TECNICAS EN BIOLOGIA MOLECULAR

Dr. Daniel Alarcón Cano

CONCEPTOS
• GENÓMICA: Es la ciencia o conjunto de ciencias y técnicas dedicadas al estudio integral del funcionamiento, la evolución y el origen del Genoma. • PROTEÓMICA: Puede definirse como genómica funcional a nivel de proteínas, estudia la correlación entre las proteínas y sus genes.

¿Qué moléculas hay en una célula?

Proteína

ARN

ADN

Estudio del ADN

Proteína

ARN

ADN

Ingeniería genética (tecnología del ADN recombinante)
Conjunto de técnicas y tecnologías que permiten manipular la información genética de distintos organismos
Permite aislar un gen de un organismo para su posterior manipulación e inserción en otro ADN diferente, logrando que un organismo produzca una proteína nueva para el. (Ejemplo: Insulina)

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ADN o ARN desnaturalizado Híbrido Zona no complementaria .Hibridación Puentes hidrógeno 1M Urea (desnaturalización química) 90ºC (desnaturalización térmica) Renaturalización (Hibridación) Diálisis Descenso lento de la temp.

Astringencia • Es una característica del medio que hace que 2 cadenas de ácido nucléico necesiten una mayor homología para poder hibridizar Es mayor cuanto mayor es: • Temperatura • Concentración salina (NaCl) • pH .

Daniel Nathans y Hamilton Smith.1978 premio Novel) • • Sistema bacteriano de defensa antiviral? • Endonucleasas de DNA que reconocen y cortan dentro de zonas palindrómicas específicas de 4 o 10 nt. (La ruta nos aporto otro paso natural) .Enzimas de Restricción 70’s descubrimiento de las Enzimas de restricción (Werner Arber. (la mayoría) • palíndrome: (dábale arroz a la zorra el abad).

cohesivos 3’ protruyentes 5’ 3’ 5’GCG C C 3’C GCG GCG HpaI Blunt ends extremos romos 5’ 3’ AAC 5’GTTAAC CAATTG TTG 3’ EcoRI G AATTC 3’ CTTAA G 5’ HhaI GCG 3’ GCG C C C GCG 5’ HpaI GTT 3’ GTT AAC CAA 5’ CAA TTG .cohesivos 5’ protruyentes 5’ 3’ G 5’ AATTC CTTAA G 3’ HhaI Sticky ends 3’ protruyentes Ext.Tipos de fragmentos de restricción EcoRI Sticky ends 5’ protruyentes Ext.

Ligación nick G AATTC GAATTC CTTAA G CTTAAG nick .

Subóptimas) AATTC G AATTC G AATTC G G CTTAA AATTC G G CTTAA G CTTAA AATTC G G CTTAA G CTTAA Restricción completa (cond. óptimas) TTAA AATT G CTTAA AATTC G Hibridación y ligación Inserto .Clonado de genes Vectores plásmido Restricción parcial (cond.

Clonado de genes Bacterias Competentes Transformación de bacterias LB-agar+antibiótico Incubación ON a 37oC Heat Shock 5’ 42oC inoculación LB-agar+antibiótico Incubación ON a 37oC LB sin antibiótico Inoculación en medio selectivo .

Vectores de expresión eucariotas origen de replicación bacteriana Marcador de selección eucariota Sitio de reconocimiento de muchas enzimas de restricción Proteína de fusión Proteina Verde Fluorescente Señal de fin de transcripción eucariota Marcador de selección procariota .

Transfección Método utilizado para introducir genes en células eucariotas superiores. • Electroporación: Se someten las células a un campo eléctrico que les genera poros por donde puede entrar el ADN. Buena eficiencia. pero es caro porque necesita un equipo especial. El más usado. Baja eficiencia. Puede ser: • Transient (transitoria): el vector queda como elemento episomal • Estable: El vector se integra en algún cromosoma (evento aleatorio y poco frecuente => Requiere de marcador de selección) Métodos más usados • CaCl2 se tratan las células con una mezcla de ADN y CaCl2. Para las células que lo resisten tiene muy buenas eficiencia. . pero muy barato • Lipofección: Se incuban las células con un complejo ADN-Lípido catiónico. pero los lípidos son caros. • FuGene 6: Lo último!! Es un reactivo de composición secreta que tiene muy buena eficiencia de transfección.

Ensayos de Gene-reporters 1 2 3 4 5 Lumin-O-meter ACME .

migración • En columna: •Filtración en gel => Sephadex •Intercambio iónico (aniónico o catiónico) •Afinidad: Acs. Se hace en capa delgada (TLC) o en papel. Hormona / Receptor.Separación de moléculas Cromatografía • Partición: sólo para moléculas pequeñas. Fracciones . Se basa en la disolución diferencial en distintos solventes.

.Separación de moléculas Electroforesis en gel.

se incuba con un fragmento de ADN radioactivo complementario al buscado (sonda) Se realiza una autoradiografía: la radioactividad impacta una placa fotográfica que al revelar muestra una banda . Southern. 1975. se ordenan por tamaño Lisis celular y purificación ADN El ADN se desnaturaoliza y transfiere a una membrana de nylon La memb. 98:508 El ADN se corta con enzimas de restricción Los fragmentos de restricción son sometidos a electrólisis en gel. M. Mol. Biol.Southern blot E. J.

dGTP ddCTP * DNAPol AACCGTA TTGGCAT dATP. dGTP ddATP* DNAPol AACCGTA TTGGCAT dATP. dTTP. dCTP. dTTP.Secuenciación de ADN AACCGTAT TTGGCATA dATP. dTTP. dCTP. dGTP ddTTP * DNAPol AACCGTA TTGGCAT dATP. dGTP ddGTP * DNAPol AACCGTA TTGGCAT A T C G Gel de secuencia => Poliacrilamida =>Mayor resolución . dCTP. dCTP. dTTP.

EMSA (Gel Shift Assay) .

FISH .

FISH .

PCR Reacción en cadena de Polimerasa .

PCR: Reacción en cadena de la polimerasa Cadena desnaturalizada Primers específicos Síntesis de ADN .

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ChIP .

Microarrays .

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Microarrays .

Basal like Normal Her2+ Breast like Luminal C Luminal B Luminal A Sorlie Proc Natl Acad Sci USA 2001. 98:10869 .

Sorlie et al (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98: 10869 Sorlie et al (2003) 100: 8418 .

Mammaprint .

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Estudio del ARN ARN ADN .

Northern blot Gel tenido con BrEt y mirado con UV 28 S 18 S Membrana .

Retrotranscripcion • Se utiliza la enzima Transcriptasa Reversa de las retrovirus que permite convertir ARN en ADN (llamado ADN copia o cDNA) • Se le pueden hacer todas las técnicas basadas en ADN • Nos da mayor información .

Estudio de las Proteinas Proteína ARN ADN .

Western blot Lisis celular Mezcla de prots de <> tamaño y abundancia relativa Anticuerpos (Acs) Separación electroforética en gel Se incuba la membrana con Acs específicos contra la prot de interés Las proteínas se disponen de acuerdo a su tamaño de forma descendente Los Acs reconocen y se unen a la proteína Transferencia a membrana y tinción Se puede ver una banda a la altura donde quedó cada una de las proteinas. El espesor de la banda es directamente proporcional a la abundancia de esa proteína en el lisado original Los Acs se detectan por incubación con un 2º Ac acoplado a una enzima. dirigido contra el primero .

Citometría de flujo .

Citometría de flujo .

Inmunofluorescencia .

IHQ .

Tissue microarray .

Tissue microarray .

Tissue microarray 4 2 0 1 2 • Single marker on many samples • Measurement of protein expression (also RNA in situ and FISH) • New classification using supervised and unsupervised methods Positivity score (0-4) cyc D c-myc Bcl2 ER CK8/18 p27 PR Mcm2 MIB1 p53 C-erbB2 cyc E CK 5/6 .

Proteomics .

Proteomics .

Proyecto CMAP del NCI (Cancer Molecular Analysis Project) • Facilitar la identificación y evaluación de blancos moleculares • Definir las secuencias de alteraciones genéticas/ epigenéticas que adquieren los tumores • Manejar e integrar todos los datos disponibles • Definir los agentes terapéuticos de utilidad para esos blancos .