ANALIZA SPECTRALĂ

1. Analiza spectrală de emisie- punerea în evidenţă a sodiului în produsele biologice

Radiaţiile electromagnetice în interacţiune cu substanţe pot determina efecte diferite, la nivel atomic sau molecular. Aceste efecte pot fi explicate dacă se iau în considerare următoarele aspecte: • Undele electromagnetice includ în spectrul lor o gamă largă de frecvenţe;

Din punct de vedere energetic, atomii pot exista doar în anumite stări energetice, bine definite, numite nivele de energie. Absorbţia, respectiv emisia unei radiaţii electromagnetice poate avea loc numai dacă frecvenţa acestora corespunde diferenţei de energie dintre cele două nivele energetice între care are loc tranziţia, conform relaţiei următoare: (1)

unde: • E= diferenţa de energie dintre cele două nivele energetice; • h= constanta lui Planck= 6,6256(5)* Js; • v= frecvenţa radiaţiei absorbită sau emisă.

Fig. 1. spectrul electromagnetic: λ- lungimea de undă; v-frecvenţa; ε-energia

în IR îndepărtat. pot produce tranziţii de pe aceste nivele. trecerea de pe nivelul energetic inferior pe un nivel energetic superior se realizează prin absorbţia unei radiaţii ce satisface relaţia (1) în ceea ce priveşte frecvenţa şi energia. tranziţiile de pe aceste nivele se pot produce doar prin interacţii cu radiaţii de frecvenţă mare şi periferice. c) Nivelele de rotaţie ale moleculelor corespund mişcării de rotaţie a întregii molecule. tranziţiile între aceste nivele realizează spectrele de vibraţie. Aceste radiaţii poartă numele de linii spectrale şi sunt caracteristice fiecărei specii specii atomice. invers. tranziţiile între ele dau spectre de rotaţie. radiaţiile din vizibil şi U. revenirea la starea fundamentală corespunde emisiei unei radiaţii cu aceiaşi parametri (fig.În aceste condiţii. absorbţie stare excitată stare E2 E2>E1 E1 emisie fundamentală fig. b) Nivele de vibraţie ale moleculelor corespund mişcărilor de vibraţie ale nucleelor din moleculă în jurul anumitor poziţii de echilibru. în condiţii identice de temperatură şi presiune. tranziţiile electronice ce apar la emisia şi absorbţia radiaţiilor Tipurile de nivele de energie diferă ca ordin de mărime după cum urmează(tabelul 1): a) Nivelele electronice pot fi: interioare(mai apropiate de nucleu. Totalitatea radiaţiilor absorbite corespunzătoare tranziţiilor între diferite nivele energetice alcătuiesc spectrul de absorbţie al substanţei respective. cu energia mai mare).V. ceea ce permite identificarea acesteia într-un amestec. În producerea liniilor spectrale este respectată legea inversiunii liniilor spectrale: fiecare substanţă poate absorbi aceleaşi radiaţii pe care le poate şi emite.2. .2).

Are o largă utilizare. • Spectre de bandă.sunt cele ce acoperă în întregime gama de frecvenţa a unui anumit domeniu. UV) Spectrele se pot clasifica după cum urmează: 1. Din cele prezentate mai sus se poate deduce o altă clasificare a spectrelor: atomice şi moleculare. IR etc. în domeniul respectiv.sunt alcătuite din anumite radiaţii grupate în anumite zone ale gamei de frecvenţe ale domeniului respectiv. urmare a unor condiţii potrivite de excitare. 2.sunt compuse doar din radiaţii monocromatice separate de intervale de lungimi de undă libere. de emisie/ absorbţie. Ea poate fi: calitativă/ cantitativă. Spectrele mai pot fi clasificate în: • Spectre continue. Un spectru de emisie se prezintă doar sub forma acelor linii sau benzi colorate corespunzătoare radiaţiilor emise. UV. Metoda fizică ce se ocupă cu studiul spectrelor de emisie si de absorbţie caracteristice elementelor şi foloseşte la depistarea acestora în compoziţia unui amestec se numeşte analiză spectrală. iar în funcţie de domeniul de frecvenţe căruia aparţin spectrele se pot clasifica în: vizibil. Spectre de emisie: cuprind totalitatea radiaţiilor emise în urma tranziţiilor de pe nivele energetice inferioare. acesta atenuându-şi pe parcurs intensitatea iniţială. Spectrele de absorbţie: cuprind totalitatea radiaţiilor corespunzătoare tranziţiilor de pe nivelele energetice inferioare ale atomilor şi moleculelor pe nivele energetice superioare. Spectrul de absorbţie se prezintă sub forma unor linii înnegrite ce apar în spectrul continuu iniţial. • Spectre de linii.Nivel de energie Rotaţie Vibraţie Electric Ordin de mărime a energiei (kcal/ mol) Domeniul de frecvenţă al spectrului emisie/ absorbţie(HZ) (microunde) (IR) (vizibil. corespunzând lungimilor de undă ale radiaţiilor lipsă. în condiţiile penetrării substanţei cercetate de către un fascicul de radiaţii electromagnetice cu spectru continuu. prezentând o serie de avantaje comparative cu alte metode de analiză: .

cu ajutorul unui spectroscop cu prismă. aşezată în focarul lentilei.• Sensibilitate mare. • Sursele de lumină şi . • Necesită cantităţi mici de substanţă cercetată. După receptorul folosit întâlnim: • Spectroscoape (receptor ochiu) • Spectrografe (receptor-placa fotografică) • Spectrometre (receptor fotoelectric. este compusă din obiectivul Ob şi ocularul Oc. Fasciculul de pentru analiza . După sistemul dispersiv aparatele spectrale se împart în: • Aparate cu prismă. fiind deviate invers proporţionalcu λ. • Luneta L foloseşte la observarea directă a rezelor luminoase. • Aparate cu reţea. Razele luminoase. cad pe faţa pe incidenţă a prismei P. • Permite determinarea simultană a aproape tuturor elementelor chimice prezente în probă şi durată scurtă de analiză. identificând liniile spectrale de emisie caracteristice acestui element. după trecerea prin lentilă. după aducerea în stare atomică prin volatizarea în flacără. Deschiderea fantei este reglabilă prin intermediul unui şurub micrometric. Partea practică Principiul metodei Sodiul este depistat într-un produs biologic lichid. termoelectric) cantitativă. Ca urmare metoda este larg folosităîn biologie şi medicină la depistarea unor elemente în cantităţi infirme în tumorile organismului. ce pătrund prin fanta iluminată de sursa . • Un alt colimator prevăzut la un capăt cu o scală gradată ce este proiectată de sursa luminoasă pa faţa de emergenţă a prismei. după care suferă un fenomen de dispersie. Descrierea spectroscopului cu trei braţe: Spectroscopul utilizat este alcătuit din următoarele părţi componente: • O prismă optică P din sticlă • Colimatorul este un tub cilindric prevăzut la un capăt cu o fantă liniară.

lumină ajunge prin intermediul lunetei la ochiul experimentatorului. Imaginea ce poate fi fi observată va cuprinde imaginea spectrului suprapusă peste imaginea scalei gradate. Acest tip de tub conţine sticlă sau silica. fanta colimatorului trebuie centrată în dreptul ferestrei dreptunghiulare practicată în învelişul acestuia. În câmpul vizual apare spectrul mercurului(figura 4) peste care se suprapune imaginea . iar vaporii sunt excitaţi de descărcările electrice produse de diferenţa de potenţial electric existent între cei doi electrozi. Figura 3. Acest tip de lămpi furnizează spectre de linii. Schema de principiu a spectroscopului cu trei braţe Timpii de lucru: 1. pentru claritatea imaginii scalei. Etalonarea aparatului • Se conectează sursa de lumină la reţea • Se conectează tubul luminescent cu vapori de mercur la reţea. • Se reglează lărgimea fantei F prin intermediul şurubului micrometric astfel încât liniile spectrale să fie vizibile şi suficient de înguste. • Se reglează ocularul aflat la extremitatea lunetei prin depărtarea sau apropiere. Electrozii pătrund în tubul închis ermetic.

6-violet 1 2 3 64 0 614 585 nm Fig. 1 2 3 4 5 6 57 9 57 7 54 6 49 2 43 6 408 nm Fig. 4-verdealbastru. • Se înlocuieşte lampa cu vapori de mercur cu un bec cu neon.scalei gradate atunci când este acţionat întrerupătorul ce comandă sursa de iluminare a scalei.galben.roşu aprins. 3. 2. Spectrul neonului: 1. • Cu ajutorul valorilor tabelate se trasează graficul.5. Spectrul caracteristic neonului este prezentat în figura 5. reprezentând pe abscisă diviziunile scalei gradate şi pe ordonată lungimile de undă corespunzătoare. spectrul mercurului: 1. • Privind prin luneta L se identifică liniile spectrului de emisie al mercurului şi corespondenţa lor cu diviziunile scalei şi se trec întrun tabel asemănător cu cel prezentat mai jos. 2-galben. procedându-se în mod analog. în sistem de coordonate XOY.4.galben .roşu oranj. 5-indigo. 3-verde.

Se trece apoi în tabel. se aprinde cu grijă.6. de unde se duce o orizontală până la intersecţia cu ordonata. se ridică verticala până la intersecţia cu graficul. cu ajutorul stativului Privind prin luneta spectroscopului etalonat şi reglat. apoi se introduce aceasta în flacără. Valoarea lungimilor de undă corespunzătoare diviziunilor scalei gradate se află cu ajutorul graficului de etalonare: se notează numărul diviziunilor pe abscisă. graficul de etalonare 2. Se conectează doar sursa la reţea • • Se depune produsul de cercetat pe plăcuţa de azbest. foarte apropiate.λ(nm ) Diviziunile scalei Fig. 1 2 3 Sursa de lumină • Etalon Mercur . reglându-se arderea astfel încât flacăra să fie incoloră. Culoarea radiaţiei violet Indigo Verde-albastru Lungimea de undă (nm) 408 436 492 Diviziunea scalei • Nr. punct în care se citeşte valoarea lungimii de undă a radiaţiei respective. Crt. în cazul prezenţei sodiului în produsul de cercetat se vor observa cele două linii spectrale caracteristice sodiului. Depistarea prezenţei sodiului în produsele biologice: • Se aşează becul de gaz la 10-15 cm de fanta F a colimatorului .

o Bec cu neon. cât şi cea de fixare a colimatorului sunt reglabile . • un colimator ce prezintă la extremitatea îbdreptată spre sursa de lumină o fantă reglabilă.4 5 6 7 8 9 • Etalon Neon Verde Galben Galben Galben Roşu-oranj Roşu-aprins 546 577 579 585 614 640 Produsul de cercetat Materiale necesare • Spectroscop cu trei braţe. • Sursa de lumină cu spectru cunoscut: o Tub luminiscient cu vapori de mercur. • Produs de cercetat în stare lichidă. • Placă de azbest ce poate fi aşezată pe stativ pentru aducerea la incandescenţă a sodiului. Descrierea spectroscopului PASCO Spectroscopul produs de firma PASCO prezintă următoarele părţi componente: • prismă optică. • Bec de gaz. Atât masa pe care este fixat telescopul. • un telescop pentru observarea razelor difractate.

6. unghiul de difracţie. măsurându-se ulterior.7. Colimator. Clemă de fixare a prismei. Telescopul poate fi rotit pentru observarea spectrelor emise. 5. • se analizează telescopul în direcţie opusă colimatorului. • se aşează spectroscopul pe o suprafaţă perfect plană. Masă de fixare a colimatorului. Lungimea de undă necunoscută a unor linii spectrale poate fi determinată prin interpolarea graficului de etalonare. Astfel. . spectroscopul PASCO 1. Telescop.. 2. foarte precis. • se verifică dacă fanta colimatorului este parţial deschisă. Masă de fixare a telscopului. 3. ca în figura 9. 4. etalonarea aparatului Fig. Timpii de lucru: 1. Utilizarea prismei ca element de difracţie are avantaje şi dezavantaje comparativ cu reţeaua de difracţie: indicele de refracţie este invers proporţional cu lungimea de undă incidentă. • se focalizează telescopul la infinit şi se reglează imaginea până ce firele reticulare se suprapun ca în figura 8. • 2. Cunoscând valorile unghiului de difracţie se pot determina lungimile de undă ale sursei de lumină emiţătoare. Prismă. linia luminoasă verticală ce trece prin fanta colimatorului să fie centrată pe intersecţia firelor reticulare ale telescopului. pentru măsurarea lungimii de undă folosind prisma trebuie realizat un grafic de corespondenţă între lungimea de undă şi unghiul de refracţie folosind o sursă de lumină cu spectru cunoscut.

Fir reticular vertical Fir reticular orizontal Fig. aliniindu-se faţă în faţă telecopul şi colimatorul unghiului citit este .10). Diferenţa ( ) corespunde unghiului de difracţie. Alinierea telescopului Măsurarea unghiului de difracţie Unghiurile de difracţie se măsoară utilizând scala vernier (fig. 9.8. Se roteşte apoi telescopul pentru observarea liniei spectrale şi se citeşte pe scala vernier unghiul α. dispunerea perpendiculară a firelor reticulare Fig. .

methemoglobina. În mod normal fierul se găseşte în stare feroasă permiţând o combinaţie labilă a hemoglobinei cu oxigenul – oxihemoglobina-responsabilă de transportul oxigenului în sânge. prin evidenţierea spectrelor de absobţie caracteristice acestora prin intermediul spectroscopului liniar. stabili ai hemoglobinei cum ar fi: hemoglobina redusă.globina. Alături de oxihemoglobină în unele stări patologice pot apare şi compuşi anormali.Fig. combinată cu o proteină. carboxihemoglobina. cianhemoglobina. Aceşti compuşi nocivi ai organismului pot fi detectaţi calitativ prin analiza spectrală de absorbţie.10 Citirea unghiului de difracţie Parte practică Principiul metodei Hemoglobina este o proteină compusă dintr-o fracţiune pigmentară care conţine fier(numită hem). Descrierea spectroscopului liniar .

.11) are drept scop mărimea puterii de rezoluţie cromatică. Sistemul de prisme Amici Pentru funcţionarea spectroscopului sunt necesare două surse de lumină: • . serveşte la realizarea spectrului de absorbţie al acesteia. etalonată direct în nm. 11.Dispozitivul respectă schema generală de alcătuire a spectroscoapelor.sursa de lumină cu spectru continuu situată lateral. în care elementul dispersiv. motiv pentru care se numeşte şi prismă cu vedere directă. denumit prisma Amici şi constituit dintr-un sistem de trei prisme (fig. Pentru o lungime de undă medie. simultan cu spectrul de examinat. şi spectrul de control şi scala gradată. • Receptorul este ochiul experimentatorului. deci citirea directă a lungimilor de undă. . spectrul său este proiectat la partea inferioară a spectrului de examinat. raza emergentă iese prin prisma Amici după direcţia razei incidente. realizând un spectru de control. care examinează prin intermediul ocularului câmpul spectroscopului în care vor fi deci vizibile.cu spectru continuu aşezată în dreptul eprubetei cu soluţia de cercetat. fig. permiţând.

2.prisma Amici.scală gradată în nanometri Timpii de lucru: 1. cu valoarea cunoscută din tabel.50 ml). . Realizarea spectrelor de absorbţie caracteristice hemoglobinei şi derivaţilor săi • Se realizează o soluţie de sânge hemolizat: câteva picături de sânge heparinat sunt introduse într-un volum mare de apă distilată (aprox.12 schema de principiu a spectroscopului liniar: . E.surse de lumină albă.Fig.eprubetă. . Reglarea spectroscopului • Se conectează spectroscopul la reţea • Se examinează lumina unei lămpi de sodiu • Se verifică corespondenţa liniei spectrale a sodiului. F. apărută în câmpul ocularului. deplasându-se eventual scala gradată până la realizarea corespondenţei. .fantă reglabilă.

Culoarea sângelui devine în acest caz mai închisă. observându-se. rezultând hemoglobina redusă. Spectru: oxihemoglobina prezintă două benzi întunecate caracteristice. una în regiunea verde şi alta în regiunea galbenă. hemoglobină redusă. a) Spectrul oxihemoglobinei: Mod de obţinere: se separă într-o eprubetă 5 ml de sânge hemolizat. methemoglobină şi se aşază în stativul special construit. cu o nuanţă albăstruie. pe rând. intervalele de lungimi de undă corespunzătoare spectrelor de absobţie ale fiecărei soluţii. b) Spectrul hemoglobinei reduse: Mod de obţinere: în eprubeta în care s-a realizat oxihemoglobina se adaugă câteva picături dintr-un reducător. c) Spectrul methemoglobinei: . Spectru: este format dintr-o singură bandă întunecoasă ce ocupă locul celor două benzi ale oxihemoglobinei.• Se realizează succesiv soluţii de oxihemoglobină.soluţie Stockes sau soluţie sulfat feros. omogenizându-se soluţia pentru o bună oxigenare cu o baghetă de sticlă. Oxihemoglobina fiind un compus foarte instabil poate ceda în anumite condiţii o parte din oxigen.

compus mai stabil decât oxihemoglobina. Spectru: prezintă două benzi de absorbţie sensibil apropiate acelor caracteristici oxihemoglobinei. culoarea sângelui devine cireşie. sulfaţi.Mod de obţinere: în eprubeta cu oxihemoglobina se adaugă ferocianura de potasiu. cu max. sângele este mai deschis la culoare. d) Spectrul carboxihemoglobinei: Mod de obţinere: se barbotează oxid de carbon într-o soluţie de hemoglobină. acetanilidă. Spectru: methemoglobina prezintă patru benzi de absorbţie. subnitrat de bismut. în această combinaţie fierul fiind trivalent. Methemoglobina apare în sângele subiecţilor intoxicaţi cu anumite medicamnete ca: nitraţi. precum şi în methemoglobinemiile congenitale. În cazul prezenţei sale. la 633 nm. Se realizează methemoglobina. . compuşi nitrobenzenici. dintre care o bandă caracteristică situată în roşu între 642-624 nm. Diferenţa dintre oxihemoglobină şi carboxihemoglobină se evidenţiază cu reactivul Stockes: oxihemoglobina se reduce în prezenţa acestuia la hemoglobină redusă cu banda sa caracteristică. Acest lucru se va realiza practic prin barbotarea gazului metan pentru câteva minute în soluţie de sânge. îm timp ce în cazul carboxihemoglobinei cu apare nici o modificare de spectru.

Se vor compara valorile obţinute experimental cu cele menţionate în literatura de specialitate. prezentate în tabelul alăturat.539 Valori practice Culoarea radiaţiei Interval de lungimi de undă . Substanţa Valori teoretice Culoarea radiaţiei oxihemoglobina Hemoglobină redusă methemoglobina Carboxihemoglobina galben verde verde Roşu Galben Verde Interval de lungimi de undă 587-568 552-527 565-545 642-624 Max.Rezultate experimentale Valorile lungimilor de undă corespunzătoare radiaţiilor absorbite observate experimental se vor trece într-un tabel de rezultate. 570 Max.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful