Biohemija II Praktikum 2011 12

Anela Topagi
Lejla Klepo
Ismet Tahirovi
BIOHEMIJA II
LABORATORIJSKE VJEBE
(INTERNA SKRIPTA)
Sarajevo, 2012.
BIOHEMIJA IIlaboratorijske vjebe
2
Vjeba broj 1
ODREIVANJE SADRAJA VITAMINA C
U UZORKU VONOG SOKA
1. TEORETSKI DIO
Vitamini su spojevi prisutni u hrani ivotinjskog i biljnog porijekla u malim koliinama
koji su neophodni za rast i odravanje organizma.
Iako su po hemijskom sastavu i fiziolokim ulogama u organizmu heterogeni spojevi,
vitamini ipak imaju nekoliko zajednikih osobina.
Prema rastvorljivosti u vodi ili uljima dijelimo ih na hidrosolubilne i liposolubilne vitamine.
Vitamini topljivi u vodi (hidrosolubilni) su:
- Vitamini B kompleksa (B
1
, B
2
, B
3
, B
5
, B
6
, B
9
, B
12
)
- Vitamin C
- Vitamin H
Vitamini topljivi u ulju (liposolubilni) su:
- Vitamin A
- Vitamin D
- Vitamin E
- Vitamin K
Vitamini su uglavnom proizvodi biljaka i nekih mikroorganizama. U organizam se
unose u malim koliinama neki i u mikrogramskim koliinama. Poslije resorpcije deponuju
se u nizu organa, a prije svega u jetri. Zbog toga i mnoge ivotinjske namirnice-jetra i drugi
unutranji organi, riblje ulje, mlijeko, jaja itd., slue kao izvor vitamina. U organizmu vitamini
imaju vane fizioloke uloge (Tabela 1).
Mnogi od njih ulaze u sastav koenzima mnogih enzima u organizmu ili su neophodni za
plodnost, razvoj embriona i fetusa, za procese rasta i razvoja, za pravilno sazrijevanje
eritrocita, za pravilan razvoj i strukturu epiderma i epitela.
Nedostatak vitamina u hrani dovodi do odreenih poremeaja u organizmu, koji su
specifini za svaki vitamin. Primijeeno je da koa osobito osjetljivo reagira na pomanjkanje
razliitih vitamina.
Hipervitaminoze su poznate kod nekih vitamina topljivih u ulju (A, D). One su gotovo
uvijek posljedica pogrenog doziranja pri terapiji vitaminima. U normalnim uvjetima prehrane
praktino ne postoje avitaminoze, iako su one uvijek posljedica jednostrane prehrane. Kliniki
su vanije, hipovitaminoze, tj. relativno stanje pomanjkanja vitamina koje jo ne dovodi do
klasine slike bolesti. Kod nekih vitamina organizam sisavaca moe provesti posljednji stupanj
sinteze, tj. moe prevesti provitamin u sam vitamin. U tim sluajevima (vitamin A) potreba se
najveim dijelom pokriva uzimanjem provitamina. Pokriu normalne potrebe za vitaminima
znatno pridonose bakterije crijeva koje moramo smatrati simbiotima. Npr. potrebu ovjeka za
vitaminom K u znatnoj mjeri pokrivaju bakterije.
3
Tabela 1: Pregled i hemijske strukture vitamina
Naziv
vitamina
Hemijska struktura
Hemijski naziv
vitamina
Preporuene
doze
Uloga u organizmu
Bolest usljed
nedostatka
vitamina
B
1
Tiamin 1,2 mg
Dekarboksilacija,
transfer
aldehidne grupe
Beriberi
B
2
Riboflavin 1,3 mg
Reakcije
redukcije
Ariboflavinoza
B
3
Nikotinamid,
Nikotinska
kiselina
16,0 mg
Reakcije
redukcije
Pelagra
B
5
Pantotenska
kiselina
5,0 mg
Prenos acilne
grupe
Parestezija
B
6
Piridoksin 1,31,7 mg
Prenos amino
grupe
Anemija
periferne
neuropatije
4
B
7
Biotin 30,0 g
Reakcija
karboksilacije
Dermatitis
B
9
Folna
kiselina
400 g Prenos C
1
grupe
Megaloblastina
anemija
B
12
Kobaltamin 2,4 g
Intramolekularna
premjetanja
Perniciozna
anemija
5
C
Askorbinska
kiselina
90,0 mg Hidroksilacija Skorbut
A
Retinol 900 g
Vid, rast i
reprodukcija
Nono sljepilo,
Kseroftalmija
D
Kalciferol
5,0 g
10 g
Metabolizam
kalcija i fosfora
Rahitis
E
Tokoferol 15,0 mg
Lipidni
antioksidant
Miina slabost
K
Menakinon 120 g Zgruavanje krvi
Usporeno
zgruavanje
krvi
6
L-askorbinska kiselina (vitamin C)
Pod vitaminom C podrazumijeva se L-askorbinska kiselina. Vitamin C je ketolakton sa
est ugljikovih atoma, pa je po strukturi jako slian glukozi i topiv je u vodi. To je kristalni
spoj, vrlo kiselog karaktera, ima sposobnost reverzibilnog prelaska iz keto u enolni oblik, te
igra ulogu oksidaciono-redukcionog sistema. Najbogatiji izvori su ipak, limun, paprika, kao i
drugo svjee voe i povre. Osim biljaka, mogu ga sintetizirati i mnoge ivotinjske vrste.
Ljudski organizam nije u mogunosti da sintetizira vitamin C, te ga ovjek mora unositi
hranom .
Rastvori askorbinske kiseline su nestabilni, jer podlijeu razgradnji u prisustvu
oksidacijskog sredstva, a pogotovo molekulskog kisika. Oksidacijom L-askorbinska kiselina
prelazi u formu L-dehidroaskorbinske kiseline, koja zadrava vitaminska svojstva, a daljnjom
oksidacijom i prelaskom u 2,3-diketogulonsku kiselinu gubi se vitaminska aktivnost.
Oksidaciju L-askorbinske kiseline potiu i svijetlo, reakcije u baznoj sredini i teki metali (Fe,
Cu, Ag). Oksidaciju u biolokom materijalu kataliziraju i razni enzimi. Obzirom da
oksidacijom L-askorbinske kiseline nastaju inaktivni spojevi, koji ne posjeduju vitaminsko
djelovanje, tokom obrade potrebno je paziti na uslove rada i time smanjiti njenu razgradnju.
Kako je L-askorbinska kiselina termolabilna, poviene temperature takoer pospjeuju
razgradnju. Kuhanjem namirnica pri visokim temperaturama dolazi do njene razgradnje.
Reaguje kao reducent u mnogim biolokim procesima. Vana je za sintezu kolagena i
karnitina, kao i za sintezu hormona serotonina i adrenalina, te za metabolizam masnih kiselina.
Postoji veliki broj metoda odreivanja sadraja vitamina C. Spektrofluorimetrijska
metoda za detekciju vitamina C zasniva se na njegovoj oksidaciji u L-dehidroaskorbinsku
kiselinu, koja u reakciji sa o-fenilendiaminom (OFDA) u baznoj sredini daje N-heterociklini
spoj sa velikim brojem konjugiranih -veza, koji moe emitovati jaku fluorescenciju. Intenzitet
fluorescencije nastalog spoja proporcionalan je koncentraciji i mjeri se pri talasnoj duini
ekscitacije oko 350 nm i emisije oko 430 nm.
Slika 1: Mehanizam fluorescirajue reakcije odreivanja vitamina C
7
2. EKSPERIMENTALNI DIO
Potrebni reagensi:
o Askorbinska kiselina (AK) (radna koncentracija): 0,100 g AK otopiti u 100 ml
destilovane vode (1mg/mL) i uvati u tamnoj reagens boci.
o o-fenilendiamin (OFDA): 0,5 g OFDA otopiti u 100 ml 0,1 mol/l HCl i uvati u tamnoj
reagens boci na 4 C.
o Pufer NH
3
-NH
4
Cl (pH 9,4): 13,5 g NH
4
Cl i 15,75 ml amonijaka otopiti u 100 ml
destilovane vode. Zatim se doda rastvor 0,1 mol/l NaOH, da bi se dobio optimalan pH
otopine (provjeriti pH metrom)
Upotrebom radne koncentracije, pripremiti u odmjernim sudovima od 10 ml standardne
otopine AK slijedeih koncentracija: 0,5; 1; 5; 10; 30; 50 i 70 g/ml.
Izvagati 1g uzorka voa ili povra i macerirati sa 9 ml destilovane vode, a potom ga
centrifugirati pri 15 000obr/min, 15 minuta. Od dobijenih supernatanata pripremiti deset puta
razblaeniji uzorak. U sluaju uzorka vonog soka, uzorak samo centrifugirati prema istim
uslovima i razblaiti na isti nain kao uzorak voa ili povra.
Ovako pripremljeni rastvori AK i uzoraka se koriste za mjerenje. Rastvori se mijeaju po
slijedeem redoslijedu: 1 ml AK, 1,0 ml 0,5% OFDA, 1,5 ml pufera NH
3
-NH
4
Cl. Rastvor se
dopuni do 10 ml s destilovanom vodom, dobro izmijea i ostavi da stoji 5 minuta prije
mjerenja. Intenzitet fluorescencije se mjeri u kvarcnoj kiveti od 1 cm pri talasnoj duini
ekscitacije od 330 nm i talasnoj duini emisije od 430 nm.
Izraunati koncentraciju AK u uzorku i rezultat izraziti kao mg/100 ml uzorka ili kao mg/100 g
uzorka.
3. ZADACI I VJEBE
-Odgovorite na slijedea pitanja:
1. Koji od navedenih vitamina, kao strukturne elemente, sadri izoprenske fragmente:
a) vitamin E
b) vitamin A
c) nikotinska kiselina
d) vitamin K
2. Koji od navedenih vitamina je derivat sterola:
a) vitamin B
12
b) vitamin D
c) vitamin A
d) vitamin B
2
8
3. Kakva je hemijska struktura askorbinske kiseline:
a) derivat sterola
b) derivat izoaloksazina
c) amid piridin-3-karbonske kiseline
d) lakton dienilgulonske kiseline (2-keto-L (-)-gulonkiseli--lakton)
4. Spojite vitamine sa ponuenim odgovorima
A. Nikotinamid a. Sadri prsten tiazola
B. Tiamin b. U organizmu ivotinja sintetizira se iz triptofana
C. Pantotenska kiselina c. Uestvuje kao koenzim u reakcijama transaminacije i
dekarboksilacije aminokiselina
D. Piridoksalfosfat d. Ulazi u sastav koenzima A
5. Vitamini A i D se mogu uzeti odmah, u jednoj dozi, u takvoj koliini da je dovoljna za
odravanje njihove normalne koncentracije u toku nekoliko sedmica. Vitamine B grupe
neophodno je uzimati znatno due i ee. Zato?
___________________________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
6. Ako je dnevna potreba za vitaminom C 75 mg, koliko mg ili g ispitivanog uzorka je
potrebno uzeti da bi se zadovoljila dnevna potreba za vitaminom C?
9
4. REZULTATI
Koncentracija
standarda
Intenzitet
fluorescencije
Odreivanje koncentracije vitamina C u uzorku
OVJERA VJEBE:
10
Vjeba broj 2
KVANTITATIVNO ODREIVANJE UKUPNIH LIPIDA I TRIGLICERIDA U
SERUMU ILI PLAZMI
1. TEORETSKI DIO
Ukupni serumski (plazma) lipidi su sastavljeni od triglicerida, fosfolipida, holesterola,
estera holesterola, neesterificiranih masnih kiselina, glikolipida (cerebrozida), acetilfosfatida
(plazmalogena), fosfatidnih kiselina, viih alkohola, karotinoida, steroidnih hormona, te
vitamina A, D, E. Po svojoj vanosti, naroito je bitno u uzorcima odrediti koncentracije
triglicerida i ukupnog holesterola.
Holesterol je najprisutniji sterol u organizmu, koji po svom hemijskom sastavu sadri
ugljikov skelet ciklopentanoperhidrofenantrena.
Struktura holesterola
Porijeklo holesterola u organizmu je dvojako, veina elija sintetizira holesterol, a drugi njegov
izvor je hrana kojom se unosi. Oko 2/3 holesterola nastaje sintezom u organizmu (kod odrasle
osobe oko 800-900 mg/dan), a svega 1/3 se unosi hranom (oko 150-300 mg/dan). Djeci je
potrebna proporcionalno vea koliina, to se opravdava njegovom znaajnom ulogom kao
strukturnog elementa svih elijskih i unutarelijskih membrana. Najvei dio holesterola nastaje
u jetri, a do njegove sinteze moe doi i u sluzokoi crijeva i nadbubrenim lijezdama. Odatle
se putem krvotoka transportuje do elija organizma. Poto je nerastvorljiv u vodi, u krvi se
holesterol transportuje tako to se vee za proteine gradei lipoproteine. Postoji vie vrsta ovih
lipoproteina i dijele se prema gustoi na:
VLDL (Very Low Density Lipoproteins), lipoproteini vrlo male gustoe
LDL (Low Density Lipoproteins), lipoproteini male gustoe
HDL (Low Density Lipoproteins), lipoproteini velike gustoe
Lipoproteini sa dosta lipida imaju niu gustou.
U krvi holesterol je prisutan u slobodnom i esterificiranom obliku vezan sa jednom
molekulom masne kiseline. Esterifikacija holesterola odigrava se u plazmi pod djelovanjem
enzima lecitin-holesterol-acetiltransferaze (LHAT), koji se nalazi u krvnoj plazmi. U plazmi je
priblino 75 % ukupnog holesterola esterificirano najee nezasienim masnim kiselinama,
(od toga 55 % linolnom kiselinom). Eliminacija holesterola iz organizma se vri preko ui
11
(konverzijom u holne kiseline), perutanjem koe, mala koliina se gubi urinom, dok ene koje
doje gube neto holesterola preko mlijeka.
Holesterol je neophodan za normalno funkcioniranje svake elije, kao bitan strukturni
element. Specifine uloge holesterola su:
Sinteza unih kiselina u hepatocitima
Sinteza steroidnih hormona u kori nadbubrenih i polnih lijezda
Transport liposolubilnih vitamina (A, D, E i K)
tetno djelovanje holesterola se ispoljava kada je u krvi prisutan u znatno veim
koliinama. Poveanje LDL-a, a time i holesterola u krvnoj plazmi dovodi do povienog ulaska
estera holesterola u elije krvnih sudova, gdje dolazi do taloenja estera holesterola, to moe
da dovede do zaepljenja krvnih sudova, smanjenja njihove prirodne elastinosti, a u kasnijim
stadijima, formiranja tromba i infarkta miokarda.
Prilikom uklanjanja holesterola iz organizma slobodni holesterol dospijeva u u u
kojoj je nerastvorljiv. On se u ui inkorporira u micele koje ine lecitin i une soli. Ove
micele imaju ogranien kapacitet rastvaranja holesterola. Kod ljudi sa kamenom u unoj kesi
dolazi do formiranja abnormalne ui, koja postaje prezasiena holesterolom. Pod djelovanjem
razliitih faktora dolazi do vika taloenja holesterola u vidu kristala. Ako se kristali ne izlue
u crijevo, narastaju i formiraju kamenje.
Metode odreivanja holesterola su spektrofotometrijske, enzimske i hromatografske.
Najee se primjenjuje Liberman-Burchard-ova metoda odreivanja, gdje holesterol u
bezvodnoj sredini sa anhidridom acetatne kiseline i koncentriranom sulfatnom kiselinom daje
nezasiene visokomolekularne ugljikovodike, plavozelene boje, tzv. halokrome. Intenzitet
nastale boje direktno je srazmjeran koncentraciji holesterola i mjeri se fotometrijski. Acetatna
kiselina i anhidrid acetatne kiseline slue kao rastvarai i dehidratacijska sredstva, jer se
reakcija odvija u bezvodnom mediju, a sulfatna kiselina dehidrira i ujedno oksidira holesterol.
Trigliceridi su esteri glicerola i masnih kiselina. Glavni su sastojak ivotinjskih i biljnih
masti i ulja. Masti nas opskrbljuju velikom koliinom energije. Nalazimo ih u masnom tkivu i
u masnim kapljicama ostalih elija. Zbog toga su masti i ulja vrlo vana skupina spojeva u
ljudskoj prehrani. One su rezerva energije neophodne svakom ivom organizmu za njegov
razvoj i odravanje. Vrlo su iroko rasprostranjene u prirodi, koliko u ivotinjskom, toliko i u
biljnom svijetu. Masti osim biolokog, imaju i veliko tehniko znaenje. One slue kao
sirovina za proizvodnju sapuna, margarina, raznih maziva, lakova i boja. Maslac i margarin su
vrlo esti izvori masti u prehrani. U probavi hrane, mast se razgrauje tek u tankom crijevu.
u, koja dolazi iz unog mjehura u duodenum (prvi dio tankog crijeva), zajedno s hranom
putuje kroz tanko crijevo i razgrauje mast na njene komponente: glicerol i masnu kiselinu.
Masna kiselina se dalje probavlja, a glicerol se metabolizira u jetri.
U analitici ukupnih lipida opisane su gravimetrijske i turbidimetrijske metode,
raunske, te kolorimetrijske metode.
Ukupni lipidi plazme (seruma) se odreuju spektrofotometrijski, reakcijom sa
vanilinom i fosfornom kiselinom. Predpostavka je da pri dodavanju koncentrirane sulfatne
kiseline serumu uz zagrijavanje, svi lipidi koji u svojoj strukturi posjeduju dvostruke veze daju
ketone ili ketole. Ovi potom reagiraju sa vanilinom u fosfornoj kiselini uz nastajanje ruiasto
crvene boje, iji intenzitet apsorpcije se mjeri izmeu 510-550 nm.
12
Prema hipotezi Knighta i saradnika, reakcija se odvija u tri stepena:
1. Nezasiena masna kiselina reagira sa H
2
SO
4
stvarajui karbonium jon:
2..Vanilin reagira sa H
3
PO
4
stvarajui aromatski ester:
3. Karbonijum jon reagira s aktiviranom karbonilnom grupom fosfovanilina stvarajui
nabijeni ruiasto obojeni kompleks, koji se stabilizira rezonancijom i maksimalno
apsorbira kod 525 nm:
Trigliceridi se odreuju po hemijskom ili enzimskom principu odreivanja glicerola. Samo
odreivanje triglicerida se sastoji od ekstrakcije, potom odvajanja fosfolipida i drugih
hromogena, te saponifikacije, odnosno ekstrakcije, nakon ega slijedi direktno odreivanje
glicerola. Faza ekstrakcije se izvodi u rastvaraima poput metanola, etanola, izopropanola ili
hloroforma. Svi ovi rastvarai dovode do denaturacije lipoproteina, dakle disocijacije vezanih
triglicerida. Interferirajue supstance se mogu ukloniti na dva naina i to koritenjem
adsorbensa poput zeolita, salicilne kiseline ili aktivnog magnezij-silikata ili pak koritenjem
nonana ili heksana. Glavne interferirajue supstance koje se mogu ukloniti na ovaj nain su
fosfolipidi i glukoza zajedno sa nekim hromogenima i ponekad sa slobodnim glicerolom.
Druga faza u sklopu ovih postupaka ukljuuje hidrolizu triglicerida na glicerol i masne kiseline
i obino se izvodi sa etanolnim rastvorom kalij-hidroksida pri visokim temperaturama
13
(saponifikacija). U treoj fazi dolazi do oksidacije glicerola u formaldehid, koji se prevodi u
reakciji sa acetilacetonom u obojeni spoj.
Odreivanje triglicerida se moe prikazati hemijskim reakcijama u tri stepena:
Prvi stepen:
C H
2
C H
C H
2
O
O
O
C
C
C
O
O
O
R
R
R
+
K OH
C H
2
C H
C H
2
OH
OH
OH
+
RCOOK
3
3
Drugi stepen:
C H
2
C H
C H
2
OH
OH
OH
+
NaJO
4 C
O
H H
+ NaJO
3 +
H
2
O
3
Trei stepen:
C
O
H H + C H
3
C
O
CH
2
C CH
3
O
2
+ NH
4
+
N
H
C
CH
3
O
CH
3 C H
3
C H
3
O
formaldehid acetilaceton
3,5-diacetil -1,4 -dihidroksitoluen
14
2.1. ODREIVANJE UKUPNIH LIPIDA
Potrebni reagensi:
- Sulfatna kiselina, koncentrirana
- o-fosfatna kiselina, p.a.
- Vanilin 0,008 M vanilina (C
8
H
8
O
3
, M
r
152,15) otopi se u 100 ml redestilirane vode
- Fosfovanilinski reagens: fosfatna kiselina 11,9 M i vanilin 0,008 M, 1 dio fosfatne
kiseline pomijea se s 1 dijelom (1:1) otopine vanilina. Reagens je stabilan u tamnoj
boci na sobnoj temperaturi 2 sedmice
- Standard maslinova ulja, 1 g maslinova ulja/100 ml etanola.
Otopine su stabilne jednu godinu na sobnoj temperaturi, ako su zatvorene. Otopine treba
uvati u tamnim bocama.
U epruvete s bruenim staklenim epom otpipetira se:
_________________________________________________
Proba Standard
_________________________________________________
Serum 50 l -
Standard lipida - 50 l
H
2
SO
4
2,0 ml 2,0 ml
Sulfatna kiselina dodaje se tako da se pokupe svi tragovi seruma na zidovima epruvete na dno.
Epruvete se stave 10 minuta u kljualo vodeno kupatilo i ohlade u hladnoj vodi.
U nove epruvete se otpipetira:
Smjesa analize: 100 l - -
Smjesa standarda lipida: - 100 l -
Fosfovanilinski reagens: 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml
Mijeati i ostaviti da stoji 30 min. a nakon toga se mjeri apsorpcija (A) probe i standarda lipida
prema slijepoj probi kod 530 nm u kiveti od 1 cm.
Odrediti sadraj ukupnih lipida u uzorku seruma, a rezultat izraziti kao g/l.
Referentne vrijednosti ukupnih lipida: 4 do 8 g/l.
2.1. ODREIVANJE TRIGLICERIDA
Potrebni reagensi:
- n-heptan;
- izopropanol;
- sulfatna kiselina, 0,04 mol/L;
- acetatna kiselina, 1 mol/L;
- kalij-hidroksid 6,25 mol/L;
15
- rastvor metaperjodata: rastvoriti 3 g natrij-metaperjodata i 25 mL glacijalne acetatne
kiseline u destiliranoj vodi i dopuniti vodom do 500 mL;
- amonij-acetat, 2 mol/L;
- rastvor acetilacetona: rastvoriti 0,75 mL acetilacetona i 2,5 mL izopropanola i dopuniti
do 100 mL 2,0 mol/l rastvorom amonij-acetata. Rastvor uvan u tamnoj boci stabilan je
mjesec dana na +4 C;
- standard: maslinovo ulje.
Pipetirati u epruvete sa bruenim zatvaraima prema priloenoj tabeli:
1. Ekstrakcija
Slijepa proba Standard Uzorak
Destilirana voda 0,5 mL
Standard 0,5 mL
Serum 0,5 mL
n-heptan 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL
Izopropanol 3,5 mL 3,5 mL 3,5 mL
Sulfatna kiselina 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
Mijeati na vorteksu oko 30 s i saekati da se odvoje slojevi.
2. Saponifikacija i oksidacija
Na 0,4 mL heptanskog sloja (gornji sloj) dodati 2 mL izopropanola i kap KOH. Dobro
promijeati i inkubirati na 70 C u trajanju od 10 min. Nakon toga dodati 0,2 mL reagensa
NaJO
4
i 1 mL reagensa acetilacetata. Dobijeni rastvor dobro promijeati i inkubirati na 70 C u
trajanju od 10 min. Nakon toga, smjesu ohladiti na sobnu temperaturu. Dobijenom rastvoru
mjeriti apsorbansu na 425 nm. Boja je stabilna oko sat vremena. Standardne rastvore ije
koncentracije idu do 2 g/L tretirati na isti nain. Na osnovu dobijenih vrijednosti apsorbansi za
standard triglicerida, konstruirati kalibracionu krivu i pomou jednaine pravca odrediti sadraj
triglicerida. Sadraj triglicerida izraziti kao mmol/L.
3. ZADACI I VJEBE
1. Oslobaanje masnih kiselina u toku posta ide iz kog organa:
a) Jetre
b) Masnog tkiva
c) Epitela tankog crijeva
d) Limfe
2. Koji se proces naziva saponifikacija masti:
a) Enzimska hidroliza
b) Alkalna hidroliza
c) Hidrogenizacija
d) Reakcija sa olovo-acetatom
e) Emulzifikacija masti
16
3. Kakvom pretvaranju podlijee glicerol koji nastaje u prvoj etapi pri razgradnji
triacilglicerola:
a) Redukciji
b) Oksidaciji
c) Metiliranju
d) Fosforiliranju
e) Aciliranju
4. Koji od navedenih lipoproteina se karakterizira kao loi holesterol:
a) LDL
b) HDL
c) Hilomikroni
d) IDL
5. Koji se od vitamina ponaaju kao lipidi:
a) vitamin C
b) vitamin K
c) vitamin A
d) vitamin E
e) vitamin D
6. Koji sastojci elije sadre fosfolipide:
a) mijelinski omota nervnih elija velikog mozga
b) hijeloplazma
c) kompleks membrana
7. Objasniti ulogu sulfatne kiseline u reakciji odreivanja ukupnih lipida?
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
4. REZULTATI
- Odreivanje koncentracije ukupnih lipida
Uzorak Apsorpcija (A)
17
- Odreivanje koncentracija triglicerida
Uzorak Apsorpcija (A)
OVJERA VJEBE
18
Vjeba broj 3
RAZDVAJANJE PROTEINA GEL ELEKTROFOREZOM
(RAZDVAJANJE I IDENTIFKACIJA PROTEINA U UZORCIMA GOVEEG SERUMA
NA AGAROZNOM GELU UZ PRIMJENU ISTOSMJERNE ELEKTRINE STRUJE)
1. TEORETSKI DIO
Elektroforeza po svojoj definiciji, je tehnika kojom se razdvajaju naelektrisane estice pod
djelovanjem homogenog elektrinog polja. Tom prilikom otopljena estica efektivnog naboja q
putuje u viskoznom puferu pod djelovanjem elektrinog polja prema jednoj od elektroda, u
ovisnosti od prirode njenog naboja. Ovo je jedna od vanijih tehnika u separaciji biolokih
molekula, jer obino ne uzrokuje promjene na nivou strukture molekula koje se separiraju, a
osim toga osjetljiva je na male promjene u naboju i masi makromolekula.
Kretanje molekula u elektrinom polju predstavlja funkciju naboja q i koeficijenta trenja f.
Brzina koju ostvaruje jedan molekul sa nabojem u elektrinom polju je funkcija jaine polja E
tako da imamo odnos:
v=
f
Eq
v - brzina kretanja molekule (m/s)
E - jaina elektrinog polja (V/m)
q - naboj molekule
f - koeficijent trenja (Vs/m
2
)
Pri tome je razdvajanje estica u elektrinom polju ovisno i o vremenu.
Kao analitika metoda, elektroforeza je jednostavna, brza i vrlo osjetljiva. U kombinaciji s
drugim tehnikama molekularne biologije, postala je jedna od najee primjenjivanih metoda.
Postoje dva tipa elektroforeze: slobodna i zonska.
Kod slobodne elektroforeze naelektrisani joni se slobodno kreu kroz rastvor sve dok postoji
djelovanje elektrinog polja. Ovdje se radi o jednom dinamikom sistemu koji direktna
mjerenja moe da vri samo kod onih estica koje svojom razliitom brzinom putovanja
stvaraju mjesta razliite gustoe. Za ovu potrebu koristi se U-cijev koja u donjem dijelu sadri
uzorak i krajeve koji su napunjeni elektrolitom kako bi se odravale otre granice prema
uzorku. Kretanje uzorka se mjeri pomou pomjeranja granica u funkciji vremena. Na ovaj
nain dolazi do optike pojave (tzv. lira), do prelamanja svjetlosti na granici dvije razliite
koncentracije i one se registruju posredstvom mjerenja indeksa prelamanja svjetlosti. Ova
tehnika uglavnom se koristi u analizama fizikih karakteristika molekula.
Mnogo pogodnija tehnika je tzv. zonska elektroforeza. Naelektrisane estice se kod ove tehnike
kreu kroz interni potporni medij koji moe biti filter papir, celuloza-acetat, skrobni gel, agar
gel, poliakrilamid gel... Prednost ove tehnike je i u tome da se razdvojene supstance u eljenom
poloaju mogu stabilizirati, osuiti i hemijski fiksirati. Potporni medij pri tome ima ulogu da
sprijei sve poremeaje vezane za kretanje uzoraka, a osim toga predstavlja u izvjesnom smislu
i molekulsko sito ili pak stabilizirajui medij za pH gradijent. Napon koji se koristi kod
razdvajanja e ovisiti od tipa uzorka i vrste potpornog medija. Tako npr. visoki naponi se
19
koriste za papirne potporne medije uslijed velikog otpora samog papira. Visoki napon se
takoer koristi za izbjegavanje problema koji bi nastali difuzijom i doveli tako do irenja
molekula. Sa velikim naponima stvaraju se i vee jaine struje, dolazi do stvaranja toplote to
zahtijeva hlaenje sistema. Dodatni problem u nekim efektivnim potpornim medijima je
fenomen elektroendoosmoze u kojem pufer sam pokazuje elektroforetski uinak i time maskira
pokretljivost molekule koja se prati. Ova pojava se moe kao takva pripisati efektima kretanja
pufera koji se javljaju uslijed negativno nabijenog potpornog medija i dovode to toga da pufer,
kada se izloi elektrinom polju se kree prema katodi. Proteini su negativno nabijeni i kreu
se prema anodi. Drugim rijeima, kada dolazi do ove pojave dolazi do njihovog kretanja
suprotno kretanju pufera. Brzina kretanja pufera se mijenja sa koritenjem razliitih potpornih
medija. U izvjesnom smislu efekat elektroendoosmoze se pokazao korisnim, jer pomae kod
razdvajanja gama globulina od ostalih proteina. Ova frakcija proteina ima negativan naboj, ali
se radi o molekulama velike molekulske mase tako da naboj koji oni posjeduju nije dovoljan da
anulira efekat kretanja pufera.
Dostupan je irok raspon opreme za elektroforezu, ali u osnovi postoji zajedniki bazni dizajn.
Dobro dizajnirana komora treba da sprijei bilo koji stepen isparavanja sa potpornih medija, da
ima uinkovit sistem hlaenja kada se koriste gelovi ili tehnike visokog napona pri emu je
potrebno posebno voditi rauna o sigurnosnim prekidaima.
Tipovi elektroforeze su:
ELEKTROFOREZA NA FILTER PAPIRU
ELEKTROFOREZA NA CELULOZAACETATU
ELEKTROFOREZA NA TANKOM SLOJU
KAPILARNA ELEKTROFOREZA
GEL ELEKTROFOREZA
Idealan potporni medij za elektroforezu je hemijski inertan, sa njima se lahko rukuje i u
svakom trenu je mogue kontrolirati poroznost. Iako se papir smatra pravim nosaem kod
separacije aminokiselina, malih peptida, ovaj medij neosporno pokazuje velike nedostatke, jer
se u ovom sluaju poroznost ne moe kontrolirati. Supstance sa velikim molekulskim masama
poput proteina i nukleinskih kiselina se ne separiraju dobro na papiru, jer celulozna vlakna
pokazuju veliki otpor prema kretanju. Gelovi sa varirajuom poroznou su idealni kod
separacije visokomolekularnih supstanci jer dozvoljavaju lagano kretanje makromolekula uz
istovremeno sprijeavanje konvekcije i uz minimalnu difuziju. Tri tipa gela se koriste u ovu
svrhu: skrobni gel, poliakrilamid gel i agaroza. Aparati mogu biti za cilindrine gelove i za gel
ploe (gdje broj rupica za uzorke se utvruje na osnovu broja zuba na plastinom elju koji se
koristi).
Najpoznatiji gelovi koji se koriste u elektroforezi su:
AGAROZNI
KROBNI
POLIAKRILAMIDNI
20
AGAROZA KAO GEL
Agarozni gelovi se stvaraju tako to se suha agaroza otopi u vodenom puferu, potom zagrije
dok se ne dobije bistri rastvor, a zatim ohladi na sobnoj temperaturi. Agaroza je prirodni
linearni polisaharid graen od galaktoze i 3,6-anhidrogalaktoze. Dobija se iz agara.
Visokoporozni gel koji se dobija na ovaj nain je pogodan za elektroforezu i za neke
imunoloke tehnike. Agaroza se obino koristi pri koncentracijama izmeu 1% i 3%. Agarozni
gel se odlikuje relativno velikom veliinom para nakon njegovog hlaenja. Ove pore su
stabilizirane vodikovim vezama. Veliina pore se kontrolira poetnom koncentracijom agaroze.
Velike pore se stvaraju pri koritenju niskih koncentracija agaroze, a manje veliine se stvaraju
prilikom koritenja velikih koncentracija agaroze. Velike pore i gelovi niskih koncentracija
agaroze omoguavaju separiranje vrlo velikih molekula poput DNK, lipoproteina,
imunoglobulina i enzimatskih kompleksa. Agaroza predstavlja definitivno metod izbora kod
pripreme DNK lanca za sekvencioniranje. Fragmente DNK je pri tome mogue ekstrahirati
direktno sa niskotopive agaroze (62
o
C-65
o
C) nakon zagrijavanja na 65
o
C. Ovaj tip gela vrlo
se esto koristi za imunoelektroforezu gdje se separiraju veliki kompleksi antigen-antitijelo, a
takoer se koristi i kod izoelektrinog fokusiranja. Dobra strana ovih gelova je da su oni fiziki
jai od niskoprocentnih poliakrilamid gelova.
SDS-PAGE KONTINUIRANA ELEKTROFOREZA (WEBER-OSBORN POSTUPAK)
Ovo je tehnika kod koje se deterdent natrijumdodecilsulfat (SDS) dodaje na sistem.
Uglavnom se koristi u istraivake svrhe za karakterizaciju proteina u toku izolacije. Proteini
velikih molekulskih masa, proteinski kompleksi ili pak nukleinske kiseline se vrlo esto
razdvajaju u prisustvu agensa koji djeluju na razbijanje nativne strukture. Natrijum
dodecilsulfat (SDS) je deterdent koji pokazuje polarne i nepolarne karakteristike. SDS se
vezuje za najvei broj proteina tako da su njegovi nepolarni hidrofobni dijelovi pohranjeni u
nepolarni region proteina, a negativno nabijeni sulfatni izloen prema rastvarau. Vezivanje
SDS-a ima dvojake efekte. Prvi su vezani za interferenciju sa nativnim hidrofobnim i jonskim
vezama to dovodi do disocijacije najveeg broja oligomernih proteina u njihove monomere i
do razaranja njihove sekundarne strukture. Ukoliko su polipeptidni lanci povezani disulfidnim
vezama, potrebno je dodatno uzorke zagrijati u prisustvu disulfid reducirajuih agenasa
(betamerkaptoetanola ili 1,4-ditiotreitola). Da bi se to postiglo, potrebno je da protein disocira
na manje podjedinice. Ovaj drugi efekat se pojavljuje kada proteini postanu zasieni sa
negativno nabijenim molekulama SDS-a. Tada elektroforetska separacija ovisi iskljuivo od
molekulske mase, tako monomeri malih molekulskih masa putuju znatno bre jer je koeficijent
trenja manji. Elektroforeza koja se izvodi pod ovim uvjetima moe da se koristi za utvrivanje
molekulske mase proteina.
Weber i Osborn su pokazali da se molekulske mase najveeg broja proteina mogu utvrditi
putem mjerenja pokretljivosti na poliakrilamidnom gelu koji sadri SDS. Standardi proteina
poznatih molekulskih masa se analiziraju elektroforetski i njihova pokretljivost se mjeri i
nanosi na graf papir i izraava u obliku logaritma molekulske mase. Ovaj grafikon daje jednu
pravu liniju. Pokretljivost nepoznatog uzorka se moe odrediti pod identinim uslovima, a
molekulska masa se moe dobiti na osnovu grafika pokretljivosti standarda u odnosu na
njihove odgovarajue logaritme molekulskih masa. Molekulske mase utvrene metodom
elektroforeze pod disocirajuim uslovima zadovoljavaju tanost u rasponu od 5-10 %.
21
SDS-PAGE primjena
Potrebni reagensi:
- Govei serum
- Standard - albumin goveeg seruma (BSA)
- Agaroza
- glicin
- tris (hidroksimetil)-aminometan
- natrijum-dodecilsulfat (SDS)
- 2-merkaptoetanol
- glicerol
- brom-fenol plavo
Za analizu uzoraka koristie se jednodimenzionalna agarozna gel elektroforeza.
Detekcija se vri pomou indikatora brom-fenol plavog, komazi briljantno plavog (coomassie
brilliant blue) ili bojenjem sa srebrom.
Intenzitet trake je veliina za relativno odreivanje koliinskih dijelova neke komponente. Na
osnovu protoka referentnih proteina sa poznatom masom, mogu se odrediti molekulske mase
razliitih proteina u uzorku i isti mogu biti identificirani. U slijedeoj tablici navedene su
relativne molekulske mase razliitih proteina odreene na poliakrilamidnom gelu:
Protein M
r
Preena
udaljenost
(mm)
Transferin 78 000 6,0
Albumin goveeg seruma 66 000 12,5
Ovalbumin (albumin jajeta) 45 000 32,0
Gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza 36 000 38,0
22
Protein M
r
Preena
udaljenost
(mm)
Karboanhidraza 29 000 50,0
Tripsinogen 24 000 54,0
Tripsin inhibitor soje 20 100 61,0
|-laktoglobulin 18 400
*
69,0
Mioglobin 17 800 69,0
Lizozim 14 300 79,0
Citohrom c 12 400 86,5
* |-laktoglobulin ima M
r
od 36 800 jer je dimer od dvije identine subjedinice sa M
r
od 18 400. Pod
reducirajuim uvjetima pufera za uzorak disulfidne veze podjedinica su reducirane (pocijepane) tako da se na gelu
vide monomerni lanci.
1. Priprema potrebnih pufera
a) Elektroforetski pufer
Postoji vie pogodnih elektroforetskih pufera za analizu proteina, ali je najee u upotrebi
TRIS-Glicin pufer koji se priprema na slijedei nain:
Pripremiti po 1 litar 0,192 mol/dm
3
glicina i 0,025 mol/dm
3
tris (hidroksimetil)-aminometana.
Mijeanjem tih komponenata dostii pH vrijednost 8,3.
b) Pufer za tretman uzorka
400 l elektroforetskog pufera + 100 l 2-merkaptoetanola + 100 l 2 % SDS-a u
elektroforetskom puferu.
c) Pufer za aplikaciju uzorka
300 l elektroforetskog pufera + 700 l 87 %-og glicerola + nekoliko kristalia brom-fenol
plavog ili komazi briljant plavog.
2. Priprema uzorka ili standarda
U kivetu za centrifugu odmjeriti 200 l uzorka ili standarda (pripremljenog tako da se 0,01 g
albumina goveeg seruma otopi sa 1 ml elektroforetskog pufera), dodati 200 l pufera za
tretman uzorka, promijeati na vorteks mijealici i drati na kljualom vodenom kupatilu 5
minuta.
3. Eksperimentalna procedura
a) Pripremiti 1% rastvor agaroze ukupnog volumena 150 mL (agarozu otopiti u
elektroforetskom puferu).
b) Mijeati na magnetnoj mijealici uz grijanje dok se agaroza ne otopi.
c) Nakon otapanja, ostaviti otopinu na sobnoj temperaturi da se hladi uz mijeanje na
drugoj magnetnoj mijealici. Dok je otopina jo vrela popuniti s njom upljine izmeu
ivica staklene ploe i okvira koristei Pasterovu pipetu. Kada se ruka moe zadrati na
tikvici sa otopinom, tada dodati 0,1 g SDS-a, promijeati staklenim tapiem da se
otopi i sipati otopinu gela na staklenu plou.
d) Odmah uroniti ealj u otopinu blizu jednog od krajeva ploe. ealj podesiti tako da
donji dijelovi njegovih zubaca ne dodiruju povrinu ploe (debljina gela na tim
mjestima treba da je 0,5 1,0 mm.
23
e) Nakon to proe 30 45 minuta paljivo ukloniti ealj i okvir, te staviti plou s gelom
u elektroforetsku jedinicu.
f) U udubljenja koja su napravili zupci elja aplicirati uzorke koji su pripremljeni na
odgovarajui nain (na ravnoj plastinoj podlozi ili parafinskom filmu pomijeati 1,5 l
pufera za aplikaciju uzorka sa 6 l uzorka ili standarda).
g) U elektroforetske komore sipati elektroforetski pufer da dodiruje ivice gela.
h) Pokriti sistem sa poklopcem i prikljuiti kablove sa elektrodama koje su spojene sa
ispravljaem.
i) Ukljuiti ispravlja uz podeavanje odgovarajueg napona (u poetku dok uzorci ne
uu u gel napon moe biti oko 50-60 V, a kasnije 80-100 V).
NAPOMENA
Prije rada upoznati se sa nainom rukovanja hemikalijama koje se koriste. Podaci o tetnosti
kemikalija, kao i nainu pruanja prve pomoi nalaze se u laboratoriju (konsultovati asistenta i
laboranta)! Ovdje su navedene neke informacije za supstance poveanog rizika:
- 2-Merkaptoetanol
tetan ukoliko se proguta ili udie. Toksian u kontaktu sa koom. Uzrokuje upaljenje.
Toksian za vodene organizme, moe uzrokovati dugotrajne tetne efekte u vodenoj sredini!
Pri radu sa ovom supstancom obavezno koristiti rukavice i rad obavljati u digestoru!
- Natrijum-dodecilsulfat
tetan ukoliko se proguta ili udie. Iritira kou, oi i respiratorni trakt. Moe uzrokovati
alergiju koe ili respiratornu reakciju (kaalj i sl.). Zapaljiv u vrstom stanju!
Pri radu sa ovom supstancom obavezno koristiti rukavice!
3. ZADACI I VJEBE
1. Kakav je pravac kretanja peptida (ostaje na startu, kree se ka anodi ili katodi) u
procesu eletroforeze pri pH 2; 3,5; 6,5; 10:
a) Lys-gly-ala-glu
b) Glu-gly-ala-glu
c) Gly-gly-ala-lys
24
2. Smjesa glicina, glutaminske kiseline, lizina, arginina i serina razdvaja se metodom
elektroforeze na papiru pri pH 6,0. Navedite koja su se jedinjenja kretala ka anodi, +
(A), katodi, - (K), a koja su ostala na startu C.
A:
B:
C:
3. Navedite pravac kretanja peptida lyz-gly-ala-gly u procesu elektroforeze na papiru pri
pH 1,9; 3,0; 6,5; 10,0.
4. Navesti u koje svrhe se moe koristiti elektroforetska metoda?
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
5. Koju ulogu u pripremi uzorka za elektroforezu imaju 2-merkaptoetanol i natrijum-
dodecilsulfat?
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
25
4. REZULTATI
OVJERA VJEBE
26
Vjeba broj 4
KVANTITATIVNO ODREIVANJE UKUPNIH PROTEINA BIURET
METODOM
1. TEORETSKI DIO
Proteini predstavljaju kompleksne polimere koji se sintetiziraju na nivou svih ivih bia.
Meusobno se razlikuju po svojim funkcijama, veliini, obliku molekule te strukturi,
rastvorljivosti, sastavu, eletroforetskoj pokretljivosti. U odnosu na ulogu koju imaju u
organizmu, u principu se mogu podjeliti na proteine katalizatore (enzime), potom regulatorne
proteine (receptori, hormoni, represori, inhibitori), transportne proteine, strukutrne proteine,
proteine odbrane (imunoglobulini i komplement), onkofetalne i placentalne proteine i proeteine
ija funkcija jo nije poznata. Najstariji pristup odreivanja ukupnih proteina jeste utvrivanje
koncentracije azota proteinskog porijekla. Poznati postupak koji se koristi kod odreivanja
ovog tipa je Khjeldahl-ov postupak. Ovom metodom se utvruje koncentracija ukupnog azota
u biolokom materijalu. Princip je da se supstance koje sadre azot pretvore u amonijum jon
posredstvom oksidacije u sistemu za razaranje koji sadri koncentrovanu sulfatnu kiselinu kao
katalizator i so koja ima funkciju da podigne taku kljuanja smjese. Amonijum jon se najbolje
analizira pretvorbom u amonijak sa dodatkom alkalija. Nakon destilacije upari se u rastvor
borne kiseline i amonijak potom titrira sa standardnim rastvorom hlorovodonine kiseline.
Korekcija za neproteinski azot se ostvari koritenjem seruma koji ne sadri proteine. Metoda
odreivanja po Khjeldahlu odlikuje visokom tanou i preciznou, injenica je da traje dugo i
da je dosta komplikovana sa aspekta izvoenja rutinske analize serumskih proteina ak i u
sluajevima kada se amonijak odreuje enzimatskim analizama. Postoji takoer i nesigurnost
oko tanosti faktora konverzije azota u proteine. Historijski se jo uvijek koristi faktor 6,25
iako se zna da je vrijednost istog relativno niska. Ova metoda se jo uvijek koristi kao
standardna metoda sa kojom se uporeuju sve druge metode.
Jedna od najee koritenih metoda za utvrivanje koncentracije serumskih proteina je
zasnovana na principu Biuret reakcije. U ovoj reakciji bakarni jon reagira sa peptidnim vezama
proteina u osnovnom rastvoru gradei ljubiasto obojene komplekse koji pokazuju apsorpcioni
maksimum na 540 nm. Biuretska reakcija predstavlja vrlo pogodnu metodu i odlikuje se
dobrom preciznou (pozitivna bojena reakcija dobija se i pri razblaenju 1:10
4
). Koliina boje
koju daje Biuret reagens u vrlo bliskom je odnosu sa polipeptidnim dijelom razliitih
serumskih proteina to je direktna prednost nad Lowry-evom metodom. Reakcija koristi jedan
vrlo stabilan reagens i uslijed toga nala svoju iroku primjenu u automatizaciji. Nedostatak je
to pozitivnu reakciju mogu dati i neke supstance koje ne poseduju peptidnu vezu u molekuli,
kao to su histidin, asparagin ili oksamid.
Kingsley je 1942. godine koristio prvi reagens koji nije bio veoma stabilan. Prvi stabilan Biuret
reagens opisao je Weichselbaum koji je dodao kalij natrij tartarat kao stabilizator i kalij jodid
da bi spreijeio autoredukciju alkalnog bakar tartarata i separaciju bakar oksida. Ovaj metod se
zasniva na interakciji Cu
2+
jona sa atomima nitrogena i oksigena u peptidnoj vezi proteina u
alkalnoj otopini, pri emu nastaje ljubiasto obojeni kompleks ija apsorpcija se mjeri na 545
nm.
27
Pored ove metode, najee koritene metode za kvantitativno odreivanje proteina su:
1. Bredford-ova metoda: zasniva se na mjerenju apsorpcije kompleksa proteina sa
Bredfordovim reagensom pri 595 nm. Bredfordov reagens je Coomassie briljantno plavo G u
fosfatnoj kiselini i metanolu. Linearno podruje koncentracija proteina: 0,1-1,4 mg/ml.
Ukoliko u uzorku ima tragova deterdenata prikladnija je BCA metoda koja e biti opisana.
2. Lowry-jeva metoda: zasniva se na redukciji fosfomolibden-volfram mjeovitog
kiselog kromogena u fenolskom Folin-Ciocalteu reagensu od strane proteina, to rezultira u
apsorpcionom maksimumu pri 750 nm. Nedostatak je to se na rezultat moe negativno
odraziti prisustvo ostalih reducirajuih supstanci i to reagens reagira samo sa proteinima koji
sadre tirozin.
3. Metoda sa bicinkoninskom kiselinom (BCA metod) zasniva se na redukciji kupri
(Cu
2+
) jona do kupro (Cu
+
) jona proteinom. Bicinkoninska kiselina se koristi za detekciju Cu
+
.
Ova metoda ima nekoliko interferirajuih supstanci iji efekat moe biti u izvjesnoj mjeri
umanjen razrijeivanjem ispitivane otopine proteina.
4. Fluorimetrijski metod zasniva se na derivatizaciji proteina sa o-ftalaldehidom
(OPA), koji reagira sa primarnim aminima proteina (N-terminalne aminokiseline i t-NH
2
grupa
lizina). Osjetljivost se moe poveati prethodnom hidrolizom proteinskog uzorka.
5. Metoda mjerenja refraktivnog indeksa zasniva se na mjerenju prelamanja ulazne
svjetlosti na smjesu uzorka, ali za serum, to e u principu odraavati masu prisutnih proteina.
Obzirom da serum sadri i znatnu koliinu ostalih tvari, refraktometar se mora specifino
kalibrirati sa serumom poznate koncentracije proteina.
Vrlo vani koraci na nivou standardizacije prilikom odreivanja ukupnih serumskih proteina su
poduzeti osamdesetih godina prolog stoljea. U tom periodu univerzalno se prihvatilo
koritenje goveeg serumskog albumina kao referentnog materijala koji e se koristiti za
odreivanje ukupne koncentracije proteina u spektrofotometrijskim metodama poput biuretske
i Lowry-eve metode. On se preporuuje kod svih odreivanja koja za princip imaju biuretsku
reakciju.
Potrebni reagensi:
- 200,00 g 0, 9% vodene otopine NaCl
- 100,00 g 6% vodene otopine NaOH
- 200,00 mL Biuret reagensa koji se priprema na slijedei nain: 3,46 g bakar (II)-sulfata
otopiti u 10,00 ml vrue vode i ostaviti da se ohladi (otopina A). Otopiti 34,6 g
natrijumcitratdihidrata i 20,0 g natrijumkarbonata u 80,0 ml vrue vode i ohladiti (otopina B).
Pomijeati otopine A i B i razrijediti sa vodom do 200,0 ml. Ovakav Biuret reagens stabilan
je pri sobnoj temperaturi 6 mjeseci. Ukoliko se pojavi zamuenje ili talog ne koristiti takav
reagens.
- 0,2% NaOH u 50%etanolu (za uzorke penice, rai, jema, zobi)
28
Priprema slijepe probe:
Na 1 ml otopine NaOH dodati 1 ml Biuret reagensa i sadraj protresti. Na to dodati 0,4 ml
otopine NaCl i promijeati.
Priprema i upotreba standardne otopine proteina:
Odvagati 0,0500 g albumina goveeg seruma (BSA) (liofilizirani prah, nabavljen od Sigma
) i
otopiti u 5,00 ml 0,9 % NaCl. Dobijenu otopinu izraziti u mg/mL, oznaiti je kao osnovnu
otopinu, te od nje prirediti po 10,00 mL slijedeih radnih otopina: 7.5, 5.0, 2.5, 1.0 i 0.5 mg/ml.
Izmjeriti apsorbansu svih otopina (ukljuujui i osnovnu) pri 545 nm koristei se slijedeim
postupkom:
U iste i oznaene epruvete (pripremiti istovremeno za standarde, uzorke i slijepu probu) sipati
po 1 ml otopine NaOH, dodati u svaku 1 ml Biuret reagensa i sadraj protresti. Na to dodati 0,4
ml otopine standarda (ili uzorka) zatvoriti i promijeati. Nakon 15 minuta sadraj istresti u
kivetu, obrisati kivetu i mjeriti apsorbansu. Konstruirati kalibracionu krivu A = f (c), nanosei
na apscisu konane koncentracije standardnih otopina.
Priprema i rad sa uzorkom proteina
UZORAK 1: Odvagati priblino 2 g sirovog bjelanca (sa preciznou na etiri decimalne cifre)
u prethodno odvaganoj istoj i suhoj aici. Pomou 0,9 % otopine NaCl prebaciti
kvantitativno sadraj bjelanca u odmjerni sud od 50 ml. Izmjeriti apsorbansu tako
pripremljenog uzorka pri istim uvjetima koritenim za rad sa standardnom otopinom BSA.
Pomou jednaine pravca dobijene iz kalibracione krive izraunati koncentraciju ukupnih
proteina u uzorku bjelanca izrazivi konaan rezultat kao mg proteina/g svjeeg bjelanca.
UZORAK 2: Odmjeriti ispitivanog uzorka po 1-1,5 g materijala koji je prethodno usitnjem ili
izmljeven u staviti u odgovarajue posebne porculanske avane. Probama dodati 2 g kvarcnog
pijeska i dodati po 3 mL NaOH u alkoholu, a zatim paljivo rastrljavati uzorak u trajanju od tri
minute kako bi se razorile elije i ekstrahovali proteini. Posle isteka 3 minute dodati u avan jo
12 mL rastvaraa i ponovo homogenizirati u trajanju od dvije minute. Tako dobijenu smjesu
kvantitativno prebaciti u odmjerni sud od 50 mL; avan 2-4 puta isprati sa po 5 mL rastvaraa i
prenijeti u odmjerni sud. Odmjerni sud dopuniti sa rastvaraem do mjerne crte, dobro
promukati i ostaviti sa stoji 1 sat. Sadraj profiltrirati u suhu erlenmajericu od 50 mL. 10 mL
takvog filtrata staviti u kivete za centrifugiranje i dodati po 1 mL 6% NaOH i po 1 mL Biuret
reagensa. Smjesu u epruvetama dobro promukati i centrifugirati u trajanju pd 5 minuta. Ako
rastvor nije proziran, onda je potrebno da se eksperiment ponovi uz dodavanje po 2 mL baze i
reagensa. Poslije centrifugiranja, rastvor mora biti bistar (proziran).
29
3. ZADACI I VJEBE
1. Prikazati mehanizam Biuret reakcije na primjeru uree?
4. REZULTATI
Standard A
Uzorak A
1
A
2
A
3
A
sr
St dev
30
- Napomena: Priloiti grafik
OVJERA VJEBE:
31
Vjeba br. 5
ODREIVANJE KONCENTRACIJE ALBUMINA I GLOBULINA
1. TEORETSKI DIO
Preiavanje proteina je osnovni korak u izuavanju njihovih fizikih i biolokih svojstava i
jedan je od najeih postupaka u praktinoj biohemiji. Za postizanje preiavanja protein
mora biti osloboen od svog biolokog matriksa i selektivno odvojen od ostalih proteina
odgovarajuim postupkom frakcioniranja. Predmeti izuavanja na preienim proteinima
odreuju prihvatljivost granica istoe koju je potrebno dostii. Tako, ispitivanja aktivnosti ne
zahtijevaju 100% ist preparat, dok osnovna strukturna izuavanja zahtijevaju. Suprotno,
ispitivanja aktivnosti zahtijevaju ouvanje funkcije i stoga smanjenje denaturacije i proteolize,
dok strukturna ispitivanja se mogu izvesti na denaturiranom proteinu. Koliina preienog
proteina potrebna za izuavanje objektivno utie na izbor metoda preiavanja. Neke tehnike
imaju visok kapacitet i mogu raditi sa velikim volumenima i koncentracijama proteina, dok
druge imaju ogranien kapacitet.
Proteini se razlikuju u njihovoj osjetljivosti na denaturaciju tokom procesa ekstrakcije i
preiavanja, posebno u njihovoj osjetljivosti na poviene temperature (iznad 40 C), na
prisutnost deterdenata, tekih metala i na ekstremne pH vrijednosti. Ove razlike esto su
iskoritene u strategiji preiavanja pojedinih proteina i tehnika zasnovanih na njihovom
zajednikom svojstvu u ranim fazama procesa preiavanja. Topivost prirodnih proteina
uvjetovana je pH vrijednou (topivost postaje minimalna u izoelektrinoj taki), dodatkom
soli kao to su amonijumsulfat i prisutnou organskih otapala, kao to su aceton i butanol, pri
niskim temperaturama. Male razlike u ovakvim svojstvima enzima takoer su iskoritene u
postupcima frakcioniranja i preiavanja. Spojevi koji sadre tiolnu grupu kao to su
merkaptoetanol i glutation (redukovani oblik) esto se dodaju enzimskim preparatima da
sprijee oksidaciju sulfhidrilnih grupa, koja se moe desiti odmah nakon razaranja stanice i
prethodne denaturacije.
Tokom odvijanja preiavanja proteina esto se prave razrijeene otopine proteina. Naalost,
razrijeene otopine proteina, posebno preienih proteina, esto su nestabilne ili zbog
disocijacije subjedinica ili adsorpcije proteina na povrini posude. Problemi adsorpcije mogu
biti smanjeni upotrebom silikoniziranih posuda uz dodatak malih koncentracija deterdenata
kao to su Triton X-100 ili Tween 20. Problemi disocijacije mogu esto biti prevazieni
dodatkom glicerola (10% do 40% (v/v)), glukoze ili saharoze ili povremeno albumina goveeg
seruma (bovine serum albumin, BSA). uvanje uzoraka pri 0-4 C je takoer korisno. Due
uvanje moe biti omogueno upotrebom visokih koncentracija amonijsulfata (to objanjava
zato su trgovaki preparati enzima esto spremljeni u otopini amonijsulfata).
Preiene proteine mogue je frakcionirati na razliite naine:
1. Frakcioniranje denaturacijom koristi razlike u toplotnoj osjetljivosti proteina. Kada
je poznata temperatura denaturiranja, mogue je ukloniti vie termolabilnih
kontaminirajuih proteina grijanjem smjese do temperature koja je 5-10 C nia od ove
kritine temperature u trajanju od 15-30 minuta. Denaturirani, neeljeni protein se
potom ukloni centrifugiranjem. Prisustvo supstrata, produkta ili inhibitora enzima esto
stabilizira enzim i omoguava da se moe primijeniti ak i via temperatura toplotne
32
denaturacije. Na slian nain, proteini se razlikuju u lakoi denaturiranja pri
ekstremnim pH vrijednostima ( < 3 ili > 10 ). Kompletan proteinski ekstrakt se dovede
na pH ne manji od jedne pH jedinice od pH unutar kojeg se ispitivani protein taloi.
Osjetljiviji proteini e se istaloiti i ukloniti centrifugiranjem.
2. Frakcioniranje solima izvodi se postepenim dodavanjem odgovarajue soli. U praksi
amonijsulfat je najee koriten jer je dobro topiv u vodi, moe se dobiti u visokom
stepenu istoe, jeftin je i nema tetnog uticaja na strukturu proteina. Nakon svakog
dodatka soli mora se osigurati potpuno otapanje soli i nastajanje homogenog otapala.
Istaloeni protein se odcentrifugira, otopi u svjeem puferu i ispita u odnosu na ukupni
protein i proteinsku aktivnost. Sve faze se izvode pri 0-10 C radi smanjenja
denaturacije. Dati protein se normalno isoli u okviru uskog podruja koncentracije
amonijsulfata. To je posljedica injenice da protein-protein udruivanje za dati protein
naglo postaje dominantno nad protein-voda i protein-so interakcijama. To je zbog toga
to dodatak soli uklanja sloj molekula vode koji okruuje hidrofobne grupe na povrini
proteina, to omoguava hidrofobnim grupama da uzrokuju udruivanje proteina i stoga
taloenje.
3. Frakcioniranje organskim otapalom zasniva se na razlikama u topivosti proteina u
vodenim otopima organskih otapala kao to su etanol, aceton i butanol. Organsko
otapalo sniava dielektrinu konstantu medija putem poveanja privlanosti izmeu
nabijenih molekula proteina i smanjenja njihove interakcije sa vodom. Topivost
proteina se stoga smanjuje. Frakcioniranje organskim otapalom u biti je suprotno
procesu obuhvaenim frakcioniranjem solima. Kod prvog procesa, hidrofobne grupe
proteina su znatno zatiene molekulama organskog otapala, a jonske grupe postaju
dominantne, dok kod drugog procesa hidrofobne grupe su jako izloene.
4. Frakcioniranje organskim polimerom slino je frakcioniranju organskim otapalom u
mehanizmu djelovanja, ali zahtijeva nie koncentracije za izazivanje taloenja proteina.
Najee koriteni polimer je polietilenglikol (PEG) sa relativnom molekulskom
masom u podruju 6 000 - 20 000.
5. Izoelektrino frakcioniranje (frakcioniranje taloenjem u izoelektrinoj taki)
zasnovano je na tome da proteini imaju minimalnu topivost u izoelektrinoj taki. Pri
ovom pH postoji jednak broj pozitivnih i negativnih naboja proteinske molekule i
intermolekulska odbijanja su minimalna, a intermolekulska privlaenja maksimalna, to
rezultira u nastajanju netopivih agregata. Osnovno to se moe iskoristiti je ili
uklanjanje neeljenog proteina, podeavanjem pH ekstrakta proteina tako da se izazove
taloenje ovih proteina, ali ne i ispitivanog proteina, ili uklanjanje ispitivanog proteina,
podeavanjem pH ekstrakta na pH
i
tog proteina.
Centrifugiranje je mona i ope primjenjiva metoda za razdvajanje i analizu stanica, organela
i biolokih makromolekula. estica koja se kree kruno sa poluprenikom r, ugaonom
brzinom e, izloena je centrifugalnom polju koje iznosi e
2
r.
Brzina taloenja tj. brzina sedimentacije estice ovisi o nekoliko inioca:
o masi estice tee estice bre se taloe od onih lakih;
o obliku estice koeficijent trenja kompaktne estice manji je nego u sluaju izduene
estice iste mase, to znai da e se kompaktnije estice bre taloiti od izduenih;
o gustoi estice gue estice se kreu mnogo bre od onih manje gustoe;
33
o gustoi otopine u kojoj se estica nalazi.
Krvna plazma je svijetlo-uta tenost, a najvei dio nje ini voda (oko 90%) u kojoj su
otopljene razliite organske i anorganske tvari, oko 7% proteina, 1% raznih anorganskih soli i
0,1% glukoze. Meu organskim tvarima najvanije su proteini plazme. U 1 litri plazme ima ih
oko 73 grama.
Te proteine moemo svrstati u 3 velike grupe:
- Albumini 45 g/l to su proteini plazme s najmanjom molekulskom masom, te su vrlo
prikladni za odravanje osmotskog tlaka. Osmotski tlak je vrlo vaan, jer odrava protuteu
hidrostatskom tlaku krvi koji stvara srce. Albumini se sintetiziraju u jetri i odatle se otputaju u
krv. Sudjeluju u prijenosu raznih hormona, razliitih jona, aminokiselina, masnih kiselina,
lijekova itd.
- Globulini 25 g/l vani su nositelji odbrane organizma u obliku razliitih antitijela. Dijele
se na alfa, beta i gama globuline. Uloga alfa i beta globulina je slina ulozi albumina, a gama
globulini su zapravo imunoglobulini (Ig), a to su molekule koje obavljaju zatitne funkcije.
- Fibrinogeni 3 g/l vrlo vani proteini u procesu zgruavanja krvi, te osiguravaju
zaustavljanje krvarenja. Fibrinogeni pomou trombocita stvaraju mreu u kojoj se onda
ulove eritrociti i nastaje ugruak (tromb). Krv bez fibrinogena je defibrinirana krv.
Potrebni reagensi:
- 0, 9 % vodena otopina NaCl
- 2, 0 % otopina trihloracetatne kiseline u 0,9 %-om NaCl
- Biuret reagens
- 6,0 % vodena otopina NaOH
U uzorku goveeg seruma izmjeriti koncentraciju ukupnih proteina koristei se Biuret testom
(100 l goveeg seruma razrijediti sa 900 l 0,9 % -ne otopine NaCl, a za daljnju proceduru
vidjeti vjebu Kvantitativno odreivanje ukupnih proteina Biuret metodom). Podatak
zabiljeiti u radni dnevnik i preraunati na sadraj proteina izraen u mg/100 ml seruma.
Nakon toga u dvije ependorf epruvete (centrifugalne kivete) odmjeriti po 100 l uzorka
goveeg seruma i na to dodati po 900 l 2,0 % otopine trihloracetatne kiseline. Propisno
zatvoriti kivete, okrenuti ih nekoliko puta da se sadraj izmijea i ostaviti ih 10 minuta da se
izvri taloenje. Za to vrijeme podesiti centrifugu na 3 500 o/min i centrifugiranjem u trajanju 5
minuta oboriti globuline na dno kiveta. U supernatantima odrediti sadraj albumina Biuret
testom. Iz razlike koncentracija ukupnih proteina i albumina izraunati koncentraciju globulina.
3. ZADACI I VJEBE
1. Glavne osobine albumina (A), globulina (B) i prolamina (C) su:
a) Nerastvorljivi u vodi, rastvorljivi u 70-80% alkoholu
b) Dobro rastvorljivi u vodi
c) Nerastvorljivi u vodi i u rastvorima soli umjerene koncentracije
34
4. REZULTATI
Standard A
Uzorak A
1
A
2
A
3
A
sr
St dev
- Napomena: Priloiti grafik
OVJERA VJEBE:
35
Vjeba broj 6
ENZIMI
1. TEORETSKI DIO
Enzimi su globularni proteini tercijarne ili kvarterne strukture, koji na povrini imaju veinu
polarnih aminokiselinskih ostataka, dok su nepolarni ostaci okrenuti prema unutranjosti
molekule. Ovako organizirane proteinske molekule nazvane enzimi imaju visoku katalitiku
mo i specifinost za pojedine hemijske reakcije i supstrate u ivim organizmima. Katalitika
mo enzima se manifestira njegovom sposobnou da smanjuje energiju aktivacije potrebnu za
odvijanje hemijskih reakcija. Enzimi ubrzavaju reakcije i vrlo esto kataliziraju samo jednu
hemijsku reakciju ili skup vrlo srodnih reakcija, a specifinost za supstrat je najee potpuna.
U trenutku katalitike promjene supstrat je s enzimom povezan uglavnom slabim
nekovalentnim vezama (vodikove, hidrofobne ili Van der Waalsove veze), to omoguava brzu
izmjenu molekula supstrata na enzimu. Ta izmjena se dogaa u jednom dijelu enzima
nazvanom aktivno mjesto. Aktivno mjesto predstavlja mali broj aminokiselina smjetenih u
unutranjosti u hidrofobnom dijelu proteinske molekule, ije prostorno ureenje odgovara
molekuli supstrata. Taj prostor u hidrofobnoj unutranjosti je odgovoran za njegovu katalitiku
mo.
Internacionalnom konvencijom enzim se svrstava u jednu od est vrsta na osnovu hemijske
reakcije koju katalizira. Svaka vrsta se dijeli prema prirodi hemijske grupe, koenzima i drugih
grupa ukljuenih u reakciju. Saglasno pravilima Evropske komisije (EC), svaki enzim moe se
oznaiti jedinstvenim kodom od etiri broja i nedvosmislenim sistematskim imenom
zasnovanim prema kataliziranoj reakciji.
36
est vrsta enzima su:
- Oksidoreduktaze, koje prenose atome hidrogena, oksigena ili elektrone od jednog
substrata na drugi;
- Transferaze, koje prenose hemijske grupe izmeu substrata;
- Hidrolaze, koje kataliziraju hidrolitike reakcije;
- Liaze, koje razlau substrate reakcijama razliitim od hidrolize;
- Izomeraze, koje pretvaraju izomere jedan u drugi intermolekularnim premjetanjem;
- Ligaze (sintetaze), koje kataliziraju nastajanje kovalentne veze, uz cijepanje
odgovarajueg nukleotid-trifosfata.
Jedinica za enzimsku aktivnost
Jedna enzimska jedinica definira se kao koliina enzima koja pri optimalnim uvjetima (25 C,
1 bar), razloi 1 mol supstrata za jednu minutu. Specifina aktivnost enzima moe se izraziti
kao broj enzimskih jedinica po miligramu proteina.
Nova internacionalna jedinica (IU) odreena od strane EC je katal (kat). Definira se kao
koliina enzima koja pri optimalnim uvjetima (25 C, 1 bar) razloi 1 mol supstrata za jednu
sekundu. Iz praktinih razloga u upotrebi su manje jedinice kao mikrokatal (kat), pikokatal
(pkat), nanokatal (nkat) itd.
Amilaza spada u grupu hidrolaza (karbohidraze), jer kataliziraju hidrolizu oligo- i polisaharida.
Hidroliza se vri razlaganjem glikozidnih veza izmeu monosaharida, koji izgrauju oligo- i
polisaharide. -amilaza se nalazi u svim organima ovjeka i drugih sisara (ubikvitaran enzim),
a najvea aktivnost je u pljuvaki (gdje se naziva ptijalin) i u pankreasnom soku (gdje se naziva
dijastaza). Specifina je za 1-4 glikozidnu vezu u polisaharidima (krob i glikogen). Poto ne
moe da cijepa 1-6 glikozidnu vezu, razlae se oko 80% molekule kroba tj. potpuno
hidrolizira amilozu i amilopektin. Krajnji produkti koji nastaju hidrolizom kroba ovim
enzimom su maltoza i granini dekstrini koji nastaju na mjestima grananja u amilopektinu, tj.
gdje se nalazi 1-6 glikozidna veza. Zato se -amilaza jo naziva i endoamilaza (unutranja) ili
dekstrinogena amilaza. Za razliku od -amilaze, -amilaza je biljnog porijekla. Specifina je,
takoer, za 1-4 glikozidnu vezu, ali djeluje na krajevima polisaharidnih lanaca. Zato ima
naziv-egzoamilaza (spoljanja) i krajni produkti njenog djelovanja su molekule maltoze.
Pepsin je takoer enzim iz grupe hidrolaza (III grupa enzima) iz grupe peptidhidrolaza. To je
proteolitiki enzim koji cijepa peptidne veze u denaturiranim proteinima u elucu. Kada se
proteini u elucu denaturiraju hloridnom kiselinom iz eluanog soka, dobiju naziv acid
albumini (acid proteini). Pepsin prvenstveno cijepa peptidne veze izmeu aromatskih i
dikarboksilnih aminokiselina tako da nastaju, kao produkti, dui ili krai peptidni lanci. Krai
lanci se nazivaju peptoni, a dui albumoze. Smjesa peptona i albumoza se koristi kao podloga
za bakterije. Pepsin lue glavne elije eluane sluznice u obliku proenzima-pepsinogena koji
je neaktivan to se tie proteolize. Pepsinogen se pri pH ispod 3 reverzibilno aktivira
promjenom konformacije, a zatim autokatalizom odcjepljuje dva peptida sa N-terminalnog
kraja, prelazei ireverzibilno u pepsin.
Schardingerov enzim katalizira oskidaciju aldehida i otuda se naziva aldehid-dehidrogenaza
Schardingera (aldehid: O
2
-oksidoreduktaza 1.2.3.1.). Pored toga, ovaj enzim ubrzava
37
oksidaciju hipoksantina i ksantina u mokranu kiselinu. Zahvaljujui drugoj reakciji koju
katalizira, dobio je naziv ksantin-oksidaza (ksantin: O
2
-oksido-reduktaza-1.2.3.2). Dugo se
mislilo da su to dva odvojena enzima.
Svijee mlijeko sadri dosta Schardingerovog enzima. Jetra ovjeka takoer je bogata ovim
ezimom. Schardingerov enzim oksidira podjednako efikasno i aromatske i alifatske aldehide.
Da bi se ostvarila oksidacija (putem oduzimanja hidrogena) in vitro, potrebno je reakcionoj
smjesi dodati supstancu-akceptor hidrogena. U tu svrhu moe da poslui metilensko plavo, jer
ono prima hidrogen do oksidiranog supstrata i odmah se obezboji-prelazi u leuko formu. Ako
due stoji, metilensko plavo moe ponovo da se oboji, jer lahko predaje hidrogen oksigenu iz
zraka. In vivo, hidrogen oduzet od supstrata predaje se direktno oksigenu, ili preko NAD-a, ako
je hipoksantin supstrat oksidacije. Schardingerov enzim spada u aerobne dehidrogenaze u oba
sluaja: i kada djeluje na aldehide i kada djeluje na purine. Ako upotrebljavamo mlijeko kao
izvor enzima, neophodno je da bude svjee. Temperatura kljuanja brzo razara enzim.
- Dokazivanje aktivnosti i termolabilnosti ptijalina (-amilaze iz pljuvake)
Skupiti 2-3 ml pljuvake, profiltrirati je, podijeliti na dva dijela. Jedan dio prokljuati na
plameniku ili reou. U est epruveta pripremiti smjese prema datoj tabeli:
Epruveta I II III
krob
2-3 ml 2-3 ml 2-3 ml
Neprokuhana
pljuvaka
Nekoliko
kapi
Prokuhana
pljuvaka
Nekoliko
kapi
Lugolov reagens
2-3 kapi 2-3 kapi 2-3 kapi
Sve epruvete staviti u vodeno kupatilo na 37

C na inkubiranje od 30 minuta. Nakon tog
vremena izvaditi epruvete i zakljuiti ta se desilo u epruvetama.
Izvesti Fehling-ovu reakciju na sadraje u drugoj i treoj epruveti. U svaku dodati po 1-2 ml
pripremljenog Fehlingovog reagensa i zagrijavati do kljuanja. Zakljuiti ta se desilo u ovim
epruvetama.
- Praenje aktivnosti pepsina
U tri epruvete odmjeriti po 1,0 ml 1 % otopine pepsina u 0,5 % otopini HCl. U etvrtu epruvetu
odmjeriti 1,0 ml iste otopine pepsina, ali prethodno prokuhanog na 70 - 100 C (u tu svrhu za
itavu grupu studenata odmjeriti manju au 10 ml otopine pepsine i prokuhati).
Treba pripremiti kuhano bjelance kokoijeg jajeta isjeckano na kockice koje e posluiti kao
supstrat. Uzeti etiri epruvete i dodati u njih:
38
Epruveta Bjelance Pepsin Prokuhani pepsin 0,2% HCl 1% Na
2
CO
3
I 2-3 kockice 2-3 kapi 5 mL
II 2-3 kockice 5 mL
III 2-3 kockice 2-3 kapi 5 mL
IV 2-3 kockice 2-3 kapi 5 mL
Sve etiri epruvete staviti u vodeno kupatilo, na 37 C i inkubirati 30 minuta. Pripremiti nove
etiri epruvete i nakon inkubacije sadraje epruveta dekantirati u nove pripremljene epruvete.
U izdvojene filtrate dodati 1-2 ml Biuret reagensa. Uoiti gdje se desila Biuret reakcija.
- Dokazivanje prisustva dehidrogenaze Schardingera u mlijeku
U tri epruvete staviti po 1 ml svjeeg mlijeka. U jednu, dodati 1 kap 0,02% rastvora
metilenskog plavog i 1 kap 0,4% rastvora aldehida, a u drugoj samo metilenskog plavog.
Epruveta Mlijeko Prokuhano mlijeko Metilensko plavo 0,4% aldehid
I 1 ml 1 kap 1 kap
II 1 ml 1 kap
III 1 ml
Sadraj epruveta promijeati i staviti u vodeno kupatilo na 70 C. Kroz nekoliko minuta sadraj
prve epruvete izgubi boju.
3. ZADACI I VJEBE
1. Koji enzim pokazuje apsolutnu specifinost prema supstratu:
a) Himotripsin
b) Papain
c) Ureaza
d) Arginaza
e) Lizozom
2. Koji od proteolitikih enzima pokazuje esteraznu aktivnost:
a) Tripsin
b) Karboksipeptidaza
c) Aminopeptidaza
d) Himotripsin
e) Pepsin
3. Na kojoj temperaturi se enzimi denaturiraju:
a) 0 C
b) 80-100 C
c) 20-30 C
d) 30-40 C
4. Koja je temperatura optimalna za djelovanje veine enzima:
a) 50-60 C
39
b) 15-20 C
c) 80-100 C
d) 35-40 C
5. Koji optimum pH ima enzim pepsin:
a) 1,5-2,5
b) 4-5
c) 6-7
d) 8-9
e) 10-11
6. Kinetika enzima je rijeena preko Michael-Mentenove konstante. Napisati jednainu i
prikazati je grafiki?
40
4. REZULTATI
- Dokazivanje aktivnosti i termolabilnosti ptijalina (-amilaze iz pljuvake)
Broj epruvete
Rezultat
Fehling-ova proba
Komentar
- Praenje aktivnosti pepsina
Broj epruvete
Biuret proba
Komentar
41
- Dokazivanje prisustva dehidrogenaze Schardingera u mlijeku
Broj epruvete
Rezultat
Komentar
OVJERA VJEBE:
42
Vjeba broj 7
ODREIVANJE AKTIVNOSTI -AMILAZE PO WOHLGEMUTH-U
1. TEORETSKI DIO
Postoji niz metoda za odreivanje aktivnosti amilaze. Prema njihovom principu mogu se
podijeliti na slijedee grupe:
o Viskozimetrijske metode (zasnivaju se na smanjenju viskoznosti rastvora kroba zbog
hidrolitikog djelovanja amilaze);
o Saharogene metode, zasnivaju se na odreivanju reduktivnih spojeva koji nastaju
hidrolizom kroba. Ove metode nisu precizne;
o Hromogene metode, koriste se u proteklih 20-tak godina, a zasnivaju se na djelovanju
amilaze na krob ili amilozu ili amilopektin koji su kovalentno vezani (eterski ili
esterski) za neku boju koja je derivat trijazina, koja se oslobaa pri hidrolizi kroba
(amiloze ili amilopektina) , centrifugiranjem odvaja i mjeri fotometrijski;
o Nefelometrijske metode, zasnivaju se na smanjenju zamuenosti reakcione smjese
kroba i ispitivanog materijala (urin, plazma, pljuvaka) nakon hidrolize kroba;
o Spektrofotometrijske i fluorimetrijske enzimske metode u kojima se prati
oksidoredukcija nikotinamidadenin dinukleotida (NAD-a);
o Fotometrijske metode sa sintetskim supstratima iji se razgradni produkti mogu mjeriti
fotometrijski, kontinuirano. Takvi su supstrati razni: p-nitrofenilni i Cl-p-nitrofenilni
maltozidi (u obliku testova). To su najnovije i dosta precizne metode. Zamjenjuju
klasine metode zbog toga, to hidrolizom kroba pod djelovanjem amilaze nastaju
produkti koji nisu tano definirani u datom momentu (amilo-, eritro-, ahromodekstrini);
o Amiloklasine metode-zasnivaju se na svojstvu kroba ili amiloze da sa jodom daju
plavi produkt (amilopektin sa jodom daje ljubiastu boju). Djelovanjem amilaze na
krob nastaju prvo amilodekstrini (sa jodom daju plavoljubiastu boju), zatim
eritrodekstrini (sa jodom daju crvenu boju), ahromodekstrini (ahrodekstrini) sa jodom
se ne boje
U grupu amiloklasinih metoda ubraja se i metoda odreivanja amilaze po Wohlgemuth-u.
Prva metoda za odreivanje aktivnosti amilaze koja se zasniva na tome koje razrijeenje
uzorka jo razgrauje krob, pa se dodatkom joda (Lugolovog rastvora) ne javlja plava boja.
Metodu je uveo Wohlgemuth kao prvu metodu odreivanja enzima u dijagnostike svrhe.
Najveu dijagnostiku vrijednost metoda je pokazala kod oboljenja pankreasa i parotitisa. Tako
-amilaza iz pljuvake (ptijalin) ima poveanu aktivnost u pljuvaci, serumu i urinu kod
akutnog parotitisa (zaunjaka) ili kod ira (ulcusa) na elucu. Amilaza iz pankreasa (dijastaza)
ima poveanu aktivnost u serumu i urinu kod akutne nekroze pankreasa u poetnom stadiju,
akutnog pankreatitisa. Znaajno povienje aktivnosti dijastaze u urinu javlja se kod upala
une kese, uremije, perforacije ira na elucu, postoperativnih stanja.
43
U stalak se pripremi 10 istih epruveta i u svakoj odpipetira po 1 ml fiziolokog rastvora
(0,90% NaCl). U posebnu, istu epruvetu se sakuplja profiltrirana pljuvaka bez dodatka vode
radi lakeg i breg filtriranja. Sakupi se neto vie od 1 ml, a potom odpipetira 1 ml i stavi u
prvu epruvetu.
Sadraj epruvete se dobro promijea i na taj nain se dobije dva puta razblaena pljuvaka.
Nakon toga se odpipetira 1 ml tako razblaene pljuvake i stavi u drugu epruvetu. Sadraj i ove
epruvete se dobro promijea i dobije etiri puta razblaena pljuvaka. Postupak se ponavlja sve
do desete epruvete iz koje se 1 ml pljuvake izbaci. Potrebno je prilikom ovog razblaivanja
pipetu kojom se pipetira i prebacuje sadraj jedne epruvete u drugu, nakon svakog prebacivanja
sadraja isprati vodom. Kada se naprave razblaenja pljuvake, u svaku epruvetu se odpipetira
po 1 ml 0,1% koloidnog rastvora kroba. Sadraji u svakoj epruveti se promijeaju, sve se vrati
u stalak i termostatira na sobnoj temperaturi. Poslije 15 minuta termostatiranja u svaku
epruvetu (od desete do prve) se doda po jedna kap Lugolovog reagensa. U epruvetama u
kojima je krob hidroliziran nema plave boje, a u kojima nije hidroliziran pojavljuje se plava
boja. Izmeu obojenih i neobojenih sadraja u epruveta javlja se jedan koji sa Lugolovim
rastvorom daje crvenu boju. Boja potie od razgradnih produkata kroba-eritrodekstrina sa
jodom iz Lugolovog reagensa. U toj epruveti razblaena pljuvaka sadri jednu enzimsku
jedinicu -amilaze, po Wohlgemuth-u.
Jedna enzimska jedinica -amilaze po Wohlgemuth-u je ona aktivnost ovog enzima pri kojoj se
na temperaturi od 38 C hidrolizira 1 mg kroba za 30 minuta, odnosno 0,00055 mg kroba za
jednu sekundu. Najmanje razblaenje uzorka u kome se za 30 minuta na temperaturi od 38

C
hidrolizira jedan mg kroba do produkata koji sa Lugolovim rastvorom ne daju plavu boju
(eritrodekstrini-daju crvenu boju) sadri jednu jedinicu -amilaze po Wohlgemuth-u (1 WJ).
Pretvaranje IU u katale:
1 kat = 1 mol/s = 60 mol/min = 60x10
6
mol/min = 6x10
7
IU
1 IU = 1 mol/min = 1/60 mol/s = 1/60 kat = 16,67 nkat
Ukoliko se kao supstrat na koji djeluje amilaza koristi krob koji ima molekulsku masu 55000,
onda 1 WJ -amilaze iznosi 0,01 nkat.
3. ZADACI I VJEBE
1. Koji pH optimum ima enzim amilaza:
a) 1,5-2
b) 7-7,5
c) 8-9
d) 3,5-4
e) 4,5-5
2. Za koje enzime su Mg
2+
aktivatori:
a) Fosforilaze
b) Amilaze
44
c) Heksokinaze
d) Kreatinkinaze
e) Karboksipeptidaze
3. Za koje enzime su joni Zn
2+
aktivatori:
a) Karboksipeptidazu
b) Karboanhidrazu
c) Glutamatdehidrogenazu
d) Laktatdehidrogenazu
e) Aminooksidazu
4. Koji je jon neophodan za djelovanje kinaza (fosfotransferaza) koje kataliziraju graenje
O-fosfatnih estera:
a) Mg
2+
b) Co
2+
c) Ca
2+
d) Na
+
e) K
+
7. Kod kojih enzima u aktivnom centru su dokazane aminokiseline glutamat i aspartat:
a) Piruvatdehidrogenaze
b) Lizozomu
c) Pepsinu
d) Ureazi
e) Karboksipeptidazi
8. Koji enzimi pripadaju grupi serinskih enzima:
a) Pepsin
b) -himotripsin
c) tripsin
d) acetilholinesteraza
e) lizozom
9. Dokazati da 1 WJ iznosi 0,01 nkat?
45
4. REZULTATI
- Izraunati aktivnost uzorka pljuvake i prikazati u WJ, kat i IU.
Broj
epruvete
Razblaenje
pljuvake
WJ
OVJERA VJEBE:
46
Vjeba broj 8
SPEKTROFOTOMETRIJSKO ODREIVANJE SADRAJA UKUPNIH
FENOLA U UZORKU PELINJEG MEDA
1. TEORETSKI DIO
Postoji vie naina da se odredi ukupna koliina fenolskih spojeva, uz napomenu da nijedna od
ovih tehnika ne detektuje sve fenolske spojeve. Jedna od najee koritenih metoda za
odreivanje ukupnog sadraja fenola je stara oko 100 godina i u poetku je razvijena za
istraivanje metabolizma proteina kod ljudi. Folin i Denis (1912) su koristili kolorimetrijski
metod detekcije tirozina prilikom hidrolize proteina. Aktivni reagens je ut i sastavljen je od
kompleksnih polimernih jona formiranih od fosfomolibdenove i fosfovolframove kiseline. ini
se da ovaj rastvor sadri integrirane polimerne serije i da imaju formu tetraedra okruenu sa
oktaedarskim molibden oksikiselinskim jedinicama u kojoj volfram moe lahko supstituirati
molibden. Ovaj reagens oksidira fenolate i heteropolarna kiselina biva reducirana iz stanja +6 u
smjesu stanja +6 i +5 uz nastanak plavog molibden-volframovog kompleksa. Metod je
modificiran od strane Folin-a i Ciocalteu-a (1927). Modifikacija ukljuuje dodatak litijuma u
fosfovolframat / fosfomolibdat reagens na kraju procesa kuhanja. Dodatak litijuma sprijeava
precipitiranje i smetnje prilikom kvantifikacije u odnosu na intenzitet boje. Intenzitet boje
moe biti koriten za kvantitativnu analizu na osnovu vrijednosti apsorbanse. Koncentracija
fenola se izraava kao ekvivalenti galne, odnosno hlorogenske kiseline koje se koriste kao
standardi.
Od ranije je evidentan uticaj fenolskih komponenti na ljudsko zdravlje. Najvjerovatnije
najstarija medicinska primjena fenolskih komponenti je upotreba fenola kao antiseptika. Zbog
negativnog uticaja koji ima na tkiva, posebno nastajanje rana pri velikim koncentracijama, nije
vie u upotrebi. Do danas su se zadrale u upotrebi 0,5% otopina fenola protiv bakterija
Staphylococcus aureus i 1,5% otopina kao oralni anestetik. Druga esta upotreba fenolskih
komponenti je kao zatita od UV zraenja. Prisustvo aromatskog prstena doprinosi efektivnoj
apsorpciji UV zraenja (izmeu 280-315 nm) i na taj nain titi od opekotina. Najei sastojak
krema za sunanje je p-aminobenzojeva kiselina (nije fenolski spoj). Ovaj sastojak se koristio
do 1970-ih kada je otkriveno da izaziva osip i akne. Alternative aktivne komponente su
salicilati, kao to je oktilsalicilat, cimetati kao to je oktilmetilcimetat (nerastvoran u vodi i
koristi se za kreme nerastvorne u vodi), benzofenon, oksibenzon, antraanilati kao to je
mentilantranilat. Imaju ulogu pri stresnim situacijama u okolini, to ukljuuje zatitu od
visokih nivoa vidljive i UV svjetlosti, odbrana od patogena i opta zatita od oksidativnog
stresa, ozona. Takoer, utiu na ljudsko zdravlje uz mogue djelovanje kao antioksidanti,
antikancerogeni i karvoprotektivni agens. Fenoli u biljkama nalaze slijedee uloge: zatita od
tetnog UV zraenja, odbrana od biljojeda, odbrana od patogena, zatita od fitoinhibije i zatita
od reaktivnih kisikovih estica (ROS-reactive oxygen species).
Potrebni reagensi:
- Uzorci za analizu-Pelinji med
- Standard-galna kiselina, > 98 %,
47
- Folin-Ciocalteu's reagens
- Natrij-karbonat
Za analizu e biti koritena metoda po Singleton-Rossiju.
a) Priprema standardne otopine galne kiseline
U istoj i suhoj aici odvagati 0,0250 g galne kiseline, dodati 200 l 95% etanola, lagano
protresti rukom da se supstanca otopi, te dodavanjem destilirane vode pric balonom
kvantitativno prenijeti sadraj (ispirati aicu destiliranom vodom) u odmjerni sud od 50 ml.
Postojanost ove otopine je 2 dana na 4 C. Odgovarajua razrijeenja ove standardne otopine
koriste se za pripremu kalibracionog pravca (npr. pripremiti po 10,00 ml 200, 150, 100, 50 i 10
mg/l galne kiseline).
b) Priprema uzorka
U istoj i suhoj aici odvagati na analitikoj vagi oko 1 g uzorka meda, zapisati tanu masu
odvage, dodati na uzorak 10 ml destilirane vode i mijeati staklenim tapiem do otapanja.
Otopinu sa uzorkom prenijeti kvantitativno u odmjerni sud od 25 ml uz ispiranje ae sa jo 10
ml (u porcijama po 5-6 ml) destilirane vode. Nakon to se i taj dio prenese u odmjerni sud,
otopina se protrese i dopuni do oznake od 25,00 ml pomou pric balona. Ukoliko se primijete
vrsti ostaci u otopini, kompletan sadraj profiltrirati preko obinog filtar papira u istu au ili
drugi odmjerni sud. Nakon toga, odreeni volumen uzorka razrijediti u omjeru 1 : 10 (npr. na
1,00 ml uzorka dodati 9,00 ml destilirane vode).
c) Eksperimentalna procedura
Na 2,00 ml otopine uzorka ili standarda (razrijeenih na gore opisani nain) doda se 10,00 ml
Folin-Ciocalteu reagensa razrijeenog u omjeru 1:10 i promijea. Ova smjesa se ostavi da
odstoji oko 10 minuta. Zatim se doda 8,0 ml 7,5 %-og Na
2
CO
3
. Nakon 30 minuta stajanja na
sobnoj temperaturi oita se apsorbansa pri 743 nm.
Priprema slijepe probe obavlja se na isti nain, s tom razlikom to se umjesto uzorka ili
standarda uzima 2,00 ml destilirane vode!
3. REZULTATI
Uzorak
(mg/L)
Apsorbansa (A)
48
- Koncentracija nepoznatog uzorka
- Uz izvjetaj priloiti i grafik kalibracione krive
OVJERA VJEBE
49
Vjeba broj 9
SPEKTROFLUORIMETRIJSKO ODREIVANJE
ANTIOKSIDATIVNOG KAPACITETA U UZORKU PELINJEG MEDA
1. TEORETSKI DIO
Fluorimetrija je analitika metoda odreivanja supstanci zasnovana na fluorescenciji.
Fluorescencija predstavlja proces koji se deava u vrlo kratkom vremenskom periodu (< 10
-8
s)
kada elektroni vraajui se sa najnieg pobuenog energetskog nivoa u osnovno energetsko
stanje emitiraju pri tome energiju u vidu svjetlosti (fotona). Mnoge organske molekule
apsorbiraju u UV ili pak vidljivom valnom podruju, ali ne fluoresciraju. Ipak, veina od onih
koje fluoresciraju, od bioloke su vanosti.
Slika 1: Dijagram energijskih razina koji pokazuje neke od energijskih promjena to se dogaaju pri (a)
apsorpciji, (b) relaksaciji bez pojave zraenja i (c) fluorescenciji molekulskih vrsta.
Na slici 1c prikazuje se relaksacijski proces fluorescencija. Treba uoiti da se pri
fluorescenciji molekule pojavljuju vrpce zraenja, jer se elektronski pobuene molekule mogu
relaksirati u bilo koje od nekoliko vibracijskih nivoa u osnovnom elektronskom stanju.
Molekulske fluorescencijske vrpce, kao i molekulske apsorpcijske vrpce, sastavljene su od
mnotva blizu smjetenih, esto teko razluljivih linija. Fluorescencija se, prema tome,
definira kao zraenje emitovano pri prelasku molekule sa najnieg vibracionog nivoa
ekscitiranog singlet stanja u osnovno stanje.
Supstance koje fluoresciraju treba da sadre fluoroforne grupe kojima je uslovljena
fluorescencija. Uvoenje nekog supstituenta u jedinjenje moe da pojaa ili oslabi intenzitet
fluorescencije. Supstituenti koji pojaavaju intenzitet fluorescencije nazivaju se auksofluori, a
oni koji slabe intenzitet diminofluori. Auksofluori su supstituenti koji se kad se uvedu
poveavaju delokalizaciju elektrona. Obino se uvode ovi supstituenti sa orto i para
50
direkcionim grupama kao to su fluoro, amino, alkilamino, dialkilamino, hidroksi, metoksi
grupe itd. Primjena fluorescencije je ograniena na spojeve koji posjeduju sistem dvostrukih
veza. Najintenzivnije i najprimjenljivije fluoresciraju spojevi koji imaju aromatske prstenove,
dok je vrlo mali broj alifatskih i aromatskih jedinjenja sa karbonilnom grupom koja mogu da
fluoresciraju.
Razni faktori mogu uticati na intenzitet fluorescencije, a to su: koncentracija uzorka koji
fluorescira, prisustvo drugih supstanci koje fluoresciraju ili ne fluoresciraju, prisustvo
supstanci koje izazivaju gaenje fluorescencije, uticaj koncentracije vodikovih jona (pH), uticaj
temperature, uticaj rastvaraa, uticaj razgradnje uzorka.
Postoje dvije vrste instrumenata koje se koriste za ovu metodu: fluorimetri i spektrofluorimetri.
Razlika izmeu ova dva instrumenta je neznatna, fluorimetar ima filtere, a spektrofluorimetar
ima prizme (monohromator) za selekciju valnih duina pri pobuivanju uzorka i prizme za
selekciju valne duine prilikom registriranja emisije fluorescencije. Izvor i detektor se u
jednostavnijim instrumentima mogu smjestiti puno blie uzorku, ime se postie vea
osjetljivost.
Vie biomolekula ima unutranju fluorescenciju koja se moe ponekad koristiti bez potrebe
vezivanja kemijske grupe. Ponekad se ova unutranja fluorescencija mijenja ako se molekula
nae u specifinoj sredini, tako da se distribucija ili vezivanje molekule moe mjeriti.
Bilirubin, npr., visoko je fluorescentan ako se vee na specifino mjesto albumina seruma.
Cink-protoporfirin, nastao umjesto hemoglobina (ako eljezo nije raspoloivo ili ako je
prisutno olovo) razvijanjem eritrocita, ima iroku fluorescenciju i moe se koristiti za detekciju
ovih problema.
Potrebni reagensi:
- Uzorak za analizu-Pelinji med
- Standardi-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilkroman-2-karboksilna kiselina (troloks),
- fluorescein
- hidrogenperoksid, 33-35 %,
- bakar(II)-sulfat-pentahidrat, p.a.
Za analizu e biti koritena metoda oksigen radikal apsorpcijskog kapaciteta (ORAC). Ova
metoda moe kvantitativno mjeriti ukupni AC biolokog uzorka kao npr. ljudskog i
ivotinjskog seruma, tkiva, poljoprivrednih i prehrambenih proizvoda, sastojaka hrane,
farmaceutskih proizvoda itd. Metoda mjeri efektivnost razliitih prirodnih antioksidanata
prisutnih u uzorku, u sprijeavanju gubitka intenziteta fluorescencije fluoresceina (FL) ili
fluorescentnog marker proteina |-pikoeritrina (beta-PE) tokom njihovog izlaganja djelovanju
FR.
51
Struktura fluoresceina
Rezultati ORAC metodom postiu se dovodei reakciju do kraja i integrirajui povrinu ispod
kinetike krive relativno prema reakciji slijepe probe koja ne sadri dodane antioksidante.
Povrina izmeu krive uzorka i krive slijepe probe srazmjerna je koncentraciji svih
antioksidanata prisutnih u uzorku. Svaka reakcija se kalibrira upotrebom standarda troloksa
(Trolox
), koji je sintetski vodotopivi vitamin E analog.

Grafiki prikaz izraunavanja ORAC vrijednosti
Podaci se proslijeuju elektronski od Perkin-Elmer luminiscentnog spektrometra LS 55 na
raunarski sistem opremljen softverskim programom FL WinLab i analiziraju programom
Microsoft Excel 2000 primjenjujui jednaine (1) i (2) za povrinu ispod fluorescentne
opadajue krive:
, )
, ) , )
. . . . / ,
/
P S S P S U g mol TE
S S S S k ORAC =
(1)
gdje je :
ORAC - oksigen radikal apsorpcijski kapacitet izraen u troloks ekvivalentima
(TE, mol/g)
k - faktor razrijeenja otopine;
U
S - povrina ispod fluorescentne opadajue krive za uzorak
52
. .P S
S - povrina ispod fluorescentne opadajue krive za slijepu probu
S
S - povrina ispod fluorescentne opadajue krive za standard
Povrina integrala ispod fluorescentne opadajue krive za uzorak, standard ili slijepu probu
izraunava se po obrascu za izraunavanje povrine trapeza na slijedei nain:
, ) , ) , ) , ) , ) , ) j
i i i i
f f t t f f t t f f t t S + + + + + + =
+ + 1 1 1 2 1 2 0 1 0 1
...
2
1
( 2 )
gdje je:
S - povrina integrala ispod fluorescentne opadajue krive za uzorak, standard ili
slijepu probu
t - vrijeme inkubacije
f - relativni intenzitet fluorescencije
a) Priprema uzorka
U istoj i suhoj aici odvagati na analitikoj vagi oko 1 g uzorka meda (zapisati tanu masu
odvage), dodati na uzorak 10 ml destilirane vode i mijeati staklenim tapiem do otapanja.
Otopinu sa uzorkom prenijeti kvantitativno u odmjerni sud od 25 ml uz ispiranje aice sa jo
10 ml destilirane vode (u porcijama). Nakon to se i taj dio prenese u odmjerni sud, otopina se
protrese i dopuni do oznake od 25,00 ml pomou pric balona. Od tako pripremljenog uzorka
uzeti 100 l, razrijediti ih sa 900 l destilirane vode i nakon mijeanja na vorteksu koristiti za
analizu.
b) Priprema standarda, fluoresceina i generatora hidroksilnih radikala
Pripremiti slijedee otopine:
4,00 ml 1 mM otopine troloksa (na odvagu troloksa dodati 100 l etanola, a zatim 3,90
ml destilirane vode); zatim razrijeivanjem u vodi pripremiti 1,00 ml 20 M otopine
troloksa;
10,00 ml 0,64 M otopine fluoresceina (FL);
1,00 ml ~ 2,2 M H
2
O
2
;
10,00 ml 72 mMCuSO
4
u destiliranoj vodi.
c) Eksperimentalna procedura
U kivetu za mjerenje dodati 50,00 l 0,64 M otopine FL, 100 l 20 M otopine troloksa ili
uzorka meda (razrijeenog na odgovarajui nain), 1750 l destilirane vode, 50 l 7,2 mM
otopine Cu
2+
, postaviti kivetu u aparat za mjerenje, a odmah zatim 50 l 2,2 M otopine H
2
O
2
i
promijeati sadraj. Nakon toga mjeriti intenzitet fluorescencije svakih 5 minuta do kraja
reakcije (sve dok relativni int. fluorescen, ne padne na nulu).
Slijepa proba:
50,00 l 0,64 M otopine FL, 1850 l destilirane vode i nakon termostatiranja 50 l 7,2 mM
otopine Cu
2+
+ 50 l 2,2 M otopine H
2
O
2
).
53
3. REZULTATI
OVJERA VJEBE
Slijepa
proba
Standard
Povrina
ORAC

Biohemija II Praktikum 2011 12

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Biohemija II Praktikum 2011 12

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Anela Topagi

), koji je sintetski vodotopivi vitamin E analog.

You might also like