Laporan Praktikum Evaluasi Biologis Komponen Pangan

PENENTUAN DAYA CERNA PROTEIN IN VITRO SECARA KUALITATIF DAN KUANTITATIF
Dr. Ir. Endang Prangdimurti, M.Si
1) 2) 1)

dan

2)

PJP Praktikum Asisten Praktikum

Kelompok/Golongan: A/1 Nur Anisa Utami (F24050090), Siyam Suseno. (F24050340), Suhendri (F24051879), Asep Suparman (F24051454), Nina NUrmayanti (F24052308)

PENDAHULUAN 1) Latar Belakang Protein merupakan suatu zat makanan yang amat penting bagi tubuh, karena zat ini berfungsi sebagai zat pembangun dan pengatur. Protein adalah sumber asam-asam amino yang mengandung unsur-unsur C, H, O, dan N yang tidak dimiliki oleh lemak atau karbohidrat (Damodaran, 1996). Protein dalam tubuh manusia terdapat terutama dalam sel jaringan, bertindak sebagai bahan membran sel, dapat membentuk jaringan pengikat misalnya kolagen dan elastin, serta membentuk protein yang inert seperti rambut dan kuku. Di samping itu protein dapat bekerja sebagai enzim, bertindak sebagai bagian sel yang bergerak (protein otot). Kekurangan protein dalam waktu lama dapat menggangu berbagai proses dalam tubuh dan menurunkan daya tahan tubuh terhadap penyakit. Protein dalam bahan makanan yang dikonsumsi manusia akan diserap oleh usus dalam bentuk asam amino. Diperkirakan sebanyak 70 gram protein dari badan masuk ke dalam saluran pencernaan bersama 30-80 gram protein yang masuk melalui bahan makanan yang dikonsumsi setiap harinya. Di pihak lain, dalam jumlah yang sedikit protein juga keluar bersama feses dan diperkirakan protein yang keluar bersama feses tidak lebih dari 10 gram

per hari. Dari data tersebut dapat dipahami bahwa badan manusia ternyata sangat efisien dalam mengolah protein yang tidak berfungsi lagi (Aykroyd dan Doughty, 1964 ). Di dalam tubuh manusia terjadi suatu siklus protein, artinya protein dipecah menjadi komponen-komponen yang lebih kecil yaitu asam amino dan atau peptida. Istilah daya cerna protein dikenal sebagai kemampuan suatu protein untuk dihidrolisis menjadi asamasam amino oleh enzim-enzim pencernaan. Protein dihidrolisis oleh enzimenzim protease pencernaan (tripsin, kimotripsin, peptidase) menjadi asamasam amino penyusunnya. Semakin tinggi daya cerna suatu protein ditunjukkan oleh semakin banyaknya asam amino yang dihasilkan dalam waktu tertentu. Banyaknya asam amino yang dihasilkan dapat diukur secara spektrofotometri, baik secara langsung pada 280 nm menggunakan spektrofotometer UV atau dengan spektrofotometer visible setelah direaksikan atau diwarnai terlebih dahulu dengan pereaksi Folin. Daya cerna protein sampel dihitung relatif terhadap protein murni (kasein). Secara kualitatif, daya cerna protein juga dapat dilihat dari besarnya penurunan pH akibat pelepasan ion-ion hidrogen selama hidrolisis protein. 2) Tujuan

Praktikum ini bertujuan menentukan daya cerna protein secara in vitro yang bersifat kuantitatif dengan metode spektrofotometri dan kualitatif dengan mengamati perubahan pH dari sampel kasein oven, ISP, ISP oven, tepung kedelai, tepung kedelai oven dan dengan kasein sebagai kontrolnya. BAHAN DAN METODE 1) Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan sebagai sampel uji adalah kasein, kasein oven, tepung kedelai mentah (varietas likal/ RRC), tepung kedelai oven (varietas lokal/ RRC), isolate soy protein mentah, dan isolate soy protein oven. Sampel yang digunakan sebagai kontrol adalah kasein. Bahan-bahan yang digunakan sebagai reagent pereaksi adalah aquades pH 8.0, larutan enzim protease (1.6 mg tripsin, 3.1 mg kimotripsin dan 4.0 mg pankreatin dalam 1.0 ml aquades pH 8.0), TCA 0.1 M, dan pereaksi folin (30 ml folin dilaritkan dalam 60 ml aquades). Alat-alat yang digunakan adalah neraca analitik, sudip, tabung reaksi, gelas piala, pipet volumetrik, pengaduk/vortex, pH-meter, inkubator water bath, sentrifuse, dan spektrofotometer UV-VIS. 2) Metode Diambil sebanyak 1.5 gram sampel uji dimasukkan dalam tabung reaksi dan ditambahkan 30 ml aquades pH 8.0, lalu diaduk/divortex. Sisa campuran dipisahakan untuk diukur daya cerna proteinnya secara kualitatif berdasarkan penurunan pH menggunakan pH-meter. Selanjutnya diambil 10 ml suspensi sampel secara homogen (duplo) dan ditambahkan 1.0 ml larutan enzim, kemudian diinkubasi pada suhu 37C selama 10 menit tepat. Selanjutnya diambil 2.0 ml suspensi sampel secara homogen dan ditambahkan 4.0 ml TCA 0.1 M, lalu divortex, kemudian disentrifus pada kecepatan 3500 rpm selama 10 menit. Sisa cempuran diukur pHnya sesegera mungkin. Daya cerna protein diperoleh dari selisih pH dengan

campuran awal. Selanjutnya diambil 1.5 supernatan, ditambah 5.0 ml Na2CO3, ditambah 1.0 ml pereaksi folin dan diamkan pada suhu 37C selama 20 menit. Setelah itu diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 578 nm. Sebagai blanko digunakan larutan dengan perlakuan seperti di atas, tetepi larutan enzim diganti dengan aquades. Perhitungan: Daya cerna relatif = (A sampel-A blanko sampel) X100% (A kontrol-A blanko kontro) HASIL DAN PEMBAHASAN Menurut Suhardjo dan Kusharto (1992) proses daya cerna terhadap protein dimulai dengan perombakkan terhadap ikatan peptida yang terjadi di dalam lambung dengan menggunakan media yang asam dari cairan lambung.. Cairan lambung menghasilkan “proteinsplitting enzyme”, yaitu pepsin (gastric protease) yang bekerja merombak ikatan peptida protein menjadi asam amino yang lebih pendek disebut pepton. Dari lambung, protein yang sudah dicerna akan masuk ke dalam usus, dimana media yang asam sudah dinetralisir menjadi sedikit alkalis. Cairan pankreas menghasilkan dua macam “proteinsplitting enzyme”, yaitu enzim tripsin dan kimotripsin (pancreatic protease), dimana 30% dari protein dirombak menjadi asam amino sederhana dan langsung diserap usus, sedangkan 70% protein dipecah menjadi dipeptida, tripeptida atau terdiri atas lebih dari tiga asam amino. Beberapa faktor yang dapat mempengaruhi daya cerna suatu protein, misalnya aseli (natove) dari kacangkacangan lebih sulit dicerna daripada yang sudah mengalami denaturasi oleh panas, faktor-faktor anti-nutrisi yang dapat menurunkan daya cerna suatu protein, terjadinya reaksi antara asam amino dengan komponen lain juga dapat mempengaruhi daya cerna protein (Muchtadi, Deddy, 1989). Selain itu,

daya cerna protein juga dipengaruhi oleh konformasi protein, ikatan antara protein dengan metal, lipid, asam nukleat, selulosa atau polisakarida lainnya, ukuran dan luas permukaan partikel protein, dan pengaruh proses panas atau perlakuan dengan alkali. Dalam praktikum penentuan daya cerna protein ini dilakukan dengan metode penetapan daya cerna protein secara in vitro baik secara kuantitatif maupun kualitatif. Metode kuantitatif didasarkan pada perbandingan antara jumlah nitrogen yang dikonsumsi dikurangi dengan jumlah nitrogen dalam feses (yaitu jumlah nitrogen yang diserap) dengan jumlah nitrogen yang dikonsumsi. Sedangkan secara kualitatif didasarkan pada kenyataan bahwa bila suatu protein dihidrolisis oleh enzim protease, maka akan dilepas sejumlah ion-ion hidrogen sehingga akan menurunkan nilai pH larutan. (Muchtadi, Deddy, 1989). Dalam praktikum ini sampel dibuat dalam bentuk tepung bertujuan agar protein yang terdapat dalam sampel dapat bereaksi sempurna dengan enzim proteolitik karena luas permukaan kontak dengan enzim menjadi lebih besar. Kondisi pH larutan juga dibuat sekitar pH 8.0 bertujuan untuk mendapatkan aktivitas enzim tripsin yang maksimum, karena pH tersebut merupakan pH optimum untuk aktivitas enzim tripsin. Setelah pengkondisian pH optimum enzim, kemudian dilakukan inkubasi pada suhu 37C selama 5 menit. Tujuan dari inkubasi ini adalah untuk mengkondisikan suhu sample, dimana suhu ini merupakan suhu yang optimal untuk aktivitas enzim. Enzim yang digunakan adalah campuran tripsin, kimitripsin, dan pankreatin. Selanjutnya dilakukan analisis secara kuantitatif dengan menggunakan metode spektrofotometri pada λ = 578 nm. Pada metode spektrofotometri digunakan TCA untuk mengendapkan senyawa non asam amino, folin untuk mewarnai larutan, Na2CO3 dan lain-lain.

Berdasarkan hasil percobaan secara kuntitatif dengan spektrofotometer diperoleh hasil sebagai berikut: Tabel 1. Daya cerna protein relative terhadap kasein Sampe A A Selisi DC l blank samp h A rela o el tif (%) Kasein -0.30 2.00 2.30 100 (kontr .00 ol) Kasein 0.16 1.96 1.80 78. oven 26 Tepun 1.32 1.42 0.10 4.3 g 5 kedelai menta h Tepun 0.00 0.13 0.13 5.5 g 6 kedelai oven ISP 0.00 1.40 1.40 60. menta 87 h ISP 0.88 1.85 0.97 42. oven 17 Hasil tersebut menunjukkan daya cerna sampel kasein oven (78.26%) lebih rendah daripada sampel kasein kontrol (100.00%). Daya cerna sampel tepung kedelai oven (5.56%) lebih tinggi daripada tepung kedelai mentah (4.35%). Sedangkan daya cerna ISP oven (42.17%) lebih rendah daripada ISP mentah (60.87%). Hasil ini ada yang sesuai dengan teori, namun ada juga yang tidak sesuai dengan teori. Sampel tepung kedelai sesuai dengan teori, sedangkan sampel kasein dan ISP tidak sesuai dengan teori. Seharusnya kasein oven memiliki daya cerna lebih tinggi dari kasein mentah, karena kasein oven telah mengalami perlakuan pemanasan sehingga protein terdenaturasi. Denaturasi protein adalah keadaan protein mengalami perubahan struktur tiga dimensinya (kuarterner, tersier, dan sekunder) menjadi struktur primer. Selain itu, perlakuan panas dapat

menghilangkan senyawa-senyawa antinutrisi yang ada dalam bahan pangan tersebut. Terdenaturasi protein menyebabkan daya ikat air oleh protein menurun. Energi panas akan mengakibatkan terputusnya interaksi non-kovalen yang ada pada struktur alami protein tapi tidak memutuskan ikatan kovalennya yang berupa ikatan peptida. Proses ini biasanya berlangsung pada kisaran suhu yang sempit (Ophart, 2003). Seharusny ISP oven juga memiliki daya cerna lebih tinggi daripasa ISP mentah. Alasannya sama seperti kasein. Muchtadi (1989) menyatakan bahwa protein yang mudah dicerna berarti protein tersebut cepat melepaskan ion-ion hidrogen yang diindikasikan melalui penurunan pH yang lebih cepat dalam kurun waktu tertentu, serta mudah diserap oleh tubuh. Sebaliknya protein yang sukar dicerna berarti jumlah asam-asam amino yang diserap dan digunakan oleh tubuh rendah karena sebagian besar dibuang melalui feses. Berdasar teori inilah daya cerna protein juga dapat ditentukan secara kualitatif berdasarkan penurunan pH. Penetapan daya cerna protein yang bersifat kualitatif adalah dengan mengamati perubahan pH yang terjadi pada larutan sampel. Pengukuran pH dilakukan terhadap larutan sampel, sebelum dan sesudah penambahan larutan enzim. Kemudian diamati besarnya perubahan pH. Ikatan peptida protein akan dihidrolisis oleh protease menghasilkan asam-asam amino yang mudah diserap oleh tubuh. Pada saat ikatan peptida dihidrolisis, ion H+ juga dilepaskan menyebabkan suasana menjadi asam. Sehingga dengan semakin besar penurunan pH, maka semakin banyak jumlah asam-asam amino yang dihasilkan dan semakin mudah pula protein tersebut dicerna oleh tubuh artinya semakin baik daya cernanya. Berdasarkan hasil percobaan secara kualitatif berdasar pengukuran pH, diperoleh hasil sebagai berikut:

Tebel 2. Daya cerna protein secara kualitatif Sa p pH pH Se Seli Sel N mpe H set set lisi sih isi il l a ela ela h pH h ai w h + h + pH awa pH al enz aq aw lde im ua al- aqu ng des en ade an zi s kor m eks i Kas 6. 6.1 6.4 0.3 0.04 0.3 4 ein 47 2 3 5 1 (ko ntro l) Kas 6. 6.1 6.6 0.5 0.00 0.5 1 ein 64 2 4 2 2 ove n Tep 7. 6.6 6.7 0.4 0.38 0.1 6 ung 11 3 3 8 0 ked elai men tah Tep 6. 6.6 6.8 0.1 0.06 0.1 5 ung 86 9 0 7 1 ked elai ove n ISP 8. 7.4 7.8 0.7 0.24 0.4 2 men 13 3 9 0 6 tah ISP 7. 7.2 7.6 0.4 0.15 0.3 3 ove 78 9 3 9 4 n Keterangan: Nilai semakin kecil daya cerna semakin baik Dari hasil kualitatif diperoleh urutan daya cerna dari yang paling baik yaitu: kasein oven, ISP mentah, ISP oven, kasein, tepung kedelai oven, dan tepung kedelai mentah. Apabila dibandingkan dengan hasil pengukuran secara kuantitatif, hasil ini memberikan hasil yang sesuai dengan pengukuran secara kuantitatif untuk sampel tepung kedelai dan ISP, namun berbeda untuk

sampel kasein. Faktor-faktor yang mungkin dapat menyebabkan perbedaan itu adalah penetapan pH awal kurang tepat, kesalahan dalam pembacaan pH dan perlakuan sampel yang tidak tepat. KESIMPULAN Daya cerna protein secara in vitro dapat dilakukan dengan metode kualitataif dan metode kuantitatif. Secara kualitatif berdasar penurunan pH, sedangkan secara kuantitatif menggunakan spektrofotometer. Protin yang memiliki daya cerna yang baik adalah yang mengalami penurunan pH yang besar dan daya cerna relatifnya besar. Pemanasan dapat memperbaiki daya cerna protein. DAFTAR PUSTAKA Aykroyd, W. R. dan J. Doughty. 1964. Legumes in Human Nutrition. FAO of The United Nation, Roma. Damodaran, S. 1996. Amino Acids, Peptides, and Proteins. Di dalam: Fennema, O. R. (ed.). Food Chemistry 3rd Ed. Marcel Deker, Inc. New York, Basel. Muchtadi, D. 1989. Petunjuk Lab. Evaluasi Nilai Gizi. PAU. IPB, Bogor. Ophart, C. E. 2003. Virtual Chembook. Elmhurst College. Suhardjo dan C. M. Kusharto. 1992. Prinsip-Prinsip Ilmu Gizi. Kanisius, Yogyakarta