1

RESUMEN
Las enzimas, proteínas con la capacidad de transformar un sustrato en un producto
gracias a su potencial catalítico. Realizan la reacción en razón a una velocidad de
transformación del sustrato a producto traduciéndose en actividad enzimática. En este
informe se da a conocer el comportamiento de la enzima “Biolactasa NTL” de acuerdo a 2
diferentes temperaturas de operación y sustrato.
En la primera experiencia se da a conocer los efectos de la actividad y estabilidad de la
enzima. Se obtiene que a una mayor temperatura en el medio de reacción esta actividad
aumenta, donde a 55°C la actividad medida en leche semi-descremada y lactosa es de
8847 y 9987 [UI/mL] respectivamente. En cuanto a la perdida de estabilidad medida a los
10 minutos, se obtiene que a una temperatura de 45°C es de un 14,4%, mientras que a
temperatura de 55°C la perdida es mayor, alcanzando un 17%.
La puesta en marcha de un reactor enzimático en comparación con un reactor de cultivo
celular, a modalidad por lotes, su operación y control es más simple de acuerdo al manejo
de menores variables, ya que en este caso se monitorea factores como pH y temperatura.
Como segunda experiencia se evalúa el comportamiento del reactor en forma teórico-
práctica en relación al grado de conversión del sustrato lactosa a los monosacáridos,
glucosa y galactosa, alcanzando sólo un 52,9%, transcurrida 2,3 horas de operación del
reactor.
En la última experiencia, correspondiente a la elaboración de manjar, donde la hidrolisis
parcial de la lactosa resulta efectiva al momento de concentración de sólidos, pues por
medición en refractómetro, la leche tratada con enzima, alcanza la concentración
requerida de 60-70°Brix, en menor tiempo de operación. Proporcionando propiedades
organolépticas, que la leche sin tratamiento enzimático pierde durante el proceso, como lo
es el efecto nocivo de la cristalización de lactosa.


2

INDICE GENERAL
1. Introducción ............................................................................................................ 3
2. Materiales y métodos ............................................................................................. 4
2.1. Determinación de azucares reductores por la técnica de miller (dns) ..................... 4
2.2. Método de glucostat. .............................................................................................. 4
2.3. Metodología analítica. ............................................................................................ 5
2.3.1. Determinación del grado de hidrólisis de la leche. .................................................. 5
2.4. Metodología experimental. ..................................................................................... 6
2.4.1. Determinación de la actividad de la enzima. ........................................................... 6
2.4.2. Determinación de la concentración de glucosa (utilizando lactosa como sustrato) . 6
2.4.3. Determinación de la concentración de glucosa (utilizando leche como sustrato) .... 7
2.4.4. Determinación de la estabilidad de la enzima. ........................................................ 7
2.4.5. Puesta en marcha del reactor. ................................................................................ 7
2.4.6. Hidrólisis enzimática de lactosa. ............................................................................. 8
2.4.7. Fabricación del manjar. .......................................................................................... 8
3. Resultados y discusiones ....................................................................................... 9
3.1. Caracterización del preparado enzimático .............................................................. 9
3.1.1. Actividad enzimática ............................................................................................... 9
3.1.2. Estabilidad enzimática .......................................................................................... 11
3.2. Hidrólisis enzimática de la lactosa en un reactor por lotes. ................................... 14
3.3. Hidrólisis enzimática de lactosa para producción de manjar ................................. 16
4. Conclusiones ........................................................................................................ 18
5. Bibliografía ........................................................................................................... 19
6. Anexos ................................................................................................................. 20


3

1. INTRODUCCIÓN
Las enzimas son biocatalizadores de naturaleza proteica con capacidad catalítica,
altamente específica y activa en condiciones moderadas, lo que hace favorable su uso
como catalizadores en la industria de procesos. Los progresos que están realizando
actualmente la ingeniería genética y la biotecnología permiten augurar un desarrollo cada
vez mayor del uso de las enzimas, al disponer de un suministro continuo de materiales
con la actividad deseada a precios razonables.

En el presente informe se muestra el trabajo realizado con el preparado enzimático
Biolactasa-NLT, que actúa de forma similar a la Lactasa en la leche, la cual es una
enzima producida de forma natural en el intestino delgado, y de forma artificial como
preparado enzimático, que juega un papel vital en el desdoblamiento de la lactosa,
mediante una reacción enzimática de hidrolisis, en sus dos componentes básicos: glucosa
y galactosa.

De forma experimental se contemplan tres prácticas de laboratorio, primero se determina
la actividad y la estabilidad al preparado enzimático comercial con el cual se está
trabajando, midiendo generación de producto por el método de glucostat utilizando leche
semi-descremada y lactosa como sustratos. Luego esta enzima se incuba de forma
soluble en un reactor por lotes, con leche semi-descremada como medio de reacción, bajo
condiciones ambientales controladas, donde se determina el grado de hidrólisis de la
leche en razón del tiempo (de lactosa a glucosa y galactosa), determinándose también la
generación de producto por el método de glucostat, y la concentración de lactosa por el
método de DNS.

Finalmente utilizando dos reactores por lotes en las mismas condiciones mencionadas
anteriormente, y cambiando solo que uno contiene la enzima y el otro no, y luego de un
determinado tiempo de reacción y grado de conversión, se lleva a cabo la elaboración de
manjar, hasta llegar a un contenido de sólidos de un 65-70%.

4

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Determinación de azucares reductores por la técnica de Miller (DNS)
El método DNS es una técnica colorimétrica que emplea 3,5-ácidodinitrosalicílico para la
hidrólisis de polisacáridos presentes en una muestra, seguido de la determinación
espectrofotométrica a 540 nm de los azúcares reductores.
Esta técnica sirve para cuantificar los azucares reductores producidos durante una
fermentación o para cuantificar los productos de una reacción enzimática.


Reacción del método
El acido 3,5-dinitrosalicilico en presencia de azúcares reductores se reduce a acido 3-
amino-5-dinitrosalicilico.
2.2. Método de Glucostat.
La glucosa oxidasa es una flavoproteina altamente específica que cataliza la oxidación de
la glucosa a β-D-gluconolactona, sin que ningún otro azúcar natural reaccione en
extensión apreciable.


Reacción del método.
Esta reacción en la que se consume oxígeno podría seguirse manométricamente
mediante un electrodo de oxígeno. Sin embargo, para poder seguir el curso de esta
5

reacción espectrofotométricamente es necesario acoplar a la misma una segunda
reacción enzimática indicadora adecuada. Para la determinación colorimétrica de glucosa
por el método de la oxidasa, se añade al medio peroxidasa de rábano silvestre (HRP),
que elimina el peróxido de hidrógeno a medida que se forma, a la vez que se genera un
colorante adecuado según el siguiente esquema de reacción:


Reacción del método.


Se podrían utilizar como aceptores de oxígeno benzidina, o-toluidina, o-dianisidina. Sin
embargo, la naturaleza carcinogénica de estos compuestos ha impulsado la búsqueda de
aceptores alternativos

2.3. Metodología analítica
2.3.1. Determinación del grado de hidrólisis de la leche.
- Las muestras de leche (2 ml) se reciben en viales los cuales son colocados en un
baño con agua a 80°C para detener la reacción.
- Se toman 0,2 ml de la muestras anterior, se le agrega 0,2 ml de una solución de
sulfato de zinc y 0,2 ml de hidróxido de bario, se centrifugan a 5000 rpm por 5
minutos y se retira el sobrenadante.
- Se toman 0.1 ml del sobrenadante y se le adicionan 1 ml del reactivo enzimático
para determinar glucosa. Si fuese necesario la muestra de sobrenadante se debe
diluir con agua destilada antes de realizar la determinación de glucosa.
- Se incuba la mezcla por 10 minutos a 37ºC y se determina la absorbancia a
505nm.
- Se realiza un blanco utilizando tampón fosfato como muestra y una muestra
Standard con una solución de glucosa de 0.1 g/l
6


2.4. Metodología experimental
2.4.1. Determinación de la actividad de la enzima.
- Se adicionan 4 mL de una solución de Lactosa (100 g/L preparada en tampón
fosfato 0.1 M pH 6), en un tubo de ensayo.
- Se incuba aproximadamente por 5 minutos a 45 °C o hasta que el sustrato alcance
la temperatura de reacción.
- Adiciona 0.1 mL de la muestra enzimática, previamente diluida con tampón fosfato
0.1 M pH 6.
- Agitar suavemente y dejar reaccionar por 5 minutos en un baño a 45 °C.
- Cumplido el tiempo de reacción, tomar la solución y colocarla en un baño con agua
hirviendo, para detener la reacción.
- Realizar un blanco de reacción sin enzima.
- Determinar la concentración de glucosa mediante el metodo de glucostat.

Las experiencias se realizan por triplicado.
- Se repite la experiencia a 55 °C.
- Se repite la experiencia también utilizando leche semidescremada.

2.4.2. Determinación de la concentración de Glucosa (utilizando lactosa como
sustrato)

- En un tubo de eppendorf colocar 0.1 mL de la muestra de reacción enzimática
(inactivada).
- Adicionar 1 mL del reactivo de determinación de glucosa.
- Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Leer la absorbancia de la muestra a una longitud de onda de 505 nm.
- Leer contra un blanco que lleva 0.1 mL de tampón fosfato y 1 mL del reactivo, y
que también es incubado.
- Interceptar en la curva de calibrado.

7

2.4.3. Determinación de la concentración de glucosa (utilizando leche como
sustrato)

- En un tubo de eppendorf colocar 0,2 mL de la muestra de reacción enzimática
(inactivada), adicionar sobre este 0,2 ml de una solución de sulfato de zinc y 0,2 ml
de hidróxido de bario, agitar en un vortex y luego centrifugar a 5000 rpm por 5
minutos.
- En un tubo de eppendorf colocar 0.1 mL del sobrenadante anterior y adicionar 1
mL del reactivo de determinación de glucosa.
- Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Leer la absorbancia de la muestra a una longitud de onda de 505 nm.
- Leer contra un blanco que lleva 0.1 mL de tampón y 1 mL del reactivo, y que
también es incubado.
- Interceptar en la curva de calibrado.

2.4.4. Determinación de la estabilidad de la enzima.

- Preparar 5 mL de una solución enzimática en tampón fosfato 0.1 M pH 6.
- Tomar 0,5 mL de la muestra anterior y medir la actividad inicial (por triplicado),
como se describe previamente.
- Incubar a 45ºC la solución enzimática restante (4,5 mL).
- Cada 10 minutos tomar muestras de la solución enzimática (0,5 mL) y medir su
actividad enzimática residual, como se describe previamente.

Las experiencias deben ser realizadas por triplicado.
- Repetir la experiencia a 55°C


2.4.5. Puesta en marcha del reactor.

- Instalar el reactor.
- Verificar las conexiones de las mangueras y el estado de los sellos.
- Evaluar la potencia de agitación.
8

- Instalar y calibrar el electrodo de pH.
- Poner en marcha el sistema de calefacción.
- Adicionar al reactor el medio de reacción que es la leche a hidrolizar.
- Adicionar la cantidad de enzima lactasa, calculada previamente.
- Instalar el termómetro para medir temperatura.
- Poner en marcha el sistema de agitación que consiste en un agitador mecánico de
hélice.
- Mantener la leche bajo agitación suave y a temperatura constante durante el
tiempo necesario para alcanzar el grado de hidrólisis preestablecido.

2.4.6. Hidrólisis enzimática de lactosa.
- Adicionar la leche descremada seleccionada y medir su pH.
- Tomar una muestra para determinar la concentración de lactosa inicial (tiempo
cero).
- Poner en marcha el sistema de agitación y calentamiento (45°C o 55°C).
- Esperar que el sistema de reacción alcance la temperatura deseada.
- Adicionar la enzima de acuerdo a la razón enzima sustrato entregada.
- Mantener la leche bajo agitación suave y a temperatura constante durante el
tiempo necesario para alcanzar el grado de hidrólisis preestablecido.
Cada 10 minutos sacar muestras de 2 ml para determinar el grado de hidrólisis de la
lactosa.
2.4.7. Elaboración del manjar.
Una vez finalizada la etapa de hidrólisis se procede a la fabricación del manjar
Debemos:
- Calentar la leche bajo agitación hasta 80ºC, en algún recipiente u olla, midiendo
temperatura constantemente.
- Adicionar lentamente la cantidad de sacarosa de acuerdo a la dosificación
sugerida (200 g/l de leche).
- Mantener bajo agitación hasta llegar a un contenido de sólidos de un 65-70%, el
que se determina mediante un refractómetro y corresponde a un valor de 70ºBrix.


9

3. RESULTADOS Y DISCUSIONES
3.1. Caracterización del preparado enzimático
3.1.1. Actividad enzimática
En esta práctica se procede a determinar la actividad de la enzima a dos temperaturas,
45°y 55°Celsius, para el preparado enzimático comercial Biolactasa – NTL.
Como primera experiencia se procede a determinar la actividad de la enzima, la cual se
realiza adicionando 4 [ml] de una solución de Lactosa en un tubo de ensayo, el cual se
incuba por 5 minutos a 45°C, luego se procede a adicionar 0,1 [ml] de la muestra
enzimática previamente diluida con tampón fosfato, que en este caso la dilución aplicada
es de 1:1000, se agita suavemente y se deja reaccionar por 5 minutos en un baño
termostatizado a 45 °C. Una vez cumplido el tiempo, la muestra se lleva a un baño de
agua hirviendo para la detener la reacción. Finalmente se determina la glucosa existente
en la muestra mediante el método de glucostat.
La experiencia se realiza también para una muestra de leche descremada a la misma
temperatura (45°C) además de repetirla para 55°C junto a la de Lactosa.
Todas las muestras se realizan por triplicado. ¿ES NECESARIO QUE APAREZCA ACA
TAMBIEN?
Se desea analizar el comportamiento de la hidrólisis de la lactosa, cuantificando la
aparición de producto final en términos de concentración de glucosa. En la tabla siguiente
se muestran los datos obtenidos en laboratorio. (Ver Anexo D, Tabla D.5.)

Tabla 3.1: Datos obtenidos de actividad enzimática a dos temperaturas.

Actividad [UI/ml]
Leche Lactosa
45 °C 9478,1 7894,6
55°C 8847,4 9987,4

De acuerdo a los datos presentados, se evidencia que el potencial catalítico de la enzima
aumenta en cuanto aumenta la temperatura del medio donde esta inserto el sustrato con
la enzima. Cabe señalar que al ser mayor esta temperatura cada vez más, llegará a un
punto donde esta última tiende a perder su conformación tridimensional por efectos
térmicos implicando que la conversión de sustrato a producto, en este caso la hidrólisis de
10

la lactosa a glucosa más galactosa, decrezcan notoriamente. Según bibliografía este
punto máximo de capacidad catalítica bordea los 60°, punto en que no conviene realizar
esta práctica pues su estabilidad también se ve afectada en gran medida.
Analizando la actividad en cuanto a tipo de sustrato, en este caso lactosa y leche semi-
descremada a concentraciones determinada de 100[g/L] y 45[g/L] respectivamente. Se
evidencia que la enzima mantuvo una mayor actividad para la leche, aunque lo esperado
es que la enzima al estar en un medio saturado de sustrato sea más activa. Se podría
pensar que se inhibe por sustrato, pero no es el caso pues de acuerdo a lo estudiado,
esta enzima se comporta de forma distinta, inhibiéndose posteriormente de forma
competitiva.


11

3.1.2. Estabilidad enzimática
Como segunda experiencia se procede a determinar la estabilidad de la enzima, la cual se
realiza preparando 5 [ml] de una solución enzimática en tampón fosfato, de la cual se
toma 0,5 [ml] y se procede a medir la actividad inicial, como se realizó en la experiencia
anterior. La solución enzimática sobrante se incuba en baño termostatizado a 45°C, luego
se toman muestras cada 10 minutos de esta solución y se mide su actividad enzimática
residual.
La experiencia se repite para una temperatura de 55 °C. Donde todas las muestras se
realizan por triplicado. NECESARIO DENUEVO?
Se entiende por actividad enzimática residual como la actividad a un determinado tiempo
de incubación. Y por actividad inicial la actividad a tiempo cero.
Los resultados serán expresados en actividad relativa, la cual se entiende por actividad
residual/actividad inicial.
A continuación se muestran los resultados obtenidos para la estabilidad de la enzima
respecto a la velocidad que se alcanza en la hidrólisis de la lactosa en el tiempo.

Tabla 3.2. Actividad enzimática residual y relativa a 45°Celsius.
45°C

Actividad enzimática
Tiempo Residual Relativa
[min] [UI/L] [%]
0 6,99 100
10 5,99 85,6
25 5,47 78,2
40 5,31 76,0
63 5,22 74,6
74 4,90 70,1
88 4,71 67,3
103 4,20 60,0

12


Tabla 3.2. Actividad enzimática residual y relativa a 55°Celsius.
55°C
Actividad enzimática
Tiempo Residual Relativa
[min] [UI/ml] [%]
0 6,47 100
10 5,37 83,0
25 5,08 78,6
40 4,87 75,4
63 4,75 73,5
74 4,44 68,7
103 3,71 57,4

Observando los porcentajes de actividad relativa existentes para cada temperatura, se
puede ver que la enzima pierde estabilidad a los pocos minutos, ejemplo de ello es a los
10 minutos la perdida de actividad para 45°C es de un 14,4% y para la temperatura de
55°C la perdida de actividad de un 17%. Esta pérdida mayor a 55°C se debe a que la
enzima es termolábil, por lo cual sufre una desnaturalización por causa de la temperatura
por lo cual decrece su actividad y ocurre en menor tiempo que a 45°C.
En la siguiente grafica (grafica 3.1) se muestra la comparación de la actividad a 45°y 55°
Celsius, para poder observar el comportamiento que tiene cada una.
De la gráfica siguiente se puede decir que la enzima a la temperatura de 45°Celsius es
más estable que la de 55°C por el comportamiento apreciado.


13


Grafica 3.1. Comparación actividad relativa a dos temperaturas de reacción.

Las fluctuaciones que se aprecian en la Grafica 3.1. de la actividad enzimática a 55°C
pueden deberse al comportamiento normal de la enzima, ya que esta no permanece
estable dentro del medio.

0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
A
c
t
i
v
i
d
a
d


r
e
l
a
t
i
v
a

[
%
]


Tiempo [min]
45°C
55°C
14

3.2. Hidrólisis enzimática de la lactosa en un reactor por lotes.
Para comenzar esta experiencia de hidrólisis enzimática se calcula la cantidad de enzima
a agregar al reactor. De tal forma que presente una conversión del 99% en 2 horas de
operación en el reactor con leche semi-descremada (ver Anexo F), dando como resultado
a agregar 0,677 ml de enzima.
Luego de adicionar la enzima y dejar el reactor en las condiciones óptimas para operar, se
pone en marcha y se comienza experimentalmente la hidrólisis de la lactosa obteniendo el
grado de conversión de los azucares reductores en la hidrólisis enzimática, siendo los que
se muestran en el siguiente gráfico:


Gráfica 3.2. Grado de conversión en el tiempo de operación del reactor, según
ANEXO F.

Para determinar la concentración de glucosa [g/L] se utiliza el método de glucostat, para
poder calcular los moles de glucosa, y para determinar la concentración de Lactosa [g/L]
se utiliza el método DNS, dando como resultado una concentración de lactosa inicial de
33,8 [g/L], valor que se utiliza para determinar el grado de conversión (moles de
glucosa/moles de lactosa) en función del tiempo, para poder llevar un seguimiento del
curso de la reacción. (Cálculos en ANEXO F).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 0.5 1 1.5 2 2.5
[
%
]

d
e

c
o
n
v
e
r
s
i
ó
n

Tiempo [h]
15

Experimentalmente con 1 ml de enzima agregado al reactor, solo se logró un 52,9 % de
conversión en 2.3 horas, esperándose un 99% en 2 horas de operación, esto pudo haber
sucedido porque se agregó más enzima de lo que se debía, ya que al realizar los cálculos
la cantidad de enzima a adicionar era sólo de 0,677 ml, y como la enzima posee una
inhibición competitiva por producto, al haber más cantidad de enzima y ésta al estar en las
condiciones adecuadas para reaccionar, comenzó a hidrolizar la lactosa teniendo así
glucosa y galactosa, donde al pasar del tiempo y al haber más galactosa que lactosa está
la inhibió y no se alcanzó el porcentaje de conversión en el tiempo esperado.


16

3.3. Hidrólisis enzimática de lactosa para producción de manjar
Ésta práctica se desarrolla en dos etapas. Primero se realiza una hidrólisis parcial de
lactosa, donde se recomienda una disminución del 35%. Luego se procede a la
fabricación de manjar.
Con respecto al grado de hidrolisis de lactosa, se agrega 1 ml de enzima al reactor de
volumen de reacción de 2 litros, y temperatura de operación de 45°C, donde transcurrida
una hora de reacción se obtuvo un grado de hidrolisis de un 14%. Cabe mencionar que
para efectos de este cálculo se considera como concentración inicial de lactosa en la
leche 45 [g/L]. Luego se procede a la elaboración del manjar, y mediante un refractómetro
se determina el contenido de sólidos, finalizando con un valor de 70° Brix
aproximadamente.
Para comparar entre leche hidrolizada y sin hidrolizar, mantenidas a condiciones de
operación iguales. Se presenta el siguiente gráfico:

Gráfico 3.3. Elaboración de manjar con leche hidrolizada y sin hidrolizar.
Medición de Grados Brix en el tiempo (Ver anexo E)

La leche hidrolizada presentó una mayor alza de grados Brix en menor tiempo que la
leche sin hidrolizar. Cabe mencionar que la medición de grados Brix representa la
concentración de azúcar presente en solución. Se mide con un refractómetro y la
concentración de azúcar es proporcional a su índice de refracción. Esto debido a que la
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80
G
r
a
d
o
s

B
r
i
x

[
°
B
r
i
x
]

Tiempo [min]
Chart Title
17

enzima Biolactasa – NTL hidroliza la lactosa, generando como producto monosacáridos
tales como glucosa y galactosa.

El mayor problema que presenta el “manjar” como anomalía de producto es la sobre-
estructuración de la lactosa y su consecuente cristalización como lactosa monohidratada.
Es por esto, que la hidrólisis enzimática constituye uno de los métodos más efectivos en
la elaboración de manjar, pues logra disminuir el efecto nocivo de la cristalización
excesiva de la lactosa sobre la estabilidad organoléptica del producto.


18

4. CONCLUSIONES


19

5. BIBLIOGRAFÍA

- Acevedo F,Gentina Juan Carlos,Illanes A,2002,Fundamentos de Ingeniería
Bioquímica,1era edición, Capitulo 4 Cinética de Fermentaciones pp.94-118,Chile.
- SENATI, Elaboración de manjar blanco, Documento de Consulta, 10 Junio de
2012, www.infolactea.com

20

6. ANEXOS
Anexo A
Curva calibrado DNS

Estándar glucosa: 1,5 [mg/ml]
Tabla A.1. Datos medidos de absorbancia a 540 [nm].
Vol. Estándar Vol. Tampón Conc. Glucosa Absorbancia [540 nm]
[ml] [ml] [mg/ml] 1 2 Promedio
0,1 0,9 0,15 0,085 0,055 0,070
0,2 0,8 0,30 0,143 0,131 0,137
0,3 0,7 0,45 0,222 0,214 0,218
0,5 0,5 0,75 0,389 0,365 0,377
0,7 0,3 1,05 0,521 0,520 0,521
0,8 0,2 1,20 0,596 0,585 0,591
1,0 0,0 1,50 0,760 0,739 0,750




Figura A.1. Curva de calibrado de glucosa por método DNS.

y = 0.5038x - 0.0083
R² = 0.9996
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

[
5
4
0

n
m
]


Concentración glucosa [mg/ml]
21

Anexo B
Curva calibrado para lactosa

Estándar lactosa: 1,5 [mg/ml]
Tabla B.1. Datos medidos de absorbancia a 540 [nm].
Vol. Estándar Vol. Tampón Conc. Glucosa Absorbancia [540 nm]
[ml] [ml] [mg/ml] 1 2 Promedio
0,1 0,9 0,15 0,044 0,056 0,050
0,2 0,8 0,30 0,106 0,105 0,106
0,3 0,7 0,45 0,171 0,171 0,171
0,5 0,5 0,75 0,266 0,291 0,279
0,7 0,3 1,05 0,421 0,410 0,416
0,8 0,2 1,20 0,478 0,466 0,472
1 0 1,50 0,594 0,591 0,593



Figura B.1. Curva de calibrado para lactosa por método DNS

y = 0.4042x - 0.0139
R² = 0.9993
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

[
5
4
0

n
m
]

Concentración lactosa [mg/ml]
22

Anexo C
Curva de calibrado glucostat

Estándar glucosa: 0,25 [mg/ml]
Tabla C.1. Datos medidos de absorbancia a 505 [nm]
Volumen

Absorbancia
Estándar Tampón Conc. Glucosa [505 nm]
[ml] [ml] [mg/ml] 1 2 Promedio
10 90 0,025 0,080 0,076 0,078
30 70 0,075 0,209 0,255 0,232
50 50 0,125 0,387 0,403 0,395
70 30 0,175 0,553 0,544 0,549
80 20 0,200 0,638 0,637 0,638
100 0 0,250 0,789 0,791 0,790



Figura C.1. Curva de calibrado para glucosa por método glucostat.

y = 3.178x - 0.0034
R² = 0.9998
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

[
5
0
5

n
m
]

Concentración de glucosa [mg/ml]
23

Anexo D
Determinación de actividad y estabilidad de la enzima.

Tabla D.1. Datos para estabilidad a 45°Celsius

Tiempo

Absorbancia [nm]

Glucosa

Actividad enzimática Actividad
Muestra [min]

a b c Promedio [g/l] [UI] Relativa
T
0
0 0,496 0,467 0,490 0,484 0,153 6,99 1,00
T
1
10

0,338 0,445 0,460 0,414

0,131

5,99 0,856
T
2
25

0,356 0,390 0,388 0,378

0,120

5,47 0,782
T
3
40

0,318 0,394 0,390 0,367

0,117

5,31 0,760
T
4
63

0,352 0,370 0,360 0,361

0,115

5,22 0,746
T
5
74

0,360 0,340 0,315 0,338

0,108

4,90 0,701
T
6
88

0,360 0,315 0,300 0,325

0,103

4,71 0,673
T
7
103 0,271 0,288 0,309 0,289 0,0921 4,20 0,600


Tabla D.2. Datos para estabilidad a 55°Celsius

Tiempo

Absorbancia [nm]

Glucosa

Actividad enzimática Actividad
Muestra [min]

a b c Promedio [g/l] [UI] Relativa
T
0
0 0,416 0,437 0,490 0,448 0,142 6,47 1,00
T
1
10

0,362 0,363 0,388 0,371

0,118

5,37 0,830
T
2
25

0,34 0,369 0,344 0,351

0,112

5,08 0,786
T
3
40

0,334 0,301 0,375 0,337

0,107

4,87 0,754
T
4
63

0,306 0,325 0,353 0,328

0,104

4,75 0,735
T
5
74

0,294 0,300 0,325 0,306

0,097

4,44 0,687
T
6
88

0,388 0,3 0,306 0,331

0,105

4,80 0,742
T
7
103 0,204 0,313 0,25 0,256 0,0815 3,71 0,574





24


Tabla D.3. Actividad de la enzima en leche

Absorbancia

45°C 55°C
1 2 3 Promedio 1 2 3 Promedio
muestra - blanco 0,205 0,237 0,209 0,217 0,239 0,147 0,221 0,202
muestra 0,270 0,302 0,274 0,282 0,308 0,216 0,290 0,271
blanco 0,065 - - 0,065 0,0690 - - 0,0690


Tabla D.4. Actividad de la enzima en lactosa.

Absorbancia

45°C 55°C
1 2 3 Promedio 1 2 3 Promedio
muestra - blanco 0,52 0,535 0,587 0,547 0,696 0,652 0,732 0,693
muestra 0,542 0,557 0,609 0,569 0,743 0,699 0,779 0,740
blanco 0,0220 - - 0,0220 0,0470 - - 0,0470


Tabla D.5. Actividad enzimática enleche y lactosa a 45°y 55°Celsius

Temperatura Promedio Glucosa FD Actividad enzimatica
[°C] abs [g/L] [UI]
Leche
45
0,282 0,0694 3000 9478,1
Lactosa 0,569 0,173 - 7894,8

Leche
55
0,271 0,0647 3000 8847,4
Lactosa 0,740 0,219 - 9985,8



25

Ejemplo calculo actividad enzimática:
Para la leche:
[

]

[]

[ ]
[]

[ ]
[ ]

[ ]
[ ]

[]
[]

[]
[]

[

] [] [

]
Agregando el factor de dilución de 3
[

]

Para lactosa:
[

]

[]

[ ]
[]

[ ]
[ ]

[ ]
[ ]

[]
[]

[]
[]

[

] [] [

]






26

Anexo E
Hidrolisis enzimática de lactosa para elaboración de manjar.

Tabla E.1. Medición de absorbancia por método glucostat y cálculo del
porcentaje de conversión de lactosa

Glucosa
Lactosa

Absorbancias [505 nm]
Tiempo
[min]
1 2 3 Prom
concentración
glucosa [g/L]
mol
glucosa
% de
conversión
Concentración
lactosa [g/L]
mol
lactosa
0 0,023 0,028 0,031 0,027 0,029 0,000 0,122 45,000 0,132
30 0,014 0,013 0,016 0,014 1,674 0,009 7,068

60 0,030 0,034 0,031 0,032 3,310 0,018 13,977



Utilizando curva de calibrado para determinación de glucosa por método glucotat se
obtiene la concentración de glucosa transcurrido 0, 30, 60 minutos de reacción. El cálculo
a tiempo 30 minutos se presenta a continuación:

[

]
( )

()

[

]

El cálculo de porcentaje de conversión se realiza con los moles de glucosa y lactosa, lo
que se presenta a continuación:




[

]
[

]
[

]
[

]

27

Tabla E.2. Medición de grados Brix para leche hidrolizada y sin hidrolizar

Grados Brix [°Brix]
Tiempo
[min]
Leche
Sin Hidrolizar
Leche
Hidrolizada
0 26,2 27
15 28,2 29,2
30 32 37
40 42,6 45
50 60 66
60 63 84
75 71,4




28

Anexo F
Hidrólisis enzimática de la lactosa en un reactor por lotes.
Para una conversión del 99% en el reactor en 2 horas de operación, utilizando para esta
enzima los valores de parámetros cinéticos de K
m
20 [g/L] y la velocidad máxima de
reacción se calculó según lo obtenido en el laboratorio anterior. La expresión que se
utilizó es:
( ) X X
K
S
V K
t V
m rxn m
m
÷ ÷ = 1 ln *
*
*
0


X: Grado de Conversión, 99%, 0,99
S
0
: Sustrato inicial, 40 [g/L]
t: Tiempo, 120 [min]
V
rx
: Volumen de reacción, 2 [L]
K
m
: constante de afinidad, 20 [g/L]
V
m
: Velocidad máxima.

De esto calculamos V
m
= 6418,3 UI.

El V
m
obtenido, lo relacionamos con la actividad de la enzima en UI/ml enzima
(determinada en la experiencia anterior) de la siguiente forma:

9478,1 UI/ml enzima * X = 6418,3 UI
X = 0,677 ml de enzima.

Por lo que la cantidad de enzima a adicionar es 0,677 ml de enzima.
29

Determinación de lactosa por método de DNS.
Tabla F.1. Absorbancias obtenidas a diferentes intervalos de tiempo a 540 [nm].

Tiempo Absorbancia Lactosa Temperatura
[h] 1 2 Promedio [g/L] fd [g/L] *fd pH [°C]
0 0,179 0,157 0,168 0,450 25 33,752 6,51 44
1,0 0,165 0,185 0,175 0,423 30 38,097 6,57 43
2,3 0,108 0,107 0,108 0,230 60 41,460 6,52 44

Mediante la siguiente ecuación se calculó la concentración de Lactosa en [g/L], a través
del tiempo:

( )
fd
Abs
L
g
Lactosa *
4042 , 0
0139 , 0 +
=
(
¸
(

¸

30

Determinación de glucosa por método de glucostat.

Tabla F.2: Absorbancias obtenidas a diferentes intervalos de tiempo a 505 [nm].
Tiempo Absorbancia Glucosa Porcentaje de
[h]
1 2 Promedio [g/L] fd [g/L] *fd
mol
glucosa
conversión
0 0,099 0,090 0,095 0,031 - 0,092 0,001 0,520
0,2 0,130 0,125 0,128 0,041 60 2,471 0,014 13,9
0,3 0,330 0,350 0,340 0,108 30 3,242 0,018 18,2
0,5 0,480 0,485 0,483 0,153 30 4,587 0,025 25,8
0,7 0,530 0,520 0,525 0,166 30 4,988 0,028 28,1
1,0 0,443 0,410 0,427 0,135 45 6,087 0,034 34,3
1,6 0,532 0,515 0,524 0,166 45 7,461 0,041 42,0
1,8 0,270 0,265 0,268 0,085 101 8,609 0,048 48,5
2,1 0,290 0,280 0,285 0,091 101 9,166 0,051 51,6
2,3 0,285 0,300 0,293 0,093 101 9,404 0,052 52,9

Mediante la siguiente ecuación se calculó la concentración de glucosa [g/L], a través del
tiempo:
( )
fd
Abs
L
g
a Glu *
178 , 3
0034 , 0
cos
+
=
(
¸
(

¸

Para calcular el grado de conversión en función del tiempo se utilizaron las siguientes
ecuaciones:
Grado de conversión = (moles de glucosa/moles de lactosa)
Por lo que la concentración de glucosa y lactosa en [g/L], se transformo a [moles/L] de la
siguiente forma:
31

Moles de lactosa =
Lactosa M P
L
g
Lactosa
. .
(
¸
(

¸

Ejemplo:
Moles de lactosa =
(
¸
(

¸

(
¸
(

¸

mol
g
L
g
342
8 , 33
= 0,099 [mol/L]

Moles de glucosa =
a Glu M P
L
g
a Glu
cos . .
cos
(
¸
(

¸

Ejemplo:
Moles de Glucosa = | |
L
mol
mol
g
L
g
0005 , 0
180
092 , 0
=
(
¸
(

¸

(
¸
(

¸

Luego se realiza el cálculo para el grado de conversión:

Grado de conversión =
| |
| |
3 .
10 * 2 , 5
099 , 0
0005 , 0
=
L
mol
L
mol



[%] de conversión= (5,2* 10
-3
)* 100 = 0,516

Todos los cálculos de conversión se realizaron con los [mol/L] de la concentración de
Lactosa inicial

INDICE GENERAL 1. 2. 2.1. 2.2. 2.3. Introducción ............................................................................................................ 3 Materiales y métodos ............................................................................................. 4 Determinación de azucares reductores por la técnica de miller (dns) ..................... 4 Método de glucostat. .............................................................................................. 4 Metodología analítica. ............................................................................................ 5

2.3.1. Determinación del grado de hidrólisis de la leche. .................................................. 5 2.4. Metodología experimental. ..................................................................................... 6

2.4.1. Determinación de la actividad de la enzima. ........................................................... 6 2.4.2. Determinación de la concentración de glucosa (utilizando lactosa como sustrato) . 6 2.4.3. Determinación de la concentración de glucosa (utilizando leche como sustrato) .... 7 2.4.4. Determinación de la estabilidad de la enzima. ........................................................ 7 2.4.5. Puesta en marcha del reactor. ................................................................................ 7 2.4.6. Hidrólisis enzimática de lactosa. ............................................................................. 8 2.4.7. Fabricación del manjar. .......................................................................................... 8 3. 3.1. Resultados y discusiones ....................................................................................... 9 Caracterización del preparado enzimático .............................................................. 9

3.1.1. Actividad enzimática ............................................................................................... 9 3.1.2. Estabilidad enzimática .......................................................................................... 11 3.2. 3.3. 4. 5. 6. Hidrólisis enzimática de la lactosa en un reactor por lotes. ................................... 14 Hidrólisis enzimática de lactosa para producción de manjar ................................. 16 Conclusiones ........................................................................................................ 18 Bibliografía ........................................................................................................... 19 Anexos ................................................................................................................. 20

2

1.

INTRODUCCIÓN

Las enzimas son biocatalizadores de naturaleza proteica con capacidad catalítica, altamente específica y activa en condiciones moderadas, lo que hace favorable su uso como catalizadores en la industria de procesos. Los progresos que están realizando actualmente la ingeniería genética y la biotecnología permiten augurar un desarrollo cada vez mayor del uso de las enzimas, al disponer de un suministro continuo de materiales con la actividad deseada a precios razonables.

En el presente informe se muestra el trabajo realizado con el preparado enzimático Biolactasa-NLT, que actúa de forma similar a la Lactasa en la leche, la cual es una enzima producida de forma natural en el intestino delgado, y de forma artificial como preparado enzimático, que juega un papel vital en el desdoblamiento de la lactosa, mediante una reacción enzimática de hidrolisis, en sus dos componentes básicos: glucosa y galactosa.

De forma experimental se contemplan tres prácticas de laboratorio, primero se determina la actividad y la estabilidad al preparado enzimático comercial con el cual se está trabajando, midiendo generación de producto por el método de glucostat utilizando leche semi-descremada y lactosa como sustratos. Luego esta enzima se incuba de forma soluble en un reactor por lotes, con leche semi-descremada como medio de reacción, bajo condiciones ambientales controladas, donde se determina el grado de hidrólisis de la leche en razón del tiempo (de lactosa a glucosa y galactosa), determinándose también la generación de producto por el método de glucostat, y la concentración de lactosa por el método de DNS.

Finalmente utilizando dos reactores por lotes en las mismas condiciones mencionadas anteriormente, y cambiando solo que uno contiene la enzima y el otro no, y luego de un determinado tiempo de reacción y grado de conversión, se lleva a cabo la elaboración de manjar, hasta llegar a un contenido de sólidos de un 65-70%.

3

MATERIALES Y MÉTODOS 2.5-ácidodinitrosalicílico para la hidrólisis de polisacáridos presentes en una muestra. Reacción del método El acido 3.5-dinitrosalicilico en presencia de azúcares reductores se reduce a acido 3amino-5-dinitrosalicilico. Esta técnica sirve para cuantificar los azucares reductores producidos durante una fermentación o para cuantificar los productos de una reacción enzimática. Esta reacción en la que se consume oxígeno podría seguirse manométricamente mediante un electrodo de oxígeno.2. Sin embargo. La glucosa oxidasa es una flavoproteina altamente específica que cataliza la oxidación de la glucosa a β-D-gluconolactona. sin que ningún otro azúcar natural reaccione en extensión apreciable. Método de Glucostat. 2. Determinación de azucares reductores por la técnica de Miller (DNS) El método DNS es una técnica colorimétrica que emplea 3.1. seguido de la determinación espectrofotométrica a 540 nm de los azúcares reductores.2. para poder seguir el curso de esta 4 . Reacción del método.

1 g/l 5 .  Se toman 0.2 ml de la muestras anterior. se centrifugan a 5000 rpm por 5 minutos y se retira el sobrenadante.  Se realiza un blanco utilizando tampón fosfato como muestra y una muestra Standard con una solución de glucosa de 0.1. Si fuese necesario la muestra de sobrenadante se debe diluir con agua destilada antes de realizar la determinación de glucosa. Determinación del grado de hidrólisis de la leche. se añade al medio peroxidasa de rábano silvestre (HRP). Sin embargo. Para la determinación colorimétrica de glucosa por el método de la oxidasa.  Se incuba la mezcla por 10 minutos a 37ºC y se determina la absorbancia a 505nm. la naturaleza carcinogénica de estos compuestos ha impulsado la búsqueda de aceptores alternativos 2.3. se le agrega 0.3. a la vez que se genera un colorante adecuado según el siguiente esquema de reacción: Reacción del método.  Se toman 0. o-dianisidina.1 ml del sobrenadante y se le adicionan 1 ml del reactivo enzimático para determinar glucosa. que elimina el peróxido de hidrógeno a medida que se forma. Las muestras de leche (2 ml) se reciben en viales los cuales son colocados en un baño con agua a 80°C para detener la reacción. Se podrían utilizar como aceptores de oxígeno benzidina.2 ml de hidróxido de bario.  Metodología analítica 2.reacción espectrofotométricamente es necesario acoplar a la misma una segunda reacción enzimática indicadora adecuada.2 ml de una solución de sulfato de zinc y 0. o-toluidina.

Se repite la experiencia también utilizando leche semidescremada. Adiciona 0. Determinar la concentración de glucosa mediante el metodo de glucostat.1 M pH 6).2.1 mL de tampón fosfato y 1 mL del reactivo. y que también es incubado.1. Metodología experimental 2.   Se repite la experiencia a 55 °C. tomar la solución y colocarla en un baño con agua hirviendo.4.2. 2.   6 .4.1 mL de la muestra de reacción enzimática (inactivada).        Se adicionan 4 mL de una solución de Lactosa (100 g/L preparada en tampón fosfato 0.1 M pH 6.4. Las experiencias se realizan por triplicado. Se incuba aproximadamente por 5 minutos a 45 °C o hasta que el sustrato alcance la temperatura de reacción. Agitar suavemente y dejar reaccionar por 5 minutos en un baño a 45 °C. previamente diluida con tampón fosfato 0. para detener la reacción. Realizar un blanco de reacción sin enzima. Leer contra un blanco que lleva 0.1 mL de la muestra enzimática. Determinación de la concentración de Glucosa (utilizando lactosa como sustrato)  En un tubo de eppendorf colocar 0. en un tubo de ensayo. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Cumplido el tiempo de reacción. Determinación de la actividad de la enzima.  Interceptar en la curva de calibrado.   Adicionar 1 mL del reactivo de determinación de glucosa. Leer la absorbancia de la muestra a una longitud de onda de 505 nm.

2 ml de una solución de sulfato de zinc y 0.  Repetir la experiencia a 55°C 2.5 mL).4. Leer la absorbancia de la muestra a una longitud de onda de 505 nm.  En un tubo de eppendorf colocar 0. 7 .2 ml de hidróxido de bario. como se describe previamente.1 mL de tampón y 1 mL del reactivo. adicionar sobre este 0. Cada 10 minutos tomar muestras de la solución enzimática (0.4.    Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.1 mL del sobrenadante anterior y adicionar 1 mL del reactivo de determinación de glucosa.  Interceptar en la curva de calibrado.4.2 mL de la muestra de reacción enzimática (inactivada).   Incubar a 45ºC la solución enzimática restante (4. Puesta en marcha del reactor. Determinación de la estabilidad de la enzima. como se describe previamente. Tomar 0.5. Leer contra un blanco que lleva 0.2.3.1 M pH 6. y que también es incubado. Determinación de la concentración de glucosa (utilizando leche como sustrato)  En un tubo de eppendorf colocar 0.5 mL) y medir su actividad enzimática residual. Las experiencias deben ser realizadas por triplicado. Evaluar la potencia de agitación.5 mL de la muestra anterior y medir la actividad inicial (por triplicado).4.   Preparar 5 mL de una solución enzimática en tampón fosfato 0. 2. agitar en un vortex y luego centrifugar a 5000 rpm por 5 minutos.    Instalar el reactor. Verificar las conexiones de las mangueras y el estado de los sellos.

Instalar el termómetro para medir temperatura. 8 . Una vez finalizada la etapa de hidrólisis se procede a la fabricación del manjar Debemos:    Calentar la leche bajo agitación hasta 80ºC. Adicionar la enzima de acuerdo a la razón enzima sustrato entregada. en algún recipiente u olla.4.4. Mantener la leche bajo agitación suave y a temperatura constante durante el tiempo necesario para alcanzar el grado de hidrólisis preestablecido.       Adicionar la leche descremada seleccionada y medir su pH. Poner en marcha el sistema de calefacción. 2. Cada 10 minutos sacar muestras de 2 ml para determinar el grado de hidrólisis de la lactosa.       Instalar y calibrar el electrodo de pH. Poner en marcha el sistema de agitación y calentamiento (45°C o 55°C). midiendo temperatura constantemente. Elaboración del manjar. Tomar una muestra para determinar la concentración de lactosa inicial (tiempo cero). Mantener bajo agitación hasta llegar a un contenido de sólidos de un 65-70%. Adicionar al reactor el medio de reacción que es la leche a hidrolizar. Adicionar la cantidad de enzima lactasa. Adicionar lentamente la cantidad de sacarosa de acuerdo a la dosificación sugerida (200 g/l de leche). Mantener la leche bajo agitación suave y a temperatura constante durante el tiempo necesario para alcanzar el grado de hidrólisis preestablecido. calculada previamente. 2.6. Esperar que el sistema de reacción alcance la temperatura deseada. Hidrólisis enzimática de lactosa. Poner en marcha el sistema de agitación que consiste en un agitador mecánico de hélice. el que se determina mediante un refractómetro y corresponde a un valor de 70ºBrix.7.

Actividad [UI/ml] Leche Lactosa 9478. para el preparado enzimático comercial Biolactasa – NTL. luego se procede a adicionar 0. cuantificando la aparición de producto final en términos de concentración de glucosa.1 7894. En la tabla siguiente se muestran los datos obtenidos en laboratorio. se agita suavemente y se deja reaccionar por 5 minutos en un baño termostatizado a 45 °C.4 45 °C 55°C De acuerdo a los datos presentados. (Ver Anexo D.1 [ml] de la muestra enzimática previamente diluida con tampón fosfato.4 9987. 45° y 55° Celsius. Cabe señalar que al ser mayor esta temperatura cada vez más.1. Finalmente se determina la glucosa existente en la muestra mediante el método de glucostat. que en este caso la dilución aplicada es de 1:1000. Una vez cumplido el tiempo. la muestra se lleva a un baño de agua hirviendo para la detener la reacción. Como primera experiencia se procede a determinar la actividad de la enzima.3. La experiencia se realiza también para una muestra de leche descremada a la misma temperatura (45°C) además de repetirla para 55°C junto a la de Lactosa.5.1. la cual se realiza adicionando 4 [ml] de una solución de Lactosa en un tubo de ensayo.6 8847. RESULTADOS Y DISCUSIONES Caracterización del preparado enzimático 3. Todas las muestras se realizan por triplicado. el cual se incuba por 5 minutos a 45°C. ¿ES NECESARIO QUE APAREZCA ACA TAMBIEN? Se desea analizar el comportamiento de la hidrólisis de la lactosa.1.1: Datos obtenidos de actividad enzimática a dos temperaturas. en este caso la hidrólisis de 9 .) Tabla 3. 3. Actividad enzimática En esta práctica se procede a determinar la actividad de la enzima a dos temperaturas. llegará a un punto donde esta última tiende a perder su conformación tridimensional por efectos térmicos implicando que la conversión de sustrato a producto. Tabla D. se evidencia que el potencial catalítico de la enzima aumenta en cuanto aumenta la temperatura del medio donde esta inserto el sustrato con la enzima.

Se evidencia que la enzima mantuvo una mayor actividad para la leche. en este caso lactosa y leche semidescremada a concentraciones determinada de 100[g/L] y 45[g/L] respectivamente. inhibiéndose posteriormente de forma competitiva. 10 .la lactosa a glucosa más galactosa. Según bibliografía este punto máximo de capacidad catalítica bordea los 60°. aunque lo esperado es que la enzima al estar en un medio saturado de sustrato sea más activa. pero no es el caso pues de acuerdo a lo estudiado. esta enzima se comporta de forma distinta. decrezcan notoriamente. Analizando la actividad en cuanto a tipo de sustrato. punto en que no conviene realizar esta práctica pues su estabilidad también se ve afectada en gran medida. Se podría pensar que se inhibe por sustrato.

6 70.22 4.6 78. la cual se entiende por actividad residual/actividad inicial. luego se toman muestras cada 10 minutos de esta solución y se mide su actividad enzimática residual. como se realizó en la experiencia anterior.0 74.99 5. Donde todas las muestras se realizan por triplicado.1.71 4. La solución enzimática sobrante se incuba en baño termostatizado a 45°C. Estabilidad enzimática Como segunda experiencia se procede a determinar la estabilidad de la enzima.47 5.2 76. la cual se realiza preparando 5 [ml] de una solución enzimática en tampón fosfato.2.3. Actividad enzimática residual y relativa a 45° Celsius. NECESARIO DENUEVO? Se entiende por actividad enzimática residual como la actividad a un determinado tiempo de incubación.2.20 Relativa [%] 100 85. Y por actividad inicial la actividad a tiempo cero. La experiencia se repite para una temperatura de 55 °C.3 60.1 67.5 [ml] y se procede a medir la actividad inicial.90 4.0 11 .31 5.99 5. 45°C Actividad enzimática Tiempo [min] 0 10 25 40 63 74 88 103 Residual [UI/L] 6. de la cual se toma 0. Los resultados serán expresados en actividad relativa. Tabla 3. A continuación se muestran los resultados obtenidos para la estabilidad de la enzima respecto a la velocidad que se alcanza en la hidrólisis de la lactosa en el tiempo.

0 78. Esta pérdida mayor a 55°C se debe a que la enzima es termolábil.47 5.2. 55°C Actividad enzimática Tiempo [min] 0 10 25 40 63 74 103 Residual [UI/ml] 6. En la siguiente grafica (grafica 3.Tabla 3. De la gráfica siguiente se puede decir que la enzima a la temperatura de 45° Celsius es más estable que la de 55°C por el comportamiento apreciado. Actividad enzimática residual y relativa a 55° Celsius.6 75. para poder observar el comportamiento que tiene cada una. ejemplo de ello es a los 10 minutos la perdida de actividad para 45°C es de un 14.5 68.4 Observando los porcentajes de actividad relativa existentes para cada temperatura.75 4. 12 . se puede ver que la enzima pierde estabilidad a los pocos minutos.44 3. por lo cual sufre una desnaturalización por causa de la temperatura por lo cual decrece su actividad y ocurre en menor tiempo que a 45°C.87 4.7 57.4 73.4% y para la temperatura de 55°C la perdida de actividad de un 17%.1) se muestra la comparación de la actividad a 45° y 55° Celsius.08 4.71 Relativa [%] 100 83.37 5.

de la actividad enzimática a 55°C pueden deberse al comportamiento normal de la enzima. Las fluctuaciones que se aprecian en la Grafica 3. Comparación actividad relativa a dos temperaturas de reacción.100 90 Actividad relativa [%] 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Tiempo [min] 80 90 100 45°C 55°C Grafica 3.1. 13 . ya que esta no permanece estable dentro del medio.1.

2. Grado de conversión en el tiempo de operación del reactor. dando como resultado a agregar 0.3. dando como resultado una concentración de lactosa inicial de 33. De tal forma que presente una conversión del 99% en 2 horas de operación en el reactor con leche semi-descremada (ver Anexo F). Para comenzar esta experiencia de hidrólisis enzimática se calcula la cantidad de enzima a agregar al reactor. valor que se utiliza para determinar el grado de conversión (moles de glucosa/moles de lactosa) en función del tiempo.5 Gráfica 3.677 ml de enzima. y para determinar la concentración de Lactosa [g/L] se utiliza el método DNS.5 Tiempo [h] 2 2. (Cálculos en ANEXO F). según ANEXO F.5 1 1. se pone en marcha y se comienza experimentalmente la hidrólisis de la lactosa obteniendo el grado de conversión de los azucares reductores en la hidrólisis enzimática. para poder llevar un seguimiento del curso de la reacción. Para determinar la concentración de glucosa [g/L] se utiliza el método de glucostat. [%] de conversión 14 .8 [g/L].2. para poder calcular los moles de glucosa. Luego de adicionar la enzima y dejar el reactor en las condiciones óptimas para operar. siendo los que se muestran en el siguiente gráfico: 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 0. Hidrólisis enzimática de la lactosa en un reactor por lotes.

comenzó a hidrolizar la lactosa teniendo así glucosa y galactosa. y como la enzima posee una inhibición competitiva por producto. ya que al realizar los cálculos la cantidad de enzima a adicionar era sólo de 0. donde al pasar del tiempo y al haber más galactosa que lactosa está la inhibió y no se alcanzó el porcentaje de conversión en el tiempo esperado.677 ml. 15 . esto pudo haber sucedido porque se agregó más enzima de lo que se debía.3 horas. solo se logró un 52. al haber más cantidad de enzima y ésta al estar en las condiciones adecuadas para reaccionar.Experimentalmente con 1 ml de enzima agregado al reactor.9 % de conversión en 2. esperándose un 99% en 2 horas de operación.

Cabe mencionar que la medición de grados Brix representa la concentración de azúcar presente en solución. y temperatura de operación de 45°C.3. Luego se procede a la elaboración del manjar. Para comparar entre leche hidrolizada y sin hidrolizar. Esto debido a que la 16 . Luego se procede a la fabricación de manjar. donde transcurrida una hora de reacción se obtuvo un grado de hidrolisis de un 14%. Cabe mencionar que para efectos de este cálculo se considera como concentración inicial de lactosa en la leche 45 [g/L]. y mediante un refractómetro se determina el contenido de sólidos. Se presenta el siguiente gráfico: condiciones de Chart Title 100 Grados Brix [°Brix] 80 60 40 20 0 0 20 40 Tiempo [min] 60 80 Gráfico 3. Con respecto al grado de hidrolisis de lactosa. Elaboración de manjar con leche hidrolizada y sin hidrolizar.3. Hidrólisis enzimática de lactosa para producción de manjar Ésta práctica se desarrolla en dos etapas. Primero se realiza una hidrólisis parcial de lactosa.3. finalizando con un valor de 70° Brix aproximadamente. se agrega 1 ml de enzima al reactor de volumen de reacción de 2 litros. Medición de Grados Brix en el tiempo (Ver anexo E) La leche hidrolizada presentó una mayor alza de grados Brix en menor tiempo que la leche sin hidrolizar. mantenidas a operación iguales. donde se recomienda una disminución del 35%. Se mide con un refractómetro y la concentración de azúcar es proporcional a su índice de refracción.

17 . generando como producto monosacáridos tales como glucosa y galactosa. pues logra disminuir el efecto nocivo de la cristalización excesiva de la lactosa sobre la estabilidad organoléptica del producto. que la hidrólisis enzimática constituye uno de los métodos más efectivos en la elaboración de manjar.enzima Biolactasa – NTL hidroliza la lactosa. Es por esto. El mayor problema que presenta el “manjar” como anomalía de producto es la sobreestructuración de la lactosa y su consecuente cristalización como lactosa monohidratada.

4. CONCLUSIONES 18 .

10 Junio de 2012.2002. Capitulo 4 Cinética de Fermentaciones pp.infolactea.94-118.Chile.Illanes A. Elaboración de manjar blanco.5. Documento de Consulta. SENATI.Gentina Juan Carlos.com 19 .Fundamentos de Ingeniería Bioquímica. BIBLIOGRAFÍA   Acevedo F. www.1era edición.

591 0.0 0.7 0. 20 .585 0.521 0.070 0.1.5 Concentración glucosa [mg/ml] 2.365 0.20 1.1 0.7 0.750 0.055 0. Glucosa [mg/ml] 0.30 0. Curva de calibrado de glucosa por método DNS.05 1.521 0.50 Absorbancia [540 nm] 1 0.8 0.8 1.4 0.9996 Figura A. Estándar [ml] 0.131 0.5 0.5 0. Datos medidos de absorbancia a 540 [nm].1 0.3 0.3 0.0 Vol.0 y = 0.5 0.7 Absorbancia [540 nm] 0.739 Promedio 0.143 0.2 0.218 0.2 0.0 0. ANEXOS Anexo A Curva calibrado DNS Estándar glucosa: 1.0. Vol.0 Conc.377 0.3 0.520 0.214 0.596 0.6 0.9 0.0083 R² = 0.085 0.1.5 [mg/ml] Tabla A.760 2 0.15 0.137 0.5 1. Tampón [ml] 0.389 0.5038x .0 1.75 1.2 0.6.222 0.45 0.8 0.

3 0.0 Concentración lactosa [mg/ml] Figura B.3 0.9 0.9993 0.594 2 0.50 Absorbancia [540 nm] 1 0.5 0.5 0.410 0. Glucosa [mg/ml] 0.1.279 0.421 0.5 [mg/ml] Tabla B.3 0.416 0.15 0.2 0. Curva de calibrado para lactosa por método DNS 21 .05 1.171 0.171 0.45 0. Vol.0 1.1 y = 0.291 0.0.8 0.1.2 0 Conc.0 0.472 0.478 0.171 0.0 0.8 1 Vol.4 0.106 0.20 1.466 0.266 0.0139 R² = 0.7 0.044 0.105 0.5 0.30 0.7 0.6 Absorbancia [540 nm] 0.5 2.106 0.5 1. Estándar [ml] 0.7 0.75 1.4042x .050 0.591 Promedio 0.056 0.Anexo B Curva calibrado para lactosa Estándar lactosa: 1.2 0.593 0. Tampón [ml] 0.1 0. Datos medidos de absorbancia a 540 [nm].

15 0.10 0.789 Absorbancia [505 nm] 2 0.553 0.Anexo C Curva de calibrado glucostat Estándar glucosa: 0.790 0.5 0.00 0.9998 Concentración de glucosa [mg/ml] Figura C.6 0.20 0.25 0. Curva de calibrado para glucosa por método glucostat.387 0.209 0.250 1 0.637 0.0.395 0.9 0.3 0.200 0.638 0.30 y = 3.549 0.05 0.7 0.078 0.1.544 0.1.8 Absorbancia [505 nm] 0.791 Promedio 0.125 0.638 0.403 0.075 0.1 0.25 [mg/ml] Tabla C.0 0. Glucosa [ml] 10 30 50 70 80 100 [ml] 90 70 50 30 20 0 [mg/ml] 0.178x . 22 .4 0.232 0.2 0. Datos medidos de absorbancia a 505 [nm] Volumen Estándar Tampón Conc.080 0.025 0.076 0.175 0.255 0.0034 R² = 0.

294 0.204 0.394 0.337 0.760 0.153 0.351 0.334 0.2.390 0.325 0.306 0.99 5.782 0.830 0.325 0.1. Tabla D.3 0.388 0.0921 Actividad enzimática Actividad [UI] 6.448 0.414 0.71 Relativa 1.0815 Actividad enzimática Actividad [UI] 6.47 5.71 4.361 0.22 4.288 0.338 0.103 0.256 Glucosa [g/l] 0.338 0.313 0.75 4.271 0.107 0.490 0. Datos para estabilidad a 55° Celsius Tiempo Muestra T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 [min] 0 10 25 40 63 74 88 103 a Absorbancia [nm] b c Promedio 0.742 0.735 0.00 0.115 0.360 0.104 0.105 0.120 0.142 0.701 0.25 23 .315 0.467 0.754 0.673 0.437 0.445 0.44 4.356 0.Anexo D Determinación de actividad y estabilidad de la enzima.306 0.856 0.352 0.328 0.353 0.306 0.289 Glucosa [g/l] 0.325 0.369 0.460 0.34 0.99 5.687 0.496 0.301 0.131 0.31 5.390 0.47 5.309 Tabla D.600 0.416 0.20 Relativa 1.363 0.118 0.786 0.00 0.388 0.344 0.484 0.318 0.370 0. Datos para estabilidad a 45° Celsius Tiempo Muestra T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 [min] 0 10 25 40 63 74 88 103 a Absorbancia [nm] b c Promedio 0.371 0.746 0.574 0.300 0.315 0.375 0.362 0.340 0.112 0.80 3.360 0.378 0.360 0.87 4.097 0.388 0.08 4.37 5.117 0.331 0.108 0.367 0.300 0.490 0.90 4.

Actividad enzimática enleche y lactosa a 45° y 55°Celsius Temperatura Promedio Glucosa FD [°C] abs [g/L] Leche 0.0694 3000 Lactosa 45 0.4.202 0.Tabla D.0690 2 0.308 0.8 24 .557 0.1 7894.302 0.282 0. Actividad de la enzima en lactosa.652 0.0470 2 55°C 3 Promedio 0.216 55°C 3 0.699 0.270 0.693 0.274 0.blanco muestra blanco 0.0220 1 0.205 0.740 0.587 0.0220 2 3 Promedio 0.173 Leche Lactosa 55 0.0470 0.239 0.4 9985.209 0.8 8847.0647 3000 0.609 - 0.065 - Tabla D.290 Promedio 0.535 0.743 0.0690 0.779 - Tabla D.blanco muestra blanco 2 3 Promedio 0.271 0.065 1 0.219 Actividad enzimatica [UI] 9478.547 0.740 0.271 0.5.147 0.569 0.732 0.3.52 0. Actividad de la enzima en leche Absorbancia 45°C 1 muestra .696 0.542 0.282 0.237 0.217 0. Absorbancia 45°C 1 muestra .569 0.221 0.

Ejemplo calculo actividad enzimática: Para la leche: [ ] [ [ ] [ ] ] [ [ [ Agregando el factor de dilución de 3 [ ] ] ] [ [ ][ ][ ] ] ] [ [ ] ] [] [ ] Para lactosa: [ ] [ [ ] [ ] ] [ [ [ ] ] [ [ ][ ][ ] ] ] [ [ ] ] [] [ ] 25 .

029 1. Medición de absorbancia por método glucostat y cálculo del porcentaje de conversión de lactosa Glucosa Absorbancias [505 nm] Tiempo [min] 0 30 60 1 2 3 Prom concentración mol % de Lactosa Concentración lactosa [g/L] 45.674 3.027 0.009 0.132 glucosa [g/L] glucosa conversión 0. El cálculo a tiempo 30 minutos se presenta a continuación: [ ] ( ) ( ) [ ] El cálculo de porcentaje de conversión se realiza con los moles de glucosa y lactosa.028 0.000 0. 30. Tabla E.068 13.Anexo E Hidrolisis enzimática de lactosa para elaboración de manjar.013 0.023 0.031 0. 60 minutos de reacción.016 0.310 0.977 0.030 0.014 0.018 0.034 0.1.032 Utilizando curva de calibrado para determinación de glucosa por método glucotat se obtiene la concentración de glucosa transcurrido 0.122 7.014 0. lo que se presenta a continuación: [ ] [ [ ] [ ] ] 26 .031 0.000 mol lactosa 0.

Tabla E.4 Leche Hidrolizada 27 29.2. Medición de grados Brix para leche hidrolizada y sin hidrolizar Grados Brix [°Brix] Tiempo [min] 0 15 30 40 50 60 75 Leche Sin Hidrolizar 26.6 60 63 71.2 32 42.2 37 45 66 84 27 .2 28.

De esto calculamos Vm = 6418. Por lo que la cantidad de enzima a adicionar es 0.1 UI/ml enzima * X = 6418.677 ml de enzima. lo relacionamos con la actividad de la enzima en UI/ml enzima (determinada en la experiencia anterior) de la siguiente forma: 9478. 20 [g/L] Vm: Velocidad máxima.99 S0: Sustrato inicial.Anexo F Hidrólisis enzimática de la lactosa en un reactor por lotes. Para una conversión del 99% en el reactor en 2 horas de operación. 40 [g/L] t: Tiempo. 2 [L] Km: constante de afinidad. El Vm obtenido. 28 .677 ml de enzima. La expresión que se utilizó es: Vm * t S  0 * X  ln 1  X  K m * Vrxn K m X: Grado de Conversión. 120 [min] Vrx: Volumen de reacción. utilizando para esta enzima los valores de parámetros cinéticos de Km 20 [g/L] y la velocidad máxima de reacción se calculó según lo obtenido en el laboratorio anterior.3 UI.3 UI X = 0. 0. 99%.

0139  * fd Lactosa  g    L   0.450 25 0.097 41.108 Lactosa [g/L] fd [g/L] *fd 0.1.460 pH 6.752 38.157 0.175 0. Tiempo [h] 0 1.51 6.57 6.230 60 33.168 0. Tabla F.185 0.108 Absorbancia 2 0.3 1 0.107 Promedio 0.165 0.52 Temperatura [°C] 44 43 44 Mediante la siguiente ecuación se calculó la concentración de Lactosa en [g/L]. a través del tiempo:  Abs  0.423 30 0.Determinación de lactosa por método de DNS. Absorbancias obtenidas a diferentes intervalos de tiempo a 540 [nm].4042 29 .0 2.179 0.

525 0.135 0.280 0.034 0.001 0.285 0.1 34.293 [g/L] 0.8 2.014 0.587 4.153 0.6 52. se transformo a [moles/L] de la siguiente forma: 30 .087 7.461 8.085 0.520 13.091 0.093 Glucosa fd 60 30 30 30 45 45 101 101 101 [g/L] *fd 0.5 0. Tabla F.485 0.108 0.532 0.0 1.178 Para calcular el grado de conversión en función del tiempo se utilizaron las siguientes ecuaciones: Grado de conversión = (moles de glucosa/moles de lactosa) Por lo que la concentración de glucosa y lactosa en [g/L].300 Mediante la siguiente ecuación se calculó la concentración de glucosa [g/L].048 0.265 0.350 0.524 0.025 0.166 0.1 2.988 6. Tiempo 1 Absorbancia 2 Promedio 0.2: Absorbancias obtenidas a diferentes intervalos de tiempo a 505 [nm].3 0.0034  * fd Glu cos a  g    L   3.128 0.090 0.166 9.9 18.268 0.2 25.125 0.166 0.130 0.340 0.5 51.6 1.410 0.092 2.099 0.3 0.443 0. a través del tiempo:  Abs  0.427 0.041 0.530 0.270 0.3 42.285 0.242 4.290 0.028 0.051 0.2 0.609 9.095 0.041 0.330 0.520 0.0 48.018 0.483 0.031 0.515 0.471 3.052 Porcentaje de conversión 0.Determinación de glucosa por método de glucostat.480 0.8 28.9 [h] 0 0.404 mol glucosa 0.7 1.

2* 10-3)* 100 = 0.Glu cos a Ejemplo: 0.8 g   L   = 0.M .516 Todos los cálculos de conversión se realizaron con los [mol/L] de la concentración de Lactosa inicial 31 .0005 mol Moles de Glucosa = L  180 g  mol      Luego se realiza el cálculo para el grado de conversión: 0.Lactosa g   L   Moles de lactosa = P.099mol  L .Lactosa Ejemplo: 33.2 *10 0.M .0005 mol Grado de conversión =  L  5.3 [%] de conversión= (5.099 [mol/L] Moles de lactosa = g  342  mol    Glu cos a  g   L   Moles de glucosa = P.092 g   L    0.