P. 1
Evaluarea Toxicologica a Medicamentului

Evaluarea Toxicologica a Medicamentului

|Views: 11|Likes:
Published by Diana Buzatu

More info:

Published by: Diana Buzatu on Nov 27, 2012
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PPT, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

11/20/2014

pdf

text

original

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE “ GR. T.

POPA” IAŞI FACULTATEA DE FARMACIE

ŞCOALA DOCTORALĂ

METODOLOGII DE REALIZAREA A CERCETĂRII FARMACEUTICE

– EVALUAREA TOXICOLOGICĂ A MEDICAMENTULUI –

Conf. dr. Luminiţa Agoroaei

2010/2011

Evaluarea unui nou medicament este un proces laborios , îndelungat şi costisitor, ce implică: 1. Evaluarea calităţii 2. Evaluarea securităţii utilizării –

interesează toxicologia

3. Evaluarea eficacităţii

Se estimează că doar una din 1000 de substanţe investigate ajunge să fie utilizată ca medicament.

Studiile întreprinse pot fi grupate în 3 etape: etapa preclinică – implică: studiul farmaceutic – studiul analitic al substanţei-test şi obţinerea unei forme farmaceutice;

cercetarea toxicologică şi farmacologică pe animale de laborator

etapa clinică – implică studii clinice, în vederea evaluării

raportului beneficiu / risc

etapa administrativă – implică înregistrarea medicamentului şi obţinerea autorizaţiei de punere pe piaţă

CERCETAREA TOXICOLOGICĂ ŞI FARMACOLOGICĂ PE

ANIMALE DE LABORATOR

Implică:
studii de toxicologie – pentru evaluarea securităţii substanţeitest

scopuri:
identificarea structurilor şi funcţiilor fiziologice afectate de substanţă; oprirea în aceasta fază a substanţelor care nu prezintă securitate pentru studiile clinice studii de farmacocinetică şi farmacodinamie – pentru evaluarea eficacităţii

Studii de toxicitate specială: ● mutagenitatea ● cancerogenitatea ● toxicitatea asupra funcţiei de reproducere C. Studii de toxicitate alternativă – studii in vitro . Studii de toxicitate convenţională: ● toxicitatea acută ● toxicitatea pe termen scurt după doze repetate ● toxicitatea subcronică ● toxicitatea cronică B.STUDIILE DE TOXICITATE A.

presupusa utilizare a substanţei. date toxicologice despre substanţe care se aseamănă structural. proprietăţile fizico-chimice. structura chimică.Înainte de începerea studiilor. rezultate ale unor teste prealabile in vitro sau in vivo. se efectuează o documentare asupra substanţei privind: identitatea. .

STUDIILE DE TOXICITATE ACUTĂ ● doză unică ● doze repetate în interval de 24 ore Obiective:  definirea toxicităţii substanţei şi încadrarea în clasa de toxicitate  identificarea ţesuturilor şi a organelor ţintă  estimarea toxicităţii la om  selectarea dozelor pentru cercetările toxicologice ulterioare şi pentru studiile farmacologice .

doza letală 25 (DL25) = doza letală minimă = doza care determină moartea a 25% din animalele din lotul de experienţă.doza letală 50 (DL50) = doza letală medie = doza unică. . se utilizează mai frecvent la diferenţierea claselor de toxici.doza letală 0 = doza maximă tolerată = doza care determină efecte toxice. .DOZA LETALĂ Exprimă toxicitatea acută a substanţei pătrunsă oral sau parenteral: . . dar nu letale. care determină moartea a 50% din animalele din lotul de experienţă. .doza letală 100 (DL100) = doza letală absolută = doza care determină moartea a 100% din animalele din lotul de experienţă. determinată prin metode statistice.

rapiditatea dezvoltării. se stabileşte CL50 – concentraţia letală medie – toxicitate acută la inhalare. . Animalele folosite se aleg funcţie de: posibilităţile de creştere pentru specia respectivă. informaţii disponibile despre specia respectivă privitoare la toxicitate.Pentru administrarea pe cale respiratorie. uşurinţa manipularii în timpul experimentelor.

şoareci. calea de administrare şi toxicitate). . parenterală. respiratorie – o cale cea preconizată pentru om. iepuri). ● folosind cel puţin două căi de administrare – orală. ● pe loturi de 20 de animale (sau 5 animale pentru acelaşi nivel de doză) (numărul de animale/lot poate varia în funcţie de metoda folosită. cobai. cealaltă cale care să asigure o biodisponbilitate de 100% sau cât mai apropiată de aceasta.Toxicitatea acută se investighează: ● pe animale din cel puţin două specii de rozătoare - şobolani. cobai (pentru toxicitatea cutanată se preferă şobolani. iepuri.

aceeaşi rasă. . .aceeaşi greutate sau cu o variaţie de maxim ± 20% (fiecare animal este cântărit înainte şi după experiment). sau numai masculi).aceeaşi vârstă (8 – 12 săptămâni). origine. . . care sunt mai sensibile la acţiunea toxică. .număr egal de masculi şi femele negestante (după caz se pot utiliza doar femele.Selecţia animalelor: .animale sănătoase.

cu o frecvenţă de 12 ore lumină / 12 ore întuneric. în număr adecvat astfel încât să nu deranjeze observarea fiecărui animal. . în cuşti pe grupuri de doză. ● ● dietă convenţională şi apă de băut la discreţie. pentru aclimatizare) şi pe toată durata experimentului. ● ● umiditate : minim 30 % . iluminat artificial. animalele sunt menţinute în condiţii standard de vivariu: ● temperatură +22oC (±3oC).Înainte (5 zile.maxim 70%. Animalele sunt marcate pentru identificare individuală.

Se aleg 3-4 niveluri . în funcţie de valoarea DL50 ce se aşteaptă a fi obţinută. nu se recomandă determinarea DL50 ci a dozei maxime tolerate. cu ajutorul sondei gastrice (după prealabilă perioadă de post). se împarte în fracţii mai mici ce se administrează pe parcursul a 24 ore. Dacă doza nu se poate administra o dată. . Dacă nu se observă letalitate la 5000 mg/kg corp.Niveluri de doze testate (mg/kg corp): ● 5 ● 50 ● 300 ● 2000 ● 5000. substanţa-test se administrează prin gavaj. Pentru studiile de toxicitate orală.

timp de 7 – 14 zile. mucoaselor. somnolenţă. activităţii somatomotorii. animalele se urmăresc la intervalele (periodic): 30 minute primele 4 ore primele 24 ore zilnic. blănii. bilanţul mortalităţii – permite calcularea DL50 prin metode clasice sau cu ajutorul unor programe informatice. hipersalivaţie. diaree. Observarea animalelor presupune: examen clinic – modificări la nivelul pielii. SNC. .După administrare. aparatului respirator. sistemului circulator. comportamentului. ● cele mai importante semne sunt: convulsii. letargie. comă.

iar la interpretarea rezultatelor se vor considera decedate în timpul testului. Starea muribundă – se referă la starea de a fi muribund sau incapabil de a supravieţui. . Simptomele care indică această stare la rozătoare sunt: convulsii. Moarte prevăzută – prezenţa semnelor clinice care indică moartea întrun timp prevăzut. tremor. chiar dacă animalul este tratat. poziţia culcat.Animalele muribunde sau care suferă intens de durere trebuie eutanasiate. înainte de sfârşitul experimentului (exemplu: incapacitatea a a ajunge la apă sau mâncare). poziţia laterală. Moarte iminentă – se referă la starea muribundă sau când moartea este aşteptată în următorul timp de observare (perioadă).

Substanţele-test. care posedă acţiune corozivă sau iritantă sau care pot provoca dureri mari şi suferinţă nu se administrează. ceea ce duce la erori de interpretare. rinichii şi organele care prezintă modificări macroscopice sunt supuse examenelor histopatologice. iar ficatul. Unele substanţe-test pot determina o moarte întârziată (după terminarea experimentului). Animalelele decedate sunt autopsiate. . respectiv dozele.

o dată cu creşterea nivelului de doză): metoda cu doză fixă “Fixed Dose Procedure” metoda “Acute Toxic Class Method” metoda “Up and Down”. fiind abrogat în 2001. Testele moderne vizează reducerea numărului animalelor şi a suferinţei acestora (administrarea şi observarea se face în etape. . Din 1970.Conceptul DL50 a fost introdus în 1927. testul clasic a fost profund criticat din punct de vedere ştiinţific şi al protecţiei animalelor.

stare muribundă sau moartea animalelor. .Metodele moderne evită dozele letale şi iau în calcul. toxicitatea evidentă – simptome certe de toxicitate după administrarea substanţei-test. conform Sistemului Global de Clasificare a Substanţelor Chimice şi a Amestecurilor – Gobally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures (GHS). astfel că la următorul nivel de doză apar: durere mare sau suferinţă puternică. ca reper final. Metodele moderne permit încadrarea substanţei-test pe categorii de toxicitate.

STUDIILE DE TOXICITATE DUPĂ ADMINISTRARE REPETATĂ Obiective:  identificarea ţesuturilor şi a organelor ţintă  determinarea relaţiei doză – răspuns. respectiv a riscului  stabilirea criteriilor de evaluare pentru testele de toxicitate ulterioare. inclusiv a nivelului NOAEL  identificarea diferenţelor între specii  evaluarea potenţialului toxic la administrare repetată. .

. Nivelul la care nu se observă nici un efect advers (NOAEL – No Observed Adverse Effect Level) – cea mai mare doză de substanţă care induce efect terapeutic. dar nu produce nici un efect advers.Organul ţintă – organul cu sensibilitatea mai mare la acţiunea toxicului sau organul în care toxicul se găseşte în concentraţie mai mare.

.

 IT < 1 – substanţa nu poate fi folosită ca medicament.Indicele terapeutic (factorul relativ de securitate) – raportul între doza medie letală (DL50) şi doza medie eficientă (DE50). . fiind prea toxică.  IT = 1-10 – utilizarea substanţei ca medicament este periculoasă – risc toxic ridicat.  IT > 10 – substanţa poate fi folosită ca medicament. IT = DL50 / DE50 DE50 – cantitatea de substanţă capabilă să determine un efect terapeutic la 50% dintre animalele folosite în experiment.

TIPURI DE STUDII DUPĂ ADMINISTRARE REPETATĂ TOXICITATEA STUDIATĂ DURATA ADMINISTRĂRII SUBSTANŢEI-TEST Toxicitate pe termen scurt 14 – 28 de zile. zilnic Toxicitate subcronică 90 de zile Toxicitate cronică 6 – 12 luni (minim 10% din durata de viaţă a speciei respective) .

Animalele utilizate pentru studii de toxicitate cu administrare repetată trebuie să fie din cel puţin două specii: o specie de rozatoare (şobolan) – 10-20 animale/sex/doză. cea orală – în dietă. prin gavaj sau capsule). Nivelurile de doze – minim 3. apă. alese încât să evidenţieze: efectul toxic reversibilitatea sau nu a acţiunii toxice efectul cumulativ sau retard organul (organele) ţintă. o specie de nerozătoare (câine. Calea de administrare – cea preconizată a fi folosită la om (cea mai frecventă. . primate sau mini-porcul – porcuşor de Guineea) – 4-6 animale/sex/doză.

datele de patologie clinică (parametrii hematologici. biochimici. . funcţiilor vitale. a comportamentului) (modificări de piele. analiza urinei). greutatea corporală. în cazul toxicităţii cronice – în plus funcţia cardiovasculară şi absorbţia substanţei în organism. tulburări de mers. consumul de alimente. mucoase.EVALUAREA TOXICITĂŢII ÎN STUDIILE DE TOXICITATE DUPĂ ADMINISTRARE REPETATĂ (I) Pe animalul viu: semnele vizibile de toxicitatea (modificarea aspectului. blană. rezultatele examenului oftalmologic. enzimatici. tulburări respiratorii. convulsii tonice sau clonice) sau mortalitatea. postură sau răspuns.

EVALUAREA TOXICITĂŢII ÎN STUDIILE DE TOXICITATE DUPĂ ADMINISTRARE REPETATĂ (II) Post-mortem: greutatea organelor. inimă). aspectul histopatologic al organelor (ficat. ovare. . creier. splină. rinichi. tiroidă. glande suprarenale.

. Cancerogeneza – inducerea de leziuni neoplazice (creşterea anormală a unui ţesut.Mutagenitatea – inducerea de leziuni la nivelul materialului genetic – la nivelul acizilor nucleici ADN şi ARN (genotoxicitate). cu diviziune anarhică şi invadarea organismului – metastază). cu apariţia de mutaţii.

hepatocite de şobolan.Drosophilla melanogaster mamifere (rozătoare) organisme umane .STUDII DE MUTAGENITATE ● peste 100 de teste Teste in vitro pe: bacterii – testul AMES pe Salmonella typhimurium (urmăreşte sinteza de histidină în urma mutaţiilor) culturi de celule de mamifere (ex.: celule de limfom de şoarece. celule de plămân sau ovar de hamster chinezesc) culturi de celule umane (ex.: limfocite) Teste in vivo pe: insecte .

omogenatul din ficatul este tratat.Deoarece multe substanţe acţionează ca mutageni după bioactivare şi transformare în metaboliţi electrofili foarte reactivi. cu inductori enzimatici (compuşi bifenilipolicloruraţi. în prealabil. 3-metil colantren. Întrucât aceste OFMM sunt inductibile. fenobarbital). mimarea metabolizării se face cu ajutorul unei fracţiuni din ficatul de şobolan (fracţiunea S9) ce conţine sistemele enzimatice implicate în metabolizarea xenobioticelor – Oxidaze cu Funcţii Mixte Microzomiale – OFMM. pentru studiile de mutageneză in vitro. .

Clasificarea testelor de mutageneză. . după tipul de efect asupra materialului genetic pe care-l evidenţiază: teste care evidenţiază mutaţiile genice teste care evidenţiază mutaţii cromozomiale teste care evidenţiază alterări primare ale ADN-ului.

există risc de acumulare. substanţa urmează a fi administrată o perioadă lungă de timp. .STUDII DE CANCEROGENITATE ● sunt de durată şi costisitoare Se realizează când: structura chimică sugerează un potenţial cancerogen. mecanismul de acţiune toxică este discutabil. rezultatele de la studiile de mutageneză şi /sau de toxicitate a reproducerii sunt pozitive.

● verificarea apariţiei oricăror mase tisulare neobişnuite.Animale utilizate – rozătoare (şoareci sau şobolani). Calea de administrare – cea prevăzută a fi utilizată la om. . ● examenul microscopic al tumorilor. Niveluri de doză – 2-3. ● evaluarea mortalităţii. mai rar câini sau primate. Numărul animalelor pe lot – 50/sex/doză. ● autopsierea. Examene efectuate: ● evaluarea clinică. Durata administrării – 18 luni la şoarece / 24 de luni la şobolan.

. Studiile de teratogeneză sunt printre cele mai importante. teratogenitate Studii peri. prin efecte toxice exercitate în perioada embrionară sau fetală (malformaţii congenitale).şi post-natale. fetotoxicitate. Teratogeneza – apariţia de defecte structurale.STUDII DE TOXICITATE ASUPRA REPRODUCERII Studii de fertilitate la femele Studii de toxicitate a dezvoltării – embriotoxicitate.

numărul de implantări.Animale utilizate – 2 specii de animale. Administrare – în perioada organogenezei. la fetuşi (extraşi chirurgical cu o zi înainte de naştere) – numărul de fetuşi vii sau morţi. sexul. . gestante. Se analizează: la femele gestante – semnele de toxicitate. numărul de resorbţii. numărul de corpi galbeni. tinere. greutatea şi dimensiunile. dintre care una de nerozătoare. primipare. femelele să fie adulte. anomaliile existente.

Se cunosc 3 alternative – cei 3 “R”: Reduction – reducerea numărului de animale utilizate. Replacement – înlocuirea testelor pe animale cu teste in vitro. testul este acceptat doar dacă aduce un beneficiu substanţial pentru sănătatea oamenilor. . apar două principii importante testele care determină animalelor durere severă sau o altă formă de suferinţă nu sunt acceptate. prin administrare de analgezice. anestezice în vederea reducerii suferinţei. Refinement – rafinament – protejarea animalelor utilizate.În reglementările privind drepturile animalelor ale Consiliului Europei.

Testele in vitro nu pot înlocui. . enzime purificate. în totalitate. mitocondrii izolate. modelul animal.Pentru testele in vitro se pot folosi: modele celulare – culturi de celule sau organe izolate. modele acelulare – fracţiunea S9 din ficatul de şobolan.

● măsurarea creşterii celulare (modificări ale proliferării celulare).Criterii nespecifice care pun în evidenţă leziuni nespecifice ce apar la diferite tipuri de celule (toxicitate generală): ● evaluarea integrităţii celulare (modificări de integritate şi permeabilitate membranară). Criterii specifice tipului de celule sau ţesut (toxicitate selectivă): ● hepatotoxicitate ● neurotoxicitate ● nefrotoxicitate ● imunotoxicitate ● capacitate iritantă ● teratogeneza . ● determinare activităţii funcţionale a celulei (alte metode).

. picături de lipide). leziunile nucleare şi citoplasmatice (acumularea de vacuole. ● prin microscopie electronică – leziuni ale structurilor celulare fine.Testele de citotoxicitate au în vedere determinarea unor parametri:  morfologici  biochimici  metabolici  Parametrii morfologici: ● prin microscopie fotonică – formarea culturii celulare (ataşarea sau detaşarea de celule).

 Parametrii biochimici: ● integritatea membranară:  numărul de celule  conţinutul în proteine totale sau ADN  testul de incluziune cu tripan bleu  LDH. transaminazele  eliberarea de Cr51 din roşu neutru ● permeabilitatea membranară:  fluxul de ioni sau molecule mici (K+. Ca2+)  acumularea de molecule exogene .

 Parametrii metabolici: ● testul MTT (obţinerea formazanului de către dehidrogenazele mitocondriale) ● conţinutul în ATP ● sinteza proteică totală (prin incorporarea unui aminoacid radioactiv) ● raportul lactat / piruvat ● concentraţia în glutation ● peroxidarea lipidică (determinarea malondialdehidei) ● fixarea covalentă .

Scopul evaluării toxicităţii generale este determinarea concentraţiei inhibitorii 50 – CI50. . CI50 – concentraţia care produce o reducere sau inhibiţie de 50% a unui parametru măsurat sau o scădere de 50% a unei activităţi.

pentru determinarea toxicităţii acute la om (Proiectul A-Cute-Tox al Comunităţii Europene).Nu se efectuează studii pe animale de laborator fără acordul Comisiei de Etică Instituţională. . în viitorul apropiat. integrată şi validată. Cercetătorii estimează că. se va reuşi înlocuirea completă a studiilor pe animale de laborator cu o strategie in vitro.

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->