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Practica #4 Fraccionamiento celular

Objetivo: Observar los diferentes orgnulos de la clula vegetal y animal mediante el fraccionamiento celular. Introduccin: El fraccionamiento celular es una tcnica bioqumica utilizada para separar los distintos orgnulos y componentes celulares para su estudio. La tcnica se inicia con la homogeneizacin. El tejido se tritura en un homogeneizador de manera que las clulas se comprimen y se libera su contenido. Lo que luego se hace con ese extracto es someterlo a diferentes centrifugaciones a diferentes velocidades y tiempos, de manera que obtenemos fracciones enriquecidas de los distintos orgnulos. Homogenizacin. Para preparar los tejidos para el fraccionamiento celular, primero se debe suspender en un medio apropiado (una solucin amortiguadora, salina azcar isotnica). Para mantener la integridad de los orgnulos y enzimas durante el procedimiento de la fraccionacin, todas las soluciones y cristalera deben mantenerse fras. Despus de rebanar las hojas, el tejido est preparado para la homogenizacin, procedimiento que rompe los enlaces celulares y libera el contenido celular, sin daar el medio en suspensin. La suspensin de clulas constituyentes se llama homogenado. Para los tejidos de plantas, la homogenizacin se debe realizar con un mortero al cual se le aade arena como abrasivo. En este proyecto los cloroplastos se aislarn de la espinaca; ncleos y mitocondria se aislarn de la coliflor. Centrifugacin. Debido a las diferencias en tamao y densidad, cada componente celular est sujeto a una fuerza centrfuga. La fuerza generada por la centrfuga se expresa como fuerza centrfuga relativa (RCF) en unidades de g. La RCF es una funcin de velocidad de centrifugacin en revoluciones por minutos (rpm) y la distancia de partculas desde el eje de rotacin. Conociendo esta distancia (x) y el (rpm), se puede determinar el RCF de la ecuacin: RCF =1.19 x 10-5 (rpm)2x, donde x se toma como la distancia (en cm) desde el eje de rotacin hasta el margen de afuera del tubo de centrfuga. Centrifugacin Diferencial. En la centrifugacin diferencial, el homogenado es centrifugado repetidas veces a altas velocidades, sedimentndolo progresivamente en pequeas partculas. El mtodo est ilustrado en la fig. 2. La primera centrifugacin es a 600g por 10 minutos, el cual sedimenta la fraccin

nuclear. Este pellet contiene el ncleo, clulas intactas y tejido.. L prxima separaciones el sobrenadante postnuclear partculas suspendidas en lquido sobre el pellet nuclear, el cual es transferido a otro tubo de centrfuga y se centrfuga a 10,000 g por 30 minutos en una centrfuga refrigerada. El material sedimentado se conoce como fraccin mitocondrial; ste contiene mitocondria y micro cuerpo. Material

Hgado de pollo Brcoli Espinacas Coliflor Tubos de ensaye Solucin tris-hcl 10 Mm. Agua destilada

Procedimiento: 1. Partimos de 0,5 gramos de hgado de pollo y de una solucin madre de TRIS-HCL 1M.Necesitamos para el homogeneizado 10 ml de solucin TRIS-HCl 10 mM, por lo que tomamos10 microlitros de la solucin madre y rellenamos con agua destilada hasta 10ml .En un mbolo de potter ponemos los 0,5 gramos de hgado de pollo junto con 4 ml de solucin TRIS-HCL 10mM. Machacamos hasta homogeneizar sin que quede ningn fragmento. Luego pasamos 1 ml del extracto a 3 tubos eppendorf marcados con la palabra ncleo y centrifugamos a 3000 rpm durante 5 minutos. Despus de esto, decantamos el sobrenadante a 3 tubos limpios y los marcamos con la palabra mitocondrias. EL pellet que ha quedado se denomina fraccin nuclear y lo resuspendemos en 250 microlitros de sacarosa-TRIS. Almacenamos esta fraccin a 20Cpara ensayos posteriores. Y centrifugamos el sobrenadante restante a 10000 rpm durante 10minutos. Una vez acabada la centrifugacin, decantamos el sobrenadante a 3 nuevos

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tubos eppendorf marcados con la palabra microsomas. EL pellet que nos ha quedado es la fraccin mitocondrial y lo resuspendemos en 250 microlitros de solucin sacarosa-TRIS y almacenamos a 20C. Centrifugamos el sobrenadante a 12000 rpm durante 25 minutos. Finalizada la centrifugacin, decantamos el sobrenadante a 3 tubos eppendorf marcados con la palabra citosol y almacenamos a 20C. Lo que nos queda en el pellet es la fraccin microsomal y la resuspendemos en 250 microlitros de solucin sacarosa-TRIS y almacenamos. Ahora observaremos la fraccin nuclear. Para ello hacemos un frotis con una gota del tubo marcado con ncleo. Le echamos hematoxilina y dejamos durante 2 minutos. Lavamos con agua caliente, colocamos un cubre y observamos. Observacin de mitocondrias. Tomamos 200 microlitros de la fraccin mitoncondrial del tubo marcado con mitocondrias y aadimos 300 microlitros de tampn TRIS-HCL y 500 microlitros de verde Jano 0,1%, de manera que estamos diluyendo la fraccin mitocondrial 5 veces. Hacemos un frotis y observamos al microscopio ptico. Vemos cantidad de esferas y ovoides que deben corresponder a mitocondrias, lisosomas y peroxisomas. Pero es imposible poder diferenciar la ultraestructura. Para hacer un recuento de las mitocondrias, hacemos uso de un hemocitmetro. Colocamos un cubreobjetos sobre el aparato. ste posee dos huecos a los lados del cubre, de manera que se inyecta la suspensin con colorante en esas huecos que luego pasa por debajo del cubre y se llena la cmara por capilaridad. Y observamos al microscopio ptico para hacer recuento. EL hematocitmetro posee bajo el cubre una zona cuadriculada, de manera que hace fcil el recuento de los orgnulos. Cada cuadrcula representa 0,1 mm cbico, es decir, 0,0001 cm a la cuarta. 1cm cbico=1ml. Luego, el nmero de mitocondrias por ml es igual a la media de mitocondrias por cuadrculas x factor de dilucin. El nmero total de mitocondrias en la alcuota que tomamos sera el nmero de mitocondrias por ml x volumen de alcuota.

Evidencias:

Conclusiones:
Despus de haber realizado todo el procedimiento se procedi a observar a microscopio todas las muestras, se tomo unas gotas del concentrado y se observo los resultados fueron que en ninguna de las muestras se alcanzo a ver nada claramente solo una en excepcin se puedo observar unas pequeas estructuras pero realmente no se sabe qu tipo de orgnulo ya que por deduccin se cree que fueron ncleos.