Jurnal Mibobiologi Indonesia, September 2003, hlm.

47-52 ISSNO853-358X

Vol. 8, No. 2

Produksi Massal Sel Rhizobium dengan Teknologi Bioproses

Mass Production of Rhizobium Using Bioprocess Technology
RASTI SARASWATI1', KHASWAR SYAMSV, DWI NINGSM SUSILOWATI1, BADRTYATULLAILA2& RENGGANIS SANTIKAANDHAYANP
'Bnlni Penelitinn Bioteknologi Tnnamnrr Pangan don Sumberdnyn Genetik Pertaninn, Jnlnn TentarnPelnjnr 3A, Bogor 16111 2Jurusnrr Tekuologi Indusfri Pertaninn, Institrit Pertaninn Bogor, Knmpus Dnrmngn, Bogor 16680
Moss Produetioa of Rhizobium Using Bioprocess Tecltnology. Efficient mass production of Rhizobium inoculant has been studied by applying bioprocess technology under laboratory and pilot scale. The mass production of Rhizobiurn strain RIFCBl RIFCB7 has been optimized by batch system under pilot scale with maximum population of 2.5 x 10' sell1 after 48 h and maximum specific growth rate of 0.129 h-' for 0-24 h, while under fed batch system the highest cell number was 2.3 x 109 sell1 after 24 h cultivation with maximum specific growth rate of 0.135 h-' far 0-24 h. The mass production were decreased after 24 h and increased at 78 h to the maximum peak at 102 h with cell number of 1.7 X lo9 cellll. Fed batch system i s much better than batch system due to the continuation of mass production. The addition of fresh medium could increase the cell number.

...

Key words: Rhizobium, bioproses

Suatu sistem teknikproduksi yang unggul diperlukan untuk menghasilkan pupuk mikrob bermutu unggul sesuai perannya yang sangat penting bagi sistem pertanian yang berkelanjutan. Teknikproduksi inokulan Rhizobium yang selama ini dilakukan lebih banyak bersifat skala kecil yang dibesarkan, bukan skala besar yang sebenamya. Produksi massal sel Rhizobium pada skala komersial membutuhkan volume biakan yang besar sehingga diperlukan usaha peningkatan efisiensi biaya produksi. Untuk memperoleh teknik produksi inokulan yang efisien deogan produktivitas tinggi diperlukan teknologi produksi massal dengan fermentor atau teknologi bioproses melalui aplikasi prinsip-prinsip keteknikan mendesain, merekayasa, mengembangkan, dan melakukan analisis prosesproses biologis (Schuler &Kargi 1992).Penelitian aplkasi teknik bioproses masih sangat terbatas pada penggunaan inokulan Rhizobium. Pengalaman di India menunjukkan bahwa di awal 1980-an,inokulan Rhizobium diasilkan dari dalam labu kocok, sehingga jumlah dan mutu hasilnya sangat bumk. Di tahun 1990-an,produksi Rhizobium dilakukan dalam skala besar yang berorientasi padapemilihan galur yang sesuai dengan fermentor ukuran 2000 liter untukpenyiapan inokulum (Alam 1994). Hal yang sama juga dilakukan di Kanada (Stephens 1996, komunikasi pribadi) pada tahun 1994 dengan fermentor ukuran 400 liter. Namun, karenamutu produhya masib tetap bervariasi dan sulit menumnkan tingkat kontaminasi maka diperlukan teknologi yang lebih efisien dengan menggunakan fermentor yang lebih kecil(20 liter). Padaprinsipnya, teknik skalapilot adalahperbesaran skalaproses produksi dari skala laboratorium ke skala dengan volume produksi yang lebih besar dengan penilaian efisiensi yang lebih terinci. Pada tabap ini faktor'Penulis untuk korespondensi, E-mail: rasti@cbn.net.id

Tel. +62-251-338820,

faktor yang tidak begitu diperhatikan sebelurnnya, seperti konsumsi energi, jumlah kehilangan yang diperbolehkan, dan pengaturan tenaga kerja sangat menentukan. Pada akhimya, teknikproduksi skala komersial adalah suatu teknologi proses yang mampu menghasilkan suatu produk yang secara ekonomis layak. Penelitian penggandaan skala dimana kondisi-kondisi optimal mulai diterapkan sangat penting bagi optimasi pertumbuban mikrob dalam fermentor, dengan memasok sumber energi, nutrisi penting untuk memenuhi semua kebutuhan biokatalis, meniadakan komponen penghambat dari media, inokulum yang baik dan kondisi fisika-kimiawi yang optimal. Jenis fermentor yang digunakan dalam penelitian ini adalah fermentor airlift dengan sistem batch (tumpak) dan sistem fed batch (semisinambung). Pada perbanyakan sistem tumpak, media atau substrat dimasukkan ke dalam fermentor, lalu dimokulasi dan dibiarkan teraduk sampai selang waktu tertentu. Pada sistem ini tidak dilakukan penambahan komponen substrat setelab inokulasi bakteri ke dalam media steril di dalam fermentor, kecuali penambahan oksigen steril, anti buih, dan asam atau basa untuk mengatur pH. Laju pertumbuhan mikrob dinyatakan dalam jumlah sel per satuan volume biakan atau dalam konsentrasi biomassa (gram massa sel kering per satuan volume biakan). Secara umum perturnhuban mikrob dalamperbanyakan sistem tumpak terdiri atas beberapa fase, yaitu adaptasi (lag), percepatan, logaritma, perlambatan, stasioner, dan penurunan. Perbanyakan sistem semisinambung,merupakan perbanyakan sistem tumpak yang menggunakan penambaban media secara sinambung dengan aliran seragam sehingga volume biakan bertambah sesuai w a h (Standbury & Whitaker 1984). Selamaperbanyakan, substratyangdiiasukkan ke dalam

48

SARASWATI ETAL

J Mikrobiol lndones

biakan sama dengan substrat yang diionsumsi oleh sel mikrob. Meskipun total biomassa dalam biakan meningkat sesuai dengan waktu, konsentrasi sel tertinggal relatif konstan. Kondisi ini disebut steady state. Pada saat itu, laju pertumbuhan rata-rata akan menurun sesuai dengan peningkatan volume media. Residu substrat akan menurun sesuai dengan penurunan laju pertumbuhan dan mengakibatkan peningkatan konsentrasi sel. Produksi inokulan d i i l a i dengan penyiapan biakan pemula pada agar-agar miring hingga inokulasi ke dalam media perbanyakan sari khamir manitol (SI<M) cair (Somasegaran & Hoben 1994). Hasil perbanyakan ini digunakan sebagai biakan pemula untult volume yang lehih besar di dalam fermentor, umumnya volume yang digunakan ialah 5-10 persen dari volume media cair dalam fermentor. Selamaproses produksi, lcondisi aseptik sangat diperlukan. Kontaminan biasanya mempunyai laju pertumbuhan yang cepat, berhau busuk, dan menimbulkan busa yang banyak. Media tumbuh harus mampu menyediakan sumber energi berupa C dan garam mineral, disamping aerasi menggunakan rotary shaker. Pertumbuhan optimum Rhizobium terjadi pada selang suhu 25-30C dan pH 6.8-7.0. Penelitian ini bertujuan mempelajari kondisi opti~num perbanyakan massal Rhizobiurn hingga diperoleh metode perbanyakan inokulan yangefisien dengan produlctivitas tinggi untuk skalapilotplant (industri).

Penelitian ini terdiri atas skala laboratorium dan skala industri. Penelitian skala laboratorium untuk mendapatkan media dan teknik perbanyakan yang cocok untuk produksi nlassal Rhizobium yang selanjutnya akan digunakan dalaln penelitian slcala industri. Jenis fermentor yang digunakan ialah fermentor airlft dengan sistem tumpak dan sistem semisinambung.Fermentor aid@tidakrnenggunakanpengaduk mekanis, tetapi menggunakan penyembur udara sebagai alat pencampur. Fermentor ini lebih ekouomis dibaudiigkan dengan fe~mentor berpengaduk karena konstruksinya sederhana. Perbanvakan biomassa sel Rhizobium dilakukan dalam dua tabapan. Perbanyakan tahap I untuk menghasilkan biakan pemula. Masing-masing biakan pemula dari agar-agar miring dibiakkan dalam 25 ml media sari bhamir manitol (SKM). Perbanyakan tahap I1 untuk menghasilkan inokulan dilakukan dengan menlbiakkan ketujuh campuran galur Rhizobium umur 24jam dalam 500 ml SIUvl.
Tabel

Galur Rhizobirmr. Pada penelitian skala laboratorium digunakan Rhizobium tumbuh lambat (Bradyrhizobium japonicurn galur RIFCB3) dan pada skala industri digunakan 8 galur Rhizobiurn yang terdiri atas 6 galur Rhizobiurn tumbuh cepat (Sinorhizobizninfiedii galur RIFCB 1, RIFCB2, RlFCB4, RIFCB5, RIFCB6, RIFCB7), dan 2 galur Rhizobitnm tumbuh lambat (Bradyrhizobiunzjaponicum galurRIFCB3 dan RFCB8). Seluruh galur bakteri (Tabel 1) merupakan galur terpilih hasil seleksi terhadap kemampuanuya menamhat N, udara, tahan kondisi tercekam (kemasaman-Al dan kekeringan) (Samswati 1999). Semuagalur Rhizobiurn ditumbuhkanpadamedia agaragar SKM cair (Somasegaran & Hoben 1994). Biakan Pernula. Biakan pemula untuk perbanyakan Rhizobium skala laboratorium ,dibuat dengan cara menginokulasikan satu lup Rhizobium galur RIFCB3 ke dalam duajenis media cair s a i khamir glukosa (SKG) dan SKMmasingmasing sebanyak 50 ml dan meuginkubasilcannya selama 24 jampadainkubator goyangdengan kecepatan goyang antara 100-150 rpm pada suhu ruang 28-30C. Sedangkan bialtan pemula skala industri dibuat dengan menginokulasikan satu lup Rhizobiurn ke dalam 25 mlmedia S I W cair, satu erlenmeyer untuk satu galur Rhizobizrm. Selanjutnya bialcan diinkubasi dengan menggunakan cara yang sama. Perbanyakan Biomassa Sel Rhizobium pada Sltala Laboratorium. Dalam optimasi pertumbuhan Rhizobium digunakan media yang mampu menyediakan sumber energi C, yaitu mediaSKG danmedia SKM, sertamodifiasi mediamanitol bifasik (dua fase). Produksi biomassa sel Rhizobium dilakukan dalam erlenmeyer 1 liter (volume kerja 500 ml) dan fermentor beragitasi 2 liter (volume kerja 1 liter). Volume biakan pemula yangdigunakan 5-1 0% dari volume mediacair dala~n erlenmeyer atau fermentor yang digunakan. Perbanyakan sel Rhizobium dalam erlenmeyer dilakukan dengan menginoltulasikan biakan pernula Ice dalam 500 ml media SI<Gdan SI(M (volume biakan pemula 10% dari volnme media cair dalam erlenmeyer). Selanjutnya bialcan tersebut di inkubasikan pada inkubator goyang dengan kecepatan goyang antara 100-150 rpm pada suhu mang 28-30C selama 24jam. Perbanyakan sel dalam fermentor dilakukan dengan sistem tumpak dan bifasik. Perbanyakan dilakukan dengan menginokulasikan biakan penlula ke dalam 1 liter media SI<M (volume biakan pemula 5% dari volume media cair dalam fermentor) dengan kecepatan agitasi 500 rpm, laju aerasi 0.5 vvm, suhu luang 28-3O0C,danpH 6.8-7.0.

I. Ciri marfologi galer yang digonakm pada media sari khamir manitol (SKM) yang mengandung brom timol

biru

RIFCB4 RIFCBS RIFCB6

S. fieedii S. fieedii S fieedii

G 1

I 1 I 6

Biru Kuning Kuning

Ronine Kuning Biru

1.5 3 7 4
17
1.5

Cembung, berlendir Datar, berair Sedikit cernbung, berair Datar, berair Dstar, berair Ccmbung, kering

Licin

Tidak rafa
Licin Licin Licin Licin

Besar berlendir Besar berair Besar bcrair Berar bcrair Besar berair ICccil kering

J Mikrobiol lndones 49 Produksi Biomassa Sel Rhizobium pada Skala Industri. Perbanyakan galur ganda Rhizobium dengan sistem semisinambung dilakukan dalam fermentor 30 liter dengan volume kerja terpakai 10 liter. Kondisi perbanyakan dengan sistem ini meliputi aerasi dengan laju alir 1-2 literudaralmenit, suhu mang 28-30QC,dan tekanan udara dalam fermentor 0 psi serta tidak diberikan kontrol pH. Udara dialirkau melalui filter steril dan dikeluarkan melalui saluran udara keluar yang dilengkapi dengan filter juga. Penelitian ini dilakukan dengan tiga metode perbanyakan, yaitu perbanyakan menggunakan sistem tumpak untuk galur RIFCB1, RIFCB2, RIFCB3, RIFCB4, RIFCBS, RIFCB6, RIFCB7 (FUFCBI ... RIFCB7) dan campuran galur yang sama dengan tambaban galur RIFCB8, serta sistem semisinambung untuk galur RIFCB1 ...RIFCB7. Perbanyakannya dilakukan dalam fermentor aid$ denganvolume kerja 10 liter. GalurRhizobium yang diperbanyakdalam fermentor dengan sistem tumpak dilakukan dengan menginokulasikan sebanyak 50 ml inokulan campuran ke dalam 500 ml media SKM dalam erlenmeyer sebagai biakan pemula. Biakan diinkubasi pada inkubator goyang dengan kecepatan goyang 100-150 rpm dan suhu mang 28-30C selama 24 jam. Selanjutnya biakan pemula diinokulasikan ke dalam 9.5 liter media SKM (volume biakan pemula 5% dari volume media cair dalam fermentor). Aerasi dilakukan dengan memompakan udara steril dengan laju 1-2 literlmenit. Suhu dalam fermentor dipertabankanpada suhu ruang 28-30C dan pH awal diatur pada tingkat pH netral (6.8-7.0). Inkubasi dilakukan selamaenam hari danpengambilan contoh untuk pengamatan dilakukan secara aseptik setiap 24jam. Perbanyakan galur ganda Rhizobium pada fermentor dengan sistem semisinambung dilakukan dengan mengalirkan media segar pada saat pertumbuban sel berada pada akhir fase eksponensial. Pada awalnya fermentor berisi 5 liter media segar dan diinokulasi dengan 5% (vlv) biakan pemula. Setelahpertumbuban 24 jam, fermentor dialiri 5 liter media segar dengan laju alir yang lebih kecil dari pada laju pertumbuban spesifik maksimunmya, yaitu 150 mWjam. Galur yang digunakan berdasarkan pada hasil sistem tumpak yang paling baik. Pengaliran media menggunakan pompa peristaltik. 1nk;basi dilakukan selama enam hari dan pengambilan contob untuk pengamatan dilakukan secara aseptik pada 30, 54, 78, 102,126, dan 150jam. Pengarnatan. Peubah yang diukur ialah biomassa sel dan pH media. Contoh yang diambil langsung diukur pH-nya. Penghitungan jumlah sel dilakukan dengan menggunakan metode pengenceran serial dan cawan tuang. Penghitungan jumlah sel dilakukan setelah 1-3 hari dari waktu inkubasi dan penghitungan kinetika pertumbuhan (laju pertumbuban spesifik maksimum) dilakukan berdasarkau pada hasil pengukuran jumlah sel. maksimum (pmats) yang diperoleh ialab sebesar 0.12/jam, sedangkan hasil biomassa tertinggi hanyalah sebesar 11.70 1 mgil yang dicapai pada jam ke-96 (data tidak disajikan). Persentase penggunaan substrat pada saat konsentrasi sel mencapai maksimum ialah 54%. Rendemen tertinggi yang mempakan efisiensi konversi substrat menjadi biomassa ialah 0.005 mg seWmg substrat. Glukosa tampaknya kurang cocok digunakan sebagai sumber karbon untuk produksi biomassa Bradyrhizobium. Perbanyakan sel galur RIFCB3 pada erlenmeyer goyang dalam media SKM menunjukkan bahwa biomassa sel tertinggi dicapai pada jam ke-96, yaitu sebesar 190.9 mgli (data tidak disajikan). Hasil ini 16 kali lebih baik daripada hasil yang diperoleh pada perbanyakan dalam erlenmeyer goyang dengan menggunakan media SKG. Kinetika pertumbuhan, laju pertumbuhan spesifik maksimum, persentase penggunaan substrat dan efisiensi konversi substrat menjadi biomassa b e r t ~ m t - t u ialah sebesar 0.12/jam, 61%, dan 0.14 mgseVmg ~t substrat. Perbanyakan sel galur W C B 3 pada fermentor dalam media SKM menunjukkan bahwa biomassa sel tertinggi dicapai pada jam ke-96, sebesar462 mgll atau 2.4 kali lebih tinggi daripada hasil tertinggi yang diperoleh dengan perbanyakan dalam erlenmeyer. Persentase substrat yang digunakan ialab 73.6% dan nilai ini jauh lebib tinggi daripada di erlenmeyer goyang, tetapi efisiensipenggunaan substrat menjadi biomassa (0.12 mg seWmg substrat) sedikit lebih rendah daripada di erlenmeyer goyang. Laju pertumbuban spesifik maksimum yang dapat dicapai dengan metode ini ialah sebesar 0.13ljam. Peroleban biomassa sel menumn setelah mencapai angka tertinggi pada jam ke-96 karena kelangkaan oksigen untuk pertumbuhan. Perbanyakan Set Rhizobiumpada Skalalndustri. Jumlah sel Rhizobium setiap galur pada media perbanyakan tabap I telab mencapai lo8-109sel/ml, kecuali RIFCB-3 (lo7seYml) dan RIFCB-8 (lo6seWml) (Tabel 2). Perbedaanjumlab sel disebabkan oleh genusnya, 6 galur Sinorhizobium dan 2 galur Bradyrhizobium. Pertumbuhan fase lag tidak terlibatpada perbanyakan galur Rhizobium (RIFCBI ... RIFCB7) dengan sistemturnpak. Ketika sel bakteri diinokulasikan ke dalam fermentor, jumlahnya mencapai 7.9 x lo8sellml dan kondisi pertumbubannya masih berada pada fase eksponensial (Gambar 1). Fase eksponensial terjadi antarajam ke-0 sampaijam ke-24, dengan laju pertumbuhan spesifik maksimum sebesar 0.129ljam dan jumlah sel2.5 x lo9 sellml dicapai pada jam
Tahel 2. Jumlah sel beberapa galu Rhimbiur biakan pemula dalam umur 24 iam media sari khamir rnanitol ~ a d a Galur Rlrizobiunr RIFCB-I RIFCB-2 RIFCB-3* RIFCB-4 RIFCBJ RIFCB-6 RIFCB-7 RTFCB-8* Jumlah sellml 2.5 x 10' 2.0 x lo1 2.7 X 10' 4.8 X 10' 4.1 x lo8 2.7 x loP 1.9 x 10' 8.0 x lo6

Perbaoyakan Sel Rhizobirrrrr pada Skala Laboratorium. Perbanyakan sel galur FUFCB3 pada erlenmeyer goyang dalam media SKG menunjukkan bahwa laju pertumbuhan spesifik

50

SARASWATI ETAL

J Mikrobiol Indones

ke-48. Setelahjam ke-48, pertumbuhan bakteri memasuki fase kematian. Kontrol pH banya dilakukanpadaawalkultivasi,yaitu dengan mengondisikan pH media segar 6.5-7.0, tetapi sesaat setelah media diinokulasi pH-nya tunm sampai 4.3 1 (Gambar 2). SelanjutnyapHmenm sampaijam ke-96 dan naik kembali sampaijam ke- 144,namun Nlai pH masih kurang dari 6. Jumlab sel galurgandapadajam ke-120 ialah 1 x los s e h l (datatidak disajikan), tetapi tidak diketahui bakteri mana yang jumlahnya lebih banyak. Penamhahan RIFCB8 ke dalam biakan ganda Rhizobium dengan sistem tumpakmenumnkan Iaju perhmbuhan spesifik maksimum dan jumlah sel. Laju pertumbuhan spesifik maksimumnya menjadi 0.077/jam dan jumlah sel maksimum 1.7 x 109seVmlyangdicapai pada jam ke-72 (Gambar3). Nilai pH media (Gambar 4) sesaat setelah media diimokulasi menunjukkan 5.32. Nilai ini terus menurun sampai jam ke-72 dan b m meningkat setelahjam ke-96, namunpeningkatannya tidak terlalu besar.

Jumlah sel maksimum yang dihasilkan dalamperbanyakan galur Rhizobiu~n(RIFCBI ... RIFCB7) dengan sistem semisinambung ialah 2.3 x lo9sel/l padajam ke-24 dan setelah dialiri media segar,jumlah sel tampak menurun dan kemudian bertambah lagi setelahjam ke-78 sampai pada puncaknya jam ke-102 dengan jumlab sel 1.7 x lo9 self1 (Gambar 5). Laju pertumbuhan spesifk maksimum yang dicapai ialah 0.135/jam lebih tinggi daripada dengan sistem tumpak. Nilai pH media tidak banyak berbeda dengan teknikperbanyakan sebelumnya. Sesaat setelah media diiiokulasipH terukurmenunjukkan 5.62. Nilai iN terus menurun sampaijam ke-102 dan baru meningkat setelah jam ke-126, namunpeningkatannya tidak terlalu besar.

7.0

4
0 24 48

~j

72 96 120 144 Waktu (jam) Gambar 1 . Pertumbuhan Rhizobium (RIFCBI RIFCB7) pada perbanyakan sistem tumpak.

...

Perbanyakan Sel Rhizobium pada Skala Laboratorium. Biakan pemula yang digunakan dalam penelitian ialah h a d pertumbuhan pada jam ke-24 sampaijam ke-48. Pertumbuhan Rhizobium meningkat 2 kali lipat darijam ke-0 sampai dengan jam ke-24, meskipun pada selang waktu tersebut pertumbuhan sel masih berada pada fase adaptasi dan pada selang waktu antara 24 jam sampai 72jam, pertumbuhan sel beradapada fase eksponensial. Pertumbuhan Rhizobium pada media dengan sumber karbon glukosa dalam erlenmeyer goyang relatif lambat dan kurang efisien. Tampaknyajenis sumber karbon glukosakurang cocok uutuk produksi biomassa Bradyrhizobium. Lambatnya pertumbuhan serta sedikitnya biomassa yang terbentuk mengakibatkan banyaknya substrat yang tersisa pada akhir perbanyakan. Pada skala industri, ha1 ini tidak menguntungkan danjuga menimbulkan dampak negatif pada lingkungan apabila sisa substrat akan dibuang ke lingkungan. Nilai rendemen tertinggi, yaitu 0.005 mg seVmg substrat menunjukkan bahwa banya sebagian kecil dari substrat yang digunakan untuk

-0
48 72 96 120 144 Waktu (jam) Gambar 2 . Perubahan pH media perbanyakan sel Rhizobium (RIFCBI ... RIFCB7).

24

24

48 72 9 6 Waktu (jam)

120

144

Gambar 4 . Perubahan pH media perbanyakan sistem tumpak (RIFCBI RIFCB8).

...

Waktu (jam) Gambar 3. Pertumbuhan Rhizobium (RIFCBI perbanyakan sistem tumpak.

... RIFCB8)

pada

24 30 4 2 54 6 6 7 8 90 102114126138150 Waktu (jam) Gambar 5. Pertumbuhan Rhizobium (RIFCBI ... RIFCB7) pada perbanyakan sistem semisinambung. 0

Vol. 8,2003 produksi biomassa, sebagian besar substrat digunakan untuk menghasilkan produk lain dan pemeliharaan sel karena suplai oksigen pada perbanyakan dalam erlenmeyer h a n g mencukupi untuk pertumbuhan. Apabila oksigen yang terdapat pada mang kosong dalan erlenmeyer sudah semakin berkurang, maka suasana pertumbuhan menjadi semakin tidak menguntungkan. Suasana kekurangan oksigen akan mengurangi produksi energi untuk pertumbuhan sekaligus mengaliian alokasi penggunaan substrat untuk pemeliharaan sel dan pembentukan produk sehingga mengurangi produksi biomassa. Produksi biomassa dalam erlenmeyer goyang menggunakan sumber karbon manitol lebih baik 16 kali daripada glukosa. Meskipun kecepatan pertumbuhan lambat, tetapi secara umum media SKM sebagai sumber karbon jauh lebih baik daripada media SKG dari segi jumlah biomassa yang dihasilkan, persentase substrat yang digunakan, maupun efisiensi penggunaan substrat untuk pembentukan biomassa. Pertumbuhan Rhizobium dalam fermentor lebih cepat daripada erlenmeyer goyang. Suplai oksigen tidak sinambung di dalam erlenmeyer goyang menumnkan produksi biomassa. Oksigen mempakan syarat mutlak untuk pertumbuhan mikrob aerob. Oksigen yang semakin langka tidak hanya mengurangi pertumbuhan, tetapi juga mengakibatkan kematik sei. Penggunaan fermentor beragitasi dengan oksigen yang disuplai secara sinambung melalui pompaperistaltikmemberiaerasi lebih baik daripada erlenmeyer goyang. Pada waktu yang cukup panjang, ketersediaan oksigen dalam ruang kosong akan semakin berkurang. Namun, ha1 ini tidak berpengamh apabila biomassa yang dihasilkan tidak banyak, tetapi jika biomassa yang dihasilkan semakin banyak, seperti pertumbuhan pada media SKM, ketersediaan oksigen mempakan salah satu faktor pembatas untuk mencapai hasil yang lebih tinggi lagi. Apabila oksigen yang sebelunmya menjadi faktor pembatas telah mencukupi, maka faktor pembatasnya ialah ketersediaan substrat dan atau terbentuknya produk lain yang mungkin bersifat racun bagi sel. Bila kecenderungan penumnan konsentrasi substrat dicemati, maka terlihat semakin lama substrat yang tersedia semakin habis. Apabila substrat yang tersedia tidak mencukupi lagi, maka sel akan mati. Sel yang mati biasanya akan mengalami h i s dan digunakan oleh sel-sel yang masib hidup sehingga jumlab sel total di dalam fermentor akan berkurang. Pada penelitian ini produksi biomassa menumn setelah mencapai hasil maksimum pada jam ke-96, karena sebagian substrat dikonversi menjadi produk lain yang tidak menjadi perhatian pada penelitian ini. Untuk mengatasi permasalahan ini, substrat cadangan perlu disediakan yang disuplai secara sinambung dari luar dengan sistemperbanyakan semisinambung. Perbanyakan sel RI~izobitiwpada Skala Industri. Pertumbuhan sel Rhizobium dengan sistem tumpak mulai memasuki fase kematianpadajam ke-48. Pada fase ini aktivitas bakteri menumn karena ketersediaan nutrien dalam media berkurang. Adanya persaingan antara bakteri satu dengan lainnya menyebabkan terjadinya kematian pada sebagian bakteri. Kondisi lingkungan sebamsnya diupayakan agar mendekati kondisi lingkungan Rhizobium ketika diinokulasikan ke alam. Faktor lingkungan seperti pH akah sangat bergantung

J Mikrobiol Indones

51

pada tujuan percobaan yang dilakukan. Apabila biomassa sel yang diproduksi ditujukan untuk tanah masam, maka produksinya dapat dikondisikan pada suasana masam atau bakteri h m s mampu beradaptasi dengan keadaan tersebut. Pada penelitian ini, kontrol pH banya dilakukan pada awal kultivasi. Rendahnya nilai pH ini disebabkan reaksi asam yang galur RIFCBl, RIFCB2, dihasilkan oleh genus Sinorhizobiu~n RIFCB4, RIFCB5, RIFCB6, dan RIFCB7 relatif lebih besar dibandingkan dengan jumlah senyawa penyebab reaksi alkali yang dihasilkan oleh Bradyrhizobium galur RIFCB3. Namun, bakteri masih dapat bertahan hidup dan kinerja bakteri meningkat meski pH-nya masih kurang dari 6. Menumt Cunningham dan Munns (1984) eksopolisakharida yang dihasilkan oleh Rhizobium berfungsi meningkatkan pH dan melindungi sel bakteri dari kondisi masam-Al, serta mengkelat ion A13+dan Mn2+.Dalam keadaan masam seperti ini galur Rhizobium uji masib dapat tumbuh dengan baik dan mencapai 1 x 108sel/mlpadajam ke-120, meskipun tidak diietahui bakteri mana yangjumlahnya lebih banyak. Penambahan galur RIFCB8 pada perbanyakan dengan sistem tumpak menumnkan populasi sel maksimum dan laju pertumbuhan spesifik maksimum. Perbanyakan galur Rhizobium (RECB1 ...RIFCB7) dengan sistem semisinambung dengan jumlah dan jenis substrat yang sama menunjukkan bahwa biomassa atau populasi sel yang dihasilkan lebih tinggi daripada sistem tumpak. Perbanyakan dengan sistem ini dirancang dengan pengaliran substrat ketika pertumbuhan sel Rhizobium berada pada puncak fase eksponensial untuk mendapatkan sumber energi barn untuk pertumbuhannya. Penambahan substrat barn menumnkan konsentrasi sel per ml biakan karena laju alir penambahan substrat bam lebib besar daripada kemampuan sel dalam menggunakan substrat barn sehingga mengakibatkan efek pengenceran biakan, walaupun mungkin secara total jumlah sel dalam fermentor meningkat. Perbandingan Metode Perbanyakan. Berdasarkan perbandingan ketiga metode perbanyakan, sistem tumpak biakan ganda RIFCB 1 ...RIFCB7 dan RIFCBl ... RIFCB8, dan sistem semisinambung RIFCBl ... RIFCB7 terhadap laju pertumbuhan spesifik maksimum selama masa inkubasi, maka laju pertumbuhan spesifik maksimum tertinggi ialah perbanyakan sel Rhizobium dengan sistem semisinambung RIFCB1 ... RIFCB7 (0.135ljam) dengan waktu pencapaian tercepat ialah 24 jam, dan terendah dengan sistem tumpak RIFCBl ... RIFCB7 (0.077/jam) dengan waktu pencapaian 72 jam. Nilai p umumnya berbanding lurus dengan peningkatan jumlah mikroorganisme yang dihasilkan dalam k u m waktu tertentu. Jumlah sel mikroorganisme mempakan peubah mikrobiologi bagi pertumbuhan dan kualitas biakan. Semakin tinggi jumlah sel bakteri dalam biakan, maka peluang bakteri untuk dapat bersaing dengan bakteri lainjuga lebih tinggi. Panen inokulan pada ketiga metode perbanyakan dapat dilakukan setelah biakan b e m u r 24jam denganjumlah sel maksimum 10' sel/ml, meskipun pencapaian jumlah maksimum sel ketiganya berbeda. Tingkat populasi yang diperoleh ini dianggap memenuhi kebutuhan, temtama ketika dipakai pada bahan pembawa yang tidak steril (Somasegaran & Hoben 1994).

52

SARASWATI ETAL.

J Mikrobiol Indones

Laju pertumbuhan spesifk maksimum tertinggi diperoleh pada metode perbanyakan dengan sistem semisinambung. Fenomena yang tejadi pada sistem ini merupakan penemuan yang dapat dimanfaatkan untuk efektivitas produksi massal sel Rhizobium pada skala industri. Pada sistem ini panen dapat dilakukan lebih dari satu kali dalam setiap periode produksi pada tingkat populasi sel lo9 sel/ml. Sistem ini merupakan alteruatif baru bilamana pabrik inokulan Rhizobium menginginkan produksi mikrob dengan skala lebih besar dan terus-menerus. Namun, perlu juga dipertimbangkan beberapa ha1 seperti sumber daya manusia yangmemadai. Laboran hams dapat bekerja dengan baik, karena kontaminasi yang menyebabkan kegagalan produksi dapat terjadi pada saat mengalirkan subsrat segar ke dalam fermentor saat kultur sebelurnnya selesai di panen. Bila berdasarkan pertimbangan bahwa pesanan inokulan Rhizobium tidak terus-menerus karena penggunaannya bergantung pada musim tanam kedelai maka lebih baik menggunakan perbanyakan sistem tumpak. Pada oeuelitian ini. fase ada~tasi tidak terlihat vada kuwa purtumhuhan. Baktcr~dcngan cepat mulampaui f a x adaprasi sesaat setelah inokulasi dilakukan. Hal ini discbnbkan oleh media propagasi yang sama deugan media produksi sehingga bakteri dengan cepat beradaptasi dan mengatur sistem molekulemya pada lingkungan yang barn Ketika bakteri berada pada fase eksponensial dalam kultur propagasi, maka dengan cepat bakteri melakukan reproduksi sel. Dalam keadaan tersebut jumlah bakteri pada media baru mash sedikit, sementara oksigen dan sumber makananmasih tersediadalamjumlah berlebih sehiigga dalam waktu 24 jam reproduksi sel meningkat secara drastis.
~ ~~~ ~

Laju pertumbuhan spesifik maksimum tejadi pada jam ini. Kecepatan dalam melampaui fase adaptasidan mencapai tingkat populasi maksimum merupakan salah satu kriteria dalam meneutukan metode atau teknik terbaik, terutama bagi industri yang terkait dengan masalab efisiensi. Dari penelitian ini dapat disimpulkan babwa metode perbanyakan Rhizobium sistem tumpak dengan menggunakan media sari khamir manitol ialah yang terbaik dibandingkan dengan sari khamir glukosa. Penggunaan metode perbanyakan sistem semi sinamhung merupakan altematif baru bilamana pabrikmenginginkan produksi mikrob dengan skala lebih besar dan terus-menerus. Namun demikian, berdasarkan beberapa pertimbangan bilamana sumber daya manusia belum memadai dan kebutuhan inokulan yaug tidak terus-menerus, maka perhanyakannya cukup menggunakan sistem tumpak. DAFTARPUSTAKA
Alam G. 1994. Biotechnology and sustainable agriculture: Lessons from India. Tech. Paper No. 103. OECD Dev. Ctr., Paris. Cunningham DS, Mums DN. 1984. The canelation between extracellular polysaecharides production and acid tolerance in Rhiiobiltm. Soil Sci Soe Biochem 48:1273-1276. Saraswati R. 1999. Teknologi Pupuk Mikrob Multiguna Menunjang Keberlanjutan Sistem Produksi Kedelai. J Mikrobiol Indon 4:l-9. Schuler ML, Kargi F. 1992. Bioprocess Engineering Basic Concepts. New Jersey: Prentiee Hall. Somasegaran P, Hoben HJ. 1994. Handbook for Rhiiobia. Mefhods in Legume-Rhirobio Technology. New York: Springer-Verlag. Standbury PF, Whitaker A . 1984. Principles o Fermeufarion f Tecbtrology. New York: Pergamon PI.