UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGA

Maestra en Ciencias Bioqumicas Curso de Mtodos Fisicoqumicos en Biotecnologa

Inmunoqumica

Presenta: IBQ. Roco Vanessa Caldern Pascacio

Coordinador del curso Dr. Roberto P. Stock Silberman

Cuernavaca, Morelos, Junio 2007

Contenido Introduccin ..... Historia de la inmunologa ... Anticuerpos .. Antgenos . Interaccin antgeno-anticuerpo ... Anticuerpos monoclonales y policlonales Tcnicas inmunoqumicas ... Tcnicas de precipitacin . Reaccin de precipitacin clsica . Tcnica de precipitacin . Tcnica de difusin radial doble de Ouchterlony . Tcnica de inmunoelectroforsis .. Incremento de precipitacin por inmunoelectroforesis con contracorriente .. Tcnica de difusin radial simple de Manzini (SRID) . Tcnicas de aglutinacin .. Aglutinacin de partculas recubiertas por antgeno Hemoaglutinacin directa . Hemoaglutinacin indirecta .. Tcnicas de inmunofluorescencia Citometra de flujo Tcnica de radioinmunoensayo Tcnica de enzimoinmunoensayo (ELISA) . Nefelometra . Seleccin de clulas unidas a un anticuerpo Purificacin de antgenos y anticuerpos por cromatografa de afinidad .. Inmunoprecipitacin e inmunoblotting Western blot, Dot blot y Slot blot . Deteccin especfica de protenas en filtros . Bloqueo de la membrana .. 23 24 25 25 26 27 27 29 32 34 36 39 39 40 41 43 43 4 4 10 13 15 17 19 21 21 22 23 23

Tincin de protenas en el filtro Colorantes . Tincin mediante biotina-estreptavidina .. Tincin mediante oro coloidal .......... Anlisis de interacciones moleculares (BIAcore) Aplicaciones principales ... Otras tcnicas basadas en la unin antgeno-anticuerpo .. Tcnicas de biologa molecular tiles en inmunologa Southern Blot Hibridacin fluorescente in situ (FISH: Fluorescent In Situ Hybridization) ... FISH de Metafase ..... FISH de Interfase .. PCR in situ Mecanismo de la reaccin Bibliografa ..

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Introduccin Para entender las tcnicas inmunoqumicas, primero debemos comprender conceptos bsicos sobre inmunologa. Los animales superiores son atacados por microorganismos y partculas extraas. Pero poseen sistemas defensivos frente a tales patgenos; dichos mecanismos tienden a distinguir lo propio de lo extrao La inmunidad es un conjunto de mecanismos de defensa de los animales frente a agentes externos extraos. Se adquiere al nacer, y va madurando y consolidndose durante los primeros aos de vida. La inmunologa es la ciencia biolgica que estudia todos los mecanismos fisiolgicos de defensa de la integridad biolgica del organismo. Dichos mecanismos consisten esencialmente en la identificacin de lo extrao y su destruccin. La inmunologa tambin estudia los factores inespecficos que coadyuvan a los anteriores en sus efectos finales. La respuesta inmune es la actuacin integrada de un gran nmero de mecanismos heterogneos de defensa contra sustancias y agentes extraos. En general, a las sustancias extraas se las denomina como antgenos, y son ellos los que desencadenan en el organismo una serie de eventos celulares que provocan la produccin de los mecanismos de defensa. Historia de la inmunologa La inmunologa es, en la actualidad, una ciencia autnoma y madura, pero sus orgenes han estado estrechamente ligados a la Microbiologa. Su objeto consiste en el estudio de las respuestas de defensa que han desarrollado los animales frente a la invasin por microorganismos o partculas extraos, aunque su inters se ha volcado especialmente sobre aquellos mecanismos altamente evolucionados e integrados, dotados de especificidad y de memoria, frente a agentes reconocidos por el cuerpo como no propios, as como de su neutralizacin y degradacin. Como tantas otras ciencias, la Inmunologa presenta un prolongado perodo pre-cientfico, de observaciones y aproximaciones meramente empricas. Registro de enfermedades y de epidemias en los documentos picos de Babilonia (Gilgamesh) y de las dinastas antiguas de Egipto. 2000 a.c, as como la variolizacin era una prctica habitual de la cultura china. 1000 a.C. La resistencia a ulteriores ataques de una enfermedad infecciosa fue ya recogida en escritos de la antigedad; el historiador griego Tucdides (464-404 a.C.) narra que en una epidemia acaecida durante la guerra del Peloponeso, los enfermos eran atendidos solo por aquellos que haban sobrevivido previamente a la enfermedad, en la seguridad de que stos no volveran a ser contagiados. Hipcrates propone alteraciones en el sistema de los humores para explicar las enfermedades y el humor maligno como causa de la peste (460377 a.C).

Ya en el siglo X, Rhazes (medico islmico) describe clnicamente a la viruela y la diferencia de otras enfermedades eruptivas. Adems establece que los sujetos que se recuperan de la enfermedad tienen una inmunidad prolongada (teora de la inmunidad adquirida). Para el siglo XI Avicena propone que las enfermedades son transmitidas por semillas pequeas, o grmenes. Igualmente, en la antigua China se haba observado que las personas que en su niez haban padecido la viruela no la adquiran ms adelante en su vida. Los mismos chinos, en el siglo XI a. C., fueron los primeros en intentar una aplicacin de estas observaciones que indicaban la induccin de un estado protector por medio de una forma suave de la enfermedad: la inhalacin de polvo de escamas de viruela provocaba un ataque suave que confera resistencia ante infecciones posteriores. Una modificacin fue introducida en Occidente en el siglo XVIII por Pylarini y Timoni, y fue popularizada en Gran Bretaa por Lady Mary Wortley Montagu, esposa del embajador ingls en Constantinopla, tras una serie inicial de pruebas sobre "voluntarios" (prisioneros). Sin embargo, este tipo de prcticas no llegaron a arraigar ampliamente, ya que no estaban exentas de riesgos, entre los cuales figuraba la posibilidad de transmisin de otras enfermedades. En l546 Fracastoro extiende la hiptesis de Avicena sobre el contagio de las enfermedades y de que la proteccin es comn para varias enfermedades eruptivas. Se observa que el contacto del contenido de lesiones de viruela de las vacas (cow-pox), en los ordeadores haca que stos no sufrieran la enfermedad. Hieronymus Mercurialis difiere de Fracastoro y dice que la proteccin contra infecciones es especfica (155?). En 1722, el Prncipe y la princesa de Gales en Inglaterra permiten la variolizacin de su hijo favorecindose esta medida al resto de la poblacin, Voltaire en su libro de cartas filosficas describe la variolizacin aplicando polvo de las costras de las lesiones de viruela en la mucosa nasal que fue practicada por los chinos y turcos (1733). El contenido de lesiones de viruela de personas enfermas, en personas sanas, las dejaba libres de contraer la enfermedad. El primer acercamiento a la inmunizacin con criterios racionales fue realizado por el mdico ingls Edward Jenner (1749-1823), tras su constatacin de que las vaqueras que haban adquirido la viruela vacunal (una forma benigna de enfermedad que slo produca pstulas en las manos) no eran atacadas por la grave y deformante viruela humana. Esta observacin llev a Edward Jenner, mdico ingls en 1796, a transferir seis semanas despus pus de una lesin infectada de una ordeadora (Sarah Nelmes) al brazo del nio James Phipps y ste no enferm. Jenner public sus resultados en 1798 ("An enquiry into the causes and effects of the variolae vaccinae..."), pronosticando que la aplicacin de su mtodo podra llegar a erradicar la viruela. Jenner fue el primero en recalcar la importancia de realizar estudios clnicos de seguimiento de los pacientes inmunizados, consciente de la necesidad de contar con controles fiables. La falta de conocimiento, en aquella poca, de las bases microbiolgicas de las enfermedades infecciosas retras en casi un siglo la continuacin de los estudios de Jenner, aunque ciertos autores, como Turenne, en su libro "La syphilization" (1878) lograron articular propuestas tericas de cierto inters.

A fines del siglo XIX Robert Koch demostr que las enfermedades infecciosas eran provocadas por microorganismos, (virus, bacterias, hongos y parsitos), causantes de enfermedad patologa. Transmite el ntrax a los animales a partir de un cultivo "in vitro", cumplindose los postulados de Koch. 1876. Hizo adems aportes fundamentales sobre hipersensibilidad. El primer abordaje plenamente cientfico de problemas inmunolgicos se debi, a Louis Pasteur. Estudiando la bacteria responsable del clera aviar (ms tarde conocida como Pasteurella aviseptica), observ (1880) que la inoculacin en gallinas de cultivos viejos, poco virulentos, las protega de contraer la enfermedad cuando posteriormente eran inyectadas con cultivos normales virulentos. De esta forma se obtuvo la primera vacuna a base de microorganismos atenuados. Fue Pasteur quien dio carta de naturaleza al trmino vacuna, en honor del trabajo pionero de Jenner. En los aos siguientes Pasteur abord la inmunizacin artificial para otras enfermedades; concretamente, estableci de forma clara que cultivos de Bacillus anthracis atenuados por incubacin a 45C conferan inmunidad a ovejas expuestas a contagio por carbunco. Aos despus, abordara la inmunizacin contra la rabia, enfermedad de la que se desconoca el agente causal. Pasteur observ que ste perda virulencia cuando se mantenan al aire durante cierto tiempo extractos medulares de animales infectados, por lo que dichos extractos se podan emplear eficazmente como vacunas. Realiz la primera vacunacin antirrbica en humanos el 6 de julio de 1885, sobre el nio Joseph Meister, que haba sido mordido gravemente por un perro rabioso. A este caso siguieron otros muchos, lo que vali a Pasteur reconocimiento universal y supuso el apoyo definitivo a su mtodo de inmunizacin, que abra perspectivas prometedoras de profilaxis ante muchas enfermedades. Estos logros determinaron, en buena medida, la creacin del Instituto Pasteur, que muy pronto reuni a un selecto grupo de cientficos, que enfocaran sus esfuerzos en diversos aspectos de las inmunizaciones y de sus bases biolgicas. A su vez, los norteamericanos Salmon y Smith (1886) perfeccionaron los mtodos serolgicos de Pasteur, lo que les permiti producir y conservar ms fcilmente sueros tipificados contra la peste porcina. A finales del siglo XIX existan dos teoras opuestas sobre los fundamentos biolgicos de las respuestas inmunes. Por un lado, el zologo ruso Ilya Ilich Mechnikov (1845-1916), que haba realizado observaciones sobre la fagocitosis en estrellas de mar y pulgas de agua, estableci, a partir de 1883, su "Teora de los fagocitos", tras estudiar fenmenos de englobamiento de partculas extraas por los leucocitos de conejo y de humanos. Inform que existan fenmenos de eliminacin de agentes patgenos por medio de "clulas devoradoras" (fagocitos) que actuaban en animales vacunados contra el carbunco, y explic la inmunizacin como una "habituacin" del hospedador a la fagocitosis. Ms tarde, ya integrado en el Instituto Pasteur, propugn la idea de que los fagocitos segregan enzimas especficos, anlogos a los "fermentos" digestivos (1900). Esta teora de los fagocitos constituy el ncleo de la teora de la inmunidad celular, de modo que la fagocitosis se consideraba como la base principal del sistema de defensa inmune del organismo. Por otro lado, la escuela alemana de Koch haca hincapi en la importancia de los mecanismos humorales (teora de la inmunidad humoral). Emil von Behring (1854-1917) 6

y Shibasaburo Kitasato (1856-1931), a resultas de sus trabajos sobre las toxinas del ttanos y de la difteria, observaron que el cuerpo produce "antitoxinas" (ms tarde conocidas como anticuerpos) que tendan a neutralizar las toxinas de forma especfica, y evidenciaron que el suero que contiene antitoxinas es capaz de proteger a animales expuestos a una dosis letal de la toxina correspondiente (1890). La intervencin de Ehrlich permiti obtener sueros de caballo con niveles de anticuerpos suficientemente altos como para conferir una proteccin eficaz, e igualmente se pudo disponer de un ensayo para cuantificar la "antitoxina" presente en suero. Ehrlich dirigi desde 1896 el Instituto Estatal para la Investigacin y Comprobacin de Sueros, en Steglitz, cerca de Berln, y, a partir de 1899, estuvo al frente del mejor equipado Instituto de Terapia Experimental, en Frankfurt. Durante este ltimo periodo de su vida, Ehrlich produce una impresionante obra cientfica, en la que va ahondando en la comprensin de la inmunidad humoral. En 1900 da a luz su "Teora de las cadenas laterales", en la que formula una explicacin de la formacin y especificidad de los anticuerpos, estableciendo una base qumica para la interaccin de stos con los antgenos. Por su lado, R. Kraus visualiza por primera vez, en 1897, una reaccin antgenoanticuerpo, al observar el enturbiamiento de un filtrado bacteriano al mezclarlo con un suero inmune especfico (antisuero). Durante cierto tiempo se crey que el suero posee distintas actividades inmunes humorales, cada una denominada de forma diferente: antitoxina (neutralizacin de toxinas), precipitina (precipitacin de toxinas), aglutinina (aglutinacin de bacterias) y bacteriolisina (lisis de bacterias). Hubo que esperara a los aos 30 para caer en la cuenta que todas estas actividades se deban a un nico tipo de entidad, que fue bautizado como anticuerpo. En 1898 Jules Bordet (1870-1961) descubre otro componente srico relacionado con la respuesta inmunitaria, al que bautiza como "alexina", caracterizado, frente al anticuerpo, por su termolabilidad e inespecificidad (ms tarde se impondra el nombre de complemento, propuesto por Ehrlich). El mismo Bordet desarroll, en 1901, el primer sistema diagnstico para la deteccin de anticuerpos, basado en la fijacin del complemento, y que inici un largo camino, que llega a nuestros das. La conciliacin de las dos teoras (celular y humoral) se inici con los trabajos de Almorth Wrigth y Stewart R. Douglas, quienes en 1904 descubren las opsoninas, anticuerpos presentes en los sueros de animales inmunizados y que, tras unirse a la superficie bacteriana, incrementan la capacidad fagoctica de los leucocitos. En los aos 50 se reconoce que los linfocitos son las clulas responsables de los dos componentes, humoral y celular, de la inmunidad. El rea de la inmunopatologa inicia con la descripcin del fenmeno de anafilaxia producido por introduccin en un animal de un suero de una especie distinta (Portier y Richet, 1902; Arthus, 1903), lo que a su vez abrira la posibilidad de mtodos de serodiagnstico, con aplicaciones mltiples en Medicina, Zoologa y otras ciencias biolgicas. En 1905 Pirquet sugiere que la enfermedad del suero (un fenmeno de hipersensibilidad) tiene relacin directa con la produccin de anticuerpos contra el suero inyectado, introduciendo el trmino de alergia para referirse a la reactividad inmunolgica alterada.

La inmunoqumica cobra un gran impulso en las primeras dcadas del siglo XX con los trabajos de Karl Landsteiner (1868-1943). Su primera contribucin de importancia haba sido la descripcin, mediante reacciones de aglutinacin, del sistema de antgenos naturales (ABC0) de los eritrocitos humanos (1901-1902), completada (en colaboracin con Von Dungern y Hirzfeld), con las subdivisiones del grupo A y el estudio de su transmisin hereditaria. Estos trabajos sirvieron de estmulo para avanzar en el desentraamiento de la especificidad qumica de los antgenos que determinan la formacin de anticuerpos. Landsteiner estudi sistemticamente las caractersticas de inmunogenicidad y especificidad de reaccin de antgenos con anticuerpos, valindose de la modificacin qumica de antgenos, denominando haptenos a aquellos grupos qumicos que por s mismos no desencadenan formacin de anticuerpos, pero s lo hacen tras ser conjugados a protenas portadoras. La cuestin de las reacciones antgeno-anticuerpo se convirti en otra polmica entre escuelas hasta finales de los aos 20. Mientras Ehrlich y sus seguidores mantenan que estas reacciones tienen una base puramente qumica, Bordet y sus discpulos las explicaban como fenmenos fsicos de reacciones entre coloides. La resolucin del debate debi aguardar hasta finales de los aos 30, al incorporarse avances tcnicos como la electroforesis, la cromatografa en papel, la ultracentrifugacin y el microscopio electrnico. Heidelberg y Kendall (1936) purificaron anticuerpos a partir de sueros por disociacin de precipitados. Tiselius (1939) demostr que los anticuerpos constituyen la fraccin gamma-globulnica del suero. En 1959, Rodney R. Porter y Gerald M. Edelman presentan el modelo fundamental de las inmunoglobulinas (dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras) y su estructura qumica., acontecimiento que separ los 200 aos de la historia de la inmunologa en dos perodos, en los cuales ms de 70 investigadores han hecho su contribucin en los campos de: la inmunidad, la serologa, la inmunoqumica y la inmunobiologa. Durante este lapso de tiempo se descubre que la sntesis de anticuerpos ocurre en las clulas plasmticas, aunque stas no son puestas en relacin an con los linfocitos; durante muchos aos se sigui creyendo que los linfocitos eran clulas pasivas, sin funcin inmune. Por aquella poca se describe, tambin, la diversidad de inmunoglobulinas, llegndose al establecimiento de una nomenclatura. Enseguida comienza la era de los mltiples experimentos sobre timectoma en ratones neonatos y sobre bursectoma en aves, as como los de reconstitucin de animales irradiados, con timocitos y clulas de la medula sea, y que permiten afirmar el papel esencial de los linfocitos, encuadrarlos en tipos funcionales T y B, y relacionarlos con las respuestas inmunes celular y humoral, respectivamente. Una importante faceta de la inmunologa de la primera mitad del siglo XX fue la obtencin de vacunas. Se lograron toxoides inmunognicos a partir de toxinas bacterianas, en muchos casos por tratamiento con formol: toxoide tetnico (Eisler y Lowenstein, 1915) y toxoide diftrico (Glenny, 1921). En 1922 se desarrolla la vacuna BCG contra la tuberculosis, haciendo uso de una cepa atenuada de Mycobacterium tuberculosis, el bacilo de CalmetteGurin. La utilizacin de coadyuvantes se inicia en 1916, por LeMoignic y Piroy. La inmunogentica nace cuando Bernstein describe en 1921 el modelo de transmisin hereditaria de los cuatro grupos sanguneos principales, basndose en el anlisis estadstico 8

de sus proporciones relativas, y con el descubrimiento por Landsteiner y Levne (1927) de los nuevos sistemas MN y P. Los experimentos de transfusiones sanguneas interespecficas permitieron distinguir la gran complejidad de los antgenos sanguneos, explicables segn unos 300 alelos mltiples. Otra de las grandes controversias de los primeros tiempos de la Inmunologa se refera al tipo de mecanismos postulados para explicar la especificidad de la reaccin antgenoanticuerpo. Se propusieron dos tipos de teoras: la selectiva y la instructiva. La primera formulacin de tipo instructivo se debi a Paul Ehrlich (teora de las cadenas laterales): supona que las clulas inmunes expresan en su superficie una gran variedad de cadenas laterales preformadas; la unin de un agente patgeno determinado con una cadena lateral adecuada sera anloga a la complementariedad entre una llave y su cerradura; dicha interaccin originara la liberacin de la cadena lateral, e inducira a la clula a producir y liberar ms cadenas laterales de ese tipo concreto. Como se ve, esta teora supone que la selectividad de la cadena lateral est determinada previamente a la exposicin al antgeno, que slo acta seleccionando la produccin y liberacin de la cadena adecuada. En cambio, durante los aos 30 y 40 se daba ms crdito a las teoras instructivas. En ellas, el antgeno juega un papel central a la hora de determinar la especificidad del anticuerpo correspondiente. Se sugera que el antgeno servira como un molde alrededor del cual se plegara la molcula del anticuerpo, que de esta forma adquirira su especificidad. Estas teoras, popularizadas sobre todo por Linus Pauling, podan encajar en aquellos tiempos en que an existan muchas lagunas de los conocimientos, pero en los aos 50, tras los nuevos descubrimientos en Biologa Molecular (ADN, ARN, cdigo gentico, etc.), fueron descartadas. Una contribucin esencial a las ideas sobre el mecanismo de formacin de los anticuerpos la realiz el australiano Macfarlane Burnet (1899-1985), al establecer su teora de la seleccin clonal; sta argumenta que cada linfocito B, previamente al contacto con el antgeno, sintetiza un nico tipo de anticuerpo, especfico para cada antgeno determinante antignico), de modo que la unin del antgeno causa la proliferacin clonal del linfocito B, con la consecuente sntesis incrementada de anticuerpos especficos. Esta teora resucit las ideas selectivas, y actualmente es el paradigma aceptado por todos los inmunlogos. Ms recientemente Niels Jerne ha realizado nuevas aportaciones y refinamientos a la teora de la seleccin clonal, proponiendo un modelo de regulacin inmune conocido como teora de las redes idiotpicas. Cabe citar la tcnica de produccin de anticuerpos monoclonales a partir de hibridomas, desarrollada originalmente por Cesar Milstein y Georges Kohler en 1975, y que presenta una enorme gama de aplicaciones en biomedicina, o el desentraamiento de los fenmenos de reorganizacin gentica responsables de la expresin de los genes de inmunoglobulinas, por Susumu Tonegawa. Para 1983 James Allison y Kathryn Haskins aslan el receptor para antgeno de los linfocitos T. En 1984 Mark Davis y Tak Mak caracterizan los genes del receptor para antgeno de linfocitos T. Desde 1901 hasta nuestros das alrededor de 25 cientficos han obtenido el premio Nbel por distintos descubrimientos que han sido un aporte fundamental en Inmunologa. En dos 9

siglos de historia se han realizado grandes avances cientficos en reas como: la serologa, inmunidad celular, inmunologa molecular e inmunogentica. Mecanismos inmunolgicos han permitido explicar la patognia de diversas enfermedades: alergias, enfermedades autoinmunes, inmunodeficiencias y gamapatas monoclonales. Desarrollo de reas como la inmunofarmacologa, inmunologa del cncer y la inmunologa del transplante. En el mbito del diagnstico el uso de sondas y mtodos inmunolgicos contribuyen en reas como la medicina humana, la veterinaria y la fisiopatologa. El desarrollo de la inmunohistoqumica es un gran paso para la inmunologa, estudiando directamente lo que sucede en la clula o en secciones de tejidos. Anticuerpos Un anticuerpo se define como una inmunoglobulina (Ig) capaz de una combinacin especifica con el antgeno que ha causado su produccin en un animal susceptible. Ellos son producidos en respuesta a la invasin de molculas forneas en el cuerpo. Los anticuerpos existen como una o mas unidades en forma de Y, compuesta por cuatro cadenas polipeptdicas. Cada Y contiene dos copias idnticas de una cadena pesada (HC, heavy chain), y dos copias idnticas entre s de una cadena ligera (LC, light chain), llamadas as por sus pesos moleculares relativos que son de aproximadamente 50kDa la cadena pesada y de cerca de 25kDa la cadena ligera. Estas cadenas se mantienen unidas mediante enlaces disulfuros intercatenarios. Estas cadenas pueden separarse por reduccin de los enlaces S-S y acidificacin (Figura 1).

Figura 1. Estructura de un anticuerpo

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Los anticuerpos pueden ser divididos en cinco clases: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, basado en el nmero de unidades Y y en el tipo de cadena pesada. Las cadenas pesadas de IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, son conocidas como gamma, mu, alpha, delta y epsilon (, , , y ), respectivamente. Las cadenas ligeras de cualquier anticuerpo pueden ser clasificadas como tipo kappa () o lambda (), basadas en pequeas diferencias estructurales polipeptdicas; sin embargo, las cadenas pesadas determinan la subclase de cada anticuerpo (Tablas 1 y 2). Tabla 1. Propiedades fisicoqumicas de inmunoglobulinas humanas

Tabla 2. Propiedades fisicoqumicas de inmunoglobulinas de ratn

Las subclases de anticuerpos difieren en el nmero de puentes disulfuro y la longitud de la regin bisagra. El anticuerpo ms comnmente usado en ensayos inmunoqumicos es el de la clase IgG debido a que son las inmunoglobulinas ms abundantes en la circulacin en el suero, la regin bisagra expuesta tiene estructura extendida debido al alto contenido de prolna, por lo que es vulnerable al ataque proteoltico; en consecuencia, es muy fcil escindir la molcula en el laboratorio mediante papana, para obtener dos fragmentos Fab (llamados as por el fragmento que contiene el sitio de unin al antgeno por sus siglas en ingles) idnticos, cada uno con un nico sitio de combinacin para el antgeno, y un tercer fragmento, Fc (fragmento que cristaliza), que carece de capacidad para fijar el antgeno. La pepsina ataca en otro punto y escinde el Fc del resto de la molcula, para separar un fragmento 5S de gran tamao que se designo F(ab)2, dado que se mantiene divalente con respecto a la fijacin al antgeno, al igual que el anticuerpo original (Figura 2). La regin entre los fragmentos Fab y Fc es a la que se le llama bisagra. Este segmento le permite movimiento lateral y rotacional de los dos dominios que se unen al antgeno. Una cadena 11

ligera asociada con la regin amino-terminal de una cadena pesada forman un domino de unin al antgeno. Las regiones carboxi-terminal de las dos cadenas pesadas se doblan juntas para formar el dominio Fc.

Figura 2. Fragmentos de anticuerpos creados por diferentes enzimas La clsica forma Y de un IgG esta compuesta de dos variables: brazos antgeno especfico F(ab), los cuales son crticos para la unin del antgeno, y la cola constante Fc que sirve como mango para la manipulacin del anticuerpo durante muchos procedimientos inmunoqumicos. El nmero de regiones Fab en un anticuerpo, corresponde con su subclase, y determina la valencia del anticuerpo (el nmero de brazos con el que el anticuerpo puede unirse al antgeno, Figura 3).

Figura 3. Diferentes clases de anticuerpos Anticuerpos directamente conjugados pueden ser marcados con una enzima o un fluorforo en la regin Fc. La regin Fc tambin ancla el anticuerpo a platos en ensayos de ELISA y adems por anticuerpos secundarios en ensayos de inmunoprecipitacin, inmunoblots e inmunohistoqumica.

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Antgenos El principio bsico de cualquier tcnica inmunoqumica es el de que un anticuerpo especfico se unir con un antgeno especfico para dar un complejo anticuerpo-antgeno exclusivo. La definicin clsica de antgeno es cualquier sustancia fornea que elicita una respuesta inmune cuando es introducida dentro de tejidos de animales susceptibles y que son capaces de combinar con los anticuerpos especficos formados. Los antgenos son generalmente de alto peso molecular y comnmente son protenas o polisacridos. Polipptidos, lpidos, cidos nucleicos y otras molculas pueden tambin funcionar como antgenos. La respuesta inmune puede tambin ser generada contra sustancias pequeas, llamadas haptenos, si estos esta acoplados a una protena acarreadora, como la albmina de suero bovino (BSA) u otras matrices sintticas. Una variedad de molculas como drogas, azucares simples, aminocidos, pequeos pptidos, fosfolpidos o triglicridos pueden funcionar como haptenos. As, dndole suficiente tiempo, cualquier sustancia fornea ser identificada por el sistema inmune y evocara la produccin de un anticuerpo especfico. Sin embargo, esta respuesta inmune especfica es altamente variable y depende mucho en parte del tamao, estructura y composicin de los antgenos. Los antgenos que elicitan una fuerte respuesta inmune se dice que son altamente inmunognicos. Las partes de las regiones hipervariables del anticuerpo que contactan con el antgeno se denominan partopos y la regin de un antgeno que puede especficamente unirse a un anticuerpo es llamado eptope. Un eptope no tiene una propiedad intrnseca de alguna estructura particular. Estos son usualmente uno a seis monosacridos o 5-8 residuos de aminocidos sobre la superficie del antgeno. Debido a que la molcula de antgeno existe en el espacio, el eptope reconocido por un anticuerpo puede depender de la presencia de una especifica conformacin tridimensional del antgeno (por ejemplo, un sitio nico formado por la interaccin de dos loops o subunidades de una protena nativa) o el eptope puede corresponder a una regin de una secuencia primaria simple, as, los eptopes son descritos como conformacionales y lineares, respectivamente. El rango de posibles sitios de unin es enorme, ya que cada sitio de unin tiene sus propias propiedades estructurales derivadas de enlaces covalentes, inicos e interacciones hidroflicas e hidrofbicas. Para que exista una eficiente interaccin entre el antgeno y el anticuerpo, el eptope debe estar fcilmente disponible para la unin. Si la molcula blanco es desnaturalizada, por ejemplo, por la fijacin, cambios de pH o durante la preparacin para el gel de electrofresis, el eptope puede ser alterado y esto puede afectar su habilidad para interactuar con un anticuerpo. Por ejemplo, algunos anticuerpos son inefectivos en un Western blot pero muy bueno en inmunohistoqumica debido a que en el proceso, un complejo sitio antignico puede ser mantenido en el tejido, mientras que en el otro procedimiento la preparacin de la muestra altera la conformacin de la protena lo suficiente para destruir el sitio antignico y as elimina el sitio de unin con el anticuerpo.

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Si el producto de un gene de inters esta presente en concentraciones extremadamente bajas, una opcin puede ser el uso de la informacin de la secuencia conocida de nucletidos para derivar el correspondiente pptido para generar anticuerpos especficos para esa secuencia. Caractersticas de un buen antgeno incluyen: Areas de estabilidad estructural dentro de la molcula Un peso molecular mnimo de 8000 a 10000 Daltons, aunque los haptenos con pesos moleculares tan bajos como 200 Da han sido usados en presencia de protenas acarreadoras La habilidad de ser procesado por el sistema inmune Regiones inmunognicas accesibles al mecanismo formado por el anticuerpo Elementos estructurales que sean suficientemente diferentes al husped Para pptidos antgenos, regiones que contengan por lo menos 30% de aminocidos inmunognicos: K, R, E, D, Q, N Para pptidos antgenos, significante hidrofobicidad o residuos cargados

Interaccin antgeno-anticuerpo Los antgenos y anticuerpos interactan por complementariedad espacial y no por uniones covalentes. La asociacin especfica del antgeno y el anticuerpo es dependiente del los puentes de hidrogeno, las interacciones hidrofbicas, fuerzas electrostticas y las fuerzas de van der Waals; por lo general solo son efectivas en distancias cortas. Todos estos son uniones dbiles no covalentes, aunque algunas de las asociaciones entre antgeno y anticuerpo pueden ser bastante fuertes. Al igual que los anticuerpos, los antgenos pueden ser multivalentes, ambos a travs de mltiples copias del mismo eptope, o a travs de la presencia de mltiples eptopes que son reconocidos por mltiples anticuerpos. Las interacciones que involucran multivalencias pueden producir mayor estabilidad a los complejos, sin embargo la multivalencia puede tambin resultar en dificultades estricas, por lo tanto reduciendo la posibilidad de unin. Los haptenos de tamao pequeo en s son monovalentes en lo que respecta a la reaccin con el anticuerpo. En un experimento donde se mezcl el hapteno con el anticuerpo en una bolsa de dilisis se mostr que la combinacin con el anticuerpo era reversible y que el complejo as formado podra disociarse con facilidad en funcin de la fuerza de unin, a la que denominamos afinidad. En la situacin simplista de un brazo de unin Fab aislado a un eptope en el antgeno, la fuerza de unin puede definirse mediante la constante de equilibrio KA de la reaccin de asociacin: Ac + Ag AcAg

Como todas las uniones antgeno-anticuerpo son reversibles y siguen los principios bsicos termodinmicos de cualquier interaccin reversible bimolecular, tenemos que: KA = [Ac-Ag] 14

[Ac][Ag] donde KA es la constante de afinidad, Ac y Ag son las concentraciones molares de los sitios de unin no ocupados del anticuerpo y del antgeno, respectivamente, y Ac-Ag es la concentracin molar del complejo antgeno-anticuerpo. Si el anticuerpo y el antgeno encajaran juntos de modo muy ntimo, el equilibrio estara bien a la derecha de la reaccin de asociacin; nos referimos a estos anticuerpos que se unen con fuerza al antgeno como anticuerpos de alta afinidad. As mismo la afinidad puede definirse en trminos de la constante de disociacin (KD) de la reaccin: AcAg Ac + Ag Si las concentraciones se expresan en moles por litro: KD = [moles de Ac/L][moles de Ag/L] [moles de AcAg/L] Es claro que KD es la reciproca de KA, es decir, 1/ KA y sus unidades son moles/L o M. Al contrario, KA se expresa en las unidades L/mol o M-1 y tiene la ventaja de que cuanto mayor es la fuerza de unin la cifra es mas alta. El tiempo que toma en alcanzar el equilibrio es dependiente de la velocidad de difusin y de la afinidad del anticuerpo sobre el antgeno y puede variar ampliamente. Las constantes de afinidad de unin antgeno-anticuerpo pueden abarcar un amplio rango, extendindose por debajo de 105 mol-1 hasta ms de 1012 mol-1. Las constantes de afinidad pueden ser afectadas por la temperatura, el pH y los solventes. La afinidad describe la fuerza de interaccin entre anticuerpo y antgeno en un solo sitio antignico. Dentro de cada sitio antignico, la regin variable del anticuerpo interacta a travs de fuerzas dbiles no covalentes con el antgeno en numerosos sitios. Mientras que el trmino afinidad describe la unin del anticuerpo a un hapteno monovalente o a un solo determinante antignico, en la mayora de las circunstancias practicas nos preocupamos por la interaccin con el antisuero (es decir, el suero proveniente de un individuo inmunizado) con un antgeno multivalente. El termino empleado para expresar esta unin es la avidez o afinidad funcional. La avidez es la fuerza con la que el Ac multivalente se une a un Ag multivalente. Aunque depende de las afinidades individuales de cada uno de los determinantes individuales de ese antgeno, su valor es mucho mayor que la suma de afinidades. Pero por otro lado, hay que considerar que los Ag naturales suelen tener ms de un tipo de determinante antignico. Cuando un antgeno de este tipo entra en un individuo, ste produce un antisuero, que presenta varios tipos de anticuerpos, cada uno de ellos dirigidos a un tipo diferente de determinante antignico del Ag original. En este caso se habla de avidez del antisuero, que es la fuerza conjunta de los distintos anticuerpos de ese antisuero que reconocen al antgeno multivalente complejo:

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n Ac + mAg

{Acn Agm}

donde n representa la heterogeneidad del anticuerpo, y m los distintos tipos de epitopos del antgeno. Los factores que contribuyen a la avidez del antisuero son complejos, pero uno muy interesante es el derivado de la multivalencia del antgeno. La fuerza de unin de un antgeno complejo multivalente a varios tipos de Ac es mucho mayor que la suma aritmtica de las fuerzas de unin de cada anticuerpo: La avidez refleja mejor la situacin fisiolgica, pero la afinidad nos caracteriza lo que ocurre con cada tipo de anticuerpo concreto en su interaccin con el eptope. La avidez es quiz una medida ms informativa de toda la estabilidad o la fuerza del complejo antgeno-anticuerpo. Esto es controlado por tres factores: la afinidad anticuerpoeptope; las valencias de ambos, antgeno y anticuerpo; y el arreglo estructural de las partes que interactan. Cuando el anticuerpo y el antgeno pueden formar complejos multivalentes, la fuerza de interaccin es grandemente incrementada. Estos factores definen la especificidad del anticuerpo, que es, la probabilidad de que un anticuerpo particular se una a un preciso eptope del antgeno. Dado que la intensidad de la reaccin puede cuantificarse por la afinidad o la avidez, relacionaramos la especificidad de un antisuero con su avidez relativa por los antgenos para los que estn siendo discriminados. Al reconocer que un antisuero puede tener una avidez relativamente mayor por un antgeno que por otro, indicamos que el antisuero despliega una especificidad relativa ms que absoluta; en la prctica se habla de grados de reactividad cruzada. La reactividad cruzada se refiere a un anticuerpo o poblacin de anticuerpos unidos a eptopes sobre otros antgenos. Esto puede ser causado por ambos, por la baja avidez o especificidad del anticuerpo o por mltiples distintos antgenos que tienen idnticos o muy similares eptopes. La reactividad cruzada es a veces deseable cuando uno quiere una unin general a un grupo relacionado de antgenos o cuando se intenta clasificar especies cruzadas cuando la secuencia del eptope del antgeno no esta muy altamente conservada en la evolucin. Los aminocidos que forman el sitio de unin del antgeno son derivados de ambas cadenas, la pesada y la ligera, y corresponden a los aminocidos de las regiones hipervariables determinadas por la secuencia de la protena. Las regiones hipervariables son conocidas como las regiones determinantes de la complementariedad o CDRs (por sus siglas en ingles, complementarity determining regions). Los CDRs son seis, tres de cada cadena, y estos forman loops discretos anclados y orientados por las estructuras de los residuos de los dominios variables (Figura 4).

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Figura 4. CDRs de las regiones variables (HV = regiones hipervariables) Anticuerpos monoclonales y policlonales Cuando se disea un procedimiento experimental, es importante diferenciar entre anticuerpos monoclonales y policlonales, ya que estas diferencias son el fundamento de las ventajas y limitaciones en su uso. Muchos de los anticuerpos usados en tcnicas inmunoqumicas son producidos por inmunizacin repetida de un adecuado animal, por ejemplo, conejo, cabra u oveja, con una suspensin del antgeno apropiado. El suero es tomado en el pico de produccin del anticuerpo. Concentraciones especficas de IgG de aproximadamente 1 a 10mg/mL de suero pueden ser obtenidas con este mtodo. Molculas dbilmente antignicas pueden requerir la adicin de un adyuvante, el cual permite una salida mas lenta del antgeno haciendo que sea mas rpidamente atrapado por los macrfagos. Molculas pequeas como drogas pueden ser acopladas a estructuras ms antignicas (protenas acarreadoras) para estimular la respuesta inmune. Una caracterstica de grandes molculas antignicas es que ellas inducen la activacin de muchas clulas B productoras de anticuerpos en el animal inmunizado. Esta mezcla de 17

anticuerpos policlonales resultantes puede entonces reconocer una variedad de eptopes sobre el antgeno, el cual puede ser una caracterstica de uso especial en algunos procedimientos experimentales (Figura 5). Debido a que esta mezcla de anticuerpos policlonales reacciona con mltiples eptopes sobre la superficie del antgeno, ellos pueden ser ms tolerantes de cambios menores en el antgeno, por ejemplo, polimorfismo, heterogeneidad de glicosilacin o ligera desnaturalizacin, que los anticuerpos monoclonales (homogneos). Dependiendo del antgeno que se haya usado para crear el anticuerpo, uno puede usar anticuerpos policlonales para identificar protenas de alta homologa con la protena inmunognica o para escoger de la protena blanco en muestras de tejido de otras especies que el inmungeno. A lo largo de la misma lnea, esto es especialmente importante cuando se trabaja con anticuerpos policlonales instruirse acerca del inmungeno que ha sido usado para la produccin del anticuerpo policlonal y el potencial para indeseables reacciones cruzadas dentro de la misma muestra. Pptidos inmunognicos son frecuentemente usados para generar anticuerpos policlonales que centran un nico eptope, especialmente para familias de protenas de alta homologa.

Figura 5. Anticuerpos policlonales y monoclonales Una poblacin homognea de anticuerpos (anticuerpos monoclonales) puede ser promovida por fusin de linfocitos B con cultivos de clulas inmortales para producir hibridomas. Los hibridomas producen muchas copias del mismo anticuerpo exacto. Este fenmeno impresionante ha sido fundamental en el desarrollo de anticuerpos con aplicaciones de diagnostico. Debido a que los anticuerpos monoclonales reaccionan con un eptope del antgeno, estos son ms vulnerables a la perdida del eptope a travs de

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tratamientos qumicos del antgeno que los anticuerpos policlonales. Esto puede ser compensado por el uso de dos o ms anticuerpos monoclonales del mismo antgeno. Algunos usos de las propiedades de anticuerpos policlonales son: Los anticuerpos policlonales frecuentemente reconocen mltiples eptopes hacindolos ms tolerantes a pequeos cambios en la naturaleza del antgeno. Son frecuentemente la opcin preferida para la deteccin de protenas desnaturalizadas. Pueden ser generados en una variedad de especies, incluyendo conejos, cabras, ovejas, asnos, gallinas y otros, dndole al usuario muchas opciones en el diseo experimenta. Los anticuerpos policlonales son a veces usados cuando la naturaleza del antgeno en una especie no estudiada no se conoce. Los anticuerpos policlonales se une a mltiples eptopes y as ellos generalmente proveen una deteccin ms robusta.

Algunos usos y propiedades de anticuerpos monoclonales son: Debido a su especificidad, los anticuerpos monoclonales son excelentes como anticuerpos primarios en un ensayo, o para detectar antgenos en un tejido y frecuentemente dan significativamente menos tincin de fondo que los anticuerpos policlonales. Cuando se compara con los anticuerpos policlonales, la homogeneidad de los anticuerpos monoclonales es muy alta. Si las condiciones experimentales se mantienen constantes, los resultados provenientes de anticuerpos monoclonales son altamente reproducibles entre experimentos. La especificidad de los anticuerpos monoclonales los hacen extremadamente eficientes para la unin al antgeno dentro de una mezcla de molculas relacionadas, como para el caso de la purificacin por afinidad.

Tcnicas inmunoqumicas Gran parte de los progresos alcanzados por la biologa moderna se deben al perfeccionamiento de los mtodos analticos de medida. La introduccin de los procedimientos basados en las reacciones inmunolgicas ha representado un importante avance en el anlisis de sustancias de inters en biologa animal y vegetal difciles de medir empleando los mtodos bioqumicos habituales. Dentro de los procedimientos inmunolgicos, los ms tiles y prcticos son aquellos que se basan en la especificidad de la unin Ag-Ac. La propiedad que tienen las Igs de unirse a un Ag, la especificidad de esta unin y el hecho de que pueda ser visualizable por los fenmenos de precipitacin, aglutinacin y otros mecanismos indirectos (marcaje con fluorescena, con radioistopos o con enzimas) hacen que estos mtodos se empleen ampliamente. Dado que los antgenos y anticuerpos se definen por sus interacciones mutuas, uno de ellos puede utilizarse para cuantificar al otro. Si disponemos de una solucin de un anticuerpo 19

monoclonal, podemos definir su afinidad y especificidad con considerable confiabilidad y, si est en estado puro y en su conformacin nativa, conoceremos que la concentracin de anticuerpos es la misma que la de la inmunoglobulina, en mg/mL u otra unidad. Cuando se determina el contenido de anticuerpos en un antisuero, el problema es diferente debido a que la fraccin inmunoglobulina esta compuesta de una serie enorme de molculas en cantidades y afinidades variables. Los sueros pueden compararse de acuerdo con su contenido de anticuerpos, ya sea por la determinacin de cuantos anticuerpos se unen al antgeno en una dilucin fija del suero o por la comprobacin de una dilucin seriada del suero para comprobar a que nivel una cantidad estndar de antgeno es suficiente para dar un resultado positivo de la unin. ste es denominado titulo de anticuerpos. Para tomar un ejemplo, un suero podra diluirse, digamos, 10,000 veces y aun dar una prueba de aglutinacin positiva. Este titulo de 1:10,000 permite realizar una comparacin con otro suero mucho ms dbil que solo posea un titulo, digamos 1:100. Ntese que el ttulo de un suero dado variar de acuerdo con la sensibilidad de la prueba, ya que se necesitan cantidades mucho ms pequeas de anticuerpos para unirse al antgeno cuando la prueba posee una alta sensibilidad, como la aglutinacin, que en el caso de una prueba de baja sensibilidad, como la precipitacin, la cual requiere concentraciones altas del producto antgeno-anticuerpo. Existen diversos mtodos basados en procedimientos distintos para visualizar la unin AgAc (Tabla 3). Tabla 3. Principales mtodos analticos basados en la unin Ag-Ac Trazador Denominacin Complejo Ag-Ac Tcnicas de inmunoprecipitacin (tcnica de Ouchterlony, Inmunoelectroforesis, difusin radial Mancini, nefelometra, etc.) Aglutinado Tcnicas de inmunoaglutinacin. (Hemaglutinacin directa e indirecta y otras tcnicas con ltex, etc.) Fluorocromo Tcnicas inmunofluorimtricas Radioistopos Tcnicas inmunorradiolgicas (Radioinmunoensayo -RIA-) Enzimas Tcnicas inmunoenzimticas As tenemos: 1. Tcnicas de aglutinacin. Cuando el antgenos e encuentra unido o formando parte de clulas, bacterias o partculas, la reaccin Ag-Ac se puede detectar y cuantificar por el aglutinado celular o bacteriano formado. 2. Tcnicas de fluorescencia y citometra de flujo. Para la realizacin de estas tcnicas el anticuerpo se marca con un fluorocromo detectndose la formacin del complejo Ag-Ac por la fluorescencia emitida. 3. Tcnicas de radioinmunoensayo. En estas tcnicas al anticuerpo se une un istopo radiactivo siendo posible la cuantificacin del complejo Ag-Ac a travs de la radiactividad emitida. 4. Cromatografa de afinidad. La especificidad de la unin Ag-Ac puede utilizarse para obtener Acs y Ags puros.

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5. Inmunoprecipitacin e inmunoblotting. Permite detectar la presencia y cantidad de antgenos y anticuerpos especficos. Tcnicas de precipitacin Reaccin de precipitacin clsica Cuando un antgeno en solucin se agrega de manera progresiva a un antisuero potente, se forman precipitados del complejo antgeno-anticuerpo (Figura 6a y b). El entrecruzamiento de antgenos y anticuerpos da origen a estructuras enrejadas tridimensionales, las que coalescen, en gran parte a travs de la interaccin Fc-Fc, para formar grandes agregados que precipitan. A medida que se agregan ms y ms antgeno se alcanza un ptimo (Figura 6b) despus del cual, de modo uniforme, se forma menos precipitado. En esta etapa puede demostrarse que el sobrenadante contiene complejos solubles de antgeno (Ag) y anticuerpo (Ac), gran parte con composicin Ag4Ac3, Ag3Ac2 y Ag2Ac (Figura 6c). En el extremo de exceso de antgeno (Figura 6c) el anlisis por ultracentrifugacin revela que los complejos son sobre todo de la forma Ag2Ac, un resultado directamente atribuible a los dos sitios de combinacin (bivalencia) de la molcula del anticuerpo IgG. Los sueros contienen con frecuencia hasta el 10% de anticuerpos no precipitantes, los que son efectivamente monovalentes debido a la presencia asimtrica de oligosacridos en uno de los brazos de unin al antgeno de la molcula de anticuerpo, que bloquea de modo estereoqumico el sitio de combinacin. Asimismo, los precipitados francos solo se observan cuando los antgenos, y en particular los anticuerpos, estn presentes en concentraciones bastante grandes. Por lo tanto, cuando se forman los complejos que no precipitan de manera espontnea, deben aplicarse mtodos ms sofisticados para estimar el nivel de anticuerpos.

Figura 6. Representacin esquemtica de complejos formados entre un antgeno hipottico tetravalente y un anticuerpo bivalente mezclados en diferentes proporciones. Los anticuerpos no precipitantes pueden detectarse por nefelometra. Los pequeos agregados formados cuando se mezclan soluciones diluidas de antgeno y anticuerpo crean 21

una nubosidad o turbidez, que puede determinarse por dispersin angular anterior de una fuente de luz incidente (nefelometra). La mayor sensibilidad puede obtenerse mediante el uno de una luz monocromtica proveniente de un lser y con el agregado de polietilenglicol a la solucin, de modo tal que aumenta el tamao del agregado. En la practica, la nefelometra se aplica ms a la deteccin de antgenos que a la de anticuerpos. Para la realizacin de estas tcnicas se requiere que tanto el Ac como el Ag se encuentren en un medio fluido en el que sea posible la precipitacin del complejo Ag-Ac. Existen diferentes modalidades siendo las principales: 1. Tcnica de precipitacin propiamente dicha. 2. Tcnica de difusin radial de Ouchterlony. 3. Tcnica de inmunoelectroforesis. 4. Tcnica de difusin radial simple de Mancini. 1. Tcnica de precipitacin El complejo Ag-Ac precipita espontneamente o por centrifugacin cuando la proporcin de Ags y Acs de la mezcla es equivalente. En la Figura 7 se muestra un esquema de los tipos de complejos formados al mezclar, en tubos de ensayo, soluciones con diferentes cantidades de antgenos a los que se aaden igual cantidad de un antisuero. La precipitacin es mxima all donde la proporcin entre ambos es ptima (parte central de la curva), pero va disminuyendo a medida que predomine el Ac o el Ag (izquierda y derecha de la curva respectivamente) Este tipo de reaccin no es muy utilizado al requerirse grandes concentraciones de antgeno y de anticuerpo para poder medir el precipitado formado.

Figura 7. Curva de precipitacin obtenida mezclando concentraciones de antgeno con una cantidad constante de anticuerpo.

2. Tcnica de difusin radial doble de Ouchterlony

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Esta tcnica se realiza en placas de agar en donde se practican pocillos (Figura 8), en uno de estos pozos se coloca el suero o muestras a investigar y en el resto se coloca el anticuerpo preparado frente a la sustancia que se quiere identificar. Cuando difunden, ambos sistemas se encontrarn y se formar en la zona de equivalencia el complejo Ag-Ac correspondiente que se hace visible en forma de una lnea de precipitacin. En una preparacin que contenga varios antgenos, se obtendrn mltiples lneas de precipitado. La tcnica de Ouchterlony permite identificar sustancias segn la forma de unirse las lneas de precipitacin de dos o varios sistemas.

Figura 8. Placa de doble difusin de Ouchterlony en agar preparada 3. Tcnica de inmunoelectroforsis La inmunoelectroforesis es una tcnica que se realiza en dos fases. Primero se separa la mezcla de Ags por electroforesis y posteriormente el antgeno que se desea detectar se hace reaccionar con un anticuerpo especfico colocado en un pocillo lateral. Por difusin llegan a encontrarse los antgenos y el antisuero, apareciendo el complejo Ag-Ac visible en forma de lneas de precipitacin que pueden ser estudiadas por comparacin con un sistema estndar (Figura 9). En Inmunologa clnica, esta tcnica puede utilizarse en la identificacin de las protenas de mieloma. Incremento de precipitacin por inmunoelectroforesis con contracorriente Esta tcnica puede aplicarse a antgenos que migran hacia el polo positivo en la electroforesis en agar (si es necesario, los antgenos pueden sustituirse por grupos con carga negativa para lograr este fin). El antgeno y el antisuero se colocan en orificios realizados en el agar y se les aplica una corriente elctrica (Figura 10). El antgeno migra de manera progresiva a la zona del anticuerpo donde sucesivamente se une ms y ms a las molculas del anticuerpo, en esencia con un aumento artificial de la concentracin efectiva de anticuerpo y, en consecuencia, forma una lnea de precipitina.

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Figura 9. Inmunoelectroforesis de suero humano normal frente a anti IgG (B) y antiinmunoglobulinas (C)

Figura 10. Inmunoelectroforesis con contracorriente 4. Tcnica de difusin radial simple de Mancini Esta tcnica se basa en la difusin cuando un antgeno difunde desde un orificio al agar que lleva incorporado un anticuerpo especfico, en un comienzo esta presente en una concentracin relativamente alta y forma complejos solubles; al difundir el antgeno se genera un gradiente de concentracin, a medida que el antgeno difunde ms, la concentracin disminuye de modo continuo hasta que se alcanza el punto en el cual los reactantes estn ms cerca de las proporciones ptimas (zona de equivalencia), el inmunocomplejo se insolubiliza y se forma un anillo de precipitacin.

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Este anillo de precipitacin es fcilmente visible y las concentraciones antignicas estn en relacin directa con el rea del crculo de precipitacin (Figura 11), cuanta ms alta es la concentracin del antgeno, mayor es el dimetro del anillo. A esta tcnica tambin se le conoce como cuantificacin por inmunodifusin radial simple (SRID). Si se incorporan, digamos, tres estndares de concentracin de antgeno en la placa, puede obtenerse una curva de calibracin que sirve para determinar la cantidad de antgeno en las pruebas de muestras desconocidas. Este mtodo fue utilizado de manera sistemtica en inmunologa clnica, en particular para las determinaciones de inmunoglobulina y tambin para sustancias como el tercer componente del complemento, transferan, protena C reactiva y la protena embrionaria, -fetoprotena, que se asocia con ciertos tumores hepticos. Cuando se desea analizar una mayor cantidad de muestras se tiende a usar la nefelometra.

Figura 11. Placa de difusin radial de Mancini. Tcnicas de aglutinacin En estas tcnicas se hacen visibles los complejos Ag-Ac por la aglutinacin que producen los anticuerpos cuando el Ag forma parte o se ha unido artificialmente a la superficie de glbulos rojos, plaquetas, leucocitos, partculas de ltex, etc. Normalmente se utilizan glbulos rojos (hemoaglutinacin) o partculas de ltex. Aglutinacin de partculas recubiertas por antgeno Mientras que el entrecruzamiento de los antgenos proteicos multivalentes con el anticuerpo produce una precipitacin, la interrelacin entre clulas o partculas de gran tamao con los anticuerpos dirigidos contra los antgenos de superficie conducen a una aglutinacin. Dado que la mayora de las clulas poseen cargas elctricas, se requiere una cantidad razonable de anticuerpos entre dos clulas antes de que se supere la repulsin mutua. Por esto, puede ser difcil lograr la aglutinacin de clulas que slo poseen un nmero pequeo de determinantes, a menos que se utilicen mtodos especiales, como el tratamiento adicional

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con un reactivo antiglobulina. De manera similar, la mayor avidez del anticuerpo multivalente IgM con respecto a la IgG hace que el primero sea ms eficaz como agente aglutinante, molcula por molcula (Figura 12).

Figura 12. Mecanismo de aglutinacin de partculas recubiertas por antgeno Las reacciones de aglutinacin se utilizan para identificar bacterias y para tipificar los glbulos rojos; estas reacciones fueron observadas con leucocitos y plaquetas, e incluso con espermatozoides en cientos casos de infertilidad masculina debida a aglutininas presentes en el esperma. Debido a su sensibilidad y conveniencia, el uso de la prueba se ha extendido a la identificacin de anticuerpos contra antgenos solubles que de modo artificial se adhieren sobre eritrocitos, las partculas de ltex o de gelatina. La aglutinacin de las partculas de ltex recubiertas por IgG se utiliza para detectar los factores reumatoideos. Pruebas similares que utilizan partculas recubiertas con antgeno pueden llevarse a cabo en placas de microtitulacin con fondo en U, donde puede observarse el patrn de sedimentacin en el fondo de las cubetas; esto proporciona un indicador mas sensible que la aglutinacin macroscpica. La cuantificacin de grados ms sutiles de aglutinacin puede lograrse por nefelometra o por un contador Coulter. Hemoaglutinacin directa La presencia de antgenos en la superficie de los glbulos rojos se puede detectar por la hemoaglutinacin producida cuando se aade un antisuero con anticuerpos frente a dichos antgenos. Esta tcnica se emplea habitualmente para la identificacin de los grupos sanguneos y Rh, para lo cual a la sangre heparinizada se le aaden los antisueros correspondientes: anti-A, anti-B o anti-AB (todos ellos anti-Rh negativos). Habr aglutinacin cuando los glbulos rojos posean la especificidad del antisuero aadido (Tabla 4). De igual manera se procede con antisueros anti-Rh para la determinacin de los distintos grupos Rh. Tabla 4. Determinacin del grupo sanguneo Grupo Aglutinacin con suero sanguneo Anti-A Anti-B Anti-AB O A + + B + + AB + + + 26

Hemoaglutinacin indirecta Se basa en el principio de la inhibicin de la hemoaglutinacin. Para su realizacin se precisan glbulos rojos a los cuales se les ha unido la misma sustancia que se desea detectar o cuantificar (Figura 13). Si estos glbulos rojos son puestos en presencia de anticuerpos preparados frente a dicha sustancia se producir su aglutinacin. Por el contrario, cuando se aade un suero problema que contiene la sustancia a cuantificar entonces los anticuerpos se unirn a dicha sustancia y no a los glbulos rojos. En este caso no se producir la hemoaglutinacin. Por tanto, aglutinacin (+) indica ausencia de la sustancia a estudiar, y aglutinacin (-) indica presencia de la misma. La medida de gonadotrofina corinica (HCG) para el diagnstico de embarazo puede realizarse por esta tcnica.

Figura 13. Inhibicin por aglutinacin de glbulos rojos con gonadotrofina corinica (HCG) presente en suero Tcnicas de inmunofluorescencia La fluorescencia es una propiedad de ciertas molculas que, al ser irradiadas con energa electromagntica de longitud de onda adecuada, emiten radiacin de longitud de onda caracterstica permitiendo su cuantificacin. Las molculas de un colorante fluorescente absorben luz en una longitud de onda y convierten la luz absorbida de alta energa (longitud de onda ms corta) en luz de menor energa (longitud de onda ms larga). Cada fluorocromo tiene un espectro de emisin y excitacin caractersticos; si se utilizan dos con el mismo espectro de excitacin pero distinto espectro de emisin, se pueden medir dos caractersticas al mismo tiempo (fluorescencia de dos colores).

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Una molcula que fluoresce puede ser fijada en el anticuerpo para ser detectada usando luz UV. Ejemplos de estas molculas son la Fluorescena, Rodamina, Texas Red, Cy3 y Cy5 (Figura 14). En la seleccin de los fluorocromos, uno esta limitado por la disponibilidad del juego de filtros del microscopio a utilizar. Muchos juegos de filtros son ms compatibles con rodamina o fluorescena. El Texas red puede ser usado tambin con un juego de filtros para rodamina.

Figura 14. Fluorforos y sus espectros de absorcin y emisin La inmunofluorescencia se utiliza esencialmente en la deteccin de autoanticuerpos y anticuerpos contra antgenos de superficie de clulas y tejidos.

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Figura 15. Inmunofluorescencia directa (izquierda) e indirecta (derecha) Para ello se emplean anticuerpos preparados frente a la protena que se desea detectar marcados con molculas fluorescentes (Figura 15). Se aprecia si hubo unin del anticuerpo con el antgeno por la fluorescencia emitida, que se observa bajo microscopio de luz ultravioleta. Este procedimiento (inmunofluorescencia directa) tiene la limitacin del marcaje con un fluorocromo de cada uno de los anticuerpos necesarios para cada una de las sustancias a investigar. Para evitar esto, lo que se hace es tratar el tejido o clulas con antisueros anti-antgeno producidos, por ejemplo, en conejo y secundariamente antiinmunoglobulinas marcadas con un fluorocromo (inmunofluorescencia indirecta) Citometra de flujo La tcnica de inmunofluorescencia se suele utilizar en el estudio de poblaciones de clulas de sangre perifrica. Actualmente el anlisis de una suspensin de clulas vivas marcadas con un fluorocromo se realiza mediante un citmetro de flujo. La suspensin celular se hace circular en forma de gotas microscpicas. Las clulas pasan por un campo de deteccin atravesado por un potente rayo lser que produce la dispersin de la luz y la activacin de la fluorescencia. Mediante sensores especficos se analizan y cuantifican las poblaciones en estudio en funcin de sus propiedades fisicoqumicas y del marcaje efectuado. Para la separacin celular este aparato lleva acoplado un sistema que carga elctricamente las clulas y con placas deflectoras se realiza su separacin (Figura 16). Adems de basarse en la deteccin de la fluorescencia emitida por las clulas marcadas, tambin lo hace en otras propiedades diferenciales de las clulas en estudio como tamao (FSC), complejidad (SSC), etc. (Figura 17).

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Figura 16. Representaciones de un citmetro de flujo y separacin celular (FACS, Fluorescente Activated Cell Sorter)

Figura 17. Imagen de dos dimensiones de citometra de flujo (Dot-Plot) La seal producida como consecuencia de la excitacin del fluorocromo, permite conocer el porcentaje de clulas reconocido por el anticuerpo monoclonal empleado. Como consecuencia se observan imgenes en dos dimensiones (Dot-Plot) (Figura 18).o en una dimensin (Histograma) (Figura 19) en las que se distinguen las diferentes poblaciones celulares marcadas.

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Figura 18. Imagen en dos dimensiones de citometra de flujo (Dot-Plot). Detalle de las subpoblaciones linfocitarias definidas mediante inmunofluorescencia La puesta a punto de las tcnicas de citofluorometra, en las que se conjugan los avances de informtica, rayos lser y anticuerpos monoclonales permite el anlisis fenotpico y funcional de las clulas T, B y de todas aquellas clulas de las que se disponga de un antisuero que las identifique. En la tabla 5 se recogen los valores normales obtenidos en clulas de sangre perifrica.

Figura 19. Imagen en una dimensin (histograma) de una de las fluorescencias medidas en el dot-plot

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Tabla 5. Niveles en suero de las inmunoglobulinas (mg/dl) IgG IgA Recin nacido 1-3 meses 4-6 meses 6-12 meses 1 a 2 aos 2 a 3 aos. 3 a 4 aos 4 a 7 aos 7 a 10 aos Adultos 500-1000 300-500 300-500 500-700 600-1200 750-1500 750-1800 800-1800 800-1800 800-1800 0-5 2-16 15-30 30-60 30-175 70-250 90-390 90-450 90-450 90-450

IgM 0-10 15-30 35-60 60-180 60-220 60-250 60-280 60-280 60-280 60-280

Marcadores de linfocitos B. Para cuantificar los linfocitos B totales se utiliza el marcador CD19. Por otro lado, en los linfocitos B activados se pierde la expresin de las molculas CD21, CD22 y CD24, hay un incremento en la expresin de molculas HLA-DR y de receptores de linfocinas (por ejemplo el receptor de la IL-2) y aparecen marcadores nuevos, como el CD23, ausente en linfocitos B en reposo. Marcadores de linfocitos T. En este caso se utilizan los marcadores CD3, CD4 y CD8 presentes de forma especfica en linfocitos T totales y en la subpoblaciones de clulas T de colaboracin y citotxicas/supresoras respectivamente. En el proceso de activacin celular T se expresan nuevas molculas de superficie, son principalmente receptores para factores de crecimiento y proliferacin celular. Entre estos nuevos antgenos de activacin expresados en la superficie celular se incluyen: a) receptores de interleucinas (como la molcula CD25 que corresponde a la cadena p55 del receptor de la IL-2); b) receptores de la insulina y de la transferrina (CD71); c) antgenos del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) clase II, que no estn presentes en linfocitos T en reposo; y d) una gran variedad de molculas de superficie, cuya funcin no es totalmente conocida (por ejemplo, CD26, CD29, VLA-2, CD69). n(Ac)+c(Ag) + m(Ag*) <---> h(Ag-Ac)+j(Ag*-Ac)+K(Ag*)+I(Ag) donde: Ac: Anticuerpo; Ag: Antgeno (sustancia a cuantificar); Ag*: Antgeno marcado con un istopo; Ag-Ac: Complejos de anticuerpos y antgenos no marcados y Ag*-Ac: Complejos de anticuerpos y antgenos marcados. Tcnica de radioinmunoensayo El radioinmunoensayo (RIA) se basa en la competencia que se establece, para unirse a anticuerpos especficos, entre la sustancia a cuantificar y cantidades conocidas de la misma sustancia marcada con un istopo. Al establecerse esta competicin resulta que a mayor cantidad de sustancia a cuantificar, menor ser la cantidad de sustancia radiactiva que se une al anticuerpo y viceversa.

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Figura 20. Esquema del principio general de radioinmunoensayo para medir hormonas Este tipo de reaccin se encuentra esquematizado en la Figura 20. Los resultados se obtienen al medir la radiactividad de la hormona marcada unida al anticuerpo y la de la hormona marcada libre mediante un contador de centelleo. Al centrifugar, la hormona libre queda en solucin y la hormona unida al anticuerpo forma agregados fcilmente precipitables. Una vez medida la radiactividad se construye una curva con los resultados obtenidos con cantidades conocidas de hormona sin marcar y marcada. A esta curva se llevan los valores obtenidos de los sueros problema y se obtiene la concentracin de la hormona no marcada a investigar. En el RIA directo, a la fase slida se une una cantidad conocida de Ac. Diferentes concentraciones conocidas de antgeno marcado se incuban con una concentracin constante de la muestra de la que se desea conocer la concentracin del antgeno en cuestin. El fundamento y la deteccin no sufriran cambios respecto lo anteriormente comentado. El RIA de inhibicin tambin sera una tcnica competitiva de anlisis pero lo que se une a la fase slida es una cantidad fija de antgeno. Para el proceso de inhibicin se incuba una concentracin fija de anticuerpo marcado frente a una serie de diluciones de la muestra que contiene el antgeno. Existe una tcnica no competitiva que es el denominado sndwich: Se une un Ac en cantidades constantes a la fase slida. Una vez realizado el bloqueo, se aade el antgeno en concentraciones variables. Posteriormente se aade un segundo anticuerpo contra el antgeno, pero esta vez marcado. Adems del radioinmunoensayo antes descrito hemos de considerar que, en la actualidad, es cada vez ms frecuente el empleo de inmunoglobulinas marcadas con istopos radiactivos para su posterior aplicacin en diferentes campos: trazador en determinaciones in vitro de antgenos especficos, en tcnicas inmunorradiohistolgicas y tcnicas de anlisis no competitivo que pueden ser una

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alternativa al RIA en la determinacin de algunas molculas que no pueden ser marcadas directamente con radioyodo, en la deteccin de tumores primarios o metastticos (inmunoescintografa) e incluso la posibilidad de irradiacin local de clulas neoplsicas (inmunorradioterapia). Todas las posibilidades anteriormente indicadas se basan en la posibilidad de marcar el anticuerpo con radioyodo sin mermar su inmunorreactividad. El marcaje de protenas o pptidos con yodo radiactivo I125 I132 puede realizarse por diferentes mtodos. La incorporacin del yodo a la molcula se realiza en los aminocidos aromticos que forman parte de la estructura de la cadena peptdica: tiroxina, fenilalanina, triptfano o histidina. La tcnica del radioinmunoensayo posee algunos inconvenientes que derivan de la necesidad de utilizar istopos. Adems de su peligrosidad y la obligatoriedad de disponer de instalaciones adecuadas para su utilizacin, existen istopos que tienen el inconveniente de su pronta caducidad. Tcnica de enzimoinmunoensayo. Esta tcnica, tambin se conoce como ensayo de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). La identificacin de los complejos Ag-Ac, se hace mediante el empleo de enzimas, bien unidas al antgeno, o bien unidas al anticuerpo. El ensayo de ELISA puede ser directo o no competitivo, constando de los siguientes pasos: a) Se tapiza la placa con el anticuerpo especfico frente al antgeno a determinar. b) Se aade la muestra con el antgeno. c) Se adiciona el anticuerpo secundario marcado con la enzima que en presencia de su sustrato da un producto coloreado soluble, este producto es cuantificado mediante el lector de ELISA (Figura 21), e indirecto o competitivo, se diferencia del caso anterior en que se aaden los anticuerpos, previamente incubados con la muestra, los anticuerpos que no se han unido a los antgenos de la muestra lo harn a los antgenos de los pocillos. Como enzimas se suelen utilizar la peroxidasa, la galactosidasa o la glucosa oxidasa. Esta tcnica se utiliza para la medida de hormonas, antgenos de la hepatitis y otras muchas sustancias que se encuentran a muy bajas concentraciones. Una variante de esta tcnica de gran utilidad se conoce como ensayo en fase slida y est orientada a la determinacin de anticuerpos frente a un determinado antgeno. Para ello el antgeno se encuentra fijo a un soporte (por ejemplo tubo de plstico). Al aadir la muestra con el posible anticuerpo se unir y podr ser detectado aadiendo anti-inmunoglobulinas marcadas con el enzima.

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Figura 21. Principio bsico de la tcnica de ELISA indirecto o competitivo y directo o no competitivo Otra variante de las aplicaciones inmunoenzimticas es cuando el antgeno se encuentra fijo en clulas o tejidos. Al igual que hemos visto en el apartado de inmunofluorescencia indirecta, en este caso tambin se emplean dos anticuerpos. El primero, con actividad frente a los antgenos a estudiar, y el segundo, que va dirigido frente al primero y que acta de puente con el complejo portador de la enzima. Cuando la enzima es la peroxidasa, este complejo suele ser una peroxidasa-antiperoxidasa (PAP) (Figura 22). La diferencia principal entre las tcnicas de RIA y ELISA es que la primera utiliza como marcador un istopo y la segunda la actividad de un enzima, as el RIA directo y el ELISA competitivo seran equivalentes, y tambin existira ELISA de inhibicin y ELISA en sndwich. El ensayo ELISA tipo sndwich es un ensayo de captura de antgeno y deteccin mediante inmunocomplejos. Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antgeno. Despus de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antgeno, que ser retenido en el pocillo al ser

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reconocido por el primer anticuerpo. Despus de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solucin con un segundo anticuerpo anti-antgeno marcado. As pues cada molcula de antgeno estar unido a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificacin de seal que permite el segundo anticuerpo.

Figura 22. Tcnica de peroxidasa aplicada a tejidos Existen inmunoensayos que se denominan homogneos en los cuales no es necesario la separacin de necesario la separacin de los inmunocomplejos de los reactivos libres. Son tcnicas muchas de ellas patentadas por diferentes firmas comerciales. En la tabla 6 se recogen los marcadores enzimticos ms comnmente empleados en ensayos ELISA, los sustratos que se emplean para su revelado y el modo de prepararlos. Nefelometra Esta tcnica se basa en la deteccin de los complejos Ag-Ac, por la refraccin que dichos complejos producen sobre rayos de luz que se hacen pasar por el tubo con el antgeno y el anticuerpo correspondiente. Habitualmente se utilizan rayos lser y se establece una relacin entre la cantidad de luz que llega y la cantidad de complejos formados (Figura 23).

Figura 23. Esquema de un nefelmetro. Los complejos Ag-Ac formados son cuantificados por el grado de difraccin. 36

Tabla 6. Marcadores enzimticos ms comnmente utilizados Enzima Sustrato Tampn HRP OPD 10mg/25mL de tampn citrato sdico 0.15 M pH 5; aadir L de (peroxidasa 30% perxido de hidrgeno 30% de rbano) TMB 2.5mg/250L de DMSO; hasta 25mL con tampn citrato sdico 0.1M pH 6; aadir 5 L de perxido de hidrgeno 30% ABTS 60mg/100mL de tampn citrato sdico 0.1 M pH 6; aadir 35 L de perxido de hidrgeno 30%; parar con fluoruro sdico 1.25%; leer a 405nm DAB 10mg/20mL de tampn Tris 50mM pH 7.4; filtrar y aadir 20 L de perxido de hidrgeno 1% CNP 6mg en 1mL de metanol; aadir 10mL de tampn Tris 50mM pH 7.4; filtrar y aadir 40L de perxido de hidrgeno 30% AEC 80mg en 1mL de N,N'-dimetilformamida + 200L de tampn acetato 0.1 M pH 4.5; filtrar y aadir 50L de perxido de hidrgeno 30% ASA 80mg/100mL de agua destilada caliente; ajustar a pH 6.0 con 1mM NaOH y aadir 10 % por volumen de 0.05% perxido de hidrgeno; parar con 25L de NaOH 1M AP PNPP 5mg/5mL de tampn dietanolamina-HCl 0.1M pH 9.8 +1mM (Fosfatasa cloruro de magnesio alcalina) NAPFB (A) 4mg de fosfato de naftol en 200L de dimetilformamida en un tubo de vidrio, (B) 10mg de sal Fast Blue BB/ 10mL de tampn Tris 0.05M pH 9.2 - 2mM cloruro de magnesio. Mezclar A + B y filtrar. NAPR (A) 4mg de fosfato de naftol en 200L de dimetilformamida en un tubo de vidrio, (B) 10mg de sal Red BB/ 10mL de tampn Tris 0.05M pH 9.2 - 2mM cloruro de magnesio. Mezclar A + B y filtrar. BCIP 1mg/mL en solucin AMP (2-amino-2-metil-propanol) beta-G ONPG 2.5mg/ml en tampn fosfato sdico 0.1M pH 7.0 + 1mM cloruro de magnesio + 0.1M beta-mercaptoetanol ureasa BP 8mg/1.48ml de 0.01M NaOH; llevarlo a 100mL con agua desionizada; aadir 100mg de urea y EDTA a 0.2mM; ajustar el pH a 4.8 con 1mM NaOH o HCl; almacenar a 4C PG IS Aadir a cada placa de ELISA 25L de cada uno de los reactivos siguientes en secuencia : (A) 1% (peso/vol) gelatina en 0.1M tampn fosfato pH 7.0, (B) 1% (peso/vol) almidn en agua destilada caliente, (C) 3.04mg/mL de benzil-penicilina en 0.1M tampn fosfato pH 7.0 (5000 U/mL), (D) 0.01 N ioduro en 0.1M KI solucin stock (en una botella oscura) Si el antgeno se agrega a una solucin con exceso de anticuerpos, la cantidad de complejos que pueden evaluarse por la dispersin de la luz en un nefelmetro se relaciona de manera lineal con la concentracin de antgeno. Con la disponibilidad de una amplia gama de 37

anticuerpos monoclonales que facilita la estandarizacin del mtodo, la nefelometra est reemplazando a la SRID para la estimacin de inmunoglobulinas, C3, C4, haptoglobina, ceruloplasmina y PCR. Es posible analizar muestras de volumen muy pequeo, en el orden de 1-10L. La turbidez de la muestra puede constituir un problema; es posible realizar blancos carentes de anticuerpos pero una solucin ms satisfactoria es seguir la proporcin de formacin de complejos que es proporcional a la concentracin del antgeno, dado que esto evita la necesidad de un blanco separado (Figura 24). Debido a que los complejos solubles comienzan a formarse en exceso de antgeno, es importante asegurar que el valor del antgeno se obtuvo en un exceso de anticuerpo en la cual se incluye ms antgeno.

Figura 24. Nefelometra proporcional. a) Cuando se aade el antisuero, se forman pequeos agregados de Ag-Ac que dispersan la luz incidente filtrada para dar una banda de longitud de onda de 450-550nm. Para la nefelometra se mide la dispersin de la luz en un ngulo de 70. b) Despus de aadir la muestra (1) y luego el Ac (2), se determina la proporcin en la que se forma el agregado (3) a partir de la seal de dispersin. c) Un software calcula luego la mxima proporcin de dispersin de la luz que se relaciona con la concentracin del Ag, como se muestra en d) Este procedimiento es rpido y sensible y se est utilizando en la actualidad, sobre todo, para la cuantificacin de protenas en suero y en otros lquidos biolgicos.

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Seleccin de clulas unidas a un anticuerpo En la actualidad se dispone de varios mtodos para seleccionar clulas a las que previamente se ha unido un anticuerpo. La adicin de complemento elimina dicha poblacin celular (seleccin negativa), es la denominada tcnica de inmunotoxicidad.

Figura 25. Fundamento de la separacin celular empleando la tcnica de Dynabeads La separacin inmunomagntica se basa en la interaccin entre antgenos celulares superficiales y anticuerpos unidos a bolas magnticas (Figura 25). La aplicacin de un campo magntico permite separar las clulas unidas a las bolas (seleccin positiva) de las clulas no unidas (seleccin negativa). Es un mtodo fcil, rpido y no muy costoso. Este mtodo presenta muchas aplicaciones no slo en Inmunologa sino tambin en Microbiologa, utilizando bolas unidas a anticuerpos frente a un determinado microorganismo; en Biologa Molecular para aislamiento de DNA y mRNA utilizando bolas a las que se adsorbe el DNA y bolas unidas a una secuencia de oligonucletidos respectivamente. Tambin se pueden usar para la purificacin de protenas si se unen las bolas a anticuerpos especficos. La separacin de clulas puede realizarse mediante el FACS (fluorescence activated cell sorting) en la que adems de los dispositivos de citometra ya mencionados se dispone de mecanismos de separacin celular en funcin de la fluorescencia emitida por las clulas marcadas con anticuerpos. Esta es la tcnica que actualmente ofrece mejores resultados. Purificacin de antgenos y anticuerpos por cromatografa de afinidad La cromatografa de afinidad es una tcnica usada en el aislamiento de anticuerpos o antgenos puros. El principio es simple y su aplicacin, muy amplia. El antgeno o el anticuerpo est unido a travs de sus grupos aminados libres a las partculas de Sepharose activadas con bromuro de ciangeno. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos insolubilizados para extraer el antgeno correspondiente de la solucin, en la que est presente como un componente de una mezcla compleja, por absorcin a su superficie. Los residuos que no interesan son eliminados por levado y el ligando requerido es liberado del

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absorbente de afinidad mediante la ruptura de los enlaces antgeno-anticuerpo por variaciones de pH o por el agregado de iones caotrpicos como el tiocianato (Figura 26). Del mismo modo, puede utilizarse un antgeno a partir de una mezcla de donde puede purificarse por elusin.

Figura 26. Purificacin de anticuerpos tpica usando un antgeno inmovilizado en columna La cromatografa de afinidad es una tcnica ampliamente utilizada en Bioqumica e Inmunologa. Puede aplicarse en el aislamiento de una poblacin pura de anticuerpos. Para ello se prepara un inmunoabsorbente en fase slida, que es un antgeno unido covalentemente a un soporte inerte, como otro ejemplo bolitas de dextrano entrecruzadas. El inmunoabsorbente, se coloca en una columna y la mezcla de anticuerpos se hace pasar a travs de l bajo condiciones fisiolgicas. Los anticuerpos especficos para el antgeno permanecen unidos a la columna, y aquellos que no se unen son eliminados mediante lavado. En el segundo paso, se eluye la columna, usando un tampn de elucin que disocia la unin antgeno-anticuerpo (por ej., acetato a pH 3.0) para obtener el anticuerpo que se uni al inmunoabsorbente. A la inversa, colocando anticuerpos en la columna se tendr antgeno puro. Esta tcnica permite obtener otros tipos de molculas. As una columna de lectina absorber todas las molculas con determinados residuos azcar, que pueden eluirse en un tampn con el azcar libre, ya que ste compite con la protena ligada por los sitios de unin a la lectina. Inmunoprecipitacin e inmunoblotting La inmunoprecipitacin es una de las tcnicas inmunolgicas ms tiles cuando se asocia a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. De este modo se pueden determinar la presencia y cantidad de un antgeno, el peso molecular relativo de una cadena polipeptdica, su sntesis y degradacin, la interaccin con protenas, cidos nucleicos u otros ligandos. La tcnica de inmunoprecipitacin se divide en seis pasos:

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1. Marcaje del antgeno (opcional) 2. Preparacin de las muestras: Lisis de las clulas para liberar el Ag 3. Formacin del complejo Ag-Ac 4. Precipitacin de los complejos Ag-Ac 5. Purificacin de los inmunocomplejos 6. Anlisis En la mayora de los casos el antgeno se marca incubndolo con un precursor radiactivo aunque muchos antgenos se pueden detectar por medios que no requieren marcaje directo. El antgeno se extrae de las clulas mediante lisis. Despus, los anticuerpos se aaden al lisado y se forman los inmunocomplejos Ag-Ac. Estos se unen por adsorcin a una fase slida que contiene protena A. Los inmunocomplejos se analizan generalmente por electroforesis en gel pero tambin pueden ser usados en diferentes tcnicas incluyendo estudios enzimticos, unin a ligandos, inmunizaciones, inmunoblotting, etc. La transferencia de protenas o 'blotting' supone la inmovilizacin de las protenas sobre membranas sintticas, seguido de la deteccin empleando sistemas especialmente diseados para la tincin de 'blots'. Una de las tcnicas de inmunoblotting es el Western blot que combina la resolucin de la electroforesis en gel con la especificidad de la deteccin inmunoqumica. Western Blot, Dot Blot y Slot Blot Se utiliza para determinar la presencia y cantidad de antgenos y de anticuerpos especficos. En la actualidad el Western blot es el estudio confirmatorio ms empleado para el diagnstico del SIDA. Se emplean antgenos virales obtenidos por cultivo celular. Mediante electroforesis se separan las diferentes protenas vricas por su diferente peso molecular. Posteriormente se transfieren a papel de nitrocelulosa y secundariamente se incuban con el suero problema. Los anticuerpos se detectan aadiendo una anti-IgG humana marcada con una enzima (peroxidasa) que produce una banda coloreada al aadir un sustrato. Esta tcnica identifica anticuerpos especficos frente a las distintas protenas del VIH (Figura 27). Las protenas son separadas en primer lugar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y posteriormente se transfieren mediante la aplicacin de un campo elctrico perpendicular al gel a una membrana. El procedimiento es anlogo al desarrollado por el Prof. E. Southern ('Southern blotting') y por ello se le denomin 'Western'.

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Figura 27. Tcnica de inmunoblotting. Consiste en la separacin electrofortica de protenas virales, y posterior revelado con anti-IgG marcada con peroxidasa Hay sin embargo otros mtodos de transferir o aplicar protenas sobre una membrana. El ms sencillo es aplicarlas directamente en forma de una pequea gota de una solucin concentrada sobre la membrana. La absorcin de la gota provoca la adhesin de la protena a la membrana, quedando en forma de una mancha o 'dot' (es el caso del 'dot blot'. Existen dispositivos que facilitan la aplicacin de las protenas directamente a la membrana, aplicando una succin que facilita la penetracin de la solucin, y reciben los nombres de 'dot blot' o 'slot blot' en funcin de que la protena quede aplicada en forma de una gota circular o de una lnea (Figura 28).

Figura 28. Esquema de una aparato de aplicacin directa de soluciones de protena sobre una membrana (dot blot/spot blot) Trabajar con las protenas fijadas sobre una membrana tiene ventajas sobre el emplearlas dentro del propio gel: son ms rpidas de teir y desteir. no se produce tincin de los anfolitos en los geles de isoelectroenfoque. se detectan cantidades menores de protenas pues se concentran en la superficie y no se diluyen en todo el espesor del gel. el blot es un registro conveniente y cmodo de manipular del gel. 42

las membranas son mucho ms fciles de manipular que el propio gel

Todo procedimiento de blotting consta de 5 etapas: Inmovilizacin de protenas sobre la membrana ya sea mediante transferencia (electrofortica, aspiracin, presin, etc.) o mediante aplicacin directa. Saturacin de todos los lugares de unin de protenas de la membrana no ocupados para evitar la unin no especfica de anticuerpos, que son protenas. Incubacin del blot con anticuerpo primarios contra la/s protena/s de inters. Incubacin del blot con anticuerpos secundarios, o reactivos que actan de ligando del anticuerpo primario unidos a enzimas u otros marcadores. Las bandas de protenas marcadas con enzimas se hacen visibles por incubacin con los sustratos apropiados para formar productos coloreados insolubles en el lugar donde se encuentran las bandas de protena.

Hay tres mtodos para transferir protenas a las membranas: Transferencia capilar Transferencia por difusin Transferencia electrofortica ('electroblotting')

Deteccin especfica de protenas en filtros Una protena especfica puede ser identificada y visualizada en un Western blot empleando tcnicas de inmunodeteccin (tcnicas que emplean la capacidad de reconocimiento de los anticuerpos a sus antgenos). En Western blot se emplea comnmente el sistema de inmunodeteccin indirecta que se representa en la figura 29. En este mtodo se emplea un anticuerpo primario para localizar la protena de inters. Un segundo anticuerpo, marcado con un enzima, y contra la especie en la que se ha producido el primero, se emplea para localizar donde se formaron los complejos antgeno-anticuerpo. Este anticuerpo secundario se puede marcar de formas muy diversas con el fin de producir una seal detectable (por ejemplo una seal sobre una pelcula radiogrfica o una mancha de color en el filtro). En ocasiones se emplean en lugar del anticuerpo secundario protena A o protena G. Bloqueo de la membrana Una etapa comn a todos los procedimientos de inmunodeteccin es el bloqueo, para prevenir la unin no especfica del sistema de deteccin a la membrana, con el riesgo asociado de tener un elevado 'background' o falsos positivos. Se han descrito numerosas soluciones bloqueantes, y todas ellas son efectivas. El factor esencial a tener en cuenta es elegir un sistema de bloqueo compatible con el sistema de deteccin empleado. Por ejemplo, las soluciones de bloqueo que contienen leche desnatada contienen una gran cantidad de carbohidratos complejos, y por ello deben descartarse cuando se van a emplear anticuerpos que reconocen determinantes en carbohidratos, o por ejemplo se ha de evitar el uso de suero completo si en la deteccin se emplea protena A o protena G. 43

Figura 29. Mtodos de deteccin en Western blot Las dos soluciones de bloqueo que son compatibles con casi cualquier sistema de deteccin son las soluciones de leche desnatada y las soluciones de albmina srica bovina (BSA). Tambin se recomienda el bloqueo en Tween-20 si hay demasiado 'background'. Sin embargo es conveniente usar con cuidado los detergentes no inicos como Tween-20 pues pueden solubilizar las protenas transferidas al filtro. En la tabla 7 se recogen algunas de las soluciones de bloqueo ms comnmente empleadas: Tabla 7. Soluciones de bloqueo ms comunes en Western blotting Agente bloqueante Caractersticas Leche en polvo 5% de leche desnatada en PBS /TBS. Muy econmico. Con poco 'background'. Se deteriora con rapidez. Es posible que tape algunos antgenos. Leche / Tween-20 Econmico. 5% de leche desnatada en PBS/TBS - 01% Tween-20. Con poco 'background'. Se deteriora con rapidez. Es posible que tape algunos antgenos. Tween-20 0.1% Tween-20, 0.02% azida sdica en PBS/TBS. Econmico. Permite la tincin despus de la inmunodeteccin. Puede quedar un 'background' residual. BSA 3% BSA, 0,02% azida sdica en PBS. Bueno. Relativamente econmico. Suero de caballo 10% suero de caballo, 0,02% azida sdica en PBS. Sin 'background'. Moderadamente caro. Incompatible con algunos anticuerpos antiinmunoglobulinas. Tincin de protenas en el filtro

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Habitualmente se emplean tcnicas de tincin de protenas sobre el filtro como control de la transferencia. Existen diferentes mtodos para teir todas las protenas presentes en el filtro, pero los que ms inters despiertan son los mtodos de tincin de protenas especficas a partir de mezclas complejas separadas en geles y transferidos a filtros, son los mtodos de tincin especficos, usualmente basados en mtodos inmunoqumicos. Colorantes Los colorantes que permiten teir las protenas en los geles de poliacrilamida no son utilizables en los filtros pues se unen inespecficamente a stos. Para teir las protenas en los filtros se emplean: Ponceau S, Tinta china o Negro amido. Ponceau S se emplea en forma de solucin acuosa. La tincin es rpida pero no es permanente y puede desaparecer en el procesamiento posterior. Como la tincin desaparece es compatible con casi todos los procedimientos de deteccin con anticuerpos. El mtodo de tincin de filtros con tinta china es reproducible, sensible y permanente, y no interfiere con los procedimientos de inmunodeteccin, pero puede tapar la tincin colorimtrica del proceso inmunoqumico. La tincin se basa en la adherencia preferente de las partculas coloidales de carbn de la tinta sobre las protenas inmovilizadas. La destincin se hace en PBS. El negro amido es menos sensible que la tinta china. Las bandas aparecen negras sobre un fondo azul claro. Despus de la tincin se destie con una solucin de metanol/cido actico. Este mtodo de tincin es incompatible con la inmunodeteccin posterior. Tincin mediante biotina-estreptavidina Este mtodo de tincin se basa en la afinidad de la estreptavidina por la biotina. Los grupos amino primarios y secundarios de las protenas unidas a la nitrocelulosa se pueden biotinilar empleando un derivado N-hidroxido succinimida de la biotina que contiene un brazo espaciador hidrofbico. Un lavado posterior elimina el exceso de biotina y despus se bloquea la membrana con una solucin de leche en polvo. Las protenas biotiniladas pueden ser detectadas empleando un complejo preformado de estreptavidina-enzima y el sistema de deteccin de la actividad enzimtica (Figura 30). Tincin mediante oro coloidal Existen productos comerciales como AuroDye-R de Amersham que acta como colorante para protenas sobre filtros. Se trata de una solucin coloidal estabilizada de oro a pH 3. A este pH las partculas de oro estn cargadas negativamente y se unen especficamente a las protenas. No se puede usar sobre membranas de Nylon pues se une no especficamente a las cargas de la membrana. El color obtenido es rojo oscuro. Existen sistemas de amplificacin de seal. Este mtodo tiene una sensibilidad similar al de la tincin con plata de los geles.

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Figura 30. Deteccin de protena total en un Western blot usando biotina-estreptavidina Anlisis de interacciones moleculares La tcnica utilizada en el anlisis de interacciones moleculares en el BIAcore se basa en un fenmeno ptico, el principio de resonancia del plasmn de superficie (SPR). Al iluminar con luz polarizada una interfase entre medios con diferente ndice de refraccin separados por una lmina de material conductor se puede apreciar una sombra en su reflejo. Esta zona de sombra se debe al acoplamiento entre la energa de la luz incidente y los plasmones de superficie de la pelcula conductora que separa los dos medios. El ngulo de esta sombra con la interfase depende directamente del ndice de refraccin del medio donde se propaga la onda evanescente, es decir la cara opuesta a la de la luz incidente y reflejada. Estos cambios se detectan solo cerca de la interfase, ya que la onda evanescente decae de manera exponencial a la distancia de la superficie (Figura 31).

Figura 31. Esquema del principio bsico del BIAcore. SPR obtenido por reflexin total interna
en una interfase entre vidrio-metal. El instrumento permite el registro de las interacciones en tiempo real entre las macromolculas (Y invertidas) depositadas en la superficie del biosensor y las molculas que fluyen por el canal (esferas pequeas)

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En el BIAcore, las interacciones entre biomolculas cambian la concentracin del soluto y por tanto el ndice de refraccin en la zona de la interaccin. El fenmeno SRP permite medir los cambios de masa producidos en una superficie entre la molcula unida a la misma y otras en suspensin, en tiempo real, sin necesidad de marcaje y de manera totalmente independiente a la naturaleza de las molculas que interaccionan.

Figura 32. Monitoreo la respuesta del SPR en trminos de la unin al receptor Aplicaciones principales Interacciones antgeno-anticuerpo (afinidad y cintica de anticuerpos monoclonales, "screening" de anticuerpos). Diseo de frmacos (caracterizacin de molculas modificables). Interacciones DNA protena, procesos de elongacin e hibridacin. Interacciones celulares (virus, clulas eucariotas). Otras tcnicas basadas en la unin antgeno-anticuerpo Hay otros modos para detectar el complejo antgeno-anticuerpo una vez que ste se ha formado, adems de los descritos en los apartados anteriores. Son, por ejemplo, las tcnicas basadas en el marcaje de anticuerpos con ferritina u oro coloidad, de gran utilidad en microscopa electrnica. La tcnica de anticuerpos marcados con ferritina se basa en el hecho de que casi el 25% de esta molcula est formada por hierro que, al ser opaco a los electrones, puede ser detectado en microscopa electrnica. Los anticuerpos pueden ser combinados a la ferritina (u otras protenas) mediante ligandos bivalentes como el 1,3-difluoro-4,6-dinitrobenceno o la bencidina bidiazoica entre otros. La tcnica basada en el marcaje de anticuerpos con oro coloidal y su uso en microscopa electrnica se basa, al igual que en el caso anterior, en la opacidad de estas molculas a los 47

electrones. Estas tcnicas son de gran utilidad en inmunohistologa e inmunocitologa humana, animal y vegetal aplicado directamente sobre clulas o secciones de tejidos. Tambin estn tomando cada vez mayor auge las tcnicas quimioluminiscentes. La quimioluminiscencia consiste en trminos generales en la produccin qumica de la luz. Los marcadores quimioluminiscentes son sustancias capaces de emitir luz cuando, al absorber la energa de una reaccin qumica oxidativa, son colocadas en un estado de excitacin electrnica. La emisin de luz se produce al volver a su estado inicial y la energa qumica absorbida se cede en forma de fotones fcilmente cuantificables con un fotodetector. Los marcadores quimioluminiscentes constituyen una alternativa al uso de istopos radiactivos en el inmunoanlisis, pues los compuestos quimioluminiscentes son de gran estabilidad y la emisin de luz slo se produce cuando se provoca la reaccin oxidativa siendo posible almacenar largo tiempo los compuestos luminiscentes. Las tcnicas anteriores as como las de inmunofluorescencia, radioinmunoanlisis e enzimoinmunoensayo pueden realizarse utilizando un sistema de ampliacin de las seales empleando el complejo avidina-biotina. La biotina es una vitamina de bajo peso molecular, y la avidina es una glicoprotena, contenida en la clara del huevo. La biotina se une covalentemente al anticuerpo a travs de un grupo amina, carboxilo sulfhidrilo o tiosil. Varias molculas de biotina, pueden unirse a una de anticuerpo y dada la afinidad biotinaavidina resulta que, cada molcula proteica, se vera unida, a travs de la biotina, con varias molculas de avidina a su vez unidas al marcador correspondiente. Tcnicas de biologa molecular tiles en inmunologa

Figura 33. Esquema de un Southern Blot Southern Blot Otro grupo de tcnicas ampliamente utilizadas en inmunologa son de biologa molecular. Una de las ms utilizadas es la Southern Blot. Esta tcnica consiste en la separacin de

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fragmentos de DNA previamente obtenidos por digestin con enzimas de restriccin. La separacin se hace mediante electroforesis y despus este DNA es transferido a membranas de nylon o nitrocelulosa (blot). Despus, para la identificacin de la banda que interesa se realiza un proceso llamado hibridacin, en el que la membrana es "incubada" con un fragmento de DNA complementario al gen de inters (sonda) previamente marcada, generalmente con un istopo, lo que permite posteriormente visualizar mediante autoradiografa la banda en la cual se ha producido unin (Figura 33). La tcnica de Northern blot permite estudiar ARN en forma anloga al Southern blot. Hibridacin fluorescente in situ (FISH: Fluorescent In Situ Hybridization) La hibridacin fluorescente in situ (FISH) utiliza molculas fluorescentes para localizar genes o fragmentos de DNA. Esta tcnica es especialmente til para mapear genes o localizar anormalidades cromosmicas. La tcnica consiste en preparar cortas secuencias de DNA de una sola hebra, llamadas sondas, que son complementarias de las secuencias de DNA que se quieren marcar y examinar. Estas sondas se marcan con molculas fluorescentes (p. ejemplo con biotina o fluorescena). Estas sondas se hibridan o unen al DNA complementario y, como estn marcadas con molculas fluorescentes, permiten localizar las secuencias en las que se encuentran (Figura 34). A diferencia de otras pruebas utilizadas para estudiar los cromosomas que requieren que las clulas se encuentren en divisin activa, la hibridacin fluorescente in situ puede ser llevada a cabo en clulas no activas

Figura 34. Hibridacin fluorescente in situ (FISH) FISH utiliza tres tipos de sonda: Sondas especficas de un locus: estas sondas se hibridan a una regin particular de un gen. Esta sonda es til cuando se ha aislado una pequea parte de un gen y se quiere averiguar en que cromosoma se encuentra. 49

 Sondas alfoides o centromricas: son sondas que contienen secuencias complementarias de las secuencias repetidas que se encuentran en los centrmeros de los cromosomas. Como pueden utilizarse sondas de diferentes colores, cada cromosoma puede ser marcado de manera distinta, con lo que se puede averiguar si un individuo tiene el nmero correcto de cromosomas o si tiene un cromosoma extra Sondas para cromosomas completos: son colecciones de sondas de un tamao reducido, cada una de las cuales se hbrida a una secuencia diferente a lo largo de todo un cromosoma. Utilizando estas libreras de sondas, se puede marcar todo un cromosoma generando un cariotipo espectral. De esta manera, se consiguen imgenes en color que permiten examinar los cariotipos de una forma ms exacta que los tradicionales cariotipos basados en bandas ms o menos oscuras. Esta tcnica es particularmente til para examinar anormalidades cromosmicas FISH de Metafase Esta tcnica puede usarse sobre clulas en metafase para detectar microdeleciones especficas ms all de la resolucin de la citogentica de rutina o para identificar material extra de origen desconocido. Puede tambin ser de ayuda en casos donde es difcil determinar mediante la citogentica de rutina si un cromosoma tiene una delecin simple o est implicado en una reorganizacin sutil o compleja. Adems, FISH de metafase puede detectar algunos de los reordenamientos especficos que se observan en ciertos cnceres. El nmero de sndromes de microdelecin diagnosticados por FISH est aumentando con rapidez. La sensibilidad de estos ensayos es en todos los casos mejor que la de la citogentica de rutina, pero depende del sndrome en concreto. En algunos, la sonda es especfica para el gen defectuoso, como en el Sndrome de Williams, donde se ha encontrado una delecin en el gen de la elastina en el 96% de los pacientes con diagnstico confirmado. En otros sndromes como el de Prader-Willi/Angelman, la etiologa es heterognea y las microdeleciones slo forman una parte de los casos (60%). FISH de Interfase La FISH se puede usar sobre clulas en interfase para determinar el nmero de copias de uno o varios cromosomas, as como para detectar algunas reorganizaciones especficas que son caractersticas de ciertos cnceres. La ventaja principal del FISH de interfase es que se puede realizar muy rpidamente si es preciso, normalmente en 24 horas, porque no requiere crecimiento de las clulas. Un buen ejemplo es el ensayo de Prueba de Aneuploida, que se realiza sobre clulas del fluido amnitico cuando hay una fuerte indicacin clnica de una de las trisomas ms comunes. Se desnaturalizan los ncleos de la muestra, se hibridan con sondas especficas para los cromosomas 13, 18, 21, X e Y, y los resultados se obtienen comnmente en 24 horas. La prueba de aneuploida suele incluir tambin una citogentica de rutina para confirmar los resultados o detectar cualquier anomala no detectada por la FISH de interfase. 50

PCR in situ El PCR in situ es una reaccin en cadena de polimerasa que tiene lugar dentro de la clula. La amplificacin en el PCR in situ puede ser llevada a cabo sobre tejidos o clulas fijas (Figura 35).

Figura 35. PCR in situ, directo e indirecto Durante el inicio y el progreso de una enfermedad, cantidades mnimas de un producto en pequeas poblaciones de clulas o tejidos puede ser vital para la deteccin de la patogenicidad de la enfermedad. En muchas enfermedades de lento desarrollo, las cuales requieren meses o incluso aos para tener manifestaciones clnicas, se ha mostrado que en la mayora de las poblaciones de clulas afectadas estn en un estado de inactividad transcripcional, y a un nivel de un gen por clula hospedera. Los mtodos de hibridacin y PCR han sido empleados para examinar la expresin y deteccin de cada gen afectado durante la patognesis. Aunque ambas tcnicas son bastante usadas, la desventaja de estas tcnicas es que estn enfocados a la expresin celular y al estudio de poblaciones. Las secuencias de cidos nucleicos son aisladas de una poblacin de clulas que contienen un numero suficiente de molculas que se detectan directamente por tcnicas de hibridacin estndar, o, cuando una subpoblacin contiene una sola copia de la secuencia de cidos nucleicos, la molcula es amplificada por PCR y detectada despus de la amplificacin. El PCR in situ aplica la metodologa de la tcnica de hibridacin de cidos nucleicos a nivel celular. Combinando la citoqumica y la inmunohistoqumica, el PCR in situ permite la identificacin de marcadores celulares y permite una localizacin mas detallada de secuencias celulares especficas dentro de poblaciones celulares, tal como tejidos y muestras de sangre. Factores que afectan la sensibilidad del PCR in situ incluyen: 51

1) la linearidad de la molcula blanco 2) la carencia de una secuencia complementaria prxima a la secuencia blanco mecanismo de la reaccin Mecanismo de la reaccin Es llevada a cabo en un portaobjeto para microscopio Denhardt en el cual clulas o secciones de tejido han sido fijadas. 5 L de la mezcla de PCR es aplicada directamente sobre un punto de la clula la cual ha sido fijada con para-formaldehido; para las secciones de tejido, una cantidad suficiente de la mezcla para humedecer la seccin (generalmente de 20 a 40 L). Un cubreobjeto es cuidadosamente colocado, y, de una manera similar en las usadas en hibridaciones Southern o Nothern, los portaobjetos son colocados en una delgada bolsa de plastico termo-sellada y aceite mineral es cuidadosamente adicionado en la bolsa en una cantidad suficiente para rodear los portaobjetos; la bolsa es sellada y puesta en un termociclador. El aceite mineral sirve para estabilizar la transferencia de calor y prever la evaporacin de la reaccin en solucin acuosa. Un controlador trmico es fijado en un portaobjetos en otra bolsa plstica con una cantidad similar de aceite para proveer un ambiente comparable para medir la temperatura de la muestra durante la reaccin. Despus de 30 ciclos, la bolsa se abre y los portaobjetos se le quita el aceite por inmersin en cloroformo. Cuidando no permitir que el portaobjeto se seque, el cubreobjeto es cuidadosamente retirado, y una adicional alcuota de mezcla de PCR es introducida en la clula o el tejido; el portaobjeto es resellado dentro de la bolsa llena de aceite, y se le da otros 30 ciclos adicionales. Como con cualquier PCR, la optimizacin emprica de la concentracin del primer, concentracin de magnesio, temperaturas de alineacin y elongacin pueden resultar en una mayor eficiencia, la cual, en el caso del PCR in situ, resulta en una mejor seal con menos ruido de fondo.

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