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Traduccion Articulo Boletus Edulis

Traduccion Articulo Boletus Edulis

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11/05/2012

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Optimización de la extracción asistida por ultrasonido de los polisacáridos solublesen agua del micelio
 Boletus edulis
usando la metodología de superficie de respuesta
RESUMEN
Un procedimiento asistido por ultrasonido para la extracción de polisacáridos solubles en agua sumergido en el cultivo del micelio
Boletus edulis
seinvestigó mediante la metodología de superficie de respuesta (RSM).Tres variables independientes fueron proporción del micelio seco en agua (X
1
:1:40-1:60), tiempo de extracción (X
2
: 6-10 minutos), y la temperatura del ultrasonido (X
3
: 50-70°C).El análisis estadístico indica las variablesindependientes (X
2
, X
3
), los términos cuadráticos (
 
y
 
) y la interacción entre X
3
y X
1
tenía efectos significativos en el rendimiento de lospolisacáridos (p <0.05). Las condiciones óptimas fueron 56°C, 1:55 de la relación del micelio seco en agua, y un tiempo de contacto de 8,4 min.Bajoestas condiciones, el rendimiento experimental de los polisacáridos era de 15,48%, que corresponde bien con el rendimiento predictivo de 15,53%.
 
1.
 
Introducción
 Boletus edulis
es una de las setas más conocidas comestiblesrecolectados sobre todo en el hemisferio norte de Europa, Asiay América del Norte. Los polisacáridos extraídos de
 B. edulis
 se ha reportado que tiene muchas funciones biológicas, comoefectos anticancerígenos, antioxidantes y antiinflamatorios.Sinembargo, los frutos pertenecientes de
 B. edulis
son muyvaliosos por su rareza y dificultad en el cultivo.
 B. edulis
es unhongo micorriza. Su micelio pero no los cuerpos de frutapueden cultivarse fácilmente. Así 
 B. edulis
puede obtenerse enforma de micelio de cultivo sumergido y los polisacáridosbioactivos pueden ser extraídos a partir del micelio
 B. edulis
.Un estudio de la literatura indica que no hubo ningunainvestigación sobre la extracción de polisacáridos solubles enagua delmicelio
 B. edulis
. El calentamiento o ebullición esusado convencionalmente para extraer polisacáridos solublesen agua. Sin embargo, durante la extracción, muchoscompuestos bioactivos debido a la ionización, hidrólisis yoxidación se pierden fácilmente. Recientemente, diversastécnicas novedosas de extracción se han desarrollado para laextracción de compuestos bioactivos tales como la extracciónasistida por ultrasonido, extracción asistida por microondas yla extracción con fluidos supercríticos. Entre éstos, laextracción asistida por ultrasonido es una de las máseconómicas, es una técnica simple y eficaz, que puedenaumentar el rendimiento de los componentes extraídos, reducirel tiempo de extracción y hace que tenga un mayorrendimiento en el procesamiento. Es muy útil para laextracción de compuestos termolábiles e inestables,presumiblemente por evitar reacciones de degradación. En esteestudio, se investigó la condición de extracción asistida porultrasonido de los polisacáridos del cultivo sumergido delmicelio
 B. edulis
.Para mejorar el rendimiento de los polisacáridos, lametodología de superficie de respuesta (RSM) fue diseñadopara analizar sistemáticamente los efectos de los parámetros deextracción en los rendimientos de los polisacáridos de miceliode
 B. edulis
y sus interacciones. RSM es una técnicaestadística eficaz para optimizar los procesos complejos, quees ampliamente utilizado en la optimización de las variablesdel proceso de extracción. La principal ventaja de RSM es elreducido número de ensayos experimentales necesarios paraevaluar varios parámetros y sus interacciones, lo que es máseficiente y más fácil de organizar e interpretar losexperimentos en comparación con los demás. Box-Behnkendiseñó (BBD), una RSM, basado sobre 3 niveles y 3 variablesdel compuesto central, fue empleado para obtener la mejorcombinación posible de temperatura de extracción, tiempo deextracción y relación de agua del micelio seco para la máximaproducción de polisacáridos.
2.
 
Materiales y métodos
2.1.
 
 Microorganismos y condiciones del cultivo B. edulis
ACCC50559 era de la Colección de la CulturaAgrícola de China (ACCC). Tubos inclinados de agar quecontienen patata-dextrosa-agar se inocularon con el micelio yse incubaron a 25°C durante 6 días y luego se usa comoinóculo para semilla de siembra. La semilla de siembra secultivó en matraces deflectores de 250 mL en un agitadorrotatorio durante 60 horas a pH natural, 25°C y 120 rpm conun medio (g/L) que contiene: glucosa 20, patata 200 (puesto200g de patata en el agua, se hirvió durante 30 minutos, yfiltrado, volumen medido a 1L), MgSO
4
·7H
2
O 0.5,KH
2
PO
4
1.0, ZnSO
4
·7H
2
O 0.1, extracto de levadura 14,peptona 6. La fermentación se llevó a cabo en el medio de lasiguiente composición (g/L): patata 100 (puesto 100g de patataen el agua, se hierve durante 30 minutos, y se filtra, volumenmedido a 1L), sacarosa 20, peptona 6, MgSO
4
·7H
2
O 2,KH
2
PO
4
3, CaCO
3
2. Todos los medios se esterilizaron a115°C durante 30 min. El cultivo de fermentación se inoculóen 10% (v/v) del medio de cultivo de siembra anterior y semantuvo a 28°C y 200 rpm en matraces deflectores de 250mLen un agitador rotatorio durante 5 días.
2.2.
 
 Extracción de crudo de polisacáridos delamiceliade B.edulis con tratamiento asistida por ultrasonido.
El micelio
 B. edulis
del cultivo sumergido se lavaron con aguadestilada. El micelio se secó a 30°C. Luego, se molió y sealmacenó en desecadores a temperatura ambiente (15-20°C)hasta su uso. El proceso de extracción de polisacáridos delmicelio
 B. edulis
por el tratamiento asistida por ultrasonido serealizó en un procesador de ultrasonidos (SY-360, ShanghaiNinson Inc., Shanghai, China). Una décima del micelio enpolvo seco se extrajo con agua destilada en un tubo decentrífuga de 50mL. El tubo de centrífuga se colocó en elprocesador de ultrasonidos y se expuso para extraer lospolisacáridos en diferentes tiempos en diversas temperaturasdel ultrasonido en diferentes proporciones del micelio seco alagua.
 
2.3.
 
 Determinación del rendimiento de los polisacáridos de lamicelia deB. Edulis
Después del tratamiento con el ultrasonido, la suspensión seextrajo y se centrifugó a 7000 rpm por 10 minutos pararecoger el sobrenadante y los polisacáridos se determinaronpor el método de fenol-ácido sulfúrico.
2.4.
 
 Diseño experimental y análisis estadísticos
Un solo factor de prueba se empleó para determinar el rangopreliminar de las variables de extracción incluyendo X
1
 (relación de micelio seco al agua), X
2
(tiempo de extracción) yX
3
(temperatura del ultrasonido). Entonces, un BBD de tresniveles y tres factores se empleó para determinar la mejorcombinación de variables de extracción para los rendimientosde micelio
 B. edulis
de los polisacáridos solubles en agua.Tabla 1 representa los valores codificados y no codificado delas variables experimentales y 15 puntos experimentales.
 
Tresrepeticiones (13-15) se utilizaron para evaluar el error puro.Los datos experimentales muestran que las variables derespuesta se ajustaron a un modelo polinomial de segundogrado. La forma general del modelo cuadrático del polinomiofue el siguiente:





 (1)
 
donde Y es la respuesta medida asociado a cada combinación
del factor de palanca; 
0
,
i
,
ii
y
ij
son los coeficientes deregresión para la intercepción, la linealidad, cuadrado y lainteracción, respectivamente, X
i
y X
 j
son las variablesindependientes. El software Design Expert (versión de prueba7.1.6.) se utilizó para estimar la respuesta de cada grupo dediseño experimental y las condiciones optimizadas. Laadecuación del modelo del polinomio cuadrático fueinspeccionada por el coeficiente de regresión R
2
. El valor F yvalor p se utiliza para comprobar los significados delcoeficiente de regresión.3.
 
Resultados y discusión
 
3.1.
 
Selección de la relación de micelio seco al agua para elrendimiento de extracción de polisacáridos
Los estudios preliminares se realizaron con el fin dedeterminar la proporción requerida de micelio seco al aguapara los rendimientos de extracción de polisacáridos de
 B.edulis
. La extracción se lleva a cabo a diferentes proporcionesde micelio seco al agua (1:20, 1:30, 1:40, 1:50 y 1:60),mientras que otros parámetros de extracción fueron comosigue: el tiempo de extracción 2 min, temperatura delultrasonido 40°C. Los resultados mostraron que la extracciónde los polisacáridos era dependiente de la relación de sólido alíquido (Fig. 1 (A)). El rendimiento de polisacáridos aumentócon el aumento de la relación de sólido a líquido. Un pico altoen la transferencia de masa se llegó a la proporción sólido-líquido de 1:50. El rendimiento máximo (14,1%) también sealcanzó. Así, la relación de micelio seco al agua 1:40-1:60 fuefavorable para la producción de polisacáridos.
3.2.
 
Selección del tiempo en el rendimiento de extracción de polisacáridos
El tiempo de extracción es otro factor que podría influir en laeficacia de la extracción. El proceso de extracción se llevó acabo utilizando el tiempo de 2, 4, 6, 8 y 10 minutos, cuandootros parámetros de extracción fueron como sigue:temperatura del ultrasonido 40°C, la relación de micelio secoal agua 1:20. El efecto diferente del tiempo en el rendimientode extracción de los polisacáridos se muestra en la figura 1(B). Cuando el tiempo de extracción varió de 6 a 10 minutos,la varianza de rendimiento de extracción fue relativamenterápido y la producción de polisacáridos alcanzó un máximo en8 minutos (15,22%), y luego disminuyó a medida que laextracción procedió. Esto indicó que el tiempo de extracciónde 6-10 min fue suficiente para obtener los polisacáridos, queera menor en el calentamiento convencional o tiempo deextracción de ebullición.
3.3.
 
 La selección de la temperatura sobre el rendimiento deextracción de los polisacáridos
Para estudiar el efecto de la temperatura diferente en elrendimiento de extracción de polisacáridos, el proceso deextracción se llevó a cabo utilizando la temperatura deextracción diferente de 40, 50, 60, 70, 80°C, cuando otrascondiciones de extracción fueron las siguientes: tiempo deextracción 2 min, la relación de micelio seco al agua 1:20. Elrendimiento de extracción de los polisacáridos habíaaumentado cuando la temperatura del ultrasonido era de 40 a60°C. Como se muestra en la fig. 1 (C), el rendimientomáximo (15,01%) de los polisacáridos se observó cuando latemperatura de extracción fue de 60°C, y luego disminuyó amedida que la extracción procedió.
 
Por lo tanto, el rango detemperatura de extracción de 50-70°C se considera óptimo enel presente experimento. Debido al calentamientoconvencional la temperatura de extracción de más de 70°C,fue menor por la extracción asistida por ultrasonido.
3.4.
 
Optimización de las condiciones de extracción de los polisacáridos3.4.1.
 
Predicción del modelo y el análisis estadístico
La matriz de diseño y los resultados de los experimentoscorrespondientes de la RSM para determinar los efectos de lastres variables independientes, incluyendo relación de micelioseco al agua (X
1
), tiempo de extracción (X
2
) y la temperaturadel ultrasonido (X
3
) se muestran en la Tabla 1. Medianteanálisis de regresión múltiple de los datos experimentales, elmodelo para la respuesta Y predicho podría ser expresado porla ecuación siguiente, un polinomio cuadrático (en forma devalores codificados):










 donde
es el rendimiento de los polisacáridos, X
1
, X
2
y X
3
 son las variables codificadas para la relación de micelio seco al
 
agua, tiempo de extracción y la temperatura del ultrasonido,respectivamente.Las pruebas estadísticas del modelo se llevaron a cabo en laforma de análisis de varianza (ANOVA). El ANOVA para elmodelo del polinomio cuadrático ajustado de la extracción delos polisacáridos se muestra en la Tabla 2. El modelo deregresión cuadrática mostró el valor del coeficiente dedeterminación (R
2
) fue 0,9883, lo que implica que 98.83% delas variaciones podrían ser explicadas por el modelo ajustado.Para un buen modelo estadístico, R
2adj
debe estar cerca de R
2
.Como se muestra en la Tabla 2, R
2adj
era 0,9674, lo queimplica que sólo menos 4,0% del total de variaciones no seexplica por el modelo. También indicó que un alto grado decorrelación entre los valores observados y los valorespredichos. Un valor relativamente bajo de C.V. (coeficiente devariación) (1,25%) indica una mejor fiabilidad de los valoresde los experimentos. Las variables correspondientes seríanmás significativas si el valor F se hace mayor y el valor p sehace más pequeño. Los valores del valor p inferiores a 0,05mostraron los términos del modelo fueron significativos. Deeste modo el valor F (F=47.12) y el valor p (p = 0,003) implicaque este modelo fue significativo. Significado del modelotambién fue juzgado por la prueba de la falta de ajuste. Comose muestra en la Tabla 2, el valor F y el valor p de la falta deajuste (forma) eran 1,94 y 0,3578, respectivamente, lo queimplicaba que no era significativa y un 35.78% de congruenciapodría ocurrir debido al ruido. El significado de cadacoeficiente se determinó usando el valor F y el valor p. Losresultados se dan en la Tabla 3. Se pudo observar que dosvariables independientes (X
2
, X
3
) y dos términos cuadráticos(
 
y
 
) afectó significativamente la producción depolisacáridos, y la interacción entre X
1
y X
3
también fuesignificativa (p <0.05). Los resultados también mostraron quela variable independiente X
3
fue el factor más significativo enel rendimiento experimental de los polisacáridos.
3.4.2.
 
 Análisis de superficie de respuesta
La relación entre las variables independientes y dependientesse ilustra mediante la representación tridimensional de lasuperficies de respuesta y los contornos de dos dimensionesgeneradas por el modelo (visto en las figuras. 2-4). Diferentesformas de los trazados de contorno indican las diferentesinteracciones entre las variables, un gráfico de contornoelíptico indica las interacciones entre las variables fueronsignificativas, mientras que un gráfico de contorno circular,significa lo contrario. En estas tres variables (relación demicelio seca al agua, tiempo de extracción y la temperatura delultrasonido), cuando dos variables dentro del rangoexperimental se representan en la superficie de trazado en tresdimensiones, la tercera variable se mantuvo constante en elnivel cero. Como se muestra en la fig. 2, cuando latemperatura del ultrasonido (X
3
) se fijó en el nivel 0, el tiempode extracción (X
2
) demostraron los efectos cuadráticos en losrendimientos de extracción. Cuando la proporción del micelioseco al agua se mantiene a un nivel inferior, el rendimientoaumentó en un primer momento y luego disminuyó con elaumento del tiempo de extracción (X
2
). Como se muestra en lafig. 3, cuando el tiempo de extracción (X
2
) se fijó en el nivel 0,la temperatura del ultrasonido (X
3
) muestra un efectocuadrático sobre el rendimiento de la respuesta. El gráfico decontorno elíptico se muestra en la fig. 3 indica lasinteracciones mutuas entre la relación de micelio seca al aguay la temperatura de extracción fueron significativas. Losresultados de la figura 4 mostraron que cuando la proporciónde micelio seca al agua (X
1
) se fijó en el nivel 0, latemperatura de ultrasonidos (X
3
) se incrementó con aumentosen el tiempo de extracción (X
2
). Y entonces, la temperatura deultrasonidos (X
3
) se redujo con mayor aumento en el tiempode extracción. El tiempo de extracción y la temperatura delultrasonido demostraron efectos cuadráticos sobre la respuesta.
3.5.
 
Optimización de los parámetros de extracción yvalidación del modelo
A través de esto trazados en tres dimensiones y sus respectivostrazados de contorno, la idoneidad de la ecuación del modelopara predecir los valores óptimos de respuesta se probaronusando las condiciones óptimas seleccionadas. Los resultados(Tabla 4) mostró que las condiciones optimizadas fueron latemperatura del ultrasonido de 56,06°C, tiempo de extracciónde 8,38 minutos, y la relación del micelio seca al agua 1:54.53.
 
Bajo las condiciones, el rendimiento de extracción de lospolisacáridos fue 15,53%. Sin embargo, teniendo en cuenta laoperatividad de la producción real, las condiciones óptimas sepueden modificar como sigue: temperatura del ultrasonido de56°C, tiempo de extracción de 8,4 minutos, y la relación demicelio seco al agua 1:55. Bajo las condiciones modificadas,el rendimiento experimental de polisacáridos era 15,48%(N=3), que era próximo al valor predicho. Generalmente, losrendimientos de extracción de polisacáridos a partir demicelios de hongos o setas estaban por debajo de 10%. Hou yChen (2008) investigó que la eficacia de la extracción depolisacáridos de hongos silvestres comestibles BaChu fue de8,75%. Yan et al. (2011) reportó los rendimientos deextracción de polisacáridos de
Tremella mesenterica
fue del8,26%. Guo et al. (2010) encontró que los rendimientos deextracción de polisacáridos de
Phellinus igniarius
fue del5,04%. Así la eficacia de la extracción de 15,48% era muyalta.
4.
 
Conclusión
En este estudio, se ha investigado un método asistido porultrasonidos para extraer los polisacáridos del micelio
 B.edulis
usando RSM. Los resultados mostraron que lasvariables independientes (temperatura y tiempo de extraccióndel ultrasonido), y los términos cuadráticos de temperatura ytiempo de extracción del ultrasonido, y los efectos deinteracción entre la temperatura del ultrasonido y la relaciónde micelio seco al agua tenía efectos significativos en elrendimiento de los polisacáridos. La temperatura delultrasonido fue el factor más significativo en el rendimientoexperimental de los polisacáridos. Un modelo polinomial desegundo orden se emplea para optimizar la extracción depolisacáridos de micelio
B. edulis
por la tecnología deultrasonidos. La extracción óptima condiciones para lospolisacáridos fueron las siguientes: temperatura del ultrasonido56°C, tiempo de extracción de 8,4 minutos, y la relación demicelio seco al agua de 1:55. Bajo estas condiciones, elrendimiento experimental de polisacáridos era 15,48%, que

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