Universidad de Guanajuato. Departamento de Medicina y Nutricin. Alumna: Dulce Carmn Hernndez Velzquez PRACTICA 4. BACILOS GRAMNEGATIVOS. ENTEROBACTERIAS.

INTRODUCCIN Los bacilos gramnegativos constituyen un grupo de grmenes de gran importancia en la clnica, dada la cantidad de cuadros nosolgicos con los que son relacionados. Algunos BGN (como Haemophilus y Brucella), no desarrollan en el medio de MacConkey, y requieren el medio de chocolate para su desarrollo; stos se conocen como Grmenes gramnegativos de difcil crecimiento, en esta prctica no trataremos de ellos. Para los fines clnicos, cuando alguien se refiere a los bacilos gramnegativos (BGN), en general se refiere a aquellos que desarrollan en el medio de MacConkey. Para los fines clnicos, estos bacilos MacConkey-positivos se dividen en fermentadores o no fermentadores segn tengan o carezcan de la capacidad para utililizar la glucosa en un medio anaerobio (fermentacin). ENTEROBACTERIAS Los BGN MacConkey-positivos, fermentadores, se conocen como Enterobacterias; sta es una familia de bacterias de primordial importancia en la medicina. Las enterobacterias, como su nombre lo dice, son microorganismos que habitan en el tubo digestivo del hombre, son gramnegativas y anaerobias facultativas (aunque crecen en aerobiosis, pueden crecer en anaerobiosis). Existen otras bacterias que coinciden en estas condiciones, pero hay tres requisitos extras que deben de cumplir para pertenecer a este grupo. Mencinelos. Fermentan la glucosa en anaerobiosis, reducen nitratos a nitritos y carecen de actividad de oxidasa. Estos microorganismos requieren aislarse de medios selectivos, aunque crecen extraordinariamente en medios enriquecidos. Mencione 3 medios de cultivo enriquecidos y 3 medios de cultivo selectivos: Selectivos: Salmonella Shigella, TCBS, McConkey. Enriquecidos: Sangre, BHI y chocolate. Una vez que se ha obtenido una muestra en un medio para enterobacterias, como lo es el agar MacConkey, se procede a realizar pruebas bioqumicas para identificarlas, estas pruebas son: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Utilizacin de hidratos de carbono Produccin de acetil metil carbinol (acetona) Utilizacin de citrato Produccin de ureasa Produccin de indol, motilidad y descarboxilacin de ornitina Descarboxilacin de aminocidos (lisina, ornitina y arginina) Produccin de sulfuro de hidrgeno Motilidad Produccin de DNAsa

UTILIZACIN DE HIDRATOS DE CARBONO Para esta prueba, se utilizan medios slidos en tubo como el agar hierro de Kligler. Este es el tubo ms importante pues permite confirmar que el germen en estudio es una enterobacteria. Este medio tiene un fondo y un pico de flauta. Se inocula por picadura y siembra en superficie observndose la fermentacin de lactosa en la superficie (aerobiosis) y de glucosa en el fondo (anaerobiosis), con produccin de gas, o sin ella. El medio contiene un indicador de pH, de tal forma que al utilizarse los carbohidratos existe un cambio en la coloracin del mismo (vira del rosado al amarillo). Este medio tambin contiene hierro el cual pone en evidencia la produccin de sulfuro de hidrgeno (vira al negro), que se ve mejor en el fondo cido ya que el microorganismo requiere de un pH bajo para producirlo. Interpretacin El medio sin inocular es alcalino, de color rosado y se representa como K/K. Cuando un germen utiliza

la lactosa y fermenta la glucosa, se tornar cido, de color amarillo, tanto el pico como el fondo, representndose como A/A. Existen otras posibilidades como K/A (lactosa-, glucosa+). Cuando se produce H2S, se agrega una s, como K/As (lactosa-, glucosa+,sulfuro+). Cuando adems se produce gas, existen burbujas que rompen o levantan el medio, y se representa como g, v.gr.: A/Ag. Cuando el medio permanece K/K, estamos en presencia de un germen no fermentador de la glucosa, o bacilo no fermentador (Como Pseudomonas o Acinetobacter). La reaccin A/K es muy poco comn y no abundaremos en ella. Escriba 5 ejemplos de bacterias (gnero y especie) posibles para cada una de las variantes de resultados en la prueba de Kligler. A/A (E. Coli, K. Pneumoniae, Enterobacter Chloacae, Serratia Fonticola, Yersinia Intermedia). A/As (Citrobacter freundii, Salmonella Choleraesuis (subespecies arizonae, diarizonae), Salmonella indica, Budvicia aquatica) . A/Ag (E. Coli, K. Pneumoniae, E. Aerogenes (subespecies ammnigenus, asburiae), Enterobacter cloacae) K/A E. Coli, Shigella . Klebsiella pneumoniae, Serratia entomophila, Salmonella choleraesius, morganella morganii. K/K Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter, Stenotrophomonas. PRODUCCION DE ACETIL METILCARBINOL (VOGES-PROSKAUER) El acetil metilcarbinol (acetona) es un producto de la degradacin del cido pirvico proveniente de la fermentacin de la glucosa y su produccin se hace patente mediante la reaccin de Voges-Proskauer en el medio lquido del mismo nombre. La reaccin se basa en la conversin de la acetona en diacetil por accin del KOH que se agrega al medio y del oxgeno atmosfrico. El medio es lquido y se siembra mediante la agitacin del asa en su interior. Interpretacin Luego de la incubacin por 18 a 24 h, se agrega 0.2 ml de KOH en solucin y se agita. Es necesario agregar luego 0.6 ml de alfa naftol para catalizar la reaccin. Si la prueba es positiva, se puede ver la reaccin rojiza en 1 a 15 minutos. Cules gneros se pueden identificar con esta prueba, y de acuerdo a ellos mencione cuadros clnicos de importancia que hagan de sta prueba una de las ms importantes. Ayuda a diferenciar Klebsiella y Enterobacter (+) de E. Coli (-) [Bacteremia por contaminacin de soluciones parenterales] Staphylococcus (+) de micrococcus (-) [Infeccin de tejidos blandos, donde micrococcus puede ser un contaminante]. K. pneumoniae (pneumoniae) de otras especies de Klebsiella. Mencione la importancia de sta prueba en la identificacin de enterobacterias. sta puede identificar entre tres tipos de enterobacterias de la especie Klebsiella: Klebsiella, Enterobacter y Serratia, reduciendo as el nmero de opciones de bacterias para poder identificarlas. UTILIZACION DEL CITRATO Algunas bacterias utilizan el citrato como nica fuente de energa para su metabolismo y crecimiento. Para esta prueba se utiliza el medio de citrato de Simmons, que contiene citrato de sodio y fosfato de amonio (como fuente de nitrogeno). Las bacterias que usan citrato utilizan la sal de amonio para extraer el nitrgeno, produciendo as amoniaco, el cual se convierte en hidrxido de amonio que alcaliniza el medio. El medio contiene azul de bromotimol que es verde a pH menor de 6 y azul a pH igual o mayor de 7.6. El medio se debe sembrar mediante estra en la superficie.

Interpretacin Luego de 18 a 24 h de incubacin, basta para considerarse positivo el crecimiento de la colonia en la estra. El color azulado confirma la reaccin positiva. Mencione 5 gneros bacterianos que dan negativa sta prueba y 5 gneros bacterianos que la den positiva. Bacterias citrato negativas: E. Coli en la gran mayora de los casos, Shigella, Citrobacter Edwarsiella, Hafnia, y algunas especies de salmonella y proteus dan negativa la prueba. Positiva: Ewingella, Salmonella, Proteus, providencia, Klebsiella. HIDRLISIS DE LA UREA Los microorganismos que hidrolizan la urea liberan amoniaco y dioxido de carbono; el amoniaco forma carbonato de amonio alcalinizando el medio produciendo una coloracin rojo-rosado. Existen dos medios disponibles para realizar esta prueba, el de Stuart que detecta solo grandes cantidades de amonio y el de Christensen, que est menos amortiguado y es por lo tanto, ms sensible a menores cantidades de amoniaco. Por ello, la mayora de los laboratorios prefieren este ltimo. El medio se inocula mediante la siembra en la superficie en pico de flauta. Interpetacin Luego de la incubacin se observa el cambio de color, de neutro a rosado. Los organismos que hidrolizan intensamente la urea (como Proteus) producen un cambio de color en todo el medio. Los hidrolizadores dbiles (como Klebsiella) viran slo el pico de flauta. DESCARBOXILACION DE LISINA La descarboxilacin de aminocidos, como la lisina, libera aminas de reaccin alcalina y dixido de carbono requirindose de un pH inicial cido. El medio que se utiliza es el de Meller, el cual es de color azulgrisceo. En un inicio el color vira a amarillo por la fermentacin de glucosa pero al producirse la descarboxilacin regresa a su color original. El medio es slido, se inocula mediante picadura del mismo ya que la reaccin debe llevarse en anaerobiosis. Interpretacin Luego de la incubacin, las pruebas de descarboxilacin son peculiares en su interpretacin, pues cuando el tubo torna a su apariencia original, se considera la prueba positiva. As, si el fondo del tubo es amarillo, la prueba se interpreta como negativa. De todas las pruebas bioqumicas, cual es la funcin primordial de sta en la identificacin? Cuando tenemos un tubo kliger con K/K y la lisina positiva, podemos hablar de contaminacin del cultivo. Adems, en el kliger tanto salmonella, citrobacter y proteus precipitan sulfuros, con una prueba positiva de lisina podemos distinguir a Salmonella de estos ltimos. PRODUCCION DE INDOL, MOVILIDAD Y DESCARBOXILACION DE ORNITINA El indol es un producto de la degradacin del triptfano, y se puede hacer patente en el medio mediante la adicin de reactivo de Ehrlich, formndose un sobrenadante rojo en el medio MIO (movilidadindol-ornitina); es un medio semislido y se siembra por picadura. El movimiento se observa en bacterias que son flageladas o que tienen la capacidad de formar flagelos a ciertas temperaturas, y se puede observar en este medio ya que es semislido. Interpretacin Luego de 18 a 24 h de incubacin, se observa si el piquete est bien definido (bacteria inmvil) o si se ha borrado, enturbiando todo el fondo del tubo (bacteria mvil). Se observa si el fondo se torn amarillo (ornitina negativa, o no descarboxilada) o si se mantuvo azulado (ornitina positiva). Finalmente, para observar la produccin de indol, se agrega el reactivo de Ehrlich, interpretndose como positivo cuando se forma una lnea rojiza por arriba del medio. Mencione que bacterias ayuda a discriminar la prueba de ornitina, movilidad e indol. Movilidad: Positividad de la prueba: Proteus, Salmonella, Enterobacter y Serratia.

Negativa: Klebsiella. Indol positivo; E. Coli y Proteus Vulgaris. Negativo: Proteus Penneria y Proteus Mirabilis. Ornitina: positivo: Proteus Mirabilis, negativo Proteus Penneria. PRODUCCION DE DNAsa Algunas enterobacterias producen la enzima DNAsa, lo que puede observarse en un agar con DNA preparado en caja de Petri, que vira al acidificarse. Interpretacin Luego de la incubacin, se observa, en los casos positivos, un halo blanquecino alrededor de inculo bacteriano, y la coloracin rojiza de la colonia bacteriana que desarrolla en dicho agar. Se pueden realizar todas estas pruebas y otras ms, inclusive existen paquetes completos ya disponibles por algunos laboratorios para diagnstico rpido, pero tienen pocas ventajas sobre los convencionales y s aumentan considerablemente su costo. Una vez que se incuban los medios diferenciales inoculados por 18 a 24 horas se anotan los resultados para compararlos posteriormente con tablas realizadas exprofeso, las cuales tienen el porcentaje de reaccin a cada una de ellas de los diferentes microorganismos para lograr su identificacin, la cual puede llegar a ser inclusive de gnero y especie. PRCTICA Objetivo Identificacin de BGN MacConkey-positivos. Material necesario: Medios de Agar MacConkey con colonias aisladas Asas bacteriolgicas Solucin salina estril Hidrxido de potasio Alfa naftol Reactivo de Ehrlich

Los medios siguientes: Citrato de Simmons. Kligler. Lisina descarboxilasa. MIO Voges Proskauer. Urea de Christensen. DNAsa MTODO 1. Se toman 3 a 5 colonias aisladas con caractersticas morfolgicas similares con una asa previamente esterilizada y se introducen en los tubos de la siguiente manera: a. Citrato de Simmons: Estra en superficie. b. Kliegler: Estra en superficie y picadura. c. MIO: Picadura ( Previa reduccin del medio a la flama). d. Urea de Christensen: Estra en superficie. e. Lisina descarboxilasa: Picadura del medio. f. Voges Proskauer: inmersin del asa y agitacin. g. DNASA: Estra en superficie. 2. Incubar los medios por 18 a 24 horas, a 36 C. 3. Interpretar con el auxilio de tablas. REPORTE DE PRACTICA. Escriba con letra de molde bien legible o a mquina. Utilice dibujos cuando sea necesario. Desarrolle: 1. Describa todas las reacciones en los tubos de bioqumicas de su prctica y sus compaeros, e interprete. 4

Prueba Kliger

Resultado A/Ag

Interpretacin Fermentador de glucosa en anaerobiosis, productora de gas. Fermentadora de lactosa en aerobiosis. Negativo positivo Bacteria Mvil. Ureasa negativo No pertenece Klebsiella a la tribu

Uilizacin de citrato Lisina descarboxilasa Movilidad, Indol y Ornitina. Ureasa Vogues- Proskauer

Verde Violeta Turbidez, resto sin cambios. Sin cambios Sin cambios

E. Coli es una de las pocas bacterias que dan la prueba de citrato negativa, y es un fermentadora de glucosa en anaerobiosis y fermentadora de lactosa en aerobiosis. 2. Diferencie y d ejemplos de: BGN MacConkey (+), BGN MacConkey (-), BGN fermentador, BGN no fermentador. Al agar MacConkey se le agrega cristal violeta y sales biliares para inhibir el crecimiento de las bacterias gram positvias, sin embargo, existen algunas BGN las cuales sern sensibles a estas sustancias, impidiendo su crecimiento. Entre las BGN MC+ existe la familia Enterobacteriaceae , y algunas no fermentadoras como Pseudomonas y Acinetobacter. Los gneros de BGN MC- son Haemophilus, Brucella, Bordetella, Francisella. Un BGN fermentador es aquel que produce cido lctico en el metabolismo de la glucosa, la familia enterobacteriaceae es la ms representativa, mientras que los no fermentadores se valen de otras rutas metablicas, no fermentan la glucosa en anaerobiosis. Pseudomonas y Acinetobacter son claros ejemplos. 3. Diferencie y d ejemplos de lactosa negativo y no fermentador. Una BGN lactosa negativo quiere decir que no fermenta la lactosa en aerobiosis, sin embargo, puede que fermente la glucosa en anaerobiosis, mientras que el no fermentador no hace esto ltimo. BGN lactosa negativos: Shigella, Salmonella, Serratia, Proteus. No fermentadores: Pseudomonas, Acinetobacter, Stenotrophomonas, etc. 4. Desarrolle brevemente en una cuartilla las principales enfermedades causadas por las enterobacterias en la clnica. Claramente las enterobacterias causan en muchas ocasiones cuadros intestinales, abajo se describen los causados por E. Coli. Sin embargo, existen cuadros clnicos extraintestinales son causados por enterobacterias. Entre ellas, E. Coli se lleva los primeros lugares. stos son de importancia mdica, puesto que una de las complicaciones ms graves es causada en gran parte por BGN. Tipo de E. coli E. Coli productora de toxina shiga (STEC) (E. Coli enterohemorrgica) O157 H7 Cuadro clnico asociado Patogenicidad Colitis hemorrgica. Sndrome Produccin de toxina Shiga. Urmico Hemoltico. Este cuadro tambin puede ser producido por Shigella dysenterae.

E. Coli Diarrea del viajero enterotoxignica (ETEC) (productora de LT-1 y STa) E. enteropatgena (EPEC)

Produccin de toxinas termoestables y termolbiles, factores de colonizacin. y lesin al

Coli Diarrea acuosa en nios y jvenes Adhesin, fijacin epitelio intestinal.

E. Coli enteroinvasora Disentera (EIEC) E. Coli Diarrea del enteroagregativa persistente. (EAEC), E. Coli con adherencia difusa (DAEC). viajero,

Invasin de clulas del epitelio del colon, con replicacin intracelular y transferencia de clula a clula. diarrea Adherencia colectiva, adherencia diifusa.

E. Coli Extraintestinal. IVUs (80%) Factores de adhesin para Infeccin abdominal y plvica superficies diferentes al epitelio Neumona adquirida en la intestinal. comunidad (1-5% de los casos) Meningitis infecciosa neonatal (2da causa despus de Streptococcus del grupo B) Celulitis o infeccin msculocutnea (miositis, puede llegar a osteomielitis) Endocarditis, muy raro Bacteremia y sepsis (17% de los casos)

Enfermedad Infeccin de Vas urinarias

Agente etiolgico E. Coli (80%) [IVU no complicada], K. pneumoniae [1-3% de las IVUs, complicada], Proteus [15% complicadas] Serratia** Citrobacter E. Coli, Klebsiella E. Coli (muy raro) K. pneumoniae, Proteus (raro), Enterobacter**, Acinetobacter** Serratia, E. coli Proteus, Enterobacter Citrobacter ,

Infeccin abdominal y plvica Neumona

Meningitis

Celulitis o infeccin msculo - cutnea Bacteremia Otras

E. Coli., Klebsiella E. Coli (17%), Acinetobacter* Klebsiella* , Proteus*

Infeccin de vas biliares (E. coli, Proteus)

*asociado a neutropenia febril y a dispositivos intravasculares. ** es potencialmente nosocomial. asociados a meningitis neonatal Cuadros extraintestinales: E. Coli, Klebsiella, Acinetobacter, Shigella, Citrobacter, Morganella, Proteus, Providencia y Edwatsiella normalmetne se encuentran en el colon, pero al desarrollar en otros focos, producen cuadros clnicos diversos. Entre ellos, encontramos el choque sptico, el cual es la complicacin ms grave de la infeccin por BGN, que acaparan la principal causa del mismo, sobre todo por E. Coli, Klebsiella y Proteus, que son los ms patgenos de este grupo. 5. Desarrolle brevemente en una cuartilla las principales enfermedades causadas por los BGN no fermentadores en la clnica. Las infecciones causadas por Pseudomonas sp. Y otros no fermentadores son similares, son ubicuos y oportunistas. Entre los factores de riesgo asociados a la infeccin por Pseudomonas Aeruginosa, encontramos: TRANSGRESIN DE LAS BARRERAS CUTNEAS O MUCOSAS: Quemaduras, Intubacin endotraqueal, Fibrosis qustica,Colocacin a permanencia de un catter en vena central, Dermatitis, Sondeo vesical, Traumatismo penetrante, Consumo de drogas inyectables Operaciones, INMUNODEPRESIN: Neutropenia, Extremos de edad (lactantes y ancianos), Defectos cualitativos en leucocitos, Diabetes mellitus, Hipogammaglobulinemia, Corticoterapia, Defectos en la inmunidad mediada por clulas Cncer, SIDA. PERTURBACIN DE LA FLORA BACTERIANA NORMAL: Administracin de antibiticos de amplio espectro, Exposicin al entorno en hospital. Esta es una infeccin predominantemente nosocomial, y se encuentran cuadros clnicos principalmente neumnicos, sta puede ser primaria o bactermica, en la primera, la infeccin de las vas areas es antecesora, luego de eso, puede producir consolidaciones lobares, y bronconeumonia, la cual tiene una alta mortalidad. En la bactermica, en cambio, exista un foco infeccioso fuera del aparato respiratorio, por lo que se disemina a ste va hematgena. No produce la consolidacin pulmonar tan frecuentemente como en la primera, pero tambin se encuentra el edema intersticial y alveolar, existe bronconeumona, necrosis alveolar, hemorragias y abscesos pulmonares. necrotizante. Clnicamente se encuentra tos productiva, hemoptoicos, disnea grave, cianosis, fiebre, escalofros y deterioro neurolgico, esto debido al sindrome de respuesta inflamatoria sistmica tan grave que produce. Este mismo agente se encuentra asociado a endocarditis bacteriana, abscesos cerebrales y cerebritis, otitis extera maligna, endoftalmitis, etc. Bibliografa. Fauci, Et. Al. Harrison Principios de medicina interna, Edicin 17. Mc Graw Hill.