Digitally signed by Biblioteca UTM Reason: I attest to the accuracy and integrity of this document

UNIVERSITATEA TEHNIC A MOLDOVEI

FACULTATEA TEHNOOGIE I MANAGEMENT N INDUSTRIA ALIMENTAR CATEDRA ENOLOGIE

BIOCHIMIE
ndrumar de laborator

Chiinu U.T.M. 2007

ndrumarul este destinat studenilor anilor 2(U) i 3(U) a seciilor de zi i cu frecven redus pentru toate specialitile tehnologice ale facultii TMIA care studiaz cursul de "Biochimie".

Elaborare: conf.univ., dr. Liudmila Palamarciuc conf.univ., dr. Tatiana Vrabie lector superior Aliona Sclifos Redactor responsabil: prof.univ., dr. Anatol Blnu Recenzent: conf.univ., dr.Rodica Sturza

Bun de tipar 23.05.07. Formatul 60x841/16 Hrtie ofset. Tipar RISO Tirajul ex. 200 Coli de tipar 7,25. Comanda nr. 85 U.T.M., 2004, Chiinu, bd.tefan cel Mare, 168. Secia Redactare i Editare a U.T.M. 2068, Chiinu, str.Studenilor 9/9
U.T.M., 2007

ORGANIZAREA I METODICA EFECTUARII LUCRRILOR DE LABORATOR, REGULILE TEHNICII DE SECURITATE PENTRIU LABORATORUL DE BIOCHIMIE nainte de a ncepe lucrul n laborator trebuie s fie cunoscute regulile generale de lucru, regulile tehnicii securitii, msurile de prentmpinare i prevenire a accidentelor. Studentul care rspunde materialul nsuit profesorului este notat ntr-un registru special. Cei care snt nepregtii pentru efectuarea lucrrii practice nu snt admii. Regulile generale de efectuare a lucrrilor practice 1. nainte de a ncepe lucrarea practic trebuie s fie nsuit materialul teoretic la aceast lucrare din ndrumarul metodic. Materialul nvat se expune profesorului, aceasta fiind ca permis la efectuarea lucrrii. 2. n procesul lucrrii practice trebuie s fie respectate consecutivitatea operaiilor recomandate de regulile de securitate i de indicaia metodic. 3. n timpul lucrului studentul trebuie s fie atent, s pstreze linitea, s fie punctual. 4. Se interzice ca studentul s lucreze n laborator singur, fr supravegherea profesorului sau a inginerului. 5. Fiecare student trebuie s lucreze la locul stabilit, s foloseasc aparatele, vesela chimic, reactivele, care snt pe mas la lucrarea corespunztoare. Dac lipsete un reactiv sau un vas chimic trebuie de adresat la profesor sau inginer. Se interzice de a lua reactive i vase chimice de pe alte mese de laborator. 6. Pe masa de laborator nu trebuie s fie obiecte ce nu au legtur cu lucrarea practic. Dup terminarea lucrrii, locul de lucrul din laborator trebuie s fie adus n ordine.

Tehnica de securitate pentru laboratorul de biochimie i regulile de folosire a reactivelor chimice 1. Pe parcursul efecturii experienelor trebuie cu atenie de folosit vasele chimice, aparatele i reactivele. 2. Se interzice de lucrat cu vase chimice nesplate sau stricate. 3. Se interzice de lsat fr supraveghere aparatele n funciune. 4. Toate lucrrile cu substanele toxice sau cu miros iritabil trebuie s fie efectuate n nia de ventilare. 5. n timpul lucrrilor practice legate de substane inflamabile (eter, alcool, benzin, benzol, aceton i altele) sau explozive trebuie de respectat urmtoarele reguli: substanele date se in ct mai departe de foc i de aparatele de nclzire; nu se admite pstrarea lor n vase de sticl subire i nchise ermetic cu dop; nu se admite pstrarea reactivelor n cantiti mari pe masa de laborator; se interzice de turnat aceti dizolvani aproape de foc sau de nclzit la foc deschis. Se permite de nclzit numai n baia de ap cu rcitor de ap invers; se interzice de turnat reactivele date n chiuvet; dac au fost vrsate cantiti mari de substane inflamabile trebuie imediat de nchis toate robinetele de gaz, de deconectat aparatele electrice, aparatele de nclzit, de deschis toate ferestrele i de strns soluia vrsat cu crpa. 6. Vasele cu reactive trebuie de astupat cu dopuri respective. 7. Se interzice de lsat soluia n vase fr inscripii. 8. Pentru a cntri probe de produs de natur vegetal trebuie de folosit cntarul tehnic i nu cel analitic. 9. Se interzice categoric de tras cu ajutorul gurii n pipete soluii care pot provoca arsuri chimice (acizi i baze alcaline concentrate, reactivele Fehling, amestecul formolic i altele). 4

10. n laborator nu se mnnc nici nu se bea din vesela chimic. 11. n laborator se interzice de fumat, de consumat buturi alcoolice sau droguri. Primul ajutor n caz de arsuri i intoxicaii 1. Dac arsura provine de la un obiect incandescent sau de la foc leziunea trebuie tratat cu o soluie de alcool etilic, apoi de uns cu glicerin sau vaselin. Arsurile grave se trateaz cu soluie de permanganat de potasiu sau cu vaselin i se adreseaz la medic. 2. Dac pe suprafaa pielii au nimerit stropi de lichid agresiv ea trebuie splat imediat cu ap din robinet, apoi neutralizat: acidul cu soluie de sod calcinat de 3 % sau amoniac, iar baza alcalin cu soluie de acid acetic de 2 %. 3. Dac n ochi au nimerit stropi de acid concentrat, splai imediat cu ap din robinet, apoi cu soluie de sod calcinat de 3 %, adreseai-va urgent la medic. Dac au nimerit stropi de baz alcalin se spal cu ap , apoi cu cantiti mari de soluie de 0,5 % de acid boric, se adreseaz urgent la medic . 4. Dac ntmpltor au nimerit reactive n organism se recomand: n caz de baz alcalin de but o cantitate mare de ap, apoi un pahar cu soluie de 2 % de acid acetic sau citric; n caz de acid un pahar cu soluie de 2 % de bicarbonat de sodiu. 5. Dac s-a produs lezare cu sticl n primul rnd trebuie de nlturat cioburile din ran, apoi de dezinfectat cu soluie alcoolizat de 3 % de iod i de legat cu pansament steril. Dac scurgerea e mare, mai sus de ran se aplic un garou, apoi se adreseaz la medic. 6. Dac n laborator izbucnete incendiu, trebuie nchise imediat robinetele de gaz i de lichidat focarul incendiului cu nisip sau stingtor de bioxid de carbon. Dac s-a aprins haina stingerea se face cu o plapum de ln.

Lucrarea de laborator nr. 1 Determinarea azotului total n produse vegetale (dup metoda Kjeldahl) Importana analizei Aceast metod este utilizat pentru determinarea azotului aminic, amidic, peptidic i a amoniacului liber. n materia vegetal (cu excepia pomuoarelor i strugurilor) masa principal de substane azotoase este reprezentat de proteine. Protidele i proprietile lor Protidele snt substane formate din aminoacizi, ele au o importan primordial (grec. protos- primul) pentru organismele vii. Protidele se gsesc n toate organismele vegetale i animale. n regnul animal protidele snt substane predominante 65-70 %, n plante 2-35 % din masa uscat. Necesitatea fiziologic a omului este de 100 grame pe zi. Compoziia elementar a proteinelor: C - 50,6 - 54,5 %; O - 21,5 - 23,5 %; N - 15,0 - 17,6 %; H - 6,5 - 7,3 %; S - 0,3 - 2,5 %; Numeroase proteine mai conin n cantiti mici i alte elemente: P, Fe, Mg, Cu, Mn etc. Reieind din coninutul azotului N n protein (16 % n mediu) se poate determina indirect cantitatea de protein brut din materialul cercetat, utiliznd formula: Proteina brut = N x 100/16 = N x 6,25 n organismele vii proteinele exercit funciile de cataliz, structur, transport, aprare, depozitare, recepie i de reglare a activitii genomului, efectueaz micrile i reprezint o mare parte de hormoni. Pentru proteine se deosebesc patru niveluri de organizare intramolecular: structura primar, secundar, teriar i cuaternar. 6

Proteinele formeaz aceste structuri datorit celor cinci tipuri de legturi dintre aminoacizi: peptidice, covalente disulfidice, ionice, de hidrogen i hidrofobe. Proteinele au proprieti amfotere, fiindc conin grupri acide i bazice. Proteinele uor denatureaz, ca rezultat i schimb proprietile biologice i fizico-chimice. Sub aciunea enzimelor, bazelor i acizilor proteinele se descompun formnd produse intermediare (peptone, polipeptide) i la ultima faz a hidrolizei aminoacizi. Clasificarea proteinelor simple i conjugate Toate proteinele se mpart n dou grupe mari: proteine simple (proteine), n compoziia crora intr numai resturi de aminoacizi i proteine conjugate (proteide), care reprezint o combinaie dintre o protein simpl cu un compus de natur neproteic, denumit gruparea prostetic. Proteinele simple n funcie de solubilitatea i proprietile fizice proteinele simple se divizeaz n urmtoarele grupe: albumine, globuline, prolamine, protamine, histone, gluteline, scleroproteine sau proteinoide. Albuminele snt proteine solubile n ap. Au masa molecular relativ mic de la 10 mii pn la 100 mii uniti. Snt foarte rspndite n natur: ovalbumina din albuul de ou, leucozina din gru, legumelina din mazre, lactalbumina din lapte, etc. Globulinele snt proteine insolubile n ap, dar solubile n soluii de sruri ale metalelor uoare (5-10 % NaCl sau Na2SO4). Au o mas molecular mare 100 000 1 000 000. Snt foarte rspndite n natur: lactoglobulina din lapte, miozina din muchi, legumina din mazre, fasolina din fasole albe etc. Prolaminele (sau gliadinele) snt proteinele greu solubile n ap i n alcool absolut, dar solubile n alcool de 60-80 %. Ele conin mult prolin. Se gsesc mai ales n plante, n seminele cerealelor: gliadina din boabele de gru i secar, zeina din boabele de porumb. Protaminele snt proteine, soluiile crora au un caracter bazic puternic, snt uor solubile n soluii diluate de acizi, masa 7

molecular este joas (pn la 12 000). Nu conin sulf, se gsesc n cantiti mari n nucleul celular i sperma petilor: clupeina din scrumbie, sturina din nisetru. Histonele proteine nucleare cu un caracter slab bazic, solubile n soluii diluate de acizi. Intr in componena proteidelor cromozomilor, eritrocitelor , leucocitelor, celulelor timusului. Glutelinele snt proteine cu un caracter slab acid, solubile n baze diluate. Snt bogate n acid glutamic, au proprieti mucilaginoase, ca i prolaminele se gsesc n semine de cereale (gluteina din boabele de gru, orizenina din boabele de orez). Amestecul format din gluteina i gliadina care se izoleaz din fina de gru poart denumirea de gluten. Proteinele din gluten prin punile lor -S-S- confer finii de gru proprietatea de a forma cu apa un aluat elastic, care reine ntr-un mod caracteristic dioxidul de carbon eliberat n timpul fermentrii, dnd pinii o structur poroas i un volum corespunztor. Scleroproteinele proteine insolubile (fibrilare). Conin o cantitate mare de glicin i cistein. Reprezentanii tipici snt colagenul din esutul conjunctiv, elastinele din arterii i tendoane , cheratinele din pr, coarne, copite, piele, ln, unghii. Proteine conjugate (proteide) Proteidele n funcie de gruparea prostetic se clasific n subgrupe: 1. Fosfoproteidele snt un grup mic de proteine care conin acid fosforic. Au caracter acid, snt solubile n soluii alcaline, se conin n lapte (cazeina), n glbenuul de ou (vitelina). Unele enzime snt fosfoproteide: pepsina, fosforilaza, fosfoglucomutaza, fosfotriozoizomeraza etc. n plante fosfoproteidele au fost identificate n polenul de porumb. 2. Cromoproteidele au o grupare prostetic colorat i n general snt biocatalizatori ai fotosintezei i ale altor reacii de oxidoreducere. Ca grupare prostetic pot servi derivai ai porfirinei (clorofila, hem), izoaloxazinei, carotinei. Clorofila intr n componena cloroglobinei, hemul mpreun cu globina 8

3.

4.

5.

6.

formeaz hemoglobina, izoaloxazina este gruparea prostetic a flavinproteidelor (dehidrogenazelor aerobe), derivaii carotinei formeaz rodopsina din retina ochiului. Glicoproteidele au gruparea prostetic de natur glucidic. n majoritatea cazurilor, gruparea prostetic este reprezentat de mucopoliglucide, care prin hidroliz dau manoza, galactoza, hexozaminele, acizii glucuronic, acetic i sulfuric. Cele mai importante glicoproteide snt mucinele n secreia mucoaselor (protejeaz mucoasele tractului gastro-intestinal) i mucoidele (intr n constituia cartilagiilor, oaselor, tendoanelor i ligamentelor). Avidina este o glicoproteid din albuul de ou crud, care inhib activitatea biotinei. n semine i alte organe vegetale se gsesc glicoproteide care produc aglutinarea eritrocitelor, ele se numesc lectine. Cantiti mai mari de lectine se gsesc n leguminoase. Lipoproteidele au n componena lor lipide: colesterol, fosfolipide, acilgliceroli. Lipoproteidele au o larg distribuie, fiind componente structurale ale biomembranelor. n cantiti mari se gsesc n esutul nervos, plasma sngelui, lapte, glbenu de ou. Ele ajut la transportul unor substane liposolubile (vitamine, hormoni, carotinoide, diverse medicamente). Metaloproteidele conin un metal (Fe, Cu, Mg, Zn, Mn, Co etc.) fixat prin legturi complexe direct de componena proteic. Gruprile proteinei care fixeaz metalul poart denumirea de liganzi. Unele metaloproteide snt enzime (polifenoloxidaza, alcooldehidrogenaza), altele ndeplinesc funcia de proteine transportatoare de metal (transferina) i rezerva de metal (feritina). Ele particip la diverse procese metabolice: fotosinteza, respiraia, transportul de O2 i electroni. Nucleoproteidele snt constituite din acid nucleic i protein, au o mas molecular mare (de la cteva mii pn la sute de milioane). Cromozomii, ribozomii, viruii snt particule nucleoproteice. 9

Principiul metodei Produsul vegetal, care conine substane azotoase, se mineralizeaz prin ardere n acid sulfuric concentrat. Ca catalizator, n dependen de substan care se arde, se folosete sulfat de cupru sau peroxid de hidrogen, mercur, permanganat de potasiu, selen etc. Pentru a ridica temperatura de fierbere a acidului sulfuric se folosesc cristale de sulfat de sodiu sau potasiu. n procesul de mineralizare se formeaz amoniac, care se unete apoi cu acidul sulfuric, formnd sulfat de amoniu: __ R __ CH COOH + H2SO4 CO2 + H2O + SO2 + (NH4)2SO4
NH2 Arderea produsului analizat se efectueaz n balonul Kjeldahl. Dup mineralizarea total soluia rcit se dozeaz cu o cantitate mare de hidroxid de sodiu, iar amoniacul eliminat se distileaz i se reine cu soluie diluat de acid sulfuric. Cantitatea de acid sulfuric legat se recalculeaz n amoniu, apoi n azot, care se exprim n procente n raport cu masa produsului analizat. Pentru a calcula cantitatea de azot n substana proteic rezultatul se nmulete cu coeficientul corespunztor. Pentru majoritatea proteinelor se folosete coeficientul 6,25 din considerarea c cantitatea de azot este n medie 16 %. Pentru proteinele din cereale coeficientul este egal cu 5,71 din cauz c cantitatea de azot este n medie 17,5 %. __

Aparate, vase i materiale: aparat pentru ardere; aparatul Kjeldahl; 2 baloane Kjeldahl; 2 pipete gradate de 5 cm3 i pipeta Mor de 10 cm3; 2 baloane conice de 250 cm3; cilindru de 10 cm3; H2SO4 concentrat; 10

sulfat de cupru (cristale), CuSO4; sulfat de natriu sau potasiu (Na2SO4 sau K2SO4); soluie de 0,02n H2SO4; soluie de 0,02n NaOH; soluie de 33 % NaOH; indicator mixt (metilrot-metilen albastru): 0,2 g metilrot i 0,012 g metilen albastru se dizolv n 60 cm3 alcool i cu ap se aduce pn la 100 cm3. Ordinea ndeplinirii lucrrii Aparatul Kjeldahl (fig. 1) este constituit din vaporizator (1), umplut cu ap distilat cu ajutorul plniei (2). Balonul Kjeldahl (6) este unit cu vaporizatorul printr-un tub (3) nzestrat cu o plnie (4) cu clem (5) pentru dozarea soluiei de 33 % NaOH i este unit cu rcitorul (7) prin captatorul de picturi (8). Alonjul rcitorului (10) este unit cu un balon conic (de recepie) de 250 cm3 (9).

Figura 1. Aparatul Kjeldahl

11

Metoda determinrii azotului total n produse lichide n dou baloane Kjeldahl se msoar cu pipeta gradat cte 3 5 cm soluie pentru analiz (vin, suc etc.). Baloanele se nclzesc la aparatul de ardere i se fierb pn cnd volumul soluiei ajunge la 1-1,5 cm3 (nu se admite prinderea de fund). Apoi n fiecare balon dup rcire, se dozeaz cu cilindrul 3 cm3 de H2SO 4 concentrat, aproximativ 50 mg de CuSO4 i 0,5 g de Na2SO4, balonul se nchide liber cu dop de sticl i se pune la ardere n nia de ventilare. Arderea probei se face pn cnd soluia din balon devine incolor i nu conine resturi carbonizate de substan. Se pregtete aparatul Kjeldahl pentru distilare. Apa din vaporizatorul (1) se fierbe. Balonul Kjeldahl (6) cu proba neutralizat i rcit se unete la aparat. n balonul conic (de recepie) de 250 cm3 (9) se dozeaz cu pipeta Mor 10 cm3 soluie 0,02n de H2SO4 i balonul se instaleaz sub rcitorul (7) astfel, nct captul alonjului (10) s fie de 2-3 mm n soluie. n balonul Kjeldahl prin plnia (4) se dozeaz 15 cm3 de ap distilat, apoi cu cilindrul soluie 33 % de NaOH din raportul (la fiecare 1 cm3 H2SO4 concentrat luat la ardere se adaug cte 5 cm3 soluie 33 % de NaOH). Se nchide repede clema (5) la plnia (4) i se ncepe procesul de distilare a amoniacului, care decurge 15 min. n ultimele 5 minute alonjul rcitorului nu trebuie s fie n soluia de acid. Dup distilare alonjul se spal cu o cantitate mic de ap distilat. La soluia obinut din balonul conic de 250 cm3 se dozeaz 4-6 picturi de indicator mixt i surplusul de acid se titreaz cu soluie 0,02 n de NaOH din biuret. Paralel se pune proba de control, pentru care n balonul Kjeldahl n loc de vin se ia ap distilat i se repet aceleai operaii descrise mai sus. La recalcularea cantitii de azot total se ia n considerare c 1 cm3 soluie 0,02 n NaOH corespunde la 0,28 mg de azot.

12

Cantitatea de azot (X) n mg/dm3 n produsul analizat se calculeaz dup formula:

(a-b) * K * 0,28 * 1000 ____________________ V , unde: a - cantitatea (cm3) de soluie 0,02 n de NaOH, folosit la titrarea acidului sulfuric pentru proba de contro,; b - cantitatea (cm3) de soluie 0,02 n NaOH, folosit la titrarea acidului sulfuric pentru proba de lucru; K coeficientul de corecie al bazei; 0,28 cantitatea de azot n mg, care corespunde unui cm3 de soluie 0,02 n NaOH; V volumul soluiei analizate, cm3. X=
ntrebri de control: 1. Caracteristica general a proteinelor. 2. Compoziia elementar a proteinelor. 3. Clasificarea proteinelor simple i compuse. 4. Metoda de determinare a azotului total n produse lichide. 5. Regulile tehnicii de securitate ce trebuie respectate n procesul determinrii azotului total dup metoda Kjeldahl.

13

Lucrarea de laborator nr. 2 Determinarea poteniometric a derivailor formolici ai aminoacizilor Importana analizei aminoacizii snt elemente structurale ale moleculei proteice, adic monomerii proteinelor. Totodat aminoacizii liberi ndeplinesc funcii vitale n organisme. Aminoacizii i amidele lor se ntlnesc, de regul, n cantiti mici n stare liber n materia prim de origine vegetal sau animal i n produsele prelucrrii lor. Dar se gsesc i n cantiti mari. De exemplu, n mustul din struguri, n sucuri i vinuri aminoacizii constituie mai mult de jumtate din substanele azotoase. n organism i la prelucrarea materiei prime alimentare din aminoacizi se formeaz un ir de substane, care determin gustul, culoarea i mirosul produselor. Melaninele, melanoidinele, uleiurile de basamac . a. se obin din aminoacizilor Proprietile chimice ale aminoacizilor Aminoacizii snt derivai ai acizilor carbonici, n molecula crora atomul de hidrogen de lng atomul carbonic este nlocuit cu gruparea aminic (-NH2). Avnd proprieti amfotere (reacia 1), aminoacizii pot s reacioneze ca amine (reaciile 2-4) i ca acizi carbonici (reaciile 5-6): 1) R CH COOH R CH COO-

NH3 + NH2 Datorit gruprii aminice aminoacizii intr n reacia specific cu acidul azotos, pot s reacioneze cu acizii minerali, cu aldehidele i glucidele reductoare. De exemplu:

14

2) RCHCOOH + HNO2 RCHCOOH + N2 + H2O | | NH2 OH n rezultatul ultimii reacii se elimin azotul i se formeaz hidroxiacidul. Aceast reacie st la baza determinrii cantitative a aminoacizilor dup metoda Van Slyke (se ia n considerare cantitatea de azot eliminat). 3) Cu HCl se formeaz o sare complex: R CH - COOH + HCl [ RCHCOOH ] Cl | | + NH 2 NH 3 4) n urma interaciunii aminoacizilor cu aldehide (de exemplu cu glucide) se formeaz baze Schiff: RCHCOOH + O=CHR RCHCOOH + H2O | aldehida | NH2 N=CHR baza Schiff Din baze Schiff pot fi formate melanoidine (substane de culoare ntunecat). Grupa carboxilic a aminoacizilor reacioneaz cu baze (reacia 5) i alcooli (reacia 6), formnd respectiv sruri i esteri:

5) RCHCOOH + NaOH RCHCOONa + H2O | | NH2 NH2

15

6) RCHCOOH + HOC2H5 RCHCOOC2H5 + H2O | | NH2 NH2

n rezultatul ultimii reacii aminoacizii din stare solid se transform n esteri lichizi, amestecul crora se poate separa prin distilarea fracionat cu vid. Toi aminoacizii reacioneaz cu ninhidrina, formnd n mediul acid produse incolore, iar n mediul neutru sau bazic produse colorate albastru intens. n mediul acid aminoacidul este degradat pn la aldehid, iar ninhidrina se reduce pn la ceto-alcool:
CO OH +R C OH CO CH COOH

H+

CO

H OH

C
CO

__ + R CHO+ NH 3 + CO 2

NH2 OH CH COOH

CO 2

OH +R C OH CO

CO C =N CH CO
__

CO + CO

NH2

__ + R CHO+ 3H2O + CO 2

Reacia cu ninhidrin are o mare importan pentru recunoaterea i dozarea aminoacizilor. aminoacizii prin nclzire lent pierd dou molecule de ap i se transform n substan ciclic dicetopiperazin. De exemplu, din dou molecule de glicocol se formeaz 2,5 dicetopiperazina:

16

NH2 CH2 COOH +

COOH CH2 NH2 -2 H2O

H2C O=C

NH C=O NH CH2

Prin nclzirea rapid a unui amestec de aminoacizi se elimin n molecule de ap din gruparea carboxilic a unui aminoacid i gruparea aminic a altui aminoacid i se formeaz peptide (sau polipeptide):
H2N CH R COOH + HNH CH R1 H2N CH R CO NH CH R1 COOH COOH
-H
2

dipeptid Legtura ce se formeaz ntre doi aminoacizi (sau n molecule de aminoacizi) se numete legtur peptidic (-CO-NH-). Aminoacizii, care se conin n materia prim alimentar, pot fi supui proceselor biochimice de dezaminare oxidativ i n continuare decarboxilrii i hidrolizei. Aceste reacii au loc la diferite operaii tehnologice n prezena oxigenului, peroxizilor, chinonelor i altor oxidani. n rezultat se formeaz aldehide, care dau deseori produselor finale o arom specific. Dezaminrea aminoacizilor are loc n mai multe etape cu formare de iminoacid (prin dehidrogenare), care apoi prin hidroliz trece ntr-un cetoacid i amoniac. Iar cetoacidul prin decarboxilare trece n aldehid. Respectiv, prin decarboxilarea iminoacidului rezult o aldimin, care prin hidroliz se transform n aldehid i amoniac:

17

CH NH2

COOH

- 2 H+

C NH

COOH

iminoacid

C O

COOH

- CO2

NH

H2

-C

CHO

+ H2O - NH3

CH

NH

aldehida

Principiul metodei Aminoacizii uor reacioneaz cu un exces formaldehid formnd baze Schiff (sau derivai formolici):
R CH COOH R CH N=CH 2 COOH

de

NH 2 + O = CH2

+ H2 O

Prin aceasta aminogrupele i pierd proprietile bazice, iar grupele carboxilice libere se titreaz cu baz (NaOH), formnd sruri:
R CH COOH

NaOH

CH

COONa

H2 O

N = C H2

N = C H2

Se consider convenional, c numrul grupelor carboxilice titrate snt echivalente cu numrul grupelor aminice legate de formaldehid (ceea ce e corect pentru aminoacizii monocarboxilici). Pentru a introduce corecia la aminoacizii dicarboxilici (acidul glutamic, asparagic i alii), soluia se neutralizeaz n prealabil cu baz pn la pH = 6,8. 18

Totodat se titreaz i acizii organici (tartric, acetic, malic, citric etc.), care se conin n vinuri i sucuri.
Aparate, vase i materiale:

poteniometru, pH-673 M sau pH-150 MA; agitator magnetic ; pahar de 100 cm3; biuret de 25 cm3; cilindru de 25 cm3; pipet Mor de 10 cm3; soluie 0,1n NaOH; amestec formolic (20 cm3 formalin 40 % + 1 cm3 fenolftalein, se titreaz cu soluie 0,2 n NaOH pn la pH = 6,8); probe de materie prim (vin, suc).
Ordinea ndeplinirii lucrrii Pentru titrare se folosete poteniometrul cu doi electrozi de sticl i calomel. nainte de a ncepe lucrarea pHmetrul se nclzete 30 minute. Electrozii se spal bine cu ap distilat i se usuc cu hrtie de filtru. Biureta se umple cu soluie 0,1n de NaOH. n pahar se dozeaz 10 cm3 soluie pentru analiz (vin sau suc) i se adaug ap distilat 10 cm3. Se introduc electrozii i se titreaz pn la pH 6,8. Titrarea se efectueaz n felul urmtor: 1. Se determin pH-ul soluiei analizate. 2. Se cupleaz agitatorul magnetic. 3. Proba analizat se titreaz cu soluie 0,1n de NaOH cu viteza de 5-7 picturi pe secund concomitent urmrind indicaia de pe ecranul pHmetrului. 4. Cnd indicaia pH-metrului ajunge la 6,8 titrarea se stopeaz. n acelai pahar se adaug 10 cm3 de amestec formolic cu ajutorul cilindrului gradat.

19

5. Biureta se aduce la zero cu baz (volumul de NaOH care s-a consumat la titrarea soluiei analizate pn la pH ul 6,8 nu se ia n calcul). 6. Coninutul paharului se titreaz cu baz pn la pH 9,1 Titrarea se repet de 3-4 ori. Diferena volumelor la titrare nu trebuie s depeasc 0,1 cm3. Pentru determinarea cantitii de azot aminic se ia n considerare numai volumul (n cm3) de baz, care s-a consumat la titrarea soluiei de lucru dup ce a fost adugat amestecul formolic. 1 cm3 de soluie 0,1n NaOH corespunde la 1,4 mg de azot aminic. Se calculeaz coninutul de azot aminic n mg/dm3 de soluie analizat dup formul: V 1,4 K 1000 , N= Vp unde Vvolumul NaOH n cm3; Kcoeficientul de corecie al bazei; Vpvolumul probei n cm3 ;
ntrebri de control

1. Descriei nsemntatea analizei i principiul metodei. 2. Scriei i explicai reaciile caracteristice gruparii aminice. 3. Scriei i explicai nsemntatea reaciilor, caracteristice pentru gruparea carboxilic. 4. Prezentai reaciile aminoacizilor cu ninhidrina. 5. Explicai prin reacii modul de formare a legturii peptidice intre aminoacizi n diferite condiii termice. 6. Prezentai schema formrii aldehidelor din aminoacizi.

20

Lucrarea de laborator nr. 3.

Determinarea amoniacului dup metoda Conwei i Bairn Importana analizei n toate plantele, n materia prim i produsele alimentare se conin n cantiti mari diferite substane azotoase. La ele se refer proteinele, polipeptidele, aminoacizii, amidele, vitaminele grupei B, ureea i amoniacul. Pentru biosinteza compuilor cu azot plantele i microorganismele pot folosi azotul anorganic. Omul i animalele n cazul proceselor similare folosesc numai azot organic. Azotul necesar plantelor se gsete n natur sub form nitric sau amoniacal. Azotul nitric (NO3-) din sol este direct asimilabil de ctre plante. n celulele plantelor azotul nitric este redus la azotul nitros (NO2-) i apoi la azot amoniacal (NH3 sau NH4+). Azotul nitric din sol provine fie din ngrmintele chimice administrate n sol, sau se formeaz prin oxidarea amoniacului de ctre microorganisme specifice (nitrificatoare). Azotul amoniacal este asimilat direct de ctre plante. n organismul vegetal azotul amoniacal particip direct sau indirect sub form de compui (sruri de amoniu ale acizilor organici, amidele acizilor asparagic i glutamic) la biosinteza aminoacizilor. Azotul amoniacal din sol provine din ngrminte chimice sau din resturile substanelor organice n curs de degradare. Procesul se numete amonificare. Azotul organic provenit din substanele organice aflate n sol nu este direct asimilabil. Sub aciunea bacteriilor de putrefacie, azotul organic este transformat n procesul de amonificare n azot amoniacal asimilabil. Azotul atmosferic nu este asimilabil pentru plante direct, dar prin intermediul bacteriilor fixatoare de azot, care triesc n nodozitile de pe rdcinile leguminoaselor. Transformarea azotului atmosferic n azot amoniacal este un proces de reducere enzimatic.

21

Amoniacul n organismul vegetal se formeaz ca rezultat al proceselor de dezaminare suferite de aminoacizi i de ali compui cu azot i servete n primul rnd la biosinteza de noi aminoacizi i compui cu azot. Excesul de amoniac, fiind toxic pentru celule este fixat de plant sub form de sruri de amoniu ale acizilor organici, amide ale aminoacizilor dicarboxilici i ca uree. Toi aceti compui constituie rezervele de azot ale plantei. Plantele bogate n acizi organici liberi, numite plante acide (mcri, revent, begonia etc.) au capacitatea deosebit de a fixa amoniacul sub form de sruri de amoniu (oxalat de amoniu, malat de amoniu, citrat de amoniu, fumarat de amoniu etc.). Cea mai important cale de detoxicare a amoniacului n celulele plantelor este fixarea sub form de amide, ndeosebi ale acizilor aspartic (asparagina) i glutamic (glutamina). Asparagina i glutamina au fost identificate nu numai n plantele superioare, ci i n ciuperci, drojdii, bacterii, precum i n organismele animale. Formarea asparaginei i glutaminei este un proces care decurge cu consum de ATP:
ATP ADP

HOOC - CH - CH2- CH2- COOH

NH2

HOOC - CH - (CH2) - CO - O - P + 2
NH2

acid glutamic

acid fosfoglutamic (forma activa)

+ NH3

HOOC - CH - CH2- CH2- CO - NH2 + H3PO4

NH2

glutamina

Amoniacul fixat sub form de amide (asparagin i glutamin) nu este toxic, poate fi eliberat prin hidroliza enzimatic pentru a fi utilizat n biosinteza compuilor cu azot sau n meninerea echilibrului acido-bazic din plant:
HOOC - CH - CH2- CH2- CO - NH2
NH2 + H2O

glutamina

- NH3

HOOC - CH - CH2- CH2- COOH

NH2

acid glutamic

22

Fixarea (dezintoxicarea) amoniacului sub form de uree este un proces ntlnit n regnul animal i uneori n cel vegetal, numit ciclul ureogenetic sau ornitinic. Dup cum susin savanii V.I. Nilov i I. M. Scurihin cantitile mari de amoniac duc la scderea calitii i anume gustului vinului, sucului, compotului. De aceie determinarea amoniacului are o nsemntate teoretic i practic.
Principiul metodei Cnd la soluia analizat, care conine sruri de amoniu, se adaug baz, se elimin amoniac, care cantitativ se reine cu soluie de 0,02 n H2SO4 luat n exces. Titrnd cu hidroxid de sodiu excesul de acid, care n-a reacionat cu amoniacul, se poate calcula cantitatea de acid necesar pentru a neutraliza amoniacul. Bazele puternice, odat cu descompunerea srurilor de amoniu, parial hidrolizeaz i amidele, care se conin n obiectele analizate: R CO NH2 + KOH R COOK + NH3 Amoniacul format n acest caz poate falsifica rezultatele analizei. De aceea pentru a evita hidroliza amidelor, n loc de baz la soluia analizat se dozeaz soluie saturat de K2CO3, care n procesul hidrolizei formeaz un mediu bazic relativ slab. Chimismul procesului:

K2CO3 + H2O = KHCO3 + KOH NH4Cl + KOH = KCl + NH3 + H2O 2 NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4 H2SO4 exces+ NaOH = Na2SO4 + H2O

23

Aparate, vase i materiale:

4 ceti Conwei; 2 pipete Mor de 5 cm3 i o pipet gradat de 5 cm3; 4 baloane conice de 100 cm3; soluie saturat de carbonat de potasiu (K2CO3); soluie de 0,02 n H2SO4; soluie de 0,02n NaOH; indicator mixt (metilrot-metilen albastru): 0,2 g metilrot i 0,012 g metilen albastru se dizolv n 60 cm3 alcool i cu ap se aduce pn la 100 cm3.
Ordinea ndeplinirii lucrrii

Se dozeaz 5 cm3 soluie 0,02n H2SO4 n camera intern (1) a cetii Conwei (fig.1). n camera extern (2) se dozeaz 5 cm3 soluie analizat (vin, suc etc.). Ceaca Conwei se nchide aproape la 9/10 cu o plac de sticl lefuit. Prin gaura deschis cu ajutorul pipetei gradate se dozeaz n camera extern 3 cm3 soluie saturat de K2CO3. Ceaca se nchide cu placa i prin cltinri atente, uoare se amestec soluia analizat cu K2CO3. Se pune n termostat i se ine 1 or la temperatura 50-55 oC.

Fig.1.Ceaca Conwei Dup ce se scoate din termostat, ceaca Conwei se deschide i soluia din camera intern se transfer cantitativ n balonul conic de 100 cm3 cu ap distilat ( 10 cm3). Soluia se titreaz cu soluie de 0,02n NaOH n prezena indicatorului mixt pn la schimbarea culorii din violet n verde. 24

Experiena se repet n 2 ceti Conwei. Paralel se face proba de control, unde n loc de soluie analizat se folosete ap distilat. Cantitatea de azot amoniacal (mg/dm3) n soluia analizat se calculeaz dup formula:

X=

(Vcontrol - V lucru) * K * 0.28 * 1000

unde: V control volumul soluiei de 0,02n NaOH, folosit la titrarea probei de control, cm3; V lucru - volumul soluiei de 0,02n NaOH, folosit la titrarea probei de lucru, cm3; K coeficientul de corecie al bazei; 0,28 cantitatea de azot n mg, care corespunde unui cm3 de soluie 0,02n NaOH; V volumul probei analizate, cm3.
ntrebri de control: 1. Numii substanele azotoase din organisme vii. 2. Ce forme de azot pot utiliza plantele i animalele ? 3. Descriei transformrile azotului nitric n plante. 4. Cum se numete procesul oxidrii amoniacului pna la nitrai ? 5. Dai definiia amonificrii. 6. Descriei asimilarea azotului atmosferic ? 7. Prin ce procese se produce amoniacul n organism ? 8. Cum se fixeaz excesul de amoniac n plante ? 9. Scriei reaciile formrii i descompunerii amidelor n plante. 10. Descriei principiul metodei determinrii amoniacului. 11. Regulile tehnicii de securitate la determinarea amoniacului.

25

Lucrarea de laborator nr. 4

Determinarea proteinelor n vin dup metoda Lowry

Unele din caracteristicile importante ale proteinelor snt: capacitatea de a precipita din soluii i capacitatea de adsorbie. Din soluii proteinele pot precipita reversibil sau ireversibil. Precipitaia reversibil are loc cnd se adaug urmtoarele reactive: soluii concentrate de sruri neutri ale metalelor alcaline (sulfat de amoniu, sulfat de natriu, clorur de natriu, etc.); soluii apoase concentrate de alcool: metilic, etilic, propilic; soluii concentrate apoase de aceton. n urma dozrii acestor substane, care concureaz cu proteinele pentru ap, nveliul apos din jurul moleculelor de protein ncepe s se descompun i moleculele sub influena forelor de coeziune molecular formeaz agregate mari; soluia se tulbur i apare un precipitat floculos, care se aeaz pe fundul vasului. Precipitatul format la fundul vasului dispare cnd soluia este diluat cu ap. Alcoolul i acetona n soliii diluate formeaz precipitate proteice reversibile, iar dac au o concentraie mare formeaz precipitate ireversibile. Srurile alcaline se comport diferit fa de proteine. n soluii diluate mresc solubilitatea proteinelor, iar n soliii concentrate determin precipitarea lor reversibil. Cauza precipitrii proteinelor este hidratarea ionilor cu ap extras din macromolecula proteic. Neavnd ap suficient proteinele precipit, floculeaz, sau se coaguleaz. Prin precipitarea ireversibil proteinele sufer modificri fizico-chimice adnci i se produce denaturarea structurii lor moleculare.

26

Precipitaia ireversibil are loc, cnd proteinele formeaz precipitate insolubile, care nu se dizolv la nlturarea factorului precipitant. Denaturarea este modificarea structurii spaiale a moleculei proteice ce duce la micorarea solubilitii, pierderea activitii biologice. Denaturarea poate fi reversibil i ireversibil. Denaturarea proteinelor are loc sub aciunea unor ageni denaturani care pot fi de natur fizic sau chimic. Factorii fizici snt: nclzirea, creterea presiunii, congelarea, radiaiile ionizante, ultrasunetele etc. Agenii chimici: ureea, srurile metalelor grele (mercur, argint, cupru, plumb, bismut, stibiu), solvenii organici, acidul tricloracetic, compuii coloidali (acid wolframic, tanin), pH mai mic de 4 i mai mare de 10, detergeni. Denaturarea este foarte important n panificaie, prepararea prafului de ou, lapte, conservare. Proteoliza proteinelor denaturate este mai rapid, deci i asimilarea lor este mai rapid. Alt proprietate caracteristic a proteinelor este capacitatea de adsorbie pe argila de bentonit sau silicagel, rini sintetice, gelatin, crbune. Fenomenul de adsorbie (reinere la suprafa) are loc la suprafaa de contact dintre faza dispers i mediul dispergent i const n fixarea substanelor (proteinelor) ce se gsesc n soluie de ctre partuculele coloidale. Adsorbia are un rol important n vinificaie i conservare. Se aplic acest proces la limpezirea mustului nainte de fermentaie, sucurilor i vinurilor. Principiul metodei Metoda Lowry este una din cele mai sensibile metode de determinare a proteinelor. Este bazat pe dou reacii concomitente - biuretic i Folin. Ultima este caracteristic pentru aminoacizii triptofan, tirozina, cisteina, care reduc Reactivul Folin (amestec de i acizi dodecawolframofosforic H3PW12O40 dodecamolibdofosforic H3PMo12O40) pn la oxizi (W8O23, Mo8O23) de culoare albastr. Din cauza formrii complecilor moleculelor proteice cu cupru coloraia cu reactivul Folin devine mult mai intens dect numai datorit aminoacizilor sus-numite. 27

Deoarece n reacie intr i ali aminoacizi, intensitatea culorii este direct proporional cu cantitatea de proteine n soluia analizat i se determin cu ajutorul fotoelectrocolorimetrului la lungimea de und 650 nm.
Aparate, vase i materiale: centrifuga de laborator; fotoelectrocolorimetru KFK-2; acid tricloracetic de 80 %; reactivul "A" conine 20 g de NaOH, 100g de Na2CO3, 2g de sare Seignette, 0.5 g de CuSO4 x 5 H2O. Fiecare component se dizolv aparte n ap distilat, se amestec n balon cu cot de 1 dm3, volumul soluiei se aduce la cot; reactivul "B"reactivul Folin diluat (la 0,5 cm3 de reactiv Folin 1 n se adaug 4 cm3 ap distilat); soluie 1 n de NaOH; reactivul Folin100 g wolframat de sodiu i 25 g molibdat de sodiu se dizolv n 700 cm3 ap, se adaug 50 cm3 acid ortofosforic 85 % i 100 cm3 acid clorhidric concentrat, se dizolv i se fierbe cu rcitor invers timp de 10 ore, apoi se adaug 150 grame sulfat de litiu, 50 cm3 ap distilat i 3-5 picturi de brom i iari soluia se fierbe 15 minute fr rcitor sub nia de ventilare pentru a nltura excesul de brom. Apoi soluia se rcete pna la temperatura de camer i se aduce cu ap la volumul de 1 dm3, se filtreaz i se pstreaz ntr-un balon ntunecat cu dop rodat. nainte de a ncepe lucrarea soluia se dilueaz n aa fel, ca s corespund acidului 1 n. Concentraia soluiei se controleaz prin titrarea reactivului Folin diluat de 10 ori cu soluie 0,1 n hidroxid de sodiu dup fenolftalein; patru eprubete i cilindru de 5-10 cm3; pipete de 1-2 cm3 i de 5 cm3; baie de ap; termometru.

28

Ordinea ndeplinirii lucrrii ntr-o eprubet cu 10 cm3 de vin se dozeaz 1 cm3 acid tricloracetic. Soluia se pune n frigorifer pe douzeci i patru ore. Apoi soluia se centrifugheaz 1 or la 5000 ture/minut i se decanteaz. n eprubet cu precipitat se dozeaz 1 cm3 soluie 1n NaOH i dup 30 minute se adaug 1 cm3 H2O. Din proba obinut, n alt eprubet, se ia 1 cm3 soluie i se dozeaz 1 cm3 reactiv "A" i dup 10 minute se adaug 4 cm3 reactiv "B". Paralel cu proba de analiz se pregtete proba de comparaie, constituit din: 1 cm3 H2O + 1 cm3 NaOH + 2 cm3 reactivul"A" + 8 cm3 reactivul "B". Eprubetele cu probele de analiz i comparaie se plaseaz n baia de ap la temperatura 55 oC pe 5 minute i dup rcire rapid se msoar intensitatea culorii. Probele se colorimetreaz folosind filtru de lumin 8 (rou) cu lungimea de und =650 nm, cuva cu lungimea 10 mm. Coninutul proteinelor se calculeaz dup formula: X = Do x 2 x 250 =Do x 50 V unde: X cantitatea de proteine n soluia analizat, mg/dm3; Do densitatea optic a soluiei analizate; 2 volumul bazei i soluiei analizate, n cm3; 250 coeficient de recalculare; V volumul vinului luat pentru analiz, n cm3. ntrebri de control

1. Caracteristica general a proteinelor. 2. Compoziia elementar i clasificarea proteinelor. 3. Proprietile caracteristice ale proteinelor. 4. Metodica determinrii proteinelor dup Louri. 5. Regulile tehnicii de securitate n procesul ndeplinirii lucrrii. 29

Lucrarea de laborator nr. 5

Reaciile de culoare a proteinelor

S-a stabilit c proteinele datorit aminoacizilor formeaz circa 30 reacii de culoare caracteristice. Cele mai importante snt: biuretic, xantoproteic, Millon, Louri, Adamkiewics, sulfhidrilic etc. Snt i reacii incolore care se realizeaz prin hidroliza proteinelor cu acizi, baze sau enzime. Prin hidroliza proteinelor rezult produi mai simpli i n ultima faz aminoacizi. Hidroliza acid este mai frecvent utilizat. n acest caz soluia proteic se fierbe n fiole ermetic nchise 10-12 ore cu soluie 10 % de acid clorhidric sau soluie 20 % de H2SO4. Proteinele se descompun pn la aminoacizi, dar dispare complet triptofanul. Hidroliza alcalin se realizeaz cu hidroxizi alcalini timp de 10-12 ore cu soluie 10 % de NaOH sau Ba(OH)2. Metoda are avantajul c nu se distruge triptofanul, ns se descompun ali trei aminoacizi: arginina, citrulina, histidina. Din punct de vedere biologic mai importante snt procesele de hidroliz enzimatic. Hidroliza enzimatic se realizeaz prin intermediul enzimelor la temperatura 20-40 oC i la pH ul aproape de neutru. n acest caz nu se distruge nici un aminoacid. Hidroliza enzimatic are loc n tubul digestiv al organismului animal, uman, n celula vegetal a fructelor, legumelor, n struguri i vinuri. De exemplu, la prelucrarea strugurilor hidroliza enzimatic are lor dup schema: Proteine albumoze peptone polipeptide oligopeptideaminoacizi.
Aparate, vase i materiale: lapte degresat sau soluie 0,5 g cazein n 100 cm3 baz de

1 %; 30

soluie de albu de ou, (albuul unui ou se separ de glbenu, se amestec cu 0,5 dm3 ap distilat i se agit minuios); soluie 1 % de gelatin; soluie 1 % de CuSO4; soluie 10 % de NaOH; soluie 30 % de NaOH sau 20 % de NH4OH; acid azotic concentrat de HNO3; acid acetic glacial de CH3 COOH; acid sulfuric concentrat de H2SO4; reactivul Millon: la 40 g mercur se dozeaz sub nia de ventilaie 50 cm3 acid azotic concentrat (=1,42), se las pe 30 minute la temperatura de camer, apoi se nclzete n baia de ap pn mercurul se dizolv complet. Soluia obinut se dilueaz cu dou volume de ap (aproximativ pn la 160 180 cm3 ), dup depunere se decanteaz de sediment; 5 % soluie de Pb(CH3COO)2.

Reacia biuretic. Aceast reacie este caracteristic pentru toate proteinele, polipeptidele care conin grupa peptidic ( CO NH ). Dar reacia biuretic se poate obine i cu o serie de compui, care nu au nimic comun cu proteinele, de exemplu, cu biuretul NH2-CO-NH-CO-NH2, sau oxamida NH2-CO-CO-NH2, etc. n urma tratrii soluiei de proteine cu soluie de baz alcalin (NaOH) i ctorva picturi de soluie diluat de sulfat de cupru (CuSO4), proteinele obin o culoare violet datorit faptului c cuprul formeaz substane complexe cu grupele (-CO-NH-).
Chimismul reaciei: CuSO4 + 2 NaOH Cu (OH)2 + Na2SO4

31

R CH NH ... ... OC CH R3 NH CO CO NH

R1 CH CO NH CH R2 ...

R CH N C HO HC R3
...

R1 C N CH C-OH -2 H 2 O N CH R2

OH OH Cu HO HO N C

un sector din catena polipeptidic

R CH N ... C HO HC R3 N
...

R1 C O Cu O C N CH C-OH N CH R2

complex biuretic

Ordinea ndeplinirii lucrrii n trei eprubete se administreaz: n prima 0,5 cm3 soluie de cazein sau lapte degresat; n a doua 0,5 cm3 soluie albu de ou; n a treia - 0,5 cm3 soluie gelatin. n fiecare eprubet se dozeaz cte 0,5 cm3 soluie 10 % NaOH i cte 5 picturi soluie 1% CuSO4. Eprubetele se agit. Apare culoarea violet. Se face concluzia despre natura chimic a substanelor analizate. Reacia xantoproteic. Aminoacizii aromatici la fierbere cu HNO3 concentrat se supun nitrrii. Ca rezultat soluia capt o culoare galben care trece n oranj la adugarea bazei. Acidul azotic nitreaz nucleul benzenic al aminoacizilor ciclici: tirozin, fenilalanin, formnd nitrocompui de culoare galben. De exemplu, radicalul tirozinei din componena proteinei n prezen HNO3 se transform n nitrotirozin galben, care n mediul bazic d culoare oranj (forma chinoidic). Chimismul reaciei:

32

...

HN

CH CH2

...

...

HN

CH

...

...

HN

CH

C0 ...

CH2

CH2

+ HO

NO2

+ NH4OH O N

+ NH4+ + H2O O N O

OH

OH

Radicalul tirozinei

Radicalul nitrotirozinei chinoidic

Radicalul n forma

Ordinea ndeplinirii lucrrii n trei eprubete se administreaz: n prima 0,5 cm3 soluie de cazein sau lapte degresat; n a doua 0,5 cm3 soluie albu de ou; n a treia 0,5 cm3 soluie gelatin. n fiecare eprubet se dozeaz cte 5-6 picturi HNO3 concentrat i eprubetele se nclzesc (orientndu-le n direcie opus de la sine sau de la persoanele, care lucreaz n laborator). n urma fierberii, coninutul eprubetelor se coloreaz n galben. Dup rcire n eprubete se adaug 10 picturi soluie 30 % de NaOH (sau soluie 20 % de NH4OH), culoarea soluiilor devine oranj. Se face concluzia despre compoziia aminoacidic a proteinelor analizate Reacia Millon. Reacia este caracteristic aminoacizilor care au radicalul fenolic, de exemplu, tirozina. Reactivul Millon la cald d cu tirozina o coloraie roie. Adic, la nclzirea proteinei cu o soluie azotat mercuric i n prezena acidului azotic concentrat cu puin acid azotos se formeaz un precipitat rou crmiziu, datorit formrii nitrocompuilor tirozinei n forma chinoidic. Ordinea ndeplinirii lucrrii n trei eprubete se administreaz: n prima 0,5 cm3 soluie de cazein sau lapte degresat; n a doua 0,5 cm3 soluie albu de ou; n a treia 0,5 cm3 soluie gelatin. n fiecare eprubet se dozeaz cte 5-7 picturi reactiv Millon, eprubetele se nclzesc atent, ndreptndu-le n direcie opus. Peste un timp se observ apariia unei coloraii roietice i apariia precipitatului crmiziu.

33

Dup schimbarea culorii se face concluzie despre proteinele n care este prezent tirozina. Chimismul reaciei:
O . .._
_

HN

CH CH
2

+ 2 H O _-N O -_

+ H g 2( N O

)2

OH ... HN CH CH
2

O C ... ...
_ _

O HN CH CH O O
_ _

C
2

...

N O

= N

_ _H

g _ _H g

_ _

O_ _ N = O

N O

Reacia sulfhidrilic. La nclzirea soluiilor proteice cu baze n prezena srurilor de Pb se formeaz culoarea neagrcafenie n urma reaciei cu aminoacidul cisteina:
CH2 SH +2NaOH CH2 OH +Na2S +H2O HOOC CH NH2 HOOC CH NH2

Cu plumb sulfura de sodiu formeaz un sediment PbS.

Na2S + (CH3COO)2Pb PbS + 2 CH3COONa Intensitatea culorii depinde de cantitatea cisteinei n proteina i concentraia proteinei n soluie.
Ordinea ndeplinirii lucrrii n trei eprubete se administreaz: n prima 0,5 cm3 soluie de cazein sau lapte degresat; n a doua 0,5 cm3 soluie albu de ou; n a treia 0,5 cm3 soluie gelatin. n fiecare eprubet se dozeaz cte 5 picturi de 30 % NaOH i 1 pictur de 5 % Pb(CH3COO)2. La nclzirea ndelungat lichidul devine cafeniu i se formeaz sedimentul negru de PbS. Reacia Adamkiewics. Soluiile de triptofan sau proteine, care conin resturi de triptofan fiind tratate cu acid

34

glioxilic (n form de impuriti n acidul acetic glacial) n prezena acidului sulfuric concentrat formeaz la nivelul zonei de contact un inel violaceu.
O
...

O
... ...

O
... ...

O
... ...

HN

CH C CH2

HN

CH C CH2

HN

CH C CH2

HN

CH C ... CH2

O HN CH C HO O HN

+ H2SO4 - H2O

CH HN C HO O HN

Intensitatea culorii depinde de cantitatea de triptofan. Triptofanul n cantiti mai mici se gsete n lapte, carne, ou. n cantiti mai mari se conine n icre negre i roii de pete. Ordinea ndeplinirii lucrrii n trei eprubete se administreaz: n prima 0,5 cm3 soluie de cazein sau lapte degresat; n a doua 0,5 cm3 soluie albu de ou; n a treia 0,5 cm3 soluie gelatin. n fiecare eprubet se dozeaz cte 5 cm3 acid acetic concentrat, puin se nclzete, apoi atent (pe peretele eprubetei) se adaug 1 cm3 acid sulfuric concentrat. Se noteaz n care eprubete la nivelul zonei de contact dintre lichide apare inelul rou-violet, care se extinde treptat n ambele pri. Dup intensitatea culorii se face concluzia despre proteinele n care este prezent triptofanul.
ntrebri de control:

1. Caracteristica general a proteinelor. 2. Caracteristica reaciei biuretice. 3. Caracteristica reaciei xantoproteice. 4. Caracteristica reaciei Millon. 5. Caracteristica reaciei Adamkiewics. 6. Descrierea metodelor de hidroliz a proteinelor. 35

Lucrarea de laborator nr. 6 Determinarea formei reduse a glutationului (n levuri sau germenii cerealelor) Glutationul este o tripeptid format din trei resturi de aminoacizi: acidul glutamic, cistein, glicocolul (glicina):
HS

Glutationul este foarte rspndit n natur, se conine n aproape toate celulele vii n cantiti mici. n cantitate mare a fost gsit n germenii grului pn la 0,45 % din masa uscat, n levurile vechi, struguri. El prezint o substan solid, alb, solubil n ap i alcool. Din soluia alcoolic cristalizeaz sub form de prisme. Glutationul are 2 grupe carboxilice libere, deci are un caracter pronunat acid (pH= 2,83). Datorit gruprii sulfhidrilice (-SH) glutationul are proprieti reductoare puternice. Poate fi n dou forme: redus (G - SH) i oxidat ( G-S-S-G). Aceste forme trec uor una n alta dup urmtoarea reacie:

CH 2 NH 2 - CH - CH 2 - CH 2 - CO - NH - CH - CO - NH - CH 2 -COOH COOH

G - SH + HS - G

-2 H+ + 2 H+

G -S-S-G

Transformrile de oxidare i reducere snt reversibile i n organismele vii snt catalizate de enzime specifice, anume de glutationreductaz n prezena acidului dehidroascorbic (acceptor de hidrogen). Multe enzime proteolitice de natur vegetal, care au n centrul activ gruparea SH (enzime tiolice) snt activate de glutationul redus. Ca rezultat se hidrolizeaz proteinele de rezerv (gluten) din fin i aluatului se las, nu ine volumul. Aciunea de activare a glutationului se datoreaz faptului, c el este un reductor puternic i se oxideaz uor. 36

Forma redus de glutation se acumuleaz n cantiti mai mari la ncolirea cerealelor i n procesul de nvechire a levurilor, i deci este un factor, care diminueaz puternic calitatea acestor produse vegetale. De exemplu, la a patra zi de germinare cantitatea de glutation redus n orz crete de 2,5 ori. n panificaie pentru a preveni distrugerea glutenului, glutationul redus se oxideaz cu acidul dehidroascorbic (vitamina C oxidat). Glutationul redus protejeaz oxidarea acidului ascorbic i al adrenalinei.
Principiul metodei

Metoda se bazeaz pe oxidarea gruprii SH a glutationului redus cu iod. Pentru a primi soluii stabile de iod se folosete KIO3 i titrarea se petrece n prezen de KI n mediul acid:

KIO3 + 5 KI + 2 H3PO4

2 K3PO4 + 3 H2O + 3 I2

Iodul oxideaz glutationul redus conform ecuaiei:

Titrarea se termin cnd apare culoarea albastr a amidonului, ce indic prezena iodului i dispariia glutationului n forma redus.
Aparate, vase i materiale:

2G-SH + I2

G-S-S-G

+ 2HI

materie prim pentru analiz: levuri de panificaie sau de vin, germeni de cereale, crupe, cereale. soluie de 5 % acid meta-fosforic; soluie de 1,5 % KI (se pregtete nainte de determinare); soluie de 1 % amidon cu adaos de NaCl; soluie de 0,001 n KIO3 (potasiu iodat); mojar cu pistil; balon cotat de 50 cm3; baloane conice de 100 cm3; microbiuret sau biureta de 10 cm3; 37

pipete: 1, 5, 10 cm3; plnie de sticl; hrtie de filtru pliat. Ordinea ndeplinirii lucrrii Proba produsului analizat (2 g) se transfer n mojar i se mrunete cu pistilul cu nisip de cuar n prezena a 5 cm3 soluie de 5 % acid meta-fosforic. Apoi, masa mrunit cantitativ se transfer n balonul cotat de 50 cm3, se aduce pn la cot cu ap distilat. Dup 5 min de macerare coninutul balonului se agit 2-3 min i se filtreaz prin hrtie de filtru pliat. Pentru determinarea coninutului de glutation n balonul conic de 100 cm3 se administreaz 5 cm3 de filtrat, 1 cm3 soluie de 1,5 % KI i 5 picturi de soluie de 1% amidon dup care se titreaz din microbiuret cu soluie de 0,001 n KIO3 pn la apariia culorii albastre. Coninutul glutationului se exprim n mg-% la masa uscat a materialului analizat dup formula : A*0,307*C*100*1000 , mg -%, X= P*b*1000 unde: X cantitatea glutationului n mg-%; 0,307 coeficientul de recalculare a glutationului, care arat c 1cm3 soluia de 0,001 n KIO3 este echivalent cu 0,307 mg de glutation redus; P masa levurilor, grame; C volumul finit al suspensiei de levuri, cm3; A cantitatea de soluie de 0,001 n KIO3, care a fost folosit la titrare, cm3; b volumul filtratului luat la titrare; 100 recalcularea la 100 g de produs; 1000 recalcularea g n mg. ntrebri de control 1. Descriei structura glutationului i proprietile lui. 2. Pe ce se bazeaz principiul metodei de determinare a formei reduse a glutationului ? 38

3. Ce mportan practic are analiza glutationului redus ? 4. Ce enzime snt activate de glutationul redus, care este mecanismul acestei activri ?

39

Lucrarea de laborator nr. 7

Determinarea activitii invertazei n vinuri, sucuri Enzimele snt catalizatori biologici specifici de natur proteic, care se sintetizeaz n celulele organismelor vegetale i animale. Datorit enzimelor toate organismele vii pot realiza un numr enorm de diverse procese chimice legate de metabolismul substanelor. Enzimele se mpart n dou grupe: enzime monocomponente (proteine), care snt constituite din aminoacizi i enzime bicomponente (proteide), constituite dintr-o component proteic (apoenzim) i o molecul de natur neproteic (cofactor). Deseori cofactorul prezint derivaii vitaminelor hidrosolubile. Din enzimele monocomponente fac parte multe hidrolazele, iar din enzimele bicomponente --oxidoreductazele, transferazele, liazele, izomerazele i ligazele. Cnd gruparea prostetic se leag de apoenzim prin legturi slabe, uor disociabile, atunci cofactorul se numete coenzim. n cazul cnd gruparea prostetic se leag de apoenzim prin legturi covalente, nedisociabile, atunci cofactorul se numete gruparea prostetic. Substana asupra creia acioneaz enzima se numete substrat. n cele mai multe cazuri legtura dintre substrat i enzim se face prin intermediul centrelor active(regiunea enzimei, care direct realizeaz cataliza). Uniti de msur ale activitii enzimelor. Activitatea enzimelor se determin prin: msurarea gradului de transformare a substratului, msurarea concentraiei produsului de reacie sau msurare a cineticii de reacii, urmrite ntr-un anumit interval de timp prin metode fizice sau chimice adecvate. Activitatea enzimelor se exprim cantitativ n unitile propuse de Comisia de Enzime (CE) i anume:

40

Unitatea de activitate enzimatic (U) reprezint cantitatea de enzim care catalizeaz transformarea a 1mol substrat /min., n condiii standard (t 0 = 25 0C, pH i concentraie de substrat optime). Aceast unitate de msur este recomandat de CE din 1961 i folosit pn n prezent. Dar CE recomand trecerea la unitatea Katal. Katalul (Kat) reprezint cantitatea de enzim care catalizeaz transformarea a 1 mol substrat secund n condiii standard. n practic se folosete microkatalul (Kat = 106Kat), nanokatalul (nKat =109 Kat), picokatalul (pKat=1012 Kat). Pentru enzimele solide (praf) se folosete activitatea specific reprezint numrul de uniti enzimatice /mg protein (respectiv Kat/mg protein i Kat/kg protein), sau reprezint numrul de Katali care corespund la 1 kg de enzim. Pentru enzime n stare cristalin cu masa molecular cunoscut se folosete activitatea enzimatic molar (numr de transfer) reprezint numrul de molecule de substrat transformate de ctre o molecul de enzim timp de 1 min sau 1s (Kat/mol enzim), sau reprezint numrul de katali care revin unui mol de enzim. Metodele principale de separare i purificare a enzimelor. Enzimele se conin n stare dizolvat n plasma tuturor esuturilor vegetale, animale i a microorganismelor (bacterii, drojdii, mucegaiuri). Prelucrarea materiei prime de origine vegetal, animal sau microbian este n linii generale aceia-i: omogenizare, extracie, concentrare, fracionare i uscare. Preparatele enzimatice parial purificate pot fi n form lichid, semilichid sau uscat. Enzimele din esuturi se extrag uor cu ajutorul apei, soluiilor de sruri, acizi i baze slabe. Un dizolvant bun pentru majoritatea enzimelor l constituie soluia apoas de glicerol. Dac enzimele snt strns legate cu elementele structurale ale celulei, atunci pentru distrugerea esuturilor se folosesc: nisipul

41

de cuar sau sticl, dezintegrarea prin macerare, autoliza i n aparate speciale omogenizatoare etc. Impuritile (molecule cu masa molecular mic) din soluiile obinute se nltur prin dializ, electrodializ, precipitarea enzimelor cu alcool, aceton, sruri. Dup extracie soluiile enzimatice se purific i se concentreaz prin metodele de cromatografie i electroforez.
Rolul invertazei

n natur snt mult rspndite enzimele care catalizeaz hidroliza legturilor glicozidice din glicozide, oligoglucide i poliglucide. Aceste enzime au denumirea general de carbohidraze. Se disting enzime care hidrolizeaz numai poliglucidele (poliazele) i enzime care hidrolizeaz oligoglucidele (glicozidaze). Enzima -fructofuranozidaza se refer la carbohidraze (glicozidaze). Aceast enzim catalizeaz inversia sau hidroliza zaharozei i de aceea se numete invertaza sau zaharaz. Invertaza acioneaz asupra legturii -fructo-furanozidice din moleculele zaharozei, rafinozei etc., i desprinde de la ele restul de -D-fructofuranoz. Zaharoza este o dizaharid din cele mai rspndite dintre oligozaharide. Se gsete aproape n toate plantele, n cantiti mai mari se gsete n sucul florilor alturi de monozaharide, apoi n sfecl, n trestia de zahr i n cocenii tineri de porumb. Sub influena acizilor sau a invertazei zaharoza se hidrolizeaz formnd un amestec de monoglucide (D-glucoza i Dfructoza):

42

CH2OH H OH H OH H

O H

CH2OH H O OH

O OH

H CH2OH H

OH

Aciunea invertazei

Zaharoza (sustratul invertazei) are proprieti optic active, este dextrogir (rotaia specific + 66,5o). Dup hidroliz soluia rezultat devine levogir []D20 = -20o, deoarece fructoza este pronunat levogir []D20= -93o n comparaie cu glucoza care este dextrogir []D20 = +52,5o. Aceast hidroliz se numete inversie sau invertire, inversiune, iar amestecul echimolar de glucoz i fructoz are denumirea de zahr invertit (mierea de albine). Invertaza e mult rspndit n plante, n drojdii, ciuperci i bacterii, n struguri, suc i vin. mpreun cu enzima maltaza (care se conine n drojdia de bere) invertaza are o mare nsemntate pentru industria alimentar. Aceste enzime se folosesc n industria panificaiei i fermentaiei: ele catalizeaz hidroliza zaharozei i maltozei i prin aceasta pregtesc materia prim de fermentaie. Invertaza este foarte rezistent la aciunea SO2, este sensibil la etanol i activitatea ei variaz foarte mult cu temperatura. Tratarea mustului i vinului cu bentonita (fixeaz proteinele) diminueaz activitatea invertazei. La prelucrarea strugurilor numai o treime din invertaz trece n must, cea mai mare parte rmne fixat pe componentele solide ale botinei i n burb. Strugurii au potenial invertazic ridicat: 1 cm3 must nedeburbat cu pH 3,5 la temperatura 30 oC are n mediu 200 uniti. Datorit potenialului invertazic ridicat al mustului zaharoza adugat n el (aptalizarea) este complect hidrolizat n cteva ore. Drojdiile cu o activitate mic de inversie nu pot fi utilizate n industria panificaiei i fermentaiei. De aceea studierea activitii acestor enzime are o nsemntate practic. 43

Principiul metodei Activitatea invertazei se determin dup cantitatea de zahr invertit care s-a format la hidroliza unei anumite cantiti de zaharoz sub aciunea invertazei la to = 25 oC timp de 24 ore. Cantitatea de zahr invertit se determin dup metoda Bertrand. Aparate, vase i materiale:

4 baloane conice 100 cm3; 4 baloane cotate 100 i 200 cm3 ; 4 cilindre de 50 cm3; plnie ott nr.3; 2 baloane Bunzen de 500 cm3; pipete 5 i 10 cm3; soluie de zaharoz 10 %; soluie-tampon acetic cu pH = 4,7 (la 50 cm3 soluie 1N de NaOH se adaug 96,8 cm3 soluie 1 N de CH3 COOH i volumul amestecului se aduce cu ap distilat pn la cota 500 cm3). n soluia tampon acetic se adaug 1-2 cm3 toluol pentru reducerea creterii microorganismelor n probele de materie prim (vin, suc); reactivul Fehling I: se dizolv 40 g CuSO4 x 5 H2O ntr-un dm3ap de distilat; reactivul Fehling II: se dizolv ntr-un dm3 ap de distilat 200g sare de Seignette (tatrat dublu de sodiu i potasiu) i 150 g de NaOH; soluie feric amoniacal (86g sulfat feric amoniacal se dizolv n 500 cm3 ap, la soluie se adaug 108 cm3 acid sulfuric concentrat cu densitatea 1,84 i volumul amestecului se aduce cu ap distilat pn la un dm3). nainte de ntrebuinare soluia feric amoniacal se oxideaz cu cteva picturi de 0,1N KMnO4 pn la culoarea slab roz; soluie 0,05N KMnO4, care se pstreaz n sticle brune la ntuneric; probe de materie prim (vin, suc). 44

Ordinea ndeplinirii lucrrii Pregtirea probelor pentru inversia zaharozei Probe de 10 cm3 vin sau suc se dozeaz n dou baloane conice de 100 cm3. Coninutul primului balon (proba de control) se fierbe timp de 3 minute pentru inactivarea enzimei. Apoi n ambele baloane se dozeaz cte 5 cm3 soluie 10 % zaharoz, 10 cm3 soluie-tampon acetic cu toluol. Baloanele se nchid strns cu dopuri i se las pentru 24 ore la temperatura 25 oC n termostat. Dup expirarea termenului proba de lucru (cu excepia probei de control) se fierbe 3 minute pentru inactivarea enzimei. Diluarea probelor Coninutul ambelor baloane se transfer cantitativ n dou baloane cu cot de 200 cm3 i se aduc cu ap distilat pn la cot, se amestec minuios. Din fiecare balon se iau cu pipeta probe de 10 cm3, care se transfer n baloane conice de 100 cm3 i se determin n ele zahrul rezidual dup metoda Bertrand. Pentru aceasta la fiecare prob se adaug cu cilindru cte 10 3 cm soluie Fehling I i II. Probele se nclzesc i se fierb 3 minute. La nclzirea soluie Fehling I i II cu zahrul invertit (zaharuri reductoare) se depune Cu2O (protoxid de cupru) rou crmiziu i au loc urmtoarele reacii: CuSO4 + 2 NaOH Cu(OH)2 + Na2SO4
COOK CHOH CHOH COONa + COOK

Cu (OH)2

CHO CHO COONa

Cu +

2 H2O

complex cuprotartric

45

CH= O HCOH HOCH HCOH HCOH CH2OH COOK

COOH HCOH COOK HCOH

+ 2

CHO CHO COONa

Cu + 2 H2O

HOCH + Cu2O HCOH HCOH CH2OH

+2

HCOH

COONa

Deoarece reactivul Fehling II este un reactiv alcalin, n prezena lui fructoza se poate transforma ntr-o aldoz (glucoz sau manoz), care reacioneaz cu soluia Fehling:
H CH 2 OH C=O HOCH HCOH HCOH CH 2 OH C OH C OH HOCH HCOH HCOH CH 2 OH CH= O CH(OH) HOCH HCOH HCOH CH 2 OH

Fructoza Forma enolic Aldoza Pentru determinarea cantitii Cu2O trebuie de ndeplinit urmtoarele procese. Coninutul primei probe (de control) dup rcire pn la 50 o 60 C se transfer n plnia ott, (care are un strat de 0,5 cm de asbest celuloz), unit cu balonul Bunzen. Balonul Bunzen se unete cu pompa de ap. Soluia se filtreaz prin plnia ott i se spal de 5-6 ori cu ap fierbinte distilat pn cnd soluia devine incolor. Precipitatul de Cu2O din plnia ott i din balonul conic (unde a fost proba) tot timpul trebuie s fie meninut sub un strat de ap pentru a nu permite oxidarea Cu2O n contact cu aerul. 46

Imediat dup ultima splare n vasul conic (unde a fost proba) se adaug 10 cm3 soluie feric amoniacal (cu cilindrul) pentru dizolvarea sedimentului de Cu2O i se agit pn cnd dispare precipitatul rou crmiziu de pe pereii balonului conic. ntre timp plnia ott se monteaz pe un alt balon Bunzen curat, iar pompa de ap se deconecteaz. Soluia feric - amoniacal din balonul conic se toarn peste precipitatul din plnia ott i se amestec cu o baghet de sticl pn la dizolvarea complet a precipitatului de Cu2O. Apoi balonul Bunzen se unete cu pompa de ap i amestecul obinut se filtreaz. Balonul conic (unde a fost soluia feric - amoniacal) se spal de 5-6 ori cu ap distilat fierbinte i se filtreaz prin plnia ott pn cnd picturile de filtrat din balonul Bunzen au reacie neutr (dispare reacia acid a soluiei, pH se determin prin intermediul indicatorului universal de hrtie). Are loc reacia de dizolvare a sedimentului de Cu2O n soluia de sulfat feric Fe2(SO)3: Cu2O + Fe2(SO4)3 +H2SO42CuSO4 + 2 FeSO4 + H2O Sulfatul feros format (FeSO4) se titreaz cu KMnO4 : 10 FeSO4 + 2 KMnO4 + 8 H2SO4 5 Fe2(SO4)3 + +2 MnSO4 + K2SO4 + 8 H2O. Filtratul limpede cu nuane verzui se titreaz cu soluie 0,05 n de KMnO4 direct n balonul Bunzen pn cnd soluia se coloreaz n roz i la o pictur n exces de KMnO4 coloraia persist un minut. Volumul soluiei 0,05N KMnO4 consumat la titrarea probei se fixeaz. Analogic se trateaz i se filtreaz proba de lucru. Pentru a obine rezultate comparabile este necesar n probele diluate de vin de repetat determinarea zahrului prin metoda Bertran de 2-3 ori (n proba de lucru i control). n corespundere cu reaciile scrise mai sus 1 cm3 soluie 0,05 n permanganat de potasiu echivaleaz cu 3,18 mg cupru. Cantitatea de zahr invertit n mg se determin dup tabelul Bertrand (tab.1), care indic ce cantitate de zahr invertit corespunde la anumite cantiti de cupru. 47

Tabelul 1. Calculul coninutului de zahr invertit n mg dup

Bertrand.
Zahr 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Cu 20,6 22,6 24,6 26,5 28,50 30,50 32.5 34.5 36.4 38.4 40.4 42.3 44.2 46.1 48.0 49.8 51.7 53.6 55.5 57.4 59.3 61.1 63.0 Zahr 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 Cu 64.8 66.7 68.5 70.3 72.2 74.0 75.9 77.7 79.5 81.2 83.0 84.8 86.5 88.3 90.1 91.9 93.6 95.4 97.1 98.8 100.6 102.3 104.0 Zahr 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 Cu 105.7 107.4 109.2 110.9 112.6 114.3 115.9 117.6 119.2 120.9 122.6 124.2 125.9 127.5 129.2 130.8 132.4 134.0 135.6 137.2 138.9 140.5 142.1 Zahr 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 Cu 143.7 145.3 146.9 148.5 150.0 151.6 153.2 154.8 156.4 157.9 159.5 161.1 162.6 164.2 165.7 167.3 168.8 170.3 171.9 173.4 175.0 176.5

48

Calculul activitii enzimei invertaza Activitatea invertazei sau zaharazei (Az) se exprim n uniti de activitate enzimatic ntr-un dm3 vin sau suc. Pentru aceasta cantitatea de zahr invertit gsit dup tabelul Bertrand (Z) se recalculeaz la coninutul lui n volumul balonului cu cot (200 cm3) i se nmulete cu 0,95 (coeficientul de recalculare a zahrului invertit n zaharoz), i se determin cantitatea zaharozei (mg), care s-a supus hidrolizei. Activitatea invertazei se determin dup formula: As =

P 1000 1000 342 t v

unde: P masa de zaharoz care a fost hidrolizat [mg]; P = Plucru-Pcontrol = (Zlucru Zcontrol) x 0,95 x 20 342 masa molecular a zaharozei; t durata inversiei [min]; v volumul de vin [cm3]. 1000 - transformarea mg n micrograme ; 1000 - recalcularea la 1 dm3.
ntrebri de control:

1. Numii unitile de msur ale enzimelor. 2. Descriei structura i proprietile chimice ale zaharozei i zahrului invertit. 3. Descriei metodele de separare i purificare a enzimelor. 4. Descriei enzima invertaza. 5. Metoda determinrii invertazei.

49

Lucrarea de laborator nr. 8 Determinarea activitii enzimei polifenoloxidaza Pn n prezent au fost studiate mai mult de 3000 enzime diferite. Enzimele se clasific dup tipul reaciilor pe care le catalizeaz i dup substraturile asupra crora acioneaz. Denumirea enzimelor este alctuit din trei pri. Prima parte indic denumirea substratului asupra cruia acioneaz enzima, a doua parte indic natura reaciei catalizate i a treia parte sufixul aza. De exemplu, polifenoloxidaza, piruvatdecarboxilaza, etc. Se deosebesc numai enzimele din clasa 3 hidrolazele, care snt formate din denumirea substratului unit cu sufixul aza. De exemplu amilaza, zaharaza, ureaza. Odat cu denumirile raionale se pstreaz i denumiri mai vechi: pepsina, tripsina, papaina, etc. Dup tipul reaciei catalizate enzimele se clasific n urmtoarele 6 clase: 1. Oxidoreductazele sau enzimele, care catalizeaz reaciile de oxidoreducere (cu transfer de hidrogen sau de electroni sau prin combinarea unui substrat cu oxigenul molecular). 2. Transferazele snt enzimele, care catalizeaz reacii de transfer ale unor atomi sau grupri de atomi (-NH2, - CH3, CH2OH, - O-PO3-H2 etc.) de pe un substrat donator pe un alt substrat acceptor. 3. Hidrolazele snt enzime, care catalizeaz scindarea hidrolitic a legturilor esterice, glicozidice, peptidice, amidice etc. dup urmtorul mecanism: R1 R2 + HOH R1 OH + R2 - H 4. Liazele catalizeaz reaciile de scindare nehidrolitic a legturilor chimice. Se elimin molecule de CO2, H2O, NH3 etc. i des se formeaz legturi duble. Liazele Catalizeaz i reaciile inverse. 5. Izomerazele snt enzimele care catalizeaz diverse reacii de izomerizare sau de rearanjri intramoleculare. 50

6. Ligazele sau sintetazele snt enzime care catalizeaz reaciile de formare a legturilor chimice ntre dou molecule cu ajutorul energiei cedate de substanele macroergice (ATP, GTP, etc.) Fiecare enzim are codul de patru cifre, stabilit de Comisia de Enzimologie a Uniunii Internaionale de Biochimie (1961). Prima cifr indic clasa la care aparine enzima. ase clase de enzime se formeaz n funcie de tipul general al reaciilor catalizate. A doua cifr indic subclasa, referitor la natura chimic a gruprilor la substrat, a treia cifr reflect o subdiviziune din aceeai subclas, iar a patra enzima concret (numrul de ordine al enzimei respective n subdiviziunea din interiorul subclasei). De exemplu, enzima dehidrogenaza alcoolului (codul 1.1.1.1) este o oxidoreductaz (clasa 1), acioneaz asupra grupei CHOH a donatorului de hidrogen (subclasa 1), piridinnucleotidele (NAD+ i NADP+) servesc ca acceptor de hidrogen (subsubclasa 1) i enzima este prima (a patra cifr-1) din aceast ultim diviziune. Importana analizei Polifenoloxidaza (EC.1.10.3.2) este cunoscut i sub denumirea catecholoxidaze, o-difenoloxidaza sau, mai recent, oxigen oxidoreductaza enzima din grupa oxidazelor clasei oxidoreductazelor, care transport electronii direct la oxigen. Polifenoloxidaza este rspndit n plante, gsindu-se n cantitate mai mare n special n ciuperci, tuberculi de cartofi, frunze de ceai i de tutun, boabe de cafea i n diferite fructe: mere, piersici, caise, banane, n struguri, etc. Polifenoloxidaza (PFO) are o mas molecular de 34000, reprezint o protein, ce conine cupru (0,26 %). Ea poate cataliza oxidarea monofenolilor n difenoli (activitatea crezolic) i a o-difenolilor n o-chinone (activitatea catecholazic):

51

__

Activitatea crezolica __ R + 1/2 O

Activitatea catecolazica __ R + 1/2 O2 OH OH o-difenol O chinona O

OH monofenol

PFO oxideaz substanele tanante (taninurile). Prin aciunea ei se explic brunificarea legumelor i fructelor la uscare. PFO are un rol important la respiraia plantelor. Dup teoria lui V.I. Paladin sistema polifenol-chinon are un rol nsemnat n calitate de verig intermediar la oxidarea diferitelor substane organice n procesul respiraiei plantelor. Participarea PFO n acest proces poate fi redat prin schema urmtoare:
Compus redus o-chinona R H2O
O O

OH OH

+ 1/2 O2

Compus oxidat

o-difenol

Aadar o cantitate mic de polifenol i chinon respectiv poate de multe ori s fie supus variabil oxidrii i reducerii. Sistema PFO, polifenolilor i chinonilor respectivi, poate oxida acidul ascorbic n materia prim alimentar. Aceast situaie se ia n considerare la prelucrarea fructelor, legumelor i strugurilor, care conin acid ascorbic. Materia prim vegetal (fructe proaspete tiate, legume i struguri) n contact cu oxigenul din aer se mbruneaz din cauza 52

polimerizrii oxidative a chinonelor formate din mono- i difenoli. Pentru inactivarea PFO i prevenirea formrii chinonelor se folosete tratamentul termic (de exemplu, blanarea fructelor) sau chimic cu SO2 sau cu K2S2O5 etc. Principiul metodei Metoda determinrii polifenoloxidazei se bazeaz pe proprietatea ei de a oxida pirocatehina n orto-chinon. Ortochinona oxideaz acidul ascorbic. Anume acidul ascorbic rmas n mediu de reacie se determin cantitativ prin metoda de titrare cu 0,02 n soluie de iod.
o-chinona Acidul ascorbic
O O

H2O

Acidul dehidroascorbic

OH OH

+ 1/2 O2

pirocatehina

Prin aceast metod se determin activitatea polifenoloxidazei numai n primele 2 minute de aciune asupra substratului. Aparate, vase i materiale: patru baloane conice de 100 cm3; mojar cu pistil; plnie din sticl; balon cotat de 50 cm3; pipete Mor 5 cm3, 10 cm3; patru pipete gradate 2 i 5 cm3; 53

soluie de substrat: se dizolv 100 mg acid ascorbic n 100 cm3 ap distilat; soluie 0,02 n pirocatechin, (2,2 g n 1 dm3); soluie 10 % acid fosforic (orto sau meta) ; soluie 0,02 n soluie de iod; soluie 1 % amidon; amestec tampon (aparte se dizolv 11, 867 g de Na2HPO4 x 2 H2O ntr-un dm3 ap distilat i 9,078 g de KH2PO4 ntr-un dm3 ap distilat) Amestecnd volume egale de soluie obinem amestecul tampon cu pH-6,8) ; materie vegetal (mere, cartofi, struguri); cntar tehnic.
Ordinea ndeplinirii lucrrii

Pentru a obine extractul de enzime din materia prim vegetal de cntrit 5 g de produs cu balana tehnic (precizia de 0,01 g). De transferat proba n mojarul de porelan i de mrunit cu pistilul. Extracia enzimelor se efectueaz cu cantiti mici de ap distilat. Coninutul mojarului se transfer cantitativ ntr-o plnie cu filtru din materie instalat ntr-un balon cotat de 50 cm3. Coninutul balonului se aduce pn la cota 50 cm3 cu ap i se agit. n patru baloane conice se dozeaz cte 5 cm3 de filtrat i cte 10 cm3 de H2O. Dou baloane se nclzesc pn la fierbere i se fierb 2 minute pentru inactivarea enzimei (probele de control), apoi se rcesc. Probele (de control i lucru) se aduc la temperatura 25oC. n fiecare balon se adaug cte 5 cm3 soluie-tampon (cu pH-ul 6,8), cte 2 cm3 soluie pirocatehin, cte 5 cm3 soluie acid ascorbic i baloanele se omogenizeaz timp de 2 minute. n fiecare balon se adaug cte 1 cm3 soluie 10 % acid fosforic i se titreaz cu 0,02 n soluie de iod n prezena 1 cm3 soluie 1 % amidon. Se noteaz volumul de iod consumat la titrare. Deoarece 1 cm3 soluie de 0,02 n iod este echivalent la 1,76 mg sau 10 mol de acid ascorbic, activitatea PFO ce 54

corespunde unui gram de produs, exprimat n uniti de activitatea enzimatic se calculeaz dup formula: (Vc-Vl) x 10 x 10 APFO = = (Vc-Vl) x 10 5x2 , unde: Vc volumul soluiei 0,02 n iod, care s-a consumat la titrarea a 5 cm3 soluie de control; Vl volumul soluiei 0,02 n iod, care s-a consumat la titrarea a 5 cm3 soluie de lucru; 10 numrul de mol de acid ascorbic; 10 gradul de diluare a probei; 5 volumul filtratului, cm3 ; 2 - durata aciunii enzimei, minute.
ntrebri de control:

1. Nomenclatura i clasificarea enzimelor. 2. Caracteristica enzimei PFO. 3. Este posibil oxidarea acidului ascorbic cu PFO n lipsa polifenolilor? 4. Pe ce se bazeaz metoda determinrii activitii PFO? 5. Chimismul determinrii activitii PFO.

55

Lucrarea de laborator nr. 9

Determinarea activitii enzimei lacaza Lacaza (oxigenreductaza E.C. 1.10.3.1.) este o enzim de origine fungic secretat de mucegaiul Botrytis cinerea, care n unele condiii infecteaz struguri. Lacaza ca i polifenoloxidaza este o cuproproteid dar are un spectru de aciune mult mai larg, oxidnd orto- i para-difenolii, antociane i acidul ascorbic din must i vin. Oxidarea direct a antocianelor este cauza principal a degradrii rapide a culorii vinurilor roii (casarea oxidazic). Tratarea mustului i vinului cu bentonit i SO2 puin reduce activitatea lacazei. Determinarea lacazei n bobie, struguri i vinuri, cunoaterea caracteristicilor fizico-chimice ale acestei enzime (temperatura optim, pH-ul optim, constantele, inhibitorii, etc.) permit de a aciona asupra proceselor de vinificaie. Lacaza denatureaz n 10 minute prin nclzirea mustului, vinului la temperatura 45 oC. Temperatura de 75 oC inactiveaz lacaza complet. Metodele de determinare a lacazei

Snt utilizate dou tipuri de metode: metode colorimetrice, utiliznd substraturi sensibile, care formeaz dup oxidare compui colorai, determinai prin spectrofotometrie; metode polarografice, utiliznd electrozi specifici de oxigen pentru determinarea cantitativ a oxigenului consumat din mediu pe parcursul oxidrii unui substrat specific de ctre enzim.

56

Determinarea colorimetric a activitii lacazei

Principiul metodei

Siringaldazina (4-hidroxi-3,5-dimetoxibenzaldehid azin) este substratul specific utilizat care prezint o form redus fenolic, incolor sau pn la galben pal, care dup oxidare cu O2 formeaz o chinon, care se condenseaz formnd un compus colorat rou violet, apariia crui-a poate fi urmrit la spectrofotometru la =530 nm (coeficientul de extincie molar = 65000). Chimismul reaciei:
H3COHOH3CO - OCH3 - HC=N - N=CH -OH - OCH3 -2H+,-2e-

Forma redusa fenolica (incolora pina la galben pal)

H3COO= H3CO=HC-N=N-CH=

- OCH3 =O - OCH3 Forma oxidata chinonica (rosu-violet)

Exprimarea rezultatelor

O unitate de activitate a lacazei corespunde cantitii enzimei care catalizeaz oxidarea unui nanomol (10-9) de siringaldazina n minut n condiiile de reacie (temperatura 20 oC, pH=5, 1cm3 prob prealabil diluat pentru 3 cm3 de amestec reactiv, =530 nm; cuva = 1 cm, = 65000). 57

Not: metodele colorimetrice necesit de a lucra cu soluii destul de limpezi i incolore la start. Ele pot fi rezervate pentru lucrul n soluii pure (pentru determinarea pH-lui optim, Km i Vm) sau n cazul mustului din struguri, pentru determinri n must decolorat.

Determinarea activitii lacazei n soluii pure

Determinrile pH-ului optim i constantelor cinetice (Km i Vm) necesit utilizarea unei enzime deja purificate. Deci, studiul pH-ului optim va fi efectuat cu Lacaza din Pyricularia oryz (disponibil n comer) i nu din Botrytis cinerea. PH-ul optim: Msurrile snt efectuate la 20 o C (temperatur ambiant) ntr-o soluie apoas de lacaz pur (EC.1.10.3.2.), determinrile la =650 nm. ntr-o cuv de sticl (1 cm3) curat i uscat se introduc succesiv: 1,4 cm3 soluie-tampon citrat - fosfat 0,1 M; 0,6 cm3 soluie siringaldazin de 60 mg/l. Se agit printr-o returnare pentru omogenizare (de a evita contactul amestecului cu degetele, utiliznd parafilm pentru a nchide cuva). Cuva se instaleaz n spectrofotometru, capacul se las n jos i se regleaz la indicaia 0 (zero). Se programeaz 15 minute la cronometru. Din soluia analizat de lacaz se ia cu exactitate 1 cm3. Foarte rapid acest volum se introduce n cuva de msurat, (fr a o scoate din spectrofotometru), n acelai moment se deschide cronometrul (timpul zero). Amestecul reacionat se agit prin returnare (scotnd cuva din spectrofotometru i utiliznd parafilm pentru a nchide cuva) i apoi cuva se reinstaleaz rapid n aparat. Capacul se las jos. 58

Not: valoarea extinciei trebuie s fie deja diferit de indicaia zero iniial. De notat pentru fiecare prob variaia extinciei n fiecare minut, timp de 8 minute (dup ce aparatul a fost reglat la "zero" n timpul zero) Determinrile se efectueaz cu fiecare din soluiile tampon propuse: tampon citrat fosfat 0,1 M, pH-3; 4; 5; 6 i 7. Rezultate 1.Cinetica Trasa-i pe aceiai foaie de hrtie milimetric curbele reprezentative a cineticii de oxidare a siringaldazinei: Extincia = = f (timpul) pentru diferite valori a pH-lui n soluiile tampon analizate. (Se va lua ca unitate pentru axa absciselor 25 cm = 10 minute). 2. Vitezele iniiale Determinai pantele curbelor, exprimate n extincie/minut. Aceste pante corespund vitezelor iniiale de oxidare enzimatic. Trasa-i curba Extincie /minut = f (pH). Analizai aceast curb. La ce concluzii ai ajuns? Not: toate rezultatele experimentate i calculele trebuie s fie prezentate n form de tabel.

Determinare activitii lacazei n must i struguri

Alte tipuri de polifenoloxidaze se gsesc n struguri sntoi (n particular tirozinaza), aceast determinare implic utilizarea unui substrat specific de Lacaz. n cazul determinrii colorimetrice: De asemenea este obligatoriu de a elimina n prealabil (fr a denatura enzima) compuii fenolici din mediu (taninuri, antociani) din cauza rolului de inhibitor la oxidarea siringaldazinei. 59

Aceast eliminare se va face prin tratarea mustului cu o rin absorbant : polivinilpolipirolidon (PVPP).
Ordinea ndeplinirii lucrrii a) Eliminarea compuilor fenolici: ntr-un balon conic Erlenmeyer de 50 cm3 care conine 0,8 g PVPP, se dozeaz 10 cm3 suc (limpezit la necesitate) sau must, se agit energic (aproximativ 1 minut) i se las n contact 10 minute, se filtreaz cu vid (filtrul Millipore), recupernd filtratul (care trebuie s fie decolorat) ntr-un tub prevzut pentru acest scop. Aadar, se obine prima prob de suc decolorat, care va fi diluat, la necesitate, pentru determinarea activitii. b) Determinarea activitii Lacazei: Msurrile se vor efectua la spectrofotometru Spectronic 20, temperatura 20 oC i =530 nm. ntr-o cuv de 1 cm, curat i uscat, se dozeaz: 2,8 cm3 soluie-tampon acetat pH=5,0; 1,2 cm3 soluie de substrat (siringaldazin de 60 mg/l). Soluia se agit prin returnare pentru omogenizare (fr a pune degetele n contact cu amestecul, utiliznd o bucic de pelicul mic de pelicul de film pentru a nchide cuva). Cuva se instaleaz n spectrofotometru, se las n jos capacul i se regleaz la indicaia 0. Se programeaz 15 minute la cronometru. Din proba analizat (suc decolorat, prealabil diluat) se ia cu exactitate 2 cm3. Acest volum se dozeaz foarte rapid n cuva (fr a scoate cuva din spectrofotometru),n acelai moment se deschide cronometrul(timpul zero).Amestecul reactiv se agit rin returnare (scond cuva din spectrofotometru i utiliznd parafilm pentru a nchide cuva) i apoi cuva se reinstaleaz rapid n aparat. Capacul se las jos.

60

Not: valoarea extinciei trebuie s fie deja mai mare de 0, care este valoarea iniial. Se noteaz valoarea extinciei n timp (8 minute). c) Rezultate: 1. Cinetica Trage-i Pe aceia-i foaie de hrtie milimetric curbele reprezentative a cineticii oxidrii siringaldazinei: Extincia = f (timpul) pentru diferite probe examinate. (De luat ca unitate pentru axa absciselor 25 cm = 10 minute). 2. Vitezele iniiale De determinat pantele curbelor, exprimate n extincie/minut. Aceste pante corespund la vitezele iniiale de oxidare enzimatic. Transforma-i aceste rezultate n uniti de activitate considernd c, n condiiile de msurri utilizate, o soluie de 1 mole de siringaldazin pe litru (1M) reprezint o extincie de 0,065 ( = 65000, l = 1 cm). (P.M. siringaldazin = 360) 3. Comparai activitile Lacazei pentru diferite probe analizate. Ce a-i putea spune despre gradul de contaminare cu Botrytis cinerea.?

Determinarea polarografic a activitii lacazei

Principiul metodei

Cu ajutorul unui electrod specific la oxigen (electrodul lui CLARC), se msoar consumul de O2 a unei probe n prezena unui reactiv, ce conine un substrat fenolic specific lacazei (cu excepia siringaldazinei, de exemplu: hidroxichinona sau altul), asociat cu un ihibitor specific tirozinazei. 61

n rezultat, dac lacaza se conine numai n boabele contaminate de Botrytis cinerea, boabele strugurilor sntoi conin n mod normal o alt fenoloxidaz: tirozinaza (EC 1.10.3.1.), capabil de a oxida un numr mare de compui monofenolici i orto-difenolici i care trebuie, deci, s fie inhibai n timpul msurrii activitii numai a lacazei. Electrodul polarografic

Cnd se aplic o diferen de potenial negativ de 0,6-0,8 V ntre un electrod inert (aur sau platin) i un electrod de referin (de calomel ori Ag/AgCl) ntr-o soluie neutr de KCl, oxigenul dizolvat este redus la suprafaa catodului. Curentul calibrat n raport cu oxigenul dizolvat este nregistrat. Acest curent este proporional presiunii pariale a oxigenului dizolvat (presiunea oxigenului). Cnd catodul, anodul i electrolitul snt separai de mediu printr-o membran plastic, permeabil pentru gaze, dar impermeabil pentru majoritatea ionilor, rezistena esenial la transferul de mas se datoreaz n special membranei, ceea ce permite msurarea presiunii oxigenului n diverse lichide. Reacia la catod: O2 + 2 H2O + 2 e H2O2 + 2 OH 62

H2O2 + 2 e 2 OH

Reacia la anod: Ag + Cl- AgCl + e Reacia sumar: 4Ag + O2 + 2 H2O + 4Cl 4AgCl + 4OH Fiindc O2 este rapid consumat la catod, se poate de considerat, c presiunea O2 (Po2) asupra membranei este nul, deci, fora responsabil de difuzie a O2 prin aceast membran este proporional cu Po2 n exteriorul membranei. Dac Po2 crete, se e difuzeaz mai mult O2 prin membran i un curent mai mare traverseaz detectorul; o presiune Po2 mai joas va corespunde la un curent mai slab. Exprimarea rezultatelor O unitate de activitate a lacazei corespunde cantitii de enzim care catalizeaz consumul a 100 g de oxigen ntr-o minut la 1 litru must, n condiiile experienei (temperatura 35 oC; pH= 5; 4 cm3 prob prealabil diluat pentru 20 cm3 amestec reactiv saturat cu oxigen).
ntrebri de control: 1. Caracteristica lacazei. 2. Explicai metoda colorimetric a activitii lacazei. 3. Explicai metoda polarografic a activitii lacazei. 4. Cum se determin lacaza n soluii pure i must de struguri? 5. Tehnica securitii la determinarea lacazei.

63

Lucrarea de laborator nr. 10

Determinarea activitii catalazei dup A. Bah i A.Oparin Oxidoreductazele dup mecanismul de aciune se clasific n trei grupe: Dehidrogenaze anaerobe i aerobe, care snt enzime transportoare de hidrogen; Citocromi, care snt enzime transportoare de electroni; Oxidaze, enzime care catalizeaz reaciile de oxidare a substratului cu oxigenul molecular sau cu oxigenul peroxidic. Oxidazele se mpart n trei subgrupe: Oxigenaze Hidroxilaze Oxidaze transportoare de electroni. Oxigenazele catalizeaz reaciile de combinare a substratului cu oxigenul molecular (cu ambii atomi din molecul): AO2 AOOH; sau A + O2 AH + O2 Hidroxilazele enzime care oxideaz substratul cu formarea concomitent a apei. Un atom din oxigenul molecular particip la oxidarea substratului, iar alt atom la formarea apei: A + SO + H2O AH2 + S + O2 unde: AH2 donator de hidrogen; S substrat; A donator liber; SO substrat oxidat. Oxidazele transportoare de electroni conin n molecula sa ioni metalici i catalizeaz reacia de oxidare a substratului cu ajutorul oxigenului atomic. Oxidazele se mpart n dou subgrupe: 64

Cupruoxidaze, enzime care conin cupru, din ele fac parte fenoloxidazele, polifenoloxidazele, ascorbatoxidaza, tirozinaza etc.; Feroxidaze, enzime care conin fier, din ele fac parte peroxidazele i catalazele. Peroxidazele, snt enzime cu structura heteroproteidic, adic heminproteide, ce conin Fe3+. Ele descompun peroxidul de hidrogen (H2O2) numai n prezena unui acceptor de oxigen sau a unui donator de hidrogen: H2O2 + A AO + H2O;

H2O2 + AH2 2 H2O + A Ele snt larg rspndite n regnul vegetal (mai ales n rdcinile de hrean) i mai puin n cel animal (lapte, saliv, ficat, leucocite). Peroxidazele snt active n struguri n perioada maturrii lor. Temperatura de peste 70 oC i dozele ridicate de SO2 inactiveaz sau distrug peroxidazele din must i vin.
Catalazele snt heminproteide, ce conin Fe3+. Se gsesc n toate celulele vegetale, dar pot fi secretate i de microorganisme, n special de bacteriile acetice. La animale se conin mai mult n snge i ficat. Catalaza (E.C. 1.11.1.6.) are proprietatea de a descompune peroxidul de hidrogen (apa oxigenat) n ap i oxigen molecular. Peroxidul de hidrogen poate fi i donator de oxigen:

H2O2 2 H2O2

catalaza catalaza

H2O + 1/2 O2 2 H 2O + O 2

Catalaza se inhibeaz de cianuri, hidrogenul sulfurat i fluoruri.

65

Apa oxigenat se formeaz la etapa final de oxidare biologic, cnd dehidrogenazele aerobe (flavinice) transmit hidrogenul direct oxigenului atmosferic. Apa oxigenat (H2O2) este toxic pentru celulele vii. Descompunnd apa oxigenat, catalaza protejeaz celulele de intoxicaii. Catalaza este foarte sensibil i i pierde activitatea la nclzire. Preparatele enzimatice de catalaz, obinute din ficat de bovine sau prin sinteza microbian, se utilizeaz n industria alimentar pentru distrugerea H2O2 rmase n urma conservrii laptelui, pasteurizrii oulor. Principiul metodei Determinarea activitii catalazei se bazeaz pe evidena apei oxigenate, descompuse de enzim timp de 30 minute, prin titrarea peroxidului cu permanganat de potasiu 0,1 N:
5 H2O2 + 2 KMnO4 + 4 H2SO4 5 O2 + 2 KHSO4 + 2MnSO4 + 8 H2O

Diferena volumelor de soluie 0,1N KMnO4 (cm3) a probei de control i probei de lucru, indic cantitatea apei oxigenate descompuse de enzim.
Ordinea ndeplinirii lucrrii a) Pentru probe solide Aparate, vase i materiale:

baloane conice 100 cm3 i 250cm3 ; cilindru de 100 cm3; mojar cu pistil; pipete 5, 10 i 20 cm3; biuret 25 cm3; soluie 1 % ap oxigenat; soluie 0,1N KMnO4; 66

soluie 10 % H2SO4; probe de produs (fin, cereale, mal). 5 g de produs se infuz timp de 1,5 ore cu 100 cm3 ap distilat la temperatura camerei n balon conic de 250 cm3. Suspensia obinut se filtreaz prin hrtie de filtru pliat. Pentru determinare se iau dou probe cte 20 cm3 de filtrat limpede. Coninutul probei de control se fierbe timp de 5 minute pentru inactivarea enzimei. n ambele probe se dozeaz cte 20 cm3 ap distilat i 3 cm3 soluie 1 % peroxid de hidrogen i se las pentru 30 minute la temperatura de camer. Aciunea enzimei este stopat prin administrarea a 3 cm3 soluie 10 % de H2SO4, iar restul de peroxid de hidrogen se titreaz cu soluie 0,1 n de KMnO4. Diferena volumelor de soluie 0,1n de KMnO4 (cm3) a probei de control i probei de lucru, indic activitatea enzimei. Activitatea catalazei poate fi exprimat n mg peroxid de hidrogen sau cm3 soluie 0,1 n KMnO4 la 1g produs analizat. 1 cm3 soluie 0,1n KMnO4 corespunde 1,7 mg peroxid de hidrogen. Activitatea catalazei (Ac) n mg H2O2/g x 30 min se determin dup formula:

Ac =

unde: a volumul soluiei 0,1N KMnO4 pentru titrarea probei de control, cm3; b - volumul soluiei 0,1N KMnO4 pentru titrarea probei de lucru, cm3; 5 recalcularea la volumul extractului 1,7 mg H2O2 echivalente 1cm3 0,1N KMnO4; n- masa probei, g.

(a-b) x 1,7 x 5 n

67

b) pentru probe lichide Aparate, vase i materiale:

soluie 1 % de ap oxigenat, prealabil neutralizat cu soluie 0,1n NaOH; soluie 0,05 n de KMnO4; soluie 10 % de H2SO4; probe de produs (vin, suc). n 4 baloane conice cu dop rodat de 100 cm3 se adaug cte 10 cm de vin sec. Dou probe ( de control) se fierb 5 minute cu rcitor invers pentru inactivarea enzimei. n dou probe de lucru i n cele de control se adaug cte 10 cm3 de ap distilat i cte 3 cm3 soluie 1% de H2O2, preventiv neutralizat cu soluie 0,1n NaOH i se las n repaus 30 minute la temperatura camerei. Apoi n toate probele se adaug cte 5 cm3 soluie 10 % H2SO4, se agit bine i se titreaz cu soluie 0,05 n KMnO4. Titrarea continu pn cnd apare culoare roz stabil 5 secunde. Activitatea catalazei se exprim prin cantitatea de peroxid, descompus de enzim timp de 30 minute, care se conine n 1 cm3 de vin.
3

Activitatea catalazei se determin dup formula:

Ac =

unde: a volumul soluiei 0,05 n de KMnO4 pentru titrarea probei de control, cm3; b - volumul soluiei 0,05 n de KMnO4 pentru titrarea probei de lucru, cm3; 0,85 mg de H2O2 echivalente cu 1cm3 0,05 n de KMnO4; n - volumul vinului analizat, cm3. 68

(a-b) x 0,85 n

ntrebri de control:

1. Caracteristica oxidoreductazelor, oxidazelor. 2. Explicai de ce catalazele se refer la oxidaze. 3. Importana catalazelor i peroxidazelor pentru organismele vii. 4. Descriei metodele de determinare a catalazei n produse solide i lichide.

69

Lucrarea de laborator nr. 11

Determinarea prii de mas a amidonului

n prezent toate polizaharidele convenional se mpart n dou grupe: oligoglucide (oligozide) i polizaharide superioare (poliozide sau poliglucide). Din oligozide fac parte ozidele cu o mas molecular relativ mic, care conin 10-20 resturi de monoze. Poliozidele snt substane macromoleculare cu un numr mare de resturi de monoze (de la cteva zeci pn la cteva mii), i alte substane, care, nu fac parte din glucide, numite agliconi. Cele mai importante din ele snt poliozidele vegetale: amidonul, celuloza, hemicelulozele, inulina, substanele pectice etc., i poliozidele de origine animal: glicogenul i aa-numitele mucopoliglucidele (acizii hialuronic, condroitinsulfuric, heparina i altele).
Importana analizei:

Un rol important ca substan de rezerv n plante l are amidonul, la fel i glicogenul - att pentru om ct i pentru animale. Amidonul reprezint o poliglucid de rezerv cu formula (C6H10O5)n, care se depoziteaz sub form de granule (de la 2 pn la 150 m) n tuberculi, semine, frunze, rdcini i chiar n prile lemnoase ale plantelor. Granulele de amidon la diferite specii se deosebesc dup dimensiuni, form, componena chimic i proprieti, ce servete ca metoda determinrii provenienei fainei. Amidonul este un praf, insolubil n ap rece, alcool i eter. n ap cald se umfl formnd geluri. Amidonul este constituit din 3 % substane minerale, acizi grai i 97 % amiloz, amilopectin. Amiloza este o poliglucid liniar care conine 200 1000 resturi de D glucopiranoz, unite prin legturi glicozidice de tipul 1,4 n lan liniar (masa molecular variaz pn la 30.000 70

1000.000 uniti). Caracteristica amilozei i amilopectinei este prezentat n tabelul 1.

Caracteristica amilozei i amilopectinei. Tabelul 1.

Structura chimic Forma moleculei Reacia cu I2 Masa molecular Solubilitate a Stabilitatea soluiilor

Amiloza Polimer al D Glp format prin legtura (14) Neramificat

Culoarea albastr 100 900 de mii Solubil n apa cald, formeaz soluii cu viscozitatea relativ joas, nu se gelific Instabile

Amilopectina Polimer al D Glp format prin legtura (14) i (16) Ramificaia la fiecare 20 de resturi Culoarea albastruviolet

Pn la 20*106 Se dizolv la temperaturi nalte, formeaz soluii cu viscozitate nalt, se gelific. Stabile

Structura macromoleculei de amiloz:

71

Structura macromoleculei de amilopectin:

Amiloza n ap cald formeaz o dispersie coloidal (dar nu formeaz geluri). Amiloza se coloreaz cu iodul n albastru. Molecula amilopectinei este puternic ramificat. Este alctuit din 600 6000 resturi de D glucopiranoz, legate ntre ele prin legturi 1,4 i dup 25-30 resturi de glucoz apare o ramificare cu legtura glucozidic de tipul 1,6. Masa molecular a amilopectinei este cuprins ntre 100 000 i 1 000 000 uniti sau zeci de milioane uniti. De exemplu, n componena amidonului de cartofi se conin fracii de amilopectin cu masa molecular mai mare de 70 mln. uniti. Amilopectina nu se dizolv n ap rece. Cu iodul se coloreaz n albastru-violet. n ap cald formeaz un sistem dispers stabil cu viscozitate mare (cleister). Principalele tipuri de materie prim care conin amidonul snt cartofii, cerealele i produsele de prelucrare a lor (crupele, fina). Coninutul amidonului n cartofi n mediu constituie 17,5 % (sau 70-80 % din masa uscat), n seminele cerealelor 40-80 % din masa uscat. Amidonul uor hidrolizeaz n prezena acizilor minerali (chiar diluai), pn la glucoz:

72

+ n H2O

(C6H10O5)n Acid mineral

dextrine Acid mineral

nC6H12O6

Hidroliza amidonului este catalizat i de enzimele - i amilaze, care se conin n mal i n saliv. Produsul final al acestei hidrolize enzimatice este maltoza:
amilaze amilaze

amidon

dextrine

maltoza

Amidonul la 96,1 97,7 % este format din polizaharide, care la hidroliza acid formeaz glucoza. De aceea metodele existente de determinare cantitativ a amidonului se bazeaz pe proprietile glucozei de reducere, activitatea optic etc. Din cele mai rspndite metode de determinare a amidonului pot fi numite: polarimetrice, colorimetrice, chimice, gravimetrice. n industria fermentativ de producere a amidonului i melasei, n alte ramuri ale industriei alimentare snt rspndite metodele polarimetrice (metodele Evers, Lintner, Arhipovici). Metoda Evers este metoda standard de baz pentru determinarea amidonului la aprecierea calitii cerealelor i produselor de prelucrare a lor. Pentru determinarea coninutului de amidon n materia prim vegetal prin aceast metod este necesar n prealabil de transferat amidonul n stare solubil i de hidrolizat pn la glucoz, ce se realizeaz prin tratarea produsului analizat cu acid clorhidric sau cu clorur de calciu. Pentru a nltura substanele nsoitoare (care mpiedic determinarea), ndeosebi proteinele, i pentru a limpezi hidrolizatul, soluia este tratat cu unul din reactive precipitante, care pot fi: acidul dodecawolframofosforic, acidul picric, molibdatul de amoniu, reactivul Karrez (un amestec de soluii ale srurilor ferocianurii (II) 73

de potasiu i sulfatului de zinc). Soluia transparent se polarimetreaz. Aparate, vase i materiale: zaharimetru universal C-3; cntar tehnic; baia de ap; 2 baloane cu cot de 50 cm3; baloane conice de 250 cm3; cilindre de 25 cm3; pipete de 2, 5, 10, 25 cm3; plnie din sticl; filtru de hrtie; soluie 0,31n de HCl (sau soluie cu concentraia 1,124%); soluie 25 % HCl; reactivul Karrez I: (15g [K4Fe (CN)6]3 X 3 H2O cu eroarea 0,01 g, se dizolv n balon cotat 100 cm3 i se aduce cu ap distilat pn la cot); reactivul Karrez II: (30g ZnSO4 X 7 H2O cu eroarea 0,01 g, se dizolv n balon cotat 100 cm3 i se aduce cu ap distilat pn la cot). Reactivul Karrez I i II pot fi nlocuite cu soluie 2,5 % molibdat de amoniu sau soluie 4 % de acid dodecavolframofosforic; produse pentru analiz: fin, crupe i cereale mcinate.
Ordinea ndeplinirii lucrrii Proba de lucru. ntr-un balon cotat uscat de 50 cm3 se dozeaz cu cilindru 15 cm3 soluie 0,31 n de HCl. Cu ajutorul plniei se administreaz agitnd permanent 2,5 g de produs analizat (fin, crupe, etc). Plnia i gtul balonului se cltesc cu 10 cm3 soluie 0,31 n de HCl. Coninutul balonului se menine 3 minute n baia de ap la temperatura fierberii, agitnd permanent. Apoi nclzirea n baia de ap se prelungete 12 minute. Balonul se scoate din baia de ap i repede se rcete sub robinet pn la ot = 20 oC.

74

Pentru a precipita proteinele i a limpezi soluia n balon se adaug cu cilindrul reactivul precipitant: cte 1 cm3 soluie Karrez I i II. Dup 5 minute coninutul balonului se aduce cu ap distilat pn la cota 50 cm3. Soluia se agit i se filtreaz prin hrtie de filtru pliat ntr-un balon conic uscat. Primele porii de filtrat (pn la 5-10 cm3) nu se folosesc. Cu filtratul limpede la ot = 20 oC se umple tubul de polarizare cu lungimea 2 dm. Se determin unghiul de rotaie a planului de polarizare la zaharimetru C-3. Concomitent se pregtete proba de control pentru a introduce corecie la substanele solubile n ap optic active care, nu precipit cu reactivul precipitant i se gsesc n soluie (n special glucidele). Pentru proba de control se cntrete 5 g de produs, care se transfer n balonul cotat de 50 cm3, se adaug 30 cm3 ap distilat i se agit timp de 15 minute. Plnia i gtul balonului se cltesc cu 10 cm3 ap distilat i soluia se decoloreaz cu reactivul precipitant Karrez I i II ca n proba de lucru. Timp de 5 minute coninutul balonului se agit i se aduce cu ap distilat pn la cota 50 cm3, se filtreaz. Se msoar cu cilindrul 25 cm3 de filtrat limpede, se transfer ntr-un balon cotat de 50 ml i se adaug 1 cm3 soluie 25 % HCl, se menine 15 minute n baia de ap la fierbere, apoi se rcete sub robinet pn la ot = 20 oC i se aduce pn la cot cu ap distilat. Cu filtratul limpede la ot = 20 oC, se umple tubul de polarizare cu lungimea 2 dm. Se determin unghiul de rotaie a planului de polarizare la zaharimetru C-3. Coninutul amidonului se calculeaz dup formula: ( ) 100 100 50 , C = l 20 c [ ]D m l (100 W ) unde: C partea de mas a amidonului (%) n substane uscate; l mrimea unghiului de rotaie a planului de polarizare obinut de substanele optic active n experiena de baz, n grade a zaharimetrului ;

75

c mrimea unghiului de rotaie a planului de polarizare obinut de substanele solubile n ap optic active (nu de amidon) n proba de control, n grade a zaharimetrului; (l - c) mrimea unghiului de rotaie a planului de polarizare obinut de proba de amidon dizolvat, n grade a zaharimetrului; m masa (2,5 g) produsului analizat, g; l lungimea tubului de polarizare, dm; [] D20 capacitatea de rotaie spicific a amidonului din produsul analizat, n grade; W coninutul de mas a umiditii n produsul analizat, %. De obicei pentru a calcula coninutul de mas a amidonului se utilizeaz tabelul 1, unde snt date mrimile capacitii de rotaie specific [] D20 pentru diverse produse ce conin amidon i coeficientul Evers (F, egal cu 1000/[]D20), pentru diverse produse ce conin amidon. Capacitatea de rotaie specific [] D20 pentru diverse produse ce conin amidon. Tabelul 1. Amidon [] D20 F Orez 176,7 5,66 Gru 177,5 5,64 Porumb 177,5 5,64 Cartofi 181,2 5,50

1. 2. 3. 4.

ntrebri de control: Structura i proprietile amilozei. Structura i proprietile amilopectinei. Hidroliza amidonului. Metodele principale de determinare a amidonului n produse vegetale. 5. Care este principiul de determinare a amidonului n metodele polarimetrice ? 6. Ce reprezint coeficientul Evers ?

76

Lucrarea de laborator nr. 12

Determinarea fotocolorimetric a vitaminei C

Vitamina C sau acidul ascorbic este cea mai rspndit vitamin n regnul vegetal i poate fi sintetizat de toate animalele excepie fiind omul, primatele i cobaiul. Insuficiena n hran a vitaminei C duce la oboseal, dureri de dini. Lipsa n organism este determinat de apariia scorbutului. Boala se manifest prin inflamarea i sngerarea gingiilor, insuficien cardiac i apariia de hematoame. Necesitatea zilnic pentru om este de 50-100 mg. Coninutul vitaminei C este mai mare n fructe i frunze, n cantiti mai mici se conin n rdcini i n cantiti minime de tot n organismele animale (tab.1).
Coninutul de acid ascorbic n produse vegetale (mg -% sau mg/100 g de produs) Tabelul 1 Coninutul de Produsul Coninutul de acid ascorbic vegetal acid ascorbic Coacz 100-400 Ardei verde 100-400 neagr Ptrunjel 150 Lmi 40 Mrar 100-150 Mere 3-17 Varz alb 30-50 Viine 15 Mcri 40-60 Struguri 3-12 Mceul de 2000-4500 Cartofi 20-30 nord Ceap verde 30 Nuci verzi 3000 Tomate 20-25 Ctin alb 100-400 Cetin de Mazre 150-200 25 brad i pin verde Acidul ascorbic particip activ n procesele de oxidare i reducere care au loc n celula vie. Acesta se datoreaz sistemului Produsul vegetal

77

(acid ascorbic - acid dehidroascorbic) care are rol de reglare a potenialului redox din celule, contribuind la transportul hidrogenului. Prin oxidare lent vitamina C se transform n acid dehidroascorbic:
O=C O=C -2 H
+

HO - C HO - C HC HO - C - H CH 2 O H

O=C O=C

+ 2 H+

HC HO - C - H CH 2 O H

acid L-ascorbicacid L-dehidroascorbic n plantele crucifere (varz, ridiche de iarn, ridiche de lun etc.) alturi de acidul ascorbic liber se conine forma (complexul) asociat, numit a s c o r b i n o g e n. Structura lui poate fi redat prin formulele urmtoare: O C O
HC - CH 2 - C O HC NH HO - C - H CH 2OH CH C-OH O

78

O C O CH2 - C HC O NH H C HO - C - H CH 2 O H CH C-O H O

Aceast substan n prezena acidului clorhidric uor se hidrolizeaz formnd acidul ascorbic liber. Hidroliza ascorbinogenului are loc n tubul digestiv.
Proprietile chimice ale acidului ascorbic

Vitamina C aparine acizilor dei n structura sa lipsete gruparea carboxilic COOH. Vitamina C este lactona unui acid hexonic i caracterul acid se datoreaz grupei OH enolice de la C3. De aceea cu baze diluate acidul ascorbic formeaz sruri.
O NaOH O + C C O + H2O

C C - OH C - OH HC

O C - O Na HC HO - C - H CH2OH

HO - C - H CH2OH

Ascorbinat de sodiu Acidul ascorbic uor reduce iodul, diclorfenolindofenolul i ali oxidani. 79

2,6

C C C HC O O O

C - OH
C - OH HC HO - C - H CH2OH O

I2

2 HI

HO - C - H CH2OH

n prezena oxidanilor mai puternici, ndeosebi n mediul neutru i bazic, acidul ascorbic trece ireversibil n acid oxalic i treonic:
O C O C C C HC HO - C - H CH2OH O O O COOH COOH

C - OH
C - OH HC HO - C - H CH2OH O

H2O

C C

O O

O
H2O

acidul oxalic
COOH COOH H-C-OH HO - C - H CH2OH

H-C-OH HO - C - H CH2OH

acidul 2,3-diceto-L-gulonic

acidul treonic

Vitamina C este foarte instabil, se distruge n mediul neutru i bazic la temperatura 20 oC, este mai stabil n mediul acid. Coninutul n acid ascorbic scade mult la conservare i fierberea alimentelor. Uor se distruge n prezena luminii i oxigenului, cationilor metalelor grele i mai repede n prezena enzimelor din clasa oxidoreductazelor (ascorbatoxidazei, polifenoloxidazei). Coninutul n acid ascorbic se micoreaz mult n procesul pstrrii materiei prime alimentare.
Principiul metodei Acidul ascorbic se extrage din materialul analizat cu acid oxalic. Dup filtrarea extractului (cu pH-ul 3-4) se titreaz cu soluie de 0,001n 2,6-diclorfenolindofenol. Ultimul este un oxidant

80

selectiv i reacioneaz cu acidul ascorbic, dar nu reacioneaz asupra zahrului i a altor substane reductoare.
Cl O N ONa H
+

Cl O N OH + Na

Cl 2,6-diclorfenolindofenolat de sodiu (albastru)

Cl 2,6-diclorfenolindofenol (rou)

Cl O Cl N OH +

O C C - OH O C - OH HC HO - C - H CH2OH

C C C HC O O Cl O +

HO
Cl

NH

OH

HO - C - H CH 2OH

substanta incolora

Aparate, vase i materiale: fotocolorimetru, KFK-2; cntar tehnic; mojar cu pistil; trei baloane cotate de 100 cm3; ase eprubete; pipete de 0,5; 1,0; 5,0; 10,0; 20,0 cm3; plnie din sticl; filtru din materie,

81

soluie de acid oxalic de 1 %; soluie de 0,001n de sare de sodiu 2,6diclorfenolindofenol; cristale de acid ascorbic; produse pentru analiz: mere, struguri, mcri, mrar, ceap verde, varz, cartofi etc. Pregtirea soluiei de 2,6 - diclorfenolindofenol Reactivul (sau indicatorul) se pregtete cu soluie-tampon fosfat cu pH= 6,9 7,0 deoarece n soluia apoas el se distruge. Pentru tampon se pregtesc urmtoarele soluii: KH2PO4 9,078 g n 1 dm3 de ap distilat i NaHPO4 x 2 H2O 11,867 g n 1 dm3 de ap distilat. Fiecare soluie se pstreaz aparte. nainte de ntrebuinare soluiile se amestec: 2 volume soluie KH2PO4 i 3 volume soluie NaHPO4. 0,26 g de reactiv 2,6- diclorfenolindofenol se transfer n balonul cotat de 1 dm3, se adaug 700 cm3 ap distilat, amestecul se aduce pn la cot cu soluie-tampon pH= 6,9 7,0. Soluia de 2,6 diclorfenolindofenol se pstreaz la ntuneric nu mai mult de 7 zile. Titrul soluiei se controleaz zilnic cu soluie 0,01 n tiosulfat de sodiu. Determinarea titrului se bazeaz pe proprietatea 2,6diclorfenolindofenolului de a oxida cantitativ iodidul n iod. Determinarea titrului 2,6- diclorfenolindofenolului n patru baloane conice de 50 cm3 se dozeaz: n primele dou (probe de lucru) cte 10 cm3 soluie indicator, 0,5 -1 cm3 acid sulfuric (1:4) i 1 cm3 soluie 10 % KI; n cele de control n loc de indicator se adaug 10 cm3 ap distilat, 0,5 -1 cm3 acid sulfuric (1:4) i 1 cm3 soluie 10 % KI. Soluia din baloane se agit i iodul, eliberat la oxidarea KI, se titreaz n prezena soluiei 1 % amidon cu 0,01n de tiosulfat. Cantitatea de acid ascorbic care corespunde la 10 cm3 de 2,6diclorfenolindofenol se determin prin nmulirea volumului soluiei de tiosulfat, care a mers la titrare cu coeficientul 0,88. (V lucru - V control) * 0,88 T= 10 82

Ordinea ndeplinirii lucrrii Analiza produselor lichide

40-50 cm3 de suc sau must se dozeaz n balon cotat de 100cm3 i se aduce pn la cot cu soluie de 5 % acid acetic. Amestecul se agit i cu pipeta se transfer 30-40 cm3 ntr-un balon cotat de 50 cm3 n care se adaug 0,5 g CaCO3 praf (n cantiti mici pentru a evita spumegarea). Dup dizolvarea CaCO3 se dozeaz 5-10 cm3 soluie acid de 5 % de acetat de plumb. Amestecul se aduce pn la cot cu soluie de 5 % acid acetic. Soluia se amestec i se filtreaz sau se centrifugheaz. Ulterior se msoar cu pipeta (n dependen de coninutul acidului ascorbic) 10-20 cm3 de filtrat i se titreaz din microbiuret cu soluie 0,001 n 2,6diclorfenolindofenol pn la apariia culorii slab roze, care se menine timp de 30-60 secunde. Se fixeaz volumul de 2,6diclorfenolindofenol consumat la titrare i se adaug 2 picturi (de control) 2,6- diclorfenolindofenol i dac apare culoare roz intensiv se consider c titrarea a fost efectuat corect. Se repet titrarea la probe de 2-3 ori. Coninutul acidului ascorbic se calculeaz dup formula: 100 100 50 =V x T x x x V1 x D V3 V2 unde: a coninutul de acid ascorbic n mg-%; V - volumul soluiei de 2,6-diclorfenolindofenol consumat la titrare; T - cantitatea de acid ascorbic n mg, care corespunde la 1 cm3 de 2,6-diclorfenolindofenol; V1 volumul de suc sau must luat pentru analiz, n cm3; V2 volumul probei luat la titrare n cm3; V3 volumul probei luat pentru titrarea cu acetat de plumb, n cm3; D densitatea optic a sucului sau a mustului analizat.

83

Analiza produselor solide (prin metoda fotocolorimetric)

Proba produsului analizat (10 g) se transfer n mojar i se mrunete cu pistilul n prezena acidului oxalic de 1 %. Apoi, cantitativ se transfer n balonul cotat de 100 cm3 , se aduce pn la cot cu acid oxalic i se agit. Coninutul balonului se filtreaz prin filtrul de materie ntr-un balon conic. n filtratul obinut se adaug 6 cm3 2,6diclorfenolindofenol. n continuare, se determin extincia D1: soluia obinut se transfer n cuv (cu lungimea de 1 cm), se fotocolorimetreaz la lungimea de und =540 nm (contra apei distilate). La determinarea extinciei D2: n cuva cu soluie analizat se adaug cteva cristale de acid ascorbic (culoarea 2,6-diclorfenolindofenolului dispare) soluia se agit i iari se fotocolorimetreaz. Pentru a introduce o corecie la schimbarea intensitii culorii la pstrarea soluiei de 2,6-diclorfenolindofenol, se msoar extincia amestecului (Do), format din 10 cm3 de 2,6diclorfenolindofenol, 6 cm3 de soluie de 1 % de acid oxalic. Ulterior se msoar extincia (D) soluiei proaspt pregtite de 2,6diclorfenolindofenol, din care se scade extincia (Do). Densitatea optic a soluiei analizate se determin dup formula: Corecia (D-Do) se include n calcul atunci cnd calibrarea i determinarea D1 i D2 nu se face n aceeai zi. Dup graficul de calibrare se determin concentraia de acid ascorbic (Cx) care corespunde Dx.
Graficul de calibrare Substrat ascorbic: se dizolv 100 mg acid ascorbic n balon cotat de 100 cm3 i se aduce pn la cot cu soluie 1 % acid oxalic. Pentru a construi graficul de calibrare se dilueaz substratul ascorbic: 10 cm3 soluie de substrat ascorbic se transfer n balon

Dx = D1 + (D - Do) - D2

84

cotat de 100 cm3 i se aduce la cot cu soluie de 1 % acid oxalic (concentraia soluiei diluate de substrat ascorbic este 100 mkg/cm3). n ase cilindre se administreaz de la 1 cm3 pn la 6 cm3 de soluie diluat de substrat ascorbic, (ce va corespunde concentraiilor 16,6; 33,2; 50,0; 100 mkg/cm3) apoi se dozeaz 10cm3 soluie proaspt pregtit de 2,6-diclorfenolindofenol. Volumul la fiecare cilindru se aduce pn la 16 cm3 cu soluie de acid oxalic de 1 %. Exemplu:
C, mkg/cm3 D 16.6 1.3 33.2 1.2 50 1 66.6 0.8 83.2 0.7 100 0.6

Determinarea concentraiei de vitamina C

D 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 20 40 60 80 100 120

C, mkg/cm3

Recalcularea n mg-% (mg de vitamina C n 100 g de produs alimentar):

K =

C * 100 * 100 a * 1000

85

K coninutul de vitamina C n mg-%, a masa probei; 1000- recalcularea n mg. ntrebri de control:

1. Care snt proprietile fiziologice ale acidului ascorbic ? 2. n care produse se gsete vitamina C n cantiti mai mari ? 3. Scriei structura i proprietile chimice ale acidului ascorbic. 4. Principiul metodei de determinare a acidului ascorbic. 5. Descriei metoda determinrii acidului ascorbic n produse lichide i tari. 6. Argumentai formula de calcul a acidului ascorbic prin dou metode. 7. Regulile tehnicii de securitate la determinarea acidului ascorbic.

86

Lucrarea de laborator nr. 13

Metoda cromatografic de determinare a carotinelor nsemntatea analizei

Rolul biochimic al vitaminei A: intr n componena membranelor plasmatice, micoreaz permeabilitatea la factori patogeni, prin aceasta protejeaz celulele epiteliale; particip n recepia luminii, fiind n componena purpurului vizual - rodopsinei; particip la fotosintez, n reglarea fosforilrii oxidative, ciclului acizilor tricarboxilici, biosintezei mucopoliglucidelor; Insuficiena vitaminei A duce la ncetarea creterii copiilor, se micoreaz rezistena la infecii. Apare boala orbul ginilor (hemeralopia) scderea vederii n amurg ori noaptea. Lipsa vitaminei A n hran provoac boala xeroftalmie (grec. xeros uscat, ophtalmos - ochi) din cauza inflamrii corneei i cheratinizrii epiteliului canalelor lacrimogene, ceea ce duce la nchiderea lor. Aceasta boal se ntlnete mai des la copii. Necesitatea zilnic n vitamina A pentru un om matur constituie 1,5 2 mg, iar n carotine 3 5 mg. Vitaminele grupei A se gsesc exclusiv n produse animale. n cantiti mai mari n untura i ficatul de pete. De exemplu n bibanul marin 5 mg-%; n paltus 8 mg-%; n ficatul de vite 1,5 2 mg-%. n cantiti mai mici se gsesc n lapte, unt, glbenu de ou, etc. n natur se ntlnesc vitamina A1 i A2. Vitamina A1 (retinol) reprezint un alcool, ce are n molecul ciclul iononic, o caten lateral din 2 resturi izoprenice i gruparea terminal CH2 OH n poziia trans, conine 5 duble legturi conjugate.

87

Vitamina A2 (dehidroretinol) se ntlnete mai mult n ficatul petilor de ap dulce. Are n plus o legtur dubl n poziiile 2-3 ale ciclului iononic. Structura chimic a vitaminei A1 C20H30O.
H3C CH3 __ __ CH=CH CH3 __ CH3 C = CH CH3

Structura chimic a vitaminei A2 C20H28O.

H3C CH3 __ __ CH=CH CH3 __ CH3 C = CH CH3

Provitaminele sau carotine se conin n produse vegetale i plante, snt hidrocarburi cu structura C40H56, substane cristaline de culoare oranj. Se conin n: morcov 5 15 mg-%, verdea 3 10 mg-%, mai puin n frunze i struguri verzi, caise, piersici, pepene galben, bostan, iar n roii se conine licopina. n vinuri lipsete, dar poate fi n cantiti mici n vinurile aromatizate. Din carotine se cunosc trei izomeri: , , , care se deosebesc prin caracterul i numrul de cicluri: carotina este mai activ, deoarece conine dou cicluri iononice; carotina conine un ciclu iononic i altul iononic; carotina conine numai un ciclu iononic. n organismul omului i animalelor carotinele se transform n vitamina A. Din carotina prin hidroliza enzimatic n organismul animal se formeaz 2 molecule de vitamina A1. Iar din i carotine se obine numai cte o molecul de vitamina A1.

__

__

__

CH =CH

__

C = CH

__

CH2OH

__

__

__

CH =CH

__

C = CH

__

CH2OH

88

 carotina
H3C CH 3 __ (C H=C H
3

CH 3

+ HO
__

__

CH 3

H 3C C H=C H) 2 H 3 C __

CH 3

__

__

__

C = CH) 2

CH = C H __ (CH= C

__

__ CH

+ H
H 3C 2 CH 3 __ __

__

OH

(CH=CH CH 3

__

C = CH) 2 CH 3

__

CH 2 OH

__

carotina
H3C CH3 __ (CH=CH
3

CH3

CH3

H3C

CH3

__

__

__

C = CH)2

__

__ CH = CH__ (CH= C CH=CH)2 H3C __

__ CH

carotina
H3C CH3 __ __ (CH=CH __ CH3 C = CH)2 CH3 H3C CH3

__

__

__

__ __ __ HC CH = CH (CH= C CH=CH)2 H3C __

CH3

licopina
H3C C CH3 CH3 CH3 H3C C CH3

__

__ __ __ __ __ HC CH __ (CH=CH C = CH)2 CH = CH (CH= C CH=CH)2 __ CH3 H3C __

Vitamina A i carotinele uor se descompun, se oxideaz cu oxigenul din aer din cauza prezenei legturilor duble n molecula lor. De aceea nu se poate de pstrat mult timp morcovul i verdeaa tiate mrunt. 89

__

Carotenoidele se folosesc ca colorani naturali netoxici n industria alimentar, farmaceutic, medicin, cosmetic i ca adaos n hrana animalelor de ferm pentru intensificarea coloritului unor produse alimentare (glbenuul de ou, grsimea corpului psrilor).
Principiul metodei de determinare a carotinelor Se bazeaz pe extragerea lor cu solveni organici corespunztori din plante (fructe) mrunite i prin separarea ulterioar a impuritilor cu ajutorul cromatografiei de adsorbie urmat de fotocolorimetrare. n practica de laborator se folosete pe larg metoda cromatografic de separare a carotinelor dup M. S. vet, modificat de I.K. Murri. Aparate, vase i materiale: fotocolorimetru KFK - 2; coloana cromatografic tub de sticl cu lungimea 30 cm cu diametrul inferior 1 cm; balon Bunzen, uscat; pompa cu vid; mojar cu pistil; baloane cotate 50, 100 cm3, uscate; adsorbent Al2O3 (praf) sau carbonat acid de magneziu activat; Na2SO4 calcinat; probe de materie prim (legume colorate, fructe, plante verzi); hrtie de filtru; solvent organic: eter de petrol sau pentan, hexan, heptan, etc. NOT: Solvenii organici snt inflamabili. Respectai regulile de securitate !

90

Ordinea ndeplinirii lucrrii Metoda cromatografic Proba de material vegetal 1 g (pn la 5 g n dependen de umiditate) se mrunete n mojarul de porelan cu pistilul, dar nu mai mult de 30 minute, pentru a evita oxidarea carotenilor. Pentru deshidratarea probei n mojar se adaug periodic cristale de Na2SO4 calcinat pn cnd se obine o mas uscat, fin. Masa obinut se las n mojar pe 20 30 minute. n partea ngust a coloanei cromatografice se pune un tampon de vat cu grosimea 1 de cm. Apoi coloana se umple cu Al2O3 (praf) pn la nlimea 5-10 m, n dependen de cantitatea carotinelor i compoziia pigmenilor adsorbii. Pe suprafaa stratului adsorbant se aeaz hrtie de filtru. Proba de analizat mrunit se transfer cantitativ n coloana cromatografic. Coloana cromatografic se unete cu balonul Bunzen (fig.1). n coloan se toarn solvent organic pn cnd coninutul ei devine umed Balonul Bunzen se unete la pompa cu vid sau la pompa de ap. Proba de analizat se spal cu solvent (1-2 picturi pe secund), pn cnd culoare galben a picturilor dispare. Este necesar ca adsorbantul s fie acoperit tot timpul cu solvent organic, deoarece carotenii uor se oxideaz n curentul de aer care trece prin coloan. Coninutul balonului Bunzen se transfer n balonul cotat de 50 sau 100 cm3 i se aduce pn la cot cu solvent. Coninutul de carotene din soluia obinut se determin prin metoda fotocolorimetric. La aparatul KFK 2, la lungimea de und =540 nm (filtrul de lumin verde), dac soluia este colorat intensiv galben oranj i la lungimea de und = 490 nm (filtrul de lumin albastruverde), dac soluia este colorat n galben pai. Pentru determinarea extinciei se folosesc cuve din sticl cu lungimea de 5 cm (care se acopere cu cpcel de sticl). Ca soluie de comparaie va servi soluia incolor de solvent organic. Cuvele se cltesc cu solvent, se usuc cu hrtie de filtru.

91

Dup finalizarea lucrrii solventul i soluiile se toarn n baloane corespunztoare. Solvenii organici se interzice s fie turnai n lavoar !
Reglarea aparatului KFK 2 Aparatul KFK-2 (fig.2) este alctuit din : 1. Microampermetrul cu dou scri ; scara de sus gradat n % T, iar scara de jos n uniti ale extinciei (absorbiei) D. 2. Locaul cuvelor. 3. Suportul (prghia) pentru permutarea cuvelor. 4. Comutatorul filtrelor de lumin. 5. Manete pentru reglarea sensibilitii : scara neagr pentru fotoelementul F4 ; scara roie - pentru fotodioda FD7K. 6. Maneta pentru reglarea grosier i fin a acului galvanometrului la diviziunea 100 %T.

Fig.2. Aparatul KFK-2 Aparatul se conecteaz la reeaua electric i se las 15-20 minute pentru a se nclzi. n acest timp lcaul cuvelor trebuie s fie deschis. La ridicarea capacului aparatului placa metalic nchide calea fluxului luminos ctre fotoelemente. Rotind maneta din 92

partea stng a comutatorului se regleaz lungimea de und necesar. Cuva cu solvent pur (proba de comparaie) se pune n suportul pentru cuve (n partea din stnga), iar cuva cu soluia de analizat n partea dreapt a suportului i capacul aparatului se nchide. n prealabil se regleaz scara aparatului la zero cu ajutorul manetei din partea dreapt (reglarea grosier i fin a acului galvanometrului la diviziunea 100 % T sau la diviziunea 0 pe scara extinciei D). Schimbnd poziia suportului de sub capacul aparatului permutai cuvele n fluxul luminos i notai valoarea extinciei pe scara de jos a galvanometrului. Repetai msurrile de 3 ori i notai valoarea medie a rezultatului. Graficul de calibrare Cantitatea de carotine se determin cu ajutorul graficului de calibrare, construit n coordonatele: extincie concentraie. Pe baza rezultatului obinut din graficul de calibrare se calculeaz cantitatea de carotin mg n 100 g de prob vegetal. Pentru a construi graficul de calibrare se utilizeaz soluia standard de K2Cr2O7 (bicromat de potasiu). 300 mg K2Cr2O7 uscat i recristalizat (de trei ori) se dizolv n ap distilat n balonul cu cot 1dm3. 1 cm3 de aa soluie dup culoare corespunde la 0,00208 mg (2,08 g) de carotin. n 10 baloane cu cot de 100 cm3 se introduce o anumit cantitate de soluie K2Cr2O7 conform tabelului1. Soluiile se aduc pn la cot cu ap distilat, se agit i se determin extincia fiecrei soluii. n baza rezultatelor obinute se completeaz tabelul1 i se construiete graficul de calibrare n coordonatele: extincie (D) concentraie (C) n g. Ca soluie de comparaie va servi apa distilat. 93

Volumul K2Cr2O7 i concentraiile carotinei. Tabelul 1. 10 15 20 25 30 50 75 100 V ml 2 5 K2Cr2O7 4 10 21 31 42 52 73 104 156 208 C g D

Coninutul carotinelor (X) n mg-% se calculeaz dup formula urmtoare: C * 100 X= m * 1000 , unde mmasa probei n g
ntrebri de control:

1. Rolul biochimic al vitaminelor grupei A i carotinelor. 2. Structura vitaminelor A1, A2, i a carotinelor. 3. Descriei principiul de separare a carotinelor prin metoda cromatografic. 4. Cum se determin extincia soluiilor colorate la aparatul KFK 2 ? 5.Cum se pregtesc soluiile pentru graficul de calibrare a carotinelor ?

94

Lucrarea de laborator nr. 14

Determinarea indicilor de calitate a lipidelor Lipidele reprezint o categorie de substane solubile n solveni organici (cloroform, acetona, benzen, eter etilic), dar insolubile n ap i sruri minerale. Din punct de vedere chimic lipidele snt substane foarte heterogene, caracterizate n general prin structura hidrofob apolar. Lipidele au un rol plastic i energetic, particip la formarea membranei celulare, la permeabilitatea celular i la vehicularea diferitelor substane organice. Lipidele au funciile de termoizolare, termogenez, aprare de leziuni mecanice, hidroizolare. Organismul uman necesit pe zi 70-145 grame de lipide. Schema general a clasificrii lipidelor poate fi redat astfel:

Gliceride Simple Lipide (esteri ai acizilor grai) Complexe Sfingolipide Lipide (pe baza izoprenei) Monoterpene C10 Diterpene C20 Politerpene C500 C25000 Steride Ceride Glicerolipide

95

Acizii grai

Majoritatea acizilor grai separai din grsimile naturale snt acizi monocarboxilici cu catena normal, care conin un numr par de atomi de carbon. Acizii grai cu catena saturat corespund urmtoarei formule generale: CH3(CH2)n COOH, n=230 n = 10, C12 acidul lauric (unt de laur); n = 14, C16 acidul palmitic (majoritatea grsimilor); n = 16, C18 acidul stearic (majoritatea grsimilor); n = 18, C20 acidul arahic (ulei de arahide); Acizii grai lineari nesaturai snt acizii monocarboxilici care conin n molecula lor una sau mai multe legturi duble. Structura acizilor grai nesaturai poate fi codificat prin cifre. De exemplu codul 18.19 nseamn c n structura acidului oleic intr 18 atomi de carbon, este o singur legtur dubla lng C9. 12.1 9 acidul lauroleic (lapte de capr); 16.1 9 acidul palmitoleic (grsimi animale); 18.2 9, 12 acidul linoleic (n majoritatea lipidelor); 18.3 9, 12, 15 acidul linolenic (ulei de in); 18.4 5, 8, 11, 14 acidul arachidonic (lipide complexe). Ultimii trei acizi grai constituie vitamina F, care stimuleaz procesele de cretere la mamifere, previne dermatitele i acumularea colesterolului n snge. Gliceride Gliceridele snt esteri ai acizilor grai cu glicerolul (propantriolul). Denumirea gliceridelor se formeaz innd seama de acizii grai din structura lor i de poziia acestora.

CH2OCO(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3 CH OCO(CH2)14CH3 CH3OCO(CH2)16CH3

Oleopalmitostearina

96

Gliceridele de consisten lichid (uleiurile vegetale) conin acizi grai nesaturai. Grsimile unde predomin acizii grai saturai snt solide. Grsimile lichide se transform n solide prin hidrogenizarea la locul legturilor duble (prepararea margarinei). Snt mai muli indici care caracterizeaz calitatea grsimilor. De exemplu, indicele de saponificare (Is) reflect cantitatea legturilor esterice n molecula gliceridului i masa molecular a acizilor grai. Indicii de saponificare al unor grsimi alimentare snt urmtorii: unt de vaca 220 240, ulei de floarea soarelui 186 198 (mg de KOH necesar pentru saponificarea 1 g de grsime). Indicele de iod reflect cantitatea legturilor duble n gliceride i se exprim n g de iod fixate de 100 g grsime. Ulei de floarea soarelui are indicele de iod 114 135, de soia 114 140. La aciunea luminii, la contactul cu oxigenul i cu vaporii de ap grsimile snt supuse transformrilor degradative, cunoscute sub denumirea de rncezire. Rincezirea poate fi hidrolitic i oxidativ. n urma rncezirii hidrolitice se acumuleaz acizii grai liberi, care au un miros i gust neplcut. Reaciile de oxidare duc la formarea a) cetonelor i b) peroxizilor, aldehidelor, aldoacizilor.

Acumularea produselor de oxidare duce la pierderea proprietilor organoleptice i scderea valorii nutritive a grsimilor. Oxidarea grsimilor poate fi prevenit prin introducerea antioxidanilor (tocoferoli, hidrochinona, derivai ai acidului galic etc.).

97

1. Determinarea indicelui de aciditate

Indicele de aciditate se exprim n mg de KOH necesare pentru neutralizarea acizilor grai liberi, care se conin n 100 g de lipide. Cantitate de acizi grai liberi n grsime nu este stabil, fiindc depinde de tehnologia obinerii, duratei i condiiilor pstrrii i de ali factori. Caracterizeaz prospeimea grsimilor i se mrete cu durata pstrrii. Determinarea se bazeaz pe neutralizarea acizilor grai liberi n proba de grsime cu soluii alcoolice de NaOH sau KOH.
Aparate, vase i materiale: soluia saturat de NaCl; dou baloane conice de 150- 200 cm3; biureta de 50 cm3; baia de ap; 1% fenolftaleina, soluie alcoolic; 0,1 n soluie alcoolic de NaOH sau KOH (4,5 g de NaOH sau 6 g de KOH mrunim, transferm n balon, adugm 60-70 cm3 96 % alcool etilic rectificat, nchidem balonul cu dop i lsm pe 24 ore. Soluia de hidroxid o separm de sediment prin filtrare (prin vat de sticl sau asbest), dilum cu apa distilat pn la concentraia necesar; amestecul neutru de alcool i eter (1:2 raportul volumelor). Ordinea ndeplinirii lucrrii (pentru grsimi de culoarea deschis)

n baloanele conice de 150-200 cm3 introducem 3-5 g de grsimi analizate cu eroarea 0,01 g, adugm 50 cm3 de amestec neutralizat de etanol i eter etilic, agitm coninutul. Dac grsimea nu se dizolv, balonul l nclzim la baia de ap, agitnd permanent. Rcim balonul pn la 15-20 0C, adugm 3-5 picturi de 1 % 98

soluie alcoolic de fenolftalein i agitnd permanent titrm proba cu 0,1 n soluie alcoolic de NaOH sau KOH pn la apariia culorii slab roz, care nu dispare timp de 30 sec. Indicele de aciditate (mg/g grsime) se calculeaz dup formula : V K 5,61 Ia = b m
unde: Vb volumul (cm3) soluiei de NaOH sau KOH pentru titrarea acizilor grai; K coeficientul de corecie a soluiilor bazice; 5,61 cantitatea de KOH (mg) n cm3 soluie de 0,1 n ; m masa probei, g.
Ordinea ndeplinirii lucrrii (pentru grsimi de culoare nchis) n aceasta metod nu se utilizeaz solvent pentru grsime. Pentru separarea fazelor se introduce soluia saturat de NaCl. La titrare se utilizeaz 1% fenolftaleina. Dup ce toi acizii liberi se neutralizeaz, surplusul de baz trece n soluia de NaCl i l coloreaz n roz. NaCl inhib hidroliza grsimilor i nu permite formarea emulsiilor stabile la titrare. ntr-un balon de 200 cm3 introducem 10 g de grsime (cntrite cu eroarea 0,01 g), adugm cu cilindru 50-60 cm3 soluie saturat de NaCl i 0,5 cm3 de 1 % soluie alcoolic de fenolftalein. Balonul l nchidem cu dop, agitm, apoi o titrm cu 0,1 n KOH. La titrarea agitm fiecare dat dup adugarea 4-5 picturi de KOH pn nu dispare culoarea stratului de jos a soluiei. n procesul de titrare coloraia trebuie s se schimbe lent, de aceea la finisarea titrrii agitarea o facem mai des. Titrarea se termin, cnd n stratul de jos a srii va aprea culoarea roz stabil, care nu dispare timp de 30 sec. Indicele de aciditate (mg/g grsime) se calcul dup formula :

99

Ia =

Vb K 5,61 , m

Unde: Vb volumul (cm3) soluiei de NaOH sau KOH pentru titrarea acizilor grai K coeficientul de corecie a soluiilor bazice 5,61 cantitatea de KOH (mg) n cm3 soluie de 0,1 n m masa probei, g
Limitele normelor admisibile de indicele de aciditate pentru unele uleiuri i grsimi (mg/g grsime): Ulei de floarea soarelui rafinat 0,4 nerafinat calitatea superioar 1,5 nerafinat calitatea I 2,25 Ulei de soia rafinat 0,3 hidratat calitatea I 1,0 Ulei de porumb rafinat 0,3 nerafinat 5,0 Grsimi alimentare topite: calitatea superioar1,3 calitatea I2,2 2. Determinarea indicelui de saponificare Indicele de saponificare Is se exprim n mg de KOH pentru saponificarea gliceridelor i neutralizarea acizilor grai liberi ntrun gram de grsime. Valoarea Is depinde de masa molecular a acizilor grai din componena lipidelor. Cu ct masa molecular e mai mare, cu att valoarea Is este mai mic. Is este mai mare la lipide cu indicele de

100

aciditate mai mare. Is la mono- i digliceride e mai mic de ct la trigliceride. Dup Is n producere se calculeaz cantitatea de baz, necesar pentru saponificarea grsimilor, de exemplu, la rafinarea uleiurilorla etapa neutralizrii.
Aparate, vase i materiale: 2 baloane de 250-300 cm3 cu tif; rcitor de aer; biureta 25 cm3; baia de ap; 0,5 n soluie alcoolic de KOH; 0,5 n soluie de HCl; 1 % soluie de fenolftalein.

Ordinea ndeplinirii lucrrii

ntr-un balon de 250-300 cm3 cu tif se introduce 2-3 g (cu precizia 0,0002 g), de grsime analizat prealabil bine amestecat i filtrat din biuret, se adaug 25cm3 de 0,5n soluie alcoolic de KOH i balonul se unete prin tif cu rcitorul de aer. Colba se menine o or ntr-o baie de ap la 100 oC (la fierbere), periodic coninutul se agit i nu se admite evaporarea alcoolului. E necesar ca nivelul soluiei n balon s fie mai jos dect nivelul apei n baie. Concomitent n aceleai condiii se face proba de control prin meninerea balonului cu 25 cm3 de 0,5 n soluie alcoolic de KOH . Soluia din balon dup terminarea saponificrii trebuie s fie transparent, fr picturi de grsime. Apoi coninut ambelor baloane se titreaz cu 0,5 n soluie de KOH n prezena indicatorului (1 % soluie alcoolic de fenolftalein pentru grsimi de culoare deschis i timolftalein, pentru grsimi de culoare nchis) pn la dispariia culorii. Soluia de lucru se titreaz fierbinte, puin rcit. 101

P Unde: 28,05 titru 0,5g soluie de KOH, mg/cm3; a cantitate de 0,5n soluie de HCl pentru titrarea KOH n proba de control, cm3; b - cantitate de 0,5n soluie de HCl pentru titrarea KOH n proba de lucru, cm3; K coeficientul de corecie de 0,5n soluie HCl; P masa grsimii, g. Devierile admisibile la probele paralele nu trebuie s fie mai mari de 0,1mg KOH/g.
Limitele normelor admisibile de indicele de saponificare pentru unele uleiuri i grsimi (mg/g grsime):

Indicele de saponificare Is (mg KOH/g ) se calculeaz dup formula: I = 28,05 (a-b) K

s

Ulei de floare soarelui 188-194 Ulei de soia 192-194 Ulei de cocos 242-269 Ulei de msline 185-200 Ulei de bumbac 191-200 Unt de vac 220-245 Unt de cacao 192-196 Grsime topit de vit 193-200
3. Determinarea indicelui de iod

Indicele de iod reflect cantitatea legturilor duble n gliceride i se exprim n g de iod fixate de 100 g grsime. La legturile duble acizii grai uor se oxideaz, ce determin procesele de rncezire i uscare a grsimilor. Indicele de iod se

102

utileaz la calculul cantitii de hirogen pentru hidrogenizarea lipidelor. Determinarea cantitii legturilor duble sau indicelui de iod este bazat pe fixarea unei molecule de halogen (iod, clor, brom) de o legtur dubl n condiii cnd halogenul nu substituie hidrogenul. Reacia are loc dup urmtoare schem:
CH2 CH CH2 O- CO- (CH2)7- CH = CH- (CH2)7- CH3 O - CO- R1 O - CO- R1 I CH2 CH CH2 I O- CO- (CH2)7- CH - CH- (CH2)7- CH3 O - CO- R1 O - CO- R2 + I2

unde R1 i R2 snt radicalii acizilor grai saturai. Pentru determinarea indicelui de iod n industrie este convenabil metoda lui Margoes. Aceast metod dup precizia rezultatelor cedeaz metodelor standard, dar este mai rapid, necesit mai puine reactive complicate i toxice, nu se cere calificarea nalt a personalului. Metoda este bazat pe reacia acidului gras nesaturat cu acidul hipoiodos, care se formeaz n rezultatul interaciunii iodului cu ap: I2 +H2OHOI + HI Reacia acidului gras cu acidul hipoiodos trece n modul urmtor: CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH + HOI CH3(CH2)7CHOH CHI - (CH2)7COOH Restul de iod se titreaz cu tiosulfat de sodiu.
Aparate, vase i materiale: sticl de ceas; pharul chimic; baie de ap;

103

 ceaca Petri; cilindru de 200 cm3; biureta 25 cm3; etanol 96 %; soluia alcoolic de iod (25 g de iod cristalin n dm3 de 96 % etanol); 0,1 n tiosulfat de sodiu Na2S2O3; 1 % soluie de amidon. Ordinea ndeplinirii lucrrii Pe o sticl de ceas, prealabil cntrit cu eroarea 0, 0002 g, se introduc 3-5 picturi de grsime analizat i se cntrete, sticla cu grsime se plaseaz ntr-un pahar chimic i se adaug 100 de volume de 96 % etanol: E de dorit ca masa grsimii s fie ntre 0,20,3 g, atunci cantitatea de alcool adugata va fi 20-30cm3.Pentru dizolvarea mai bun amestecul nclzete n baia de apa la temperatura 45-50o C, permanent agitnd coninutul pharului pn la dispariia picturilor de grsime. Pharul trebuie s fie acoperit cu ceaca Petri, apoi n phar din biuret se adaug 20 cm3 de soluie alcoolic de iod i cu cilindrul 200 cm3 de ap distilat. La adugarea apei amestecul permanent se agit cu bagheta de sticl, apoi pharul se acoper i se las pe 5 minute, dup ce surplusul de iod se titreaz cu 0,1n soluie de Na2S2O3 n prezena soluiei de amidon, de 1%. Paralel, n aceleai condiii, se face proba de control (fr grsime). Indicele de iod (g de iod la 100 g de grsime) se calculeaz dup formul : (a-b) x K x 100 x 0,01269 Indicele de iod = P unde a cantitatea de 0,1 n soluie de Na2S2O3 pentru titrarea probei de control, cm3; b cantitatea de 0,1 n soluie de Na2S2O3 pentru titrarea probei de lucru, cm3; K coeficientul de corecie a 0,1 n soluie Na2S2O3;

104

0,011269 cantitatea de iod, care corespunde 1 cm3 0,1 n soluie Na2S2O3, g; P masa grsimii, g.

105

Lucrarea de laborator nr. 15

Determinarea substanelor aromatice n pine i alte produse de panificaie

Mirosul este un indice organoleptic important al calitii pinii. Aroma pinei ntr-o mare msur caracterizeaz calitatea i prospeimea ei. Cea mai intensiv este aroma pinii calde, la rcire i pstrare aroma suficient scade. n formarea aromei pinii particip aproape 300 de substane care reprezint alcooli, fenoli, aldehide, cetone, acizi, lactone, compui cu sulf, esteri, amine. Toate acestea substane se afl n pine n cantiti foarte mici. Complexul substanelor aromatice se formeaz la toate etapele pregtirii aluatului. n procesul formrii aluatului crete coninutul alcoolilor , acizilor organici, esterilor, substanelor carbonilice. Important este prezena n aluat nainte de coacere a glucidelor reductoare i produilor hidrolizei proteinelor peptidelor i aminoacizilor. Finalizarea proceselor formrii aromei are loc anume la coacere, cnd se formeaz melanoidinele cu un miros specific i alte substane aromatice. Determinarea aromei pinii este prevzut de standarde ntrun ir de indice de apreciere organoleptic a calitii produselor de panificaie. Substanele carbonilice cantitativ prezint aproape o treime din toate substanele aromei pinii. Coninutul substanelor carbonilice n miezul pinii de secar i de gru-secar 6,8 - 28,9 cm3 0,1 n soluie de iod la 100g substanelor uscate, n miezul pinii de gru 5,4 28. n coaja pinii de secar i de gru-secar 43,6-162,7, n coaja pinii de gru 20,4-108,2 cm3 0,1 n soluie de iod la 100g substanelor uscate.

106

Principiul metodei Metoda se bazeaz pe interaciunea substanelor carbonilice cu bisulfit de sodiu NaHSO3. Determinarea constituie din urmtoarele etape: reacia formrii compuilor bisulfitcarbonilici; eliminarea surplusului de NaHSO3; scindarea compuilor bisulfitcarbonilici; determinarea cantitativ a NaHSO3 eliminat, care este echivalent cu coninutul substanelor carbonilici. Coninutul substanelor carbonilice se exprim n cm3 0,1 n soluie de iod pentru titrarea bisulfitului de sodiu, legat cu substanele carbonilice din 100 g de pine uscat. Aparate, vase i materiale: 0,15 % soluie de NaHSO3 (0,75 g de NaHSO3 nehidratat se dizolv n 400 cm3 de ap, se aciduleaz cu 2 n acid acetic n prezena 3-5 picturi de indicator metilrot pn la culoarea roz, apoi volumul se aduce pn la 500 cm3); soluie-tampon pH -8,3 (30 g de acid boric i 5 g de NaOH se dizolv n 1000 cm3 de ap distilat). Ordinea ndeplinirii lucrrii Proba de pine cu masa de 10 g (eroarea 0,01 g) se mrunete n mojar cu soluia 0,15 % de NaHSO3. Suspensia se transfer cantitativ n balonul cotat de 100 cm3, se aduce pn la cot cu soluia de bisulfit de sodiu, se agit 10 min, se las pentru decantare 10 min i se filtreaz ntr-un balon uscat. ntr-un balon conic de 150 cm3 introduc cu pipeta 10 cm3 de filtrat, la analiza soluiilor intens colorate se ia 10 cm3 de filtrat i 10 cm3 de ap distilat. Surplusul de bisulfit de sodiu se titreaz cu 0,1 n soluie de iod n prezena indicatorului (1 cm3 de 0,1 % soluie de amidon) pn la culoarea violet-albastr slab. Dac a fost adugat mai mult iod, el se titreaz cu 0,01 n soluie de tiosulfat de sodiu Na2S2O3.

107

Pentru scindarea compuilor bisulfitcarbonilici se utilizeaz soluie-tampon, care permite de a aduce pH mediului pn la 8,3. Titrarea bisulfitului de sodiu eliminat se face n dou etape: Titrarea de orientare Titrarea principal
Titrarea de orientare. n balonul conic dup ndeprtarea excesului de bisulfit de sodiu se adaug 15 cm3 de soluie-tampon i n acelai moment ncep titrarea din microbiuret a bisulfitului eliminat cu 0,01 n soluie de iod pn la apariia culorii violetalbastr, care nu dispare 15 s. Se noteaz volumul titratului. Titrarea principal. n balonul conic dup ndeprtarea excesului de bisulfit de sodiu se adaug 90 % de volum soluie de 0,01 n iod, care s-a utilizat pentru titrarea de orientare, apoi 15 cm3 de soluie-tampon i termin titrarea cu 0,01 n soluie de iod. Coninutului substanelor carbonilice se calculeaz dup urmtoare formul:

, unde : X coninutul substanelor carbonilice n cm3/100 g; K - coeficientul de corecie a soluiei de iod; V - volumul de 0,01 n soluie de iod pentru titrarea principal a 10 cm3 de filtrat, cm3; 10 coeficientul de recalculare la 0,1 n soluie de iod; W % de umiditate n pine.

108

PRELUCRAREA STATISTIC A DATELOR EXPERIMENTALE

Pentru prelucrarea statistic a datelor experimentale se ndeplinesc urmtoarele calcule: se efectueaz un numr dat de determinri paralele (n) se determin valoarea medie

se gsete devierea (abaterea) se calculeaz devierea standard:

se determin devierea standard relativ: Sr = S/x se calculeaz dispersia: 2 V=S

se determin limita de certitudine a mediei

x , sau x S t Toate rezultatele prelucrrii statistice se introduc n tab.1.

Tabelul 1. Rezultatele finale ale prelucrrii statistice. n x S Sr V x

Calcularea indicilor statistice Valoarea medie. Dac n rezultatul dozrilor directe nu se cunosc erori grave i sistematice, se obine un numr destul de mare de msurri i rezultate, valoarea cea mai probabil a

109

parametrului, care se determin trebuie luat ca media aritmetic, obinut dint-un ir de msurri. Ea se noteaz prin simbolul x: x = (x1 + x2 + x3 + ... + xn)/n = x/n , Unde n este numrul de msurri. Devierea (abaterea). Este diferena dintre variant i valoarea medie. Ea se noteaz prin litera "d": d = (xi-x). Devierea "d" se caracterizeaz prin: d = 0 Devierea standard. Msurrile separate sau rezultatele analizei snt dispersate fa de valoarea medie. Pentru caracteristica statistic a acestei dispersri se folosete devierea standard: d2 S= k unde k este numrul gradelor de libertate, egal cu n-1 Devierea standard relativ. Sr este egal cu devierea standard, mprii la valoarea medie Sr = S/x Dispersia. Devierea standard la ptrat se numete dispersie V= S2. Cu ct e mai mic dispersia cu att e mai mic mprtierea datelor i e mai corect analiza.
S= d2 n(n 1)

Limita de certitudine a mediei - . ntruct determinarea valorii reale a parametrului msurat este imposibil, ne mrginim

cu determinarea limitelor n care ea se include x . Stiudent pentru probabilitatea =0,95. Dac d > 2S, atunci acest rezultat se exclude din rndul variantei, supuse prelucrrii statistice la probabilitatea admis. 110

. se calculeaz dup formul : . = S t , unde t este parametru

BIBLIOGRAFIE
1. .. . .; : 1981. 2. .. .-.; : 1986. 3. . . .. .; : 1986. 4. Kucerenco N.E., Babeniuk Iu.D. . a. Biochimie. - Chiinu; Universitas: 1993. 5. G. Neamu Biochimie alimentar. Bucureti: Editura Cere: 1997. 6. R. Segal R. Biochimia. Galai; Universitatea "Dunre de Jos": 1992. 7. . .. -.; : 1991. 8. ., ., . .-.; : 1975.

111

CONINUTUL
ORGANIZAREA I METODICA EFECTUARII LUCRRILOR DE LABORATOR, REGULILE TEHNICII DE SECIRITATE PENTRU LABORATORUL DE BIOCHIMIE.............................. ..3 Lucrarea 1. DETERMINAREA AZOTULUI TOTAL N PRODUSE VEGETALE(DUP METODA KJELDAHL)..........................................6 Lucrarea 2. DETERMINAREA POTENIOMETRIC A DERIVAILOR FORMOLICI A AMINOACIZILOR......................14 Lucrarea 3. DETERMINAREA AMONIACULUI DUP METODA CONWEI I BAIRN................................................................................21 Lucrarea 4. DETERMINAREA PROTEINELOR N VIN DUP METODA LOURI....................................................................................26 Lucrarea 5. REACIILE DE CULOARE A PROTEINELOR.......................................................................................30 Lucrarea 6. DETERMINAREA FORMEI REDUSE A GLUTATIONULUI (N LEVURI SAU GERMENII CEREALELOR)......................................................................................36 Lucrarea 7. DETERMINAREA ACTIVITII INVERTAZEI N VINURI, SUCURI..................................................................................40 Lucrarea 8. DETERMINAREA ACTIVITII ENZIMEI POLIIFENOLOXIDAZA.........................................................................50 Lucrarea 9. DETERMINAREA ACTIVITII ENZIMEI LACAZA..................................................................................................56 Lucrarea 10. DETERMINAREA ACTIVITII CATALAZEI DUP A. BAH I A.OPARIN.................................................................64 Lucrarea 11. DETERMINAREA PRII DE MAS A AMIDONULUI........................................................................................70 Lucrarea 12. DETERMINAREA FOTOCOLORIMETRIC A VITAMINEI C.........................................................................................77 Lucrarea 13. METODA CROMATOGRAFIC DE DETERMINARE A CAROTENILOR ..................................................87 Lucrarea 14. DETERMINAREA INDICILOR DE CALITATE A LIPIDELOR.............................................................................................95 Lucrarea 15. DETERMINAREA SUBSTANELOR AROMATICE N PINE I ALTE PRODUSE DE PANIFICAIE.......................................................................................106 PRELUCRAREA STATISTIC A DATELOR EXPERIMENTALE.............................................................................109

112

UNIVERSITATEA TEHNIC A MOLDOVEI

BIOCHIMIE
ndrumar de laborator

Chiinu 2007 113