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E.A.

P Farmacia y Bioquímica Curso: Analisis Instrumental

PRÁCTICA NUMERO 02 ESPECTROFOTOMETRIA
I. OBJETIVOS: Determinación cuantitativa de la concentración de una sustancia coloreada, en una muestra problema. • Elaboración de una curva de calibración de los colorantes a utilizar.

II.

FUNDAMENTO TEORICO: La Espectrofotometría se incluye dentro de la Espectroscopia, ciencia que estudia los fenómenos de absorción y de dispersión de la luz. Los espectros pueden ser de: Emisión, cuando los átomos pierden energía radiante, emiten una radiación electromagnética. Absorción: cuando captan energía radiante, aumentan su energía interna. Esta energía que los átomos de una sustancia emiten o absorben constituye una radiación electromagnética o REM. Las radiaciones electromagnéticas tienen doble naturaleza: corpúsculo y de onda: Corpuscular: porque la luz está constituida por pequeñas partículas llamadas fotones. Onda; porque viajan en las tres direcciones del espacio con movimiento ondulatorio. Cada REM lleva una energía asociada que se calcula por la conocida ecuación de Max Planck:

E=h.ν
Donde: E: Energía. h: Constante de Planck = 6,626 x 10-34 Joule seg. ν: Frecuencia de la radiación en seg-1. La frecuencia de la radiación ν es inversamente proporcional a su longitud de onda λ.

ν=C/λ
C=Velocidad de la luz (300 000 Km/seg) Muchos experimentos en bioquímica dependen de la medición de absorción de luz monocromática de una sustancia en solución en la región visible y ultravioleta del espectro electromagnético. Diversos compuestos sean o no coloreados tienen la capacidad de absorber luz de una determinada longitud de onda, pero en otros casos, es necesario transformar la luz en un derivado coloreado usando reactivos apropiados.

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Tanto el color (colorimetría) como la transmitancia (fotometría) de la luz de una solución pueden usarse como medida de su concentración.A.E. b: Espesor de la cubeta (1cm) c: Concentración de la muestra (g/l.34 g/mol Se empezó a usar como indicador químico en 1878. el cual contiene un prisma de dispersión entre la fuente de luz y la muestra para poder seleccionar la longitud de la onda analítica adecuada. Por la fórmula: A = a. En la actualidad se registran muchas aplicaciones desde preparaciones farmacéuticas. mg/ml.1% por cada 10 ml de disolución. aminoácidos. La fórmula molecular de la sal sódica es C14H14N3NaO3S y su peso molecular es de 327. La espectrofotometría consiste en comparar la transmisión de la luz a través de una solución que contiene muestra. μg/ml).1 y 4. Capacidad de una solución para absorber luz. Para realizar las medidas de concentración se utiliza un instrumento llamado ESPECTROFOTOMETRO.b. a: Coeficiente de extinción molar. proteínas y otros. Se usa en una concentración de 1 gota al 0. 2 .c Donde: A: Absorbancia.4.P Farmacia y Bioquímica Curso: Analisis Instrumental Las moléculas de interés biológicos absorben luz en la longitud de onda comprendida entre 200 y 8000 nanómetros (nm). La ley de Lamber – Beer nos manifiesta que la fracción incidencia absorbida por la solución a una determinada longitud de onda esta relacionada con el espesor de la capa absorbente y concentración de la especie que absorbe. ácidos nucleicos. colorante de teñido al 5%. como las purinas. con cambio de color de rojo a naranja-amarillo entre pH 3. y determinante de la alcalinidad del fango en procedimiento petroleros. También se aplica en citología en conjunto con la solución de Fuschin También es llamado heliantina. Anaranjado de metilo Naranja de metilo es un colorante azoderivado.

3 .7-bis (dimetilamino)Nombre químico Cloruro d fenazationio Cloruro de tetrametiltionina Fórmula química C16H18N3ClS Masa molecular 319. cuyo nombre científico es Cloruro de Metilionina. Es un compuesto químico heterocíclico aromático con fórmula molecular: C16H18ClN3S.85 g/mol Número CAS [61-73-4] Número EC 200-515-2 Punto de fusión 100 °C Punto de ebullición Se descompone CN(C)c3ccc2nc1ccc(N(C) SMILES C)cc1[s+]c2c3. es un colorante que se usa para tratar una enfermedad llamada metahemoglobinemia.P Farmacia y Bioquímica Curso: Analisis Instrumental Naranja de metilo (Indicador de pH ) Inferior a pH 3.A.4 Naranja-amarillo Anaranjado de metilo Viraje del Naranja de Metilo Azul de metileno 3.[Cl-] El azul de metileno.E.1 Rojo ↔ Sobre pH 4.

El proceso consiste en aplicar el método de absorción en el espectro visible. 420. Diluir cada uno con 1ml de agua destilada. 500. Procedimiento: a) Establecer el siguiente sistema de tubos de ensayo. Medir a 300. Curva de Calibración para un colorante: El objetivo del presente experimento es poner en evidencia la ley de LambertBeer. 02 pipetas de 2ml. Componentes 1 2 3 4 5 6 4 .P Farmacia y Bioquímica Curso: Analisis Instrumental III.A. 580nm. 460. Se utiliza el método de absorción visible. c) Determinar la longitud de onda analítica de mayor absorbancia. usando las concentraciones progresivas de este colorante y las absorbancia obtenidas mediante el uso del espectrofotómetro. 02 pipetas de 10 ml 02 pipetas pasteur IV. 04 gradillas. 04 varillas de vidrio. 02 probetas de 50ml.E. 360. 540. que considera longitudes de onda comprendidas entre 380 y 700nm. Espectro de Absorción y Longitud de máxima absorción: El presente experimento tiene por objetivo encontrar la curva de un colorante y determinar su longitud de onda analítica en una solución coloreada. Procedimiento: a) En un tubo de ensayo de 10ml de capacidad colocar 2ml de los colorantes anaranjado de metilo y azul de metileno. mediante la construcción de la curva de calibración para el anaranjado de metilo y verde malaquita. 02 fiola de 100ml. b) En otro tubo de ensayo colocar 3ml de agua destilada para calibrar el espectrofotómetro a cero absorbancia. 12 tubos de ensayo pequeños. 02 pipetas de 5ml. PARTE EXPERIMENTAL: 1. MATERIALES Y REACTIVOS: REACTIVOS Anaranjado de metilo Verde malaquita Agua destilada MATERIALES DE LABORATORIO 12 tubos de ensayo grandes. 2. 340.

0 0.A. RESULTADOS: Describir las observaciones realizadas en cada procedimiento. VI. 1 0. anotar los cambios respectivos y esquematizar los resultados.0 6 5. b) Medir la absorbancia de la muestra utilizando la longitud de onda analítica. c) Determinar la concentración de la muestra problema usando la curva de calibración o el factor de calibración.nm 3. Realizar todas las reacciones químicas. Que entiendes por factor de calibración. 3. aminoácidos. nucleótidos. V.E. 7. Que entiendes por coeficiente de extinción molar.0 5.0 1.0 3.0 4. si hubiera.0 5. 8.0 3 2. 4.0 4 3. CONCLUSIONES: VIII. 5 . 2. Cuál es la longitud de onda para las bases nitrogenadas. Formula matemática de factor de calibración.0 2.0 5 4.0 Determinar Concentraciones desconocidas: El objetivo del presente experimento es determinar la concentración de una sustancia desconocida mediante el uso de la curva de calibración y del factor de calibración.0 2. proteínas.0 3. 6. Componentes Concentración del Colorante Absorbancia a …….0 b) Medir la absorbancia de cada uno de los tubos de ensayo contiendo la solución colorante. Qué longitudes de onda podríamos utilizar en la Absorbancia de sustancias no coloreadas como ácidos nucleicos.0 4.0 1. DISCUSIÓN: VII. 5. Explique las desviaciones a la ley de Lambert-Beer Qué es un fotocolorímetro.P Farmacia y Bioquímica Curso: Analisis Instrumental Colorante(10μg/ml) Agua destilada 0. Procedimiento: a) Colocar en un tubo de ensayo 3ml de la muestra problema.0 2 1. CUESTIONARIO: 1. La densidad óptica es igual a la absorbancia.

BIBLIOGRAFIA: Q.F Verónica Amanda Apaza Coronel 6 .P Farmacia y Bioquímica Curso: Analisis Instrumental IX.E.A.