Extrao de DNA plasmidial (Lise alcalina Birboin e Doly, 1979 modificado)

Soluo I: 20mg/ml lisozima*, 50mM glicose, 10mM EDTA, 25mM Tris-HCl-pH 8 Soluo II: 0,2N NaOH, 1% SDS Soluo III: 3M acetato de sdio pH 4.8 Soluo IV: 0,1M acetato de sdio, 0,05M Tris HCl pH 8 * dispensvel para E.coli. 1. Crescer a bactria em 1.5ml de caldo LB com ampicilina (50g/ml) durante 4 horas sob agitao constante; 2. Centrifugar por 1 minuto a 9000 g a 4C; 3. Desprezar o sobrenadante invertendo o tubo; 4. Suspender o sedimento em 100l de soluo I; 5. Incubar a 27C por 30 minutos; 6. Adicionar 200l da soluo II e homogeneizar por inverso cuidadosamente (etapa crtica); 7. Incubar a 0C por 5 minutos; 8. Adicionar 150l da soluo III e homogeneizar por inverso cuidadosamente; 9. Incubar a 0C por 1 hora; 10. Centrifugar por 5 minutos a 9000 g a 4C; 11. Transferir 250l para um novo tubo; 12. Adicionar um ml de etanol absoluto gelado; 13. Incubar a -20C por 30 minutos; 14. Centrifugar por 2 minutos a 9000 g a 4C; 15. Remover o sobrenadante cuidadosamente; 16. Suspender o sedimento em 100l de soluo IV; 17. Adicionar 200l de etanol absoluto gelado; 18. Incubar a -20C por 10 minutos;

19. Centrifugar por 2 minutos a 9000 g a 4C; 20. Remover o sobrenadante cuidadosamente; 21. Suspender o sedimento em 36l de gua Milli-Q estril e 4l de RNase 1mg/ml). Manter a amostra a 0C. 22. Quantificar a concentrao de DNA plasmidial; 23. Aplicar 5l do material extrado em gel de agarose 1% para anlise por eletroforese. 24. Congelar at o momento do uso.