Nematodos Entomopatogenos

NEMATODOS COMO AGENTES DE CONTROL BIOLÓGICO

EDNA PAOLA BECERRA E Ing. Agronómica

Seminario elementos de microbiología agrícola 2008-II

CONTENIDO
Introducción Familias Plagas que controlan Ubicación taxonómica de los nematodos entomopatógenos Ciclo de vida Relación simbiótica (Bacterias) Modo de acción Formulación y comercialización Estudio de caso
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Introducción Principales familias Plagas que controlan Ubicación taxonómica de los nematodos entomopatógenos Ciclo de vida Relación simbiótica (Bacterias) Modo de acción Formulación y comercialización Estudio de caso
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INTRODUCCIÓN
Los nematodos son organismos invertebrados, multicelulares de forma alargada y cilíndrica asemejándose a un gusano (Nematoda, del griego nema, "hilo", eidés u oidos, "con aspecto de"). Estos presentan cuerpo no segmentado y simetría bilateral.

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NEMATODOS ENTOMOPATÓGENOS
Agentes de Control Biológico Organismos que parasitan larvas de insectos causando su muerte. Fácil producción, adaptabilidad en campo, buena capacidad de búsqueda (Parada, 2001).
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Familias
Tetradonematidae Allantonematidae Sphaeruliidae Phaenopsitylenchidae Mermithidae

Heterorhabditis megidis

Heterorhabditidae Steinernematidae
Steinernema feltiae

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Plagas que controlan
Coleópteros Chizas

Phyllophaga spp. (Coleoptera: Melolonthidae)

Ancognatha scarabaeioides (Coleoptera: Scarabaeidae)

creatures.ifas.ufl.edu/field/white_grub4.htm

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Plagas que controlan
Otros coleópteros de importancia económica

Premnotrypes vorax (Coleoptera: Curculionidae) Hypothenemus hampei (Coleoptera: Curculionidae)
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Plagas que controlan

Lepidópteros

Phthorimaea operculella (Lepidoptera: Gelechiidae) Tecia solanivora (Lepidoptera: Gelechiidae),
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Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyrallidae)

Plagas que controlan
Otras
Cyrtomenus bergi (Hemíptero: Cydnidae) Chinche de la yuca

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Ubicación taxonómica
Reino: Animalia Phylum: Aschelmyntes (Nematoda) Clase: Secernentea Orden: Rhabditida Familia: Heterorhabditidae y Steinernematidae Genero :Heterorhabditis y Steinernema Especie: spp.

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Especies
Steinernema feltiae S. scarabaei S. carpocapsae Heterorhabditis Bacteriophora H. megidis
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S. carpocapsae

H. bacteriophora

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Ciclo de vida

Ciclo de Nematodos Huevo JI Primera muda J2 Segunda muda J3 (infectivo) Tercera muda J4 Cuarta muda adulto

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JI liberan toxinas El hospedante Y fase I del muere y se bacterio torna crema produce antibióticos Y toxinas 1 Generacion Ingresan por de adultos la cutícula hermafroditas

Juveniles infectivos Localizan el hospedante

Eficiente reproducción Y desarrollo de huevos J1, J2, J3 y J4

Juveniles infectivos J3 emergen Del cadaver del hospedante Fase I del bacterio Coloniza nematodos
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Eficiente producción Y desarrollo de Huevos J1, J2, J3

2da Generación De adultos Tamaño 50% menor Que la 1G

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RELACIÓN SIMBIÓTICA
BACTERIAS

• Photorhabdus luminiscens • Xenorhabdus bovienii

Heterorhabditis

Steinernema

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Bacteria simbionte
Familia Enterobacteriaceae Bacilos Gram negativos Móviles por medio de flagelos o cilios No se encuentran en estado libre en la naturaleza Photorhabdus spp son bioluminiscentes y producen pigmentos amarillos o rojos (no es común en Enterobacteriaceae) Fijan el cadáver del hospedante en color rojo purpúreo, anaranjado, amarillo, castaño. Produce antibióticos Xenorhabdus spp presenta fase I y fase II ( estacionaria). es catalasa negativa y no reduce nitrato (no es usual en Enterobacteriaceae) Se encuentra en el intestino posterior de los J3.
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Diferencias

(Forst y Nealson, 1996)

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Relacion simbiotica
BACTERIA
Es incapaz de vivir en el suelo y se debe alojar en el intestino del juvenil Depende del juvenil infectivo para llegar al hemocele (cavidad sanguínea) del hospedante Recibe protección del nematodo, el cual inhibe las defensas antibacterianas del hospedante.

Fuente: www.cost850.ch/welcome.html

NEMATODO
La bacteria mata al hospedante rápidamente y crea un ambiente conveniente para el desarrollo del nematodo, produciendo antibióticos que suprimen competencia de microorganismos. La bacteria transforma los tejidos del hospedante en una fuente de comida para el nematodo. La bacteria sirve como fuente de comida para el nematodo ( Parada et al 2002). La reproducción es optima cuando esta en simbiosis con la bacteria.

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Heterorhabditis bacteriophora infected waxmoth larvae. 36 hours post-infection, these larvae glow due to the symbiotic bacteria, P. luminescens.
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http://www.oardc.ohiostate.edu/nematodes/using_insect_parasitic_n ematodes.htm

Cranberry rootworm larvae and pupa (middle) infected with H. bacteriophora

(a) Larva sana (crema); (b) Steinernema feltiae - cafe (c) Steinernema carpocapsae - infected (marron claro) (d) Heterorhabditis bacteriophora infectado (rojo) larvae of Galleria mellonella.

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Características de las bacterias simbiontes

(Forst y Nealson, 1996)

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Características de las bacterias (Forst y Nealson, 1996) simbiontes

Antibióticos: Xenorhabdinas, xenocumacinas, Hydroxistilbenes, Indoles derivados de antibióticos. Pigmentos: derivados de Antraquinona Menor actividad en la fase II Seminario elementos de
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Especies de bacteria y hospederos

(Forst y Nealson, 1996)

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A dissected Japanese beetle larva showing later stages of the Heterorhabditis bacteriophora nematode. Seminario elementos de http://www.pueblo.gsa.gov/cic_text/housing/japanese-beetle/jbeetle.html
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Fuente:

Seminario elementos de microbiología agrícola 2008-II http://el-atracio.blogspot.com/search/label/Cusco

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Modo y mecanismo de acción
Búsqueda de su hospedero, Producción de secreciones enzimáticas para entrar al cuerpo a través de la boca, ano y espiráculos del insecto hasta llegar a la hemocele. El nematodo obtiene el alimento de la hemolinfa El nematodo regurgita la bacteria El hospedero muere 48 horas posterior a la inoculación Los infectivos salen del cadáver a los 12-14 días después de la infección. de Seminario elementos
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Requerimientos medioambientales
Objetivo: mantener la movilidad y viabilidad del nematodo Temperatura: 12-18ºC Luz: Aplicación en la tarde para que la radiación UV no afecte los nematodos y aplicar con protectantes Humedad del suelo: capacidad de campo Textura del suelo: no compactada
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Formulación Gel alginato

Descripción Contenedor de 0,5 litros, 10 millones de nemátodos atrapados en matriz. Contenedor de 4 litros, 250 millones de nemátodos atrapados en matriz.

Almacenamiento 5 meses a temperatura ambiente, 12 meses con refrigeración. 3 meses a temperatura ambiente, 6 meses con refrigeración.

Gel poliacrilamida

3 billones de nemátodos por caja (25 x 40 x 60 cm), 109 nemátodos atrapados en 2 kg. 50 millones de nemátodos dispersos en 80 g de arcilla. 250 millones de nemátodos suspendidos en matriz encerrada en bolsa plástica (40 x 50 cm).

5 días a temperatura ambiente, 3 meses con refrigeración.

Arcilla

3 meses con refrigeración.

Gel soluble

3 meses a temperatura ambiente, 6 meses con refrigeración.

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Comercialización
NemaSeek - Beneficial Nematodes - H. bacteriophora 10 milliones de nematodos NEMOPAKH heterorhabditis bacteriophora nematodos entomopatógenos de larvas de coleópteros. 50 millones de larvas infectivas de nematodos B-Green Dependiendo del envase, contiene 50 ó 500 millones de nemátodos juveniles. Los envases de 50 y 500 millones de nemátodos permiten respectivamente el tratamiento de una superficie de 100 m² y 1.000 m². PROBIONE
Guardian T - Heterorhabitis bacteriorphora Prod. ID: 2210BT Seminario elementos de
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Estudio de caso
Aislamiento de Xenorhabdus bovienii, simbionte de Steinernema feltiae (Rhabditida: Steinernematidae), cepa colombiana (Triviño et al., 2006).

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Aislamiento de Xenorhabdus bovienii, simbionte de Steinernema feltiae (Rhabditida: Steinernematidae), cepa colombiana

Objetivo Aislamiento de X. bovienii, simbionte de S. feltiae, cepa colombiana como etapa inicial para determinar la cinética de población en medios de cultivo.
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Introducción
La bacteria presenta dos fases: La fase I es de gran importancia en el proceso patogénico, provee mas nutrientes al nematodo. La fase II se observa cuando los nematodos abandonan el cadáver, en esta fase pierde algunas funciones metabólicas aun no es claro los mecanismos de variación de fase.
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Introducción
FI forman colonias redondas pequeñas, adsorbe rojo neutral en McConkey y en NBTA adsorbe Azul de Bromotimol y degradan cloruro de trifeniltetrazolio FII Las colonias son mas grandes y no adsorben colorantes pero se tiñes de rojo al degradarse el CTT Es un proceso reversible identificado como fase de variación inversa
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Materiales y métodos
AISLAMIENTO: Aislamiento a partir de hemolinfa de larvas de G. mellonella de ultimo instar. CARACTERIZACIÓN Medio NBTA (agar + 0,0025% azul de bromotimol + 0,004% de cloruro de trifeniltetrazolio) Agar McConkey para evidenciar las dos formas de la bacteria Criterio de selección de la bacteria asimilación de azul de bromotinol a las 42 horas después de incubación. Descripción de las colonias y pruebas bioquímicas
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Materiales y métodos
El cultivo base se inicio transfiriendo una de las colonias aisladas a un medio liquido YS, incubando a 25ºC durante dos días, en agitación a 200rpm. Las bacterias Fase I y fase II fueron almacenadas en medio con glicerol al 15%, en Eppendorf a -80 ºC. ACTIVIDAD ANTIBIOTICA: Se evaluó en fase I sobre Bacillus cereus, inoculando una placa de esta con 24 horas de crecimiento en medio nutritivo distribuyéndolo en el agar. Se pusieron discos de papel filtro impregnados con X. bovienii de 24 horas de crecimiento en medio nutritivo. Registro del tamaño de las zonas de inhibición a las 24 horas.
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Materiales y métodos
Patogenicidad:
Soluciones (10ml) buffer fosfato (50nM) 90.000.000 - 900.000 - 90.000 - 9.000 - 900 - 9 células/ml. ( 25 larvas por dosis) Fueron inyectadas vía oral con jeringa, en el hemocele de las larvas de últimos instares de G. mellonella. Las larvas se dispusieron en cajas de petri y se incubaron a 21ºC en oscuridad. Se registro la mortalidad y cambio de coloración de la cutícula durante 24 – 72 horas. Control: solución salina
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Resultados y discusión
Aislamiento y caracterización de X. bovienii
Fase I Descripción de la colonia Agar McConkey Agar NBTA circulares convexas, granuladas, opacas, con borde irregular Coloración rojo y rosado Color azul-verde con zona clara alrededor Fase II Planas, traslucidas, con margen regular y mayor diámetro Blancas o amarillas Rojas- marrón sin zona clara alrededor

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Resultados y discusión
No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
20 21 22 23 24 25 26 27

Bioquímicas Arabinosa Manosa Sacarosa Melibiosa Ramnosa Sorbitol Manitol Adonitol Galactosa Inositol p-n-p-fosfato p-n-p-a- glucosido p-n-p-galactosido Prolina nitroanilida p-n-p-bis fosfato p-n-p-xilosido p-n-p-a-arabinosido p-n-p-fosforilcolina p-n-p-a- glucoronido
p-n-p-N- acetil glucosamida L-glutamil p-nitroanilida Esculina p-nitro-DL-fenilalanina urea glicina citrato acido malonico

Aislamiento + + + + + + + + + + + + + + D + -

Literatura + + + + + + + + + + + + D +

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Bioquímicas complementarias lactosa sacarosa glucosa + producción de gas rojo de metilo + voges Proskauer sulfuros indol D + movilidad + nitratos + gelatina catalasa oxidasa + patogenicidad en larvas + + adsorcion de azul de bromotinol + + colonia en Agar McConkey Roja Marrón Seminario elementos de microbiología agrícola 2008-II

28 cloruro de trifenil tetrazolio 29 arginina 30 lisina

Resultados y discusión
Actividad antibiótica Se presentaron zonas de inhibición de crecimiento con áreas promedio de 0,43 cm2 de Bacillus cereus por actividad antibiótica de X. bovienii. El control no presento crecimiento de B. cereus . La actividad antibiótica permite un ambiente adecuado para el nematodo ya que infecta invasores secundarios.

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Resultados y discusión
Patogenicidad Transcurridas 24 horas se registro un 70% de mortalidad de larvas de G.mellonella. Se obtuvieron cultivos puros de X. bovienii y se observo la rápida patogenicidad sobre el hospedante comparadas con otras sepas evaluadas por otros autores.
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Conclusiones Generales
Los nematodos son Agentes de Control Biológico que pueden ser usados en MIP. Las principales especies son Heterorabditis bacteriophora y Steinernema spp. El Nematodo es efectivo gracias a las bacterias simbiontes de los géneros Xenorhabdus y Photorhabdus. Se ha comprobado su acción en plagas de importancia económica. Es eficaz gracias a que el nematodo busca a su hospedero y la bacteria permite la entrada y muerte del mismo.
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GRACIAS

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