituio de um C por um G. Note-se que se o nucletido onde ocorreu a desaminao possuir uma 5-metil-citosina, a base desaminada uma 5-metiluracilo, ou seja timina, a qual no reconhecida pela maquinaria de recombinao, resultando numa mutao no reparvel. Por este motivo as 5-metil-uracilo so hot spots de recombinao. Uma forma menos frequente de mutao espontnea so os danos oxidativos. Espcies de oxignio altamente reactivas como os radicais superxido (O 2 ), perxido de hidrognio (H2 O2 ) e o seu derivado radical hidrxilo (OH) so produtos secundrios do metabolismo aerbico, e podem causar danos oxidativos 1.29 Desaminao Figura no DNA ou seus percursores. Por exemplo a 7-hydrodeoxiguanosina ou 8-oxodG de bases nucleotdicas. (GO) frequentemente emparelha com adenina, resultando num elevado nmero de mutaes GT. 1.48

A recombinao homloga geral no envolve nenhuma especificidade em termos de sequncia do DNA, para alm de se verificar apenas entre molculas de DNA homlogo. Esta recombinao envolve a formao de uma estrutura em que uma molcula de DNA (dupla hlice) emparelha parcialmente com outras

Figura 1.30 Formao do 8-oxodG (GO)

1.1.2.4.3

Recombinao gentica

1.1.2.4.3.1 Recombinao por crossing-over

O crossing-over um mecanismo normal de troca de material gentico entre dois cromossomas homlogos, durante a meiose. Trata-se de um fenmeno complexo em que habitualmente conseguida uma extraordinria preciso, mas de onde podem surgir mutaes quando algo de errado acontece. Existem hoje vrios modelos de recombinao por crossing-over: Recombinao homloga Geral

Figura 1.31 - Modelo de Holiday para a recombinao homloga homloga, formando uma estrutura em quiasma. Note-se que de cada cromossoma, apenas um dos dois cromatdeos (ou uma das duas molculas de DNA de cadeia dupla) toma parte na recombinao. O local de corte e juno ocorre ento no centro do quiasma, resultando dois cromossomas hibridos, mas intactos em termos do seu contedo gentico. O modelo mais plausvel para explicar os passos necessrios para a recombinao foi apresentado por Robin Holliday (fig.1.31) para explicar o fenmeno de converso gnica. Como se pode ver na fig. 1.31, o modelo de Holliday prev que num dos passo iniciais se verifique um corte por uma endonuclease numa das cadeias de cada molcula de DNA, a que se segue a troca de extremidades de uma das 1.50

1.49

cadeias de cada dupla hlice. As cadeias so ento ligadas pela ligase formando-se cadeias hbridas. A este passo segue-se a migrao do ponto de troca, terminando o processo com a resoluo, a qual pode ocorrer por um de dois mecanismos (Fig. 1.31): 1) cortando e ligando mantendo as cadeias originais no resto do DNA ou; 2) cortando e ligando as cadeias novas, efectivamente trocando todo o material cromossmico deste o ponto de cross-over at ao telmero. Este modelo, se bem que explique os resultados obtidos com fungos, no permite explicar todas as observaes efectuadas com leveduras, o que levou Meselson & Radding a propor um mecanismo diferente. Este mecanismo, parte no de um corte de uma cadeia em cada molcula de DNA, mas apenas numa delas, seguindo-se a polimerizao a partir de um dos terminais. Esta polimerizao provoca o desemparelhamento de parte da cadeia em sntese, originando uma molcula de DNA parcialmente de cadeia simples, a qual pode ento substituir a sua homloga no outro cromossoma. Os ltimos passos neste modelo consistem na ligao das cadeias com terminais, seguida da migrao do ponto de juno, e resoluo horizontal ou vertical. Note-se que este modelo explica a formao de produtos no passveis de serem produzidos pelo modelo de Holliday, como o caso de cromossomas irmos que numa diviso possuem trocas cromossmicas desiguais entre si. Um outro tipo de implicao deste modelo a possibilidade de ocorrncia de converso de cromatdeos e de converso de meios-cromatdeos. Estes fenmenos ocorrem quando se formam cromatdeos com cadeias de DNA no homlogas, isto quando, por crossing-over, o produto final uma molcula de DNA com cadeias pontualmente no emparelhadas (locais G:T, G:A, C:T, C:A). Quando isto sucede, os mecanismos de correco do DNA podem corrigir o mal-emparelhamento, do que resulta uma molcula de DNA convertida (converso de cromatdeos), ou igual molcula inicial. Pode ainda no ter ocorrido correco, e a molcula de DNA possuir o desemparelhamento local (converso de meio-cromatdeo). Assim se obtm as propores 1.51

menos frequentes, e no iguais no nmero de cromossomas resultantes de um crossing-over.

1.1.2.4.3.2 Recombinao somtica

Trata-se de um processo enzimtico complexo e altamente regulado, que permite a uma clula T ou B adquirir um gene especfico para o TCR ou para uma imunoglobulina respectivamente. O mecanismo de recombinao (ou rearranjo) somtica (descrito em pormenor na seco 2.1) habitualmente restrito s clulas T e B, e apenas aos genes do TCR e Ig. No entanto, a existncia de sequncias de recombinao ditas crpticas (sequncias de recombinao imperfeitas) pode originar a que em casos raros, nestas clulas, os genes do TCR ou Ig sejam refranjamos indevidamente com outros loci genticos, do que resulta uma translocao intra ou intercromossmica com perturbao do programa gentico. O programa gentico da clula em que ocorrem estas anomalias pode ser perturbado de uma de duas formas: 1) a formao de uma protena quimera pode desregular a funo dos genes em questo; 2) a colocao de um gene habitualmente silencioso nos linfcitos debaixo da aco do enhancer do TCR ou das Ig, faz com que este seja expresso de forma permanente. Exemplos de anomalias destes tipos, e suas consequncias clnicas sero apresentadas na seco 4.2.
1.1.2.4.4 Mutaes mediadas por elementos de transposio

Os elementos de transposio so elementos genticos com a propriedade de serem capazes de se mobilizarem, e moveremse para outro local do genoma, ou de criarem cpias de si prprios noutro local do 1.52

Figura 1.32 Elemento de transposio simples ou sequncia de insero (IS do ingls insertion sequences).

genoma. Este conceito, criado por resultados experimentais produzidos por Marcus Rhoades e Barbara McClintock em milho, foram inicialmente encarados com grande cepticismo. Sabe-se no entanto hoje que estes elementos so bastante representados em todo o mundo biolgico, dos Procariotas aos Eucariotas superiores. As sequncias de insero (fig.1.32) so os elementos de transposio mais simples, sendo constitudos por sequncias de nucletidos que se podem agrupar em famlias, de acordo com a sua sequncia. Assim, a IS1 foi historicamente a primeira a ser descrita, possuindo cerca de 800bp, mas muitas outras foram entretanto descritas. Uma das caractersticas das IS a presena de uma pequena sequncia que aparece invertida em cada uma das extremidades (IR do ingls inverted repeats). Os inverted repeats possuem entre 16 nucletidos e algumas dezenas, sendo o seu comprimento e sequncia especfico de cada IS.

Figura 1.33 caractersticas de alguns transposons e consequncias da sua insero Um transposon (Tn1, Tn2, etc.) um elemento de transposio mais complexo, contendo dois IS separados por uma sequncia de DNA que pode conter um ou mais genes. Os dois IS nas extremidades so idnticos, e podem estar na mesma orientao, ou em orientaes invertidas. Se estiverem na mesma orientao os IR presentes so os IR de cada um dos IS. Se estiverem em orientaes invertidas, todo o IS funciona como um IR. Os transposons herdam dos IS que os constituem a capacidade de se deslocarem no genoma, mas com uma habilidade extra que a de transportarem consigo o(s) gene(s) que os constituem. Na verdade, em bactrias, este o mecanismo que muitas vezes se encontra por detrs da aquisio de resistncia a antibiticos num nico plasmdeo.

1.53

1.54

Figura 1.34 Os transposons so elementos de transposio mais complexos. So constitudos por uma sequncia central contendo genes ou marcadores, e sequncias laterais que podem ser repeties directas ou invertidas de IS. Os mecanismos de transposio podem ser conservativos ou replicativos. No primeiro ocorre a deslocao do elemento de transposio de um local para outro, sem que o numero de elementos tenha variado. No segundo caso, deixada uma cpia do elemento de transposio no local original, isto o elemento de transposio replicado para um novo local.

Figura 1.35 Mecanismo de Figura 1.36 Mecanismo de transposio replicativa transposio conservativa

O mecanismo de transposio replicativa catalizado por uma transposase, e envolve um intermedirio que possui todo o genoma do plasmdeo dador integrado no genoma do plasmdeo receptor, possuindo este intermedirio duas cpias do elemento de transposio (uma em cada extremidade do genoma dador). Em seguida, ocorre como que um cross-over (mediado Figura 1.37 Os transposons podem pela sequncia do elemento ser excisados por recombinao de transposio), que resolvida pela homloga entre os direct repeats, depois transposase ( a qual pode ou deixando uma cpia dos repeats no no ser codificada nos local de insero elementos de transposio, pelo que a sua aco efectuada em trans ou cis respectivamente). Uma outra consequncia da transposio a ocorrncia de uma duplicao do DNA receptor em cada extremidade da insero. Esta duplicao resulta do facto de o corte em cada cadeia do DNA receptor ser efectuado em locais diferentes, e de a sequncia de DNA de cadeia simples ser depois resolvida pela polimerase.

1.55

1.56

A presena de elementos de transposio origina uma alta frequncia de deleces na sua vizinhana. Estas deleces ocorrem como eventos de transposio aberrantes e podem incluir ou no parte do elemento de transposio. A prpria mobilidade dos elementos de transposio pode ser causa de mutaes, j que quando um IS se posiciona no meio de um gene, produz uma interrupo deste. Se altera a sequncia codificante, ou a separa do promotor, o resultado pode ser um gene no funcional, com funcionalidade alterada, ou com baixa ou nula expresso. Os elementos de transposio acima descritos, so relativamente simples e pequenos, existindo nos procariotas. Nos Eucariotas foram tambm descritos elementos de transposio como os Ty (levedura), os Copia like elements (drosofila), os FB elements (drosofila), os P elements (drosofila), e os retrovrus. Os Ty elements possuem uma sequncia altamente varivel, mas Figura 1.38 Elementos de transposio dos terminada por uma eucariotas e suas caractersticas sequncia repetida (a sequncia ), a qual 1.57

tambm varivel de elemento para elemento. Os Ty podem ter vrios Kb de comprimento, e as sequncias cerca de 300bp. Uma particularidade das sequncias que no se constituem em repeties invertidas, mas repeties directas. Cerca de 10% do genoma da drosofila composto por famlias de elementos de transposio disseminados, e que se movem como elementos discretos no genoma. Na drosofila foram caracterizados 3 tipos de elementos de transposio distintos: (Copia like, Fold Back ou FB e os P elements). Os Copia like so compostos por 7 famlias diferentes, variando em tamanho de 5 a 8.5Kb. Membros de cada famlia so representados com 10-100 elementos no genoma da drosofila. Cada elemento possui uma repetio directa longa, e uma repetio invertida imperfeita e curta, sendo estruturalmente semelhante ao Ty da levedura. Os elementos FB (Fold Back) variam em tamanho de algumas centenas de pares de bases a alguns Kb. Possuem entre si sequncias semelhantes mas no iguais. Possuem terminais longos em repeties invertidas. Por vezes todo o elemento constitudo pelas repeties invertidas, com excepo de uma pequena sequncia entre estas. O seu nome deriva do facto de em virtude de possurem estas repeties to longas estes elementos poderem hibridizar consigo prprios, como que dobrando-se sobre si mesmos. As propriedades observadas em elementos FB indicam que estes podem excisar-se a si prprios do genoma, provocando rearranjos cromossmicos com elevada frequncia. Os elementos P variam em tamanho de 0.5 a 2.9 Kb (os elementos mais pequenos derivam de deleces parciais num elemento P completo), tendo sempre uma sequncia repetida invertida perfeita com 31 bp nas suas extremidades. Na regio central dos elementos P 1.58

podem existir at 3 open reading frames, sugerindo que os elementos completos codificam para trs protenas. Uma propriedade surpreendente dos elementos P que se uma fmea sem elementos P for cruzada com um macho com P+, a progenia apresenta mutagnese por insero de elementos P (isto os elementos P apresentam-se activos). Em contraponto, se a fmea for P+ e o macho P-, a progenia no apresenta mutagnese por insero os elementos P. O modelo correntemente aceite para explicar as propriedades dos elementos P baseia-se na existncia no interior do elemento de uma transposase e de produtos repressores dos elementos P. Se a fmea possuir elementos P, ento o vulo possui protenas repressoras dos elementos P, pelo que no ocorre transposio. Se no entanto a fmea no possuir estes elementos, os elementos P do macho vo estar activos, inserindo-se no genoma, do que resulta mutagnese por inactivao de genes. Os provrus (DNA de cadeia dupla inserida no genoma do hospedeiro) dos retrovrus podem ser considerados elementos de transposio j que podem efectivamente transportar-se de um lugar para outro no genoma da clula alvo. Com efeito, o genoma dos retrovrus tem algumas semelhanas com os elementos de transposio habituais. Em particular possuem um LTR (long terminal repeat) em cada extremidade semelhantes aos observados nos elementos Ty1 da drosofila. A insero dos retrovrus, tal como a dos elementos de transposio resulta na duplicao da zona de DNA onde se inserem. Uma outra forma de descrever esta similaridade entre os retrovrus e os elementos de transposio como os Ty1 e os copia-like a de dizer que estes apresentam sequncias que indicam serem reminiscncias de retrovrus. Esta forma de ver o problema recebeu suporte experimental de experincias efectuadas por Jef Boeke and Gerald 1.59

Fink, demonstrando a existncia de um intermedirio de RNA na insero destas sequncias.

Figura 1.39 Os retrotransposons e os retrovrus possuem semelhanas na forma de se integrar no genoma celular. Os elementos de transposio que utilizam este intermedirio de RNA (ex. Ty1 e copia-like) so denominados retrotransposons, e so frequentes entre os eucariotas, sendo geralmente divididos em duas classes: Os retrotransposons virais (como os Ty1 e os copia-like) e os retrotransposons no virais (os mais frequentes entre os mamferos). Exemplos de retrotransposons no virais entre os mamferos so os LINES (Long interspersed elements; 1-5Kb) e os SINES (short interspersed elements; ex. as sequncias alu).
1.1.2.5 Mecanismos de reparao do DNA

As clulas eucariticas desenvolveram uma srie de mecanismos integrados de reparao de danos no DNA, os quais podem ser 1.60

essencialmente de trs tipos: mecanismos excisativos, no excisativos e mecanismos ps replicativos.

1.1.2.5.1 Mecanismos no excisativos

Evitar erros antes de surgirem: alguns sistemas enzimticos neutralizam compostos potencialmente perigosos antes de poderem reagir com o DNA. Um bom exemplo o mecanismo de eliminao de radicais superxido, catalizado pela superxido dismutase e pela catalase (2 HO H2 O2 ; 2 H2 O2 H2 O + O 2 ). Um outro exemplo o do sistema catalizado pela protena do gene muT, o qual previne a incorporao do 8-oxodT no DNA hidrolizando o trifosfato de 8-oxodT em monofosfato. Reverso directa do dano: A forma mais directa de reverter uma leso efectuar o seu processo inverso, restaurando assim a sequncia alterada. No entanto, a reverso directa nem sempre possvel, j que algumas reaces so no essencial irreversveis. Um dos casos em que a reverso possvel o da fotodimerizao por luz UV. O fotodmero de ciclobutano pirimidinico pode ser reparado por uma fotoliase (foi encontrada em eucariotas inferiores e bactrias, mas no em humanos). Figura 1.41 dmero de ciclobutano pirimidinico formado por aco da luz ultravioleta. Esta enzima liga-se ao dmero, catalisando a sua ciso em monmeros, na presena de luz visvel de certos comprimentos de onda. Um outro mecanismo de reverso directa catalisado pelas alquiltransferases. Estas enzimas removem certos grupos alquilo adicionados s guaninas na posio O-6, por certos agentes qumicos. Note-se no entanto que este um processo enzimtico em que as alquiltransferases ficam inactivadas, do que pode resultar uma saturao deste mecanismo em situaes de grande alquilao do DNA.

Figura 1.40 Esquema de aco da fotoliase que por aco da luz reverte a formao dos anis de ciclobutano pirimidinico formados por aco da luz ultravioleta. 1.61 1.62

1.1.2.5.2

Mecanismos excisativos

casos, as clulas desenvolveram mecanismos especficos de deteco e reparao dos danos: Reparao de DNA Glicosilase (base excision repair): As DNA glicosilase no clivam as pontes fosfodiester, mas antes as ligaes N-glicosilicas (base-pentose), gerando um nucletido apurnico ou apirimidinico (locais AP). Esta leso posteriormente reparada pelo mecanismo de reparao endonucleolitica AP (ver abaixo). Existem numerosas glicosilases, como por exemplo Uracil-DNA glicosilase, a hipoxantina glicosilase (a hipoxantina o resultado de uma desaminao da adenina), 3-metiladenina glicosilase, 3metilguanina glicosilase, a 7 metilguanina glicosilase, etc. Reparao endonucleolitica endonucleases que atacam os locais purnicos e pirimidnicos (AP endonucleases). A aco destas enzimas vital j que como vimos a despurinao espontnea muito elevada. Estas enzimas produzem quebras das ligaes fosfodiester junto ao nucletido apurnico. A este corte endonucleoltico segue-se um corte exonucleoltico, o preenchimento do vazio pela polimerase, e finalmente o restabelecimento de continuidade pela ligase. de AP: Todas as clulas tm

Mecanismo de reparao geral por exciso: Tambm denominado nucleotide excision repair, envolve a quebra da ligao fosfodiester de ambos os lados da leso, mas apenas na cadeia nucleotdica lesada. A sequncia interrompida da resultante reparada por uma polimerase e uma ligase, tendo como padro a cadeia nucleotdica complementar. Este mecanismo no Homem bastante complexo, envolvendo Figura 1.42 Mecanismo geral de pelo menos 17 protenas reparao por exciso. Mecanismo de reparao ligado transcrio: A transcrio e reparao esto tambm ligadas, o que o demonstra o envolvimento de TFIIH (um factor de transcrio) na reparao, bem como o facto de nos eucariotas e nos procariotas, a cadeia transcrita , nos genes activos, preferencialmente reparada, em desfavor da cadeia complementar. Mecanismo excisativo especfico: Algumas leses provocam danos geomtricamente mais subtis, pelo que a sua deteco mais difcil (no causam grandes distores no DNA). Para estes 1.63

Figura 1.43 Mecanismo de reparao endonucleolitica de locais apurnicos

1.64

O sistema GO: Para prevenir leses mediadas pela 8 -oxodG, duas glicosilases codificadas pelos genes mutM e mutY trabalham em conjunto com o produto do gene mutT j referido. Quando surge um dano oxidativo produz leses tipo GO, a glicosilase codificada pela mutT remove a leso. No entanto, por vezes as leses passam despercebidas, emparelhando com adenina. Neste caso, o produto do gene mutY remove a adenina levando sua substituio pela citosina correcta por reparao de sntese, a que se segue a remoo do produto GO pelo produto mutM.
Mecanismos ps-replicativos

1.1.2.5.3

Alguns mecanismos de reparao so capazes de reconhecer os erros no DNA, mesmo aps ou durante a sua replicao: Reparao de Mismatches: Este mecanismo detecta a existncia de bases mal emparelhadas ( mismatches) durante a replicao. Este processo envolve trs passos essenciais: 1) a deteco da existncia de um par de bases mal emparelhado; 2) o reconhecimento de que a base mal incorporada tem que ser a que existe na cadeia a ser sintetizada; 3) excisar a base incorrecta e reparar o corte. Assim, o passo critico o reconhecimento da cadeia sintetizada de novo, o que conseguido recorrendo ao atraso na metilao relativamente sntese de DNA. Assim, a cadeia de DNA no metilada reconhecida como sendo a que deve ser processada. Reparao por recombinao: O gene recA envolvido no

bypass SOS est tambm envolvido na reparao por recombinao. Neste mecanismo, o sistema de replicao pra junto a um dano, continuando depois Figura 1.45 Mecanismo de reparao da leso, deixando SOS. este mecanismo apesar de permitir uma quebra de a continuao da replicao, ao alguns nucletidos introduzir aleatoriamente nucletidos, na cadeia sintetizada pode produzir mutaes. de novo. Neste mecanismo de reparao, o DNA da zona de quebra cortado da outra molcula de DNA homloga, sendo esta depois reparada por sntese normal. Assim, este mecanismo de reparao difere do SOS, j que neste so adicionados nucletidos de forma aleatria na zona de quebra (efectivamente criando mutaes), enquanto na reparao por recombinao no so efectuadas nenhumas alteraes ao programa gentico da clula. 1.2 O ciclo celular 1.2.1 Diviso celular e anomalias genticas De acordo com a sua actividade reprodutora, a clula pode encontrase em interfase (a fase entre duas divises celulares), ou em fase M (a fase em que se encontra em mitose). A maior parte do ciclo celular passa-se portanto em interfase. Durante perodos especficos da interfase a clula integra estmulos e toma decises centrais para a entrada na fase de mitose. De acordo com a actividade especfica que se efectua, a interfase subdivide-se em fases, com actividades e papeis especficos na diviso celular, e que culminam na mitose: 1.66

Figura 1.44 Reparao por recombinao 1.65

Fase G1 (de GAP 1; 6 a 12 horas). No h qualquer sntese de cidos nucleicos, mas uma intensa actividade de sntese proteica prepara a maquinaria necessria s fases subsequentes. A deciso de avanar para a duplicao do DNA ocorre durante a fase G1 (ponto de restrio).

Figura 1.46 Fases do ciclo celular

Fase S(6 a 8 horas). Inicia-se com a replicao do DNA, e continua at que todo o DNA se encontra duplicado (contedo em DNA 4n). Fase G2 (de GAP 2; 3 a 4 horas). Decorre entre o fim da fase S e o incio da mitose, durante o qual a clula organiza os seus 2 conjuntos completos de cromossomas diplides. No final desta fase ocorre a deciso de avanar para a mitose Durante a mitose (1 hora), um conjunto diplide de cromossomas segregado para cada ncleo. Apenas nesta fase, os cromossomas so observveis como entidades discretas, sendo a organizao celular destruda, e organizado o fuso acromtico entre os dois futuros ncleos. Toda a actividade sinttica pra durante a mitose. Fase G0. Uma fase especfica de clulas maduras, que pararam a diviso celular. No entanto alguns tipos de clulas, podem ser estimulados a deixar a fase G0 e entrar em G1.

1.2.2 Ciclinas e CDK Durante todo o ciclo celular, existem pontos de deciso, os quais verificam se a clula se encontra j preparada para proceder para a fase seguinte. Alguns dos mais importantes so: O DNA j se encontra todo duplicado, e apenas duplicado? Existem erros na duplicao do DNA? A massa celular est j duplicada? Estes checkpoints existem sob a forma de factores activadores e inibidores. Destes, alguns encontram-se j identificados enquanto que a existncia de outros se encontra apenas deduzida do comportamento observado em fuses de clulas em fases diferentes do ciclo celular. Nomeadamente o factor que determina a deciso de passar o ponto de restrio totalmente desconhecido, enquanto que o factor que determina a entrada na fase S se encontra identificado como sendo uma protena cinase, relacionada com a cinase que inicia a mitose. Esta ltima (MPF M phase promoting Factor ou M phase Kinase), a primeira a ser identificada a mais bem estudada, um dmero composto por duas subunidades: uma a subunidade cataltica (p34) activada no inicio da fase S, a outra (p45) uma ciclina (acumula-se por sntese contnua durante a interfase), sendo destruda durante a mitose, o que responsvel pela inactivao da cinase da fase M, o que sinaliza a sada da mitose. O estudo cristalogrfico do dmero de MPF revelou que a ligao da ciclina provoca uma alterao conformacional na p34, a qual essencial para a formao do centro cataltico. Uma MPF tem apenas um tipo de p34, mas pode conter uma de vrios tipos de ciclinas. Basicamente dois tipos de ciclinas pouco relacionadas(A e B) podem fazer parte da MPF. A similaridade entre estas duas ciclinas centra-se numa estrutura com cerca de 150 aminocidos chamada a cyclin box. Em mamferos existem ainda dois tipos de ciclinas B (B1 e B2). A p34 encontra-se em nveis constantes ao longo de todo o ciclo celular, e como a sntese de ciclina constante ao longo de toda a fase G1, a sua presena no constitui o sinal de activao da MPF. Na 1.68

1.67

realidade, o dmero acumula-se numa forma inactiva, sendo a modificao da p34 que constitui o evento activador do dmero. A activao da p34 efectuada por fosforilao/desfosforilao, j que para esta se encontrar activa necessria a presena de grupos fosfatos em alguns resduos e a sua ausncia noutros. Como a actividade cinase da MPF auto-cataltica, basta a activao de uma pequena poro, para que rapidamente toda a MPF disponvel seja activada. Como a MPF no uma fosfatase, e necessrio actividade de cinase e fosfatase para a activao da MPF, esta deve activar directamente a fosfatase que a activa, criando um circulo autocataltico completo. O evento inactivador constitudo pela destruio proteoltica da ciclina, a qual ocorre durante a fase M. Na realidade, o controlo da diviso celular constitudo por uma intricada rede de reaces de cinase e fosfatase, que desencadeiam a activao/inactivao de uma srie de factores, permitindo o desencadear temporalmente organizado das vrias fases do ciclo celular. Toda esta srie de reaces culminam na activao da MPF com a concomitante entrada na fase M. Dois modelos gerais podem explicar a actividade da MPF: 1) Pode ser um regulador central que fosforila protenas alvo que por sua vez actuam para regular outras actividades, i.e., pode tratar-se de uma reaco clssica em cascata; 2)pode ser um regulador central, que activa ele prprio uma serie de substractos cruciais indispensveis para realizar trabalhos regulatrios ou reorganizacionais envolvidos no ciclo celular. Os substratos da MPF tm em comum uma estrutura proteica constituda por Ser-Pro flanqueada por resduos bsicos (habitualmente na forma Ser-Pro-X-Lys). Substratos potenciais incluem a histona H1 (possivelmente necessria para condensar os cromossomas), lamininas (possivelmente necessrias para desorganizar o envelope nuclear), nucleolina (possivelmente envolvida na paragem da actividade ribossomal), bem como outras 1.69

protenas estruturais e enzimticas. Dos modelos acima propostos, o mais provvel que a MPF actue directamente em todos (ou na maioria) destes substractos. A protena p34 foi pela primeira vez identificada no Xenopus, que pela dimenso do seu ovo (1mm de dimetro) constitui um bom modelo para purificar protenas envolvidas no ciclo celular. Posteriormente descobriu-se que o homlogo na levedura eram protenas baptizadas como cdc2 (S.Pombe) e CDC28 (S.Cerevisae). Dado o grande paralelo entre as protenas de levedura e de mamferos, o homlogo animal habitualmente designado por cdc2 ( o nome do exemplo mais bem caracterizado em levedura). Em todas as espcies, a protena que emparelha com a cdc2/p34 para formar o dmero activo uma ciclina, muito embora o nvel de homologia entre espcies nas ciclinas seja bem menor que na subunidade cataltica (p34). Na levedura o cdc2 um regulador central quer da deciso de prosseguir de G1 para S quer de prosseguir de G2 para M. Em cada fase, cdc2 tem um par diferente no dmero: na mitose cdc2 emparelha com cdc13 formando uma cinase da fase M semelhante ao p34ciclina B das clulas animais. Durante a fase G1, a forma activa de cdc2 tem um par diferente chamado cig2, e igualmente semelhante a ciclina-B. Note-se que as 2 formas de dmeros cdc2 podem coexistir na levedura, mas so diferentemente reguladas. Assim, a fase do ciclo celular pode tambm ser definida consoante o tipo de dmero activo em cada momento. Figura 1.47 via de activao da MPF por fosforilao da dmero O produto de cdc25 necessrio para desfosforilar a cdc2 doY15 e T161 de Cdc2 respectivamente cdc2/cdc13. Apesar de no possuir um domnio clssico de fosfatase, mediada pela Wee1 e CAK, e pela a cdc25 efectivamente uma fosfatase, que possivelmente tem como aco da Cdc25 seu alvo a tyr-15 da cdc2. Assim provavelmente responsvel pela desfosforilao que constitui o evento chave na activao da M phase cinase. Como mutantes de cdc25 no param a mitose se a duplicao 1.70

de DNA no tiver sido conseguida, esta fosfatase importante para assegurar que a fase S se completa antes de se iniciar a fase M. Mutantes do gene wee1 permitem que a fase M se inicie sem que o crescimento necessrio tenha ocorrido. Assim, este gene normalmente impede o incio da fase M, se a massa celular crtica no tiver sido atingida. Wee1 codifica para uma cinase pouco usual. Pode fosforilar em serina/treoninas e tirosinas. Inibe cdc2 por fosforilao em tyr-15. Um outro gene mik1 tem efeito semelhante. Este controlo da cdc2 na transio G2/M parece ter sido preservado ao longo da evoluo, j que genes homlogos so encontrados em vrios tipos de leveduras, em anfbios e em mamferos. A activao da transio G1/S requer activao da cdc2/cig2 (em S. Pombe), mas tambm a inactivao da cdc2/cdc13 indispensvel. Com efeito, mutantes de cdc13 no s no entram em fase M, como prosseguem por vrios ciclos da fase S, sugerindo que a cdc2/cdc13 um inibidor da fase S. Assim, activao de cdc2/cd13 durante a fase G2 impede a continuao da fase S, e estimula o incio da fase M. A destruio da cd13 no fim da fase M pra a fase M e permite um novo ciclo de fase S antes de se iniciar nova diviso. O funcionamento

deste ciclo depende, provavelmente de cdc18. Esta protena activada aps a passagem do ponto START, sendo necessria para entrar na fase S. Para cdc18 ser activa necessrio que cdc2/cdc13 esteja inactiva. A activao deste dmero na fase M inactiva a cdc18, impedindo novo ciclo de sntese de DNA. A actividade de cdc2/cdc13 dependente do factor rum1. Sem este factor, as clulas entram em mitose prematuramente. Assim, rum1 deve ser um inibidor de cdc2/cdc13 (M phase kinase) expresso entre G1 e G2 mantendo a M phase kinase inactiva ( o que particularmente importante em G1 antes da fosforilao em tyr-15), e reprimindo o nvel de cdc13. Desta imagem, dois conceitos gerais emergem para o controlo da diviso celular: 1) a presena de loops de feedback de controlo e; 2) a presena de duplicidade de efeitos, em que um factor activa a fase seguinte e reprime a anterior. A passagem do ponto START est tambm dependente de cdc2. No entanto, a ciclina que se associa a cdc2 diferente quando a cinase controla o ponto start e a transio G2M. Os mecanismos envolvidos na regulao do ciclo celular em leveduras e em animais so semelhantes, ainda que o nmero de subunidades presentes em animais seja maior, havendo subunidades especificas para o controlo das transies G1/S e G2/M. A comparao das subunidades envolvidas nos diferentes seres estudados esto descritas na tabela 1.4. Como se pode ver, nos animais, a cinase dependente de ciclinas que regula a transio G2/M nica, semelhana do que se passa com as leveduras. No entanto, existem vrias ciclinas que com ela podem interactuar. O mesmo no se passa na transio G1/S, a qual regulada por vrias cinases e vrias ciclinas.

1.71 Figura 1.48 Interveno das vrias ciclinas em diferentes fases do ciclo celular.

1.72

Tabela 1.4

- comparao das subunidades envolvidas nas vrias transies do

ciclo celular em diferentes organismos Transio G1/S G2/M subunidade subunidade subunidade subunidade cataltica reguladora cataltica reguladora cdc2 cig 1,2 cdc2 cdc13 cdc28 CLN1-3 cdc28 CLB1-4 cdk2(p33), ciclinas A, D1, p34(cdc2) ciclinas A, B1, cdk4 D2, D3, E B2

S.Pombe S.cerevisae Mamferos

Cdk = cyclin dependent kinases

A mitose ocorre como um processo temporal controlado. A mitose, como vimos, iniciada pela activao da MPK. O progresso da mitose requer a degradao de ciclinas e outras protenas. Por exemplo a separao dos cromossomas na anafase requer a actividade proteoltica, mas no directamente de ciclinas. Existem pelo menos 3 alvos proteolticos: o primeiro evento a degradao da ciclina A na metafase, seguindo-se a degradao de 2 alvos na anafase. Uma protena desconhecida tem que ser degradada para a separao das cromatdeas irms e a degradao de ciclina B necessria para a inactivao da MPK. No final da mitose as fosforilaes efectuadas pela MPK tm que ser revertidas. A sntese de ciclinas D activada pela aco de factores de crescimento. Estas ciclinas tm uma semi-vida muito curta, o que permite clula responder a factores externos e sua remoo. Estas ciclinas esto provavelmente envolvidas na reentrada na diviso celular de clulas em G0. O produto do gene de supresso tumoral RB (gene do retinoblastoma) um substracto dos complexos cdk-ciclinas D, e exerce o seu efeito durante a fase G1 que precede o ponto de restrio. O produto deste gene, na ausncia de fosforilao liga-se ao regulador gentico E2F, actuando como supressor de alguns genes, bloqueando a transio G1/S. Quando por aco de cdk4,6-ciclina D1,2,3 fosforilado, liberta a E2F, a qual passa a actuar como um activador gentico, promovendo a entrada na fase S. RB o alvo de vrias vias que inibem o crescimento celular, pelo que pode ser uma forma importante de vrios sinais manterem a clula em G1 ou G0. Alguns destes sinais (incluindo o TGF) actuam atravs de inibidores de cinases cdk (chamadas ckis). Exemplos de ckis so a p15/p16 (ink4), p21(c1p1/wAF1) e p27(kip1). A importncia das ciks realada pelo facto de p16 ser tambm um gene de supresso tumural, o que indica que a p16 e possivelmente todas as outras ckis so necessrias para parar o crescimento celular. Na verdade, parece que a via das ciks at 1.74

Uma outra diferena tem a ver com as ciclinas C e E, as quais acumulam durante a fase G1 como as restantes, mas no so destrudas na fase M. Assim, como vimos, nos animais existem essencialmente 2 tipos de cinases : a cdk2 e a cdc2, respectivamente responsveis pela transio G1/S e G2/M. Ainda que se trate de componentes diferentes, as estruturas regulatrias conhecidas so similares em ambas, pelo que se deduz que so similarmente regulados. Assim, a sntese de ciclinas na fase G1, vai progressivamente aumentando a sua concentrao, at que se chega a um ponto em que se inicia a formao de dmeros. No entanto estes no so ainda activos, sendo necessrias reaces de fosforilao nos resduos 15 e 161. A primeira fosforilao ocorre por aco da Wee1 cinase, enquanto a segunda catalisada pela CAK (cdc2-activating kinase). O dmero activo promove ento a entrada em mitose, activando concomitantemente por fosforilao a fosfatase cdc25. Esta por sua vez promove a remoo do grupo fosfato na tirosina 15 da cdc2, inactivando-a. A ciclina por sua vez alvo de degradao proteoltica, resultando apenas a cdc2 fosforilada na thr161, terminando assim a mitose. No foram identificadas cinases que actuem separadamente em thr-14, em alguns casos a mesma enzima actua na thr-14 e tyr-15. 1.73

RB uma via ventral para o bloqueio do crescimento celular, j que so conhecidos genes de supresso tumoral em todos os seus passos. 1.2.3 Apoptose Durante a vida de um organismo multicelular, algumas clulas morrem num processo natural designado por Apoptose ou morte celular programada. Nos vertebrados, os exemplos mais visveis de apoptose ocorrem no sistema imune e no sistema nervoso. O processo de morte caracterstico, envolvendo compactao celular, fragmentao membranar, condensao da cromatina e fragmentao do DNA. Este processo activo, dependendo do RNA e da sntese proteica. So conhecidas vrias formas de activar a apoptose. Estas envolvem insultos moleculares (retirada de factores de crescimento, tratamento com glucocorticoides, irradiao ), bem como estmulos especficos como os produzidos pelas clulas T citotxicas ou activao de p53. Assim, a apoptose importante na embriognese e conteno do crescimento tecidual, bem como na resposta imune e na conteno de cancro. Foram j descritas vrias mutaes recessivas associadas com o estmulo ou o bloqueio da apoptose. Alguns exemplos so: 1) a lpr no ratinho (esta mutao leva a deficincia em faz) que causa a proliferao excessiva levando a autoimunidade; 2) a gld (generalized lymphoproliferative disease) cuja mutao ocorre no gene que codifica para o receptor de fas. A protena faz um receptor membranar relacionado com o receptor para o TNF. Tanto o faz como o TNF so capazes de estimular a apoptose. Ao nvel da poro transmembranar destes receptores existe uma sequncia de 80 aminocidos essencial para o envio do sinal apopttico, pelo que designado por domnio da morte. Pouco se sabe sobre o mecanismo de sinalizao do receptor faz ou TNF para o interior da clula. Contudo, foram identificadas algumas protenas que interagem com o 1.75

domnio da morte, as quais curiosamente tambm os possuem. Pensa-se assim que este domnio seja importante para promover a dimerizao destas p rotenas. Outros compostos importantes na via da apoptose so a famlia de proteases designada por ICE. O prottipo destas proteases a IL2-converting enzyme: uma protease de cistena que por protelise converte o percursor da IL2 na sua forma activa. O processo de apoptose desencadeado pelas ICE inibido por crmA e pelo bcl-2. Uma outra via appttica desencadeada pelos linfcitos Tc, os quais matam as clulas alvo libertando na sua superfcie grnulos contendo proteases de serina e outras protenas lticas como a perforina, abrindo buracos na superfcie das clulas alvo. As proteases de serina dos grnulos so chamadas granzimas, e na presena de perforina induzem morte por apoptose nas clulas alvo. O bcl-2 inibe a apoptose. Foi originalmente descrito como um protooncogene activado em linfomas por translocao causando a sua hiper-expresso. O bcl-2 tem uma sequncia de ancoragem membranar na zona c-terminal, tendo sido encontrado nas membranas externas de mitocndria, ncleo e retculoendoplasmtico. Um outro gene semelhante ao bcl-2 nos mamferos o gene Bax. O produto do gene Bax pode dimerizar com bcl-2. O dmero bcl-2, bem como o dmero Bax bloqueiam a apoptose, mas o heterodmero (bcl-2/Bax) no o faz. Assim, a susceptibilidade de uma clula apoptose proporcional proporo bcl-2/Bax.

1.76

1.3 Actividade Celular 1.3.1 Componentes dos sistemas de sinalizao Todos os sistemas de comunicao intercelular tm vrios componentes. Tipicamente, uma molcula denominada ligando libertada pela clula sinalizadora. Alguns ligandos so protenas, enquanto outros so pequenas molculas como pptidos, esterides ou vitamina D. O ligando liga-se ao receptor, habitualmente uma

gentica directamente, enquanto outros necessitam de enviar sinais atravs de uma cadeia de transduo, levando o sinal da membrana celular at ao ncleo (fig.1.49). Alguns ligandos, chamados hormonas viajam a grandes distncias na circulao sangunea, antes de interactuarem com a sua clula alvo. Estas molculas podem actuar como sinais mestres para a actividade de rgos diferentes, os quais podem assim responder de forma coordenada. Outros ligandos no actuam distncia, mas apenas nas clulas vizinhas das que os produziram. 1.3.2 Regulao da sinalizao por modulao da conformao proteica Interaces de pequenas molculas com as protenas receptoras podem provocar intensas alteraes conformacionais nestas. Por exemplo, alteraes conformacionais esto na origem da regulao mediada por algumas protenas cinases. A alterao da conformao coloca ou no amino-cidos em posies favorveis fosforilao. Este mecanismo extremamente eficiente, no s porque permite a rpida activao dos sinais, mas tambm porque permite revert-los rpida e facilmente, reciclando os componentes de sinalizao. 1.3.3 A Superfamilia dos receptores das hormonas esterides Um grupo diverso de ligandos, incluindo vrias hormonas esterides, bem como outras pequenas molculas como a hormona tiride e a vitamina D, devido sua estrutura no polar, so capazes de atravessar a membrana citoplasmtica, actuando directamente no interior da clula alvo. Os receptores para estes ligandos chamam-se globalmente a superfamilia dos receptores esterides, e esto estrutural e funcionalmente relacionados. A ligao destes ligandos ao seu receptor, causa uma alterao conformacional, a qual provoca a sua libertao de uma protena sequestradora. Nestas condies, o complexo receptor-ligando desloca-se para o ncleo, onde em 1.78

Figura 1.49 Os sinais podem ser recebidos na membrana celular por um receptor o qual envia o sinal para o interior da clula. Em alguns casos a molcula sinalizadora ela prpria enviada para o citoplasma, enquanto noutros casos o receptor que interage com componentes intracelulares para assegurar a passagem do sinal.

protena, na membrana celular ou no interior da clula alvo. Alguns tipos de complexo ligando-receptor so capazes de alterar a expresso 1.77

conjunto com outros reguladores da transcrio vo activar ou reprimir directamente a expresso gnica, ao ligar-se a sequncias reguladoras chamadas HRE (hormone response elements). Figura 1.50 As hormonas esterides no possuem um receptor membranar, mas um receptor citoplasmtico, j que so capazes de atravessar livremente a membrana plasmtica. 1.3.4 Receptores transmembranares; vias de transduo de sinal A maior parte dos ligandos so molculas demasiado volumosas e/ou com carga, para poderem atravessar a membrana citoplasmtica. Assim, os seus receptores so habitualmente protenas de membrana, as quais medeiam a passagem de um sinal para o interior da clula. Os receptores transmembranares so assim compostos por 3 domnios principais: o extracelular, que se liga ao ligando; o transmembranar, que pode atravessar uma ou mais vezes a membrana; e o citoplasmtico, que medeia a transmisso do sinal. Muitos ligandos so dmeros, podendo assim ligar a mais do que um receptor. Desta forma, os ligandos colocam a poro citoplasmtica de dois receptores fisicamente prximos, activando a via de sinalizao destes receptores (Fig. 1.51). Alguns destes receptores so cinases, tendo por isso a habilidade de fosforilar certos resduos em protenas alvo, enquanto outros so serinas/treoninas cinases, e outros no tm qualquer actividade enzimtica. 1.79

FiguraFigura1.52 Com frequncia a propagao do seus ligandos, o 1.51 Muitos receptores so dimerizados pelos sinal no que activa a zona clula envolve a utilizao de ligar-se a protenas interior da citoplasmtica, a qual pode a) mensageiros cinases ou b) autofosforilar-se activando protenas G secundrios como a) cAMP ou b) a sua capacidade de fosforilar substractos citoplasmticos Um dos mais bem conhecidos exemplos de receptores deste tipo so os receptores tirosina cinase, nomeadamente os receptores para os factores de crescimento. Estes receptores, aps ligao do ligando dimerizam, originando a sua auto-fosforilao (fig. 1.51). Esta por sua vez activa a actividade de cinase, que vai fosforilar outras protenas, iniciando uma cascata transdutora do sinal em que a 1.80

fosforilao causa conformao proteica com consequente activao/inactivao proteica. Eventualmente a cascata de activao leva fosforilao de factores de transcrio, com consequente alterao do estado de activao de um ou mais genes. Mas a autofosforilao no causa apenas a fosforilao de protenas alvo. Tambm a ligao a protenas adaptadoras estimulada pela autofosforilao. Interaces entre o complexo e outras molculas causam a propagao do sinal. (fig. 1.51) Com frequncia a propagao deste sinal envolve protenas G (fig. 1.52). As protenas G so protenas cuja vida um ciclo entre a forma ligada a GDP (o estado inactivo) e a forma ligada a GTP (o estado activo); um exemplo particularmente importante de uma protena G a ras, a qual como veremos est envolvida na carcinognese. A propagao do sinal das RTK leva activao de uma protena que se liga a protenas-G inactivas, alterando a sua conformao, levando-a a ligar-se ao GTP. A protena G assim activada liga-se ento a uma protena cinase citoplasmtica, alterando a sua conformao, activando-a, o que a leva a fosforilar outras protenas, incluindo protenas cinases e factores de transcrio.

Figura 1.53 Sumrio dos vrios tipos de receptores e vias de transduo de sinal.

1.81

1.82

Captulo 2
2 reas de interveno da gentica molecular em Imunologia

2.2

2.1 O Receptor da Clula T (TCR) Ao efectuar a evoluo do sistema imune para funes de reconhecimento especifico, a natureza teve que resolver o problema gigantesco de codificar num genoma limitado, um nmero suficiente de genes capaz de reconhecer todo o mundo exterior e interior do organismo. A soluo encontrada se bem que econmica, bem complexa, como o revela o facto de no ser ainda possvel construir sistemas de recombinao in vitro isentos de clulas. Estes receptores do antignio so de 2 tipos: as imunoglobulinas, produzidas pelos linfcitos B, das quais existem formas solveis e formas membranares, e que reconhecem o antignio na forma nativa; e o receptor da clula T, do qual apenas existem fisiologicamente formas membranares, e que reconhece o antignio depois de processado por uma clula apresentadora do antignio (APC), e apresentado no contexto do MHC da APC. Dos dois tipos de linfcitos, a clula T a responsvel pela resposta imune dita celular. Para tal, estas clulas esto equipadas sua superfcie com um receptor para o antignio (TCR do ingls T -CellReceptor), atravs do qual a clula madura recebe um estimulo de activao quando encontra o antignio para o qual especifica. Este receptor composto por um de dois tipos de heterodimeros ( ou ). So portanto 4 os genes do TCR, dos quais apenas 2 estaro a ser transcritos em cada clula T. Cada um dos genes composto por um mximo de 4 tipos de segmentos (V ou varivel, D ou de diversidade, J ou de juno, C ou constante). Cada um destes segmentos composto por mais que um elemento gnico, dos quais cada clone celular escolher um e apenas um para ser utilizado no TCR que ir expressar. As clulas T diferem assim de todas as restantes clulas do organismo (com excepo dos linfcitos B), pois o contedo gentico da clula madura diferente do de qualquer outra clula que no pertena ao mesmo clone.

2.1.1 Estrutura somtica dos genes do TCR Os genes do TCR, tal como os das imunoglobulinas possuem uma configurao somtica, igual em todas as clulas no linfides. Nos linfcitos, a configurao destes genes alterada no processo denominado recombinao, para dar origem a um gene funcional. Os 4 genes do TCR existem em 3 locus cromossmicos, j que o gene est localizado no interior do gene (Fig. 1). Os locus e possuem 4 classes de segmentos (V,D,J,C), e os locus e apenas 3 (V,J,C). Como se pode ver na fig. 1, no Homem, a organizao bsica dos locus do TCR a dita estendida, em que os vrios tipos de segmentos se organizam separadamente no genoma (V.V. (etc.) .D.D. (etc.) .J.J. (etc.)). No caso do locus , uma variao a esta configurao permite ao gene partilhar segmentos V com o gene (Lewis, 1994). 2.1.2 Mecanismo de rearranjo somtico dos genes do TCR O mecanismo de rearranjo somtico dos genes do TCR no diferente do observado para as imunoglobulinas. Na verdade, foi possvel clonar clulas B com os genes do TCR rearranjado (OConnor et al., 1985), sugerindo que ambos os receptores so substractos do mesmo conjunto de enzimas. O processo de recombinao quer do TCR quer das imunoglobulinas (doravante denominada recombinao V(D)J) depende primariamente de sequncias sinal que flanqueando os segmentos a recombinar constituem todos os elementos necessrios para indicar aos componentes enzimticos onde efectuar a recombinao (Lewis et al., 1985; Akira et al., 1987; Hesse et al., 1987). Estes sinais de juno variam em sequncia, mas seguem de muito perto o consenso heptamero-espaador-nonamero, em que as sequncias consenso do heptamero e do nonmero so respectivamente CACAGTG e ACAAAAACC. O espaador tem uma sequncia muito varivel, mas o seu comprimento tem 12 ou 23 pares de bases (bp)(Max et al., 1979; Sakano et al., 1979,1981; Kurosawa et
2.4

2.3

sinal excisadas sob a forma de DNA circular extracromossmico (Fujimoto et al., 1987; Okazaki et al., 1987). A juno codificante, no ocorre no entanto sempre numa posio fixa. Por um lado a quantidade de material gentico com que cada elemento contribui pode variar em at 10 nucletidos (Max et al, 1979; Sakano et al 1979; Weiggert et al 1980). Por outro lado, resduos extra no includos na configurao germline podem ser includos (Sakano et al., 1981; Lafaille et al., 1989; McCormack et al., 1989). Estes resduos extra podem ser de dois tipos fundamentais: os resduos N (do Ingls Non-germline-regions) e os resduos P (de Palindromicos). Os resduos N tm tipicamente um elevado contedo G/C (Alt et al., 1982; Roth et al., 1989), no ultrapassam os 15 nucletidos, e ocorrem mais frequentemente nas junes codificantes que nas junes de sinal (Lewis, 1994). Estes resduos so adicionados pela enzima TdT (do Ingls Terminal deoxynucleotidil transferase) como o demonstram os modelos de animais transgnicos com inactivao do gene desta enzima (Gilfillan et al, 1993; Komori et al., 1993). No entanto, o facto de estes modelos resultarem em uma muito grande, mas no completa abolio da frequncia de resduos N parece indicar a existncia de um mecanismo alternativo, independente da expresso de TdT(Lewis, 1994). A regulao de TdT na ontogenia, origina a menor frequncia de resduos N em animais fetais ou neonatais, possivelmente para permitir o domnio de alguns receptores com especificidades necessrias numa fase mais precoce da ontogenia (Gu et al., 1990; Feeney, 1991, 1992). Os resduos P parecem ter origem numa molcula intermediria tipo hairpin gerada (aps o corte na sequncia sinal) pela ligao covalente das duas cadeias da dupla hlice do DNA, a qual seria posteriormente clivada num ponto diferente do inicial (Fig. 3.; Lieber, 1991; Roth et al., 1992).

al., 1981). A regra base que dita a orientao dos rearranjos a de que apenas podem rearranjar elementos com espaadores diferentes, isto um elemento com uma sequncia sinal composta por um espaador de 12 bp apenas rearranja com uma outra cujo espaador for de 23 bp e vice-versa. Desta forma rearranjos envolvendo elementos do mesmo grupo (V com V; J com J) so impedidos. O mecanismo molecular que origina esta restrio no entanto ainda hoje completamente desconhecido (Lewis, 1994). Quando dois segmentos gnicos se envolvem no processo de recombinao, feito um corte na fronteira entre a sequncia sinal e a sequncia codificante, em cada um. As quatro extremidades assim formadas so ento ligadas formando uma juno codificante, e uma juno sinal (fig. 2). Devido configurao cromossmica, as sequncias codificantes so retidas no genomas, sendo as Junes
2.5

2.6

O agente ou agentes de recombinao permanecem ainda largamente desconhecidos, ou incompletamente caracterizados e purificados (Lewis, 1994). A tendncia actual no entanto no sentido de aceitar que a recombinao V(D)J se realiza no por um factor, mas por uma coleco de factores com actividades pouco relacionadas. Os factores j identificados incluem RAG-1 e RAG-2 (do ingls Recombination activating Gene; Schatz et al., 1988, 1989; Oettinger et al., 1990;), NBP ( do ingls nonamer binding protein; Halligan et al., 1987; Li et al., 1989), T-160 (Shirakata et al., 1991), Rc (Wu et al, 1993), RBP-Jk (Hamaguchi et al., 1989), Rp (do ingls recognition protein; Muegge et al., 1993). Dos factores identificados com base na sua capacidade para produzir cortes no DNA, nenhum apresentava a especificidade necessria (Desiderio et al, 1984; Kataoka et al., 1984; Hope et al., 1986). Apenas um factor foi identificado com base na sua actividade

de ligase, tendo sido denominado VDJP (do ingls V(D)J Joining Protein; refered in Lewis, 1994). A actividade de ligase desta protena s pde ser observada em fragmentos contendo sinais de ligao, pelo que possui a especificidade necessria para estar envolvida na recombinao V(D)J (Lewis, 1994). 2.1.3 POLIMORFISMOS DO TCR As deleces de regies variveis foram dos primeiros polimorfismos a serem detectados no genoma do TCR, tanto em ratinhos de laboratrio (Behlke et al, 1986; Haqqi et al., 1989a., 1989b) como em ratinhos selvagens (Pullen et al., 1990; Jouvin-Marche et al., 1989). Polimorfismos mais pontuais foram no entanto tambm detectados no gene de V17 de ratinho, verificando-se que as 2 substituies de aminocidos afectavam a especificidade final do receptor (Cazenave et al., 1990). No Homem, apenas uma deleco de Vs foi documentada, consistindo na deleco de V6.2 (mas no de qualquer outro dos genes de V testados) num nico indivduo venezuelano pertencente tribo ndia waraos (Concanon et al., 1987). No entanto os polimorfismos das regies variveis do TCR parecem ser quase universalmente representados, ainda que no frequentes na populao (Concanon et al., 1987). Com efeito, uma busca sistemtica por RFLP indicou a existncia de polimorfismos em 12 das 14 famlias de Vs estudadas (Concanon et al., 1987). Alguns destes polimorfismos podem constituir variaes silenciosas, como o caso de um polimorfismo encontrado em V12.2 (Day et al, 1992), outras no entanto afectam a expresso do gene em linfcitos T maduros, como so os casos dos polimorfismos de V1 (Robinson, 1989), V18 (Charmley et al., 1993), V3 (Posnett et al., 1994) e V6.7 (Posnett et al., 1986; Li et al., 1990; Prashar et al., 1991). Este ltimo com a particularidade de ser detectvel com um anticorpo (Posnett et al., 1986), o que permitiu mapear o epitope de ligao do anticorpo numa zona de hipottica ligao a superantignios (Prashar et al., 1991).
2.8

V
GTCCTCC.CACAGTG-12-ACAAAAACC

+
GGTTTTTGT-23-CACTGTG.CTCAG

GTCCTCCGGTCAG

V +

JUNO CODIFICANTE

JUNO SINAL GGTTTTTGT-23-CACTGTG|CACAGTG-12-ACAAAAACC

Figura 2 - Equao padro para a recombinao V(D)J. Os sinais de juno so indicados por tringulos e os segmentos codificantes por quadrados. Extrado de Lewis, 1994.

2.7

Tambm o polimorfismo descrito para V3 nico, j que este polimorfismo localiza-se no espaador, constituindo assim, o nico exemplo conhecido de uma mutao numa zona no codificante do TCR, que afecta a expresso do respectivo gene (Posnett et al., 1994). Finalmente, a variao allica identificada no V18 a nica que introduz um codo stop, originando um buraco no repertrio presente em 11% dos indivduos estudados (Charmley et al., 1993). Estes dados indicam que mesmo variaes moderadas de apenas 1 ou 2
GT CA

GT CA

CATG

Figura 3 Mecanismo proposto para a origem dos nucletidos P (Adaptado de Lewis, 1994).

2.1.4 O TCR EM SITUAES PATOLGICAS Qualquer processo que induza rearranjos cromossmicos tem o potencial de desorganizar o genoma de forma nociva. Desde muito cedo se reconheceu que o sistema de recombinao V(D)J poderia ter um papel pelo menos em alguns casos de malignidade de clulas T e B (Tycko and Sklar, 1990; Reis et al., 1991; Korsmeyer, 1992; Lieber, 1993). Uma possibilidade de mecanismo consiste na participao da maquinaria de rearranjo no potenciar de rearranjos oncognicos (Boehm and Rabbits, 1989; Tycko and Sklar, 1990), quer por reconhecimento indevido de alvos de recombinao imperfeitos ou crpticos (Aplan et al., 1990; Brown et al., 1990), quer pela doao de um terminal de uma cadeia de DNA correctamente cortada (Bakhshi et al., 1987). Exemplos de ambas as hipteses existem (Lewis, 1994), tornando difcil o estabelecimento de um mecanismo nico de envolvimento da maquinaria de rearranjo V(D)J na gerao de malignidade. A sua implicao parece no entanto indubitvel em alguns casos de leucemias linfoblsticas das clulas T (Lewis et al., 1994), bem como em muitos outros tumores linfoides (Tycko and Sklar, 1990; Rabbitts, 1991, Reis et al., 1991; sawyers et al., 1991; korsmeyer, 1992; Magrath, 1992). O caracter monoclonal do rearranjo dos genes do TCR e das imunoglobulinas, permitiu que as tcnicas de anlise destes genes se tornassem ferramentas teis na identificao de tumores de clulas T e B (Rabbits et al., 1985; Oconnor et al., 1985; Paslier et al., 1987; Rambaldi et al., 1985; Loughran et al., 1988; Tawa et al., 1987; Loughran et al., 1988; Furoni et al., 1989; Flug et al., 1985), particularmente na definio da linhagem (Oconnor et al., 1985; Hare et al., 1989), avaliao da progresso da doena e recidiva (Minden et al., 1985; Minden and Mak, 1986; Griesser et al., 1989; Lee et al., 1987). Dois tipos de abordagens foram utilizados: a utilizao de anticorpos idiotipicos, reconhecendo na sua maioria epitopes das regies variveis do TCR (Royer et al., 1987; Smith et al., 1988; Janson et al., 1991); e a deteco de rearranjos clonais por southern
2.10

GTAC CATG

Nucletidos "P"

pares de bases nas sequncias codificantes ou no codificantes do genoma do TCR podem ter repercusses significativas no repertrio do TCR (Vissinga et al., 1994).

2.9

Blotting(Flug et al., 1985), o que permite a deteco de clones representando pelo menos 1% da populao celular em anlise (Griesser et al., 1989; Minden et al., 1985). Em alguns casos, como a investigao da linhagem em leucemias linfoblsticas, parece mesmo haver vantagem na utilizao conjugada de ambas as tcnicas (Hare et al., 1989). Refira-se no entanto que a identificao de monoclonalidade no deve ser imediatamente interpretada como sinnimo de malignidade. Com efeito, em casos de hiperlinfocitoses CD8 ou CD4 (situao com curso benigno), foi possvel encontrar monoclonalidade (Minden and Mak, 1986; Griesser et al., 1989; Cabeda resultados no publicados) sem que tal significasse uma posterior evoluo maligna. Alguns autores sugerem mesmo que esta patologia possa ter inicio policlonal evoluindo posteriormente para uma situao monoclonal (Minden and Mak, 1986) no se observando no processo qualquer sinal de evoluo para malignidade (Cabeda resultados no publicados). No entanto, a deteco de uma populao clonal de clulas em proliferao pode ajudar a discriminar entre um processo reactivo e uma leso neoplsica ou pr-neoplsica (Grieser et al., 1989). As mesmas tcnicas utilizadas na investigao de clonalidade em doenas linfoproliferativas foram aplicadas investigao de doenas autoimunes, imunodeficiencias e outras (Royer et al., 1987; Posnett et al., 1988; Goldman et al., 1992). Exemplos destes estudos so os realizados para a sarcoidose pulmonar (Tamura et al., 1991; Forrester et al., 1994; Forman et al., 1994), doena de Chrons (Posnett et al., 1990), esclerose mltipla (Wucherpfenning et al., 1990; Ben-Nun et al., 1991; Nick et al., 1995; Droogan et al., 1994), Doena de Kawasaki (Abe et al., 1992), Miastenia Gravis (Infante et al., 1992), Artrite Reumatoide (Sottini et al., 1991; Howell et al., 1991; Uematsu et al., 1991; Haqqui et al., 1992; Posnett et al., 1988; Zagon et al., 1994), encefalomielite (Urban et al., 1988), doena tiroideia autoimune (Davies et al., 1992), doena de Gravis (Posnett et al., 1988), Trombocitopenia purpura Idioptica (Posnett et al., 1988), Psoriase (Posnett et al., 1988), Diabetes (Posnett et al., 1988; Wong et al.,
2.11

1994) Lupus eritematoso (Olive et al., 1994; Rozzo et al., 1994; Okubo et al., 1994 e Coeliac Disease (Falk et al., 1994). Em todos estes estudos, anomalias do repertrio do TCR foram encontradas quer nas clulas CD4 quer nas clulas CD8, devidas quer a diminuio(Goldman et al., 1992; Posnett et al., 1988) quer a aumento da frequncia de utilizao de determinados genes variveis (restantes referencias acima mencionadas). No entanto, nos casos em que a mesma patologia foi investigada por mais que um laboratrio, os resultados nem sempre foram concordantes (Tabela 1), o que pode ser devido quer falta de tcnicas padro, quer extensa utilizao de tecnologia de PCR quantitativo, a qual no se encontra ainda hoje suficientemente padronizada. 2.2 As Imunoglobulinas (Ig)

2.12

2.3 O MHC Similarmente ao que sucede com os grupos sanguneos, que determinam a compatibilidade das transfuses de sangue, um grupo de genes, globalmente conhecido como o Complexo Major de Histocompatibilidade (MHC) controla a compatibilidade dos tecidos em transplantes de rgos. Estes genes, localizados no homem no brao curto do cromossoma 6, encontram-se concentrados numa nica regio ou locus, existindo genes homlogos em todas as espcies de mamferos.

2.13

2.14

No homem, os antignios produzidos por estes genes so globalmente designados por Antignios de Histocompatibilidade Humana (HLA). Deve notar-se no entanto, que neste locus gentico se encontram genes no envolvidos na histocompatibilidade, como por exemplo o caso de genes do complemento.

A hereditariedade dos genes do MHC efectua-se em bloco, j que estes genes se encontram agrupados num mesmo locus cromossmico. No entanto, ocorrncia de recombinao entre os genes deste locus faz

A principal caracteristica gentica dos genes do MHC o seu elevado grau de polimorfismo. Como j dissemos, um gene polimrfico, quando existem alteraes na sua sequncia que, ou no alteram a sequncia proteica, ou a alteram sem que a sua funcionalidade seja diminudo. No caso dos genes do MHC, os polimorfismos existem no s a nvel gentico, mas tambm a nvel proteico, sem que a funo destas protenas saia diminuida, mas antes reforada. Com efeito, como veremos, sendo a funo dos genes do MHC a de apresentar aos linfcitos T o maior nmero possvel de pptidos diferentes, esta s benefecia com a existncia de um elevado nmero de alelos (a consequncia do elevado grau de poolimorfismo), j que os pptidos que um alelo no apresentar podem ser apresentados por outro alelo.

com que nem sempre a regra da transmisso em bloco se verifica, j que em alguns casos raros, a existncia de recombinao entre os dois cromossomas homlogos de uma clula cria novas associaes entre os genes. Como a individualidade de um individuo, em termos de transplante de rgo, definida pelo conjunto de alelos que possui para cada um dos genes do MHC, o elevado nmero de alelos de cada gene, e a espordica ocorrncia de recombinao concorrem para criar um elevadissimo nmero de hapltipos (sequncia allica dos vrios genes do MHC), criando as imensas combinaes que constituem a individualidade dos rgo para transplante.

2.15

2.16

imunolgicas contra bactrias e parasitas. Entre estes dois grupos de genes, localizam-se os genes da classe III. Este loci, alberga genes do complemento e outros que no participam nas reaces de histocompatibilidade.

Os vrios genes do MHC foram agrupados em 3 grupos, de acordo com a sua funo e localizao genmica. Os genes da classe I (no homem HLA-A, HLA-B, e HLA-C) constituem um grupo de genes localizados na zona 5 do complexo, e participam nas reaces imunolgicas contra tumores e vrus. Os genes da classe II (DP, DQ e DR) localizam-se na zona 3 do complexo, e participam nas reaces
2.17 2.18

2.4 O Complemento O sistema do complemento constitudo por mais de 30 protenas sricas e da superfcie das clulas, que interagem com resto do sistema imune optimizando as condies para que se possam realizar muitas das funes para a imunidade humoral. O prprio nome: complemento, foi atribudo graas capacidade destas protenas complementarem a aco dos anticorpos. Este sistema tem vrias funes no sistema imune : Algumas protenas do complemento so intermedirios da citlise levando formao de poros na camada bilipdica de microorganismos da membrana celular, que provoca a lise osmtica dos microorganismos. Promove a opsonizao de microorganismos ou de partculas estranhas. Esta funo exercida por protenas especficas para esta funo: as opsoninas. Os leuccitos fagocticos tm receptores para as opsoninas promovendo a ligao dos leuccitos aos microorganismos e facilitando a fagocitose. Alguns fragmentos que resultam da fragmentao de certas protenas do complemento activam a inflamao. Estes pptidos so chamados anafilotoxinas j que por vezes provocam uma resposta to forte que se assemelha a uma reaco alrgica. O sistema do complemento o responsvel pela solubilizao e pela destruio fagoctica dos complexos imunes que se poderiam depositar tanto nas paredes do vasos como nos orgos. Finalmente, uma das funes mais importantes do complemento promover a resposta humoral facilitando a apresentao do antignio e baixando o nvel de sensibilidade da activao das clulas B pelos antignios.
2.19

Assim, o complemento desempenha uma papel muito importante no a ataque aos microorganismos, quer na activao da imunidade humoral quer directamente, levando lise osmtica . 2.4.1 As cascatas do complemento O complemento actua por cascatas enzimticas que permitem amplificar a aco de uma s molcula, permitindo uma resposta imune mais eficaz. Algumas das protenas do sistema do complemento so enzimas proteolticas que actuam concertadamente levando formao final do complexo MAC (Membrane attack complex) que provoca alise osmtica dos microorganismos patognicos (Tabela 2-1). As cascatas tm duas vias de actuao: a via clssica e a via alternativa. Uma das protenas chave nas duas cascatas a protena C3 (Figura 2.1.1-1). A protena C3 clivada em C3a que uma anafilotoxina, e em C3b que funciona como convertase do C5. A partir da clivagem do C5 as duas cascatas so idnticas e culminam na formao do complexo MAC que se vai inserir na membrana dos microorganismos e provocar a lise osmtica (Figura 2.1.1-1). No entanto, antes da clivagem do C5 as duas cascatas seguem caminhos diferentes e so activadas por mecanismos diferentes. A via alternativa a mais antiga filogeneticamente mas assumiu este nome j que foi descoberta depois da via clssica. Esta via activada na presena de microorganismos e no precisa de outras respostas imunes especficas, sendo portanto um mecanismo de imunidade inata. Os passos iniciais da via alternativa tm como objectivo a formao da C3 convertase que como j referi vai clivar o C3 e dar origem C5 convertase. A C3 convertase da via alternativa um complexo proteico formado por um produto da clivagem proteoltica do factor B (Bb) e de um fragmento do C3 que existe na circulao (C3b ou C3i). o complexo C3Bb que actua como C3 convertase.

2.20

Tabela 2-1- alguns componentes proteicos das cascatas do complemento (continua na pag. seguinte)
Componente Via alternativa Factor B Factor D Properdina C3 93 25 220 195 200 1-2 25 550-1200 Ba Bb uma serina protease que faz parte das C3 e C5 convertases. Protease que circula na forma activa: cliva o factor B ligado ao C3b. Estabiliza a C3 convertase da via alternativa C3a uma anafilotoxina. C3b liga-se covalentemente a superfcies activantes onde faz parte das C3 e C5 convertases e tambm actua como opsonina. Tamanho /kD Concentrao no soro/ g/mL Produtos de activao Funes

C3a C3b

Tabela 2-2- alguns componentes proteicos das cascatas do complemento (continuao).

Componente Via Clssica C1 C1q C1r C4 C1s 750 410 85 85 210 75 50 50 200-500 C1r C1s C4a C4b Serina protease: cliva o C1s. C1s uma serina protease: cliva O C4 e C2. C4a uma anafilotoxina. C4b liga-se covalentemente a superfcies activantes onde faz parte da C3 convertase e tambm age como opsonina. C2a C2b Serina protease que faz parte das C3 e C5 convertases. Inicia a via clssica; Liga-se poro Fc das IG Tamanho /kD Concentrao no soro/ g/mL Produtos de activao Funes

C2

110

20

Figura 2.4.1-1As duas cascatas do complemento. As protenas do complemento vo reagindo entre si para formarem o complexo MAC, que se liga aos microorganismos A via alternativa activada na ausncia de anticorpos sendo um mecanismo relacionado com a imunidade inata. A via clssica por sua vez um dos mecanismos essenciais na imunidade humoral.

Na via clssica a C3 convertase formada na presena do complexo antignio-anticorpo e depende da aco de uma srie de protenas chave (C1, C2 e C4) e um mecanismo da imunidade humoral. O C1 protena iniciadora da cascata e permite a activao da via clssica. O complexo antignio-anticorpo liga-se molcula C1 que
2.21 2.22

depois de activada, vai clivar o C4 em C4a e C4b. O C4b por sua vez vai clivar o C2 e dar origem C3 convertase da via clssica-o complexo C4bC2a. 2.4.2 O MHC III Os genes do complemento localizam-se num cluster do MHC III que, por sua vez se situa entre o MHC classe II e o MHC classe I . Os genes do cluster do MHC III codificam para um srie de protena entre as quais as protenas do complemento: factor B, C2 e C4; para enzimas: Citocromo P450 21- Hidroxilase, para a RP1. Estes genes esto organizados em mdulos: clusters RCCX (Figura 2.1.2-2) que so formados pelos genes RP, C4 e a Citocromo P450 21-Hidroxilase. Estes clusters resultam de duplicao dos genes C4, RP, da enzima Citocromo P450 21-Hidroxilase e Tenascina X. Tal como aconteceu anteriormente, as mutaes nestes genes normalmente envolvem todos os genes do cluster. Como vamos ver adiante estes acontecimentos podem ser importantes.

constituda por 1744 aminocidos, mas sofre uma clivagem posterior originando a protena srica activa.

Figura 2.4.2-2 Mapa do gene do C4. A zona assinalada com C4d compreende a zona de diferenciao dos dois isotipos (C4A e C4B): AC CTC TCT CCA GTG ATA CAT AGG

Existem duas isoformas da protena activa: o C4A e a C4B. As duas isoformas tm reactividades diferentes com grupos bsicos ou cidos. O C4A reage mais rapidamente com grupos amino, enquanto que o C4B reage mais facilmente com o grupo hidroxilo. Alm disso a actividade hemoltica do C4B trs a quatro vezes maior que a do C4A. A diferena nas reactividades deve-se ao facto de existirem aminocidos diferentes no local reactivo da protena. No resduo 1106 do C4B existe uma Histidina enquanto que no C4A h uma asparagina. No caso do C4B o aminocido nucleoflico (His) ataca o grupo tiol de um resduo de cistena, formando um intermedirio acdico (figura xxx). No caso do C4A a asparagina, no sendo nucleoflica no origina a formao do intermedirio pelo que a reaco de ligao s outras molculas mais lenta (figura).

Figura 2.4.2-1 Organizao dos genes do MHC III

2.4.2.1

A protena

O C4 uma das protenas da via clssica do complemento que participa na formao da C3 convertase, alm de dar origem a uma anafilotoxina que promove a inflamao. A protena constituda por trs cadeias polipeptdicas , e (figura 2.1.3-1). A pr-protena
2.23

Figura xxx Mecanismo de aco do C4A e do C4B.

2.24

As duas isoformas do C4 diferem apenas em quatro aminocidos entre os resduos 1101 a 1106. A diferenciao funcional entre as duas isoformas d-se mesmo no aminocido 1106, j que mutaes pontuais neste resduo do origem a converses de C4B a C4A. No fundo estas diferenas fazem com que o C4A reaja mais facilmente com pptidos enquanto que o C4B reage com carbohidratos. Devido a estas reactividades diferentes o C4b do C4A consegue opsonizar os fragmentos imunes mais facilmente que o C4b do C4B (Vaishnaw et al.,1998). Esta funo muito importante no caso de doenas imunes em que h uma grande acumulao de complexos imunes nos orgos e nos vasos.

est associada a formas graves de doenas imunes. Os alelos nulos podem resultar de delees do gene ou de mutaes que do origem a codes STOP (1). Esto referidas inseres de 2bp (TC) que do origem a pseudogenes do C4 e originam genes nulos (Figura 2.1.3-2). Quando se d uma deleo completa do gene normalmente ainda so abrangidos os genes vizinhos como o caso da Citocromo P450 21-Hidroxilase (13).
Insero TC 5667 L Y W G S Q S I V I R A ...........................................STOP

CTG TAC TGG GGC TCT CAG TCA CTG ATT CTC AGA GCA............ CGC TGA CTG TAC TGG GGC TCA GTC ACT GAT TCT CAG AGC AT.....................................

C4 Normal L

2.4.2.2

O gene

Figura 2.4.2-3 Insero de TC duas bases que do origem a uma protena truncada do C4 no funcional. Como j foi referido anteriormente, as diferenas de tamanho devemse ao intro 9 que tem 6.5Kb e que est presente em todos os genes do C4A (dando origem a um gene com 22Kb), mas que s est presente em alguns C4B fazendo com que o tamanho deste gene varie entre 22 e 16Kb. O intro 9 contm um retrovrus endgeno (HERV-K) que est inserido no locus C4A e s em alguns C4B e que est espalhado por todo o genoma humano. OS dois isotipos: C4A e o C4B, resultaram duma duplicao dos genes C4 (e provavelmente os genes anexos dando origem aos clusters RCCX). O retrovrus n se encontra nos macacos do Mundo Novo o mas est presente nos macacos do Velho Mundo, revelando que a insero do retrovrus se deu depois da divergncia entre os macacos do novo mundo e nos macacos do mundo velho. Como este intro existe em todos os genes do C4A mas apenas em alguns do C4B isto leva supor que a insero do vrus se tenha dado depois da duplicao
2.26

Localizao e organizao

O C4 codificado por dois genes: C4A (cido) e C4B (bsico), localizados no brao curto do cromossoma 6, mais exactamente no locus 6p21.3. Os genes so constitudos por 41 exes com aproximadamente 21 Kb. O tamanho dos genes depende da existncia do intro 9 que tem 7 Kb. Assim quando o intro est presente o gene tem 21 Kb enquanto que quando no existe intro o gene tem 16 Kb. Polimorfismos e mutaes Tal como os genes do MHC III os genes do C4 so muito polimrficos e apresentam grandes variaes quer em tamanho quer em nmero. As mutaes mais frequentes so os alelos nulos e so definidos pela ausncia de protena no plasma. Cerca de 30% da populao possui alelos nulos para o C4: 10% apresentam o haplotipo C4AQ0 e 16% C4BQ0. J a ausncia total de C4 (C4AQ0 + C4BQ0) muito rara e
2.25

dos genes. A existncia do vrus em genes C4B pressupe converses gnicas ou mecanismos de crossing over desigual. Outro tipo de mutaes a assinalar so tambm as interconverses gnicas. Esto referidas na literatura casos em que mutaes de uma s base transformam um dos genes do C4 no outro (Figura 2.1.3-3). Estas mutaes so detectveis por Southern blot j que o tamanho dos fragmentos que so reconhecidos como C4A ou C4B no corresponde ao valor esperado.
P C L D C4A C4B

AC CCC TGT CCA GTG TTA GAC AGG AC CTC TCT CCA GTG ATA CAT AGG L
1101

S
1102

1105 1106

Figura 2.4.2-4 Mutao no gene C4B que o pode transformar no gene C4A.Apesar de existirem mais pontos de discordncia entre os dois genes como nos aminocidos 1101,1102 e 1105, basta uma substituio de um aspartato por uma histidina (aminocido 1106) para transformar funcionalmente o C4A em C4B.

2.27

Captulo 3
3 reas de interveno da gentica molecular em Microbiologia

3.1 A Gentica na Virologia As partculas virais completas (viries) so constitudas por dois tipos fundamentais de material: um genoma e uma cpside. O genoma pode ser de DNA ou RNA, e encontrar-se ou no associado a protenas. A cpside constitui um invlucro proteico que envolve o genoma e possui simetria helicoidal ou icosadrica (fig. 3.1). A nucleocpside por vezes revestida por uma envelope membranar. Alguns viries possuem ainda enzimas, as quais so essenciais para as fases iniciais da replicao do genoma viral. Os vrus tm um modo de multiplicao nico, que os torna parasitas intracelulares obrigatrios. Na verdade, os vrus no so capazes de replicao autnoma, j que no possuem a maior parte da maquinaria enzimtica necessria para esse efeito. Para obviar esta limitao, os vrus socorrem-se da maquinaria enzimtica da clula hospedeira, introduzindo-lhe modificaes que sequestram a sua actividade para o seu prprio genoma, em desfavor do genoma celular.

Figura 3.1 Tipos de simetria viral, e respectivo empacotamento do material gentico

3.1 3.2

Os vrus parasitam todo o mundo vivo, desde as bactrias s plantas e aos animais. Cada espcie de vrus possui no entanto uma especificidade de hospedeiro, a qual extensvel no s espcie mas ainda ao tecido ou rgo que infecta. Esta especificidade de clulas hospedeiras, determinada por um lado pela existncia de receptores apropriados na membrana das clulas, e por outro pela existncia de factores celulares necessrios para a replicao viral. 3.1.1 - O genoma viral O genoma dos vrus constitudo por DNA ou RNA. O cido ncleico viral pode ainda ser de cadeia simples ou dupla. A quantidade de material gentico por virio varia entre 3 e 300 Kb. Assim, os vrus mais pequenos contm apenas 3 a 4 genes, enquanto os maiores contm algumas centenas. Exceptuando os retrovrus, os viries contm apenas uma cpia do genoma, isto , so haplides. Em alguns casos de vrus de plantas, cada virio contm apenas uma parte do genoma, sendo necessrio a infeco de vrios viries numa mesma clula para, por complementarizao, se reunir todo o genoma viral na clula infectada. A dificuldade de replicar os terminais de uma molcula de DNA linear ultrapassada em alguns vrus com a adopo de DNA de cadeia dupla circular como material gentico, enquanto outros vrus, possuindo molculas de DNA linear, circularizam-no aps a infeco. Outros vrus possuem redundncias terminais, que permitem que umas molculas de DNA completem outras por recombinao psreplicao. Uma outra estratgia adoptado por alguns vrus consiste em possuir sequncias palindrmicas nas extremidades, as quais actuam como primers durante a replicao. Alguns vrus possuem sequncias gnicas que reflectem a sua semelhana em comportamento aos transposons, como por exemplo a presena de "terminal repeats.
3.3

Os genes virais, sendo transcritos com a maquinaria enzimtica celular, obedecem a princpios de regulao semelhantes aos genes celulares. Assim, possuem as estruturas gerais descritas no captulo 1.1.1.3, ainda que por vezes, as sequncias reguladoras sejam ligeiramente diferentes das celulares, conferindo aos genes virais vantagem selectiva na competio para a transcrio e traduo. Por exemplo, nos Poxvirus as sequncias reguladoras da transcrio viral no seguem o padro celular, necessitando de elementos reguladores codificados pelo genoma viral. Os vrus de RNA possuem RNA de cadeia simples ou dupla. Os vrus de RNA de cadeia simples podem possuir cadeias positivas (o RNA do virio pode actuar directamente como mRNA) ou cadeias negativas (o RNA do virio tem que ser transcrito em mRNA). Os vrus de RNA+ tm habitualmente as caractersticas habituais do mRNA (CAP e poliA). O RNA dos vrus de RNA- no possuem CAP ou cauda poliA, mas possuem um terminal 5 com um nuclesido trifosfato. O genoma dos Vrus de RNA de cadeia dupla habitualmente segmentado, ainda que um segmento possa codificar para mais que uma protena. A segmentao do genoma favorece a recombinao gentica entre os vrus, originando consequentemente uma enorme variabilidade gentica. O genoma viral encontra-se densamente compactado dentro da cpside dos vrus icosadricos. O DNA associado a protenas ou poliaminas forma um core central de voltas paralelas. Em alguns vrus animais como os poliomavirus, o DNA associa-se fortemente a histonas centrais, formando uma estrutura semelhante cromatina. O maior nvel organizativo encontra-se nos vrus de DNA dos adenovirus. Nestes vrus, o DNA em conjunto com protenas virais especificas forma doze bolas iguais, cada localizada num vrtice da cpside icosadrica. Os vrus que possuem envelope possuem, para alm das protenas associadas ao genoma e das da cpside, protenas do envelope. Estas podem ser de dois tipos: as glicoprotenas e as protenas da matriz. As
3.4

glicoprotenas so protenas transmembranares com grandes domnios extracelulares e domnios citoplasmticos muito pequenos. As protenas da matriz no so habitualmente glicosiladas. Algumas possuem vrios domnios transmembranares, enquanto outras apenas se ligam face interna das membrana por um domnio hidrofbico. Estas protenas, reforam o envelope, e estabelecem pontes entre este e a nucleocpside. Em alguns casos, a estrutura fluida do envelope, e a quase total ausncia de coneces cpside fornece aos viries uma forma pleiomrfica, enquanto em outros, a coneco firme entre o envelope e a cpside lhes confere formas caractersticas. As principais protenas do envelope, tal como as da cpside e das protenas associadas ao material gentico so codificadas no genoma viral. Na realidade, a maioria dos antignios virais so protenas do envelope, cuja especificidade depende da sua origem no genoma viral. Alguns vrus contm, tambm alguns componentes do envelope que no so codificados no genoma viral, sendo oriundos da membrana citoplasmtica da clula hospedeira. Para alm dos componentes estruturais referidos, alguns vrus contm enzimas, que executam funes essenciais nas fases iniciais da infeco. Tipicamente so enzimas que transcrevem o RNA viral para mRNA (em vrus de RNA- e em vrus de RNA de cadeia dupla), ou que transcrevem o R NA viral para DNA (nos retrovrus). Trata-se de enzimas especificas dos vrus que no esto presentes nas clulas a infectar, e que portanto devem ser fornecidas pelo virio que delas necessita. 3.1.2 - O ciclo de vida Viral
3.1.2.1 Passos iniciais da multiplicao viral

celular. Este passo bloqueado por anticorpos dirigidos quer contra o ligando no vrus, quer contra o receptor na clula). Penetrao (segue-se rpidamente adsoro, processando-se habitualmente por pelo menos trs processos: 1) endocitose (o processo mais eficaz em que a penetrao mediada por receptores); 2) fuso do invlucro com a membrana plasmtica; 3) translocao. Descorticao (o mecanismo mais frequente para a libertao do material gentico consiste na desestabilizao de componentes do envelope e cpside por interaco com componentes celulares, um fenmeno que ocorre por exemplo com a acidificao da vescula de endocitose. A acidificao c ausa a exposio de aminocidos hidrofbicos, os quais se vo ligar membrana vesicular, libertando o material gentico no exterior da vescula.

3.1.2.2 Fase da Multiplicao viral

A fase que se segue libertao do material gentico no citosol da clula alvo, a da multiplicao dos vrus. Nesta fase, os vrus virulentos bloqueiam a sntese de protenas celulares, forando a maquinaria celular a sintetizar exclusivamente as protenas virais. A replicao e transcrio do DNA celular so tambm inibidos nos adenovrus, herpesvrus, e poxvrus, sendo ainda observados, com frequncia, cortes cromossmicos. O mecanismo de bloqueio da sntese proteica celular muito varivel. Por exemplo, o poliovrus possui uma protease viral que lisa uma protena celular necessria para o reconhecimento do CAP. Como o RNA deste vrus no possui o CAP, no afectado. Os Herpesvirus causam a degradao do mRNA celular, enquanto o gene E1b dos adenovirus impede o transporte do mRNA celular para o citoplasma. Na maioria dos casos, estes mecanismos esto dependentes da sntese de protenas virais, para se iniciar o bloqueio da sntese proteica celular.
3.6

Nos animais, toda a nucleocpside penetra na clula hospedeira, onde liberta o material gentico , tornando-o disponvel para a replicao. Assim, os passos iniciais da multiplicao viral so: Adsoro (o vrus liga-se clula, habitualmente atravs de ligandos no envelope ou na cpside, e de receptores na superfcie
3.5

Ao contrrio dos vrus virulentos, os vrus moderados no s no inibem a sntese proteica celular como podem estimul-la.
3.1.2.2.1 Fase da sntese de vrus de DNA

genoma no possui introns, utilizam a maquinaria enzimtica mais simples codificada no seu prprio genoma, e transportada no virio. Traduo: As protenas virais so sintetizadas nos polisomas citoplasmticos, numa sequncia temporal correspondente descrita para a transcrio. Assim, numa fase inicial so transcritos essencialmente protenas reguladoras (polimerases, inibidores da traduo e transcrio celular, activadores dos late expressing genes), enquanto na fase tardia, so produzidas essencialmente protenas estruturais do virio. Na maioria das classes vricas, estas protenas migram para o ncleo onde ocorre a reunio das nucleocpsides. Replicao: A replicao utiliza percursores do meio celular. Os vrus mais simples utilizam a polimerase do DNA da clula hospedeira, enquanto os vrus mais complexos como os adenovirus, os herpesvrus e os poxvrus possuem as suas prprias polimerases para esse efeito. A sntese inicia-se cerca do meio do perodo de eclipse, aps a transcrio dos early genes. A replicao viral semiconservativa, mas o mecanismo preciso de replicao depende do tipo de vrus: Adenovirus: Apresentam replicao assimtrica, que se inicia no terminar 3 de uma das cadeias de DNA. A cadeia em sntese utiliza como primer um cido citidilico ligado ao percursor da protena terminal. Aps a completa sntese desta cadeia, a cadeia oposta tambm replicada de forma semelhante, aps formar uma estrutura tipo hairpin por emparelhamento das repeties invertidas.

Durante a fase da sntese, ocorrem trs processos genticos altamente regulados: a transcrio, a traduo e a replicao. No processo de sntese dos vrus animais, e ao contrrio do que sucede nos procariotas, a transcrio e a traduo no esto fisicamente ligadas, j que, com a excepo do poxvrus, a transcrio ocorre no ncleo, e a traduo no citoplasma. Transcrio: Os mRNA produzidos so como os celulares monocistrnicos, sendo tambm sujeitos aos habituais mecanismos de processamento ps-transcricional. A transcrio tem uma organizao temporal. Na maioria dos vrus de DNA apenas uma fraco do genoma transcrito na fase inicial ( early genes), sendo os restantes genes transcritos numa fase posterior (late genes). Os vrus mais complexos tm ainda os immediate early genes, os quais so expressos na presena de inibidores da sntese proteica, bem como delayed early genes, os quais requerem sntese proteica para a sua expresso. A passagem dos early genes aos late genes necessita da prvia replicao do DNA. A regulao da transcrio efectuada por protenas presentes no virio, ou codificadas por genes especficos virais ou celulares. A sequncia 5 de cada gene viral encontra-se envolvida nesta regulao, estendendo-se por vezes durante algumas centenas de bases a regio reguladora. Estas regies possuem semelhanas funcionais com os enhancers celulares, respondendo em trans a substncias produzidas por outros genes, e em cis ao gene que regulam A transcrio inicial, e o processamento da maioria do mRNA so efectuados pela maquinaria enzimtica celular. A excepo so os poxvrus cujo genoma no migra para o ncleo. Estes vrus, cujo
3.7

3.8

infeco, o DNA migra para o ncleo da clula hospedeira, onde sofre exonuclelise limitada, que lhe permite formar estruturas circulares por emparelhamento das extremidades. Numa fase inicial, a replicao, origina monmeros circulares, enquanto numa fase posterior se formam concatmeros circulares, os quais so posteriormente cortados originando o DNA linear dos futuros viries. Poxvirus: O Poxvrus possui um genoma de DNA bastante extenso com uma peculiaridade nica. As duas cadeias de DNA complementar so covalentemente unidas. nas extremidades. A ligao ocorre no fim de duas sequncias repetidas e invertidas (inverted repeats). Esta organizao permite ao vrus replicar-se de forma contnua, originando produtos polimricos que so posteriormente clivados em monmeros e de novo fechados nas extremidades. Vrus da hepatite B: Apesar de ser um vrus de DNA, utiliza a transcrio reversa para a sua replicao. Os viries contm DNA circular, parcialmente de cadeia dupla. A cadeia negativa (complementar do mRNA) completa, apresentando-se de forma circular com um corte a garantir a descontinuidade. A cadeia positiva incompleta. Aps a infeco, a cadeia positiva completada, gerando-se uma cadeia completa circular e fechada, a qual transcrita. O cido nucleico ento transcrito de forma reversa para DNA por uma enzima viral, num processo complexo que envolve um salto entre dois direct repeats, originando a cadeia positiva incompleta.
3.1.2.2.2 Fase da sntese de vrus de RNA

Figura 3.2 Tipos de vrus de DNA e respectivos mecanismos de replicao

Replicao com recurso a intermedirios circulares: Como j foi dito, alguns vrus utilizam intermedirios circulares, para conseguir replicar na totalidade o seu genoma. o caso dos herpesvrus, os quais possuem um genoma de DNA de cadeia dupla, com cerca de 300-400 bp de repeties directas nas extremidades. Aps a
3.9

Os vrus de RNA podem ser divididos em 7 classes, de acordo com a polaridade do seu RNA (o mRNA tem polaridade positiva), bem como o nmero de molculas de RNA, e se este de cadeia simples ou dupla. (tabela 3.1).
3.10

A estratgia de sntese destes vrus ditada pela ausncia de unidades de traduo mltiplas num mesmo mensageiro. Para obviar a esta dificuldade trs estratgias foram desenvolvidas: 1) o virio de RNA actua como mensageiro, e transcrito de forma monocistrnica num pptido gigante, que depois cortado originando as protenas funcionais; 2) O virio de RNA transcrito em vrios mRNA monocistrnicos por iniciao da transcrio em pontos diferentes do RNA viral; 3) O genoma do vrus uma coleco de vrias molculas Tabela 3.1 - Tipos de vrus de RNA
Classe Constituio do genoma Trascriptase no virio Infectividade do RNA Exemplo

transcritos correspondentes aos vrios genes, continuando a sequncia do mRNA at ao final 3 do genoma. Os vrus da classe III, tm genoma com polaridade negativa, uma transcriptase vrica transcreve o genoma em vrios mRNA monocistrnicos, a partir de um nico promotor. A transcriptase pra e reinicia a transcrio em cada juno gnica, originando os vrios mRNA. Os vrus da classe IV tm a particularidade de possuir o seu genoma disperso por vrias molculas de RNA, sendo cada segmento transcrito em molculas de mRNA distintas. Em alguns casos, um segmento d origem a dois produtos genticos por splicing alternativo. Por este motivo o ciclo de vida destes vrus passa por uma fase nuclear, j que o splicing de RNA essencial para a sua fisiologia. Os vrus da classe V tm um genoma peculiar, j que metade tem polaridade negativa, sendo transcrito em mRNA por uma transcriptase vrica, enquanto a outra metade do genoma tem polaridade positiva, sendo transcrito duas vezes at se obter o mRNA. Os vrus da classe VI possuem segmentos mltiplos no sobreponveis de RNA de cadeia dupla. Cada segmento transcrito num mRNA diferente por uma transcriptase vrica. Os vrus da classe VII so os nicos vrus de RNA cujo ciclo de vida passa por uma fase em que o genoma existe sob a forma de DNA. Estes vrus possuem dois RNA de cadeia simples idnticos de polaridade positiva com uma cauda poli-A na extremidade 3, e um CAP na extremidade 5. Cada um destes RNA transcrito reversamente em DNA por uma transcriptase reversa presente no virio. O DNA resultante ento transcrito em mRNA para a actividade vrica. Nos vrus de RNA no existe diferenciao entre early genes e late genes, com a possvel excepo dos reovirus (classe V).

I II III IV V VI VII

+ SS + SS - SS - SS MM PM DS MM + SS MM

+ + + + +

+ + -

picornavirus coronavirus paramixovirus ortomixovirus arenavirus reovirus retrovirus

+ polaridade do mRNA - polaridade oposta do mRNA CS cadeia simples DS cadeia dupla MM multiplas molculas de RNA PM polaridade multipla

de RNA, sendo cada uma transcrita em espcies de mRNA monocistrnicos. Nos vrus da classe I, o RNA actua como mensageiro. A mesma molcula tem ainda que iniciar a replicao, o que necessita de protenas codificadas pelo RNA viral. Assim, a organizao temporal traduo/replicao imposta pela necessidade de protenas no estruturais, mas essenciais para a replicao. Nos vrus da classe II, o genoma origina primeiro um transcrito de polaridade negativa, o qual ento transcrito em mRNA monocistrnicos de diferentes tamanhos, num processo nico. Cada um inicia com uma curta sequncia leader 5, a qual adicionada aos
3.11

3.12

Replicao dos vrus das classes I a V: A replicao, que ocorre no citoplasma consiste em todos os casos em produzir uma cadeia padro, complementar do genoma, e com o mesmo comprimento que este, a qual depois utilizada como padro para a sntese do RNA genmico da progenia. Em alguns casos, a replicao e a transcrio interferemse mutuamente, pois a falta inicial de protenas virais tem como consequncia que s a transcrio possvel, mais tarde, a mesma cadeia de RNA deve mediar os dois processos. Assim, por vezes os vrus possuem protenas especficas, que se ligam ao RNA, promovendo a replicao. Na replicao do RNA, a cadeia sintetizada permanece associada cadeia padro, formando uma molcula de RNA de cadeia dupla com o comprimento do genoma viral (RNA conhecido por RF de replicating form). A sntese de novas cadeias realiza-se de forma conservativa e assimtrica: a prxima sntese remove a cadeia formada de novo, a qual se liga a protenas da cpside, generando uma nova nucleocpside. Replicao dos vrus da classe VI: Cada segmento de RNA do genoma destes vrus replicado independentemente dos restantes. A replicao est intimamente ligada transcrio pela transcriptase viral. A replicase usa o mRNA nascente como padro, fazendo a partir deste uma cadeia de polaridade negativa, a qual actua ento como padro para a sntese do RNA genmico de polaridade positiva. As duas cadeias permanecem ligadas, sendo incorporadas na cpside viral. esta replicao assimtrica (a cadeia negativa a nica a servir de padro para a sntese do novo genoma) e conservativa (o RNA original no integra as novas partculas virais). Replicao dos vrus das classes VII: O ciclo de vida dos retrovrus objecto de descrio alargada na seco seguinte. Cabe aqui apenas referir que sinteticamente a replicao parte do intermedirio de DNA de cadeia dupla (integrado no genoma celular), sendo a partir deste produzido o RNA por transcrio normal.

3.1.2.3

O ciclo de vida dos retrovrus

Pela sua importncia nas infeces crnicas correntes com maior relevo em sade pblica, os retrovrus, e em particular o HIV, tm sido alvo de intensa investigao, pelo que muito se sabe j acerca das especificidades do seu ciclo de vida. Como j vimos o genoma dos retrovrus constitudo por RNA de cadeia simples de polaridade positiva. Tal como o mRNA celular possui uma cauda poliA na extremidade 3, e uma estrutura CAP na

Figura 3.3 Genoma tipo de um retrovrus.

extremidade 5. Cada virio possui duas molculas de RNA ( diplide), com a mesma polaridade, juntas por uma estrutura de dimerizao na extremidade 5. O virio contm ainda alguns RNA celulares de baixo peso molecular entre os quais tRNA, os quais, como veremos, possuem funes essenciais no ciclo de vida dos retrovrus. Os retrovrus possuem essencialmente 3 genes bsicos: gag, pol e env respectivamente pela ordem 53. Os onco-retrovrus humanos possuem ainda um gene adicional, e os lentivirus possuem cinco genes adicionais. Para alm das estruturas CAP e poli-A, as extremidades genmicas dos retrovrus possuem ainda, na ordem 53, uma redundncia terminal (R), a sequncia U5 (do ingls unique 5) e o local de ligao do primer (PBS do ingls primer binding site). O PBS possui 16 a 18 nucletidos e complementar de um da extremidade 3 de um tRNA que a ele se encontra ligado, e que funciona como primer para a transcrio reversa.

3.13

3.14

O codo de iniciao AUG do gene gag localiza-se algumas centenas de nucletidos depois do local CAP, e neste intervalo encontram-se ainda duas sequncias importantes o local de dimerizao (DLS do ingls dimer linkage site) o qual mantm juntas as duas cpias do virio, e o sinal de empacotamento () que permite o empacotamento

do RNA dos viries.

Figura 3.5 Mecanismo de transcrio reversa nos retrovrus

Figura 3.4 Ciclo de vida de um retrovrus

3.15

3.16

A extremidade 3 contm aps o final do gene env, a regio de primer + (+P) com 12 bases ricas em purinas (intervm na transcrio reversa) a sequncia U3 (unique 3 contm sequncias importantes para a transcrio viral), e redundncia terminal (R) semelhante da extremidade 5 e finalmente a cauda poliA. Esta organizao geral com os terminais repetitivos a circunscrever os genes semelhante dos transposons eucariticos. A adsoro e entrada dos retrovrus nas clulas hospedeiras no diferente dos restantes vrus, dependendo da existncia de receptores apropriados na superfcie das clulas alvo. A maioria dos retrovrus no so nem citopticos, nem alteram grandemente o metabolismo das clulas que infectam. Em cultura as clulas infectadas continuam habitualmente a dividir, ao mesmo tempo que produzem e libertam partculas virais. Pouco depois da infeco (menos de uma hora em clulas de galinha infectadas com um retrovrus compatvel) tem lugar a sntese de uma cpia de DNA de polaridade negativa por transcrio reversa do RNA viral (utilizando a transcriptase reversa viral). Ainda antes de estar completa a cadeia de DNA de polaridade negativa, tem inicio a sntese da cadeia de DNA de polaridade positiva (uma reaco tambm mediada pela transcriptase reversa viral). Quando termina a sntese da cadeia de polaridade negativa, a parte do RNA que permanece a ela ligada degradada pela RNAse H. Inicialmente a cadeia de DNA nascente uma cadeia dupla linear com cortes, j que a cadeia contnua e a + descontnua. Cerca de 6 a 9 horas aps a infeco os cortes so preenchidos, e o DNA desloca-se para o ncleo sob a forma de DNA de cadeia dupla circular. Cerca de 24 horas aps a infeco vrias cpias deste DNA encontram-se integradas no genoma celular como provrus, em locais do genoma aparentemente aleatrios. As molculas de RNA para os novos viries so ento produzidas por transcrio normal dos provrus integrados. Como consequncia deste
3.17

Figura 3.6 Insero de um retrovtus no genoma celular

mtodo de replicao, o DNA de cadeia dupla diferente do RNA do virio, possuindo mais cerca de 500 a 600 nucletidos. As diferenas consistem nas duas extremidades que se tornaram iguais. As estruturas que medeiam este processo so designadas por LTR (long terminal repeats) consistindo cada (na direco 53) por um U5, um R e um U3. Cada LTR contm um sinal para a adio de um CAP, uma TATA box e um local de CAP determinando a origem da transcrio, bem como um sinal para a adio de uma cauda poliA. O provrus utiliza apenas os sinais de iniciao do LTR 5 porque a transcrio a partir deste interfere com a iniciao da transcrio a partir do LTR 3. Este contribui com os sinais de terminao, e pode iniciar a transcrio se faltar o LTR 5. Tal como as sequncias presentes nos transposons eucariotas, os LTR virais possuem em cada extremidade short direct repeats do local de integrao (5 a 13
3.18

nucletidos). Uma outra importante caracterstica dos LTR a existncia de um enhancer. Os LTR so cruciais no processo de integrao no genoma celular. Apenas molculas circulares com os LTR ligados extremidade-comextremidade so passveis de integrao. A integrase corta as duas cadeias de DNA na juno U5-U3, faz dois cortes no DNA genmico, em locais ligeiramente diferentes, e insere o DNA viral. Aps a insero, ficam alguns nucletidos de DNA celular em cadeia simples, o que reparado. Aps este passo, o provrus 4 nucletidos mais pequeno que o DNA circular e rodeado pelos direct repeats do DNA celular resultantes da reparao do DNA de cadeia simples. Estes provrus podem ser excisados por recombinao entre os LTR, mas este um processo extremamente raro. A produo de protenas virais inicia-se em simultneo com a sntese do DNA. Existem basicamente duas espcies de RNA traduzido. A mais pesada corresponde espcie presente no virio, e origina a gag e em alguns casos (5%) a pol (o gene pol encontrase out-of-frame, pelo que s em

ribossomas que executaram o frame-shift a pol passvel de leitura). Uma outra espcie de RNA resultante do splicing da primeira d origem protena env. As protenas produzidas (gag-pol e env) so na realidade poliprotenas que sero posteriormente clivadas dando origem s protenas virais maduras. A protease que efectua este corte uma protease viral especfica codificada entre os genes gag e pol.

Figura 3.8 Sada das particulas virais por evaginao. A poliprotena env entra no retculo endoplasmtico durante a sntese, dirigindo-se depois para o golgi onde glicosilada, sendo ento canalizada para a membrana celular. A maioria da gag fica retida no citosol, mas uma pequena parte segue a mesma via da env. Cerca de 8 horas aps a infeco, os percursores gag e gag-pol comeam a juntar-se ao RNA viral, formando uma nucleocpside debaixo da membrana plasmtica, onde aps ocorrer a protelise a nucleocpside se liga ao env. Esta poliprotena ento clivada originando uma protena transmembranar da matriz e uma protena externa, ligadas por pontes dissulfureto. O virio ento formado excretado por evaginao, o que permite manter a integridade celular. Figura 3.7 Produo das partculas virais do retrovrus
3.19 3.20

3.1.3 - Virologia em Medicina Transfusional

3.1.3.1 - O vrus da Hepatite B (HBV)

O soro de doentes com hepatite B possui habitualmente 3 estruturas diferentes com o antignio HbsAg. A partcula de Dane a menos comum, possuindo todas as estruturas observadas em vrus (core electrnicamente denso revestido por um envelope), e infecciosa. As partculas esfricas so as mais numerosas, sendo diferentes dos restantes vrus; a sua superfcie parece ter uma estrutura semelhante da partcula de Dane, mas sem simetria aparente. As formas filamentosas so tambm frequentes. Quando estas estruturas filamentosas so sujeitas aco de um detergente aninico, originam estruturas indistinguiveis das partculas esfricas, sugerindo que esta estrutura um aglomerado de partculas esfricas. O genoma do HBV constitudo, como j foi referido, por DNA

circular de cadeia dupla incompleta. Assim, possui uma cadeia longa (L), de comprimento constante, com uma extremidade 3 livre, e com uma extremidade 5 ligada covalentemente a uma pequena protena. O vrus possui ainda uma cadeia curta (S de short) cujo comprimento varia entre 15% e 60% do comprimento do genoma circular. A posio dos terminais 5 de ambas as cadeias so fixas, mas no coincidentes, sendo a posio do terminal 3 da cadeia S varivel. O emparelhamento das duas cadeias, assegura que o genoma assume uma configurao circular, j que as cadeias no possuem terminais coincidentes. A nucleocpside formada por uma nica protena - o antignio do core (ABcAg). Esta protena possui actividade de cinase, sendo capaz de se autofosforilar; um domnio desta protena, rico em argininas (a

Figura 3.9 O vrus da Hepatite B existe em circulao sob a forma de vrias Partculas (A). A partcula de Dane (B) uma partcula completa e infecciosa.
3.21 3.22

Figura 3.10 O genoma do HBV, espcies de mRNA dele derivadas e respectivas protenas

zona carboxi-terminal) interage com o DNA. No seu interior a nucleocpside contm ainda o DNA, a DNA polimerase e uma protena cinase. A polimerase viral depende dos dNTP e Mg2+celulares, mas capaz de produzir as duas cadeias de DNA viral sem necessitar de qualquer primer. A polimerase tem ainda a funo de transcriptase reversa, como veremos abaixo. O envelope viral contm 3 glicoprotenas designadas major, midle e large proteins. O antignio de superfcie (HBVsAg), que o componente principal das partculas esfricas um dmero da major protein. A entrada do virio no hepatcito provavelmente mediada pela ligao da middle protein albumina polimerizada. Aps a entrada no hepatcito, e a libertao do genoma no citoplasma, este dirige-se ao ncleo, onde com a ajuda da DNA polimerase viral produz um DNA
3.23

de cadeia dupla completa. A RNA polimerase celular produz ento mltiplas cpias de RNA (RNA pregenoma) a partir da cadeia de polaridade negativa. O RNA ento transportado para o citoplasma onde produzida a protena do core, que rapidamente encapsula o RNA pregenoma, bem como a DNA polimerase viral produzida de novo e a protena terminal do DNA. Esta protena, substitui provavelmente o primer, levando a DNA polimerase a produzir a cadeia L do DNA viral com a sua actividade de transcriptase reversa. medida que o DNA sintetizado, o RNA pregenoma degradado, com excepo de uma pequena poro derivada da zona 5, a qual serve com primer para a sntese da cadeia S. O core completo assim formado obtm o seu envelope por evaginao de parte da membrana celular contendo o Hb sAg. A deteco molecular do genoma viral, para alm de constituir uma forma altamente especfica de deteco do vrus, permite ainda a deteco de ttulos virais mais baixos e patologicamente activos, bem como o acompanhamento da eficcia da aco teraputica. Se especificidade da reaco de hibridao, for ainda aliada a sensibilidade da reaco de PCR, obtm-se um mtodo analtico extremamente sensvel e especfico, e portanto de grande utilidade clnica.
3.1.3.2 - O Vrus da Hepatite C (HCV)

O vrus da Hepatite C (HCV), isolado pela primeira vez em 1989, parece ser um importante factor causador de doena heptica crnica, cirrose e carcinoma hepatocelular, em todo o mundo. Hoje em dia foram j isoladas vrias estirpes virais do HCV, o que permitiu desenvolver testes serolgicos e de gentica molecular (deteco de RNA viral) para a determinao da virmia. O genoma do HCV possui 9379 nucletidos, sendo constitudo por uma cadeia simples de RNA com um nico e longo open reading frame. O produto gentico uma protena precursora com 3011 aminocidos, que por protelise ps-traducional origina protenas
3.24

Figura 3.11 Ciclo de vida do HBV

estruturais (core e envelope) e no estruturais (proteases, helicases, polimerases do RNA). A deteco do HCV no possvel de ser realizada por testes padro de deteco de antignios no soro, j que as partculas virais circulam no soro em concentraes abaixo das detectveis por imunoensaios. Assim, a maioria dos estudos epidemiolgicos foram inicialmente baseados na prevalncia de anticorpos contra o antignio c100-3. Presentemente, ainda testada a presena de anticorpos contra outros antignios virais (testes ELISA de terceira gerao). No entanto, estes testes originam um grande nmero de falsos positivos, pelo que se tornou necessrio o desenvolvimento de testes confirmativos. Como j foi referido, vrias estirpes do gene da Hepatite C foram j identificadas (estirpes 1a, 1b, 2, 2a, 2b, 3a, 4, 5), tendo estirpes diferentes prognsticos e repostas teraputicas diferentes.
3.1.3.3 - O vrus Linfotrpico Humano (HTLV-I e HTLV-II)

menos claras, no havendo nenhum sndroma clnico especificamente associado infeco por este vrus. Estes vrus tm um muito limitado leque de hospedeiros. Com efeito, sendo o CD4 o receptor para o vrus, apenas as clulas que o expressam (linfcitos Th e moncitos) so passveis de infeco. O HTLV induz a formao de sinccios multinucleados em diversas linhas celulares (o que um bom indicador de diagnstico). O papel do vrus na induo de tumores parece provvel, j que as

O vrus HTLV tipo I foi o primeiro retrovrus humano descrito, sendo considerado o agente causador da Leucemia/linfoma da clula T de Adultos (ATLL). Este vrus tem ainda sido associado com uma famlia

Figura 3.13 expresso dos genes do HTLV

Figura 3.12 Genoma do HTLV-1

clulas leucmicas tm todas o vrus, e este aparece integrado do genoma celular de modo clonal (sempre no mesmo local, num indivduo, mas em locais diferentes em indivduos diferentes). Como o vrus no possui um oncogene, o seu papel deve-se influencia em um oncogene celular. Como o seu local de integrao diferente de indivduo para indivduo, este papel deve ser feito em trans, possivelmente atravs da expresso do gene viral tax, o qual um activador da transcrio. O gene tax encontra-se na extremidade 3
3.26

de doenas neurolgicas incluindo spastic paraparesis e Mielopatia associada a HTLV-I. Mais recentemente, tambm a polimiositose e a poliartrite tm sido associadas a infeces por HTLV-I. As manifestaes clnicas, e epidemiologia do HTLV-II so no entanto
3.25

do gene env estendendo para a regio U3, a qual altamente conservada em diferentes isolados virais. A protena tax para o vrus um activador de sequncias enhancer like presentes no LTR viral. A nvel celular, o principal efeito desta protena parece ser a activao dos genes da IL-2, o que permite s clulas multiplicar de forma autnoma. Devido razo custo/benefcio particularmente boa dos testes de deteco do HTLV baseados em ELISA, este habitualmente o mtodo de eleio para o screening de produtos sanguneos. No entanto, e dado o elevado nmero de falsos positivos apresentados, um resultado positivo deve ser confirmado por um mtodo diferente, como o western Blot. Os mtodos de deteco do genoma viral baseados em PCR e hibridao constituem testes poderosos complementares. Devido grande sensibilidade e especificidade do PCR, aliada enorme sensibilidade da hibridao de DNA, este mtodo permite com rapidez, sensibilidade e especificidade determinar a presena mesmo de nveis muito baixos de partculas virais, bem como seguir a resposta teraputica muito depois de os resultados por ELISA serem negativos.
3.1.3.4 - O vrus do sndroma da imunodeficincia adquirida (HIV)

Figura 3.14 Mapa Genmico do HIV transmembranar gp-41, e a protena externa gp-120. Ambas as estirpes possuem ainda os cinco outros pequenos genes: tat, ver, nef, vif e vpr. Adicionalmente, o HIV-1 possui ainda o gene vpu enquanto o HIV-2 possui o gene vpx. Mutaes nos genes tat e rev inibem a multiplicao viral, enquanto mutaes no gene nef tm o efeito oposto. O gene tat codifica um transactivador que, em colaborao com uma protena celular, aumenta a expresso de todos os genes virais por aumento da transcrio. O seu efeito consiste na preveno da terminao precoce da transcrio na 59 base aps o local CAP. A sequncia nesta zona (regio TAR), forma uma estrutura em hairpin que facilita a terminao, sendo assim necessrio um inibidor da terminao. A protena ver necessria para a expresso dos genes gag, pol e env, mas no para os genes ver e tat. Como todos os genes so transcritos num nico transcrito que depois processado, este efeito diferencial deve ser efectuado num passo pstranscricional. No gene env, esta protena, ligando-se num local na metade 3 do gene impede a inibio da sua traduo causada pela interaco do restante mRNA com factores celulares. A protena rev pode ainda impedir o splicing do transcrito env, fazendo com que os genes tat e env sejam expressos com prejuzo do gene env. O modo de aco do ver nos genes gag e pol pode ser similar. A protena nef reprime a transcrio do genoma HIV actuando na sua zona NR (de negative regulatory). Esta protena tem propriedades similares ao oncogene ras: miristolado, liga-se ao GTP, fosforilado
3.28

O vrus da Imunodeficincia Humana (HIV) demonstradamente o causador do Sndroma Humano de Imunodeficincia Adquirida (SIDA). Sendo um retrovrus, capaz de inserir uma cpia de DNA do seu genoma de RNA no genoma da clula infectada, podendo manterse desta forma num estado latente. O genoma do HIV (cerca de 10Kb) contm 9 genes, existindo diferenas importantes entre o HIV-1 (predominante na Europa, Amrica e frica Central) e o HIV-2 (predominante na frica ocidental). Como os restantes retrovrus, o seu genoma inclui os genes gag, pol e env. Os produtos dos genes gag e pol so processados por uma protease viral, que parte da poliproteina pol. O produto do gene env processado por uma protease celular, originando a glicoproteina
3.27

por uma protena cinase, e tem actividade GTPase. Mutaes neste gene aumentam a progenia viral 2 a 3 v ezes, sugerindo que este gene pode estar envolvido no desenvolvimento do estado latente. Os genes vif, vpu, vpr e vpx provavelmente codificam protenas do virio, que aumentam a eficincia da infeco. Como vimos, a transcrio do genoma do HIV activada ou inibida pela ligao de factores especficos de origem viral ao LTR 5. No entanto, estes factores so coadjuvados por factores celulares, ligando assim o estado de activao/latncia viral ao prprio estado de activao da clula infectada. Assim, a regio NR responde protena nef, mas tambm protena celular Ppt-1, expressa em linfcitos no activados (este gene inibe tambm a sntese de IL-2). Vrias regies virais (regies de ligao do SP1, enhancers, TATA box) aumentam a transcrio em resposta a factores celulares como o NFk-B, que so produzidos em linfcitos activados. O vrus capaz de infectar clulas que possuem o CD4 na sua superfcie, ainda que s esta molcula no seja suficiente para garantir a entrada do vrus (clulas de ratinho transfectadas, no so infectveis, a no ser que o genoma seja injectado directamente na clula). Este receptor liga-se gp120 (um dos dois produtos de clivagem da gp160 o produto do gene env). Estudo mutacionais indicam tambm a necessidade do domnio extracelular amino-terminal da gp41 (o outro produto de clivagem da gp160), a qual est ligada no covalentemente gp120. possvel que a ligao da gp120 exponha domnios da gp41, que ento se liga a um outro receptor celular, fazendo com que esta protena de membrana entre na membrana celular, arrastando a membrana viral consigo, e libertando o core no citoplasma celular. O vrus tem tambm sido observado em endosomas, indicando que a via endoctica tambm uma via de entrada do vrus. Figura 3.15 ciclo de vida do HIV
3.29 3.30

Uma importante consequncia funcional da infeco a diminuio da expresso do CD4, em parte por interferncia, isto ligao intracelular da gp120 com o CD4, impedindo a sua migrao para a superfcie. A consequncia da infeco na sobrevivncia celular varia, j que o vrus se pode integrar no genoma celular, entrando num estado de infeco latente, com pouca ou nenhuma produo de viries. No entanto, a activao celular, como vimos, pode estimular a entrada do vrus numa fase de infeco produtiva, com um pico na replicao vrica, e libertao de partculas infecciosas seguida de morte celular. Note-se que algumas linhas celulares no morrem, mesmo quando o vrus est na fase produtiva (ex. H9 e linhas monocticas). A morte celular parece ser um fenmeno activo, mediado pelo gp41 na membrana celular, j que a amputao do seu domnio intracelular impede a morte celular. Um outro factor tendente a provocar a morte celular a acumulao de DNA no integrado. Uma das caractersticas mais notveis do HIV a sua hipervariabilidade. Isolados diferentes do vrus apresentam diferenas na sua composio gentica, devidas a mutaes (inseres, deleces e mutaes pontuais). Tal facto deve-se sua transcriptase reversa, a qual introduz mutaes a um ritmo cerca de um milho de vezes superior ao observado em vrus de DNA. Dos genes virais, o env parece ser o mais varivel, com 5 zonas de hipervariabilidade na gp120. Os genes gag e pol so os menos variveis, possivelmente devido a restries nas variaes viveis. Uma importante consequncia da hipervariabilidade da gp120 (o antignio viral mais exposto) a sua capacidade para iludir reaces imunolgicas mediadas por anticorpos, fazendo com que as especificidades destes se tornem desactualizadas. Dos testes disponveis para a deteco do HIV, o ELISA habitualmente utilizado. No entanto, e devido ao elevado nmero de falsos positivos, um resultado positivo deve ser confirmado por uma tcnica complementar, habitualmente Southern Blot. Os mtodos
3.31

baseados na reaco de PCR, ainda que de uso relativamente recente, constituem poderosos meios complementares ao ELISA, j que associam a enorme sensibilidade da reaco de PCR com a especificidade quer do PCR quer da hibridizao. Estes mtodos tm ainda a vantagem de detectar directamente o genoma viral, independentemente do estado imunolgico ou replicativo do vrus, aumentando por isso a sua eficincia de deteco. Estes testes so ainda importantes na avaliao clnica da infeco em crianas nascidas de mes seropositivas, j que independente da presena de anticorpos ou antignios provenientes do sangue materno. 3.1.4 - Papel dos vrus em oncologia 0 papel dos vrus em oncologia foi inicialmente considerado apenas como uma curiosidade acadmica, sem contraponto no mundo clnico. No entanto a descoberta em 1932 do papel de vrus de DNA em tumores de coelhos selvagens, e mais tarde (Bittner, 1936) em adenocarcinoma de ratinhos e (Gross, 1951) em leucemias de ratinho levou ao estabelecimento seguro do papel dos vrus na etiologia de alguns tumores. Estes estudos e os que lhe seguiram permitiram estabelecer os mecanismos que permitem que a etiologia viral nos tumores pode permanecer insuspeita: 1) a tumorigenese pode ser um fenmeno raro em vrus largamente disseminados, e habitualmente incuos; 2)em alguns vrus, as partculas virais so heterogneas, sendo que a maioria infecta as clulas sem ocasionar tumores, o que faz com que o tumor s surja numa fase muito avanada da doena, disfarando a sua caracterstica infecciosa. Posteriormente, o potencial oncognico viral foi estudado, avaliando o seu potencial transformador em culturas celulares. Estes estudos levaram concluso que um vrus que induziu um tumor, deixa de ser reconhecido em cultura pela sua infectividade, mas que a sua presena pode ser confirmada a nvel de DNA ou RNA. Nos anos 60, verificou-se que a maioria das classes de vrus de DNA eram capazes de induzir tumores em animais, enquanto dos vrus de RNA apenas os retrovrus tinham essa capacidade. (tabela 3.2)
3.32

3.1.4.1

Oncogenes virais

Tabela 3.2 potencial oncognico das vrias classes de vrus genoma de DNA Familia/grupo do vrus Adenovirus Papovavirus Herpesvirus Hepadnavirus Poxvirus Parvovrus retrovrus Picornavirus Togavirus Ortomixovirus Paramixovirus Rabdovirus Coronavirus Arenavirus Reovirus Vrus oncognicos muitos tipos Polioma, SV40,papiloma EBV,CMV, herpes HBV fibroma vrus nenhum Leukosis viruses, Sarcoma viruses Nenhum Nenhum Nenhum Nenhum Nenhum Nenhum Nenhum Nenhum

O estudo do papel dos vrus na etiologia dos tumores, revelou a existncia de oncogenes no genoma de alguns vrus. Como vimos, trata-se de um conjunto de genes homlogos de genes celulares, mas que devido sua desregulao adquirem a propriedade de estimular o crescimento celular de forma contnua. Os exemplos so hoje em dia muito numerosos. A ttulo de exemplo veja-se a tabela 3.3. Os oncogenes presentes nos retrovrus so habitualmente genes celulares alterados, no realizando funes especficas para os vrus, pelo que no conferem qualquer vantagem ao vrus para alm da de lhe permitirem uma enorme multiplicao enquanto integrados no genoma da clula transformada. Os oncogenes presentes nos vrus de DNA so habitualmente de natureza diferente, realizando funes especficas do vrus. Trata-se de vrus que se replicam em clulas no activadas, pelo que no possuem habitualmente a maquinaria necessria para a replicao viral. Os
3.34

RNA

A descoberta da passagem do ciclo viral dos retrovrus por uma fase de DNA, levou unificao do papel viral na oncognese, como sendo uma propriedade atribuvel ao DNA viral. Mais recentemente, esta regra ganhou fora com a descoberta que o papel oncognico atribuvel a oncogenes transportados ou activados pelos vrus (ver capitulo 4.1.4).

Figura 3.16 incorporao de um proto-oncogene celular no genoma viral, com a sua transformao em oncogene

3.33

oncogenes virais resolvem este problema, estimulando a produo destas enzimas, por activao da maquinaria de replicao do DNA celular. O efeito secundrio traduz-se no crescimento celular, isto , num fentipo transformado.

Tabela 3.3 Oncogenes virais

Oncogene Localizao Funo Oncogenes presentes em vrus de DNA E1A Ncleo/citoplasma Regula a transcrio E1B Nucleo/citoplasma Regula a transcrio PV-ST citoplasma PV-MT membrana citoplasmtica liga e estimula pp60c-src e pp62c-yes PV-LT ncleo inicia a sntese de DNA e regula a transcrio SV40-ST citoplasma SV40-LT ncleo, memb.citoplasm. inicia a snt.DNA, reg.transcrio, liga p53 Oncogenes presentes em Retrovrus abl memb.citoplasm. tirosina cinase erb A citoplasma receptor da hormona tiroideia erb B membranas tirosina cinase / EGF receptor ets ncleo fes memb.citoplasm. tirosina cinase fgr memb.citoplasm. tirosina cinase fms memb.citoplasm. receptor do CSF-1 (tirosina cinase ) fos ncleo fps kit membranas tirosina cinase mil/raf citoplasma serina/tirosina cinase mos citoplasma serina cinase myb ncleo myc ncleo ras memb.citoplasm. proteina G raf rel citoplasma ros citoplasma tirosina cinase sis citoplasma e excretado subunidade do PDGF src memb.citoplasm. tirosina cinase ski ncleo yes tirosina cinase Oncogenes no presentes em vrus bcl - linfoma folicular humano p53 activo em clulas transformadas bcr - LMC ret Linfoma int-1,2,3,4 cancro da mama (rato) rho semelhante a ras met linha celular transformada neu neurogliobastoma de rato

Figura 3.17 exemplos de vrus com oncogenes no genoma viral, e sua expresso.

3.35

3.36

3.1.4.2

Converso de proto-oncogenes celulares em oncogenes Activao de proto-oncogenes

3.1.4.2.1

codificante. Assim, as mutaes podem traduzir-se em alteraes de um ou mais amino-cidos com funes essenciais, ou mesmo na eliminao de extensas zonas da molcula (causada por mutaes nonsense).
3.1.4.2.2 Amplificao de proto-o n c o g e n e s

O principal mecanismo que origina a converso de um proto-oncogene num oncogene consiste na alterao da sequncia gentica por acumulao de eventos mutacionais. Estas mutaes podem ocorrer quer na regio codificante, quer na regio controladora, ainda que na maior parte dos casos, as alteraes se verifiquem na regio

Os vrus necessitam habitualmente de realizar a transcrio de pelo menos parte dos seus genes a um ritmo extremamente elevado, assegurando assim uma rpida formao de novos viries, antes de as suas protenas serem detectadas pelo sistema imune na superfcie celular. Para conseguir este efeito, os vrus possuem enhancers muito eficientes, os quais quando integrados no genoma celular podem descontrolar o programa gentico da clula, levando ao aumento de expresso de alguns genes celulares, que de outra forma seriam expressos em nveis baixos. Surge assim, um oncogene por um efeito quantitativo por oposio ao efeito qualitativo descrito na seco anterior. Facilmente se percebe que se o gene cuja expresso foi alterada estimular a diviso celular, o efeito da sua desregulao quantitativa pode ser a transformao celular.
3.1.4.3 A translocao t(8;14)(q24;q32) e o EBV

O vrus do Epstein-Barr (EBV) foi pela primeira vez observado por Epstein e Barr em clulas de doentes com mononucleose infecciosa, tendo desde ento sido demonstrado ser o agente causador desta patologia. Este vrus est ainda associado ao Linfoma de Burkitt, muito embora a nvel genmico, as estirpes associadas mononucleose infecciosa e ao Linfoma de Burkitt apresentem cerca de 35% de diferenas. Figura 3.18 Mecanismos de activao viral de protooncogenes celulares. O vrus pertence famlia dos Herpesvirus, possuindo no entanto caractersticas peculiares: 1) o seu DNA composto por 5 regies de DNA de sequncia nica, e por 7 regies de sequncias repetitivas,
3.38

3.37

incluindo os terminais genmicos. O genoma do EBV possui ainda um elevado grau de polimorfismo entre os vrios isolados. O vrus infecta selectivamente as clulas B, atravs de um receptor relacionado com o terceiro componente do complemento (c3b). A infeco primria resulta numa fase de latncia, em que apenas regies limitadas, no contguas do genoma so transcritas (genes de expresso latente).Os genes de expresso latente so 6 genes de expresso nuclear (EBNA- Epstein Bar nuclear antigens) e 3 genes codificando protenas membranares (LMP e TP1 e 2). Todas as protenas de expresso latente, com a excepo de EBNA1 so apresentadas pelo HLA, e reconhecidas pelas clulas citotxicas, contribuindo para a manuteno da infeco num estado suportvel pelo hospedeiro. Isto mesmo exemplificado no facto de a maioria dos tumores associados a EBV que surgem nos doentes imunossuprimidos, regredirem quando a imunossupresso reduzida ou retirada. Na fase inicial da infeco, o DNA linear do vrus circulariza servindo-se dos terminais repetitivos, seguindo-se a replicao. A maior parte do genoma viral existe intracelularmente nesta forma circular extracromossmica, tendo no entanto sido detectados ocasionalmente cpias de DNA integrado no genoma celular. A fase replicativa do ciclo caracterizada pela activa transcrio viral, extensa replicao, e produo de protenas dos late genes. Cada clula produz no entanto poucas partculas virais infecciosas. Devido existncia de uma fase latente, e manuteno da infeco num estado suportvel nos indivduos no imunocomprometidos, a infeco por EBV muito frequente (cerca de 95% dos adultos esto infectados).

Figura 3.19 - Diagrama mostrando os eventos genticos geradores de uma das trs translocaes encontradas no Linfoma de Burkitt. O oncogene c-MYC est normalmente localizado no brao longo(q) do cromossoma 8. A translocao t(8;14) coloca este oncogene junto ao locus da IgH, e por isso sob a influncia do enhancer da IgH, o qual muito activo em linfcitos B.

O EBV est classicamente associado ao Linfoma de Burkitt (BL), o qual endmico em frica e doena linfoproliferativa do linfcito B (BLPD), caracterstica dos indivduos imunocomprometidos. Recentemente foram ainda identificadas associaes entre o EBV e subtipos de Linfoma de Hodgkin e de Linfomas T. O Linfoma de Burkitt (BL) fundamentalmente diferente da Doena Linfoproliferativa do Linfcito B, j que a primeira surge num indivduo imunocompetente. Neste caso, o vrus parece escapar vigilncia do sistema imune, expressando apenas o gene EBNA1, o qual como vimos no apresentado pelo HLA. No caso do BL existem ainda anomalias genticas associadas infeco pelo EBV, conduzindo desregulao do c-myc e ou p53, o que contribui para o fentipo maligno da clula infectada. Ainda que a implicao definitiva
3.40

3.39

do EBV na etiologia dos linfomas que ocorrem em indivduos infectados com o vrus da SIDA permanea motivo de investigao, o facto de a replicao do EBV nestas clulas ser muito alta e de uma nica estirpe, parece favorecer a implicao do EBV. Assim, parece ser importante controlar a replicao do EBV nos indivduos afectados por estes tumores, sendo ainda necessrio dispor de tecnologias laboratoriais para detectar a existncia de baixos nveis de vrus replicativamente activos nos indivduos em tratamento.

3.41

Captulo 4
4 reas de interveno da gentica molecular em hemato -oncologia

4.1

4.2

4.1 O cancro: Uma doena gentica de clulas somticas 4.1.1 A origem gentica dos tumores Uma abordagem sistematizada e aprofundada deste tema est para alm do ambito deste manual. Procuraremos fornecer a informao suficiente para uma viso global da oncognese hematolgica, com uma descrio dos principais mecanismos nela envolvidos. Numa segunda parte faremos uma exposio das alteraes genticas mais frequentes nas principais doenas hematolgicas. Finalmente abordaremos de forma breve a utilidade actual dos estudos moleculares em hemato-oncologia. Em resposta a necessidades internas ou a factores externos a que esto submetidas, as clulas podem seguir vrias vias: a) no reaco; b)diferenciao para adaptao s novasnecessidades; c)diviso celular; d) apoptose. Estes processos, envolvem mltiplas vias enzimticas que interagem em complexas redes ainda no completamente esclarecidas. Importa, conhecer algumas dessas vias para mais fcilmente entender como a sua alterao pode desregular a capacidade proliferativa, de diferenciao ou de sobrevida de uma clula, levando-a a adquirir caracteristicas neoplsicas. Podem considerar-se seis tipos de protenas que participam no controlo da diviso celular e sobrevida da clula: 1)factores de crescimento; 2)receptores de factores de crescimento; 3)transdutores intracelulares do sinal; 4) factores de trasncio nuclear; 5) protenas de controlo do ciclo celular; 6)protenas de controlo da apoptose. A todos estes nveis a alterao estrutural/funcional dos genes que codificam estas protenas pode criar desiquilibrios que favoream a proliferao da clula, rompendo os mecanismos de controlo habituais. Na realidade, actualmente pensa-se que a maioria das neoplasia se inicia por um nico evento mutacional no DNA de uma nica clula. Desta forma, a oncognese actualmente entendida como uma doena gentica
4.3

adquirida em clulas no somticas. A mutao que ocorre no DNA da clula inical, confere-lhe vantagem selectiva sobre as restantes. Esta vantagem de sobrevida/proliferao cria condies para mutaes subsequentes no patrimnio gentico da sua descendncia (clone), com o aparecimento de clulas com alteraes genticas adicionais (subclones) que lhes vo conferindo vantagens selectivas progressivas, em paralelo com uma maior agressividade clnica noo "multistep" da carcinognese. costume dividir os genes envolvidos no aparecimento de tumores em dois grupos: 1) proto-oncogenes So genes que se encontram nas mais diferentes espcies de vertebrados e invertebrados e que codificam uma protena envolvida no controlo da diviso celular. A sua activao em oncognese causa um efeito positivo na proliferao celular, mesmo na presena da verso no alterada do restante alelo (aco dominante); 2) genes de supresso tumoral so genes que codificam protenas envolvidas no controlo da proliferao celular e da integridade do DNA. A sua alterao cria condies para a proliferao de clulas com alteraes do DNA. Neste caso, ambos os genes teriam que estar funcionalmente inactivos (aco recessiva). Note-se no entanto, que em alguns casos (ex. p53), o facto de a protena funcionar como multimeros, cria condies para a existncia de uma aco dominante (ver captulo 4.3.2). So habitualmente alteraes congnitas dos genes de supresso tumoral que so responsveis pela tendncia hereditria para o desenvolvimento de tumores (ex. familias Li-Fraumeni, Retinoblastoma, Ataxia-telangiectasia), o que se compreende, j que cria de forma transmissivel uma menor resitncia ao acumular de eventos mutacionais.

4.4

4.1.1.1

Proto-oncogenes e o n c o g e n e s

4.1.1.1.1

Factores de crescimento

Assumida a caracterstica gentica dos tumores, resta procurar os genes responsveis pelo fentipo tumoral. Uma das primeiras pistas proveio da observao que alguns vrus eram capazes de induzir o fentipo tumoral nas clulas que infectavam. O estudo do contedo gentico destes vrus permitiu identificar um nmero hoje bastante extenso de genes indutores de caractersticas oncolgicas, genericamente designados por oncogenes. Mais surpreendente que a identificao dos oncogenes foi a descoberta de genes homlogos no genoma das clulas normais. Estes genes (denominados por analogia de proto-oncogenes) no so iguais, mas homlogos aos oncogenes. Na verdade, os oncogenes so cpias mutadas dos proto-oncogenes, estando as mutaes (pontuais, nonsense e translocaes) associadas gerao das caractersticas oncolgicas, quer por alterao directa da respectiva protena, quer por alterao do programa de expresso da protena. Os proto-oncogenes e respectivos oncogenes so designados por um nome de trs letras (ex. src). Se o nome escrito s com minsculas e em itlico, este refere-se ao oncogene, enquanto o proto-oncogene representado sem itlico e com a primeira letra em maisculas. O nome do oncogene quando existente no genoma de um vrus representado com o prefixo v (ex: v-src). Por oposio o proto-oncogene tambm por vezes representado em minsculas, com o prefixo c (ex: c-src).

Os factores de crescimento constituem sinais (sob a forma de hormonas ou no) que sinalizam a uma clula que deve iniciar o processo de diviso. Estas molculas, ao ligarem ao respectivo receptor, induzem a produo de uma pletora de sinais intracelulares e respectivas respostas como a mobilizao de reservas energticas, diferenciao e entrada no ciclo de diviso celular. Como clulas diferentes possuem receptores diferentes, cada factor de crescimento produz respostas em alguns tipos celulares e noutros no. O nico caso conhecido em que um factor de crescimento originou um oncogene o do PDGF (platelet derived growth factor). No entanto, foi experimentalmente confirmado o potencial destas protenas para produzirem caractersticas oncolgicas, se estimuladas em cascatas autcrinas. Assim, quando experimentalmente uma clula com um receptor para o factor de crescimento X foi induzida a a produzir este factor de crescimento, gerou-se um ciclo fechado de produo/consumo de estimulo (ciclo autcrino), que levou a clula diviso permanente (ex. de ciclos

4.5

4.6

autcrinos produzidos em laboratrio so o mediado pelo GM-CSF e TGF-).

4.1.1.1.2 Receptores para factores de crescimento

Alguns receptores para factores de crescimento possuem na sua cauda citoplasmtica actividade de tirosina cinase, transmitindo o estimulo produzido pela ligao do factor de crescimento, atravs da fosforilao de uma ou mais protenas citoplasmticas. Estes receptores tornam-se oncogenes, se uma mutao fizer com que a actividade de tirosina cinase no esteja condicionada ligao do factor de crescimento. Por exemplo uma mudana num aminocido localizado na zona transmembranar do gene Neu transforma-o no oncogene neu. Na maioria dos casos, uma grande parte do domnio extracelular do receptor delectado originando o oncogene (ex. ErbB).
4.1.1.1.3 Transdutores intracelulares de sinal

Este o maior grupo conhecido de proto-oncogenes. constitudo por protenas que transmitem sinais desde receptores at alvos nucleares. Os mais bem conhecidos transdutores de sinal so as protenas G. Um bom exemplo a protena Gs, a qual controla a produo de cAMP. Esta protena detecta a ligao de um ligando ao seu receptor, liga-se a GTP, activa a adenil ciclase, levando formao de cAMP. Hidrolisa ento o GTP, regressando a um estado inactivo. Uma mutao no gene da Gs, eliminando a actividade de hidrlise do GTP, transforma esta proteina num oncogene, j que o mecanismo de inactivao desta protena fica inoperacional, do que resulta um aumento constitucional de cAMP celular, o qual leva a uma proliferao desregulada de clulas pituitrias, levando a tumores deste rgo.

Muitos dos proto-oncogenes desta classe codificam para tirosinas cinases no receptores (ex. Src e Abl). Trata-se portanto de protenas citoplasmticas ou nucleares, sem qualquer domnio transmembranar ou extracitoplasmtico. Muitas destas protenas possuem miristatos, um cido gordo longo ligado sua glicina N-terminal. Este facto faz com que estejam parcialmente ligados membrana citoplasmtica, colocando a sua actividade de tirosina cinase numa posio idntica dos receptores com esta actividade.

4.7

4.8

A alterao gentica que origina o oncogene src foi estudada em grande detalhe. A protena normal (pp60c-src ou c-src) possui mltiplos locais de fosforilao, atravs dos quais controlada. Fosforilao da tyr-527 junto da sua extremidade C-terminal origina uma grande reduo na sua actividade cinase. Esta zona proteica est frequentemente alterada nas protenas src que possuem actividade cinase constitutiva. Por exemplo no vrus do sarcoma Rous, a v-src sofreu uma deleco que eliminou os ltimos 18 aminocidos da csrc. Um outro grupo de oncogenes desta classe so os genes Ras, cujos produtos se ligam ao GTP, hidrolisando-o lentamente. Tal como as protenas Src, as Ras possuem cidos gordos ligados (um grupo farnesil), localizando-se no interior da membrana citoplasmtica. Este proto-oncogene transformado por uma simples substituio da valina-12 por glicina, o que apesar de apenas causar uma ligeirssima alterao conformacional, impede a hidrlise do GTP, causando um fentipo tumoral. O produto dos genes Crk no apresenta actividade bioqumica conhecida, mas possui em comum com muitos outros oncogenes domnios designados por SH2 e SH3 (src homologous domains), os quais interactuam com outras proteinas. O domnio SH2 interactua
4.9

com pptidos curtos, em locais proteicos com uma tirosina fosforilada, enquanto o domnio SH3 interactua com domnios proteicos ricos em prolinas. Assim, a actividade oncognica do crk implica que um aspecto central na gnese de tumores no apenas a fosforilao de protenas chave, mas tambm o padro de associaes proteicas mediadas pelos domnios SH, pelo padro de fosforilaes e eventualmente pela exposio de grupos ricos em prolinas por modulao da conformao proteica.
4.1.1.1.4 Factores de transcrio nuclear

Seja porque mecanismo for, todos oncogenes originam mudanas no programa gentico das clulas em que existem. Estas mudanas traduzem-se na alterao do tipo e/ou quantidade de espcies de mRNA produzidas, e das respectivas protenas. Os factores de transcrio nuclear actuam directamente nos genes, aumentando ou diminuindo a transcrio dos genes com que interactuam. Fazem-no de uma de duas formas: 1) interactuando com os promotores, e assim

4.10

ligando/desligando a transcrio; 2) interactuando com enhancers, e assim aumentando ou diminuindo a quantidade de mRNA produzido. Um bom exemplo de proto-oncogene deste tipo so os genes Jun e fos. Os produtos destes genes, quando dimerizados constituem parte do factor de transcrio AP-1, o qual se liga a sequncias nos promotores e enhancers de muitos genes. Presumivelmente, este genes actuam como oncogenes, activando a transcrio de genes que promovem o crescimento celular, ou inibindo a transcrio de genes que reprimem a diviso celular. Muitas protenas nucleares codificadas por proto-oncogenes so induzidas quando as clulas so estimuladas a crescer. Exemplos so o aumento de c-Fos e c-Myc em clulas 3T3 estimuladas com PDGF. Curiosamente, o aumento fisiolgico destas protenas rpido, transitrio e moderado, enquanto a sua expresso oncognica prolongada e extremamente elevada. Este efeito obtido custa da perda de sequncias gnicas que instabilizam quer o mRNA quer a protena, contribuindo assim para o seu rpido desaparecimento.
4.1.1.1.5 Protenas de controlo do ciclo celular

tumoral, o RB (gene do retinoblastoma). Crianas que herdaram uma nica cpia defeituosa do RB (frequentemente traduzida numa deleco no cromossoma 13) desenvolvem em mdia 3 tumores de retinoblastoma, cada qual resultado de uma nica clula transformada. Apesar de parecer um elevado nmero, verifica-se que apenas 1 em cada 106 clulas da retina destas crianas desenvolve tumores, o que significa que mesmo neste caso de hereditariedade dominante, ao nvel celular a expresso fenotpica altamente recessiva, sendo necessrio um segundo evento para despoletar o fentipo. Este segundo evento a mutao da cpia normal do gene RB. Como vimos, o gene RB um gene de controlo da diviso celular. Outro gene da sua classe que actua tambm como gene de supresso tumoral o p53. Trata-se de genes cuja funo verificar a progresso do ciclo celular, mantendo as clulas num estado quiescente, ou levlas a entrar em apoptose, se as condies no forem as adequadas para a progresso do ciclo celular. O p53 actua como um tetrmero, ou mesmo um oligomero de ordem mais elevada, o que significa que a diminuio da concentrao de protena funcional ocasionada pela mutao de um dos dois alelos na clula pode eliminar quase por completo a actividade do p53, pois virtualmente todos os oligmeros possuiro pelo menos uma subunidade mutada. Assim, o p53 um gene de supresso tumoral com uma hereditariedade invulgar, j que ao contrrio das mutaes do RB (e da maioria dos genes de supresso tumoral), as mutaes do p53 funcionam de forma dominante. Cerca de metade dos tumores humanos possuem mutaes do p53. Tais mutaes impedem o controlo do ciclo celular e permitem a acumulao de defeitos no DNA, funcionando como um intensificador da probabilidade de ocorrncia de mutaes oncognicas. Como j vimos uma das formas de aco do p53 induzir a apoptose. No entanto, para que tal funcione, necessrio que outros genes, que habitualmente a suprimem estejam capazes de ser desactivados. Um destes genes o bcl-2, o qual tem como funo proteger as clulas
4.12

Como vimos j, o ciclo celular precisamente controlado por vrias protenas, nomeadamente por ciclinas, cdk, p53 e RB, assegurando que o crescimento, duplicao de DNA e diviso nuclear esto perfeitamente sincronizados. Se a regulao da expresso de uma ou mais ciclinas alterada, ou se ocorrem mutaes nos genes que codificam as ciclinas, o p53 ou o RB, podem surgir desregulaes do ciclo celular, com consequncias oncognicas.
4.1.1.2 Genes de Supresso tumoral

A herana de certos genes aumenta para quase 100% a probabilidade de desenvolvimento de tumores. Um caso clssico o retinoblastoma, que como muitos outros tumores hereditrios um tumor da infncia. Este tumor levou identificao do primeiro gene de supresso
4.11

vlidas da apoptose, sendo a sua expresso muito diminuida quando as clulas entram em apoptose. Assim, se este gene se encontrar desregulado, por forma a que a sua expresso seja elevada e constitutiva, induz um fentipo tumoral nas clulas, impedindo que os genes de supresso tumoral induzam a morte celular programada. 4.1.2 Os carcinognios como mutagnios Pensa-se que muitos tumores humanos tm na sua origem a aco de agentes qumicos. Os agentes qumicos com aco carcinognica tm uma enorme variedade de estruturas, sem uma actividade qumica unificadora bvia. Podem no entanto ser agrupados em duas categorias principais: os de aco directa e os de aco indirecta. Os carcinognios de aco directa (de que se conhecem poucos exemplos) so espcies qumicas electrfilas, reagindo com compostos de carga negativa. Os carcinognios indirectos, requerem transformao metablica, a qual consiste na introduo de centros electroflicos. Esta transformao efectuada por complexos enzimticos como o P-450, constituintes habituais dos organismos (no fgado dos mamferos), os quais tm como principal funo a destoxificao de compostos qumicos txicos. Com efeito, algumas drogas teraputicas, insecticidas, hidrocarbonetos policclicos e outros compostos naturais so to insolveis em gua, mas solveis em gorduras, que se acumulariam nos organismos, se no sofressem transformaes qumicas que os tornassem solveis em gua. Estas transformaes consistem na adio de grupos hidrfilicos, o que torna possvel a excreo por solubilizao na gua. Na maioria dos casos, os altamente reactivos grupos epxido adicionados pela P-450 so rapidamente hidrolisados em grupos hidroxilo, seguindo o processo de solubilizao com a adio de cido glucornico ou outros grupos. No entanto, em alguns casos, por presumivelmente os grupos epxido no se encontrarem facilmente acessveis epoxido hidratase, estes grupos permanecem como tal, formando-se os carcinognios.
4.13

Uma vez no interior das clulas, os electrfilos podem reagir com compostos possuindo centros negativamente carregados. Ainda que estes centros possam existir em protenas, RNA e DNA, a aco sobre o DNA que torna estes compostos carcinognios. Com efeito, estes compostos ao reagirem com as bases do DNA, em posies que dependem do seu tamanho e estrutura, causam alteraes na sequncia do DNA. Assim, a aco carcinognica destes compostos sobreponivel sua aco mutagnica.

4.14

4.1.3
4.1.3.1

Agentes virais na origem dos tumores

Oncogenes virais

O estudo do papel dos vrus na etiologia dos tumores, revelou a existncia de oncogenes no genoma de alguns vrus. Como vimos, trata-se de um conjunto de genes homlogos de genes celulares, mas que devido sua desregulao adquirem a propriedade de estimular o crescimento celular de forma contnua. Os exemplos so hoje em dia muito numerosos. A ttulo de exemplo veja-se a tabela yyy2. Os oncogenes presentes nos retrovrus so habitualmente genes celulares alterados, no realizando funes especficas para os vrus, pelo que no conferem qualquer vantagem ao vrus para alm da de lhe permitirem uma enorme multiplicao enquanto integrados no genoma da clula transformada. Os oncogenes presentes nos vrus

de DNA so habitualmente de natureza diferente, realizando funes especficas do vrus. Trata-se de vrus que se replicam em clulas no activadas, pelo que no possuem habitualmente a maquinaria necessria para a replicao viral. Os oncogenes virais resolvem este problema, estimulando a produo destas enzimas, por activao da maquinaria de replicao do DNA celular. O efeito secundrio traduzse no crescimento celular, isto , num fentipo transformado.

4.15

4.16

Tabela yyy2 Oncogenes virais

Oncogene Localizao Funo Oncogenes presentes em vrus de DNA E1A Nucleo/citoplasma Regula a transcrio E1B Nucleo/citoplasma Regula a transcrio PV-ST citoplasma PV-MT membrana citoplasmtica liga e estimula pp60c-src e pp62c-yes PV-LT ncleo inicia a sntese de DNA e regula a transcrio SV40-ST citoplasma SV40-LT ncleo, memb.citoplasm. inicia a snt.DNA, reg.transcrio, liga p53 Oncogenes presentes em Retrovrus abl memb.citoplasm. tirosina cinase erb A citoplasma receptor da hormona tiroideia erb B membranas tirosina cinase / EGF receptor ets ncleo fes memb.citoplasm. tirosina cinase fgr memb.citoplasm. tirosina cinase fms memb.citoplasm. receptor do CSF-1 (tirosina cinase ) fos ncleo fps kit membranas tirosina cinase mil/raf citoplasma serina/tirosina cinase mos citoplasma serina cinase myb ncleo myc ncleo ras memb.citoplasm. proteina G raf rel citoplasma ros citoplasma tirosina cinase sis citoplasma e excretado subunidade do PDGF src memb.citoplasm. tirosina cinase ski ncleo yes tirosina cinase Oncogenes no presentes em vrus bcl - linfoma folicular humano p53 activo em clulas transformadas bcr - LMC ret Linfoma int-1,2,3,4 cancro da mama (rato) rho semelhante a ras met linha celular transformada neu neurogliobastoma de rato 4.17

4.1.3.2

Converso de proto-oncogenes celulares em oncogenes Activao de proto -oncogenes

4.1.3.2.1

O principal mecanismo que origina a converso de um proto-oncogene num oncogene consiste na alterao da sequncia gentica por acumulao de eventos mutacionais. Estas mutaes podem ocorrer quer na regio codificante, quer na regio controladora, ainda que na

4.18

maior parte dos casos, as alteraes se verifiquem na regio codificante. Assim, as mutaes podem traduzir-se em alteraes de um ou mais amino-cidos com funes essenciais, ou mesmo na eliminao de extensas zonas da molcula (causada por mutaes nonsense).
4.1.3.2.2 Amplificao de proto-oncogenes

Os vrus necessitam habitualmente de realizar a transcrio de pelo menos parte dos seus genes a um ritmo extremamente elevado, assegurando assim uma rpida formao de novos viries, antes de as suas protenas serem detectadas pelo sistema imune na superfcie celular. Para conseguir este efeito, os vrus possuem enhancers muito eficientes, os quais quando integrados no genoma celular podem descontrolar o programa gentico da clula, levando ao aumento de expresso de alguns genes celulares, que de outra forma seriam expressos em nveis baixos. Surge assim, um oncogene por um efeito quantitativo por oposio ao efeito qualitativo descrito na seco anterior. Facilmente se percebe que se o gene cuja expresso foi alterada estimular a diviso celular, o efeito da sua desregulao quantitativa pode ser a transformao celular. 4.1.4 A "estatstica" na origem dos tumores: mutaes espontneas As mutaes espontneas surgem por uma grande variedade de mecanismos, tal como j referido na seco 1.1.2.4. Qualquer destes mecanismos contribui para que fenmenos mutacionais potencialmente oncognicos ocorram com alguma frequncia. Estes eventos no so no entanto na maior parte dos casos determinantes, graas aos mecanismos de reparao referidos em 1.1.2.5. No entanto, por vezes a reparao dos danos mutacionais no eficaz, dando origem a mutaes efectivas e potencialmente oncognicas.

4.2 Anomalias Genticas em doenas hematooncolgicas 4.2.1 Translocaes cromossmicas em hemato-oncologia Dentro das alteraes cromossmicas presentes em hemopatias malignas, as mais bem estudadas so as translocaes. Em alguns casos, as translocaes so especficas de um determinado tipo de leucemia, o que atesta a sua importncia na patognese da doena. Noutros casos, ainda que as translocaes no paream ser especficas de uma patologia definida como entidade clinica autnoma, o seu estudo demonstrou o envolvimento de oncogenes, sendo em alguns casos o motor da descoberta destes. Segundo o mecanismo de activao dos oncogenes envolvidos, podem distinguir-se dois tipos de translocaes: as que envolvem um dos genes das Imunoglobulinas ou do TCR, e as que originam genes hibridos funcionais, com caracteristicas oncognicas, e em que participa pelo menos um oncogene.
4.2.1.1 Translocaes envolvendo genes das Ig ou TCR

Nestas translocaes, um protooncogene colocado pela translocao debaixo da aco do potente enhancer dos genes das Ig ou do TCR. Nestas condies, a sequncia do proto-oncogene no alterada, mas a sua transcrio encontra-se muito aumentada, por aco do enhancer. Exemplos de translocaes deste tipo os referidos na tabela xxx3 Como descrito anteriomente (seco 2.1.4), ainda que no se conhea com preciso o mecanismo envolvido nestas translocaes, a caracterizao das zonas de juno parece envolver a maquinaria fisiolgica de recombinao somtica.

4.19

4.20

Tabela xxx3. Translocaes envolvendo os genes do TCR e das Ig Translocao IgH

t(8;14)(q24;q32) t(11;14)(q13;q32) t(14;18)(q32;q21) t(14;19)(q32;q13) t(3;14)(p27;q32) t(5;14)(q31;q32) t(2;8)(p12;q24) t(2;3)(p12;q27) t(8;22)(q24;q11) t(3;22)(q27;q11) t(1;14)(p32;q11) t(10;14)(q24;q11) t(11;14)(p14;q11) t(11;14)(p13;q11) t(8;14)(q24;q11) t(1;7)(p32;q35) t(7;9)(p34;q32) t(7;11)(p35;p13) t(7;9)(q34;q34.3) t(;7)(q34;q34) t(7;19)(q34;p13)

Doena
Burkitt LNH-manto LNH-foliculares LLC-B LLA-pre B Burkitt LNH-clula grande Burkitt

Gene afectado
C-Myc bcl-1 (CCND1/PRAD1) bcl-2 (apoptose) bcl-3 (ciclina?) IL-3 (citocina) bcl-6 (zinc-finger)

4.2.1.1.1

translocao t(8;14)(q24;q32) e o EBV

IgK Ig TCR-/

No Linfoma de Burkitt, ocorrem 3 tipos de translocaes recprocas, todas envolvendo o gene MYC (8q24), e genes dos cromossomas 2 (IgK), 14 (IgH) e 22 (Ig). A translocao mais frequente a t(8;14)(q24;q32), a qual ocorre em mais de 75% destes linfomas. O gene MYC conhecido pela sua importncia na proliferao celular, mas no expresso nas clulas B maduras. No entanto, estas translocaes colocam este gene dependente de enhancers das imunoglobulinas, pelo que o gene passa a estar activo nas clulas B que possuem estas translocaes, dando origem a nveis de mRNA semelhantes aos encontrados nas clulas normais em proliferao.

LLA-T LLA-T LLA-T LLA-T LLA-T LLA-T LLA-T & LNH LLA-T LLA-T

Tal-1 TCL-3 (Hox11) Rhombotin 1 Rhombotin 2 (TCL-2) C-Myc Tal-2 dominio LIM TAN-1 lck LYL1

TCR-

Figura 1 - Diagrama mostrando os eventos genticos geradores de uma das trs translocaes encontradas no Linfoma de Burkitt. O oncogene c-MYC est normalmente localizado no brao longo(q) do cromossoma 8. A translocao t(8;14) coloca este oncogene junto ao locus da IgH, e por isso sob a influncia do enhancer da IgH, o qual muito activo em linfcitos B.

4.21

4.22

Estudos moleculares revelaram a existncia de 2 mecanismos de gerao da translocao t(8;14)(q24;q32). O primeiro, ocorre no, Linfoma endmico da frica equatorial, associado infeco por EBV, o gene MYC no rearranjado, encontrando-se intacto, se bem que prximo das regies DH ou JH do gene IgH. Esta mutao ocorre no estdio celular pr-B, quando a maquinaria de recombinao dos genes das Imunoglobulinas est activa. O segundo mecanismo de gerao desta translocao no est associado infeco pelo EBV. Neste caso, a translocao ocorre imediatamente 3 do gene MYC, ou dentro deste, envolvendo ainda a regio de switch do gene IgH. As clulas neste caso apresentam um fentipo mais maduro, compatvel com a ocorrncia da mutao numa altura em que a clula efectuava o switch de imunoglobulinas.
4.2.1.1.2 A t(14;18) - BCL2/IgH

O advento do PCR transformou o estudo molecular das mutaes envolvendo o gene do BCL-2, e particularmente a translocao t(14;18), tanto a nvel do mbr como do mcr. Desta forma foi possvel detectar 1 clula mutante num universo de 100,000 clulas normais, permitindo uma nova sensibilidade na deteco de doena residual mnima.

Em cerca de 85% dos Linfomas foliculares (FL), e 25% dos Linfomas Difusos (DL), surge a translocao t(14;18)(q32;q21), envolvendo os genes BCL-2 (B-Cell Lymphoma/Leukemia-2 gene) no cromossoma 18 e um dos segmentos JH do gene da IgH no cromossoma 14. O gene BCL-2 codifica uma protena que parece ter potencial oncognico sendo importante na fase pr-B do desenvolvimento do linfcito B, ao prevenir a morte celular por apoptose. Duas regies de quebra foram identificadas no cromossoma 18: 2/3 das translocaes envolvem uma regio de 150 bp na zona 3 no traduzida do gene (o Major Breakpoint region ou mbr). As restantes translocaes envolvem o Minor cluster region (mcr) localizado cerca de 20 Kb aps o inicio do gene. A translocao parece no afectar a sequncia do BCL-2, mas to somente os nveis de mRNA deste gene, e ocorre presumivelmente por erro na maquinaria gentica de recombinao das Ig. Esta interpretao parece ser suportada pela descoberta de regies N na juno dos breakpoints, bem como pela existncia de mutaes somticas na mesma zona.
4.23

Figura 2 - Diagrama mostrando os cromossomas 14 e 18 normais, e os cromossomas resultantes da translocao t(14;18)(q32;q21), envolvendo os genes BCL-2 (18q21) e IgH (14q32).
4.24

4.2.1.2

Translocaes que originam genes hibridos

Estas translocaes afectam um proto-oncogene, o qual justaposto a um outro gene, originando um gene quimera funcional, que transcrito, originando uma proteina com caracteristicas oncognicas. Exemplos deste mecanismo so apresentados na tabela xxxy. Tabela xxxy- Translocaes que originam genes hibridos Translocao
t(9;22)(q34;q11) t(15;17) (q22;q21) t(11;17)(q35;q21) t(5;17)(q35;q21) t(8;21)(q22;q22) Inv(16)(p13;q22) t(6;9)(p23;q34) inv(3)(q21;q26) t(3;3)(q21;q26) t(1;9)(q23;q13) t(12;21)(p13;q22) t(2;5)(p23;q35) t(4;11)(q21;q23) t(1;11)(q32;q23) t(6;11)(q27)(q23) t(9;11)(p21;q23) t(11;17)(q23;q21) t(11;19)(q23;p13) t(8;13)(p11;q12)
a) c) e) g) i)

Doena
LMC;LLA adulto/LMA LMA-M3 LMA-M3 LMA-M2 LMA-M4Eo LMA,LMA-TdT+ LMA-M1 LLA-pre B LLA-prec.B infantis LNH-anaplsico LLA-pre B LAM LAM LAM-M5,prec.B LAM LAM,LLA -prec. B sindrome mieloproliferativo
b) d) f) h)

Genes afectados
abl PMLb PLZFc NPM e ETOc MYHf DEK EVI1c PBX1h TEL ALK a ALLc AF1Pe AF6i AF9i AF19 ZNF198 bcra RARd RARd RARd AML1 CBFBg CAN

Crnica (CML) em 1960. Porque este achado foi realizado em Filadlfia, utilizou-se o nome desta cidade para designar esta translocao (t(9;22)(q34;q11)) ou ainda cromossoma Ph. Estudos moleculares revelaram que esta translocao envolvia no cromossoma 9 o gene ABL(Abelson proto-oncogene) e no cromossoma 22 o gene BCR(Breakpoint Cluster Region gene) originando um gene quimera codificando 1 protena com capacidade oncognica. O cromossoma Ph mais frequente, surge em cerca de 90% dos casos de CML, e variantes citogenticas surgem em mais 5%. Dos restantes 5%, cerca de metade possui rearranjos do gene ABL no detectados por cariotipagem, mas visveis por mtodos moleculares, sendo os restantes 2.5% considerados Ph-. O cromossoma Ph ainda frequente em Leucemias Linfoblsticas Agudas (ALL; 5% das crianas e 20% dos adultos), e mais raramente em Leucemias Mieloblsticas Agudas (AML; cerca de 1%).

E2A AML1 NPM e AF4i

ENLi FGFR-1

tirosina cinase zinc finger fosfoproteina factor de transcrio transduo de sinal

guanosina trifosfatase receptor acido retinoico gene da miosina gene hometico

4.2.1.2.1

t(9;22) - b c r / a b l

A primeira anomalia cromossmica consistente em tumores humanos foi identificada por Nowell e Hungerford na Leucemia Mielide
4.25 4.26

O cromossoma Ph , como vimos, originado pela juno de parte dos genes BCR e ABL. Esta juno, ocorre sempre no mesmo ponto no gene ABL, mas pode ocorrer em 3 locais diferentes do gene BCR. Estas diferentes junes, do origem a 2 tipos de protenas: a p190, resultante da juno do exon e1 do gene BCR com o a2 do gene ABL (transcrito e1a2) e a p210 resultante da juno do exon a2 do gene ABL com os exons b2 ou b3 do gene BCR (transcritos b2a2 e b3a2). A vasta maioria dos casos de CML (95%) expressam a protena p210. J na ALL, cerca de 70% dos casos de ALL expressam a p190, e os restantes 30% a p210.
4.2.1.2.2 t(15;17) pml/rar

Cerca de 10% das FAB-M3 so negativas para a t(15;17), e no respondem clinicamente ao ATRA. Os restantes 90% foram constituem uma entidade clinica denominada Leucemia Aguda Promieloctica (APL) sendo citogenticamente caracterizados pela presena da translocao t(15;17)(q22;q21). Os genes envolvidos na translocao so o gene PML no cromossoma 15, e o gene RAR (Receptor do Acido Retinico) no cromossoma 17. Os pontos de rotura no locus RAR no esto distribudos ao acaso, mas localizados numa zona de 16 Kb do intron 2. De igual modo, os pontos de rotura no locus PML no so aleatrios, concentrando-se em apenas 3 regies do gene: intron 3 (bcr3: 47% dos casos), exon 6 (bcr2: 4% dos casos), e intron 6 (bcr1: 49% dos casos). Como consequncia da translocao, formamse genes quimera (PML/RAR e RAR /PML). O gene quimera PML/RAR transcripcionalmente funcional, pelo que origina uma espcie de mRNA passvel de deteco por RT-PCR. Foi assim possvel determinar a presena deste transcrito em 100% dos casos de APL ( em contraste com apenas 70% dos casos expressando o gene RAR /PML), esta uma tecnologia de grande valor na deteco de doena residual mnima nesta patologia.

Figura 3 - Os genes BCR e ABL normais, e as translocaes que originam as protenas p190 e p210 do gene quimera BCR-ABL. A protena p210 caracterstica da CML, sendo a p190 a protena BCR-ABL encontrada na maioria dos casos de ALL (ver texto).

4.27

4.28

Desta forma, foi sugerido que um teste positivo deve ser indicativo da continuao do tratamento, ao passo que doentes com 2 testes negativos, e mais de 2 meses de remisso completa, podem ser poupados a sesses teraputicas.

4.2.2 Dele ces cromossmicas em hematooncologia 4.2.3 Mutaes pontuais em hemato-oncologia

4.2.3.1 mutaes n o g e n e p 5 3

Apesar de anomalias citogenticas envolvendo 17p13 serem raras, o gene p53 a localizado encontra-se mutado (como determinado por SSCP) em 10-15% dos casos de LLC. Os doentes com deleces ou translocaes que envolvem esta zona, possuem quase invariavelmente mutaes deste gene. Existe ainda uma forte correlao entre a existncia de mutaes no gene p53, e um estadio avanado, resistente quimioterapia, e curta sobrevida. 4.3 Patologias hemato-oncolgicas 4.3.1 LMC 4.3.2 LMA 4.3.3 LLA 4.3.4 LLC 4.4 Utilidade clnica da gentica molecular em hemato-oncologia Uma vez que o gene quimera BCR-ABL apenas expresso nas clulas malignas, a sua deteco molecular constitui um poderoso mtodo de avaliar a progresso da doena. Com efeito, vrios autores servindo-se da grande sensibilidade e especificidade da metodologia de PCR (reaco em cadeia de polimerase), desenvolveram estratgias para avaliar a doena residual mnima, inferindo mesmo dados vlidos na avaliao de prognstico. Foi assim possvel observar que se frequente a deteco permanente ou intermitente de clulas residuais BCR-ABL+, vrios meses aps transplante de medula e remisso citogentica completa, j a sua deteco 1 ano aps o transplante

Figura 4 - A localizao cromossmica e estrutura normal dos genes PML e RARa, e a translocao t(15;17)(q22;21) que origina o gene quimera PML-RARA.
4.29

4.30

indicadora de pior prognstico que o dos casos em que se observe remisso por PCR. No obstante estes dados, a validade da avaliao de prognstico com base nos dados obtidos por PCR constitui, presentemente motivo de aceso debate e estudo.
PML/RAR

Se os estudos efectuados no final do tratamento parecem ter pouco valor prognstico, j os estudos efectuados mais tarde parecem ter grande valor prognstico, com resultados positivos em RT-PCR a indicarem uma recada. Com efeito, estudos de doentes em remisso por perodos prolongados de tempo (4-12 anos) revelaram que a sobrevida est associada com a erradicao das clulas PML/RAR, pelo que este deve ser o objectivo teraputico. 4.4.1 4.4.2 4.4.3 Aprofundamento de conhecimentos Escolha de tratamentos especficos Monitorizao da doena

4.31

Captulo 5
5 reas de interveno da gentica molecular em hematologia

5.1

5.2

5.1 - DOENAS GENTICAS DO GLBULO RUBRO 5.1.1 - Anemias No esferocticas Congnitas

5.1.1.1 - Deficincia em Glucose-6-fosfato desidrogenase

A deficincia em i (G6PD) uma anomalia gentica muito frequente, sendo estimado que afecte cerca de 400 milhes de indivduos em todo o mundo. A maioria dos portadores desta deficincia assintomtica, correndo no entanto o risco de desenvolver anemias hemolticas agudas, quando expostos a certas infeces, drogas, ou ingesto de favas. Uma pequena poro dos portadores da deficincia sofre de uma doena mais pronunciada: anemia no-esferocitica congnita.

(Xq28). Este gene expresso em todas as clulas do organismo, sendo essencial viabilidade celular. At ao momento foram identificadas 75 mutaes de G6PD, correspondendo a mais de 100 variantes enzimticos. As mutaes constituem quase exclusivamente mutaes Missense, causando portanto a substituio de um nico aminocido. Dois grupos de situaes so de relevncia clinica: a primeira composta pelas mutaes que afectando a actividade enzimtica, deixam no entanto actividade suficiente para o metabolismo normal do eritrcito. Neste caso, os portadores so assintomticos, enquanto no existirem factores externos propensores ao desenvolvimento de anemia hemoltica aguda. No segundo caso, a deficincia em G6PD to severa, que os indivduos desenvolvem anemia no esferoctica congnita. A caracterizao das deficincias genticas da G6PD permitiu verificar que mutaes diferentes podem originar uma deficincia com semelhantes caractersticas bioqumicas, e vice-versa.
5.1.1.2 - Deficincia em piruvato quinase

A Deficincia em Piruvato Quinase (PKD) a causa mais comum de Anemia Hemoltica No Esferoctica Hereditria. Geralmente assintomtica nos portadores (heterozigticos), a deficincia de Piruvato Quinase manifesta-se nos indivduos homozigticos (ou duplamente heterozigticos) como anemia hemoltica crnica, com severidade varivel. Figura 1 - Gel de sequenciao do exon 5 do gene ALAS2, indicando uma transverso C para A na posio 547, prevendo a substituio de uma Phe por uma Leu no aminocido 165 da enzima. No Homem existem dois genes de piruvato quinase: PKLR (codificando as isoenzimas L e R) e PKM2 (codificando as isoenzimas M1 e M2). o primeiro o nico habitualmente expresso em eritrcitos, sendo o responsvel pela PKD nestas clulas. A caracterizao bioqumica da PK permitiu identificar cerca de 300 variantes enzimticos, no entanto a caracterizao molecular das mutaes que afectam o gene da PK permitiu verificar uma heterogeneidade mais limitada, j que a mesma mutao parece estar
5.4

A G6PD um homodimero. O gene que codifica o respectivo polipptido de 514 amimocidos extremamente conservado na escala evolutiva, estando localizado no homem no cromossoma X
5.3

associada a variedades bioqumicas diferentes (ex.: PK Nagasaki, PK Tquio e PK Beirut resultam da mutao 1151 ACCG-ATG, e as variantes PK Fukushima e PK Maebashi resultam da mutao 349 CAG - AAG). As mutaes encontradas gene PKLR, responsveis pela PKD, incluem mutaes tipo missense, nonsense e inseres. Estas mutaes foram encontradas quer na regio codificante quer na regio promotora. De grande utilidade nos estudos familiares da PKD foi a descoberta de polimorfismos de microssatlites no intron 11, bem como de um polimorfismo C/A na posio 1705, os quais podem ser utilizados para seguir os hapltipos herdados dos progenitores.
5.1.1.3 - Deficincia em -aminolevulinato sintetase (Anemia sideroblstica)

5.1.2 - Talassmias (anomalias das e globinas)

A enzima -aminolevulinato sintetase (ALAS) catalisa o primeiro passo da sntese do grupo heme. Nos vertebrados existem 2 formas de ALAS: uma forma transcrita constitucionalmente em todas as clulas, e uma forma apenas existente nas clulas eritrides. No Homem, a forma eritride (ALAS2) codificada num gene localizado no cromossoma X (Xp11.21), estando a sua actividade reduzida na anemia sideroblstica ligada ao cromossoma X. Que a origem da anemia sideroblstica est relacionada com este gene ficou claramente demonstrado quando em 1992 Bishop descreveu a primeira mutao neste gene, e a sua segregao ao longo de 8 geraes de uma famlia afectada. A identificao molecular desta mutao, permitiu ainda pela primeira vez desenhar mtodos de diagnstico e estudo de transmisso familiar para esta doena.

5.5

5.6

A -talassmia resulta da produo deficiente das cadeias da hemoglobina embrinica (22), fetal (22) e adulta (22). As formas mais frequentes de alfa talassmia consistem na deleco de um ou ambos os genes do cromossoma 16. Desta forma, os portadores de talassmia possuem 3 (/) ou dois (/, /) genes, ao passo que os doentes possuem apenas 1 gene ( /). Os doentes com sndroma de Hb Barts

Fig ura 2 - Os clusters dos genes da globina nos cromossomas 11 e 16 (a). Durante a vida enbrionica, fetal e adulta, os genes activados e suprimidos so diferentes (b). As diferentes cadeias da globina so sintetizadas independentemente, associando ento para for

Os loci genticos das - e -globinas incluem vrios genes arranjados em clusters. O cluster humano da -globina, inclui um gene enbrinico (2), dois genes fetais/adultos (2 e 1), e vrios pseudogenes (1, 2 e 1) bem como um gene sem funo conhecida (1). Os genes da globina so expressos em nveis muito elevados nas clulas eritrides, mas no so expressos em nenhuma outra clula.
5.7

hydrops fetalis no possuem genes (/). Outras causas menos frequentes de -talassmia so mutaes pontuais no gene da -globina, e muito raramente em elementos reguladores destes genes. A -talassmia caracteriza-se por uma sntese reduzida da -globina, levando a um desequilbrio da sntese das cadeias /no que o factor major na gravidade da doena.
5.8

IVS-1-110 -A codon 6

IVS-1
IVS-1-6 IVS-1-1

IVS-2

39 37

Figura 3 - Posies das mutaes do gene da globina mais frequentes na zona mediterrnica.

anos 80 esta era a estratgia de eleio para o screening da talassmia. Esta tecnologia era ento complementada com a clonagem e sequenciao Figura 4 - Distribuio geogrfica de dos genes algumas mutaes na -globina mutantes, completando-se assim a caracterizao destes. Com o desenvolvimento da tecnologia de PCR em 1985, foi possvel amplificar o gene da -globina directamente a partir de DNA genmico, sequenciando directamente os produtos amplificados, facilitando deste modo a caracterizao das mutaes. Ao contrrio das mutaes causadoras de -talassmia, as talassmias so geralmente formas no delecionadas, podendo ocorrer na regio codificante do gene, ou na regio promotora. Existem mutaes particularmente frequentes em determinadas comunidades, o que aliado tecnologia de PCR em combinao com a utilizao de reaces de restrio, simplifica grandemente a deteco e caracterizao de mutaes em estudos de sreening, e de modo particular em estudos familiares.

Os genes da -globina esto arranjados num cluster no brao curto do cromossoma 11, na ordem 5-3. O cluster contem muitos polimorfismos de restrio (RFLP). Uma caracterstica destes polimorfismos, que a sua associao s vrias formas de -globina no ao acaso. Assim, em cada populao foi encontrado um nmero limitado de hapltipos (padro de arranjos dos RFLP), pelo que a anlise destes hapltipos fornece informao clnica (dependente do background genmico em que as mutaes ocorrem). No incio dos
5.9

5.10

5.1.3 Drepanocitose

5.1.4 Anemias Hemoliticas esferociticas As clulas vermelhas devem as suas propriedades mecnicas como a resistncia, elasticidade e deformabilidade a uma rede proteica (citoesqueleto) que suporta o folheto bilipidico da sua membrana celular, do lado citoplasmtico, e a proteinas integrais da membrana. As proteinas do citoesqueleto ligam-se s proteinas integrais da membrana, formando uma estrutura responsvel pela manuteno da forma do eritrcito, e pelas suas propriedades mecnicas. Entre as proteinas integrais de membrana do eritrcito encontram-se o transportador de anies (banda 3), asglicoforinas, o transportador de glicose, uma variedade de transportadores de caties, e as proteinas dos grupos sanguneos. O citoesqueleto essencialmente formado por
5.11 5.12

espectrina, actina, anquirina, proteina 4.1 e proteina 4.2. Os heterodimeros de espectrina organizam-se numa rede em mdia hexagonal, a qual se liga banda 3 por pontes formadas pela ankirina, ou pela actina, banda 4.1 e glicoforina.

A esferocitose Hereditria uma patologia heterognea em termos da sua apresentao clinica, modo de transmisso e hereditariedade. Pode ser descrita como uma anemia hemolitica caracterizada pela presena de eritrcitos esfericos, com baixa resistncia osmtica, os quais so selectivamente retidos e destruidos no bao. Estas caracteristicas parecem dever-se a um enfraquecimento das ligaes entre o citoesqueleto e a membrana, as quais podem ser devidas a deficincias em vrias proteinas. Em cada uma destas proteinas, surgem variadissimas mutaes causadoras deste fentipo, o que justifica a sua heterogeneidade clinica e de transmisso. Cerca de 40% dos casos de HS apresentam mutaes afectando o gene da anquirina. Mutaes tipo frameshift causam alteraes estruturais muito grandes na proteina, causando formas dominantes (anquirina de estutgarda, e anquirina de Marburg). Alteraes menos severas so causadas por mutaes pontuais, e originam formas recessivas (anquirina de Dsseldorf, anquirina de Walsrode). Em alguns casos, as alteraes s so visveis no mRNA, j que resultam de junes splicing anormais (anquirina de Praga, anquirina de Rakivnik). Cerca de 20 a 30% dos casos de HS resultam de mutaes no gene da proteina banda 3 (mutao de Praga e mutao de Coimbra). Outro tipo de mutaes (mutante de Tuscaloosa e mutante de Montefiore), ocorrendo na zona citoplasmtica da banda 3, causam perturbaes na sua ligao proteina 4.2, resultando num menor nvel desta proteina na membrana eritrocitria. Podem ainda causar esferocitose mutaes nos genes da proteina 4.2 (ELB42), e das alfa e beta espectrinas (SPTA1 e SPTB).
5.1.4.2 - Deficincia grave de protena 4.2

Figxxx esquema da organizao do citoesqueleto do eritrcito. A esferocitose hereditria (HS), eliptocitose hereditria (HE) e a sua forma agravada Poiquilocitose hereditria (HP) so um conjunto heterogneo de anemias hemolticas congnitas. Estas patologias resultam de alteraes nas protenas integrais da membrana eritrcitria, e seu citoesqueleto.
5.1.4.1 Esferocitose Hereditria (HS)

A esferocitose hereditria a patologia mais frequente da membrana eritrocitria. A sua frequncia foi estimada em 1:5000 nascimentos, mas este valor pode ser uma estimativa por baixo se considerarmos que os portadores podem ser assintomticos, e que cerca de 1% dos dadores de sangue apresentam fragilidade osmtica aumentada.
5.13

A total, ou quase total ausncia de banda 4.2 resulta num quadro clnico diferente da HS. Os esfercitos no existem, e a fragilidade osmtico pouco alterada. A hemlise muito severa, e o padro de
5.14

transmisso recessivo. Foram identificados 4 mutantes do gene da protena 4.2, os quais esto na origem deste quadro clnico (mutante de Nippon, mutante de Toseur, e mutante de Lisboa).
5.1.4.3 Eliptocitose e poiquilocitose Hereditria

downstream (o nico existente no percursor do eritrcito), e uma deleco de um aminocido no local de ligao do complexo actinaespectrina. Outros exemplos de defeitos a este nvel constituem os alelos que originam erros de splicing. Mutaes raras originam a falta de glicoforina C. Como a protena 4.1 se liga glicoforina, a falta desta origina a falta de proteina 4.1. 5.2 DOENAS GENTICAS EM HEMOSTASE A hemostase, constitui um riqussimo campo de interveno da gentica molecular no diagnstico, estudos familiares e rastreio populacional, j que o nmero de mutaes e polimorfismos associados a doenas genticas em hemostase relativamente elevado (tabela 1). As tcnicas utilizadas para o estudo das doenas genticas em hemostase cobrem o espectro completo das tcnicas de gentica molecular, sendo portanto um ptimo exemplo da larga gama de tecnologias hoje disponveis para estes estudos (tabela 1). 5.2.1 - Resistncia protena C Activada (mutao FV-Leiden) Recentemente, apenas 10% dos indivduos que apresentavam tromboembolismo venoso possuam uma anomalia gentica predispondo doena. Este grupo de doentes tinha uma deficincia absoluta ou funcional de um dos principais componentes dos mecanismos de regulao da coagulao (ATIII, Prot.C, Prot.S). Recentemente, um novo mecanismo foi encontrado para justificar esta patologia: a Resistncia Proteina C Activada (APCR). Este mecanismo, estando implicado na origem de cerca de 50% dos casos de trombose venosa (dependendo da seleco dos casos), parece ter origem numa mutao pontual do gene do Factor V (Factor V de Leiden). hoje habitualmente aceite que todos os casos de APCR tm origem nesta mutao, a qual est presente em cerca de 5% da populao normal, sendo cerca de 20-50% dos doentes com tromboembolismo
5.16

A heliptocitose hereditria, e a sua forma agravada a poiquilocitose hereditria constituem um grupo heterogneo de patologias caracterizadas pela presena de eritrcitos com forma heliptica. O quadro clinico muito variado, desde condies assintomticas at presena de hemolise clinicamente significativa. A Eliptocitose apresenta-se habitualmente com transmisso dominante, enquanto a poiquilocitose apresenta transmisso recessiva. A poiquilocitose apresenta ainda fragmentao dos eritrcitos microesferocitose e instabilidade trmica. Genticamente a eliptocitose deriva de um conjunto de mutaes localizadas na regio de dimerizao das espectrinas, ou de mutaes originando uma reduo de proteina 4.1. So conhecidas 25 mutaes de -espectrina, as quais se localizam em zonas onde perturbam o processo de auto-associao. Dependendo de o alelo no mutado ser de alta ou baixa expresso, assim a mutao pode ter uma representao suave ou mais acentuada. Todas as mutaes de -espectrina conhecidas que originam HE localizam-se na repetio 17, a qual contm o local responsvel pela auto-dimerizao. Mutaes pontuais na hlice 2 ou mesmo na hlice 1 desta repetio possuem um padro de transmisso recessivo. No entanto outras mutaes, ocasionando truncagens de -espectrina so transmitidas segundo um padro dominante. Cerca de 30% dos casos de HE resultam de alelos Null (no expressos ou no funcionais) do gene da proteina 4.1. Esta condio clinicamente silenciosa na forma heterozigtica. Duas mutaes foram descritas: uma mutao pontual no codon de iniciao
5.15

portadores heterozigticos desta mutao. No entanto, no parece haver um aumento da frequncia de portadores da mutao em doentes que tenham sofrido enfarte do miocrdio ou ataque cardaco, sugerindo um papel limitado na doena arterial. A presena da mutao, a qual pode ser facilmente detectada por PCR seguido de corte por enzima de restrio, aumenta em cerca de 8 vezes o risco de tromboembolismo. Este risco pode ainda ser aumentado por factores adicionais, que podem ser genticos ou adquiridos.
Factor V exon 10 FV-10A PCR

5.2.2 Mutaes no gene d a Protrombina Tabela 1 - Resumo de polimorfismos identificados em genes responsveis por doenas hemorrgicas e trombticas hereditrias
Gene F VIII Localizaoa) Intron 13 Intron 18 Intron 19 Intron 22 Intron 22 Intron 1 Intron 3 Intron Extr. 3 Intron 2 Intron 2 Exon 14 Exon 18 Intron 19 Exon 28 Exon 28 Intron 40 7 Kb 5 Exon 1 Exon 6 Exon 8 Exon 15 Extr. 5 Exon 4 Tipo de polimorfismo Repetio CA RFLP RFLP RFLP Repetio CA RFLP RFLP RFLP RFLP RFLP RFLP RFLP RFLP RFLP RFLP RFLP Repetio(TCTA)
n

F IX

FV-506*

vWF

Normal 5--- GACAGGC G AGCTTTACAG---3 Mutado 5--- GACAGGCAAGCTTTACAG---3 HIND III

Figura 5 - Estratgia de identificao da mutao FV-Leiden. O exon 10 do factor V amplificado por PCR. O fragmento amplificado contem um local de restrio para Hind III no caso de existir a mutao, mas no no caso do gene no mutado.

Enzima de restrrio BclI Hind III XbaI DdeI XmnI TaqI HhaI SmaI HhaI AccI RsaI MspI HphI BsteII MspI RsaI XbaI BstXI PstI DdeI -

N Alelos Heterozigozidade (%) 8 80 2 42 2 42 2 48 2 44 2 36 2 41 2 45 2 48 2 45 2 45 2 46 2 45 2 44 2 50 2 46 8 75 2 2 2 2 2 2 2 2 >10 42 48 48 45 49 37 37 50 28

PC

PS ATIII

RFLP RFLP RFLP Sequncia RFLP Distncia RFLP RFLP Repetio (ATT)n

a)

Nos introns a numerao corresponde ao nucletido , nos exons a numerao corresponde ao aminocido; Extr.=extremidade

5.17

5.18

5.2.3 - Doena de von Willebrandt (Mutaes no gene do vWF) A doena de von Wildebrand (VWD) a mais comum doena hemorrgica no homem, sendo causada por uma deficincia qualitativa ou quantitativa no factor de von Wildebrand n(VWF). Esta doena pode ser transmitida segundo padres dominantes ou recessivos, de acordo com a mutao em causa. A clonagem do gene do VWF (180 Kb, contendo 52 exons, e localizado em 12p12) permitiu a identificao molecular das mutaes responsveis pela WWD. Os estudos iniciais permitiram a identificao de deleces neste gene. Contudo, e devido dimenso do gene do VWF, a maior parte dos estudos posteriores centraram-se em zonas do gene importantes para funes determinadas da protena, nomeadamente a dimerizao e processamento intracelular (exons 116), ligao ao factor VIII (exons 17-25), ligao a colagnio (exons 28-34). Neste sentido, a classificao funcional do VWF constitui um valioso auxiliar no estudo gentico de cada doente, j que permite concentrar esforos numa rea restrita de um gene excessivamente longo para ser estudado por inteiro. 5.2.4 - Trombose familiar (Mutaes nos genes da Antitrombina III, Protena C e Protena S) Existem essencialmente 2 mecanismos inibidores da actividade das protenases de serina envolvidas na coagulao: antitrombina III (ATIII), e o sistema Protena C (PC)- Protena S (PS)trombomudolina (TM). A falha dos mecanismos inibidores predispe para a trombose, e esta predisposio pode ser hereditria, como ficou demonstrado pela primeira vez em 1965 para a antitrombina (Egeberg et al., 1965). Desde ento ficou demonstrada uma forte relao entre deficincias da PC e PS e tromboembolismo venoso.
5.19

A identificao de deficincias hereditrias a nvel molecular da deficincia em antitrombina III ocorreu em 1984. Desde ento, os avanos na gentica molecular dos inibidores permitiu a identificao de outros defeitos genticos, permitindo assim estudar a transmisso nas famlias afectadas. O gene da antitrombina III est localizado em 1q23-25, tendo 13.5 Kb e 7 exons. A sequenciao dos exons permitiu a identificao de um nmero considervel de mutaes pontuais originando deficincia tipo I. A mutao mais comum consiste numa alterao da fase de leitura (Shift mutation), a qual resulta na presena de um codo stop prematuro. Outras alteraes frequentes envolvem a formao de codes stop directamente resultantes de uma mutao pontual. A deficincia tipo II parece resultar em todos os casos de uma mutao pontual ocasionando a alterao de um aminocido. Parece existir uma forte correlao entre a localizao do aminocido substitudo, e a alterao funcional observada: alterao dos aminocidos 24,27 e 129 (aminocidos positivamente carregados), ou dos aminocidos 41 e 99 (aminocidos electricamente neutros) origina uma reduo na afinidade para a heparina (negativamente carregada); mutaes nos aminocidos 382-394 resultam na deficiente inibio da trombina; mutaes nos aminocidos 402-407 e 429 produzem mutantes com alteraes mltiplas. O gene da PC (uma glicoprotena dependente da vitamina K foi ) localizado em 2q13-14. Trata-se de um gene com 12 Kb e 9 exons. A sequenciao deste gene permitiu a identificao de vrias mutaes associadas deficincia de Protena C tipo I com um predomnio de substituies de aminocidos. O gene da PS (uma proteina do plasma dependente da vitamina K) est localizado no cromossoma 3 (3p11.1-11.2, possui cerca de 80Kb de DNA e contem 15 exons. Na sua vizinhana encontra-se ainda um pseudo-gene com uma estrutura muito homloga. Os estudos para a
5.20

identificao de mutantes nesta protena so ainda poucos, mas foram j encontrados vrios mutantes, responsveis pelas deficincias de PS observadas. 5.2.5 - Hemofilias (Mutaes nos genes dos factores VIII e IX) A hemofilia A uma das doenas hemorrgicas mais frequentes, sendo causada por uma deficincia do factor VIII (FVIII) circulante, cujo gene est localizado no cromossoma X (Xq28). A doena heterognea, tanto a nvel molecular, como a nvel da severidade clnica. A dimenso do gene do FVIII impediu at pouco tempo atrs a anlise gentica das mutaes causando o gene, dificultando a caracterizao da transmisso familiar. O uso de polimorfismos intragnicos ou extragnicos permitiu no entanto recentemente iniciar uma caracterizao precisa do cromossoma X dos familiares de indivduos afectados. Esta estratgia, no pode no entanto ser universalmente empregue, j que nem sempre existem marcadores polimrficos associados mutao em causa. Nestes casos, apenas a determinao da mutao especfica permite estudar com clareza os indivduos em causa. Neste intuito, um esforo considervel foi desenvolvido no sentido de empregar mtodos de identificao de alteraes genticas pontuais, obviando sequenciao de grandes extenses genmicas. Com este propsito, tcnicas como single strand conformation polimorphism (SSCP),denaturing gradiente gel electroforese (DGGE) e chemical cleavage of mismatch (CCM) foram utilizadas com sucesso na identificao de mutaes. Estes estudos permitiram determinar que a maioria dos doentes com doena moderada ou suave possuem mutaes tipo missense, enquanto a maioria dos doentes graves possuem mutaes tipo frameshift. Em alguns casos de doena grave foi ainda possvel identificar um defeito no splicing dos exons 22-23. A hemofilia B uma doena hereditria de transmisso recessiva, devida total ausncia, ou quantidades reduzidas de factor IX (FIX).
5.21

O gene do FIX foi totalmente sequenciado, contendo 8 exons. Cerca de 40% dos aminocidos do FIX parecem ser essenciais para a funo da protena, pelo que no de admirar que a doena seja causada por um largo espectro de mutaes. Assim, e uma vez que no possvel dirigir o estudo para u regio especfica do gene, as tcnicas de ma estudo que tm sido utilizadas para identificar as mutaes causadoras da Hemofilia tm sido essencialmente as mesmas tcnicas acima descritas. 5.3 - HEMOCROMATOSE A hemocromatose hereditria (HH) uma doena gentica de transmisso autossmica recessiva. Contrariamente ao que se pensava, sabemos hoje que a hemocromatose no uma doena rara, j que a sua frequncia comparvel da anemia da Sickle cell, fibrose cstica ou distrofia muscular (Nichols & Bacon, 1 989). Foi estimado que s nos Estados Unidos devem existir entre 600,000 e 1,000,000 de doentes, bem como cerca de 27,000,000 de indivduos portadores do gene (Nichols & Bacon, 1989). A HH caracterizada por uma falha na regulao da absoro do ferro da dieta, mantendo-se a absoro mesmo na presena de altos nveis de ferro armazenado (Alper et al., 1951; Cox & Peters, 1978; Williams et al., 1986; Lynch et al., 1989; Whittaker et al., 1989). Os indivduos com HH possuem depsitos de ferro superiores a 4 g, no sendo raros indivduos com depsitos superiores a 20 g, contrastando assim com os habituais 500-1000 mg nos indivduos normais (Nichols & Bacon, 1989). O quadro completo de HH envolve a deposio de ferro em vrios rgos, nomeadamente: fgado, resultando em cirrose heptica; corao com diminuio da funo cardaca e perturbao do ritmo; articulaes com formao de poliartropatia; pele, com formao de pigmentao drmica caracterstica; e glndulas endcrinas, originando falhas endcrinas como diabetes e gonadopatias (Milder et al., 1980).
5.22

A hemocromatose hereditria, no sendo uma doena para a qual exista uma cura no entanto facilmente tratvel por flebotomias (Bomford & Williams., 1976; Niederau et al., 1985). O tratamento ainda que seja meramente correctivo, e por isso exija interveno durante toda a vida do doente, bastante eficaz, consistindo numa primeira fase em 1 a 2 flebotomias semanais (tratamento intensivo), a que se seguem, aps a depleo dos depsitos de ferro, flebotomias mensais ou trimestrais (tratamento de manuteno). Uma vez que a sobrecarga de ferro passvel de correco, a hemocromatose hereditria, como modelo de estudo da interaco entre o metabolismo do ferro e o sistema imunolgico, tem a grande vantagem de nos fornecer dados sobre a direco das interaces. Com efeito, se a sobrecarga de ferro exercer um efeito fisiologicamente relevante no sistema imunolgico destes indivduos, a remoo da sobrecarga dever corrigir esse defeito. Inversamente, se o sistema imunolgico tiver uma aco relevante na homeostase do ferro, ento esta dever preceder a sobrecarga de ferro, no sendo corrigida com a remoo de ferro. A origem precisa do erro na regulao da absoro do ferro na HH constitui ainda hoje um mistrio, tal como o a identidade do gene ou genes responsveis pela doena. No entanto, e dada a aparente falta de relao entre a doena e perturbaes da funo imunolgica clssica (ocorrncia de infeces, a j descrita estreita associao entre o fentipo HLA-A3 e o caractere hemocromatose (Simon, 1975, 1977a, 1977b) tem vindo a ser interpretado pelos geneticistas como indicador da estreita ligao fsica entre o locus HLA-A e o gene da hemocromatose(Simon, 1977a). 5.3.1 - Estudos de marcadores genticos no locus do HLA Devido estreita associao entre o locus HLA-A no cromossoma 6 (6p21.3) o gene da hemocromatose, nos ltimos anos tem-se assistido a um crescente ritmo de estudo de marcadores polimrficos tipo
5.23

microssatlite nesta regio do genoma humano, procurando-se definir marcadores mais estreitamente ligados hemocromatose que o prprio HLA-A3. No momento presente esto disponveis vrios microssatlites, cuja segregao familiar permite definir hapltipos estendidos, dando maior rigor que a determinao HLA classificao dos familiares como homozigticos ou heterozigticos, bem como na determinao de indivduos potencialmente portadores do gene em estudos de screening da populao. Deve no entanto notar-se que para o estudo da populao normal, os estudos genticos na hemocromatose so muito limitados, servindo apenas de elemento de apoio aos dados bioqumicos mais relevantes como os nveis sricos de ferritina, de transferrina, de ferro, e a taxa de saturao da ferritina 5.3.2 - Estudos dos IRE e IRP Os IRE (do ingls Iron Responsive Elements) so sequncias existentes nos mRNA do receptor da transferrina, ferritina, aconitase mitocondrial e eALAS (5-aminolevulinato sintetase). Trata-se de sequncias muito conservadas na evoluo (95% entre o homem, o rato e a galinha no caso do receptor da transferrina), e que possivelmente permitem a formao de uma estrutura no mRNA em forma de ansa (Khn, 1994). Estas sequncias so as principais responsveis pela regulao ps-translacional dos genes a que pertencem, conferindo-lhes a capacidade de se modularem dependendo da concentrao intracelular de ferro (Khn, 1994). Esta regulao mediada por uma protena citoplasmtica denominada IRP (do Ingls Iron Responsive Protein), mas previamente tambm conhecida como IRF, IRE-BP e FRP (Mllner et al., 1989; Rouault et al., 1988; Walden et al., 1988). O efeito regulador do IRE (e consequentemente da IRP) depende da localizao do IRE no mRNA. No mRNA do receptor da transferrina, os 5 IREs esto presentes na regio 3 no traduzida, pelo que a ligao da IRP aumenta a estabilidade do mRNA, prolongando o seu
5.24

tempo de semi-vida (Khn, 1994). No caso do mRNA dos genes da ferritina, da aconitase mitocondrial e da eALAS, o IRE encontra-se situado na regio 5 no traduzida do mRNA, a curta distncia da sequncia CAP, pelo que a ligao da IRP bloqueia a iniciao da traduo pelos ribossomas (Khn, 1994). A IRP uma protena bi-funcional (Klausner et al., 1993; Hirling et al., 1994). Na presena de ferro, a sua capacidade de ligar aos IRE mnima, o que pode derivar da incorporao de 1 grupo 4Fe-4S na protena. Nestas condies, a IRP capaz de funcionar como aconitase citoplasmtica, catalisando a formao de isocitrato (Emery-Goodman et al., 1993). Pelo contrrio, na ausncia de ferro, a IRP liga-se com grande especificidade aos IRE, perdendo a actividade de aconitase. O sistema imunolgico parece utilizar este duplo papel do IRP para controlar a sua actividade, e assim controlar o metabolismo intracelular do ferro. Experincias descritas em 1993 por Drappier et al., comprovam a existncia de efeitos reguladores de citoquinas, nomeadamente do IFN- e TNF- na induo da ligao de IRP a IRE em macrfagos em cultura devido modulao da sntese de xido ntrico proveniente da via da L-arginina (Drappier et al., 1993). O xido ntrico, merc da sua reduzida dimenso tem acesso directo ao ncleo 4Fe-4S da IRP, onde induz a sua degradao (Khn, 1994). Assim, a presena de xido ntrico (regulada pelo IFN- e TNF-) um factor tendente a aumentar a pool de IRP capaz de ligar ao IRE, diminuindo a pool capaz de funcionar como aconitase (Khn, 1994).

5.3.3 - Estudos Genticos do Repertrio da Clula T Os resultados do grupo da Prof. Maria de Sousa, revelando a existencia de uma correlao entre a razo CD4/CD8 e os niveis de ferro dos doentes, levou este mesmo grupo a procurar anomalias no repertrio das clulas T nesta patologia. Este estudo revelou a existncia de uma correlao entre anomalias na representao do TCR V6.7 entre as clulas CD8+ e a severidade da expresso clnica da doena, nomeadamente o desenvolvimento de cirrose heptica. Estes resultados, sugerindo intervenes do sistema imune na regulao de sistemas internos, reforam a viso crescente do sistema imune como um sistema regulador, no s das potencialmente nocivas interferncias externas, mas tambm das frequentemente fatais perturbaes dos delicados equilibrios homeostticos internos do organismo. Esta interpretao faz com que estes reultados tenham implicaes clnicas de grande relevo no s na hemocromatose hereditria mas tambm em todas as formas de sobrecarga de ferro (Porto, 1993; Cabeda, 1995).

5.25

5.26

Captulo 6
6 MTODOS DE ESTUDO EM GENTICA MOLECULAR

6.1

6.1 MTODOS NO COMERCIAIS 6.1.1 Preparao de DNA e RNA Qualquer anlise em gentica molecular requer, obviamente, o estudo do DNA ou do RNA, pelo que o primeiro passo em qualquer tcnica gentica consiste no isolamento e purificao de uma ou mesmo das espcies de cidos nucleicos. As variadas tcnicas disponveis para esse efeito, as quais originam DNA ou RNA com diferentes propriedades de pureza e integridade fsica, possuem princpios semelhantes. Todas se iniciam com uma lise suave das clulas a estudar, seguida de ataques enzimticos e/ou qumicos para destruir os componentes proteicos da mistura. Finalmente, a purificao do DNA ou RNA faz-se por um de vrios mtodos, de acordo com os objectivos pretendidos. A purificao e correcto manuseamento de RNA bem mais difcil que para o DNA. Este facto no resulta de uma maior complexidade de procedimentos, mas da maior estabilidade das RNAses. Com efeito, ao contrrio das DNAses, as RNAses so extremamente estveis, e no necessitam de cofactores para funcionarem. Desta forma, no possvel inactiv-las com a adio de quelantes do magnsio (EDTA) como acontece para as DNAses. A inactivao

Figura 6.1 A Purificao de DNA ou RNA por adsoro em coluna o mtodo mais rpido disponvel. O DNA ou RNA produzido de qualidade suficiente para a realizao de PCR ou RT-PCR, mas devido fragmentao que ocorre no utilizavel para Southern Blot.
6.2 6.3

das RNAses eficiente com a utilizao de dietilpirocarbonato (DEPC), mas a alta toxicidade deste composto, aliada necessidade da sua eliminao por autoclavagem, impede a sua utilizao em todas as solues. Em reaces enzimticas possvel utilizar inibidores especficos de RNAses (RNAse inibidor ou abreviadamente RNAsin), como o extrado do tecido placentrio, para inactivar as RNAses provenientes do material celular donde extrado o RNA. Este no , no entanto, um mtodo prtico para o tratamento generalizado dos reagentes e material de plstico do laboratrio. Se aliarmos a este facto, a presena em grandes quantidades de DNAses e RNAses nas mos humanas, facilmente se compreende a imperiosa necessidade de utilizar luvas no laboratrio de Gentica Molecular, no para a proteco do operador, mas para proteger a amostra do ataque das RNAses e DNAses do manuseador da amostra e restantes materiais de laboratrio. 6.1.2 ELECTROFORESE A grande maioria dos mtodos de gentica molecular requer num determinado momento o fraccionamento de cidos nucleicos segundo o seu comprimento. Para tal utilizam-se as tcnicas de electroforese, que consistem na separao dos cidos nucleicos

numa matriz porosa (habitualmente gis de agarose, ou acrilamida) sob a fora de um campo elctrico (os cidos nucleicos tm carga negativa, pelo que migram em direco ao polo positivo). A matriz na qual os cidos nucleicos devem ser separados depende essencialmente do tamanho dos fragmentos a separar, mas tambm do destino final a dar a estes uma vez separados. Existem diferentes tipos matrizes:
6.1.2.1

agarose - A agarose tem relativamente acrilamida a vantagem de constituir uma matriz no txica de muito fcil preparao (basta solubilizar a agarose em p num tampo (TAE ou TBE) a quente, e deixar ento arrefecer. Vrias agaroses existem, as quais permitem separar fragmentos com mais ou menos nucletidos. A agarose normal, permite uma boa resoluo para fragmentos relativamente grandes, utilizando-se em baixas concentraes (0.8-2%). J a agarose Nusieve (FMC-bioproducts) permite separar com grande resoluo fragmentos com menos de 1000bp, pelo que se adapta melhor aos fragmentos habitualmente obtidos por PCR. Uma variao destas duas agaroses (Nusieve 3:1), no mais que uma mistura de 3 partes de Nusieve com uma parte de agarose normal, o que origina um gel com uma viscosidade aceitvel em altas concentraes (normalmente at 4%, tal como a Nusieve), mas com um poder de resoluo superior quer Nusieve, quer agarose normal. Existem ainda agaroses com baixa temperatura de fuso. Estas agaroses tm a desvantagem de ser mais sensveis a aumentos de temperatura durante a electroforese, mas a vantagem de facilitarem a purificao do DNA separado. Acrilamida - Os gis de acrilamida baseiam-se na formao de uma matriz porosa, de polmeros de acrilamida. Para a
Gis de acrilamida

Gis de Agarose

6.1.2.2

Figura 6.2 Separao de cidos nucleicos por electroforese em gel horizontal.

6.4 6.5

fazer, utilizam-se monmeros de acrilamida, um reagente bifuncional (bis-acrilamida), e um gerador de radicais livres (iniciador da reaco de polimerizao; normalmente perxido de amnio), bem como um catalisador da polimerizao (temed). A resoluo dos gis de acrilamida muito grande podendo facilmente separar fragmentos com apenas um nucletido de diferena, pelo que habitualmente se utiliza como matriz nos gis de sequenciao. A grande desvantagem deste tipo de matriz consiste na sua grande fragilidade, toxicidade e complexidade de preparao. 6.1.3
6.1.3.1

Reaco de polimerase em cadeia (PCR)

Princpios do mtodo

Como em cada ciclo se duplica a quantidade de DNA de interesse que existia no inicio do ciclo, no final do processo amplificamos 2n vezes o segmento de DNA em que se estava interessado. Na maior parte dos casos, utilizam-se entre 24 e 35 ciclos de temperatura, pelo que no final existem 224 =16,777,216 a 35 2 =34,359,738,368 vezes mais cpias do segmento de interesse que inicialmente. Para implementar este procedimento necessrio incluir na mistura de reaco no s o DNA a estudar, mas tambm os oligonucletidos especficos (primers), desoxinucletidos trifosfatados (dNTPs), e uma polimerase do DNA termoestvel (para resistir s flutuaes de temperatura necessrias para realizar as vrias fases da reaco). Na prtica outros componentes so tambm adicionados, para que as condies de reaco serem as ideais para a enzima utilizada. Um dos componentes que todas as enzimas at agora descobertas utilizam o MgCl2 , de cuja concentrao dependente em larga medida a especificidade, e

O PCR (Polimerase Chain Reaction) um procedimento rpido para a amplificao enzimtica in vitro de segmentos especficos de DNA. A descoberta desta tecnologia teve um enorme impacto na gentica molecular, provocando uma revoluo de tal ordem que em 1994 foi atribudo ao inventor do PCR um Prmio Nobel. A base terica do PCR muito simples, baseando-se na propriedade das polimerases do DNA para catalisar a formao de uma cpia de uma cadeia de DNA, apenas quando encontram uma extremidade 3 livre. Desta forma, foi possvel partir de uma molcula de DNA de cadeia dupla, desnatur-la pelo calor, baixando de seguida a temperatura at um valor que permita a ligao especifica de um oligonucletido sinttico, especifico para a regio 5 do segmento a amplificar. Depois desta hibridao especifica, a polimerase inicia ento a sntese da cadeia complementar ao molde. Entretanto, um processo semelhante dever ter ocorrido em simultneo para a restante cadeia da dupla hlice inicial, pelo que no fim deste ciclo, efectivamente foi duplicada a quantidade de DNA da zona de interesse. O processo prossegue com nova desnaturao pela temperatura, repetindo-se este ciclo um nmero definido de vezes.
6.6

Figura 6.3 Esquema funcionamento de um PCR

6.7

de

qualidade do DNA amplificado. Os primers so utilizados num largo excesso relativamente ao DNA a ser amplificado, j que so necessrias pelo menos tantas molculas de primer quantas as cadeias de DNA q se deseja ue formar. Os primers so desenhados por forma a que um tenha a sequncia complementar invertida da extremidade 3 do segmento a amplificar (pelo que hibridiza directamente com esta zona do molde, deixando livre uma extremidade 3 para que a polimerase inicie o seu trabalho produzindo uma nova cadeia na direco 53). O restante primer desenhado por forma a ter a sequncia da extremidade 5 do fragmento a amplificar. Desta forma este primer hibridiza com esta extremidade da cadeia complementar do DNA, deixando livre uma extremidade para a cpia da respectiva cadeia. Como a polimerizao s termina quando a temperatura se eleva para a fase de desnaturao, no primeiro ciclo produzimos 2 tipos de fragmentos, ambos com inicio bem definido, mas com terminao incerta. No entanto, como os fragmentos produzidos no primeiro ciclo vo ser os moldes para a polimerizao da cadeia complementar no ciclo seguinte, aos poucos, o produto preponderante tem ambas as extremidades determinadas pelos locais de ligao de ambos os primers.
6.1.3.2 RT-PCR

Figura 6.4 Esquema de funcionamento de um Southern Blot quer atravs da utilizao de enzimas especiais que possuem ambas as actividades, embora em condies diferentes de reaco. 6.1.4
6.1.4.1

A reaco de RT-PCR (reverse transcriptase polimerase chain reaction), no mais do que um PCR normal realizado a partir de um DNA sintetizado por transcrio reversa a partir de RNA. Assim, so necessrios neste processo dois tipos de polimerases do DNA: primeiro uma DNA polimerase dependente do RNA (isto a transcriptase reversa), e depois a polimerase normal. Este processo pode assim ser efectuado quer pela utilizao sequencial de 2 enzimas diferentes, ajustando as condies da reaco enzima,
6.8 6.9

Southern Blot
Princpios do mtodo

Frequentemente, aps a separao dos cidos nucleicos, torna-se necessrio identificar o fragmento de interesse, numa mistura complexa de fragmentos separados. A tcnica de eleio para esse efeito a tcnica de Southern Blotting (ou Northern Blotting, conforme o acido nucleico seja

DNA ou RNA respectivamente), seguida de hibridao com uma sonda especifica para o fragmento de interesse. Esta tcnica consiste na passagem dos fragmentos de DNA (ou RNA) separados , depois de desnaturados, para uma membrana de Nylon ou celulose, por capilaridade ou por vcuo, seguida da fixao do cido nucleico membrana. Esta ento utilizada numa reaco de hibridao, em que colocada uma sonda de cadeia simples de DNA (ou de RNA) em contacto com a membrana, em condies qumicas e de temperatura que asseguram que a sonda hibridiza apenas com o fragmento complementar. A ligao da sonda ento revelada por autorradiografia (no caso de sondas radioactivas), ou por quimoluminescncia (ECL; Amersham).
6.1.4.2 6.1.4.2.1 Endonucleases de restrio Funes biolgicas dos sistemas R-M

tem como base o facto de a grande maioria das enzimas descobertas efectivamente cortarem o DNA extracelular que in vitro se insere. Simultaneamente o DNA endgeno protegido devido metilao especfica de nucletidos na sequncia reconhecida, efectuada por uma metiltransferase especfica. O conjunto da endonuclease de restrio e respectiva metiltransferase formam o que se designa por sistema de modificao de restrio (R-M system). Existem pelo menos 4 tipos de sistemas R-M, distinguidos pela composio das suas subunidades, pelo tipo de sequncias reconhecidas, e pelos cofactores necessrios para a sua actividade. Cerca de 93% das enzimas caracterizadas pertencem ao tipo II. Juntamente com as enzimas da classe IIs (cerca de 5% das enzimas descritas) constituem o grosso das enzimas comercialmente disponveis. As enzimas de tipo I (cerca de 1%) e as de tipo III (<1%) so relativamente pouco frequentes. Algumas outras enzimas existem que no podem ser includas em nenhuma destas classes.
6.1.4.2.2 Sistemas R-M tipo II

As enzimas de tipo II so as mais simples. Reconhecem sequncias de DNA simtricas, cortando entre as sequncias, deixando um terminal 3' hidroxil e um terminal 5'fosfato. Requerem apenas magnsio para a sua actividade, e as metiltransferases respectivas requerem apenas s-adenosylmetionina. Reconhecem uma variedade de sequncias quase ilimitada, mas poucas reconhecem sequncias com menos de 4 ou mais de 8 bp. Estas enzimas so habitualmente compostas por um homodimero, pelo que necessariamente interactuam com uma sequncia de repetio invertida, j que cada subunidade reconhece o mesmo motivo em cadeias de DNA opostas. As metiltransferases do tipo II so habitualmente compostas por um monmero, o que pode reflectir a necessidade de metilar apenas
6.10 6.11

Figura 6.5 - As endonucleases de restrio fragmentam o DNA de forma especfica. A especificidade determinada pela sequncia do DNA. Pensa-se que a funo biolgica das endonucleases de restrio a proteco das clulas contra DNA externo clula. Esta assuno

uma das cadeias de DNA nascentes (durante a duplicao do DNA, uma das cadeias j se encontra metilada), ao contrario das endonucleases de restrio que tem que reconhecer e cortar as duas cadeias do DNA.
6.1.4.2.3 Sistemas R-M tipo IIs

Para aumentar o tempo de conservao, as enzimas de restrio so habitualmente conservadas em 50% de glicerol. No entanto, um excesso de glicerol na mistura de reaco ( >5%) ocasiona um comportamento errtico da enzima. Assim, o volume de enzima adicionado nunca pode exceder os 10% do volume total da reaco.
6.1.4.2.4.3 Tampo de reaco

As enzimas do tipo IIs utilizam geralmente o mesmos cofactores s que as enzimas tipo II, mas as suas sequncias de reconhecimento so assimtricas e ininterrompidas, tendo 4 a 7 bp. O local de corte no se situa no interior da sequncia de reconhecimento, mas a uma distncia de ate 20bp num dos sentidos. Nestes sistemas, a metilao e efectuada por duas metiltransferases (uma para cada cadeia), sendo em alguns sistemas metiladas bases diferentes em cada cadeia do DNA.
6.1.4.2.4 Montar uma reaco de restrio

6.1.4.2.4.1 Estabilidade trmica

As enzimas de restrio (como todas as enzimas) devem ser sujeitas a menor variao trmica possvel. A temperatura a que as enzimas so habitualmente conservadas e -20C, pelo que quando se transportam para a bancada, devem permanecer em gelo, ou idealmente num congelador de bancada, os quais mantm uma temperatura de -20C durante cerca de 2 horas (depende do fabricante). Devido a instabilidade das enzimas a temperatura ambiente, estas devem ser os ltimos componentes da mistura de reaco a adicionar, para minimizar quer o choque entre a composio do tampo de conservao e a da mistura, quer o tempo de permanncia a temperatura ambiente.
6.1.4.2.4.2 Concentrao de glicerol
6.12 6.13

As diferentes enzimas tem actividades diferentes em determinados tampes. Assim, as companhias que as fornecem estudaram um conjunto de tampes concentrados (habitualmente 10X), os quais so optimizados para a actividade das varias enzimas. Estes tampes devem sempre que possvel ser utilizados com as respectivas enzimas, pois a actividade de uma enzima num tampo diferente do sugerido pode ser quase nula. Se a experincia obrigar a utilizao de varias enzimas no mesmo tubo de reaco, deve ser escolhido o tampo que apresentar o melhor compromisso entre a actividade das duas enzimas (os fornecedores fornecem habitualmente uma tabela com a %actividade de cada enzima em cada um dos tampes que fornecem). Finalmente, algumas enzimas necessitam da adio de componentes extra aos tampes padro (ex. BSA). Tambm neste caso, solues concentradas destes compostos so fornecidas com a enzima. Actividade das enzimas: Por definio, 1 unidade de enzima de restrio digere completamente 1g de DNA, num volume de 50l, ao fim de 1 hora. No entanto esta actividade apenas indicativa, j que tipos diferentes de DNA podem possuir conformaes diferentes, e um nmero diferente de locais de restrio. Assim, utiliza-se de modo geral 2 a 3 vezes mais enzima, e entre 3 a 16 horas de incubao. O volume da reaco no deve ser inferior a 50l, j que aumentam os erros de pipetagem, e a probabilidade de a concentrao de glicerol ser superior a 5%.

Um factor crtico na boa execuo de qualquer reaco enzimtica e a homogeneidade da mistura. Deve-se homogeneizar a mistura de reaco por inverso e pipetagem repetida, mas nunca utilizar o vortex j que a violncia deste pode desnaturar a enzima, deixandoa inactiva.
6.1.4.2.4.4 Temperatura de reaco

35

A temperatura de incubao da maioria das endonucleases de restrio de 37C, mas algumas enzimas, isoladas de bactrias termofilicas necessitam de incubaes entre 50-60C (verifique a temperatura ideal para cada enzima, junto do fornecedor).
6.1.4.3 6.1.4.3.1 Mtodos de marcao da sonda RADIOISTOPOS
32

O 35 S emite partculas com energia ainda mais baixa que a do 33 P (a sua actividade especifica de 1500 Ci/mmol na forma pura), tendo no entanto um tempo de semi-vida mais longo (87 dias). Os nucletidos marcados com 35 S possuem um grupo tiol em substituio de um oxignio no grupo fosfato, o que pode inibir a actividade de algumas enzimas. Por outro lado, uma vez que a sua energia menor, este radioistopo induz menos danos no DNA, pelo que as sondas com ele marcadas so mais estveis. A menor energia deste nucletido permite tambm obter bandas ainda mais bem definidas que as obtidas com 33 P, muito embora possa levar mais tempo a imprimir o filme fotogrfico. de salientar ainda o facto de este radioistopo ser menos nocivo para o operador de laboratrio, pese no entanto o facto de tambm ser mais difcil de detectar contaminaes com o auxilio de um contador Geiger.

6.1.4.3.1.1

3H
O tritio o radioistopo de menor energia que utilizado para a marcao de cidos nucleicos. Com a sua actividade especifica de apenas 29 Ci/mmol na forma pura, e um tempo de semi-vida de 12 anos, o istopo mais fraco de todos os procedimentos autorradiogrficos. A sua baixa capacidade de penetrao torna-o tambm o istopo menos perigoso no laboratrio, mas tambm mais difcil de detectar com contadores portteis tipo Geiger.

O istopo mais comumente utilizado para a marcao radioactiva de cidos nucleicos o 32 P. Este radioistopo emite partculas e tem uma actividade especfica elevada (9200 Ci/mmol na sua forma pura) e um tempo de semi-vida relativamente curto (14 dias). Existem comercialmente disponveis todas as espcies de trifosfatos de nucletidos marcados com 32 P, e com variadssimas actividades especficas. Note-se que o tomo radioactivo do dNTP, para a marcao de cidos nucleicos deve ser o (os tomos e so libertados na formao da ligao com o nucletido seguinte).

Outros radioistopos
Ainda que tal acontea com muito menos frequncia, tambm possvel utilizar 14 C e 125 I para a marcao de cidos nucleicos.

33

O 33 P emite menos energia que o 32 P, mas possui idntica capacidade de penetrao. Devido sua menor energia, este radionucletido origina bandas mais bem definidas que o 32 P.
6.14 6.15

6.1.4.3.2

POLIMERASES DO DNA

Esto hoje em dia disponveis uma vasta gama de polimerases do DNA, com propriedades e aplicaes diferentes. Os principais factores a ter em conta na escolha da polimerase certa para cada tipo de trabalho so: remoo de nucletidos existentes: da existncia desta actividade pode depender a fidelidade do produto formado. Todas as polimerases cometem erros. Da sua capacidade de verificar o trabalho realizado, e remover os nucletidos erroneamente incorporados depende a fidelidade do produto final. Obviamente, a existncia desta actividade tambm resulta numa menor velocidade de reaco, o que pode dificultar a obteno de produtos longos. Pode assim concluir-se que a opo pela existncia ou no desta actividade na enzima escolhida deve ser realizada com base no resultado pretendido. Tipicamente, as reaces que se destinam a sequenciao, ou a clonagem devem ser sempre realizadas por enzimas com esta actividade. Estabilidade trmica: tambm esta caracterstica pode ser benfica ou prejudicial, dependendo do objectivo e protocolo especficos a utilizar. Por exemplo, numa reaco de PCR, a utilizao de enzimas termoestveis evita a destruio da enzima no passo de desnaturao. No entanto, se o protocolo envolver a posterior inactivao da enzima pelo calor, necessrio escolher uma enzima termossensvel. 6.1.5 Dot-Blot Figura 6.6 Esquema simplificado de funcionamento do dot-blot / slot-blot consiste na separao electrofortica que ocorre no Southern, mas que no existe no dot-blot. Assim, o dot-blot no proporciona qualquer tipo de informao quanto ao peso molecular e numero de espcies de DNA responsveis pelo sinal. Assim, este mtodo particularmente til em experincias em que a discriminao qualitativa menos importante que a quantitativa. Uma variao ao dot-blot consiste no slot-blot. A nica diferena entre estas duas tcnicas consiste na forma que o sinal de hibridizao origina. No dot-blot o DNA aplicado numa fenda em crculo, originando um sinal circular. No slot-blot o DNA aplicado numa fenda rectangular, em que uma das dimenses muito reduzida (cerca de 1 mm), originando um sinal tipo banda. Assim, a quantificao do sinal originado pelo slot-blot mais fcil, fivel e reprodutvel. 6.2 Mtodos Comerciais A tecnologia de PCR encontra-se patenteada pela Roche, pelo que s esta empresa e suas subsidirias se encontram autorizadas a desenvolver "kits" comerciais baseados nesta tcnica. Em resposta, vrias outras companhias (Chiron, Abbot, Organnon Teknika) desenvolveram tcnicas alternativas independentes da amplificao por PCR. Outras companhias (Sorin) optaram por
6.16 6.17

Uma variante tcnica do Southern Blot consiste no dot-blot. Tratase tambm de uma tcnica em que o DNA covalentemente ligado a uma membrana, sendo posteriormente hibridizado com uma sonda. A diferena fundamental entre o dot-blot e o Southern-Blot

licenciar o PCR Roche, desenvolvendo apenas tcnicas de deteco prprias. 6.2.1 Amplicor O Amplicor da Roche uma tcnica inteiramente dependente do PCR para a deteco e/ou quantificao de espcies de RNA ou DNA em amostras biolgicas. Assim, tudo o que foi dito na seco sobre PCR se aplica a este mtodo comercial, o qual se encontra j disponvel em verso semiautomtica. Deve ser realado que este mtodo inclui um controlo interno de amplificao, o qual consiste numa espcie de cido nucleico introduzida na mistura de reaco, e que vai co-amplificar com o

assim produzido vai no entanto ser independentemente analisado, pois possui uma sequncia interna diferente do DNA alvo, pelo que hibridiza com sondas diferentes. O amplicor incorpora ainda um mtodo de eliminao de contaminao proveniente de reaces de PCR anteriores. Com efeito, em vez de dATP, o kit utiliza dUTP, pelo que se produz uma molcula de DNA com uridina. Esta eficientemente hidrolizada pela enzima Uracil-N-glicosilase (o nome comercial da Roche Amperase), a qual includa na mistura de reaco. Esta enzima tem a particularidade de no funcionar a temperatura elevada, pelo que s se encontra activa antes de se iniciar a reaco (perodo durante o qual elimina possveis contaminaes). No final da reaco a Amperase inactivada por meios qumicos, assegurando a preservao do produto do PCR a ser analisado. O sistema amplicor encontra-se disponvel em formato manual ou semi-automtico (Cobas-Amplicor), os quais diferem no mtodo de deteco. No primeiro caso, o amplimer encontra-se biotinilado (um dos primers biotinilado), o que lhe permite ligar-se a um poo de microplaca coberto com estreptavidina. No caso do formato semiautomtico, a biotina do amplimer liga-se a uma partcula magntica, o que permite ao aparelho reter os amplimers por meio de um campo magntico. Em ambos os casos a deteco mediada por uma sonda, e a quantificao realizada por leitura de absorvncia. 6.2.2 "Branched DNA" A sistema da Chiron (hoje Bayer) opta no por amplificar as molculas de cido nucleico a serem detectadas, mas por amplificar o sinal obtido de cada molcula presente na amostra. Para tal utiliza cidos nucleicos sintticos com derivaes ("branches") em nmero preciso e bem determinado, o que atravs de hibridizaes sucessivas produz o aumento de sinal necessrio.
6.18 6.19

Figura 6.7 A mistura de reaco da amplicor incorpora Amperase e dUTP para eliminao de contaminaes. cido nucleico alvo, j que possui a mesma sequncia terminal (o que permite aos primers hibridizarem). O DNA de controlo interno

6.2.3 NASBA/Nuclisens A Organon Teknika produziu um mtodo em que com uma nica temperatura, mas utilizando trs enzimas diferentes se realiza semelhana do PCR uma grande amplificao do nmero de molculas de cido nucleico em estudo. Para tal foi buscar a inspirao prpria clula, j que esta produz a partir de um nico gene, milhares de cpias de transcritos. Os mtodos NASBA e o seu sucessor mais recente o NucliSens realizam assim uma srie de reaces sucessivas (ver figura 6.9), que permitem produzir uma molcula de DNA a partir de uma molcula de RNA (utilizando uma RT), seguidamente a molcula de RNA inicial degradada pela RNase H, seguindo-se a produo da cadeia complementar pela mesma RT que produziu a primeira cadeia de DNA. O facto de o primeiro primer ter incorporado uma sequncia 5' no homloga contendo o promotor da T7 RNA polimerase permite ento a esta enzima produzir vrias cpias de transcrito do gene alvo. Cada uma destas molculas de transcrito pode ento por sua vez ser replicada pela RT, amplificando-se o processo que passa a ser cclico (fig. 6.9).

Figura 6.8 Comparao entre o PCR e o bDNA

6.20 6.21

6.2.4

Ligase Chain Reaction

A tcnica desenvolvida pela Abbot em tudo semelhante ao PCR, mas no se limita a utilizar uma polimerase para produzir a amplificao da sequncia alvo. Nesta tcnica so utilizados primers muito longos que cobrem a quase totalidade da sequncia a estudar. A parte no coberta pelos primers uma zona central, a qual aps a hibridizao dos primers sintetizada por uma polimerase, e finalmente os dois fragmentos unidos por uma ligase. Assim, a existncia do gene pode ser detectada pela deteco da unio dos dois primers, a qual dependente da hibridizao, e consequentemente da existncia do gene alvo (fig.6.10). A deteco foi tambm desenvolvida pela A bbot e denomina-se MEIA (microparticle immuno sorbent assay). Nesta tcnica, micropartculas cobertas com um anticorpo reactivo contra um hapteno existente no primer A so incubadas com os " amplimers" (fig. 6.10b). Se a reaco de ligase ocorreu, esta incubao "prende" no s o primer A, mas tambm o primer B, o qual est conjugado com um outro hapteno identificvel por um anticorpo conjugado com uma enzima que decompe um substracto, a qual decompondo um composto e emitindo fluorescncia. Tanto o LCR como o MEIA se encontram automatizados.

Figura 6.9 esquema de funcionamento do NASBA/ NucliSens

6.22

6.23

6.2.5 DEIA O sistema DEIA da Sorin um sistema genrico de deteco e quantificao da existncia de molculas de DNA complementares a uma sonda. Para o seu desenvolvimento, esta empresa isolou um anticorpo de ratinho reactivo contra DNA de cadeia dupla, mas no reactivo contra DNA monocatenrio. Desta forma, foi possvel criar um sistema em tudo idntico a um ELISA convencional, em que o antignio a ser estudado a existncia de DNA de cadeia dupla, ou seja DNA que hibridizou com uma sonda especfica. O desenho do sistema (figura 6.11) parte da utilizao de uma placa revestida com estreptavidina, qual ligado uma sonda conjugada com biotina. ento efectuada uma reaco de hibridizao na prpria placa, que a ser eficaz produz molculas de DNA de cadeia dupla, originando a presena do antignio reconhecido pelo anticorpo a utilizar em seguida. Todo o resto do processo sobreponvel a um vulgar ELISA.

Figura 6.10 Esquema de funcionamento da Ligase Chain Reaction (LCR) e do Microparticle Enzyme Immuno-sorbent assay (MEIA).

Figura 6.11 Esquema de funcionamento do DNA Enzyme Immuno-sorbent assay (DEIA)

6.24

6.25

Captulo 7
7 ndice Remissivo

2
2-desoxirriboses, 2.2

D
DNA, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 2.10, 2.11, 2.12, 2.13, 2.14, 2.15, 2.16, 2.18, 2.19, 2.21, 2.25, 2.26, 2.27, 2.28, 2.32, 2.33, 2.34, 2.39, 2.42, 2.43, 2.46, 2.4, 2.5, 2.6, 2.9, 2.12, 2.13, 2.14, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.9, 3.10, 3.12, 3.13, 3.24, 4.7, 4.9, 4.10, 4.41, 4.50, 5-2, 5-4, 5-5, 5-6, 5-7, 5-8, 5-9, 5-10, 511, 5-12

A
cidos nucleicos. Consulte DNA e RNA adenil ciclase, 4.5 Adeninas, 2.2 alelos, 2.18, 4.8, 4.45 aminocido, 2.11, 2.21, 2.22, 2.24, 2.29, 2.30, 4.5, 4.36, 4.37, 4.45, 4.48, 4.50 anemia no-esferocitica congnita, 4.36 anemias hemolticas agudas, 4.36 apoptose, 2.46, 2.47, 4.8, 4.9, 4.34

E
enhancers, 2.18, 2.28, 3.7, 3.26, 4.7, 4.13, 4.31

B
bases azotadas, 2.3 BCL-2, 4.35

F
factores de crescimento, 2.45, 2.50, 4.2, 4.4, 4.5 Factores de crescimento, 4.4 Factores de Crescimento PDGF, 4.7 Factores de Transcrio AP-1, 4.7 factores de transcrio nuclear, 4.4, 4.7 Factores de transcrio nuclear, 4.7 fosforilao, 2.40, 2.42, 2.43, 2.44, 2.45, 2.48, 2.50, 4.5, 4.6

C
cAMP, 4.5 carcinognios, 4.9, 4.10, 2 cdk, 2.45, 4.7 clulas citotxicas, 4.33 clulas tumorais, 4.2, 1 ciclinas, 2.40, 2.42, 2.44, 2.45, 4.7, 1 Citosinas, 2.2 complemento, 2.17, 4.33 Crk, 4.6

G
glicose-6-fosfato desidrogenase, 4.36 GM -CSF, 4.5 GTP, 2.29, 2.30, 2.50, 3.26, 4.5, 4.6 Guaninas, 2.2

7.1

H M
HEMATOLOGIA, ii HLA, 2.11, 2.17, 2.19, 4.33, 4.34, 4.53 mbr, 4.34, 4.35 mcr, 4.34, 4.35 Metstase, 4.2 MICROBIOLOGIA, ii mRNA, 2.10, 2.11, 2.15, 2.19, 2.25, 2.27, 2.28, 2.29, 2.30, 2.31, 2.32, 2.14, 3.3, 3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11, 3.12, 3.13, 3.25, 4.7, 4.29, 4.31, 4.34, 4.43, 4.54 mutaes, 2.17, 2.19, 2.22, 2.23, 2.24, 2.34, 2.38, 2.46, 3.25, 3.27, 4.3, 4.7, 4.8, 4.13, 4.14, 4.15, 4.16, 4.28, 4.35, 4.37, 4.38, 4.40, 4.41, 4.43, 4.44, 4.45, 4.46, 4.49, 4.50, 4.51, 4.52, 2 mutaes oncognicas, 4.9 mutagnios, 4.9, 2

O
oncogenes, 2.13, 3.30, 4.3, 4.4, 4.5, 4.5, 4.6, 4.7, 4.10, 4.13, 2 bcl-2, 2.47, 4.9 p53, 2.46, 4.7, 4.8, 4.9, 4.12, 4.28, 4.34, 2 Oncogenes Abl, 4.5 BCL-2, 4.34 myc, 4.31, 4.31, 4.32 ras, 4.6 RB, 2.45, 2.46, 4.7, 4.8 Src, 4.5, 4.6

I
Imortalizao, 4.2 imunoglobulinas Ig, 4.31 imunoglobulinas, 2.2, 2.9, 4.31 IgH, 4.31, 4.31, 4.34, 4.35, 3 Imunoglobulinas IgK, 4.31 IMUNOLOGIA, ii

retrovrus, 2.18, 2.25, 2.28, 3.2, 3.5, 3.13, 3.14, 3.15, 3.22, 3.24, 3.29, 3.30, 4.10 riboses, 2.2 RNA, 2.2, 2.3, 2.11, 2.13, 2.14, 2.15, 2.16, 2.17, 2.19, 2.20, 2.25, 2.26, 2.27, 2.28, 2.34, 2.46, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.10, 3.11, 3.12, 3.13, 3.22, 3.24, 4.10, 5-2, 5-6, 5-7, 5-13

S
SH2, 4.6 SH3, 4.6 src, 4.3, 4.6, 4.12 c-src, 4.4, 4.6

L
Linfoma de Burkitt, 4.31, 4.32, 4.33 Linfoma de Hodgkin, 4.33 Linfomas Difusos, 4.34 Linfomas foliculares, 4.34 Linfomas T, 4.33

P
PDGF, 4.4, 4.12 pentose, 2.2, 2.4 pentoses, 2.2, 2.3 Piruvato Quinase, 4.37 pontuais Mutaes pontuais, 2.23, 2.24, 2.7, 3.27, 4.3, 4.40, 4.43, 4.44, 4.50, 4.51, 2 promotores, 2.15, 2.16, 2.17, 4.7 protena G, 2.50 proteinas de controlo do ciclo celular, 4.4 Protenas de controlo do ciclo celular, 4.7 protenas G, 2.50, 4.5 proto-oncogenes c-Fos, 4.7 c-Myc, 4.7 Proto-oncogenes, 4.3

T
TGF-, 4.5 Timidinas, 2.2, 2.25, 2.33 tirosina cinase, 2.50, 4.5, 4.6, 4.12 transcrio, 2.10, 2.11, 2.15, 2.16, 2.17, 2.18, 2.19, 2.25, 2.26, 2.27, 2.28, 2.36, 2.49, 2.50, 3.3, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 3.10, 3.12, 3.13, 3.14, 3.15, 3.23, 3.25, 3.26, 4.4, 4.7, 4.12, 4.13, 4.33, 5-6, 1 transdutores intracelulares de sinal, 4.4 Transdutores intracelulares de sinal, 4.5 Transformao, 4.2 translocao, 2.13, 2.31, 2.47, 4.19, 4.26, 4.29, 4.30, 4.31, 4.31, 4.32, 4.34, 4.35 translocaes, 4.3, 4.27, 4.28, 4.31, 4.32, 4.34 tumores, 2.9, 2.19, 3.23, 3.28, 3.29, 4.3, 4.5, 4.6, 4.8, 4.9, 4.10, 4.14, 4.26, 4.33, 4.34, 1, 2

N
nonsense Mutaes nonsense, 2.24, 4.3, 4.13, 4.38 nucletido, 2.2, 2.4, 2.23, 2.26, 4.48, 54, 5-11 nucletidos, 2.2, 2.3, 2.4, 2.14, 2.19, 2.21, 2.26, 2.27, 2.30, 2.31, 2.32, 2.34, 2.5, 2.8, 3.22, 5-3, 5-7, 5-11, 512

R
receptores de factores de crescimento, 4.4

U
Uracilos, 2.2, 2.25