1

Prophase Dengan mulainya pembelahan, kromosom berkondensasi, dan dua kromatid menjadi terlihat. Membran inti menghilang. Sentriol adalah sebuah organela di luar nucleus yang membentuk spindle-spindel untuk pembelahan sel; sentriol menduplikasi dirinya sendiri, dan dua sentriol bermigrasi ke kutub-kutub sel berlawanan. Metaphase Kromosom bermigrasi ke tengah sel, membentuk sebuah garis designated the equatorial plate. Kromosom-kromosom sekarang terkondensasi secara maksimal. Spindel, mikrotubula-mikrotubula protein yang berradiasi dari sentriol-sentriol dan melekat pada sentromer, dibentuk. Anaphase Pembelahan terjadi pada plana longitudinal dari sentromer. Dua kromatid baru bergerak ke sisi-sisi sel yang berlawanan ditarik oleh kontraksi spindel-spindel. Telophase Pembelahan sitoplasma mulai pada plana equatorial, berakhir dengan pembentukan dua membrane sel komplit. Dua kelompok kromosom dikitari oleh membrane-membran inti yang membentuk nuklei (inti-inti) baru. Setiap strand DNA berperan sebagai suatu template (cetakan), dan isi DNA dari sel berlipat ganda. Meiosis Meiosis adalah pembelahan sel yang membentuk gamet-gamet, masing-masing dengan jumlah kromosom haploid. Meiosis memiliki dua tujuan: reduksi jumlah kromosom dan rekombinasi untuk mentransmisikan informasi genetik. Pada meiosis I, kromosomkromosom homolog berpasangan dan berpisah. Meiosis II adalah serupa dengan mitosis karena kromosom-kromosom yang sudah terbagi akan berpisah dan mengalami segregasi menjadi sel-sel baru. Pembelahan Meiosis Pertama (Meiosis I) Prophase

Lepotene: Zygotene: Pachytene:

Kondensasi kromosom-kromosom. Proses berpasangan kromosom-kromosom yang homolog (sinapsis) Setiap pasangan kromosom menebal untuk membentuk empat strand. Ini adalah stadium dimana crossing over atau rekombinasi dapat terjadi (pertukaran DNA dari segmen-segmen homolog antara dua dari empat strands). Chiasmata adalah tempat-tempat kontak dimana terjadi crossover (saling silang) (dan dapat divisualisasi). Gerakan blok-blok DNA ini adalah suatu metode untuk menciptakan keanekaragaman genetika. Di sisi lain, penyakit-penyakit genetic dapat diakibatkan oleh insersi sekuensi selama gametogenesis. Rekombinasi transposisi, dengan menggunakan enzim-enzim yang mengenali sekuensi asam nukleat spesifik, memungkinkan insersi suatu elemen genetic ke dalam region apapun dari suatu kromosom. Ini adalah sebuah metode yang digunakan oleh virus-virus (seperti human immunodeficiency virus) untuk metransformasi sel-sel pejamu.

Diplotene:

Separasi longitudinal tiap kromosom.

Metaphase, Anaphase, dan Telophase Meiosis I Membran inti menghilang, dan kromosom-kromosom bergerak ke pusat sel. Satu anggota dari tiap pasangan bergerak ke masing-masing kutub, dan sel-sel kemudian terbagi. Meiosis I seringkali dirujuk sebagai pembelahan reduksi karena tiap produk baru sekarang memiliki jumlah kromosom haploid. Adalah selama pembelahan meiosis pertama terjadi pewarisan ala Mendel. Saling silang yang terjadi sebelum metaphase menghasilkan kombinasi-kombinasi material genetik yang baru, baik itu disukai atau tidak. Pembelahan Meiosis Kedua (Meiosis II) Pembelahan kedua mengikuti yang pertama tanpa replikasi DNA. Pada oosit, meiosis II terjadi setelah fertilisasi. Hasil akhirnya adalah produksi empat sel-sel haploid. Struktur dan Fungsi DNA

DNA adalah material gen yang bertanggung jawab untuk koding pesan genetik yang ditransmisikan melalui protein-protein spesifik. Oleh karena itu, ini adalah molekul kehidupan yang paling penting dan mekanisme fundamental untuk evolusi. Gen-gen adalah segmen-segmen DNA yang memberi kode untuk protein-protein spesifik, bersama dengan flanking dan intervening sequences yang memiliki fungsi pengontrolan dan pengaturan. Tiap molekul DNA memiliki tulang punggung deoksiribosa, kelompokkelompok pengulang identik gula deoksiribosa yang dihubungkan melalui ikatan-ikatan fosfodiester. Tiap deoksiribosa dilekatkan secara berurutan (memberi individualitas dan spesifisitas) pada satu dari empat asam-asam nukleat, basa-basa nuklear (inti): Sebuah purine adenine atau guanine Sebuah pyrimidine thymine atau cytosine. Sebuah nukleotida adalah blok bangunan dasar dari DNA. Ia terdiri atas tiga komponen utama: gula deoksiribosa, sebuah grup fosfat, dan suatu asam basa nukleat. Hubunganhubungan gula-fosfat adalah asimetrik; fosfor dihubungkan ke 5-karbon dari satu gula dan ke 3-karbon dari gula berikut. Sehingga, satu ujung adalah ujung 5 (5 prime) dan yang lainnya ujung 3 (3 prime). Dengan konvensi, DNA dan sekuensi-sekuensi asam intinya ditulis dari kiri ke kanan, dari ujung 5 ke ujung 3, arah proses transkripsi. Ujung 5 menuju ke pembentukan ujung amino dari protein; ujung 3 membentuk ujung karboksi dari protein. DNA terdiri atas dua strand deoksiribosa yang tergulung berputar satu sama lain searah jarum jam dalam bentuk heliks ganda, dengan asam-asam nukleat pada sisi dalam dan basa-basa nuclear dipasang-pasangkan oleh ikatan hydrogen, adenine dengan thymine dan cytosine dengan guanine. RNA berbeda dari DNA dalam hal ini adalah single stranded, its sugar moiety adalah ribose, dan ia menggantikan uracil untuk thyminen. Bagaimana bisa DNA sebuah sel, yang ukuran-ukuran regangnya hampir dua meter panjangnya, muat di dalam sebuah sel? Watson dan Crick menjelaskan hal ini ketika mereka mengajukan sebuah heliks yang memiliki dua strands yang ter coiled secara ketat, yakni heliks ganda. Seperti halnya sentimeter sebagai ukuran panjang, demikian pula the base pair (bp) adalah unit ukuran untuk DNA. The base pair adalah adenine-guanine atau cytosine-thymine, asam nukleat dari satu rantai yang berpasangan dengan asam nukleat yang menghadap dari rantai lainnya. Oleh karena itu, sebuah fragmen DNA diukur dengan

jumlah base pairs, misalnya sebuah fragmen 4.800 bp (suatu fragmen 4,8 kb). Diperkirakan bahwa kita memiliki 3,2 miliar bp DNA, yang mana hanya sebagian kecilnya yang sebenarnya memberi kode untuk protein-protein. Proses replikasi DNA mulai dengan pemisahan heliks DNA yang berstrand ganda, dimulai pada langkah-langkah multiple oleh kerja enzim. Dengan DNA orisinil unwinds ke dalam strand-strand cetakan, DNA polymerase mengkatalisis sintesis strand-strand duplikat baru, yang membentuk kembali sebuah heliks ganda dengan setiap strand-strand orisinil (ini disebut replikasi). oleh karena itu, tiap molekul anak mengandung satu dari strand orangtuanya. Diperkirakan bahwa molekul DNA orisinil hadir dalam zygote yang difertilisasi harus dikopi sekitar 1015 kali selama perjalanan kehidupan manusia. Kecepatan dan akurasi adalah penting. Dengan mengkombinasi presisi dengan sistem-sistem koreksi kekeliruan, maka kekeliruan yang mempengaruhi fungsi proteinnya gen adalah dengan mengejutkan jarang. Homeobox adalah suatu sekuensi DNA, yang sangat dikonservasi sepanjang evolusi, yang mengkode serangkaian 60 asam-asam amino, yang disebut homeodomain. Produk-produk protein homeodomain berfungsi sebagai faktor-faktor transkripsi dengan berikatan pada DNA. Homeobox mempengaruhi fungsi-fungsi jaringan spesifik yang kritis bagi pertumbuhan dan perkembangan embrio. Genom Manusia Genom untuk tiap spesies terdiri atas set komplit sekuensi-sekuensi DNA pada semua kromosom. Terdapat 3,2 miliar base pairs pada setiap genom manusia haploid; dalam DNA heliks double-stranded, terdapat enam miliar nukletida, dan terdapat sekitar 30.000 sampai 35.000 gen, unit fungsional terkecil dari informasi yang diwariskan. Gen-gen berjumlah hanya sekitar 2% dari DNA manusia. Meskipun secara sekilas sangat kompleks, bahasa genetic seluruhnya dituliskan dengan hanya empat huruf: A, C, G, dan T (U pada RNA). Lagipula, bahasanya terbatas hanya pada kata-kata 3 huruf, codons. Akhirnya, pesan genetic keseluruhan difragmentasi ke dalam 23 pasang kromosom. Dengan empat nukleotida, grup-grup pembaca dari tiga, terdapat 64 kombinasi yang mungkin. Secara esensial semua organisme hidup menggunakan kode ini. Genom hanya berubah dengan kombinasi-kombinasi baru yang diwarisi dari orangtua atau dengan mutasi. Struktur dan Fungsi Gen

Pengaturan linear banyak gen membentuk sebuah kromosom. Sebuah gen tersusun atas sebuah segmen DNA yang mengandung exons yang dipisahkan oleh introns, codons koding dan nonkoding dari nukleotida, berturut-turut. Pola intron-exon cenderung dipertahankan selama evolusi. Gen-gen alfa- dan beta-globin diyakini muncul 500 juta tahun lalu, dengan introns pada lokasi yang sama seperti saat ini. Exon Segmen sebuah gen yang menghasilkan sebuah produk messenger RNA yang memberi kode untuk satu protein spesifik. Intron Segmen sebuah gen yang tidak direpresentasi dalam RNA matur, dan karenanya, nonkoding untuk protein. Codon Sebuah sekuensi dari tiga basa dalam RNA atau DNA yang memberi kode untuk sebuah asam amino spesifik; the triplet codon. Dengan beberapa pengecualian, diyakini dahulu bahwa satu gen menghasilkan hanya satu protein. Namun, melalui mekanisme yang dikenal dengan alternative splicing, 30.000 sampai 35.000 gen-gen manusia dapat memproduksi lebih dari 100.000 protein. Sebagaimana yang dicatat di atas, introns tidak ditranslasi menjadi produk-produk protein. Hanya sekuensi-sekuensi DNA di dalam exons (bagian yang exits nukleus) ditranskripsikan ke dalam messenger RNA dan kemudian ditranslasi menjadi proteinprotein. Namun demikian variasi-variasi (alternative splicing) dapat menghasilkan proteinprotein terkait. Gen-gen juga mencakup sekuensi-sekuensi flanking yang penting untuk transkripsi gen. Area yang akan menginisiasi aksi DNA (misalnya ikatan DNA ke kompleks hormonreseptor) disebut suatu region enhancer. Area actual dimana transkripsi mulai adalah region promoter. Hanya sedikit sekuensi-sekuensi nukleotida yang relative pendek adalah promoter, seperti sekuensi T-A-T-A-A, atau kotak TATA, dan sekuensi C-C-A-A-T, atau kotak CAT. Lokasi-lokasi promoter (lokasi-lokasi ikatan untuk RNA polymerase dan banyak kofaktor) adalah biasanya di dekat titik awal dari region koding gen. Lokasi-lokasi enhancer adalah lebih besar daripada lokasi-lokasi promoter dan dapat berlokasi di mana

saja, bahkan jauh dari gen nya, namun biasanya berada di ujung flanking 5. Pada ujung 3, sebuah sekuensi koding biasanya ada untuk ekor polyadenine (poly-A) yang umum untuk kebanyakan molekul-molekul messenger RNA. Lokasi-lokasi enhancer mengikat protein-protein (protein-protein pengatur) yang berperan sebagai signal-signal untuk meregulasi ekspresi gen dengan cara baik meningkatkan atau merepresi pengikatan RNA polymerase dalam region promoter. Ini adalah satu metode menciptakan fungsi-fungsi seluler yang unik. sebagai contoh, sebuah jaringan target hormon dapat berespons terhadap hormonnya karena ia mengandung sebuah protein reseptor khusus yang, pada pengikatan ke hormon, akan berikatan pada sebuah lokasi enhancer DNA. Protein-protein spesifik (disebut faktor-faktor transkripsi) berikatan ke lokasi-lokasi enhancer dan mengaktivasi transkripsi. Regulasi transkripsi gen biasanya melibatkan sekuensi-sekuensi DNA pada region upstream flanking 5 dari sebuah gen. Tiga codon (UAG, UAA, UGA) disebut stop codons, karena mereka mengkhususkan sebuah pemberhentian bagi translasi RNA menjadi protein (seperti sebuah titik pada akhir satu kalimat). Sebaliknya, sebuah open reading frame adalah suatu serial panjang dari base pairs antara dua stop codons; karenanya, sebuah open reading frame memberi kode sekuensi asam amino produk protein. Menemukan dan mengidentifikasi suatu open reading frame adalah satu langkah penting dalam menganalisa sekuensi-sekuensi DNA karena sekuensi yang demikian panjang biasanya hanya ditemukan pada sebuah gen yang aktif. Ekspresi gen terdiri atas langkah-langkah berikut: transkripsi DNA ke RNA, pemrosesan RNA untuk menghasilkan messenger RNA yang fungsional dengan cara splicing out introns, translasi messenger RNA pada sebuah ribosome ke sebuah rantai peptide, dan pemrosesan structural protein ke bentuk fungsional. Transkripsi Transkripsi adalah sintesis messenger RNA yang ber strand tunggal dari sebuah gen (double-stranded DNA). Sekuensi asam amino proteinnya diberi kode dalam DNA leh codons; asam amino tunggal diberi kode oleh tiap codon, sebuah triplet dari tiga basa asam nukleat. RNA polymerase membangung messenger RNA dengan cara membaca strand DNA (strand antisense) yang bersifat komplementer pada RNA; sehingga, RNA adalah sebuah kopi yang tepat dari strand DNA lainnya (strand sense), yang juga disebut strand

komplementer dari molekul DNA (ingat, perbedaanp-perbedaan penting adalah bahwa thymine pada DNA digantikan oleh uracil, dan ribose menggantikan deoxyribose pada RNA). Komplementaritas molekuler adalah suatu konsep yang sulit namun juga sederhana untuk dipahami. Aspek sederhananya adalah konsep satu hal menjadi seperti yang lain. Bagian sulitnya adalah keharusan untuk memahami dan memvisualisasi bahwa molekul komplementer tidaklah identik dengan cetakannya, namun lebih seperti tempat dimana cetakan masuk ke dalam, dan molekul komplementer pergi keluar. Sehingga, strand-strand heliks ganda tidaklah identik. Setiap strand DNA memiliki struktur komplementer, dalam arti, satu cetakan positif dan satu cetakan negative, masing-masing menspesifikasi yang lainya. Oleh karena itu, setiap strand berperan sebagai suatu cetakan bagi DNA komplementernya (dalam proses replikasi) atau RNA komplementer (dalam proses transkripsi). Sehingga, messenger RNA disintesis dari cetakan negative, strand antisense, sehingga ia akan memiliki struktur yang sama seperti cetakan positif, yakni strand sense. Para ahli biologi molekuler harus berpikir dalam tiga dimensi! Transkripsi diawali pada lokasi start upstream, regio flanking yang tidak ditranslasi 5 dimana dua strands dari heliks ganda menjadi berpisah. Proses ini terus berlanjut kea rah bawah, dengan mengkopi salah satu dari strand hingga sebuah codon spesifik dicapai, yang memberi satu pesan berhenti. Sintesis RNA terus dengan tambahan satu rantai panjang adenines, ekor poly-A; inilah regio yang tidak ditranslasi 3 yang diyakini menstabilkan RNA dengan cara mencegah degradasi. Setelah transkripsi dari sebuah gen, RNA bergerak ke dalam sitoplasma dimana regio-regio intron dieksisi, dan exons bergabung bersama (RNA splicing) untuk menghasilkan sebuah molekul RNA matur yang komplit. Mulai dan akhir dari setiap exon dan intron memiliki sekuensi-sekuensi yang, ketika dikopi ke RNA, memberi signal sebuah enzim untuk mengeluarkan bagian-bagian yang intervening. Hampir semua introns mulai dengan GU dan berakhir dengan AG (GT dan AG pada intron DNA). Intron-intron memiliki panjang yang bervariasi; sebuah intron tunggal dapat lebih panjang daripada produk RNA akhir. Molekul RNA matur memiliki sebuah tambahan pada satu ujung (capping, dengan penambahan sebuah nukleotida termodifikasi, 7-metil guanosine) untuk memproteksi terhadap ribonuklease (RNases) dan pada ujung lainnya, sebuah ekor polyadenine (the poly-A tail) ditambahkan (selain dari faktor stabilisasi, mungkin sebuah signal untuk mengarahkan exit dari nukleus). Kedua ujung adalah tidak ditranslasi dalam ribosomes.

Faktor-faktor Transkripsi. Faktor-faktor transkripsi adalah protein-protein yang terikat pada elemen-elemen regulator dalam DNA (enhancers dan promoters) dan karenanya mempengaruhi ekspresi gen. Reseptor-reseptor hormon steroid adalah faktor-faktor transkripsi. Transkripsi gen dan pembentukan messenger RNA dapat distimulasi ataupun diinhibisi melalui interaksi-interaksi langsung dengan DNA. Faktor-faktor transkripsi dapat lebih lanjut berinteraksi dengan faktor-faktor lain (koaktivator dan korepresor, juga disebut protein-protein adapter) untuk menghasilkan efek-efek kooperatif. Aktivitas protein-protein ini juga dapat dipengaruhi oleh fosforilasi yang dicetuskan oleh signalsignal dari reseptor-reseptor permukaan sel (seringkali faktor-faktor pertumbuhan). Sebuah konsep penting adalah untuk melihat hasil akhir dari aktivitas hormonal dan ekspresi gen sebagai suatu refleksi dari cellular context, kondisi dan aktivitas faktor-faktor transkripsi sebagaimana yang dipengaruhi oleh protein-protein adapter intraseluler spesifik. Ini menjelaskan bagaimana agen-agen serupa (dan faktor-faktor transkripsi serupa, misalnya reseptor estrogen) dapat memiliki kerja yang berbeda pada jaringan-jaringan yang berbeda. Translasi Messenger RNA berjalan dari kromosom pada mana ia disintesis ke sebuah ribosome dalam sitoplasma, dimana ia mengarahkan perakitan asam-asam amino menjadi protein (translasi). Setiap sel memiliki karakteristik namun dinamis dan selalu mengganti proteome, kumpulan protein-protein yang unik bagi sel tersebut. Asam-asam amino dibawa ke dalam proses oleh molekul-molekul RNA transfer khusus. Sekuensi spesifik dari tiga basa pada satu ujung dari transfer RNA adalah komplementer bagi codon yang melakukan koding bagi asam amino spesifik itu. Pengikatan area ini ke codon messenger RNA menempatkan asam amino spesifik tersebut yang di ujung lain menjadi sekuensi yang sesuai bagi protein nya. Asam-asam amino ditempatkan satu per satu ketika molekulmolekul transfer RNA membaca cetakan RNA, mulai pada ujung asam amino (ujung 5) dan berakhir pada ujung carboxy (ujung 3). Proses ini mulai pada triplet AUG pertama dan berlanjut hingga sebuah stop codon (UAA, UAG, atau UGA) dicapai, yang mana di tempat tersebut messenger RNA menjatuhkan ribosome dan berdegenerasi. Sekuensi asamasam amino linear khusus dispesifikasi oleh koding genetik; pada gilirannya, sekuensi ini menentukan bentuk 3-dimensi dari protein, struktur berlipat yang perlu untuk fungsi. Ekspresi akhir sebuah gen dapat saja tidak berakhir dengan proses translasi. Pemrosesan protein lanjut (pascatranslasi) terjadi, seperti glycosylation (gonadotropins) atau

proteolytic cleavage (konversi pro-opiomelanocortin ke ACTH). Ini dirujuk sebagai modifikasi epigenetika. Mekanisme-mekanisme yang menghasilkan protein-protein dari gen-gen adalah serupa sepanjang dunia biologis. Ini berarti bahwa pengetahuan penting mengenai fungsi manusia dapat diperoleh dengan mempelajari organisme-organisme sederhana, dan mikroba-mikroba dapat direkayasa untuk menghasilkan protein-protein manusia. Mutasi-mutasi Banyak gen ada dalam beragam bentuk, disebut allele. Perubahan dalam sekuensi DNA yang menghasilkan perubahan dalam struktur atau fungsi protein yang berbahaya membangun sebuah mutasi. Substitusi merujuk pada perubahan dalam asam basa nukleat tunggal. Sebuah substitusi dalam sebuah codon dapat menghasilkan inkorporasi asam amino yang salah ke dalam sebuah protein, menimbulkan perubahan atau kehilangan fungsi. Insersi atau penghilangan asam-asam amino ke produk akhir protein dapat dihasilkan dari splicing RNA yang tidak tepat. Karena kelebihan yan banyak dalam kode genetic (banyak triplet codons memberi kode untuk asam amino yang sama, dan hanya ada 20 asam amino), maka tidak semua substitusi menghasilkan suatu efek. Sebuah contoh klinis dari substitusi basa tunggal (mutasi titik) adalah mutasi sickle, dimana thymine disubstitusi untuk adenine pada gen beta-globin. Jika regio-regio DNA homolog menjadi tidak selaras, maka dapat terjadi saling silang yang tidak sama, mengakibatkan penghilangan dan penyisipan (tambahan). Sebuah nonsense mutation merujuk pada suatu substitusi basa tunggal yang menghasilkan sebuah stop codon, truncating produk protein. Penghilangan dan penyisipan dapat melibatkan basa-basa tunggal, hingga seluruh exons, atau gen-gen atau beberapa gen. Rekombinasi atau pertukaran material genetic biasanya terjadi dalam meiosis. Bahkan sebuah perubahan pada junksi dari suatu regio koding dan nonkoding dapat menghasilkan messenger RNA yang abnormal. Abnormalitas Kromosom Abnormalitas Numerik Abnormalitas numeric biasanya sehubungan dengan nondisjunction, sebuah kegagalan pemisahan pada anaphase, baik saat pembelahan mitosis ataupun meiosis. Aneuploidy adalah jumlah kromosom yang tidak merupakan multipel tepat dari jumlah haploid,

10

misalnya monosomi (45,X Turner-syndrome) atau trisomi (trisomi 13 Patau syndrome, trisomi 18 Edwards syndrome, trisomi 21 Down syndrome, 47,XXY Klinefelter syndrome). Mosaicism mengindikasikan satu atau lebih garis-garis sel dengan kariotipe yang berbeda, biasanya muncul dari nondisjunction saat mitosis awal (kegagalan dari dua kromosom yang berpasangan untuk berpisah). Polyploidy, multipel jumlah kromosom haploid, adalah suatu penyebab signifikan akan keguguran spontan. Abnormalitas Struktural Abnormalitas structural biasanya sehubungan dengan pemecahan kromosom yang diinduksi oleh radiasi, obat-obat atau virus. Abnormalitas hasilnya tergantung pada pengaturan kembali bagian-bagian yang pecah. Karenanya, pada suatu translocation terdapat saling tukar material antara dua atau lebih kromosom yang nonhomolog. Sebuah translokasi yang seimbang dikaitkan dengan tidak mendapatkan ataupun kehilangan material genetic, dan individu demikian adalah seorang pembawa translokasi (translocation carrier). Defek-defek Gen Tunggal Defek-defek gen tunggal dikarenakan oleh mutasi-mutasi pada gen-gen khusus. Mutasimutasi ini ditransmisikan sesuai dengan pewarisan ala Mendel: dominan otosom, resesif otosom, resesif terkait-X, dan jarang dominan terkait-X. Selain itu, gangguan-gangguan gen tunggal dapat ditransmisikan dengan cara pewarisan gen mitokondrial, imprinting maternal atau paternal, disomy (mewariskan kedua pasangan dari suatu kromosom dari satu induk), dan pengulangan yang berlebihan (sebuah fenomena dimana lebih dari pengulangan biasa dari tiga base pairs terjadi). Dominansi Otosomal. Transmisi tidak terkait dengan jenis kelamin satu individu, dan anak-anak homozigot maupun heterozigot terkena (hanya satu allele perlu untuk abnormal). Dengan dua orangtua yang heterozigot, tiap anak memiliki risiko 75% terkena. Dengan satu orangtua yang heterozigot, setiap anak memiliki risiko 50% untuk terkena. Efeknya adalah sesuai dengan beragam ekspresi. Contoh-contoh kondisi dominan otosom mencakup penyakit Huntington, neurofibromatosis, dan sindroma Marfan. Efek dari gen dominan yang abnormal dipengaruhi oleh penetrance, derejat gen dominan tersebut diekspresikan. Penetrance yang komplit, berlawanan dengan penetrance tidak komplit,

11

berarti bahwa gen ini selalu diekspresikan dan selalu menghasilkan fenotipe yang dapat dikenali. Resesif Otosomal. Kondisi-kondisi ini secara fenotipik diekspresikan hanya pada homozigot (kedua allele harus abnormal). Dengan orangtua yang heterozigot, setiap anak memiliki 25% risiko terkena dan 50% peluang menjadi carrier. Contoh-contoh kondisi resesif otosomal adalah kistik fibrosis, penyakit sickle cell, dan hyperplasia adrenal sehubungan dengan defisiensi pada 21-hydroxylase. Pewarisan Resesif Terkait-X. Seorang ayah yang terkena dapat mentransmisikan kondisi ini hanya pada anak perempuan. Hanya wanita yang homozigot yang terkena ketika kondisinya resesif. Tiap anak laki-laki dari seorang carrier wanita memiliki 50% peluang menjadi terkena dan tiap anak perempuan 50% peluang menjadi carrier. Kebutaan warna merah-hijau dan hemofilia A adalah contohnya. Imprinting Genomik Imprinting genomic mengindikasikan pengaruh-pengaruh yang menetap pada fungsi genom oleh kontribusi-kontribusi orangtua laki-laki dan perempuan. Sebagai contoh, perkembangan plasenta dikontrol kebanyakan oleh gen-gen yang diturunkan secara paternal. Sehingga, mola hidatidiform memiliki kariotipe normal, namun semua kromosomnya adalah diturunkan dari ayahnya. Struktur-struktur plasenta tidak ada dalam teratoma ovarium, tumor-tumor yang mengandung hanya kromosom yang diturunkan secara maternal. Eksperimen-eksperimen pada alam dan eksperimen hewan mengindikasikan bahwa kontribusi maternal pada genome adalah lebih penting untuk perkembangan embrionik. Pada kondisi-kondisi resesif otosomal tertentu, ekspres, keparahan, dan usia awitan dipengaruhi oleh jenis kelamin orangtua yang memberikan gen atau kromosom mutan. Teknik-teknik Biologi Molekuler Sebuah enzim yang memecah ikatan-ikatan fosfodiester dan memotong molekul DNA menjadi fragmen-fragmen adalah sebuah endonuklease; sebuah restriction enzyme (restriction endonuclease) hanya memotong pada lokasi-lokasi dengan sekuensi asam nukleat khusus. Enzim-enzim restriksi ditemukan pada bakteri dimana mereka membentuk sebuah mekanisme pertahanan untuk memotong (dan karenanya menginaktivasi) DNA

12

asing apapun (dari virus-virus yang menginvasi) yang diintroduksi ke dalam sel bakteri. Sebagai bagian dari mekanisme proteksi ini, bakteri juga mengandung methylases yang memetilasi lokasi-lokasi rekognisi pada DNA asli, mengarahkan aksi enzim restriksi ke DNA asing yang tidak dimetilasi (nonmethylated foreign DNA). Bakteri yang berbeda memiliki enzim-enzim restriksi yang berbeda dengan lokasi-lokasi aksi spesifik. Enzimenzim restriksi tersedia yang memotong DNA menjadi bagian-bagian (fragmen-fragmen restriksi), berkisar dari banyak fragmen kecil hingga beberapa potongan besar, tergantung pada jumlah nukleotida pada sekuensi rekognisi. Mereka dinamakan untuk organisme dan strain dariman mereka berasal. Kombinasi fragmen-fragmen restriksi, penggabungan dua potongan DNA, menghasilkan recombinant DNA. DNA polymerase adalah suatu enzim yang membawa nukleotida-nukleotida tunggal ke dalam sebuah molekul DNA. Sebuah DNA polymerase dapat membentuk DNA hanya pada adanya sebuah cetakan DNA; DNA yang disintesis akan menjadi komplementer bagi cetakan. RNA polymerase dapat membuat RNA juga hanya pada adanya cetakan DNA. Desoxyribonuclease (DNAase) dapat mengeluarkan nukleotida. Dengan

mengkombinasikan penanganan DNAase dengan aksi DNA polymerase, nukleotidanukleotida yang di radiolabeled dapat diintroduksi ke dalam molekul DNA, menghasilkan suatu DNA probe. Sebuah DNA probe dapat dibandingkan dengan antibodi yang digunakan dalam immunoassays. Antibody ini adalah khusus dan mengenali hormon terhadap mana ia dibentuk. DNA probe secara khusus mendeteksi sekuensi DNA. Reverse transcriptase adalah DNA polymerase yang dependen RNA. Ini disebut reverse transcriptase karena aliran informasi adalah dari RNA ke DNA, kebalikan dari arah aliran biasa. Enzim ini memungkinkan pengkopian secara esensial molekul RNA apapun menjadi single-stranded DNA; DNA demikian disebut complementary DNA karena ia adalah gambar cermin dari messenger RNA. Probe-probe complementary DNA dibatasi oleh pembacaan mereka hanya exons (ingat bahwa introns dieksisi dari RNA), dan makanya probe-probe ini hanya membaca area-area besar. DNA dan RNA adalah molekul-molekul bermuatan, karenanya akan bermigrasi dalam bidang elektris. Fragmen-fragmen dapat dianalisa dengan elektroforesis gel (agarose atau polyacrylamide), fragmen-fragmen terbesar yang memigrasikan yang paling lambat.

13

Dengan konvensi, gel-gel dibaca dari atas ke bawah, dengan fragmen-fragmen terkecil di bawah. Southern Blot Analysis DNA pertama didenaturasi untuk memisahkan dua strand, dicerna oleh enzim-enzim restriksi untuk menghasilkan fragmen-fragmen yang lebih kecil yang dimuat ke dalam suatu gel elektroforesis. The southern blot method, dinamakan sesuai penemunya E.M. Southern, menentukan ukuran-ukuran fragmen. Fragmen-fragmen dipisahkan oleh elektroforesis. Gel elektroforesis ditempatkan di atas sebuah lembaran tebal kertas penyaring dengan ujungnya dicelup di dalam larutan garam tinggi. Sebuah membrane khusus (nitroselulosa) ditempatkan di atas gel, dan di atas ini ditempatkan tumpukan handuk kertas yang dikompresi oleh sebuah beban. Larutan garam naik oleh aksi wick ke dalam kertas penyaring; ia bergerak dengan aksi kapiler melalui gel, membawa DNA dengannya. DNA dibawa ke membrane nitrsoselulosa pada mana ia terikat. Larutan garam tetap bergerak dan diserap oleh handuk kertas. Membrane nitroselulosa lalu menciptakan sebuah replica dari pola elektroforesis orisinil. DNA difiksasi ke membrane baik dengan pembakaran suhu tinggi atau dengan sinar ultraviolet. Kemudian probe-probe berlabel khusus dapat diintroduksi untuk hybridization. Hybridization berarti bahwa sebuah probe khusus anneals to sekuensi komplementernya. Fragmen-fragmen dengan sekuensi ini kemudian diidentifikasi oleh otoradiografi. Probe-probe fluoresen dapat digunakan yang dapat dideteksi setelah aktivasi oleh sebuah sinar laser, memungkinkan penilaian kualitatif dan kuantitatif oleh sebuah computer. Northern blotting merujuk pada pemrosesan RNA, Northern karena RNA adalah gambar lawan dari DNA. RNA yang diekstraksi dipisahkan oleh elektroforesis dan ditransfer ke sebuah membran selulosa seperti pada Southern blotting untuk hibridisasi dengan probe (complementary DNA). Northern blotting akan digunakan, sebagai contoh, untuk menentukan apakah stimulsi hormon dari sebuah protein spesifik dalam suatu jaringan dimediasi oleh messenger RNA, yakni ekspresi gen. Elektroforesis untuk memisahkan protein disebut Western blotting, dan antibodi-antibodi digunakan untuk proses identifikasi hibridisasi. Seperti Northern blotting, Western blotting mengetes ekspresi gen, tidak hanya adanya sebuah gen. Istilah Northern dan Western merepresentasikan witticisms yang sengaja (kejadian langka dalam ilmu pengetahuan)

14

sebagai respons terhadap Southern blotting. Hibridisasi tanpa elektroforesis dengan menempatkan satu tetes ekstrak sel secara langsung di atas kertas penyaring disebut dot or slot blotting. Ketika dua strand komplementer DNA melakukan reasosiasi, maka prosesnya disebut hibridisasi. Hibridisasi memungkinkan suatu area khusus DNA untuk dipelajari dengan menggunakan sebuah probe DNA yang ber radiolabel yang spesifik (sebuah sekuensi komplementer). Membran nitroselulosa yang diproduksi Southern blotting pertama diperlakukan untuk memblok lokasi-lokasi ikatan nonspesifik. Membrannya kemudian diberi perlakuan (dihibridisasi) dengan probe yang berlabel. Lokasi probe ikatan kemudian diidentifikasi oleh otoradiografi (untuk probes yang ber radiolabel) atau oleh metode colorimetric. Sehingga, sekuensi probe menentukan sekuensi pada tempat ikatan. Kapanpun dua produk adalah komplementer, maka terjadi hibridisasi. Oleh karena itu, DNA komplementer dapat dihibridisasi ke messenger RNA cetakannya. Hibridisasi in situ adalah teknik dimana probe-probe DNA atau RNA berlabel ditempatkan secara langsung pada sebuah slide jaringan atau sel-sel. Dapat digunakan sepotong DNA yang dikloning yang diberi label dengan sebuah penanda fluoresen; metodenya disebut FISH (fluorescence in situ hybridization). Regio yang berkorespondensi dengan DNA yang dikloning menyala di bawah penyinaran fluoresen kecuali bila regionya telah dihilangkan dari salah satu kromosom. Beberapa sindrom microdeletion telah ditemukan dengan teknik FISH., misalnya sindrom Prader-Willi. ..... Technology Metode ini mendeteksi ekspresi gen, mengetes ribuan gen secara simultan. DNA kloning komplementer dihibridisasi dengan DNA komplementer berlabel yang disiapkan dari jaringan yang akan dipelajari. Jika jaringan itu mengekspresikan sebuah gen, maka signal berlabel mudah diobservasi. Produksi chips gen spesifik memungkinkan teknik ini mencari mutasi-mutasi dan polimorfisme. The microarray gene chip adalah array fisik DNA yang secara simultan dapat mengidentifikasi ribuan produk-produk mRNA yang unik pada sampel-sampel heterogen. Proses yang sangat otomatis ini dapat mengindikasikan ekspresi yang berbeda gengen sebagai respons akan beragam stimuli atau kondisi. Polymerase Chain Reaction (PCR)

15

Polymerase chain reaction (PCR) adalah teknik untuk mengamplifikasi (relatif cepat) fragmen-fragmen kecil atau area-area DNA ke dalam kuantitas yang cukup besar untuk dianalisis dengan elektroforesis dan metode-metode blotting. Teknik ini menghasilkan jumlah kopian yang besar sekali akan sekuensi DNA khusus tanpa resorting ke kloning. Sekuensi yang akan diamplifikasi harus diketahui. Petanda-petanda khusus (sekuensisekuensi DNA pendek yang disintesis berkoresponding dengan tiap ujung dari sekuensi yang akan dipelajari) diseleksi yang akan delineate regio DNA yang akan diamplifikasi. Sekuensi-sekuensi flanking ini disebut primers. Sampel DNA, the primers, dan kelebihan nukleotida tunggal bebas diinkubasi dengan DNA polymerase. Langkah pertama melibatkan pemisahan DNA menjadi strand-strand tunggalnya dengan cara denaturasi dengan panas (92oC); kemudian suhu diturunkan (40oC), yang menyebabkan the primers melekat (anneal) pada regio-regio komplementer mereka pada DNA. Suhu dinaikkan hingga 62oC, dan DNA polymerase lalu mensintesis sebuah strand baru yang mulai dan berakhir pada the primers, membentuk double-stranded DNA yang baru. Mengulangi siklusnya banyak kali (dengan mengubah suhu reaksi) mengamplifikasi jumlah DNA yang tersedia untuk dipelajari (lebih dari 1 juta kali lipat); kenaikannya terjadi secara eksponensial. Sehingga, DNA bisa dianalisa dari sebuah sel tunggal, dan gen-gen dapat divisualisasi dengan blotting tanpa probe-probe yang berlabel. Karena prosesnya membutuhkan pemanasan dan pendinginan yang berganti-ganti, maka DNA polymerase yang resisten terhadap panas adalah keuntungan dimana replenishment periodic tidak diperlukan. Masalah ini diatasi dengan penemuan DNA polymerase (Taq polymerase) dalam sebuah mikroorganisme (Thermus aquaticus) yang adalah sebuah thermophile (mikroba air-panas) dan ditemukan di sebuah out-of-the-way Yellowstone National Park hot spring called Mushroom Pool. Polymerase bersuhu tinggi ini memungkinkan otomasi prosesnya. Teknik polymerase chain reaction telah dibuat mungkin untuk meneliti DNA dalam jumlah yang sangat sedikit dari jaringan atau cairan tubuh apapun. Sindroma Down dapat didiagnosis dari sedikit sel fetus yang diperoleh dari darah ibu. Hal yang mengesankan adalah amplifikasi jumlah kecil DNA yang terdegradasi dari spesies yang punah dan langka diawetkan di museum. DNA dari fosil-fosil telah diamplifikasi dan dibuat sekuensi (misalnya dari tanaman magnolia berumur 18 juta tahun). Metode ini juga memungkinkan untuk mengidentifikasi sebuah gen melalui ekspresi messenger RNA nya. RNA adalah

16

cetakan untuk amplifikasi dengan pertama-tama mengkonversinya menjadi DNA komplementer. Polymerase chain reaction digunakan untuk mendeteksi mikroba, memberi hasil dalam beberapa jam bahkan dengan adanya obat-obat antimikroba. Metode ini dapat mendeteksi bakteri yang tidak bisa diisolasi dengan teknik kultur. Kloning DNA Kloning berarti mengisolasi sebuah gen dan membuat kopiannya. Sebuah perpustakaan DNA adalah koleksi molekul-molekul DNA yang berasal dari metode kloning. Perpustakaan DNA komplementer adalah DNA counterpart dari semua messenger RNA yang diisolasi dari sel atau jaringan tertentu. DNA komplementer telah diproduksi untuk lebih dari 70% gen manusia dan tikus. Dengan memulai dengan messenger RNA, pencarian akan gen yang dimaksud dapat difokuskan (bukannya mencari keseluruhan genome). Perpustakaan demikian dibuat dengan menggunakan reverse transcriptase. Molekulmolekul DNA kemudian dapat diinsersikan ke dalam vector yang sesuai (dijelaskan di bawah) dan mereplikasi molekul-molekul yang dapat diproduksi. Dengan menggunakan probes, DNA komplementer dapat diseleksi yang sesuai dengan gen yang dimaksud (ingat bahwa DNA komplementer hanya mencakup exons dari sebuah gen). Kloning DNA berarti produksi banyak kopian identik dari fragmen DNA yang dispesifikasi. Kloning juga dapat dilakukan dengan menggunakan polymerase chain reaction. Sebagaimana yang diindikasikan di atas, kloning DNA komplementer berfokus pada DNA counterpart dari messenger RNA; kloning DNA genomic, dengan menggunakan endonuklease restriksi, kopia DNA dalam gen. Kloning juga dapat digunakan untuk membuat kopian probes yang beragam atau fragmen-fragmen DNA yang tidak diketahui. Jika sekuensi asam amino tidak diketahui, kita dapat bekerja ke belakang. Dengan mengetahui produk protein spesifik, antibody-antibodi dapat diproduksi melawan protein. Ketika DNA komplementer diinsersikan ke dalam vektor-vektor tertentu, produksi protein dapat diidentifikasi dengan antibodi-antibodi; sehingga fragmen DNA akan terisolasi. Sebuah vektor adalah sebuah entitas dimana DNA asing dapat diinsersikan. Vektor ditambah DNA asing diinsersikan ke dalam sel pejamu; sel pejamu menghasilkan baik vektor maupun DNA asing. Vektor-vektor pertama adalah plasmid bacterial, molekulmolekul DNA sirkuler (minikromosom) yang koeksis di dalam sitoplasma dengan DNA kromosom bacterial. Hal yang paling penting dicatat, mereka membawa gen-gen yang

17

memberi kode untuk resistensi antibiotika. Hal ini memampukan sel-sel bakteri yang mengandung plasmid yang akan diseleksi oleh terapi antibiotika yang tepat. Vektor-vektor plasmid juga telah dikembangkan yang memungkinkan seleksi oleh warna. Beragam strain bakteri telah dikembangkan, masing-masing untuk penggunaan khususnya. Gangguan DNA plasmid dengan enzim-enzim restriksi, yang disertai dengan inkorporasi DNA asing dengan DNA ligase, menghasilkan molekul-molekul DNA plasmid (DNA rekombinan yang mengandung DNA asing) yang dapat direplikasi. Vektor-vektor plasmid dapat menginkorporasi fragmen-fragmen DNA asing hingga 10 kb ukurannya. Pencernaan plasmid-plasmid yang pulih dengan enzim-enzim restriksi melepaskan fragmen DNA yang diinginkan, yang kemudian dapat dipulihkan dengan elektroforesis. Vektor lain ada. Bakteriofag (atau phages) adalah virus-virus yang menginfeksi dan bereplikasi di dalam bakteri. Vektor-vektor phage dapat menginkorporasi sisipan DNA yang lebih besar, hingga 20 kb. Kloning DNA dengan vektor phage mengikuti rancangan dasar yang sama seperti plasmid. Fragmen-fragmen DNA asing yang lebih besar dikloning dengan vektor cosmid, yang secara artificial diproduksi kombinasi vektor-vektor phage dan plasmid. Fragmen-fragmen yang sangat besar, hingga 1.000 kb, dapat dikloning dengan menggunakan kromosom artificial ragi. Metode ini dapat bekerja dengan keseluruhan gen. Langkah-langkah Dasar untuk Kloning 1. Pilih sumber DNA: baik itu DNA genomic atau DNA komplementer 2. Fragmentasi DNA nya dengan endonuklease restriksi. 3. Sisipkan fragmen-fragmen ke dalam vektor. 4. Introduksi vektor ke dalam bakteri 5. Kumpulkan DNA yang dikloning yang terpropagasi dalam bakteri untuk membentuk sebuah perpustakaan
6. Skrining perpustakaan untuk sekuensi yang diinginkan. Metode-metode yang

mungkin mencakup penggunaan probes nukleotida komplementer untuk fragmenfragmen yang menghibridisasi atau deteksi protein spesifik yang dihasilkan dengan antibodi terhadap proteinnya atau dengan cara assaying fungsi proteinnya.

18

Model-model Hewan Knockout Model-model hewan untuk fungsi sebuah gen memakai metode knocking out sebuah gen spesifik. Pada sebuah demonstrasi yang sederhana namun penting, dapat ditentukan apakah sebuah gen spesifik dan protein-proteinnya adalah esensial untuk kehidupan, atau untuk sebuah fungsi (seperti kehamilan). Identifikasi Gen Untuk mengkloning sebuah gen keseluruhan yang produk proteinnya telah diketahui, maka sebuah perpustakaan DNA komplementer dihasilkan. Fragmen DNA spesifik diidentifikasi dengan cara menghubungkannya dengan protein. Setelah teridentifikasi, gen total dapat diskrining dengan menggunakan DNA komplementer yang teridentifikasi, mengidentifikasi introns dan exons. Strategi lainnya adalah untuk mensintesis suatu probe oligonukleotida, mendasarkan sekuensinya pada sekuensi asam amino yang telah diketahui dalam produk protein (dari sekuensi peptide, sekuensi DNA yang memberi kode untuk protein itu dapat diprediksi). Metode ini dapat digunakan dengan hanya potongan peptide yang relatif kecil. Dengan semakin banyaknya gen yang dikloning, frekuensi codon untuk asam-asam amino tertentu ditentukan. DNA komplementer dapat dikloning tanpa memproduksi suatu perpustakaan dengan menggunakan polymerase chain reaction untuk mengamplifikasi DNA komplementer yang dibuat dari messenger RNA oleh reverse transcriptase. Sekuensi-sekuensi tumpang tindih dari genom dapat dikloning, dengan menggunakan sepotong DNA dari tiap produk yang berhasil, untuk bekerja pada sebuah kromosom dengan cara yang sistematik untuk mencari sebuah gen; ini disebut chromosome walking. Seluruh proses sekuensi dapat dikerjakan dengan computer, bahkan mencari open reading fames. Setelah diidentifikasi sekuensi fragmen DNA, maka komputer dapat menggunakan database DNA dan protein untuk memprediksi sekuensi, lokasi rekognisi, translasi protein, dan homologi dengan sekuensi yang dikenal. Ilmuwan kemudian dapat menyeleksi ukuran-ukuran fragmen restriksi untuk kloning. Setelah gen dianalisa, harus dibandingkan dengan gen dalam keadaan penyakit. Jika mutasi berukuran besar, ini dapat dideteksi dengan Southern blotting. Perubahan minor membutuhkan perbandingan dalam sekuensisekuensi DNA, yang mungkin dengan menggunakan amplifikasi rantai polymerase untuk menghasilkan sekuensi gen spesifik pada jumlah yang siap dipelajari.

19

Sebuah gen dapat dilokalisasi ke kromosom spesifik ketika produk proteinnya tidak diketahui dengan studi-studi yang melibatkan pengaturan kembali kromosom dan analisis hubungan. Penyakit-penyakit spesifik dikaitkan dengan perubahan-perubahan kariotipik. Sehingga, kromosom spesifik dapat ditargetkan untuk lokalisasi gen. Analisis hubungan menggunakan polimorfisme panjang fragmen restriksi. Polimorfisme DNA Southern blotting menunjukkan pola-pola spesifik dari bands yang merefleksikan berbagai panjang fragmen-fragmen DNA yang diproduksi oleh kerja enzim restriksi. Sebuah lokasi yang spesifik dapat menunjukkan sebuah mutasi dengan memiliki suatu pola yang berbeda (panjang yang berbeda dari fragmen DNA pada Southern blotting sehubungan dengan perbedaan sekuensi). Perbedaan-perbedaan dalam sekuensi DNA ini disebut polimorfisme panjang fragmen restriksi (polimorfisme nukleotida-tunggal), atau hanya polimorfisme, biasanya suatu variasi jinak. Ini adalah variasi-variasi umum; genom manusia mengandung sekitar 10 juta polimorfisme, dan lebih dari 3 juta telah diidentifikasi. Sebuah polimorfisme dapat berperan sebagai penanda genetic bagi gen yang penting secara medis. Suatu polimorfisme diatur oleh regulasi pewarisan ala Mendel, dan jika ternyata suatu polimorfisme teridentifikasi pada seorang pasien dengan penyakit spesifik, maka transmisi penyakitnya dapat dipelajari. Polimorfisme, yang dikaitkan dengan penyakit by chance, dapat digunakan untuk mempelajari pewarisan suatu penyakit ketika gen-gen nya tidak diketahui. Polimorfisme adalah seperti sebuah bendera yang menandai area-area kromosom spesifik. Metode studi ini membutuhkan DNA dari sekurang-kurangnya satu individu yang terkena dan jumlah anggota keluarga yang cukup untuk melacak polimorfisme, baik dengan Southern blotting (untuk sekuensi-sekuensi panjang) atau dengan polymerase chain reaction (terbaik untuk sekuensi-sekuensi pendek). Korelasi penanda-penanda genetik (polimorfisme) dan fenotipe juga memakai haplotypes (serupa dengan suatu polimorfisme namun sekuensi nukleotida yang lebih panjang, bahkan satu set dari beberapa polimorfisme). Minisatellites adalah satu bentuk polimorfisme. Gen-gen berkonsentrasi pada area-area acak sepanjang kromosom yang dipisahkan oleh sekuensi-sekuensi panjang DNA nonkoding. Minisatellites adalah area-area nonkoding DNA yang berulang dalam jumlah yang bervariasi, yang disebut tandem repeat sequences, didistribusikan sepanjang setiap kromosom manusia. Area-area ini dapat diikuti oleh probes DNA, dengan menyediakan

20

fingerprint bagi individu-individu spesifik. Keunikan ini diaplikasikan dalam kedokteran forensic. Microsatellites, sebagaimana arti namanya, adalah lebih kecil dari minisatellites. Biasanya, microsatellites terdiri atas pengulangan hanya dua nukleotida. Polimorfisme DNA sekarang berjumlah ribuan dan memungkinkan pemetaan genetic dengan presisi yang hebat. Proyek Genom Manusia Semua gen manusia secara kolektif dikenal dengan genom. Dimulai pada tahun 1990, tujuan dari Human Genome Project internasional adalah untuk mensekuensi 3,2 miliar base pairs genom manusia, satu tujuan yang dicapai dalam bentuk draft pada tahun 2001 dan 99% sekuensi actual pada tahun 2003, lebih dari dua tahun lebih cepat daripada jadwal, 50 tahun setelah publikasi Watson dan Crick. Jumlah gen (30.000 sampai 35.000) adalah lebih kecil daripada estimasi sebelumnya. Kurang dari 2% genom manusia memberi kode untuk protein; oleh karena itu, sisanya adalah sumber daya yang kaya untuk ahli sejarah evolusi dan sebuah target untuk menginduksi perubahan genetika. Jumlah gen pada kromosom spesifik bervariasi; kromosom yang dipengaruhi oleh trisomi, kromosom 13, 18, dan 21, memiliki gen paling sedikit. Sekuensi DNA dari genom manusia tersedia untuk diunduh: www.ncbi.nlm.nih/gov/genome/guide/human Peta kaitan genetik dapat berperan sebagai suatu fondasi bagi pencarian lokasi penyakit dan untuk mengintegrasi sekuensi genetic dengan fungsi-fungsi biologis. Segera, kita akan mampu memiliki CD pribadi yang mengandung cetak biru genetik komplit individual. Departemen Energi Amerika Serikat memelihara sebuah Web site yang memberikan informasi dasar dan links yang berguna ke situs-situs lainnya mengenai proyek genom manusia: http://www.ornl.gov/techresources/human_genome/publicat/publictions.html lokasi-lokasi kromosom dari gen-gen yang bertanggung jawab untuk produksi hormon dengan cepat dipetakan. Dari sekuensi DNA yang dikloning, sekuensi-sekuensi asam amino dapat diprediksi. Setiap produk protein dari sebuah gen mencerminkan target diagnostic atau terapeutik yang potensial. Dan tentu saja, gangguan-gangguan yang diturunkan akan menjadi subjek karakterisasi dan, akhirnya, terapi gen. Namun demikian,

21

bahkan setelah satu gen telah teridentifikasi dan dipetakan secara genetis, karakterisasi penuh masih merupakan tugas yang sulit dan memakan waktu. Pemahaman penuh akan gangguan-gangguan yang melibatkan interaksi-interaksi gen-gen multipel akan menjadi bahkan lebih rumit. Namun kemajuan molekuler adalah tidak terelakkan. Masa depan akan melihat kedokteran pencegahan dengan prediksi. Dengan mengetahui konstitusi genetic individu, maka skrining yang sesuai dan intensif dapat diarahkan bagi kondisi-kondisi yang berpredisposisi. Pengetahuan macam ini akan juga membutuhkan pertimbangan sosial dan politik. Bukan hal yang jauh untuk melihat perkawinan dan kehamilan dihindari karena pertemuan predisposisi genetic yang buruk. Masyarakat sedang mengembangkan pedoman mengenai penggunaan informasi ini: oleh individu, oleh para pemilik usaha, oleh organisasi kesehatan, dan oleh pemerintah. Kemajuan ilmiah harus bersesuaian dengan pendidikan public dan professional untuk secara tepat mengelola pengetahuan ini. Genomics dan Proteomics Genomics merujuk pada seluruh proses yang terlibat dalam Human Genome Project, deskripsi komplit dari sekuensi genetic, dan ini kemudian mengindikasikan studi ekspresi gen, khususnya dengan menggunakan teknik microarray dengan gene chips. Namun, genomics tidak akan menceritakan keseluruhan kisah. Produk-produk protein dari ekspresi gen diubah dalam proses translasi dan juga oleh modifikasi-modifikasi pascatranslasi seperti glycosylation, methylation, dan phosphorylation. Oleh karena itu, kisah lengkapnya, membutuhkan proteomics, studi produk-produk akhir fungsional secara biologis, protein-protein dari suatu sel atau suatu jaringan. Baik genomics maupun proteomics dibutuhkan untuk memahami fisiologi, mendiagnosis penyakit, dan untuk desainobat-obat baru. Identifikasi protein membutuhkan pemisahan protein-protein dengan elektroforesis, pencernaan protein-protein besar menjadi protein-protein yang lebih kecil, pengukuran kandungan asam amino oleh spektrofotometri massa, dan identifikasi khusus protein-protein dengan perbandingan dengan databases terkomputerisasi. Profil-profil massa protein sel-sel normal dan abnormal kemudian dapat dibandingkan. ... Aplikasi

22

Tantangan bagi kedokteran modern adalah untuk memahami banyaknya koleksi data yang dihasilkan oleh proyek genom. Dengan memahami fungsi gen dan protein akan menjadi gambaran pengakselerasi kemajuan manusia. Diagnosis molekuler kelainan-kelainan genetic membutuhkan hanya sampel DNA yang kecil, yang didapat dari sel apapun yang berinti, seperti sel-sel darah putih atau sel-sel epitel. Polymerase chain reaction yang dilaksanakan oleh mesin otomatis memungkinkan diagnosis DNA yang cepat dengan material yang diamplifikasi dari sebuah sel tunggal. Ini adalah keunggulan yang penting dalam hal analisis genetika pra natal dan dalam hal diagnosis dan pemilihan jenis kelamin sebelum implantasi. PCR memungkinkan untuk melaksanakan diagnosis DNA dari sebuah sel tunggal yang dikeluarkan dari embrioembrio yang difertilisasi secara in vitro. Diagnosis molekuler terbatas oleh prevalensi perubahan genetic heterogen. Dengan kata lain, banyak gangguan melibatkan mutasi-mutasi yang berbeda pada orang-orang yang berbeda. Sebaliknya, beberapa (seperti penyakit sickle cell) selalu melibatkan perubahan yang sama. Dengan kistik fibrosis, 70% pasien (keturunan Eropa utara) memiliki penghilangan 3-basa yang sama, sedangkan sisanya 30% memiliki koleksi mutasi yang sangat heterogen. Diagnosis molekuler selanjutnya ditantang oleh kebutuhan tidak hanya untuk menemukan perubahan yang tersamar pada suatu gen namun juga untuk membedakan perubahan-perubahan penting dari variasi-variasi yang jinak (polimorfisme). Metode-metode berbasis-PCR ingenious telah dikembangkan untuk skrining dan deteksi mutasi yang cepat. Makna penting mutasi-mutasi yang terdeteksi membutuhkan segregasi mutasi dengan suatu penyakit yang teridentifikasi dalam sebuah keluarga. Sekurang-kurangnya satu jenis defisiensi hormon pertumbuhan diwariskan dalam pola resesif-otosomal. Kloning DNA hormon pertumbuhan yang komplementer terhadap messenger RNA nya memungkinkan lokalisasi gen hormon pertumbuhan. Gen hormon pertumbuhan adalah dalam sebuah cluster yang juga mencakup gen untuk laktogen plasenta manusia. Cluster gen-gen ini mengandung beragam unit DNA yang homolog dan tunduk pada rekombinasi, yang mengakibatkan penghilangan pada satu kromosom dan duplikasi pada lainnya. mekanisme serupa bekerja untuk produk-produk protein lain yang diatur oleh gen-gen dalam cluster, seperti globin. Produksi komersial protein-protein dari gen-gen yang dikloning yang diinsersikan ke dalam bakteri cepat meningkat. Produksi insulin (pertama) dan hormon pertumbuhan

23

adalah contoh-contoh yang baik. Glikosilasi tidak terjadi pada sistem bacterial, dan kareanya produksi komersial glikoprotein-glikiprotein rekombinan membutuhkan jalur sel mamalia untuk prosesnya. Ini telah dicapai, dan gonadotropin-gonadotropin rekombinan saat ini tersedia. Gen untuk hormon pelepas-gonadotropin pada lengan pendek kromosom 8 telah diisolasi dan dikloning. Teknologi molekuler adalah penting dalam karakterisasi inhibin, hormon folikuler ovarium yang menginhibisi sekresi follicle stimulating hormone (FSH). Gen inhibin telah disekuensi dan ditemukan homolog dengan gen untuk hormon antimullerian. Subunit-alfa yang umum untuk gonadotropin, hormon penstimulasi-tiroid, dan human chorionic gonadotropin (hCG) telah dilacak ke sebuah gen yang telah diisolasi, disekuensi, dan dilokalisasi pada kromosom 6. Insersi suatu gen asing ke dalam embrio menghasilkan hewan yang transgenik. Gen asing yang diinsersikan akan ada dalam banyak jaringan, dan jika hewan ini fertile, ia akan diwariskan. Terdapat banyak aplikasi untuk hewan-hewan transgenic. Hewan-hewan transgenik memberikan model-model hewan untuk penyakit-penyakit yang diwariskan dan tumor-tumor ganas serta memberikan suatu cara untuk melaksanakan eskperimen dalam terapi gen. Transfer gen-gen baru atau yang berubah adalah suatu metode penting untuk mempelajari fungsi gen. Tanaman-tanaman transgenic bahkan dapat dikembangkan untuk menghasilkan obat-obat baru, dan introduksi gen-gen yang conferring resistensi terhadap insekta mungkin memecahkan masalah kontaminasi insektisida. Genom manusia mengandung banyak gen dengan potensi menyebabkan kanker. Gen-gen lain memiliki kemampuan untuk memblok pertumbuhan keganasan. Kanker adalah penyakit genetika yang pada mana tumor-tumor dapat dikatakan sebagai klonal; semua sel terkait secara genetika. Oncogenes, ditemukan dalam virus-virus tumor, adalah gen-gen yang mentransformasi sel-sel dari pertumbuhan normal ke abnormal dengan cara melakukan koding protein-protein yang terlibat dalam transduksi signal, secara spesifik transmisi pesan-pesan pengatur-pertumbuhan. Terdapat banyak oncogen dan banyak jalur aksi yang berbeda-beda, yang semuanya menghasilkan status proliferative. Mutasi-mutasi yang mengaktivasi gen-gen ini mendorong pada aktivitas protein yang independen akan signal-signal yang datang atau pada aktivitas di tempat salah di waktu yang salah. Garis dasarnya adalah dimulainya pertumbuhan yang persisten (oleh oncogene yang berubah). Terdapat pula antioncogene pada sel-sel normal, gen-gen yang mensupresi pertumbuhan yang harus diinaktivasi sebelum tumor dapat bertumbuh. Kerentanan terhadap kanker yang

24

diwariskan dapat juga dihasilkan oleh mutasi pada gen-gen supresor tumor. Meskipun aktivasi sebuah oncogene adalah efek yang dominan, mutasi-mutasi supresor tumor adalah resesif dan dapat dibawa dan ditransmisikan, namun tidak aktif selama pasang-pasangan terjadi dengan suatu antioncogene normal. Oleh karena itu, kanker adalah suatu penyakit genetika, namun regulasi pertumbuhan normal melibatkan suatu sistem kompleks yang memakan waktu lama untuk diatasi. Selama periode waktu ini, teknologi DNA rekombinan mungkin dapat mencapai diagnosis yang cukup dini untuk menghasilkan penyembuhan. Dengan mengetahui oncogene spesifik yang terlibat dalam suatu tumor tertentu juga menawarkan kemungkinan terapeutik. Sebagai contoh, sebuah antimetabolit dapat dilekatkan ke antibodi untuk sebuah oncogene, yang menargetkan sel-sel kanker. Biologi molekuler sedang mengalami perubahan baik diagnosis maupun terapi. DNA virus dan bakteri dapat diidentifikasi. Proses PCR otomatis dapat menghasilkan pola-pola elektroforesis yang dapat dibaca secara otomatis. Denga teknik ini, sebuah molekul DNA human papillomavirus tunggal dapat dideteksi di antara 10.000 atau lebih sel-sel manusia. Beberapa ratus tes genetika saat ini digunakan di klinis. Produksi protein endogen yang salah dapat dikoreksi dengan cara menggantikan mekanisme yang problematic. Terdapat dua strategi: sel-sel asing yang memproduksi protein yang hilang dapat diintroduksi, atau gen yang salah dapat digantikan (atau lebih akurat, menambahkan DNA terkoreksi komplementer). Oleh sebab itu, gangguangangguan gen tunggal resesif berpotensi untuk terapi gen, dan juga penyakit-penyakit yang didapat seperti kanker dan infeksi. Terapi gen secara luas didefinisikan sebagai the enlistment mesin seluler pasien sendiri untuk menghasilkan bahan terapeutik. Sebuah gen yang dimasukkan ke dalam sel dapat menggantikan gen yang rusak atau hilang ataupun menghasilkan protein dengan efek yang diharapkan. Namun, ini adalah bidang ilmu yang masih dalam tahap bayi. Pedoman khusus untuk terapi gen telah dikembangkan yang membutuhkan beberapa tingkat kajian ulang. Satu kelas terapi manusia adalah penggunaan vektor-vektor retrovirus untuk mentransfer gen-gen penanda ke dalam sel-sel manusia yang dikultur yang dikembalikan ke pasien asalnya. Sebagai contoh, ini memungkinkan pelacakan limfositlimfosit yang menginfiltrasi tumor, hepatosit-hepatosit donor, atau sel-sel T killer yang spesifik untuk human immunodeficiency virus. Gen-gen yang ditransfer ini dapat juga di

25

crafted untuk menyediakan fungsi pada pasien-pasien dengan gangguan-gangguan yang diwariskan gen-tunggal. Kelas terapi lainya melibatkan transfer gen yang memberi kode untuk faktor-faktor yang menghancurkan sel-sel tumor, seperti tumor necrosis factor atau interleukin. Vektor-vektor retrovirus adalah virus-virus yang telah diubah sehingga tidak ada protein virus yang dapat dibuat oleh sel-sel yang diinfeksi oleh vektor. Oleh karenanya, replikasi dan penyebaran virus dicegah, namun transfer gen ke dalam sel-sel yang bereplikasi dapat terjadi. Metode-metode transfer lainnya yang sedang dikembangkan mencakup penggunaan vektor-vektor adenovirus dan secara khusus DNA plasmid yang ditargetkan.