Uji sifat biokimia isolat Uji fermentasi karbohidrat Langkah-langkah yang digunakan dalam uji fermentasi karbohidrat adalah

h menyiapkan kaldu karbohidrat yaitu glukosa, sukrosa, laktosa, maltosa, dan manitol masing-masing 1%. Kaldu karbohidrat yang mengandung BTB (brom timol biru) sebagai indikator pH dan ditambahkan pepton sebagai sumber nitrogen, vitamin dan mineral dimasukkan dalam tabung reaksi yang dilengkapi tabung Durham. Kemudian diinokulasi dengan biakan bakteri. Setelah itu diinkubasi dalam inkubator pada suhu 30oC selama 24 jam. Selanjutnya fermentasi karbohidrat diperiksa dengan melihat pembentukan asam (warna kuning) dan pembentukan gas dalam tabung Durham (Lay, 1994). Uji methyl red Uji methyl red digunakan untuk membedakan dua tipe utama dari spesies bakteri anaerob enteric. Organisme-organisme tersebut pertama-tama memetabolisme glukosa secara aerob, menghabiskan seluruh oksigen yang tersedia. Langkah-langkah yang digunakan dalam uji methyl red adalah disiapkan kaldu MR-VP, lalu dimasukkan 5 mL kaldu MR-VP dalam tabung reaksi dan diinokulasikan biakan bakteri ke dalam kaldu MR-VP, diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam atau pada suhu 30oC selama 72 jam. Hari berikutnya ditambahkan reagen metil merah 5 tetes, jika kaldu berwarna merah setelah penambahan reagen metil merah maka menunjukan hasil uji positif, dan jika warna kaldu berwarna kuning maka hasil uji negatif (Lay, 1994).

Uji Voges Proskauer

Uji Voges Proskauer digunakan untuk mendeteksi asetoin. Asetoin adalah senyawa intermediet yang dihasilkan oleh organisme yang dihasilkan melalui fermentasi glukosa. Kaldu MR-VP sebanyak 5 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi, diinokulasi bakteri pada kaldu MR-VP, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Setelah itu ditambahkan 10 tetes larutan KOH 40% dan 15 tetes larutan -naftol, dikocok dan dibiarkan 30 menit. Uji positif jika kaldu berwarna merah dan uji negatif jika kaldu tidak mengalami perubahan warna setelah penambahan reagen (Lay, 1994).

Uji oksidase Biakan ditumbuhkan pada media nutrien agar (NA), diinkubasi selama pada suhu 30 oC selama 24 jam, kemudian ditambahkan reagen uji oksidase (campuran 1:1 larutan -naftol 1% dan 1% larutan dimetil-p-fenilendiamin oksalat) pada koloni bakteri dan didiamkan selama 30 menit. Uji positif jika warna koloni berubah menjadi hitam (Lay, 1994).

Uji katalase Biakan ditumbuhkan pada media NA dengan cara ditotolkan dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 30oC kemudian ditambahkan reagen H2O2 3 %. Uji positif ditandai dengan pembentukan gelembung udara pada biakan dan disekitarnya (Lay, 1994). Uji katalase digunakan untuk mengetahui aktivitas katalase pada bakteri yang diuji. Kebanyakan bakteri memproduksi enzim katalase yang dapat memecah H2O2 menjadi H2O dan O2. Enzim katalase diduga penting untuk pertumbuhan aerobik karena H 2O2 yang dibentuk dengan pertolongan berbagai enzim pernafasan bersifat racun terhadap sel mikroba. Beberapa

bakteri yang termasuk katalase negatif adalah Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, dan Clostridium. Uji ini dilakukan dengan langkah: 1. Mengambil kultur sampel dengan ose secara aseptis dari agar miring dengan meijarkan ose dan mendinginkannya. 2. Biakan digoreskan pada petridish agar sel rata dan tidak bertumpuk. 3. Kultur mikroba kemudian ditetesi 1-2 tetes H2O2 3% agar aktivitas katalase pada mikroba dapat diketahui. 4. Petridish ditutup kembali agar tidak ada kontaminasi dan memaksimalkan mikroba untuk merombak H2O2. 5. Amati ada tidaknya gelembung-gelembung kecil. Jika terdapat gelembung maka dalam petridish tersebut merupakan bakteri katalase positif, sebaliknya jika tidak ada gelembung termasuk bakteri katalase negatif. Keberadaan H2O2 pertama kali dideteksi pada kultur Pneumococcus, sebuah organismeyang tidak memproduksi katalase dan sedikit sensitif terhadap peroksida. Organisme yang tidak memproduksi katalase dilindungi oleh penanaman dengan jaringan hewan atau tumbuhan atau organisme lain yang mempunyai kemampuan memproduksi enzim. Katalase diproduksi oleh beberapa bakteri. Beberapa bakteri diantaranya memproduksi katalase lebih banyak daripada yang lain. Ini ditunjukkan dengan jumlah yang banyak pada bakteri aerob. Sedangkan enzim tidak diproduksi oleh bakteri anaerob obligat karena mereka tidak memerlukan enzim tidak diproduksi oleh bakteri anaerob obligat karena mereka tidak memerlukan enzim tersebut. Bakteri katalase positif seperti S. Aureus bisa menghasilkan gelembung-gelembung oksigen karena adanya pemecahan H2O2 (hidrogen peroksida) oleh enzim katalase yang

dihasilkan oleh bakteri itu sendiri. Komponen H2O2 ini merupakan salah satu hasil respirasi aerobik bakteri, misalnya S. aureus, dimana hasil respirasi tersebut justru dapat menghambat pertumbuhan bakteri karena bersifat toksik bagi bakteri itu sendiri. Oleh karena itu, komponen ini harus dipecah agar tidak bersifat toksik lagi. Bakteri katalase negatif tidak menghasilkan gelembung-gelembung. Hal ini berarti H2O2 yang diberikan tidak dipecah oleh bakteri katalase negatif, misalnya, L.casei sehingga tidak menghasilkan oksigen. Bakteri katalase negatif tidak memiliki enzim katalase yang menguraikan H2O2.

Uji indol Uji indol digunakan untuk menentukan kemampuan suatu organism untuk mengubah asam amino triptofan menjadi indol, ammonia, dan asam piruvat. Jika suatu organism memiliki enzim triptofanase, penghilangan gugus amino dari triptofan akan membentuk indol. Medium tripton cair dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 5 mL, diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35oC, kemudian ditambahkan beberapa tetes reagen Kovacs.

Jika terbentuk warna merah dipermukaan medium menunjukkan hasil uji positif (Waluyo, 2008).

Uji sitrat Uji sitrat dilakukan untuk mengetahui ada atau tidaknya enzim yang memungkinkan sitrat masuk ke dalam sel dan digunakan sebagai sumber karbon untuk metabolisme dan pertumbuhan.

Media yang digunakan adalah Simon sitrat agar yang berisi indicator pH bromotimol blue, yang akan berubah menjadi hijau dalam kondisi asam dan biru gelap ketika media berubah menjadi alkali. Organism yang memakai sitrat akan menghasilkan reaksi alkali. Biakan diinokulasi pada media Simmon sitrat agar dengan inokulum yang tipis, kemudian diinkubasi pada suhu 350C selama 48 jam. Jika terjadi perubahan warna dari hijau menjadi biru menunjukan uji positif (Lay, 1994).

Uji pencairan gelatin Biakan diinokulasi pada media dengan cara menusukkan mikroba yang akan diujikan sedalam bagian dari lapisan permukaan, kemudian diinkubasi pada suhu 350C selama 24 jam. Jika media gelatin mencair, maka langkah selanjutnya dimasukkan dalam lemari es selama 30 menit. Diamati pencairan gelatin, jika terdapat gelatin yang mencair menunjukkan uji positif. Namun jika tidak mencair maka di inkubasi kembali selama 1 minggu pada suhu 350C. Uji negatif jika setelah 1 minggu gelatin tidak mencair sedikitpun (Lay, 1994).

Uji hidrogen sulfida ( H2S) Inokulasi biakan pada tabung reaksi yang telah berisi media TSIA 7 mL dengan cara menusukkan jarum ose ke dalam media kemudian baru diinokulasi pada bagian slant TSIA. Inkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Diamati pertumbuhannya pada bagian Butt dan Slant (Lay, 1994).

Uji urease Inokulasi biakan pada media urea agar miring dengan mikroorganisme, kemudian diinkubasi pad suhu 350C selama 24 jam. Jika terjadi perubahan warna dari kuning menjadi merah keunguan maka menunjukkan uji positif (Hadioetomo, 1985).

Uji selulase Inokulasi biakan pada media Luria agar (LA) yang mengandung CMC

(karboksimetilselulase) pada cawan Petri

dengan melubangi agar pada cawan dengan

menggunakan cut borer sebanyak 4 sampai 5 lubang (Gambar 19.a), kemudian diinokulasi dengan cara mengambil 1 ose biakan kemudian dimasukkan dalam 1 mL aquades steril lalu dihomogenkan dengan menggunakan pipet mikro sebelum dipipet lalu diinokulasi pada lubang yang terdapat pada agar sebanyak 100 L . Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada inkubator dengan posisi tidak terbalik pada suhu 37oC. Uji positif ditunjukkan dengan terbentukknya zona bening di sekitar daerah inokulasi (Yulianingsih, 2007). O O O
(a)

O O
( b)

Gambar 19. (a) Bentuk lubang dan (b) bentuk goresan pada media uji.

Uji protease Inokulasi biakan pada media LA yang mengandung susu skim pada cawan Petri dengan membagi media menjadi 4 bagian dengan menggunakan spidol pada bagian luar cawan petri, kemudian digoreskan inokulum pada 4 bagian media tersebut (Gambar 19.b). Kemudian

diinkubasi selama 24 jam pada inkubator dengan suhu 37 oC. Uji positif ditunjukkan dengan terbentukknya zona bening di sekitar daerah goresan (Akhdiya, 2003). Uji hidrolisis pati Biakan diinokulasi pada media NA yang mengandung pati, dengan cara melubangi agar pada cawan dengan menggunakan cut borer sebanyak 4 sampai 5 lubang (Gambar 19.a), kemudian diinokulasi dengan cara mengambil 1 ose biakan kemudian diencerkan dalam 1 mL aquades steril lalu dihomogenkan dengan menggunakan pipet mikro sebelum dipipet dan diinokulasi pada lubang yang terdapat pada agar sebanyak 100 L . Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada inkubator dengan posisi tidak terbalik pada suhu 37 oC. Uji positif ditunjukkan dengan terbentukknya zona bening di sekitar daerah inokulasi (Yulianingsih, 2007).

Uji reduksi nitrat Uji nitrat dilakukan dengan menumbuhkan mikroorganisme pada kaldu nitrat dalam tabung reaksi yang telah dilengkapi dengan tabung Durham, kemudian diinkubasi pada suhu 35oC selama 24 jam. Setelah masa inkubasi, diperhatikan adanya gas dalam tabung Durham dan nitrit dalam media biakan. Keberadaan nitrit dalam media diuji dengan penambahan asam sulfanilat dan -naftilamin yang akan bereaksi dengan nitrit yang ditunjukkan dengan perubahan warna media menjadi merah atau merah muda. Pada tabung yang tidak menunjukkan perubahan warna, ditambahkan bubuk Zn untuk melihat reduksi nitrat menjadi nitrit. Bila didapatkan nitrat dalam medium, maka kaldu berubah warna menjadi merah muda atau merah karena Zn mereduksi nitrat menjadi nitrit dan nitrit ini bereaksi dengan reagen uji dan terbentuk warna merah (Lay, 2004).