Editori Mihaela Alua Simion Simon

Metode experimentale avansate pentru studiul i analiza bio-nano-sistemelor

Editori Mihaela Alua Simion Simon

METODE EXPERIMENTALE AVANSATE

PENTRU STUDIUL I ANALIZA BIO-NANO-SISTEMELOR

Casa Crii de tiin Cluj-Napoca, 2012 3

Coperta: Patricia Puca

Editur acreditat CNCSIS (24)

Universitatea Babe-Bolyai, 2012

Material editat n cadrul proiectului Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdisciplinar, ID 36154

Descrierea CIP a Bibliotecii Naionale a Romniei Metode experimentale avansate pentru studiul i analiza bio-nanosistemelor / ed.: Mihaela Alua, Simion Simon. - Cluj-Napoca : Casa Crii de tiin, 2012 Bibliogr. ISBN 978-606-17-0115-5 I. Alua, Mihaela (ed.) II. Simon, Simion (ed.) 53

Prefa
n calitate de director al proiectului cu titlul Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdisciplinar, cod contract POSDRU/21/1.5/G/36154, doresc s mulumesc tuturor colaboratorilor care au contribuit prin expertiza i profesionalismul lor la realizarea acestui volum i, implicit, la dezvoltarea programului doctoral. Mulumirile mele se ndreapt de asemenea ctre echipa de management a proiectului, n urmtoarea componen: Prof. dr. Simion Simon, coordonator tiinific program doctoral Prof. dr. Octavian Popescu, coordonator tiinific relaii internaionale Cristina Dominic, asistent manager Andra Ghira, responsabil logistic i asistent manager Jr. Alexandru Braoveanu, consilier juridic Ec. Gelu Silviu Moldovan, responsabil financiar Ing. Carmen Ciplea, expert IT Ec. Istvn Psk, expert contabil Am convingerea c informaia cuprins n aceast lucrare va sprijini generaiile prezente i viitoare de conductori de doctorat n activitatea lor de cercetare. De asemenea, va facilita orientarea doctoranzilor n lumea minunat a tiinei contribuind la determinarea acestora de a face din meseria de cercettor o vocaie. Proiectul Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdisciplinar, cod contract POSDRU/21/1.5/G/36154, a fost cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013. C.S.III. dr. Mihaela ALUA 5

Cuvnt nainte
Institutul de Cercetri Interdisciplinare a fost nfiinat prin Hotrrea Senatului Universitii Babe-Bolyai din data de 30.05.2001, ca unitate de cercetare i transfer tehnologic, avnd ca obiectiv de activitate att realizarea de studii i cercetri interdisciplinare n domeniile biologie molecular, biomateriale i sisteme biologice, materiale avansate i mediu ambiant, sisteme nanostructurate natural i artificial, ct i transferul rezultatelor obinute ctre beneficiari locali, naionali sau internaionali. Institutul beneficiaz de o cldire proprie, cu o suprafa desfurat de peste 3000 mp, modernizat la nivelul standardelor internaionale din punct de vedere al dotrilor conexe i avnd laboratoare de cercetare structurate n acord cu nevoile cercetrilor interdisciplinare menionate. ntre timp institutul, prin efortul conjugat al celor care au decis s-i dedice energia i cunotinele cercetrilor la interfaa Bio-NanoSistemelor, a devenit Institutul de Cercetri Interdisciplinare n Bio-Nanotiine (ICI-BNS). n cadrul acestuia i desfoar activitatea n prezent 12 profesori universitari (dintre care 10 conductori de doctorat), 25 alte cadre didactice i cercettori i peste 40 de doctoranzi cu frecven. Acetia aparin domeniilor Fizic, Chimie, Biologie, Informatic, tiina mediului i Psihologie. Proiectul Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdisciplinar a oferit posibilitatea de a mobiliza un set de cercettori valoroi, cu experien deosebit n tehnicile experimentale frecvent utilizate n cercetrile interdisciplinare din domeniul Bio-Nano-tiinelor. Marea majoritate a experilor a beneficiat de stagii doctorale sau postdoctorale n prestigioase laboratoare din lume unde au dobndit o bogat experien n utilizarea echipamentelor de nalt performan de care dispune Institutul nostru. Studenii doctoranzi, dar i specialiti din domenii ca: fizic, chimie, biologie, geologie sau tiina mediului interesai n studii experimentale interdisciplinare vor gsi n materialele incluse n prezentul volum date teoretice dar mai ales practice, despre tehnici experimentale avansate prezentate ntr-o form accesibil, cu exemple semnificative, menite a facilita nelegerea fenomenelor studiate i a contribui la creterea aportului fiecrui cercettor la dezvoltarea domeniului n care i va desfura activitatea tiinific. Prof. Dr. Simion SIMON Director ICI-BNS

CUPRINS
I. ANALIZE GENETICE ................................................................................................. 13 Clonarea i exprimarea genelor o metod excepional pentru obinerea de proteine.......................................................................................................................... 13 Asist. univ. dr. Iulia Lupan Aplicaii ale tehnicilor de biologie molecular n studii interdisciplinare ........... 36 Asist. univ. dr. Iulia Lupan II. CULTURI CELULARE ............................................................................................... 64 Culturi celulare ........................................................................................................... 64 Lect. dr. Mircea Teodor Chiriac Culturi celulare partea a II-a .................................................................................... 82 Lect. dr. Mircea Teodor Chiriac III. MICROSCOPUL CONFOCAL RAMAN............................................................ 101 Microspectroscopia Raman....................................................................................... 101 Conf. dr. Monica Maria Baia Microspectroscopia Raman partea a II-a................................................................ 121 Conf. dr. Monica Maria Baia IV. SPECTROMETRUL IR........................................................................................... 134 Spectroscopia de absorbie n infrarou .................................................................. 134 Lect. dr. Nicolae Leopold Tendine moderne n spectroscopia de absorbie IR ............................................. 147 Lect. dr. Nicolae Leopold V. SPECTROFLUORIMETRUL .................................................................................. 160 Spectrofluorimetria .................................................................................................... 160 Conf. dr. Dana Maniu Spectrofluorimetria - aplicaii ................................................................................... 172 Conf. dr. Dana Maniu VI. SPECTROMETRUL DE REZONAN MAGNETIC NUCLEAR ......... 191 Spectroscopie de rezonan magnetic nuclear pe solide (RMN-S) .................. 191 C.S.I. dr. Claudiu Filip, C.S.III. dr. Mihaela Alua Spectroscopie de rezonan magnetic nuclear pe solide (RMN-S) Implementarea de metode avansate RMN-S pentru aplicaii pe sisteme moleculare organice n faza solid .......................................................................................................... 216 C.S.I. dr. Claudiu FILIP, C.S.III. dr. Mihaela Alua

Rezonana magnetic nuclear pe sisteme lichide ................................................ 246 Lect. dr. Mihai Vasilescu VII. MSURTORI TERMICE .................................................................................. 266 Analiz termic diferenial. Analiz calorimetric diferenial......................... 266 Conf. dr. Raluca Ciceo-Luccel Ghid de utilizare a aparatelor de analiza termic diferenial si analiz calorimetric diferenial. Ghid de interpretare a msurtorilor DTA/TG i DSC........................................................................................................................... 275 Conf. dr. Raluca Ciceo-Luccel VIII. DIFRACTOMETRUL DE RAZE X ................................................................... 286 Difracie de raze X pe pulberi ................................................................................... 286 C.S.I. dr. Gheorghe Borodi Determinarea structurii cristaline prin difracie de raze X................................... 305 C.S.I. dr. Gheorghe Borodi IX. MICROSCOPUL ELECTRONIC DE BALEAJ I DE TRANSMISIE ........... 327 Microscopia electronic ............................................................................................. 327 ef lucrri dr. Lucian Barbu-Tudoran Microscopia electronic - partea a II-a .................................................................... 347 ef lucrri dr. Lucian Barbu-Tudoran X. MICROSCOPUL DE FOR ATOMIC ............................................................ 365 Microscopia de for atomic ................................................................................... 365 Conf. dr. Ioan Burda Microscopia de for atomic partea a II-a ........................................................... 378 Conf. dr. Ioan Burda XI. SPECTROMETRUL DE FOTOELECTRONI DE RAZE X I ULTRAVIOLETE .......................................................................................................... 394 Spectroscopia fotoelectronic ................................................................................... 394 C.S.III. dr. Maria Teodora Radu Studiul prin spectroscopie fotoelectronic de raze X a suprafeelor diferitelor tipuri de materiale ................................................................................... 424 C.S.III. dr. Teodora Maria Radu, C.S.dr. Emilia Sabina Varga XII. SPECTROMETRUL DE REZONAN ELECTRONIC DE SPIN .......... 437 Spectroscopia de rezonan electronic de spin ................................................... 437 C.S. dr. Milica Todea Spectroscopia de rezonan electronic de spin partea a II- a ............................ 452 C.S. dr. Milica Todea

10

XIII. METODE ELECTROCHIMICE ......................................................................... 467 Elaborarea, testarea i verificarea protocoalelor de practic experimental pentru echipamente de investigare prin metode electrochimice ........................ 467 Conf. dr. ing. Graziella Liana Turdean Electrochimia unei substane cu potenial biologic activ. Studiu de caz ............ 490 Conf. dr. ing. Graziella Liana Turdean XIV. SISTEME DE ANALIZ A SUPRAFEEI SPECIFICE I A DIMENSIUNII PARTICULELOR .......................................................................... 509 Sisteme de analiz a suprafeei specifice i a dimensiunii particulelor ............. 509 Lect. dr. ing. Rka Barabs

11

12

I. ANALIZE GENETICE Clonarea i exprimarea genelor o metod excepional pentru obinerea de proteine
Asist. univ. dr. Iulia Lupan

Cuprins
1. Prezentarea principiilor metodei de clonare i exprimare a genelor n sistem procariot ................................................................................................................. 13 2. Utilizarea clonrii de gene i exprimrii de proteine recombinate n studii interdisciplinare ..................................................................................................... 31 3. Infrastructura existent n cadrul Centrului de Biologie Molecular ................... 33 4. Bibliografie ............................................................................................................. 34

1. Prezentarea principiilor metodei de clonare i exprimare a genelor n sistem procariot

ADN n sine are doar 2 funcii importante i anume pstrarea informaiei genetice i furnizarea acesteia pentru sinteza de proteine. Pstrarea include transmiterea materialului genetic nemodificat de la o generaie la alta. Acest fapt este realizat prin replicarea ADN i mprirea egal a celor dou copii n timpul diviziunii celulare. A doua funcie este legat de descifrarea informaiei pentru sinteza de proteine. Mesagerul informaiei ntre ADN i proteine este ARN, care este sintetizat n procesul de transcriere a ADN de ctre o enzim numit ARN polimeraz. ARNm rezultat servete ca matri n procesul de traducere a ADN (sinteza proteinelor) care are loc n ribozomi. Practic ARN este cruul informaiei din nucleu n citoplasm unde are loc sinteza proteinelor. Dogma central a biologiei presupune transmiterea unidirecional a informaiei de la ADN la proteine prin intermediul ARN (Figura 1). Informaia genetic nu poate fi transmis invers, de la proteine la ADN. Informaia genetic poate fi transmis de la ARN la ADN n cazul retrovirusurilor la care materialul genetic este ARN. Nu exist cazuri de transmitere a informaiei de la ADN direct la proteine. 13

Clonarea genelor const n izolarea unei gene dintr-un genom i introducerea ei n alte celule gazd pentru multiplicare i n unele cazuri pentru exprimare. Prin multiplicarea celulelor cu genele clonate se pot obine milioane de copii ale unei singure gene. Sumar, procesul clonrii const din urmtoarele etape: amplificarea genei de interes introducerea genei de interes ntr-un vector de clonare introducerea moleculelor recombinate n celule gazd selecia celulelor transformate (purttoare ale moleculei recombinate) Figura 1. Dogma central a biologiei. verificarea moleculelor recombinate Amplificarea genei de interes. O gen este considerat orice fragment de ADN care se transcrie ntr-o molecul de ARN. Moleculele de ARN rezultate n urma transcrierii pot fi mprite n 2 categorii: ARN funcional ARN informaional ARN funcional este ARN care nu se traduce, ndeplinete anumite funcii n celul (n cea mai mare parte particip la procesul de traducere) i ocup cea mai mare parte din ARN total din celul: ARN ribosomal (ARNr) i ARN de transport (ARNt). ARN informaional este ARN mesager (ARNm) care codific un polipeptid i servete ca matri n procesul de traducere (sintez a proteinelor). De cele mai multe ori genele de interes care sunt scopul clonrii codific un polipeptid. n alte cazuri scopul clonrii nu este obligatoriu o gen, ci un fragment de ADN care nu poate fi separat dintr-un amestec heterogen de molecule apropiate ca mrime. Din aceast cauz n continuare se va utiliza doar termenul fragment ADN de interes pentru a evita confuziile. Deoarece fragmentul ADN de interes sau int se afl ntr-un genom este necesar extragerea acestuia. Exist 2 modaliti de a obine fragmentul dorit, fie prin tierea acestuia din genom, fie prin copierea acestuia. Tierea fragmentului din genom este mai dificil deoarece necesit prezena unor situsuri (secvene specifice) la capetele fragmentului, care necesit apoi o izolare din amestecul de fragmente generate, iar numrul moleculelor deci i cantitatea de ADN este mic. A doua opiune de copiere a fragmentului din genom este cea mai des 14

utilizat. n acest scop se utilizeaz tehnica PCR (Polymerase Chain Reaction). Aceast tehnic poate fi considerat un adevrat copiator de gene. Tehnica este pe larg utilizat, este rapid i sensibil deoarece necesit cantiti foarte mici de ADN matri. O condiie obligatorie pentru o amplificare reuit este cunoaterea secvenei int, n special la capetele acesteia. Dac secvena este necunoscut, atunci se vor analiza cel puin secvene ADN omoloage de la alte specii sau secvena de aminoacizi a proteinei dac este vorba despre o gen. Principiul tehnicii PCR este o imitaie a procesului de replicare a ADN care are loc n celule. Dac n celule pentru replicare se folosete o ntreag serie de proteine, aici rolul unora dintre ele este preluat de unii factori fizici, cum ar fi spre exemplu denaturarea ADN. Denaturarea ADN presupune separarea celor dou catene. Procesul este reversibil, catenele complementare formnd molecula dublu catenar dup nlturarea agentului de denaturare. Reacia de amplificare este una ciclic, fiecare ciclu fiind alctuit din 3 etape: denaturarea ADN alinierea amorselor sinteza catenei complementare de ctre ADN polimeraz Dup fiecare ciclu practic cantitatea de ADN se dubleaz, iar dup 35-40 de cicluri se obin milioane de copii ale fragmentului int pornind de la o singur copie. Denaturarea ADN este necesar pentru separarea celor 2 catene. Ca agent denaturant se utilizeaz temperaturi nalte de 94-98C. Denaturarea din primul ciclu dureaz cteva minute (2-6) deoarece pentru denaturarea moleculelor de ADN genomic, care sunt foarte mari, e nevoie de mai mult timp. Etapele de denaturare dup primul ciclu sunt mai scurte, doar de 30-45 sec. Amorsele (termenul englezesc este primer), denumite i oligonucleotide, sunt secvene scurte de ADN monocatenar. Aceste amorse sunt complementare cu extremitile secvenei int i formeaz cu acestea poriuni scurte dublu catenare. Pentru alinierea amorselor la secvenele complementare, temperatura este cobort la 40-60C timp de cteva zeci de secunde. Aceast etap este numit de aliniere sau hibridizare. Temperatura de aliniere se stabilete la cteva grade (2-5C) mai puin dect temperatura de topire (Tm) a amorsei. Temperatura de topire se calculeaz n dependen de lungimea amorsei i de compoziia ei. Exist mai multe formule de calcul, cea mai simpl formul de calcul pentru o amors de pn n 25 de nucleotide este: Tm = 4 (G + C) + 2(A + T) 15

Unde G, C, A i T sunt numrul de nucleotide ce conin aceste baze azotate. Numrul de G i C se nmulete dublu fa de A i T deoarece ntre acestea exist 3 legturi de hidrogen, n consecin moleculele bogate n G i C au o temperatur mai mare de topire. Exist cteva reguli pentru construirea amorselor i anume: numrul de nucleotide este de 15-35 temperatura de topire a amorselor trebuie s fie ntre 40 i 70C coninutul de G i C nu trebuie s depeasc 50-55% la captul 3' al amorsei este de dorit s fie o G sau C, deoarece ofer o stabilitate mai mare amorsele nu trebuie s prezinte complementaritate intern, n caz contrar amorsa poate forma secvene interne dublu catenare care au aspect de stem sau bucl cele dou amorse sens (forward) i antisens (reverse) nu trebuie sa fie complementare ntre ele, altfel se vor forma poriuni dublu catenare sau dimeri de amorse, iar ca rezultat se vor amplifica poriunile scurte rmase monocatenare. De la aceste poriuni dublu catenare formate ntre catena matri i amorsa ADN, polimeraza poate iniia sinteza catenei complementare. ADN polimeraza catalizeaz sinteza catenei complementare n direcia 5'3' (Figura 2). Amorsele servesc n primul rnd la delimitarea fragmentului amplificat, dar i ca punct start pentru ADN polimeraz, care nu poate porni sinteza de la zero i are nevoie de un capt liber 3'. Iniial la originea tehnicii PCR se folosea ADN polimeraza izolat de la bacteria Escherichia coli, care are activitatea optim de sintez la 37C. Cel mai mare dezavantaj al utilizrii acestei enzime era inactivarea termic n timpul denaturrii ADN. n acest fel tuburile de reacie trebuiau schimbate de la o temperatur la alta i dup fiecare ciclu era nevoie de un surplus de ADN polimeraz. Astfel amplificarea fragmentelor de ADN era una foarte costisitoare. Salvarea acestei metode a venit dup descoperirea i descrierea ADN polimerazelor de la bacteriile termofile. Enzima revoluionar n acest sens, pe larg utilizat i astzi este Taq polimeraza. Aceast enzim este o ADN polimeraz, izolat de la o bacterie termofil Thermococcus aquaticus (de unde i denumirea ei), care sintetizeaz polimerizarea nucleotidelor trifosfat ntr-un lan polinucleotidic n direcia 53. Taq polimeraza are activitatea optim la 72C i nu se denatureaz la temperaturi ridicate de peste 90C foarte repede, astfel dup cteva ore la 95C pierderea de activitate este nesemnificativ. Viteza de polimerizare a Taq polimerazei este de 16

aproximativ 1000 de nucleotide per minut. Durata elongrii necesare sintezei va fi n dependen de mrimea fragmentului int. Pentru un fragment de 500 de nucleotide vor fi suficiente 30 sec, iar pentru un fragment de 2000 de nucleotide 2minute.
Etapa iniial de denaturare

5'

3'

ADN genomic cu fragmentul int

3' 5'

5'

3' 3 5'

Alinierea amorselor la capetele fragmentului int

3'

5'

3 '

5'

Ciclu I

5'

3'

Etapa de elongare sau sintez a catenei complementare de ctre ADN polimeraz

3'

5'

5'

3'

Sfritul primului ciclu

3' 5'

5' 3'

3' 5'

5' 3'

3' 5'

5'

3'

5'

3'

3'

3'

5'

Ciclu II

5'

3'

5'

3'

3'

3'

5'

17

5' 3' 5'

3' 3'

5'

3' 5'

5' 3'

3'

5' 3'

3' Ciclu III

5' 3'

3' 5' 3'

5'

3' 5'

5' 3'

3' 5'

5' 3'

3'

Taq polimeraza

amors amors ce indic direcia de sintez

Figura 2. Reprezentarea schematic a primelor cicluri de PCR.

Un tip special de PCR este RT-PCR sau PCR de transcriere invers. Acest tip este asemntor PCR obinuit, doar c folosete o matri de ARN pentru a sintetiza ADN. Enzima responsabil de aceast sintez este transcriptaza invers, care este de fapt o ADN polimeraz ARN-dependent. Taq polimeraza este o ADN polimeraz deoarece sintetizeaz ADN i este ADN dependent deoarece utilizeaz o matri ADN pentru sintez. Transcriptaza invers a fost izolat de la virusurile care au material genetic ARN i n momentul intrrii n celul necesit sinteza unei copii a materialului su genetic. RT-PCR se utilizeaz pentru obinerea copiilor de gene eucariote care nu conin introni i analiza exprimrii de gene. n ambele cazuri se pornete de la ARNm (ARN informaional care codific proteine). Enzime de restricie Enzimele de restricie sau restrictazele sunt enzime care taie molecule monocatenare sau dublu catenare de ADN la anumite situsuri specifice. Ele pot fi numite cu alte cuvinte adevrate foarfece de ADN. Restrictazele recunosc doar anumite secvene scurte numite situsuri specifice de recunoatere, se fixeaz de acestea i taie legturile fosfoesterice ntre nucleotide. Aceste enzime au fost descoperite la bacterii i se presupune c funcia lor este de aprare contra bacteriofagilor (virusuri ale bacteriilor). n mo18

mentul intrrii ADN fagic n bacterii, enzimele de restricie diger aceste molecule. ADN bacterian propriu este protejat contra enzimelor de restricie prin metilarea unor baze azotate, enzimele de restricie, n general, nu taie ADN metilat. Pn acum au fost descrise 4000 de enzime de restricie de la cteva sute de specii bacteriene. Toate aceste enzime se mpart n 3 clase: I, II i III. Aceast clasificare este n dependen de cofactorul utilizat i de secvena de recunoatere. Enzimele cele mai utilizate n tehnicile moleculare sunt cele de tip II, care au secvena de recunoatere un palindrom i utilizeaz ioni de Mg2+ ca i cofactor. Secvena palindrom este alctuit din 4-6 nucleotide i citit pe ambele catene n direcia 53 este identic. Nomenclatura enzimelor de restricie pornete de la denumirea bacteriei de la care a fost izolat. Astfel, HindIII este izolat de Heamophilus influenzae tulpina Rd, iar EcoRI de la Escherichia coli tulpina RY13.
A EcoRI B SmaI

5 GAATTC CTTAAG 3

3 5

5 GGGCCC CCCGGG 3

3 5

5 G CTTAA 3

AATTC G

3 5

5 GGG CCC 3

CCC GGG

3 5

Figura 3. Secvenele de recunoatere pentru enzimele EcoRI (A) i SmaI (B) i capetele libere dup tiere. Locurile de tiere sunt indicate cu sgei.

Capetele libere dup tierea de ctre enzimele de restricie pot fi de 2 feluri: coezive sau drepte. Enzima BamHI i EcoRI genereaz capete coezive dup tiere, iar enzimele SmaI i EcoRV genereaz capete drepte sau netede (Figura 3). Cu ajutorul unor programe speciale se pot alctui hri de restricie care reprezint situsurile de recunoatere pentru diferite restrictaze ntr-o secven (Figura 4).

19

B am I (533) H H inf (7 5) I E co RV (5 8) H inf (32) I H inf (461) I E co (605) RI H inf (616) I E co (633) RI B am I (7 7 3) H NcoI (7 7 7 ) H inf (942 I

Y LR3 7 7 C
1047 bp

Figura 4. Harta de restricie a unei gene de la drojdia Saccharomyces cerevisiae. Cu cifre n paranteze sunt indicate situsurile enzimelor de restricie.

Ligarea fragmentelor de ADN Dei moleculele de ADN pot fi asemnate cu nite fire, acestea nu pot fi legate prin creare de noduri sau nu exist nici un lipici special. Pentru legarea fragmentelor de ADN se utilizeaz o enzim numit ADN ligaz. Aceast enzim reface legturile fosfoesterice ntre gruparea hidroxil a unui nucleotid (captul 3) i gruparea fosfat de la nucleotidul altui fragment (captul 5) (Figura 5). Funcia ligazei n celule vii este legarea fragmentelor n timpul replicrii, recombinrii i dup repararea ADN. Cea mai des utilizat este ADN ligaza T4 izolat de la bacteriofagul T4. ADN ligaza T4 utilizeaz ATP ca i cofactor.

Figura 5. Reprezentarea schematic de legare de ctre ADN ligaz a dou fragmente ADN care au capete netede.

Vectori de clonare Prin vectori de clonare subnelegem molecule de ADN transportatoare ale fragmentului de ADN strin n celulele gazd. Vectorii sunt de mai multe tipuri: cosmide, bacteriofagi, plasmide i vectori artificiali. Aceti vectori sunt utilizai n dependen de scopul clonrii. Cele mai pe larg utilizate sunt plasmidele. Un plasmid este o molecul dublu catenar de ADN, care este circular, nchis i capabil de replicare autonom n celule 20

gazd. Plasmidele comerciale utilizate pe larg sunt plasmide naturale izolate de la bacterii care au fost modificate. Plasmidele au nite secvene specifice necesare replicrii, clonrii, seleciei i uneori exprimrii genelor. Pentru replicarea autonom n celule gazd plasmidele conin secvena ori, care este originea de replicare. Nicio molecul de ADN nu poate fi replicat fr o origine de replicare. Originea de replicare este o regiune a moleculei de ADN de unde poate ncepe replicarea i care este recunoscut de anumite proteine care iniiaz replicarea. O regiune foarte important ntr-un vector de clonare este Situsul Multiplu de Clonare (termenul englezesc este Multiple Cloning Site). n aceast regiune se introduce fragmentul int de ADN cu ajutorul enzimelor de restricie i a ligazei. Att vectorul ct i fragmentul ADN sunt tiate cu aceleai enzime de restricie i legate mpreun cu ajutorul ligazei. SMC conine secvenele de recunoatere pentru mai multe enzime de restricie care nu se conin n alt regiune a vectorului. O alt component foarte important a plasmidelor sunt markerii de selecie care sunt de obicei nite gene, a cror produs (enzim) fac posibil selectarea celulelor cu plasmid de cele fr plasmid care sunt mai numeroase. Cei mai frecveni markeri utilizai sunt genele ce confer rezisten la antibiotice, mai corect spus produsul genei confer rezisten. Spre exemplu, -lactamaza confer rezisten la ampicilin. Plasmidele care conin gena pentru aceast enzim vor proteja celulele bacteriene de efectul antibioticului. Astfel dac un amestec de celule transformate cu plasmide care vor conine att celule cu, ct i fr plasmid, se nsmneaz pe un mediu cu ampicilin, vor supravieui doar celulele care conin plasmidul. Un alt fel de selecie este selecia celulelor transformate cu plasmid recombinat adic cu insert de cele cu plasmid fr insert. Insert se refer la fragmentul de ADN int clonat. n acest scop situsul multiplu de clonare se afl ntr-o gen ce codific o enzim. Dac n SMC nu a fost introdus niciun fragment ADN atunci gena este intact, produsul ei este o protein activ. Dac n SMC a fost introdus un fragment ADN atunci gena este modificat i produsul ei este inactiv. Spre exemplu dac SMC se afl n gena lacZ care codific subunitatea a enzimei -galactozidaz, atunci produsul acestei gene mpreun cu subunitile codificate din genomul celulei gazd bacteriene vor forma o enzim activ capabil s metabolizeze un derivat al galactozei numit X-Gal (bromo-cloro-indolil galactopiranozid) care este adugat n mediu i este incolor. Dac -galactozidaza este activ atunci va metaboliza acest substrat, iar produsul format n urma reaciei va avea o culoare albastr. n acest fel coloniile re21

zultate dup transformare care conin vectorul fr insert vor fi albastre, iar cele ce conin vector recombinat vor fi albe, deoarece ele nu produc enzim activ capabil de metabolizarea substratului X-Gal. Un alt tip de selecie utilizeaz o enzim toxic pentru celulele bacteriene. Astfel, celulele cu plasmid fr insert au gena funcional care va provoca moartea celulelor. Celulele bacteriene care au plasmidul cu insert vor avea gena nefuncional i vor supraveui. Vectorii de clonare au de obicei mrime mic, doar de cteva mii de pb i n care pot fi inserate fragmente de ADN de la 100 pb pn la 2000-3000 pb (Figura 6: A, B). O caracteristic important pentru plasmide este numrul de copii per celul. Vectorii de clonare mai mici au de obicei un numr mai mare de copii per celul. Acest fapt permite obinerea unei cantiti mari de ADN plasmidic dintr-o cultur mic de bacterii (din 3-5 ml de cultur se pot obine cteva g de ADN plasmidic). Pentru vectorii mai mari numrul copiilor per celul este mai mic, n consecin i pentru a obine o cantitate mai mare de ADN este necesar o cantitate mai mare de cultur. Vectorii de exprimare sunt de asemenea vectori de clonare dar care ofer n plus posibilitatea exprimrii genei clonate (Figura 6 C). Plasmidele de exprimare trebuie s mai conin cteva elemente n plus fa de vectorii de clonare. Aceste elemente sunt cele care se gsesc i n genom i fac parte dintr-o gen: promotorul, situsul de legare al ribosomilor, codonii START i STOP care delimiteaz cadrul deschis de citire (termenul englezesc este Open Reading Frame). Promotorul este o secven care se afl n amonte de gen i este recunoscut de factorii de transcriere, care se fixeaz la nivelul promotorului i iniiaz transcrierea. Numai n prezena promotorului exprimarea va fi foarte sczut, de aceea situsul de legare al ribozomilor (termenul englezesc este Ribosome Binding Site) este o secven care se transcrie dar care nu se traduce i care este recunoscut de ribosomi. Ribosomii se leag la acest situs i se deplaseaz de-a lungul ARNm pn ntlnesc primul codon START de unde ncepe traducerea. Codonul START la procariote este n cele mai dese cazuri ATG. Acest codon este de obicei inclus n situsul multiplu de clonare, n caz contrar acesta se poate introduce n fragmentul int cu ajutorul amorselor. Codonul STOP este inclus i el de obicei n situsul de clonare. n unele cazuri acesta este prezent dup regiuni care codific anumite aa-zise etichete. Etichetele faciliteaz purificarea proteinelor recombinate prin cromatografie de afinitate. Cele mai des utilizate sunt eticheta de 6 histidine (His-tag), Glutation S-transferaza (GST) i proteina de legare a maltozei (Maltose Binding Protein, MBP este termenul n englez). Aceste etichete vor fi parte integrant a proteinelor la 22

captul ei C-terminal sau N-terminal dac secvena ce codific eticheta este prezent dup sau nainte de situsul de clonare respectiv. Etichetele vor conferi proteinelor recombinate afinitate fa de anumite rini cromatografice.
A
Eco RI (4360) Sca I (3847) PvuI (3737) ClaI (25) HindIII (30) Eco RV (188) BamHI (376) SphI (567) SalI (652)

LacZ
EcoRI Sac I (6

AP r
Pst I (3612)

bla(AmR)

Kpn I (6

TC r

pTZ57R
2886 bp

Xba I (6 Bam HI

pBR322
4361 bp

MCS
Apa I (6 SalI (6 Pst I (6 Hin dI

ORI
Bst Z17I (2247)

T7 p
T7 terminator

C
f1 origin

His tag
XhoI (159) Not I (167) HindIII (174) SalI (180) Sac I (191)

Ori

M CS
Eco RI (193)

bla (Ap)

BamHI (199 NdeI (239

pET-21a
5443 bp

T7 prom
BglII (34

lacI

ColE1 pBR322 origin

Figura 6. Hrile unor vectori plasmidici. A harta plasmidului pBR322 include 2 gene de rezisten la antibiotice: Apr confer rezisten la ampicilin, iar TCr rezisten la tetraciclin, situsul multiplu de clonare l poate constitui oricare dintre cele dou gene de rezisten, n dependen de gena selectat pentru inserare, rezistena la antibioticul respectiv se va pierde . B harta plasmidului de clonare pTZ57R comercializat de firma Fermentas. Plasmidul are rezisten la ampicilin, iar situsul multiplu de clonare se afl n gena lacZ' care ofer selecia alb-albastr a clonelor pozitive. C harta vector de exprimare pET21a de la Novagen care include gena bla care confer rezisten la ampicilin, situsul multiplu de clonare care conine un codon START i un codon STOP dup eticheta de 6 histidine, promotorul de la fagul T7 care este inductibil cu IPTG.

23

Introducerea moleculelor recombinate n celule gazd Introducerea plasmidelor recombinate n celule gazd se numete transformare dac sunt utilizate celule bacteriene sau transfecie dac sunt celule eucariote. n continuare se va detalia doar transformarea celulelor procariote, acestea avnd cea mai mare aplicabilitate i simplitate n scopul obinerii clonelor i proteinelor recombinate. Exist dou tipuri de transformare a celulelor bacteriene pe larg utilizate n laboratoarele de biologie molecular: transformarea chimic transformare sub influena cmpului electric. Ambele tipuri de transformare necesit inducerea unei competene de transformare, deoarece E. coli nu are proprieti de transformare natural. Aceast competen n cazul transformrii chimice este indus cu CaCl2. n acest scop se realizeaz o cultur de E. coli i prin tratarea celulelor cu clorur de calciu la rece se poate induce transformarea celulelor bacteriene (Figura 7 A). Celulele sunt ocate termic foarte scurt, timp de maxim 2 minute, la 42C. Acest timp este suficient pentru intrarea moleculelor recombinate n celulele bacteriene. Transformarea n cmp electric este mai eficient dect transformarea chimic. Prepararea celulelor competente presupune doar creterea lor pn n faza logaritmic (D=600nm = 0,6-0,8) i nlturarea prin splri repetate a mediului de cultur. Aceste splri repetate vor asigura eliminarea ionilor care pot afecta transformarea. Pentru acest tip de transformare este necesar un aparat numit electroporator, care va crea cmpul electric ntre doi electrozi. Amestecul de celule competente i plasmide recombinate vor fi depuse ntr-o cuv special de electroporare, ai crei perei laterali sunt electrozii. Transformarea are loc la o tensiune de 1800 sau 2500 V timp de cteva msec (Figura 7 B). Dup transformare celulele ocate sunt preluate n mediu de cultur i apoi nsmnate pe mediu selectiv cu antibiotice. Doar unele celule bacteriene sunt transformate, cea mai mare parte dintre ele fiind netransformate, adic fr plasmid. Eficiena de transformare a celulelor se poate msura efectund o transformare cu o cantitate de 1 ng de ADN plasmidic i apoi numrnd coloniile rezultate. Numrul de colonii va corespunde numrului de celulele transformate deoarece fiecare colonie ia natere dintr-o singur celul. Numrul obinut de la transformarea a 1 ng de ADN plasmidic se raporteaz la 1 g de ADN (nmulind valoarea la 1000). O eficien bun de transformare este 106, ceea ce nseamn ca la transformarea unui g de plasmid s-ar obine 1 milion de colonii, o valoare foarte mare innd cont de faptul c avem nevoie de o singur colonie 24

sau de cteva cnd avem un amestec eterogen de molecule int. Desigur n amestecul de ligare numrul de molecule recombinate este mic i din aceast cauz este recomandat o eficien ct mai mare a celulelor competente. Fiecare dintre cele dou metode de transformare prezint avantaje i dezavantaje legate de eficiena de transformare i de costuri. Transformarea chimic este mai puin eficient dect electroporarea, dar mai ieftin deoarece nu necesit aparatur i cuve costisitoare.
A
CaCl2 2 min 42C

Celule de E.coli

Celule transformate de E.coli

nsmnarea celulelor transformate pe mediu selectiv

Splarea celulelor bacteriene

1800 V 5 msec

Figura 7. Transformarea celulelor bacteriene cu ADN plasmidic. A transformarea chimic cu CaCl2; B electroporarea celulelor bacteriene.

Electroforeza acizilor nucleici Electroforeza este procesul de migrare a moleculelor cu sarcin ntr-un cmp electric. Migrarea moleculelor se realizeaz printr-o matrice specific. Metoda este aplicat pentru analiza proteinelor i a acizilor nucleici. Pentru proteine se aplic cel mai des electroforeza proteinelor n condiii denaturante n gel de poliacrilamid (termenul englezesc SDS-PAGE). Poliacrilamida se poate utiliza ca matrice i pentru electroforeza acizilor nucleici care ofer o rezoluie foarte bun a separrii fragmentelor de ADN, mai ales n cazul fragmentelor mici. Aceast matrice este folosit mai rar n laboratoarele de analize genetice, deoarece este mai laborioas. Primul loc n utilizarea vizualizrii acizilor nucleici aparine electroforezei n gel de agaroz. Dei metoda ofer o rezoluie inferioar celei din poliacrilamid, ea este utilizat cu succes deoarece este mai simpl. Moleculele de acizi nucleici sunt ncrcate negativ datorit gruprilor fosfat. Aceast sarcin face posibil migrarea moleculelor de ADN i ARN 25

ntr-un cmp electric de la catod la anod. Amestecul de molecule nu se va deplasa n cmp electric cu aceeai vitez. Moleculele mici se vor deplasa mai repede prin porii matricei, iar cele mai mari vor avansa mai lent. Astfel separarea moleculelor va fi n dependen de masa lor molecular. Pentru estimarea aproximativ a mrimii fragmentelor n acelai gel, dar n godeu separat se va migra un amestec de molecule cu mase moleculare diferite dar cunoscute. Acest amestec de molecule se numete marker molecular ADN. Agaroza este un poliglucid extras din alge marine roii. Gelurile de agaroz se realizeaz prin nclzirea agarozei ntr-un tampon specific. Concentraia agarozei n gel poate fi ntre 1 i 3% n dependen de scopul urmrit. Cu ct concentraia agarozei este mai mare, cu att mrimea porilor va fi mai mic. La concentraii mai mici de agaroz, porii vor fi mai mari i migrarea moleculelor mai rapid. n concluzie concentraii mai mici se folosesc pentru fragmente mari (cteva mii de pb), iar concentraii mari pentru fragmente mici. Gelurile de agaroz de 1% sunt cel mai des utilizate, oferind separarea moleculelor ntre 0,1 i 10 kpb. Gelurile de agaroz sunt plasate ntre cei doi electrozi n cuve speciale care conin tampon de migrare. Acest tampon este acelai folosit i pentru realizarea gelului. Cele mai folosite tampoane sunt TAE (Tris/Acetat/EDTA) i TBE (Tris/Borat/EDTA). Deoarece ADN nu poate fi vizualizat cu ochiul liber este necesar utilizarea unui colorant. Cel mai des folosit n acest scop este bromura de etidiu, care fixat de ADN n lumin ultraviolet devine fluorescent i are o culoare portocalie (Figura 8). Bromura de etidiu se intercaleaz ntre bazele azotate din molecula dublu catenar de ADN. Lungimea de und a luminii ultraviolete la care este expus gelul trebuie s fie cuprins ntre 260 i 300 nm.
A B

Figura 8. Separarea unor fragmente de ADN cu ajutorul electroforezei n gel de agaroz. A imaginea gelului la expunerea n UV; B fotografia aceluiai gel.

Electroforeza n gel de agaroz este utilizat pentru vizualizarea i purificarea ADN. Vizualizarea ne ofer informaii despre integritatea ADN 26

(ADN genomic, ADN plasmidic etc), rezultatul digestiilor enzimatice, estimarea cantitii de ADN obinut n reaciile PCR sau de extracie. ADN poate fi purificat din gel de agaroz dup migrare prin excizarea fragmentului int i purificarea din gel cu kituri special predestinate acestui tip de purificri. Verificarea moleculelor recombinate Rezultatul ligrii i transformrii se poate vedea doar dup 12-18 ore de la transformare cnd apar coloniile de E. coli pe mediu selectiv. Apariia coloniilor nu indic neaprat i o reuit deplin a clonrii, deoarece acestea pot conine un amestec de colonii pozitive i colonii cu plasmid fr insert. Chiar dac se folosete un sistem alb-albastru de selecie a coloniilor pozitive, acestea necesit totui o dovad n plus a prezenei plasmidului recombinat. n acest scop se va efectua o cultur lichid de 3-5 ml de mediu cu antibiotic care se va nsmna cu o singur colonie. Cultura se va incuba peste noapte cu agitare la 37C. Ziua urmtoare din bacteriile rezultate se va purifica ADN plasmidic cu ajutorul unor metode clasice sau cu ajutorul unor kituri speciale. ADN plasmidic urmeaz a fi analizat iniial prin digestie enzimatic i apoi prin secvenializare. Digestia ADN plasmidic se va realiza cu enzimele de restricie cu care acesta a fost introdus n vector sau care se afl la extremele situsului multiplu de clonare. Aceast digestie va confirma prezena insertului n plasmid i aproximativ mrimea acestuia, dar nu va furniza nicio informaie despre secvena fragmentului clonat. Secvenializarea fragmentului int este verificarea definitiv a clonrii. Aceast verificare este necesar deoarece ADN polimeraza utilizat pentru amplificarea insertului prin PCR poate introduce erori de sintez. Pentru a evita erorile n produii PCR se poate utiliza o ADN polimeraz care are proprietatea de a corecta erorile introduse. Astfel de ADN polimeraze sunt Vent polimeraza, Pfu polimeraza, Tli polimeraza . a. Taq polimeraza nu are activitate de corectare a erorilor, dar asigur de obicei randamente de sintez mai mari. n unele cazuri se utilizeaz un amestec de 2 polimeraze (3 pri de Taq polimeraz i o parte Pfu polimeraz) pentru a combina un randament mai mare cu o fidelitate crescut. n cadrul Centrului de Biologie Molecular exist 2 secveniatoare: Analizorul Genetic ABI Prism 310, Applied Biosystems, SUA (laser cu detecie pentru 5 fluorocromi), Analizor Genetic CEQ 8800 Genetic Analysis System (laser cu detecie pentru 4 fluorocromi). Ambele aparate utilizeaz principiul Sanger de secveniere. Acest principiu presupune utilizarea unei variante de PCR pentru secveniere. Matria ADN ce urmeaz a fi secveniat este denaturat, apoi la unul din capetele sale are loc ataarea 27

unei amorse de la care ADN polimeraza va porni sinteza catenei complementare. Amestecul PCR conine dezoxiribonucleozide trifosfat (dNTP) dar i di-dezoxiribonucleozide trifosfat (ddNTP) care nu conin gruparea OH n poziia 3' a dezoxiribozei. Lipsa acestei grupri va face imposibil continuarea sintezei ADN, deoarece ADN polimeraza nu poate aduga urmtorul nucleotid. Rezultatul acestui PCR vor fi fragmente monocatenare (deoarece se folosete o singur amors) de diferite mrimi. Numrul de cicluri este de 40, ceea ce permite sinteza tuturor fragmentelor care se opresc n toate punctele matriei de ADN. Pentru detecia fragmentelor, fiecare ddNTP este marcat cu un fluorocrom. Amestecul de fragmente rezultate sunt separate cu ajutorul electroforezei capilare, care presupune utilizarea unui capilar cu un diametru de ordinul micrometrilor. O cantitate de civa microlitri vor fi separai n gelul din capilar. Migrarea fragmentelor n gel este n dependen de mrimea lor, cele mai mici vor fi primele, iar la final cele mai mari. n ultima parte a capilarului exist o fereastr transparent prin care un fascicol laser va excita fluorocromii, iar fluorescena emis va fi captat i prezentat sub forma unei electroforegrame (Figura 9). Electroforegramele sunt apoi analizate i comparate cu secvena existent n bazele de date. Mrimea fragmentelor de ADN care pot fi secvenializate variaz ntre 600 i 800 pb. Pentru fragmente mai mari sau pentru matrie dificile (cu secvene repetitive) este necesar utilzarea unor kituri speciale.

Figura 9. Electroforegrama unei secvene obinut cu ajutorul analizorului ABI Prism 310.

Exprimarea genelor n sistem procariot Clonarea genelor vizeaz n principal dou obiective posibile: multiplicarea unui fragment ADN sau exprimarea genei clonate. Clonarea n scopul multiplicrii fragmentului este utilizat atunci cnd ADN supus analizei este de fapt un amestec de fragmente care nu pot fi separate cu ajutorul electroforezei i la care se urmrete cunoaterea secvenei. n acest scop amestecul de fragmente se cloneaz ntr-un vector de clonare, iar clonele pozitive sunt apoi secvenializate. 28

Celulele de E. coli sunt utilizate pe larg n obinerea de proteine recombinate. Ele pot fi numite adevrate fabrici de proteine la comand, care ns cteodat refuz s sintetizeze proteinele comandate i de ce cele mai dese ori strine celulei bacteriene. Clonarea n scopul exprimrii genei i obinerii de protein recombinat include cteva aspecte care sunt importante pentru exprimare. Gena codificatoare poate fi clonat direct n vectorul de exprimare. Plasmidele de exprimare conin neaprat un promotor recunoscut de ARN polimeraza celulei gazd, un situs de legare a ribosomilor (rbs), un codon START i unul STOP la capetele situsului multiplu de clonare. Foarte important n acest caz este pstrarea cadrului deschis de citire, adic mprirea exact pe codoni a genei de la primul codon tradus pn la ultimul. Promotorii din aceste tipuri de plasmide sunt de tip inductibil. Cel mai des utilizat inductor este IPTG (isopropil-tio-galactozid), care este un analog al galactozei. Spre exemplu, vectorii de tip pET de la Novagen asigur de obicei o supraexprimare a genelor clonate. Plasmidul pET21 conine promotorul de la fagul T7, situsul de recunoatere a ribosomilor, codonul START n situsul multiplu de clonare i codonul STOP dup o etichet de 6 histidine. Dac se opteaz pentru prezena unei etichete 6His la captul C-terminal a proteinei pentru facilitarea purificrii, atunci din gen se va nltura codonul STOP. Dac aceast etichet nu este necesar, atunci n gen se va pstra codonul STOP i traducerea se va opri nainte de etichet. Promotorul T7 nu este recunoscut de ctre ARN polimeraza de la E. coli i simpla prezen a plasmidului n celulele bacteriene nu va sigura o exprimare a genei. Vectorii pET necesit tulpini de E. coli care conin gena pentru ARN polimeraz de la fagul T7. Aceast gen se afl sub controlul promotorului lac UV5 i a operatorului lac (Figura 10).

Figura 10. Inhibiia exprimrii genei pentru ARN polimeraza de la fagul T7 i a genei int n celulele gazd de E. coli n lipsa inductorului.

29

Operatorul lac este o secven recunoscut de ctre o protein numit represorul lac. Atunci cnd n mediu nu exist lactoz (sau analogi ai lactozei) represorul lac se fixeaz la operatorul lac i mpiedic transcrierea genei pe care o regleaz, care n acest caz este gena pentru T7 ARN polimeraz. n absena T7 ARN polimerazei nu va exista nici transcrierea genei int din plasmid. Represorul lac este codificat de gena lacI care se afl att n genomul bacteriei gazd ct i n plasmidul de exprimare. Agentul care induce exprimarea este un analog al galactozei IPTG. Moleculele de IPTG se fixeaz de represorul lac i cauzeaz disocierea acestuia de la operatorul lac, astfel promotorul lac devine accesibil pentru ARN polimeraza de E. coli care va transcrie gena pentru T7 ARN polimeraz. Aceasta din urm va recunoate promotorul T7 din plamsid i va transcrie gena int. Acest sistem de exprimare este unul foarte puternic i care poate asigura o producie de protein care va alctui pn la 50% din proteinele totale bacteriene. Purificarea proteinelor recombinate Proteinele recombinate pot fi purificate prin metode cromatografice. Pentru o purificare ct mai bun din amestecul total de proteine este necesar purificarea n cel puin 2 etape prin metode cromatografice diferite. Ataarea unor etichete la proteinele recombinate asigur purificarea proteinelor ntr-o singur etap, ceea ce reduce timpul necesar i asigur randamente de purificare mai mari (Figura 11). Dac eticheta deranjeaz n analiza ulterioar a proteinei, atunci se poate recurge la nlturarea acesteia prin digestie cu peptidaze. n acest scop pentru clonare i exprimare se va alege un plasmid care conine situsul pentru peptidaz, cum este spre exemplu situsul pentru trombin n cazul plasmidului pET28.
A B C

Figura 11. Reprezentarea schematic a purificrii de proteine recombinate prin cromatografie de afinitate. A ncrcarea amestecului total de proteine pe coloana cu rin; B splarea coloanei cu tampon i fixarea proteinei int de rin; C eluarea proteinei int de pe coloan.

30

2. Utilizarea clonrii de gene i exprimrii de proteine recombinate n studii interdisciplinare

Clonarea genelor n ultimii ani a devenit o tehnic indispensabil n laboratoarele de biologie molecular. Una dintre aplicaiile acestei tehnici, importante nu numai pentru biologie, dar i pentru studii interdisciplinare este utilizarea ei n scopul obinerii de proteine recombinate. Clonarea genelor i exprimarea lor n celule gazd reprezint o surs foarte preioas de proteine. n cele mai multe cazuri purificarea unei proteine din celulele n care aceasta se exprim n mod firesc natural prezint mai multe dificulti: cantitatea de proteine n esuturi este foarte mic, spre exemplu pentru purificarea unei proteine din bacterii este necesar o cantitate de zeci de litri de cultur bacterian, iar rezultatul purificrilor n cteva etape pot fi sub 100 mg de protein; obinerea unei cantiti mari de esut pentru purificare este aproape imposibil, spre exemplu cum este cazul unor bacterii pe care nu putem s le cultivm n condiii de laborator; obinerea materialului pentru purificare implic probleme etice, cum ar fi spre exemplu cazul unor proteine umane, obinerea de proteine din celule umane ar fi imposibil; purificarea se face n mai multe etape care necesit timp, consumabile i are randamente mai mici. Aceste dezavantaje ale purificrii direct din material biologic sunt eliminate n cazul exprimrii genelor n celule gazd. Un mare avantaj al acestei metode este posibilitatea introducerii de mutaii care pot dezvlui rolul unor domenii sau aminoacizi particulari n activitatea proteinei. Prin intermediul tehnicilor de mutagenez pot fi introduse mai multe tipuri de mutaii: mutaii missens care schimb un aminoacid cu altul; deleii n care poriuni ntregi din lanul polipeptidic pot fi nlturate; inserii care constau n introducerea de fragmente noi n gena codificatoare i respectiv n proteina recombinat; fuzionrii, se pot fuziona proteine ntre ele sau regiuni ale unei proteine cu regiuni ale altei proteine, spre exemplu regiunea N-terminal a unei proteine de la o specie se poate fuziona cu captul C-terminal al aceleiai proteine de la o specie nrudit; proteinele recombinate pot fi marcate. Proteinele pot fi marcate 31

cu anumite molecule care sunt introduse n proteine n procesul lor de sintez sau pot fi fuziuni. Un exemplu n acest sens este marcarea proteinelor cu izotopi stabili sau radioactivi, n mod specific sau randomic. Un alt exemplu este marcarea proteinelor prin fuziunea lor cu proteine fluorescente, care apoi faciliteaz detecia lor. Clonarea genelor i exprimarea lor n sistem procariot este tehnica la care se apeleaz cel mai des, deoarece este mai rapid i mai puin costisitoare. Proteinele sunt structuri cu mai multe nivele de organizare, astfel o protein are structur: primar, secundar, teriar i cuaternar. Exprimarea genelor i sinteza proteinelor n celulele procariote asigur doar structura primar exact a polipeptidului sintetizat. n unele cazuri proteinele adopt structura secundar independent dup sintez, n alte cazuri este nevoie de condiii speciale i alte proteine care contribuie la adoptarea conformaiei proteinei active. Unele proteine att de la eucariote ct i de la procariote sintetizate n celule gazd de E. coli nu reuesc s adopte o structur secundar corect, iar ca rezultat polipeptidele acumulate n citoplasm formeaz corpi de incluziune. Exist cazuri cnd acumularea proteinei sub forma corpilor de incluziune este un avantaj. Corpii de incluziune ofer posibilitatea unei purificri printr-o singur etap n condiii denaturante. Proteinele denaturate purificate n acest mod pot fi utilizate pentru imunizarea de animale n scopul producerii de anticorpi. Cel mai important aspect pentru imunizare este secvena de aminoacizi a proteinei i nu structura ei secundar sau teriar. Exprimarea proteinelor sub forma corpilor de incluziune nu poate fi prezis pe baza apartenenei genei sau pe baza analizei structurii primare. O alt problem care poate aprea este neexprimarea genei. Cauzele neexprimrii pot fi toxicitatea proteinei asupra celulelor gazd. Un alt dezavantaj (dei n unele cazuri este un avantaj) este lipsa modificrilor post-traducere a polipeptidelor sintetizate n celule bacteriene. Majoritatea proteinelor de la eucariote necesit nu numai adaptri conformaionale dar i modificri post-traducere cum ar fi fosforilri, glicozilri . a. Dac prezena acestor modificri este absolut necesar, atunci se va recurge la clonarea genei n sistem procariot i exprimarea ei n celule gazd eucariote. Lipsa modificrilor post-traducere este un avantaj atunci cnd este cunoscut funcia proteinei active i se dorete s se cunoasc rolul gruprilor care sunt adugate dup sintez. n acest fel proteina recombinat nu va fi modificat i se va putea deduce rolul acestor grupri n activitatea proteinei. 32

3. Infrastructura existent n cadrul Centrului de Biologie Molecular

Denumire echipament Instalaie de preluare i prelucrare a imaginilor Ced Limited, Marea Britanie Instalaie de ap ultrapur, Elga-Lab Water, Marea Britanie Centrifug cu rcire Sigma 3K18 (4 rotoare), Sigma, Germania Centrifug de mas Sigma 1-13, Sigma, Germania Thermocycler, Eppendorf, Germania Thermocycler, Corbett Research, Australia Electroporator Eppendorf, Germania Spectrofotometru UV-Vis monofascicul M301, CamSpec, Marea Britanie Spectrofotometru Jasco V-530 dublu-fascicul cu termostatare, Jasco, Japonia Patru instalaii electroforez proteine, Consort, Belgia ase instalaii electroforeza acizi nucleici, Consort, Belgia pH-metru P901 (dou buci), Consort, Belgia Congelator temperaturi foarte sczute, 70 litri, Sanyo, Japonia Congelator temperaturi foarte sczute, 100 litri, Snijders Scientific, Olanda Dou balane analitice, Scaltec, Germania Dou incubatoare bacteriologice, Memmert, Germania Doua bai de apa cu agitare, Memmert, Germania Caracteristici Achiziia i interpretarea imaginilor de pe geluri de poliacrilamid sau geluri de agaroz Purificarea apei pn la o rezistivitate de 18,2 M/cm (apa MilliQ) Centrifugarea probelor, de la 0,2ml la 1 litru, maximum 28000xg, rcire de la temperatura camerei la 0C, rotor Eppendorf (24 tuburi), rotor 6x30ml, rotor 8x50ml i rotor 4x250ml Fr rcire cu rotor Eppendorf (12 tuburi, 13000xg) Pentru amplificarea ADN-ului prin PCR n tuburi de 0,2ml, 0,5ml i placi ELISA cu 96 de godeuri; gradient de temperatur n tub Pentru amplificarea ADN-ului prin PCR n tuburi de 0,2ml i plci ELISA cu 96 de godeuri; gradient de temperatur Transformarea celulelor electrocompetente bacterii i drojdii Interval de fotometrare, 198-1000 nm, rezoluie 1 nm Interval de fotometrare, 198-1000 nm, rezoluie 1 nm, cu termostatare, pentru cinetic enzimatic Electroforez vertical n gel de poliacrilamid, max. 32 probe Electroforeza orizontal n gel de agaroz, max. 48 probe Masurarea pH-ului, electrod combinat prevzut cu senzor de temperatur Congelare probe biologice la -82C Congelare probe biologice la -82C Domeniul de msurare de la 0,1mg la 160g, autocalibrare, interfa pentru calculator i imprimant Incubarea culturilor bacteriene i a probelor moleculare de la temperatura camerei la 70C Incubarea probelor biologice pana la 100C, (3%)

33

Analizor Genetic ABI Prism 310, Applied Biosystems, SUA laser cu detecie pentru 5 fluorocromi Analizor Genetic CEQ 8800 Genetic Analysis System laser cu detecie pentru 4 fluorocromi Instalaie Real Time PCR, Corbett Research, Australia

Secvenierea fragmentelor de ADN, identificare uman i determinarea polimorfismelor genetice; electroforeza capilar la 15kV; soft-uri speciale pentru secveniere i genotipare;

Amplificarea ADN-ului n timp real; detecia simultan a 4 fluorocromi Separarea probelor prin cromatografie de nalt perforInstalaie HPLC, Jasco, Japonia man; gradient binar de nalt presiune i gradient cuaternar de joas presiune Microscop inversat NIKON Studiul preparatelor celulare i tisulare n lumina normaEclipse TE2000S, Nikon, Japol, contrast de faz i fluorescen nia Autoclav 80l, Selecta, Spania Sterilizarea umed sau uscat a mediilor de cultur, mateAutoclav AE-75-DRY Raypa, rialelor i instrumentelor Spania Ultrasonicator cu patru sonde, Dezintegrarea celulelor bacteriene, esuturilor animale i Sonics & Materials vegetale n volume de la 1ml pn la 1 litru Hota PCR cu flux laminar Flux laminar vertical, filtru bacteriologic HEPA, iluminasteril, Telstar, Spania re, preparare probe PCR (4% Filtru exahustare HEPA (0,3 um 99,97%), filtru HEPA (0,3 Hota flux laminar biohazard m 99,97%), prefiltru reciclabil (3-30 m); flux de aer 100, Coreea de Sud reglabil n 9 trepte (0,35-0,5 m/s);

4.Bibliografie
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., and Walter P., (2002). Molecular Biology of the Cell, 4th edition, New York: Garland Science. Berg J.M., Tymoczko J.L., and Stryer L., (2002). Biochemistry, 5th edition New York: W. H. Freeman Company. Brown T.A., (2006). Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction, 5th edition, Wiley-Blackwell Publishing. Carson S., and Robertson D., (2005). Manipulation and Expression of Recombinant DNA, 2nd Edition, Academic Press. Glick B.R., Pasternak J.J., Patten C.L., (2009). Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, 4th edition, ASM Press. Glover D.M., Hames B.D., (1995). DNA Cloning: A Practical Approach: Expression Systems (The Practical Approach Series), 2d edition, Oxford University Press. Griffiths A., Gelbart W.M., Miller J., and Lewontin R.C., (1999). Modern Genetic Analysis, New York: W. H. Freeman Company. Griffiths A., Miller J., Suzuki D.T., Lewontin R.C., and Gelbart W.M., (2000). An Introduction to Genetic Analysis, 7th edition, New York: W. H. Freeman Company. Lodish H., Berk A., Zipursky L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J., (2000). Molecular Cell Biology, 4th edition, New York: W. H. Freeman Company.

34

10. McPherson M.J., and. Mller S.G., (2000). PCR, Basics: from Background to Bench, 1st edition, Springer-Verlag Telos. 11. Metzenberg S., (2007). Working with DNA (THE BASICS (Garland Science)), 1 edition, Taylor & Francis. 12. Popescu O., 1990. Electroforeza proteinelor n geluri de poliacrilamid, Editura Tehnic, Bucureti. 13. Watson J.D., Myers R.M., Caudy A.A., Witkowski J.A., (2006). Recombinant DNA: Genes and Genomes - A Short Course, 3rd Edition, W. H. Freeman Company.

35

Aplicaii ale tehnicilor de biologie molecular n studii interdisciplinare

Asist. univ. dr. Iulia Lupan

Cuprins
1. Metoda enzimatic de sintez a acizilor aminai.................................................... 36 2. Tendine actuale n aplicarea bionanotehnologiilor ............................................... 57 3. Bibliografie ............................................................................................................. 60

1. Metoda enzimatic de sintez a acizilor aminai

Un numr mare de aminoacizi se pot obine prin sintez enzimatic, care nu se aplic la scar industrial la fel ca n fermentarea direct, din cauza costurilor prea mari a substratelor. Aceast metod capt o amploare mai mare pe an ce trece datorit cererii mari de aminoacizi, care nu se gsesc n natur, i de derivai ai acizilor aminai. Totui metoda enzimatic prezint unele avantaje fa de alte metode, deoarece: izomerii optici ai aminoacizilor se pot obine direct din substratele corespunztoare; se pot sintetiza D-izomeri, care nu se pot obine prin fermentare direct sau prin extracie; se pot obine derivai ai aminoacizilor sau aminoacizi rari; sintezele sunt uor de manipulat; cantitile produse i concentraiile sunt mai mari; necesit condiii blnde de temperatur, pH, presiune. La nceput, pentru producerea acizilor aminai pe cale enzimatic, se foloseau enzime nerecombinate produse de microorganisme, fiind stimulat sinteza lor prin diverse metode. Pentru a reduce costul sintezelor, enzimele nu se purificau i se folosea lizatul celular ce coninea enzime specifice. Imobilizarea enzimelor n sintezele enzimatice prezint dou avantaje importante i anume reutilizarea multipl a enzimelor costisitoare i recuperarea substratelor rmase, folosite n exces. Sinteza enzimatic continu prin imobilizarea enzimelor a fost aplicat n producerea L-tirozinei cu -tirozinaz i a triptofanului cu triptofanaz, pornind de la indol, piruvat i sruri de amoniu. O surs de triptofanaz 36

poate fi lizatul brut de E .coli, la care s-a indus sinteza acestei enzime. Sinteza continu a fost realizat prin ncorporarea enzimelor n gel de poliacrilamid. Imobilizarea asigur sinteza continu a aminoacizilor i reciclarea amoniului i piruvatului neutilizate, folosite n exces [Deconttignies-Le Marchal i colab., 1979; Fukui i colab., 1974]. Celule imobilizate de E. coli cu o activitate mare a aspartazei au fost utilizate n sinteza acidului aspartic [Fusee i colab., 1981; Tosa i colab., 1973]. Aceeai metod de imobilizare a fost folosit i n sinteza alaninei cu celule de Pseudomonas dacunhae care prezentau o activitate mare a L-aspartat -carboxilazei [Fusee i Weber, 1984]. Utilizarea de cofactori (NADH, NADPH), costisitori n sintezele enzimatice, nu permite extinderea sintezelor la scar industrial. Acest impediment a cauzat folosirea sistemelor enzimatice cuplate, n care se utilizeaz enzime pentru regenerarea cofactorilor. Astfel, 3-fluoroalanina s-a obinut din 3-fluoropiruvat, reacie catalizat de alanin dehidrogenaz ntr-un sistem cuplat cu formiat dehidrogenaza pentru regenerarea NADH. Mediul de sintez mai conine formiat de amoniu, ionul de amoniu fiind necesar n reacia de sintez a aminoacidului, iar ionul formiat pentru reacia de regenerare a NADH [Oshima i colab., 1988]. Producerea continu de L-valin folosind valin dehidrogenaza i glucozo dehidrogenaza pentru regenerarea NADH a fost studiat detailat [Monot i colab., 1988; Honorat-Pascal i colab., 1990]. Honorat i col. [1990] au sintetizat L-alanina i L-valina folosind sistemul cuplat de alanin dehidrogenaz, respectiv valin dehidrogenaz, cu glucozo dehidrogenaz pentru regenerarea NADH. n strategia de sintez s-au utilizat enzime provenite de la un singur microorganism i anume Bacillus megaterium. S-a testat eficiena sintezelor n cazul folosirii lizatelor i a enzimelor purificate. Numai n cazul sintezei alaninei s-a evideniat o cretere a randamentului sintezei de la 80%, n cazul folosirii lizatului brut pn la 92%, n cazul folosirii fraciunilor purificate. Sistemul multienzimatic a fost utilizat i n sinteza L-leucinei din -cetoisocaproat, utiliznd leucin dehidrogenaz de la Bacillus stearothermophilus [Oshima i colab., 1985] i formiat dehidrogenaza de la Candida boidinii, pentru regenerarea NADH [Schtte i colab., 1976]. Utilizarea enzimelor de la microorganismele termofile prezint avantajul c au o stabilitate mai mare. Producerea acidului aspartic la scar industrial s-a realizat enzimatic pornind de la fumarat i sruri de amoniu i utiliznd aspartaza ca i catalizator [Chibata i colab., 1976]. 37

Aminoacid dehidrogenaze Aminoacid dehidrogenazele (EC 1.4.1.X) sunt enzime care fac parte din familia oxidoreductazelor. Aceste enzime catalizeaz eliminarea gruprii amino din L-aminoacizi cu formare de cetoacizi corespunztori, n prezen de NAD(P)+. Aminoacid + NAD+ + H2O -cetoacid + NADH + H+ + NH3 Majoritatea aminoacid dehidrogenazelor sunt specifice pentru -aminoacizi, dar exist i cteva enzime care reacioneaz i cu aminoacizii . Cele mai bine studiate aminoacid dehidrogenaze sunt cele care au importan industrial (fenilalanin-, leucin-, alanin-, valin- i glutamat dehidrogenaza). Aminoacid dehidrogenazele au fost intens studiate n vederea utilizrii lor n diverse ramuri industriale. Ele au fost folosite la construirea biosenzorilor, care pot s monitorizeze nivelul ridicat de aminoacizi din plasma sanguin, caracteristic n unele patologii. Aceste enzime au ntrebuinare i n sinteza industrial de aminoacizi. Deoarece ele acioneaz stereospecific, enzimele produc L-izomeri ai aminoacizilor naturali puri, aceast caracteristic fiind foarte important pentru industria farmaceutic. Alanin dehidrogenaza Aminarea reductiv a cetoacizilor la L-aminoacizi n procese NAD(P)H-dependente este catalizat de o suprafamilie de enzime omoloage de aminoacid dehidrogenaze, care include fenilalanin dehidrogenaza (PheDH), leucin dehidrogenaza (LeuDH), valin dehidrogenaza (ValDH) i glutamat dehidrogenaza (GluDH). Nu exist asemnri semnificative ntre secvenele alanin dehidrogenazelor (AlaDH) i membrii acestei familii de aminoacid dehidrogenaze, cu excepia domeniului de legare a cofactorului, care este comun pentru toate aceste enzime. Dei realizeaz unul i acelai proces biologic, alanin dehidrogenazele i suprafamilia de aminoacid dehidrogenaze au evoluat separat [Baker i colab., 1998]. Alanin dehidrogenaza (L-alanin oxidoreductaz NAD+ dependent, 1.4.1.1) catalizeaz reversibil reacia de dezaminare a L-alaninei cu formare de piruvat. L-alanina + NAD+ + H2O piruvat + NADH + H+ + NH3 Alanin dehidrogenaza a fost descris de ctre Wiame i Pirard n 1955 [Norbert i colab., 1994]. Aceast enzim a fost purificat i studiat n principal la mai multe specii din genul Bacillus. Enzima are un rol important n furnizarea energiei necesare germinrii sporilor. S-a demonstrat c n lipsa enzimei sporularea avea loc cu mari dificulti [Siranosian i colab., 38

1993]. Alanin dehidrogenaza este o enzim oligomeric. Majoritatea enzimelor studiate sunt hexameri, cum ar fi cele de la B. subtilis, B. cereus, B. sphaericus, B. stearothermophilus, Mycobacterium, Thermus, Anabaena. Alanin dehidrogenaza este o enzim NAD+ dependent. Mecanismele cinetice ale AlaDH au fost studiate la mai multe specii. NAD+ se leag naintea piruvatului n reacia de dezaminare oxidativ, iar NADH n reacia de aminare. AlaDH poate utiliza ca substrate n reacia de aminare att piruvatul, ct i 3-hidroxipiruvatul, cu ultimul reacia fiind mult mai lent. Un caz unic printre alanin dehidrogenazele bacteriene este cea de la Bacillus sp DSPM730 care reacioneaz n egal msur cu ambele substrate. Aceast enzim poate fi foarte util n sinteza de L-serin din 3-hidroxipiruvat [Nagata i colab., 1989]. Lizina din poziia 74 din secvena de aminoacizi a AlaDH de la B. subtilis este esenial n cataliz i este conservat i la alte alanin dehidrogenaze. Aminoacizii din vecintatea acestei lizine prezint o regiune conservat, dar care nu este specific altor aminoacid dehidrogenaze. [Delforge i colab., 1997]. Leucin dehidrogenaza Leucin dehidrogenaza (EC 1.4.1.9) (LeuDH) este o oxidoreductaz NAD+-dependent, care catalizeaz reversibil dezaminarea L-leucinei i a unor L-aminoacizi alifatici la cetoacizii corespunztori. Leucina + NAD+ + H2O -cetoisocaproat + NADH + NH4+ + H+ Echilbrul reaciei este deplasat spre formarea aminoacidului. Ca i majoritatea aminoacid dehidrogenazelor, LeuDH intervine n catabolismul unor aminoacizi. Leucin dehidrogenazele studiate provin n mare parte de la genul Bacillus precum i de la Thermoactinomyces [Ohshima i colab., 1994], Natronobacterium magadii MS-3 [Katoh i colab., 2003]. O mare atenie s-a acordat leucin dehidrogenazelor provenite de la microorganisme mezotermofile, deoarece sunt mai stabile. Una din aceste enzime este cea de la B. stearothermophilus, a crei gen codificatoare a fost clonat, iar proteina exprimat n celule de E. coli. [Nagata i colab., 1988]. Diferenele de termostabilitate ale proteinelor totale de E. coli i proteina recombinat de LeuDH permit purificarea acesteia ntr-o singur etap, prin denaturare termic. Enzima nu-i pierde activitatea dup incubare timp de 30 min la 70C [Oka i colab., 1989]. Enzimele termostabile nu prezint numai avantajul termostabilitii, fiind, n general, stabile i la ali factori care afecteaz proteinele, cum ar fi enzime proteolitice, solveni organici, detergeni, mediu acid sau alcalin. Aspartat amoniu-liaza L-aspartat amoniu-liaza (AAL) sau aspartaza (EC 4.3.1.1) catalizeaz reversibil transformarea acidului L-aspartic la fumarat i NH4+. Aceast 39

enzim joac un rol important n metabolsimul azotului la bacterii. Majoritatea aspartazelor studiate au masa molecular n jur de 200 kDa i sunt alctuite din patru monomeri identici, de circa 50 kDa. Enzima este activat n prezen de ioni de Mg2+ la un pH alcalin; la pH mai mic ea nu necesit ioni de metal [Karsten i Viola, 1991]. Metode Clonarea genelor pentru aminoacid dehidrogenaze Genele ce codific leucin dehidrogenaza de la Bacillus sterothermophilus, alanin dehidrogenaza de la Bacillus subtilis, glucoz dehidrogenaza de la Bacillus subtilis i aspartaza de la Escherichia coli au fost amplificate prin metoda PCR utiliznd amorse specifice. n secvena amorselor au fost incluse situsurile pentru enzime de restricie necesare inserrii genei n vectorul de exprimare. Pentru clonarea genelor ce codific leucin dehidrogenaza, alanin dehidrogenaza i aspartaza s-a utilizat vectorul de exprimare pET21b (Novagen). Acest vector ofer posibilitatea exprimrii genelor la inducere cu IPTG. Produii PCR au fost purificai din gel i digerai cu enzimele de restricie corespunztoare (Tabel 1). Vectorii de exprimare au fost digerai cu aceleai enzime de restricie. Produii de digestie (produii PCR i vectorii) au fost separai cu ajutorul electroforezei n gel de agaroz.
Tabelul 1. Amorsele utilizate pentru amplificarea prin PCR a genelor.
Enzima AlaDH Q08352 LeuDH P13154 ALL (P0AC38) Amorsele utilizate 5-GAGGGATCCGATGATCATAGGGGTTCCTAAAG-3 5-GGTCTCGAGTATAGCACCCGCCACAGATGATT-3 5-GGTGGATCCGATGGAATTGTTCAAATATATGG-3 5-TATTCTCGAGTATTGCCGAAGCACCTGC-3 5' GGTAGGATCCGATGTCAAACAACATTCGTATCG 3' 5' GCTACTCGAGTTACTGTTCGCTTTCATCAGTA 3' Escherichia coli Bacillus subtilis Bacillus stearothermophilus Organism surs Enzime de restricie BamHI XhoI BamHI XhoI NdeI BamHI NdeI BamHI NdeI BamHI Vector utilizat pET21b

pET21b

pET21b

5'-GGAATTCCATATGCTGAACGAAACTCCCGCAC-3' GalM Escherichia coli (P0A9C3) 5'-CGCGGATCCTCACTCAGCAATAAACTGATATTCCG-3' GlucDH P12310 5-GGAATTCCATATGTATCCGGATTTAAAAGGAAAAG-3 5-CGCGGATCCTCAACCGCGGCCTGCCTGG-3 Bacillus subtilis

pET24a

pET24a

Fragmentele ADN au fost purificate din gelul de agaroz. Pentru inserarea genelor n vectori s-a utilizat ADN ligaza, care are proprietatea de a 40

reface legturile fosfoesterice. Moleculele recombinate rezultate dup ligare (vector + gena) au fost introduse prin transformare n tulpina de Escherchia coli DH5. Secvenele genelor clonate au fost verificate prin secvenializare cu un aparat ABI Prism 310 Genetic Analyzer utiliznd kitul de secvenializare BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems). Producerea de proteine recombinate Pentru exprimarea genelor, moleculele corect recombinate au fost introduse prin transformare n tulpina de Escherichia coli BL21(DE3). Pentru obinerea de proteine recombinate s-au realizat culturi mai mari (0,5-1L). Dup ce densitatea optic (DO) la 600 nm a atins valorile de ~1, s-a indus exprimarea genelor cu izopropil- D-tiogalactopiranozid (IPTG) 1 mM. Dup cteva ore de la inducere (3-5 ore) bacteriile au fost centrifugate i pstrate la -80C pn la utilizare. Sintezele enzimatice au fost realizate cu extracte celulare bacteriene. O purificare a proteinelor recombinate ar implica costuri i timp suplimentar, iar orice proces biotehnologic este cu att mai valoros cu ct implic mai puine costuri. Celulele bacteriene au fost preluate n tampon Tris HCl pH=8,0 50 mM. Pereii celulelor bacteriene au fost distruse prin sonicare. Dup sonicare extractul bacterian a fost centrifugat (20 min la 21 000 g la 4C), iar supernatantul cu proteinele solubile a fost utilizat pentru msurarea activitii enzimatice. Analiza exprimrii genelor i sintezei de proteine recombinate n celulele de E. coli a fost urmrit cu ajutorul electroforezei n gel de poliacrilamid n condiii denaturante n prezen de SDS (Figura 1).
AlaDH
1 2 3
94 67 43

LeuDH
1 2 3

AAL
1 94 67 43 54 2

42

94 67 43

42

30 20,1 14,4

30 20,1 14,4

30 20,1

Figura 1. Sinteza de proteine recombinate n celulele gazd de E. coli. Cu cifre sunt indicate masele moleculare ale proteinelor din markerul molecular, preum i masele moleculare ale proteinelor recombinate. Se poate observa cantitatea mare de proteine recombinate raportat la cantitatea de proteine totale din celulele bacteriene.

41

Msurarea activitii enzimatice a enzimelor Msurtorile de activitate enzimatic a dehidrogenazelor s-au efectuat la 30C cu un spectrofotometru Jasco V-530 urmrindu-se scderea absorbanei NADH (reacia de aminare a cetoacizilor) sau formarea acestuia (reacia de dezaminare a aminoacizilor) la 340nm. La aceast lungime de und NADH prezint maximul de absorban i are un coeficient molar de extincie de 6,22 103 M-1 cm-1. Activitatea enzimatic s-a calculat dup formula: A=[(DO/min)/6,22]*(Vr/Vp) *FD *103 U/l DO/min variaia densitii optice pe minut la 340 nm Vr volumul reaciei Vp volumul probei FD factorul de diluie O unitate enzimatic (1U) corespunde formrii unui mol de produs ntr-un minut. Mediile de reacie pentru enzime au fost urmtoarele: a) LeuDH (leucin dehidrogenaza): cetoacid 10 mM, NADH 0,15 mM, NH4Cl 1 M, Tris HCl 50 mM pH 8,0 n reacia de aminare; L-leucin 10 mM, NAD 2 mM, glicocol 50 mM pH 10,5 n reacia de dezaminare b) AlaDH (alanin dehidrogenaza): piruvat 10 mM, NADH 0,15 mM, NH4Cl 1 M, Tris HCl 50 mM pH 8,0 n reacia de aminare; L-alanin 10 mM, NAD 2 mM, glicocol 50 mM pH 10,5 n reacia de dezaminare c) GDH (glucozo dehidrogenaza): glucoz 10 mM, NAD 2 mM, Tris HCl 50 mM pH 8,0 d) GalM (galacto mutarotaza): glucoz 10 mM, NAD 2 mM, Tris HCl 50 mM pH 8,0, GDH 1 U e) LDH (lactat dehidrogenaza): piruvat 1 mM, NADH 0,15 mM, Tris HCl 50 mM pH 8,0 f) AAL (aspartat amoniuliaza): acid L-aspartic 100 mM, Tris HCl 50 mM pH8,5, MgCl2 6 mM Pentru msurarea activitii enzimatice a aspartzei s-a urmrit formarea acidului fumaric la 240 nm, care are un coeficient molar de extincie la aceas lungime de und egal cu 2,54 103 M-1 cm-1. Pentru msurarea activitii enzimatice s-au folosit civa l de enzim purificat sau extract brut bacterian, astfel nct valorile DO/min s fie cuprinse ntre 0,05 i 0,3. S-a ales poriunea dreptei cu activitatea cea mai mare. Sinteza de aminoacizi marcai cu 15N Mediul de reacie pentru sintezele de aminoacizi marcai cu 15N a coninut: 42

 cetoacid 100 mM 15NH4Cl 100 mM NADH 1 mM glucoz 670 mM Amestecul de sintez a fost ajustat la pH 8,0 cu NaOH. Reacia s-a declanat prin adugarea enzimelor. Sintezele de aminoacizi marcai au fost efectuate la 30C cu urmrirea pH-lui i agitare. Pe parcursul sintezei s-a urmrit consumul de NH4Cl prin metoda Berthelot. Aceast metod const n formarea unui compus de culoare, la interaciunea ionului de amoniu, a fenolnitroprusiatului i a cloraminei. Probele s-au preparat dup urmtoarea procedur: 10 l de prob diluat de 20 ori, 200 l de fenolnitroprusiat, 200 l de hipoclorit de sodiu i 590 l ap. Developarea culorii s-a fcut prin incubarea probelor timp de 2-3 min la 100C. S-a msurat absorbana la 623 nm. nainte de declanarea sintezelor s-a preluat o prob care a servit la alctuirea unei curbe etalon. Ca martor a servit amestecul de sintez fr clorur de amoniu (din care cauz se aduga la sfrit). n Figura 2 este prezentat curba etalon de la sinteza de [15N]-L-metionin. Pe baza curbelor etalon s-a calculat cantitatea de ion de amoniu rmas n mediul de sintez. Sintezele au fost oprite prin denaturarea termic a enzimelor, timp de 15 min la 85C.
y = 0.068852 + 0.013334x R= 0.99935 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 20 40 60 80 100 120

DO

623nm

NH Cl (% )
4

Figura 2. Curba etalon de la sinteza [15N] L-Metionin.

Purificarea aminoacizilor sintetizai Aminoacizii sintetizai au fost purificai pe o coloan cu rin schimbtoare de ioni Dowex 50W x 8, n forma H+. Activarea umpluturii s-a fcut prin tratare cu HCl 2N, dup care s-a splat pn la un pH neutru. Amestecul de sintez filtrat s-a ncrcat pe coloan i apoi s-a splat cu ap (10 volume). Aminoacidul s-a eluat cu NH4OH 1M. Controlul elurii s-a fcut cu ninhidrin pentru aminoacizi. Fraciunea cu aminoacid s-a concentrat pe 43

baia de ap, dup care s-a precipitat cu etanol absolut. Precipitarea s-a lsat peste noapte, iar precipitatul obinut s-a filtrat i uscat. n continuare, aminoacizii astfel obinui au fost supui determinrii structurii, puritii i concentraiei izotopice. Analiza aminoacizilor sintetizai prin spectrometrie de mas Pentru analiza calitativ prin metoda spectrometriei de mas a aminoacizilor este necesar o derivatizare a produsului de reacie. Derivatizarea, care trebuie facut la ambele funciuni polare ale moleculei de aminoacid, la carboxil i amin, s-a facut prin sililare, utiliznd metoda Das Neves i Vasconcelos, care introduce la fiecare funciune polar din molecul cte o grupare ter-butil-dimetilsilil (TBDMS). Acest tip de derivatizare are avantajul c, datorit substituentului ter-butil voluminos, la amin se introduce o singur grupare silil, i nu una sau dou n mod statistic, cum se ntmpl n cazul derivatizrii cu grupri trimetilsilil. Derivatizarea s-a fcut utiliznd ca reactiv N-metil-N-(ter-butil-dimetilsilil) triflouroacetamida (MTBSTFA) n calitate de donor al gruprii silil, reactivul avnd i un coninut de 1% ter-butil-dimetil-clorsilan, n calitate de catalizator. Derivatizarea s-a fcut pe cantitai de prob de ordinul 0.5-1 mg de prob, cu 150 l de acetonitril ca solvent i 50 l reactiv MTBSTFA, la 120C timp de 20 minute. Separarea gaz-cromatografic a produilor de sintez sub form de TBDMS-derivai s-a fcut pe o coloan capilar cu faz staionar DB5 de 30 m lungime, cu hidrogen ca i gaz purttor i cu temperatur programat ntre 55 i 250C. La ionizarea cu impact de electroni, aminoacizii sub form de TBDMS-derivai se produc n cea mai mare parte sub form de ioni prin fragmentarea moleculelor. Masele ionilor fragment fiind caracteristice fiecrui aminoacid. Prin ruperea n diferite poziii din gruparea tert-butildimetilsilil se formeaz ioni cu masele M-43, M-57 i M-85, iar prin ruperea legturii dintre carboxil i atomul de carbon alfa, adiacent, ia natere un fragment cu masa M-159. Pentru analize s-a utilizat un cromatograf de gaze Hewlett Packard 5840 A, iar spectrele s-au nregistrat cu un spectrometru de mas cuadrupolar HP 5985. Sinteza de aminoacizi marcai cu 15N Marcarea aminoacizilor cu izotopi stabili se poate realiza prin sinteze chimice i enzimatice. n primele etape de marcare a acizilor aminai cu izotopi stabili s-au folosit metode de sintez chimic. Aceste metode prezint un ir ntreg de dezavantaje, cum ar fi consumul unei cantiti mari de amoniac, randamente sczute datorit mai multor etape de sintez, obinerea racemicului. 44

Folosirea enzimelor n sinteze de aminoacizi marcai cu izotopi stabili prezint mai multe avantaje fa de metodele chimice, datorit faptului c decurg stereoselectiv i au randamente superioare. O metod relativ simpl i mai utilizat pentru obinerea de aminoacizi marcai cu 15N este sinteza enzimatic pornind de la cetoacizi i sruri de amoniu (15N). Reaciile de sintez sunt cuplate cu reacii de regenerare a cofactorilor costisitori. Majoritatea enzimelor utilizate n sinteza diverilor compui necesit coenzime (NADH sau NADP). Din cauza preului mare a acestora utilizarea lor n cantiti stoichiometrice nu este eficient. Pentru a evita acest fenomen exist cteva ci de regenerare continu a coenzimelor pe parcursul sintezelor: regenerarea n vivo, cu utilizare de celule n cretere. Aceast metod prezint dezavantajul manipulrii laborioase a celulelor i caracterul enantioselectiv sczut al reaciei; regenerarea enzimatic n vitro, cele mai utilizate enzime pentru regenerarea coenzimelor n sinteze fiind alcool dehidrogenaza i formiat dehidrogenaza (Hummel i Kula, 1989); regenerarea electrochimic, care const n oxidarea unui mediator i transferul electronului la NAD(P)+. Un dezavantaj al metodei l prezint specificitatea i viteza de regenerare reduse. Modalitatea cea mai eficient pentru regenerarea coenzimelor rmne metoda enzimatic. Sursele enzimelor utilizate n regenerarea coenzimelor sunt destul de variate, marea majoritate provenind de la bacterii. Piridin nucleotid transhidrogenaza de la Pseudomonas fluorescens a fost utilizat n regenerarea att a NAD ct i a NADP pentru producerea de hidromorfon [Boonstra i colab., 2000]. Schema de sintez a aminocizilor marcai cu 15N utilizat n prezenta lucrare este reprezentat n Figura 3.
15NH4Cl

Cetoacid

NADH AADH

Acid gluconic GDH GalM -glucoz -glucoz

L-(15N)aminoacid

NAD+

Figura 3. Schema de sintez a acizilor aminai cu 15N. AADH aminoacid dehidrogenz

Aminoacid dehidrogenazele catalizeaz reacia de formare a aminoacizilor pornind de la 15NH4Cl i cetoacizii corespunztori. Sinteza de aminoa45

cizi a fost cuplat cu reacia catalizat de glucozo-dehidrogenaza (GlucDH) de la B. subtilis. GlucDH a servit la regenerarea NADH, utiliznd ca substrat glucoza cu formare de acid gluconic. n unele sinteze s-a folosit galactozo-mutarotaza pentru transformarea -glucozei n -glucoz. Enzimele utilizate n sintezele de aminoacizi marcai nu au fost purificate. Enzimele recombinate, exprimate n celule de E. coli, reprezint aproximativ 50% din proteinele totale existente n lizatul bacterian. Purificarea acestora este o etap suplimentar care, n general, nu conduce la mrirea randamentului reaciei. Honorat i colab. [1990] au testat sinteza de L-alanin i L-valin cu enzime (alanin dehidrogenaz i valin dehidrogenaz) purificate i n lizat bacterian. Acest fapt nu a influenat randamentul sintezelor. Sinteza de [15N] L-Ala Amestecul de sintez a fost ajustat la pH 8,0. Reacia s-a declanat la adugarea enzimelor (115 U de leucin dehidrogenaz i 60 U de glucozo-dehidrogenaz). Pe tot parcursul sintezei alaninei s-a urmrit consumarea clorurii de amoniu prin metoda Berthelot (Figura 4 A) care este o metod colorimetric foarte sensibil de dozare a amoniacului. Dup purificarea aminoacidului randamentul sintezei a fost de 60%.

Figura 4. Sinteza de [15N]-alanin. (A) Consumul. 15NH4Cl pe parcursul sintezei de [15N]-alanin. Sinteza de L-alanin marcat cu 15N s-a realizat pentru o cantitate de 8 mmol. Mediul de reacie utilizat a coninut: piruvat de Na 150 mM, 15NH4Cl 130 mM, NADH 1 mM, glucoz 670 mM. (B) Spectrul de mas al [15N]-Alaninei. DMTBS derivat, M = 318, cca 97 atom % 15N

NH4Cl 100% s-a considerat cantitatea de clorur la timpul zero, nainte de adugarea enzimelor. Activitatea alanin dehidrogenazei din B. subtilis este inhibat de piruvat, constanta de inhibiie calculat de noi Ki=4,25 mM. Astfel, la concentraii mari de substrat activitatea enzimei este redus. O soluie n acest 46

caz ar fi declanarea reaciei de sintez cu cantiti mai mari de enzim. O alt soluie poate fi adugarea piruvatului n mai multe etape. n ambele cazuri este necesar o urmrire minuioas a consumului clorurii de amoniu. Masa molecular a alaninei fr marcare izotopic este 317. Masele fragmentelor ion ale alaninei cu coninut izotopic natural sunt m/z 274, 260, 232 i 158. Analiza spectrelor de mas a artat prezena fragmentelor ion cu o unitate mai mult dect cele menionate mai sus, ceea ce demonstreaz marcarea alaninei nu 15N (Figura 4 B). Sinteza de [15N]-L-Leu Leucin dehidrogenazele au specificitate pentru un numr mai mare de cetoacizi. Enzima are cea mai mare specificitate de substrat pentru acidul -cetoisovaleric. Specificitile de substrat ale leucin dehidrogenazei native din B. stearothermophilus sunt prezentate n Tabelul 2.
Tabelul 2. Activitatea specific (U/mg de protein) a LeuDH din B. stearothermophilus n prezena diferiilor -cetoacizi -cetoacid Acid -cetoisovaleric Acid ceto--metilvaleric Acid -cetoizocaproic Acid -cetocaproic Acid -ceto--metiltiobutiric Acid -cetobutiric LeuDH429 168 (100) 46,5 (28) 36,8 (22) 17,4 (10) 7,8 (4,6) 4,7 (2,8)

Activitatea enzimatic a fost determinat la 30C n tampon Tris-HCl 50 mM, -cetoacid 10 mM, NH4Cl 1M i NADH 0,15 mM, pH 8,0. ntre paranteze este exprimat activitatea procentual considernd rezultatul obinut cu acid -cetoisovaleric ca 100%.

De aceste valori ale activitii enzimatice s-a inut cont n sintezele de aminoacizi marcai cu izotopul stabil al 15N. n sintezele de aminoacizi la care enzima are o specificitate mai mic pentru precursorul acestora, a fost necesar o cantitate mai mare de enzim. Mediul de reacie pentru sinteza de [15N]-leucin s-a realizat cu reactivii la concentraiile descrise la capitolul de materiale i metode. Pe tot parcursul sintezei s-a urmrit consumul de NH4Cl (Figura 5 A). n cazul leucinei derivatizate cu dou grupri silil, masa molecular exact pentru leucin fr marcare izotopic la azot este M=359. Masele caracteristice ale ionilor fragment ale leucinei cu coninut izotopic natural au valorile m/z 316, 302, 274, i respectiv 200. n cazul aminoacizilor mar47

cai cu 15N, att masa molecular ct i masele ionilor fragment cresc cu o unitate de mas (Figura 5 B).

Figura 5. Sinteza de [15N]-leucin (A) Consumul de 15NH4Cl pe parcursul sintezei de [15N]-leucin. (B) Spectrul de mas al [15N]-Leucinei. DMTBS derivat, M = 360, cca 97 atom % 15N. NH4Cl 100% s-a considerat cantitatea de clorur la timpul zero, nainte de adugarea enzimelor. Din fiecare reactant s-a utilizat o cantitate de 8,2 mmol. Sinteza s-a declanat cu 205 U de leucin dehidrogenaz i 110 U de glucozo dehidrogenaz.

Sinteza de [15N]-L-Val Mediul de reacie pentru sinteza de [15N]-valin s-a realizat cu reactivii la concentraiile descrise la capitolul de materiale i metode. Pe tot parcursul sintezei s-a urmrit consumul de NH4Cl (Figura 6 A).

Figura 6. Sinteza de [15N]-valin. (A) Consumul de 15NH4Cl pe parcursul sintezei de [15N]-valin. (B) Spectrul de mas al [15N]-valinei. DMTBS derivat, M = 346, cca 97 atom % 15N

NH4Cl 100% s-a considerat cantitatea de clorur la timpul zero, nainte de adugarea enzimelor. Raportul molar al reactanilor (acid -ceto isovaleric:15NH4Cl )a fost de 1:1. Din fiecare reactant s-a utilizat o cantitate de 8,0 mmol. Sinteza s-a declanat cu 200 U de leucin dehidrogenaz i 125 U de glucozo-dehidrogenaz. S-au realizat cteva sinteze, raportul reactan48

ilor i randamentele sintezelor sunt prezentate n Tabelul 3. Cel mai mare randament s-a constatat n cazul sintezei de 12 mmol. Tabelul 3. Sinteze de [15N]-L-valin
Reactani (mmol) Acid cetoisovaleric 3,0 8,0 12,0
15NH 4Cl

3,0 8,0 12,0

Randamentul sintezei (%) 79 86 92

Viteza de reacie este, i deci i consumul de clorur de amoniu este foarte mare n primele minute de sintez. Astfel, dup 10 min s-a consumat 50% clorur de amoniu. n continuare viteza reaciei a sczut. Scderea vitezei de reacie se poate explica prin scderea concentraiei substratelor, viteza reaciei fiind direct proporional cu concentraia de substrat pn la anumite valori; acumularea de produi de sintez care pot inhiba activitatea enzimelor. n cazul valinei derivatizate cu dou grupri silil, masa molecular exact pentru valina fr marcare izotopic la azot este M=345 . Masele caracteristice ale ionilor fragment a valinei cu coninut izotopic natural au valorile m/z 302, 288, 260 i respective 186, iar n cazul valinei marcate cu 15N, att masa molecular ct i masele ionilor fragment cresc cu o unitate de mas. Spectrul de mas al valinei marcate isotopic este prezentat n Figura 6 B. Datele spectrometrice de mas obinute confirm pe deplin prezena valinei marcate cu 15N n produsul reaciei enzimatice. Sinteza de [15N]-L-Met Mediul de reacie pentru sinteza de 15N-metionin s-a realizat cu reactivii la concentraiile descrise la capitolul de materiale i metode. Pe tot parcursul sintezei s-a urmrit consumul de NH4Cl (Figura 7 A). Activitatea specific relativ a leucin dehidrogenazei pentru acidul -ceto--metiltiobutiric este aproximativ 8 U/mg protein. Din aceast cauz a fost nevoie de o cantitate mai mare de protein. Viteza reaciei a sczut foarte mult dup primele 10 min cnd s-au consumat 50% din substrate (Figura 7 A). Viteza a sczut mult dup nc 10 min (n primele 20 min ale sintezei s-au consumat 80% clorur de amoniu). Pentru consumarea celorlalte 20% NH4Cl au fost necesare 100 min. Dup purificarea aminoacidului s-a constatat un randament al sintezei de 94%. Masa molecular a metioninei derivatizat cu dou grupri silil este de 377. Masele caracteristice ale ionilor fragment ale metioninei fr marcare izotopic au valorile m/z 320, 292, i 218. n cazul metioninei marcate cu 15N, att masa molecular ct i 49

masele ionilor fragment cresc cu o unitate de mas. Spectrul de mas al metioninei marcate isotopic este prezentat n Figura 7 B. Datele spectrometrice de mas obinute confirm pe deplin prezena metioninei marcate cu 15N n produsul sintezei enzimatice.

Figura 7. Sinteza de [15N]-metionin. (A) Consumul de 15NH4Cl pe parcursul sintezei de [15N]-metionin. NH4Cl 100% s-a considerat cantitatea de clorur la timpul zero, nainte de adugarea enzimelor. Raportul molar al reactanilor (acid -ceto--metiltiobutiric:15NH4Cl )a fost de 1:1. Din fiecare reactant s-a utilizat o cantitate de 5,8 mmol. Sinteza s-a declanat cu 200 U de leucin dehidrogenaz i 125 U de glucozo dehidrogenaz. (B) Spectrul de mas al [15N]-metioninei. DMTBS derivat, M = 378, cca 97 atom % 15N

Sinteza de [15N]-L-NorLeu Mediul de reacie pentru sinteza de [15N]-norleucin s-a realizat cu reactivii la concentraiile descrise la capitolul de materiale i metode.
100

100 90 80 70 60

73

201

80 NH Cl (%)

60

I, %

50 40 30 20 10 0

40

57

75

147 133

275 303

15

20

346 0 50 100 150 200 m/z 250 300 350 400

0 0 5 10 20 min 30 70 90 120

Figura 8. Sinteza de [15N]-norleucin. (A) Consumul de 15NH4Cl pe parcursul sintezei de [15N]-norleucin. NH4Cl 100% s-a considerat cantitatea de clorur la timpul zero, nainte de adugarea enzimelor. Raportul molar al reactanilor (acid -ceto caproic:15NH4Cl )a fost de 1:1. Din fiecare reactant s-a utilizat o cantitate de 4,7 mmol. Sinteza s-a declanat cu 106 U de leucin dehidrogenaz i 86 U de glucozo dehidrogenaz i 39 U de galacto mutarotaz. (B) Spectrul de mas al [15N]-norleucinei. DMTBS derivat, M = 360, cca 97 atom % 15N

50

Activitatea specific relativ a leucin dehidrogenazei pentru acidul cetocaproic este relativ mic (17,4 U/mg protein). Pe tot parcursul sintezei s-a urmrit consumul de NH4Cl (Figura 8 A). Raportul reactanilor i randamentele sintezelor sunt prezentate n Tabelul 4. Tabelul 4. Sinteze de [15N]-L-norleucin
Reactani (mmol) Acid cetocaproic 2,0 4,7
15NH 4Cl

Randamentul sintezei (%) 78 78

2,0 4,7

Masa molecular a norleucinei fr marcare izotopic este 359. Masele fragmentelor ion ale norleucinei cu coninut izotopic natural sunt sunt m/z 316, 302, 274 i 200. Analiza spectrelor de mas a artat prezena fragmentelor ion cu o unitate mai mult dect cele mai menionate mai sus, ceea ce demonstreaz marcarea norleucinei nu 15N (Figura 8 B). Sinteza de [15N]-L-Norval Mediul de reacie pentru sinteza de [15N]-norvalin s-a realizat cu reactivii la concentraiile descrise la capitolul de materiale i metode. Activitatea specific relativ a leucin dehidrogenazei pentru acidul cetobutiric este cea mai mic dintre substratele analizate (4,7 U/mg protein, ceea ce constituie 2,8% din activitatea pentru acidul cetoisovaleric). Pe tot parcursul sintezei s-a urmrit consumul de NH4Cl (Figura 9 A).
100

100 90 80

187 73

80 NH4Cl (%)

70 60

I, %

60

50 40

261 147 57 133 303 331

0 50 100 150 200 250 300 350

289

15

40

30 20

20

10 0

0 0 5 15 30 m in 60 90 120

m/z

Figura 9. Sinteza de [15N]-norvalin. (A) Consumul de 15NH4Cl pe parcursul sintezei de [15N]-norvalin. NH4Cl 100% s-a considerat cantitatea de clorur la timpul zero, nainte de adugarea enzimelor. Raportul molar al reactanilor (acid -ceto butiric:15NH4Cl)a fost de 1:1. Din fiecare reactant s-a utilizat o cantitate de 8,03 mmol. Sinteza s-a declanat cu 310 U de leucin dehidrogenaz i 204 U de glucozo dehidrogenaz. (B) Spectrul de mas al [15N]-norvalinei. DMTBS derivat, M = 346, cca 97 atom % 15N

51

n cazul norvalinei derivatizate cu dou grupri silil, masa molecular exact pentru norvalin fr marcare izotopic la azot, este M=345. Masele caracteristice ale ionilor fragment ale valinei cu coninut izotopic natural au valorile m/z 302, 288, 260 i 186, iar n cazul norvalinei marcate cu 15N , att masa molecular ct i masele ionilor fragment cresc cu o unitate de mas. Datele spectrometrice de mas obinute confirm pe deplin prezena valinei marcate cu 15N n produsul reaciei enzimatice. Spectrul de mas al norvalinei marcate isotopic este prezentat n Figura 9 B. Sinteza de [15N]-L-Ile Mediul de reacie pentru sinteza de [15N]-izoleucin s-a realizat cu reactivii la concentraiile descrise la capitolul de materiale i metode. Activitatea specific relativ a leucin dehidrogenazei pentru acidul -ceto--metilvaleric (46,5 U/mg protein) este mai mare dect pentru acidul cetoisocaproic (36,8 U/mg protein). Pe tot parcursul sintezei s-a urmrit consumul de NH4Cl (Figura 10).
A
100 80 NH Cl (%)

100 90 80 70 60

201 73

I, %

60

50 40

15

303 57 75 147 133 275

40

30 20

20

10 0 0
0 5 10 20 40 min 60 90 120

345
50 100 150 200 250 300 350 400

m/z

Figura 10. Sinteza de [15N]-isoleucin. (A) Consumul de 15NH4Cl pe parcursul sintezei de [15N]-isoleucin. NH4Cl 100% s-a considerat cantitatea de clorur la timpul zero, nainte de adugarea enzimelor. Din fiecare reactant s-a utilizat o cantitate de 5,27 mmol. Sinteza s-a declanat cu 290 U de leucin dehidrogenaz i 221 U de glucozo dehidrogenaz. (B) Spectrul de mas al [15N]-izoleucinei. DMTBS derivat, M = 360, cca 97 atom % 15N

n cazul izoleucinei derivatizate cu dou grupri silil, masa molecular exact pentru izoleucin fr marcare izotopic la azot este M=359. Masele caracteristice ale ionilor fragment ale izoleucinei cu coninut izotopic natural au valorile m/z 316, 302, 274, i respectiv 200. n cazul aminoacizilor marcai cu 15N, att masa molecular ct i masele ionilor fragment cresc cu o unitate de mas. Masele fragmentelor ion obinute prin spectrometrie de mas sunt mai mari cu o unitate, ceea ce demonstreaz marcarea izoleucinei cu 15N (Figura 10 B). 52

Sinteza de acid L-aspartic Aspartaza este folosit cu succes n sinteza de acid aspartic din acid fumaric i clorur de amoniu, metoda fiind foarte eficient i simpl, iar acidul aspartic avnd o cerere mare pe piaa de aminoacizi. Producerea acidului aspartic la scar industrial s-a realizat enzimatic din fumarat i sruri de amoniu utiliznd aspartaza ca i catalizator [Chibata i colab., 1976]. Celule imobilizate de E. coli cu o activitate mare a aspartazei au fost utilizate n sinteza acidului aspartic [Fusee i colab., 1981; Tosa i colab., 1973]. Reacia de formare a acidului aspartic din fumarat este reversibil. Acid L-aspartic Acid fumaric + NH4+ Dup o anumit perioad de timp, ntre cei doi reactani (fumarat i acid aspartic) se stabilete un echilibru, care este deplasat spre formarea de acid aspartic. n cazul reaciilor reversibile nu se consum tot substratul i ca rezultat randamentul sintezelor scade.
Tabelul 5. Determinarea constantei de echilibru (Keq = [NH3] [acid fumaric] / [acid aspartic]) a reaciei catalizate de aspartaza din E. coli
Concentraia iniial (mM) Concentraia de echilibru (mM) Keq L- Asp NH4Cl Fumarat L- Asp NH4Cl Fumarat (mM) 1,0 10,0 0 0,749 10,251 0,251 3,43 2,0 10,0 0 1,523 10,477 0,477 3,28 2,0 20,0 0 1,648 20,352 0,352 4,35 4,0 40,0 0 3,566 30,434 0,432 3,70 Mediul de reacie conine la un volum de 1 ml urmtorii reactivi: tampon Tris-HCl 50 mM (pH 8,5), MgCl2 6mM, diverse concentraii de acid aspartic i NH4Cl, indicate n partea stng a tabelului. Se adaug apoi 1 U de aspartaz recombinat, iar la diferite intervale de timp se citete extincia la 240 nm, care este proporional cu concentraia de acid fumaric format (mM = 2,53). La echilibru nu se mai observ nici o variaie de extincie. Concentraiile la echilibru de L-Asp i NH4Cl se calculeaz din concentraiile lor iniiale i concentraia la echilibru de acid fumaric.

Pentru a determina concentraiile reactanilor la care se stabilete echilibrul reaciei am fcut mai multe determinri ale constantei de echilibru. Rezultatele i condiiile acestor determinri sunt prezentate n Tabelul 5.Media celor 4 msurtori au indicat o valoare a Keq = 3,69 mM (sau 3,69 x 10 3 M). Sinteza de acid aspartic s-a realizat la temperatura camerei. Dozarea activitii enzimatice a aspartazei s-a fcut de asemenea la temperatura camerei. Pe tot parcursul sintezei s-a urmrit consumul de acid fumaric prin citirea absorbanei la 240 nm (Figura 11 A). Reacia de sintez s-a oprit prin denaturarea termic a enzimei. 53

Fumarat mM Aspartat mM 1000

100 90 80

73

Fumarat/Aspartat (mM)

800

70 60

600

I, %

50 40

400

30 20

75

200

10 0 0 50 100

147 202 244

150 200 250

302 316
300 350

418 390
400 450

460
500

0 0 50 100 150 200 min 250 300 350

m/z

Figura 11. Sinteza de acid aspartic. (A) Consumul de acid fumaric i formarea de acid aspartic n cursul reaciei de sintez a acidului aspartic, catalizat de aspartaza recombinat din E. coli. Componena mediului de sintez a fost: acid fumaric 1 M, NH4Cl 0,8 M, pH s-a ajustat la valoarea de 8,5 cu NaOH. Reacia s-a declanat cu aspartaz 2 U/ml. (B) Spectrul de mas al acidului aspartic. DMTBS derivat, M = 457, fr marcare cu 15N.

Dup purificare s-a constat un randament de 70%. Masa molecular a acidului aspartic derivatizat cu trei grupri silil este de 457. Masele caracteristice ale ionilor fragment ale acidului aspartic fr marcare izotopic au valorile m/z 432, 418, 390 i 316. Spectrul de mas al acidului aspartic fr marcare izotopic este prezentat n Figura 11 B. Datele spectrometrice de mas obinute confirm pe deplin prezena acidului aspartic n produsul sintezei enzimatice. Sinteza de acid -cetoisocaproic Sinteza chimic a cetoacizilor este dificil de realizat, fapt care explic i costurile mari a acestora. Pn acum nu a fost descris o metod enzimatic eficient de producere a cetoacizilor. Aminoacid dehidrogenazele (AADH) catalizeaz dezaminarea L-aminoacizilor cu formare de cetoacizi corespunztori. Reaciile sunt reversibile, iar echilibrul este deplasat spre formarea de aminoacid. Acesta reprezint cel mai mare impediment n utilizarea AADH n sinteza enzimatic a cetoacizilor. Leucin dehidrogenaza de la B. stearothermophilus cu 9 aminoacizi lips la captul C-terminal are o activitate specific n reacia de dezaminare a L-leucinei, aproape de dou ori mai mare dect enzima nativ. Acest fapt ne-a determinat s testm o sintez de acid cetoisocaproic (Figura 12). Pentru sintez am utilizat i aspartaz recombinat de la E. coli. Aspartaza a servit la nlturarea ionului de amoniu format n urma reaciei 54

L-leucin

NAD+ LeuDH358 NADH LDH

Lactat

Acid cetoisocaproic NH4+

Piruvat

+
Fumarat AAL Acid aspartic

Figura 12. Schema de sintez a acidului cetoisocaproic.

de dezaminare a L-leucinei. Reacia catalizat de aspartaz este i ea reversibil, dar n acest caz echilibrul reaciei este deplasat spre formarea de acid aspartic, deci spre consumarea de NH4+. Pentru regenerarea coenzimei am utilizat lactat dehidrogenaza din muchi de bovine. Un impediment care poate aprea pe parcursul sintezelor de acest gen (cu mai multe enzime) este reacionarea enzimelor secundare cu produsul sintezei. Este cunoscut specificitatea strict a aspartazei pentru acid aspartic, de aceea am testat numai activitatea LDH cu diferii cetoacizi (Tabelul 6). Surprinztor este faptul c, totui, unii cetoacizi sunt substrate pentru LDH. Pentru sinteza cetoacizilor ce servesc ca substrate i pentru LDH trebuie cutate alte enzime pentru regenerarea coenzimei.
Tabelul 6. Activitatea LDH din muchi de bovine (Boehringer) n prezena diferiilor -cetoacizi n raport cu substratul fiziologic (acid piruvic) cetoacid Acid piruvic Acid hidroxipiruvic Acid fluoropiruvic Acid cetobutiric Acid cetocaproic Acid cetovaleric Acid ceto metiltiobutiric Acid cetoizocaproic Acid ceto metilvaleric Activitate U/mg protein 140 69 38 10 0,38 0,13, 0,02 0,00 0,00 % 100 49 27 7,1 0,27 0,093 0,014 0,00 0,00

Mediul de reacie conine n volumul final de 1 ml: tampon TrisHCl 50 mM (pH 8,5), MgCl2 6 mM, NADH 0,15 mM, -cetoacid 1 mM.

55

Sinteza de acid isocaproic s-a realizat pentru o cantitate de 5 mmol. Temperatura la care a fost efectuat sinteza a fost de 35C. Reaciile au fost oprite prin denaturarea termic a enzimelor (15 min la 85C). Formarea acidului cetosiocaproic s-a urmrit prin consumarea piruvatului (Figura 13).
Piruvat mM cetoisocaproat mM 120

100 Piruvat/cetoisocaproat (mM)

80

60

40

20

0 0 50 100 min 150 200 250

Figura 13. Consumul de acid piruvic i formarea de acid -cetoisocaproic n cursul reaciei de sintez a acidului -cetoisocaproic n sistemul cuplat LeuDH/AAL/LDH. Componena mediului de sintez a fost: acid fumaric 150 mM, acid piruvic 120 mM, L-leucin 100 mM, NAD 1 mM, pH-ul s-a ajustat la valoarea de 8,5 cu NaOH. Reacia s-a declanat cu 2 U/ml aspartaz, lactat dehidrogenaz i leucin dehidrogenaz (LeuDH358).

Din amestecul de sintez s-a purificat leucina rmas dup sintez. Cantitatea de leucin recuperat a servit la calcularea randamentului sintezei, care a fost de 30%. Dei randamentul este mic, sinteza este rentabil din punctul de vedere al preului reactanilor, cei folosii sunt mai ieftini dect produsul final. n concluzie, tehnicile care utilizeaz ADN recombinat au aplicaiile cele mai diverse n biotehnologie. Aplicarea lor cere ns expertize variate cum sunt: - calcularea randamentelor de reacie pe baza echilibrelor termodinamice i a parametrilor cinetici a enzimelor implicate, - utilizarea unor procedee rapide de purificare prin cristalizare sau cromatografie, dar nu n ultimul rnd i cunoaterea pieei internaionale privind cererea i oferta produselor. Piaa moleculelor marcate cu 15N este redus dar interesant, considernd valoarea ridicat a acestor compui. Pentru comparaie, 1 kg 56

de acid L-glutamic valoreaz n prezent ~1 , n timp ce 1 g acid [15N]-L-glutamic valoreaz ~150

2. Tendine actuale n aplicarea bionanotehnologiilor

Bionanotehnologiile moderne se inspir din organizarea celular a lumii vii. Astfel, structurile nano la fel ca i structurile vii, sunt alctuite din componente de natur organic i anorganic. Aceste structuri sunt sperana pentru tratarea a numeroase cancere, existnd n prezent deja aplicaii ale nanoparticulelor n tratamentul unor cancere. Nanoparticulele sunt o speran nu numai pentru tratamentul numeroaselor boli, dar i pentru stabilirea unor diagnostice. Utilizarea nanoparticulelor n medicin este axa prioritar n aplicarea bionanotehnologiilor. Limitrile bionanotehnologiilor sunt: incapacitatea de a sintetiza particule de aceleai dimensiuni cu aceeai suprafa, controlul organizrii lor. esuturile tari, cum ar fi esutul osos, cochiliile la molute, conin una sau mai multe componente organice de natur proteic care controleaz organizarea structural . Aplicaii ale bionanotehnologiilor Nanoparticulele de aur (NP-Au) sunt o adevrat speran n diagnosticul i tratamentul cancerelor. Au a fost utilzat timp de cteva decenii n diverse aplicaii n medicin (implanturi dentare) datorit caractersticilor sale neutre. Nanoparticulele de Au au nceput s fie din ce n ce mai des utilizate n depistarea i chiar tratamentul unor celule canceroase datorit faptului c acestea sunt inerte, non-toxice, au stabilitate mare, dimensiuni mici i capacitate de legare mare. NP-Au sunt capabile de a aciona asupra unor anumite tipuri de celule chiar n absena oricror grupe funcionalizate. NP-Au induc moartea celular liniei de celule de carcinom pulmonar A549 de la om, dar nu au nici un efect asupra altor linii de celule HepG2 (carcinom hepatic hepatocelular uman) i BHK21 (celule juvenile din rinichi de hamster) (Patra i col., 2007). Diagnostic Diagnosticul nanomolecular al cancerului poate asigura depistarea celulelor canceroase n faze incipiente ale bolii. Nanoparticule de aur derivatizate cu nucleotide tiolate au fost utilizate pentru depistarea celulelor canceroase (Conde i col., 2010). NP-Au la care s-au ataat oligonucleotide de ADN au fost utilizate pentru diagnosticul timpuriu al leucemiilor mieloide acute. Oligonucleotidele ADN utilizate n acest scop 57

reprezentau un fragment din jonciunea care rezult n urma translocaiiei t(9;22)(q34;q11). Un fragment dintr-un cromozom este translocat la un alt cromozom, n acest caz fragmentul de la cromozomul 9 este transferat pe cromozomul 22, cromozomul find cunoscut sub denumirea de cromozom Philadelphia. Aceast translocaie este cauza leucemiilor mieloide cronice i care sunt cauzate de fuziunea a 2 gene BCR(22)-Abl(9) (Figura 14).

Figura 14. Formarea cromozomului Philadelphia translocaia reciproc ntre cromozomul 9 i 22.

Produsul acestei gene este o protein himer cu activitate tirozin-kinazic. Metoda de detecie cu ajutorul nanoparticulelor se bazeaz pe formarea de poriuni hibride ADN:ARN (ADN sonda: ARNm din celulele canceroase) dublu catenare, care vor mpiedica agregarea nanoparticulelor de Au odat cu creterea concentraiei de sruri. Metoda nanosondelor pentru diagnosticul acestui tip particular de cancer ofer avantaje fa de metodele utilizate actual n diagnostic (FISH, transcrierea invers a ARNm i amplificarea prin PCR) prin faptul c este mai ieftin i mai rapid (~30 min) i necesit cantiti mici de ARNm (10 ng/l). Diagnosticul timpuriu n asemenea cazuri este foarte important, n fazele ulterioare celulele canceroase devenind rezistente la chemoterapice. Nanoparticulele de argint (NP-Ag) au devenit atractive n domeniul bionanotehnologic dup descoperirea efectului lor antibactericid (Sondi i Salopek-Sondi, 2004). Acest efect este unul de importan major datorit faptului c bacteriile capt din ce n ce mai mult rezisten la antibiotice. Nanoparticulele de argint par a avea o influen nu numai asupra bacteriilor, dar i asupra virusurilor. Astfel NP-Ag la concentraii non-toxice pentru celule inhib replicarea viral (sinteza materialului genetic ai virusului) 58

atunci cnd nanoparticulele sunt administrate nainte de infectare sau imediat dup (2-4 ore) aceasta (Speshock i col., 2010). Unele substane chimice s-au dovedit a avea un efect inhibitor asupra proliferrii celulare, angiogenezei i rol antiinflamator. Un astfel de exemplu este colorantul DCPIP (2,6-diclorofenol-indofenol) care induce apoptoza (moartea celular) n celule umane de melanom A375 i G361 (Cabello i col., 2009). DCPIP s-a dovedit a avea aciune antiangiogenez i antiinflamatoare asupra celulelor canceroase umane de colon HCT116. Efectul acestuia este mai intens dac este ncapsulat n particule de poliacizi (lactic i glicolic). Concentraiile de 6 g/ml de colorant (DCPIP) induc moartea celular prin apoptoz (Mondalek i col., 2010). Nanobiotehnologiile urmresc nu numai crearea de nano-vehicule pentru transportarea diferitor substane, dar i crearea i manipularea unor adevrate nano-motoare, utile n nanomanipulare celular. F1-ATP-aza este un veritabil nano-motor rotativ, a crei micri pot fi controlate cu ajutorul unor stimuli optici i chimici (Ristic i col., 2009). Sisteme particulare capabile de transport intit i eficient a diferitor substane, cu puine efecte adverse, se datoreaz probabil endocitozei transportorilor. Nanoparticule cationice formate din lipide cationice i polielectrolii s-au dovedit a fi crui exceleni pentru transportul amfotericinei B un antifungicid pentru Candida albicans (Vieira i Carmona-Ribeiro, 2008). Nanodiscurile de HDL (High Density Lipoprotein) sunt un strat bifosfolipidic cu aspect de disc (ND-HDL). Este cunoscut faptul c HDL este numit colesterolul bun deoarece este implicat n transportul moleculelor hidrofobe (colesterol) n fluxul sangvin care este un mediu hidrofil. Structura HDL (liporoteine cu densitate mare) este una simpl, fiind alctuit din fosfolipide i apolipoprotein (apo). Cea mai abundent form de lipoprotein din plasma sanguin uman este apoA-I, care este alctuit din 243 de aminoacizi, este bine caracterizat i la incubarea cu vezicule de fosfolipide n vitro formeaz HDL revers, capabil de transportul moleculelor hidrofobe (Ryan, 2010). Fosfolipidele cele mai frecvent utilizate pentru asamblarea veziculelor sunt DMPC (dimirisstoil-fosfatidil colina) i DMPG (dimirisstoil-fosfatidil glicerol). Incubarea acestor vezicule cu apoA-I se autoasambleaz ND-HDL. Aceste nano-discuri se pot autoasambla chiar dac nu este utilizat enzima integral, ci numai fragmente de apolipoproteine (Weers i col., 2001). ND-HDL reprezint astfel un mediu favorabil pentru studierea proteinelor transmembranare, transportul unor substane hidrofobe. 59

Stratul bilipidic este un mediu natural pentru proteinele transmembranare care i pstreaz proprietile sale conformaionale i activitatea. Suprafaa unui nanodisc cu diametrul de 20nm este de ~300 nm2, o suprafa suficient pentru integrarea ctorva molecule proteice. Avantajul utilizrii acestor structuri comparativ cu miceliile de detergeni, este c asigur un mediu natural apropiat, fr prezena detergenilor care pot schimba conformaiile proteinelor. ND-HDL au fost utilizate n studierea a numeroase proteine transmembranare cum ar fi bacteriorodopsina (Bayburt i col., 2006; Blanchette i col., 2008), citoromul p450 3A4 (Baas i col., 2004), toxina antraxului (Katayama i col., 2010), hidrogenaze enzime de membran produse de Pyrococcus furiosus care pot sintetiza H2 (Baker i col., 2009). ND-HDL au fost testate n utilizarea lor pentru transportul diferitor substane hidrofobe, care sunt insolubile n mediu sangvin hidrofil. Un exemplu n acest sens este transportul de ctre ND-HDL a amfotericinei B un potenial antifungicid care inhib creterea Saccharomyces cerevisiae i a altor fungi patogene, care administrat sub aceast form nu mai este toxic la anumite concentraii (Oda i col., 2006). ND-HDL ce conineau cucurmin (un polifenol hidrofob natural obinut din Curcuma longa) au inhibat creterea liniei celulare hepatice HepG2 comparativ cu administrarea curcuminei libere (Ghosh i col., 2010). O alt aplicaie a nanodiscurilor de HDL a fost ncorporarea de lipide cu ioni bivaleni de Ni2+, care au capacitatea de a fixa proteinele cu etichet de 6-His (histidine). Proteina din nveliul virusului West Nile (Fischer i col., 2010)

3. Bibliografie
1. Baas B. J., Denisov I. G., Sligar S. G., (2004). Homotropic cooperativity of monomeric cytochrome P450 3A4 n a nanoscale native bilayer environment, Archives of Biochemistry and Biophysics, 430(2), 218-28. Baker S. E., Hopkins R. C., Blanchette C. D., Walsworth V. L., Sumbad R., Fischer N. O., Kuhn E. A., Coleman M., Chromy B. A., Letant S. E., Hoeprich P. D., Adams M. W., Henderson P. T., (2009). Hydrogen production by a hyperthermophilic membrane-bound hydrogenase n water-soluble nanolipoprotein particles, Journal of the American Chemical Society, 131(22), 7508-7509. Baker P., Sawa Y., Shibata H., Sedelnikova S., Rice D., (1998). Analysis of the structure and substrate binding of Phormidium lapideum alanine dehydrogenase. Nature Structural Biology, 5, 561-67. Bayburt T. H., Grinkova Y. V., Sligar S. G., (2006). Assembly of single bacteriorhodopsin trimers n bilayer nanodiscs, Archives of Biochemistry and Biophysics, 450(2), 215-22. Blanchette C. D., Cappuccio J. A., Kuhn E. A., Segelke B. W., Benner W. H., Chromy B. A., Coleman M. A., Bench G., Hoeprich P. D., Sulchek T. A., (2008). Atomic force microscopy differentiates discrete size distributions between membrane protein

2.

3.

4.

5.

60

6.

7.

8. 9. 10.

11.

12. 13. 14.

15. 16.

17.

18.

19.

20. 21.

containing and empty nanolipoprotein particles, Biochimica et Biophysica Acta, 1788(3), 724-31. Boonstra B., Rathborne D. A., French C. E., Walker E. H., Bruce N. C., (2000). Cofactor regeneration by a soluble pyridine nucleotide transhydrogenase for biological production of hydromorphone. Applied Enviromental Microbiology, 66, 5161-66. Cabello C. M., Warner B. Bair W. B., Bause A. S., Wondrak G. T., (2009). Antimelanoma activity of the redox dye DCPIP (2,6-Dichlorophenolindophenol) is antagonized by NQO1, Biochemical Pharmacology, 78(4), 344-54. Chibata I., Tosa T., Sato T., (1976). Production of L-aspartic acid by microbial cells entrapped n polyacrylamide gels. Methods n Enzymology, 44, 739-746. Conde J., de la Fuente J. M., Baptista P. V., (2010). RNA quantification using gold nanoprobes - application to cancer diagnostics, Journal of Nanobiotechnology, 8:5. Deconttignies-Le Marchal P., Calderon-Seguin R., Vandecasteele J.,P., Azerad R., (1979). Synthesis of L-tryptophan by immobilized Escherichia coli cells. European Jornal of Applied Microbiology and Biotechnology, 7, 33-44. Delforge D., Devreese B., Dieu M., Delaivre E., Beeumen J., Remacle J., (1997). Identification of lysine 74 n pyruvate bineding of alanine dehydrogenase from Bacillus subtilis. Journal of Biological Chemistry, 272, 2276-84. Ghosh M., Singh A. T., Xu W., Sulchek T., Gordon L. I., Ryan R. O., (2010). Curcumin nanodisks: formulation and characterization, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, Honorat A., Monot F., Ballerini D., (1990). Synthesis of L-alanine and L-valine by enzyme system from Bacillus megaterium. Enzyme and Microbial Technology, 12, 515-20. Honorat-Pascal A., Monot F., Ballerini D., (1990). Coparative stady of the enzymatic synthesis of L-valine by purified enzymes, crude extract or permeabilized cells from Bacillus megaterium. Applied Microbiology and Biotechnology, 34, 236-41. Hummel W., Kula M-R., (1989). Dehydrogenases for the synthesis of chiral compounds. European Journal of Biochemistry, 184, 1-13. Fischer N.O., Infante E., Ishikawa T., Blanchette C.D., Bourne N., Hoeprich P.D., Mason P.W., (2010). Conjugation to nickel-chelating nanolipoprotein particles increases the potency and efficacy of subunit vaccines to prevent West Nile encephalitis, Bioconjugate Chemistry, 21(6), 1018-22. Fukui S., Ikeda S., Fujimura M., Yamada H., Kumagai H., (1974). Production of L-tryptophan, L-tyrosine and their analogues by immobilized tryptophanase and immobilized -tyrosinase. European Journal of Applied Microbiology, 1, 25-39. Fusee M., Swann W., Calton G., (1981). Immobilization of Escherichia coli cells containing aspartase activity with polyurethane and its application for L-aspartic acid production. Applied Enviromental Microbiology, 42, 672-76. Fusee M., Weber J., (1984). Immobilization by polyurethane of Pseudomonas dacunhae cells containing L-aspartat -decarboxylase activity and application to L-alanine production. Applied Enviromental Microbiology, 48, 694-98. Karsten W.E., Viola R.E., (1991). Kinetic studies of L-aspartase from Escherichia coli: pH-dependent activity changes. Archives of Biochemistry and Biophysics, 287, 60-67. Katayama H., Wang J., Tama F., Chollet L., Gogol E. P., Collier R. J., Fisher M. T., (2010). Three-dimensional structure of the anthrax toxin pore inserted into lipid nanodiscs and lipid vesicles, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 107(8), 3453-57.

61

22. Katoh R., Nagata S., Ozawa A., Ohshima T., Kamekura M., Misono H., (2003). Purification and characterization of leucine dehydrogenase from an alkaliphilic halophile, Natronobacterium magadii MS-3. Journal of Molecular Catalysis, 23, 231-38. 23. Mondalek F. G., Ponnurangam S., Govind J., Houchen C., Anant S., Pantazis P., Rama P Ramanujam R. P., (2010). Inhibition of angiogenesis- and inflammation-inducing factors n human colon cancer cells n vitro and n ovo by free and nanoparticle-encapsulated redox dye, DCPIP, Journal of Nanobiotechnology, 8:17, 1-9. 24. Monot F., Benoit Y., Lemal J., Honorat A., Ballerini D., (1988). Simultaneous production of amino acid dehydrogenase and glucose dehydrogenase by Bacillus megaterium and their utilization for L-valine synthesis with NADH regeneration. Biocatalysis, 2, 161-74. 25. Nagata S., Misono H., Nagasaki S., Esaki N., Tanaka H., Soda K., (1989). Thermostable alanine dehydrogenase of Bacillus sp.DSM730: gene cloning, purification, and characterization. Biochemistry, 71, 559-63. 26. Nagata S., Tanizawa K., Esaki N., Sakamoto Y., Ohshima T., Tanaka H., Soda K., (1988). Gene cloning and sequence determination of leucine dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus and structural comparison with other NAD(P)+-dependent dehydrogenases. Biochemistry, 27, 9056-62. 27. Norbert M., Brunhuber W., Blanchard J.S., (1994). The biochemistry and enzymology of amino acids dehydrogenases. Critical Reviews n Biochemistry and Molecular Biology, 29, 415-67. 28. Oda M. N., Hargreaves P. L., Beckstead J. A., Redmond K. A., van Antwerpen R., Ryan R. O., (2006). Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B, Journal of Lipid Research, 47(2), 260-67. 29. Ohshima T., Nishida N., Bakthavatsalam S., Kataoka K., Takada H., Yoshimura T., Esaki N., Soda K., (1994). The purification, characterization, cloning and sequencing of the gene for a halostable and thermostable leucine dehydrogenase from Thermoactinomyces intermedius. European Journal of Biochemistry, 222, 305-12. 30. Ohshima T., Wandrey C., Conrad D., (1988). Continous production of 3-fluoro-L-alanine with alanine dehydrogenase. Biotechnology and Bioengineering, 34, 394-97. 31. Ohshima T., Wandrey C., Kula M-R., Soda K., (1985). Impovement for L-leucine production n a continously operated enzyme membrane reactor. Biotechnology and Bioengineering, 26, 1616-18. 32. Oka M., Yang Y.S., Nagata S., Esaki N., Tanaka H., Soda K., (1989). Overproduction of thermostable leucine dehydrogenase of Bacillus stearothermophilus and its one-step purification from recombinant cells of Escherichia coli. Biotchnology and Applied Biochemestry, 11, 307-11. 33. Patra H.K., Banerjee S., Chaudhuri U., Lahiri P., Dasgupta A., (2007). Cell selective response to gold nanoparticles, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 3, 11119 34. Ristic Z., Vitali M., Duci A., Goetze C., Kemnitz K., Zuschratter W., LillH., Bald D., (2009). Two-stimuli manipulation of a biological motor, Journal of Nanobiotechnology, 7:3. 35. Ryan R. O., (2010). Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein, Journal of Nanobiotechnology, 8:28. 36. Schtte H., Flossdorf J., Sahm H., Kul, M. R., (1976). Purification and properties of formaldehyde dehydrogenase and fromate dehydrogenase from Candida boidinii. European Journal of Biochemistry, 62, 151.

62

37. Siranosian J.K., Ireton, K., Grossamn D.A., (1993). Alanine dehydrogenase (ald) is required for normal sporulation n Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 175, 6789-96. 38. Sondi I., and Salopek-Sondi B., (2004). Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E. coli as a model for Gram-negative bacteria, Journal of Colloid and Interface Science, 275, 17782. 39. Speshock J. L., Murdock R. C., Braydich-Stolle L. K., Schrand A. M., Hussain S. M., (2010). Interaction of silver nanoparticles with Tacaribe virus, Journal of Nanobiotechnology, 8:19. 40. Tosa T., Sato T., Mori T., Chibata I., (1974). Basic studies for continous production of L-aspartic acid by immobilized Escherichia coli Cells. Applied Microbiology, 27, 886-89. 41. Vieira D. B., and Carmona-Ribeiro A. M., (2008) Cationic nanoparticles for delivery of amphotericin B: preparation, characterization and activity n vitro, Journal of Nanobiotechnology, 6:6. 42. Weers P. M., Narayanaswami V., Ryan R. O., (2001). Modulation of the lipid binding properties of the N-terminal domain of human apolipoprotein E3, European Journal of Biochemistry, 268, 3728-35.

63

II. CULTURI CELULARE Culturi celulare

Lect. dr. Mircea Teodor Chiriac Cuprins
1. Prezentarea principiului tehnicii experimentale .................................................... 64 2. Prezentarea informaiilor care se pot obine pe diferite sisteme de studiu ............. 67 3. Prezentarea aparaturii disponibile i stabilirea parametrilor optimi de funcionare pentru diverse tipuri de experimente .................................................. 71 3.1. Echiparea laboratorului de culturi celulare ..................................................... 71 3.2. Strategii de lucru ............................................................................................ 74 3.3. Instruirea personalului ................................................................................... 75 3.4. Cultivarea celulelor ......................................................................................... 78 3.5. Separarea prin centrifugare a celulelor din mediul de cultur i stabilirea viabilitii acestora .......................................................................................... 78 3.6. nghearea i dezghearea celuluor .................................................................. 79 3.7. Subclonarea; tripsinizarea............................................................................... 81 4. Bibliografie ............................................................................................................. 81

1. Prezentarea principiului tehnicii experimentale

Multe dintre tehnicile introduse la un moment dat n diferite tiine au revoluionat felul n care acea tiin a fost perceput ulterior. Culturile celulare sunt un asemenea exemplu n biologie. Introducerea acestei tehnici n urm cu aproximativ 100 de ani a permis practic importul naturii n laborator, ceea ce a dus la standardizarea tehnicilor i generalizarea strategiilor de studiu ntre cercettorii din diverse instituii, urmat de o explozie informaional n lumea biologic. Avansarea cunoaterii bio-medicale din ultimele decenii nu ar fi fost posibil fr dezvoltarea printre altele a metodelor de lucru cu celulele. Cercetarea bio-medical actual folosete tehnicile de lucru cu celulele pentru investigarea unor probleme din domenii ca: biofizica, biochimie, biologie celular i molecular, genetica, biologia dezvoltrii organismelor, evolutionism, medicina molecular, farmacologia, bio-nano-tehnologia, inteligent drug design etc. 64

Este practic de neimaginat desfurarea activitii ntr-un centru de cercetare bio-medical lipsit de laboratorul de culturi celulare. Aplicaii curente sunt legate de: folosirea culturilor celulare pentru elaborarea vaccinurilor, producia glico-proteinelor recombinante (cytokine, hormoni, anticorpi monoclonali folosii n cercetare i clinica medical, interferoni, eritropoietina), testarea agenilor anticanceroi, studii de genomic, metabolism, apoptoz. ntr-un sens mai larg, cultura celular poate cuprinde cultura esuturilor i organelor. Pe de alt parte, celulele pot fi folosite ca i model pentru studiul rspunsurilor fiziologice la diferii factori de stres din mediu. Avansarea cercetrii din domeniul celulelor stem i lucrul cu celulele embrionare face posibil, deocamdat teoretic, cultivarea organelor i esuturilor cu aplicaii n bolile cronice degenerative, cancere i altele. Din punct de vedere al tipului de cultur se poate vorbi despre: - cultura de organe - presupune prelevarea i cultivarea unui organ n totalitate. Aceasta include i cultivarea unor embrioni ntregi; - cultura de esuturi - presupune prelevarea unor fragmente de esuturi i cultivarea lor; - cultura de celule - presupune prelevarea unor esuturi i digestia lor pentru obinerea unei suspensii unicelulare care este apoi cultivat mai departe. Dac ne referim la cultura de celule, exist trei tipuri de celule animale care sunt cultivate n laborator: primare, secundare i imortalizate (tabel 1).
Tabel 1. Caracteristicile celulelor primare, secundare i imortale/canceroase Proprieti Inhibiia de contact1 Fenotipul fa de situaia in vivo Genotipul fa de situaia in vivo Necesarul factorilor de cretere Difereniate Numr de diviziuni Timp necesar cultivrii Reproductibilitatea rezultatelor
1

primare da identic identic crescut da 2-3 crescut sczut

secundare da asemntor identic crescut da <100 sczut crescut

imortale/canceroase unele/nu asemntor/rotunde asemntor/diferit crescut/limitat da/nedifereniate nelimitat sczut crescut

n mod normal, celulele cresc n vasul de cultur pn cnd stabilesc contact cu vecinele lor, moment n care i opresc creterea. Celulele canceroase pierd aceast caracteristic fenotipic i dup ce ajung s fie confluente ncep s creasc una peste cealalt formnd ghemuri de celule uor de distins la microscopul optic.

65

Culturi primare Majoritatea celulelor din culturile primare necesit ancoraj. Cultivarea celulelor provenite din piele (keratinocite, fibroblaste) se face prin biopsierea esutului i formarea unei suspensii unicelulare. Aceste celule vor crete aderente de suprafaa vasului de cultur. Pentru a le separa de acesta i pentru separarea celulelor unele de altele se folosesc de obicei enzime proteolitice (tripsina). Pe de alt parte, cultivarea celulelor prelevate din sngele periferic se face ntr-o manier care nu necesit ancorarea acestora de pereii vasului de cultur. Este posibil ca celulele s formeze aderene ntre ele dar de obicei acestea sunt de o mic intensitate. Diferite substane (factori de cretere ai diferitelor populaii leucocitare i/sau mitogeni substane care stimuleaz mitoza) pot fi utilizate pentru diferenierea i nmulirea celulelor n cultur. Culturi secundare Prin subcultivarea celulelor dintr-o cultur primar se pot obine aa-numitele culturi secundare. Celulele dintr-o cultur secundar pot parcurge pn la 100 de diviziuni nainte de a-i pierde potenialul proliferativ. Dei nu prezint alterri ale setului de cromozomi (karyotipului), aceste celule acumuleaz anumite caracteristici fenotipice care le fac s devin o linie celular distinct. Pe lng derivarea culturilor secundare, subcultura are ca scop meninerea celulelor n faza logaritmic de cretere, evitarea confluenei care poate avea ca rezultat inhibarea creterii, ndeprtarea celulelor moarte i a produilor de metabolism celular i adugarea substanelor nutritive. Culturi de celule imortalizate Este posibil ca unele celule din culturile secundare s sufere anumite transformri care le confer caracterul de imortalitate adic posibilitatea de a se divide la nesfrit. Aceste celule pot aprea ca urmare a unor modificri (transformri) la nivelul cromozomului prin factori chimici, fizici (radiaii) sau biologici (virusurile oncogene). Unele dintre aceste celule imortale (transformate) pot avea caracter oncogenic; cu alte cuvinte transplantarea lor la animalele de laborator este urmat de apariia tumorilor la acestea. Dup cum se poate observa din tabelul 1, celulele canceroase au unele proprieti care le difereniaz de celelalte celule imortale necancreoase: nu mai prezint inhibiia de contact; pot crete cu mai puini nutrieni etc.

66

2. Prezentarea informaiilor care se pot obine pe diferite sisteme de studiu

Aplicaiile culturilor celulare i gsesc utilitatea n producerea: vaccinurilor (antirubeolic, antiparotidita epidemic, antivaricela, antirabic); hormonilor i factorilor de cretere (insulina, eritropoietina), factorilor de coagulare, enzimelor, anticorpilor monoclonali i altor substane imunomodulatoare (interferoni, interleukine), agenilor anticanceroi etc. Mai mult, dezvoltarea n ultimii ani a cunotinelor i tehnologiei de lucru cu celulele stem constituie una dintre temele cele mai actuale n domeniul biomedical. Este de ateptat ca acest domeniu s revoluioneze tratamentul diferitelor afeciuni. n plus, celulele animale sunt deosebit de utile n testarea citotoxicitii diferitelor substane incluznd noile terapii anticanceroase. Nu n ultimul rnd, prin folosirea tehnologiei AND-ului recombinat este posibil crearea celulelor transgene care constituie per se un model de studiu pentru investigarea metabolismului energetic, traficului de membran, ciclului celular, diferenierii, mbtrnirii i apoptozei. Anticorpii monoclonali Una dintre aplicatiile culturilor celulare cu cel mai mare impact pentru societate la ora actual este reprezentat de tehnologia de obinere a anticorpilor monoclonali prin folosirea hibridoamelor. Aceast tehnologie a fost pus la punct de ctre Milstein i Koehler n urma cu aproape patru decenii. n 1975 cei doi cercettori au publicat rezultatele prin care pot fi obtinui anticorpii monoclonali. Pe scurt tehnica presupune imunizarea unui animal de experien cu un antigen i recoltarea celulelor B (cele care produc anticorpii) la un anumit interval de timp dup imunizare (figura 1). Aceste celule sunt fuzionate apoi n prezena poli-etilen-glicolului (PEG) cu o linie celular canceroas de mielom (cancer al plasmocitelor). n urma acestei fuziuni, se formeaz celule hibrid (de unde i numele de hibridoame) dintre care unele produc anticorpii cu specificitatea dorit (caracter dobndit de la celula B a animalului imunizat) ntr-o manier continu (dobndind caracterul imortal de la celulele de mielom). Prin diferite metode de screening se pot gsi aceste celule care sunt ulterior subclonate dnd natere astfel unor linii celulare pure i stabile are produc anticorpii monoclonali. Datorit specificitii deosebit de mari (se consider c un anticorp poate distinge antigenul pereche ntre 108 molecule), anticorpii monoclonali i-au gsit foarte rapid aplicaii n domenii variate cum ar fi: diagnosticul i trata67

mentul clinic, cercetare fundamental i aplicat (metode de izolare a diferitelor substane recunoscute), catalizatori ai reaciilor chimice (abzymes). Folosirea terapeutic a anticorpilor monoclonali n diferite afeciuni umane urmeaz dou direcii: markeri diagnostici care pot identifica diferite tipuri de antigene din populaii celulare in vivo i terapia intit a diferitelor afeciuni n care anticorpului monoclonal i sunt ataate substane chimice toxice sau radioactive.
antigen

PEG

HAT

Screening

Subclonare

Linie celular producatoare de anticorp monoclonal

Figura 1 Producerea anticorpilor monoclonali

Splina este izolat la cteva saptmni (timp necesar pentru mbogirea repertoriului de celule B specifice) dup imunizarea animalului cu antigenul fa de care se dorete producerea anticorpilor monoclonali. Celulele B sunt izolate i combinate cu mieloamele (partea stng) n prezena PEG care mediaz fuziunea celulelor. Celulele hibrid sunt singurele care vor supravieui n mediul suplimentat cu Hypoxanthine Aminopterin Thymidine (HAT). Screeningul face posibil identificarea coloniilor care produc anticorpi fa de antigenul dorit. Urmeaz apoi subclonarea realizat prin diluarea celulelor din coloniile productoare n aa fel nct fiecare 68

recipient s conin teoretic o singur celul. Se obin n acest fel colonii n care toate celule provin dintr-o singur celul mam i deci vor produce acelai anticorp ca i aceasta. Aceast abordare a permis medicilor oncologi s obin rezultate spectaculoase n diferite forme de cancere. Se poate vorbi la ora actual de cancere tratate cu anticorpi monoclonali n care pacienii supravieuiesc fr recidiv la 30 de ani de la administrarea terapiei. Dei nu sunt toxici, anticorpii monoclonali produi n oarece prezint neajunsul de a fi strini organismului uman. Ajuni n organism aceti anticorpi ca orice alt substan strin iniiaz un rspuns imun din partea gazdei care se poate manifesta prin secreia de anticorpi umani anti-anticorpi monoclonali de oarece. Cu timpul anticorpii umani pot neutraliza i distruge anticorpii monoclonali injectai anulndu-le efectele terapeutice. Din acest motiv, n ultimii ani, anticorpii de oarece au fost umanizai. Tehnologia ADN-ului recombinat a fcut posibil ataarea prii specifice (cea care recunoate antigenul) derivat de la oarece cu un bra constant (care consituie cea mai mare parte) de la om. Exist la ora actual i peste 30 de anticorpi monoclonali folosii ca i agenti terapeutici n diferite afeciuni umane; numrul celor aflai n diferite stadii de testare depete 100. Celule stem Urmtorul pas n revoluia din domeniul biomedical a fost reprezentat de posibilitatea cultivrii celulelor stem n laborator. Prin definiie celulele stem sunt acele celule care prin diviziune dau natere unei celule fiic identic i unei alte celule care poate fi diferit. Dup sursa de provenien exist dou tipuri de celule stem: celule stem embrionare i celule stem adulte. Dup numrul de precursori ai liniilor difereniate pe care le poate produce, celule stem pot fi clasificate n: totipotente, pluripotente, multipotente, oligopotente. Dup cum implic numele, celulele totipotente sunt capabile s formeze un organism n totalitate. Aceste celule sunt reprezentate de ctre ovulul fertilizat i celulele obinute din primele diviziuni ale acestuia. O schi a diferenierii celulare se gsete n figura 2. Cele mai bine studiate celule stem sunt cele derivate din mduva osoas i care constituie precursorii tuturor celulelor din snge. Interesul major pentru biologia celulelor stem este explicat de potenialul de difereniere al acestora n orice tip de esuturi i organele dintr-un organism. Dei cercetarea n acest domeniu este relativ la nceput, cercettorii au reuit s izoleze i cultive cu succes 69

anumite celule stem din diferite surse unele dintre ele fiind apoi difereniate n numeroase celule finale. Pe lng potenialul terapeutic enorm, celulele stem prezint i aplicaii diagnostice. Este posibil ca una dintre cele opt celule ale embrionului rezultat n urma fertilizrii in vitro a unui ovul s fie ndeprtat i analizat din punct de vedere genetic (celula este dispensabil deoarece restul celulelor rmase refac embrionul). n urma analizelor care pot s depisteze diferite defecte genetice se poate decide neimplantarea embrionului n uterul viitoarei mame. Folosirea acestor celule face posibil i obinerea animalelor modificate genetic prin introducerea unor gene n embrionul tnr. Se pot produce astfel animale chimera care exprim genele implantate n diferite organe. Dac aceste organe sunt chiar gonadele, atunci urmaii unei mperecheri dintre doi astfel de oareci chimera pot produce un knock-out/knock-in pentru acea gen. Dei deosebit de atractiv, tehnologia cultivrii celulelor stem embrionare este puternic ngrdit de normele actuale ale eticii cercetrii.
Celula stem Pluripotent

Celula stem Multipotent

Celula stem cu potenial limitat

Celula difereniat Parial Celula difereniat final, postmitotic

Figura 2 Celulele stem pot da nastere unui numar mare de celule diferentiate final

70

Disputele asupra aspectelor etice ale lucrului cu celule stem embrionare au ncurajat dezvoltarea tehnicilor de lucru cu celulele stem adulte. Rmne de vzut dac potenialul unor astfel de celule stem adulte este la fel de nelimitat ca i al celor embrionare. Recent au fost descrise i celule stem canceroase. Aceast nou descoperire pune sub semnul ntrebrii principiile actuale care stau la baza tratamentului cancerului. Existena acestor celule canceroase stem poate explica apariia recidivelor prin participarea unui numr redus de celule care nu pot fi distinse/distruse prin tehnicile actuale. Experimental s-a dovedit c un numr de doar 200 de celule considerate ca fiind celule stem canceroase este suficient pentru a transfera cancerul de la un animal la un altul n timp ce un numr de cteva sute de ori mai mare de celule canceroase care nu prezint caracteristicile celulelor stem sunt incapabile s transfere boala. Succesul n lucrul cu celule depinde de factori variai cum ar fi: utilarea laboratorului, calitatea celulelor i a reactivilor, tehnica asepteic (prezentate n cele ce urmeaz) i experiena personal a operatorului care contribuie decisiv la primele trei.

3. Prezentarea aparaturii disponibile i stabilirea parametrilor optimi de funcionare pentru diverse tipuri de experimente
3.1. Echiparea laboratorului de culturi celulare
Organizarea general a laboratorului de culturi celulare include urmtoarele echipamente de baz (figura 3): a. Hota cu flux laminar Servete lucrului efectiv cu celulele; aranjarea spaiului de lucru este descris n figura 4; este prevazut n mod obligatoriu cu o lamp de UV care va fi pornit 5-10 minute nainte de nceperea lucrului i repornit pentru 5-10 minute dup ncheierea lucrului; tipul de hot folosit pe scar larg n cultura celulelor animale este hota cu flux de aer vertical care ofer o protecie bun att pentru celule ct i pentru operator. b. Incubator cu sursa de CO2 creterea celulelor; n funcie de tipul de celulp, concentraia de CO2 este n general ajustat ntre 5% i 7% pentru a obine un sistem tampon optimal n combinaie cu substanele din mediul de cultur; 71

responsabil pentru meninerea unei atmosfere sterile (filtre HEPA, high efficiency particulate air), umede i cu temperatura constant.

c. Microscop optic inversat cu contrast de faz (opional aparat foto) servete la observarea celulelor; deoarece n cultura de celule animale, celulele sunt n general situate pe suprafaa bazei recipientului se folosete microscopul inversat; contrastul de faz mbuntete vizualizarea specimenelor transparente (celulelor). d. Centrifuga de mas cu rcire centrifugarea suspensiilor de celule n diverse scopuri. e. Recipient cu azot lichid stocarea celulelor pe termen lung; de obicei se gsete ntr-o incint anexat; o precauie deosebit trebuie acordat faptului c recipientul este extrem de rece (-196 grade Celsisus) i azotul poate produce arsuri n urma contactului cu pielea sau mucoasele; de aceea este necesar utilizarea echipamentului de protecie (ochelari/masc facial, manui, halat). f. Frigider/congelator stocarea reactivilor L-glutamina etc.) (medii cultur, stocuri de antibiotice,

Alte componente Baie de ap o pstrarea mediilor i altor reactivi la temperatura de 37 grade Celsius; o o alternativ este nlocuirea apei cu perle metalice care prezint urmtoarele avantaje: reducerea contaminrii reactivilor cu care vin n contact, igienizare uoar, economisirea consumului de energie, stabilitate n timp. Autoclav i sterilzor cu aer uscat o Folosite pentru sterilizarea diferitelor soluii i recipiente folosite. Pompa de vid i sisteme de sterilfiltrare o pentru lichidele instabile la autoclavare (de ex. DMSO) se poate folosi i ca sistem de aspirare a mediilor folosite.

72

Figura 3. Organizarea laboratorului de culturi celulare

Consumabile pipete serologice, pot fi din plastic (de unic folosin) sau din sticl (refolosibile dup sterilizare); vase de cultur - codate n funcie de aria util de cultivare i de volumul maxim de mediu care poate fi coninut; medii de cultur (multe celule pot fi cultivate n DMEM/RPMI+10%FBS la care se adaug diferite concentraii de L-glutamina i antibiotice); 73

Conologic se poate vorbi de existena a dou categorii de medii; cele naturale care includ serul sanguin i alte secreii de origine animal i medii sintetice n care componentele de baz sunt produse separat i apoi amestecate de obicei de ctre firme specializate. Chiar dac este vorba de un mediu sintetic, cu unele excepii serul este considerat un component de baz. La ora actual, serul provine de la animale mari, n general de la vac - de unde i numele de fetal bovine serum (FBS). Mediile de cultur sunt soluii saline tamponate. Compoziia mediilor de cultur este complex incluznd: aminoacizi, acizi grai, carbohidrai, sruri, microelemente, vitamine, hormoni, factori de cretere i alte componente. Cele mai multe medii conin i phenol red, un indicator al pH-ului care trebuie s rmn ntre 7 i 7,4. Dac acesta vireaz spre galben indicnd un mediu acid este cazul ca mediul s fie schimbat. suplimente pentru mediile de cultur: antibiotice uzual se folosete un ameste de penicilin/streptomicin, L-glutamin, Na-pyruvat, bicarbonat, glucoz i altele n funcie de particularitile experimentului.

3.2.Strategii de lucru
Din punct de vedere tehnic, exist cteva principii de baz ale lucrului cu celulele: culturile celulare vor fi fcute ntr-o camer dedicat acestui scop. Este de dorit ca aceast ncapere s fie oarecum izolat fa de restul laboratoarelor pentru a limita riscul de contaminare. Tot din acest motiv, accesul personalului n aceast camer va fi restricionat pe ct posibil; de aceea se va permite doar accesul celor care sunt direct implicai n procesul de lucru cu celulule; personalul care urmeaz s lucreze cu celulele va fi instruit corespunztor (vezi mai jos); acele ncperi care sunt dedicate lucrului cu celule prezint risc infecios pentru cei implicai; de aceea ncperile vor fi semnalizate corespunztor; toate mediile i suplimentele care urmeaz a fi folosite n cultura celular trebuie s fie certificate pentru lucrul pe culturi de celule (indicaia cell culture certified/approved trebuie s apar pe ambalaj/descrierea produsului); toate acestea trebuie adaptate liniilor celulare cu care urmeaz a se lucra n laborator; spre deosebire de celulele vegetale i bacterii, celulele animale sunt pretenioase n ceea ce privete condiiile n care pot sa creasc; exist riscul contaminrii cu diferite microorganisme care datorit ratei 74

de cretere mult superioar celulelor animale vor deveni majoritare n scurt timp; n plus factori ca spre exemplu temperatura (37 de grade Celsius pentru celule mamifere), pH-ul, osmolaritatea (290-310mOsm), i o concentraie a CO2 ntre 5 i 7% condiioneaz clutura celulelor animale (sistemul de tampon cel mai frecvent utilizat este cel cu bicarbonat de sodiu sau potasiu din mediul de cultur + CO2 din incubatorul folosit); celulele animale sunt limitate n ceea ce privete numrul de generaii pe care le produc. Chiar i n condiii optime, celulele animale se vor opri din cretere dup un numr de generaii care depinde de sursa primar a celulelor; creterea celulelor animale urmeaz o curb cu trei faze: o faza de echilibrare (primele 24h) n care celulele se acomodeaz cu noul mediu n care sunt introduse; o faza de cretere exponenial care dureaz n jur de 7-10 zile; o faza de inhibare a creterii datorit inhibiiei de contact, creterii densitii peste un nivel critic, scderii potenialului de metabolizare a mediului; substanele pot fi prenclzite fie la 22, fie la 37 grade Celsius (10-20 min e suficient; se poate porni un cronometru pentru a evita uitarea mediilor pentru un timp ndelungat i degradarea lor (L-glutamina, tripsina).; lucrul bine organizat i desfurat fr grab este esenial pentru o eficien maxim: o micrile vor fi msurate i sigure; o imediat dup adugarea suplimentelor n mediile de cultur se noteaz acest fapt pe recipientul respectiv; o nimic din ceea ce vine n contact direct cu celulele nu se deschide n afara hotei sterile; nainte de scoaterea din hot se verific etaneitatea nchiderii.

3.3. Instruirea personalului

Cultivarea celulelor este un lucru care se poate nvaa repede. Cu alte cuvinte, oricine poate nvaa s menin culturile de celule dup doar cteva zile petrecute n laborator dac respect protocoalele i are la dispoziie echipamentul necesar. Singurul lucru care este i mai uor i nici mcar nu necesit nvatare este s contaminezi celulele. De aceea desfurarea activitii n linite este esenial n laboratorul de culturi celulare. Odat aparut, contaminarea se poate propaga din aproape n aproape i duce n final la compromiterea nu doar a celulelor la care contaminarea a fost iniial sem75

nalat ci a ntregului stoc de celule. Pe lng considerentele financiare, contaminarea recipientelor cu coninut original (celule produse n laborator i care nu pot fi achiziionate de la companiile specializate sau transferate de la ali investigatori) reprezint cel mai neplcut aspect care poate afecta un laborator de culturi celulare. Toi cei care urmeaz s lucreze cu celule vor fi n prealabil instruii teoretic nainte de a ptrunde pentru prima dat n laborator. Practic, ei vor ncepe prin a observa manoperele de lucru i a le discuta cu un coleg familiarizat deja cu tehnicile. Doar dup aceast perioad este permis lucrul direct, mai nti sub supravegherea direct a celor familiarizai i mai apoi n mod independent. Chiar i dup ctigarea independenei n lucru, cel proaspt iniiat va fi supravegheat din umbr de ctre un coleg cu experien care ar putea observa anumite manopere executate neconform cu normele curente. Asigurarea asepsiei i antisepsiei Exist anumite msuri care asigur igiena n lucrul cu celulele: Utilizarea echipamentului de protecie - pentru evitarea contaminrii celulelor i operatorului: o halat cu mneci lungi o pantofi nchii o mnui de unic folosin Splatul pe mini nainte i dup lucrul cu celulele; O soluie antimicrobian1 de ethanol 70% trebuie s fie n permane la ndemn; Instrumentele de lucru trebuie igienizate la intervale regulate. Orice obiect (pipeta, recipient etc.) care urmeaz s fie introdus n hota pentru lucrul steril trebuie dezinfectat nainte sau imediat dup introducere; Orice pipet trebuie folosit o singur dat2; nu este permis pstrarea pipetei n mediu sau folosirea unei pipete pentru a transfera mediu de la un recipient la altul; Orice mediu sau obiect contaminat din greeal va fi aruncat3; Orice lichid care ajunge n contact cu suprafaa de lucru steril va fi ndeprtat imediat cu ajutorul unui prosop de hrtie mbibat n ethanol 70%;
1 n categoria substanelor cu efect antimicrobian sunt incluse alturi de antisepticele aplicate pe esuturi vii, antibioticele care acioneaz n interiorul organismului i de asemenea dezinfectantele care distrug microorganismele aflate pe suprafeele neaparinnd fiinelor vii. 2 Excepie fac pipetele de sticl care pot fi splate i sterilizate. 3 Este vorba despre acele medii/suplimente/alte substane care nu mai pot fi sterilizate (fie prin sterilfiltrare fie prin autoclavare) i respectiv obiecte care nu mai pot fi sterilizate.

76

Este necesar investigarea strii de sntate a celulelor n fiecare zi. Se pot astfel observa caracteristicile normale sau abateri de la acestea. Se pot de asemenea observa contaminri cu alte celule sau microorganisme. Se pot lua probe care sunt analizate pentru stabilirea prin diferite tehnici a gradului de puritate/contaminare.

Organizarea spaiului pentru lucrul steril Pentru reducerea la maxim a pericolului de contaminare este esenial aranjarea locului de munc sub hot ntr-un mod care s evite ncruciarea minilor deasupra vaselor de cultur/mediilor. Pentru organizarea eficient a mesei de lucru se poate consulta figura 4. Trebuie evitat suprancrcarea spaiului de lucru care poate duce pe de o parte la blocarea fluxului de aer i pe de alt parte la accidente nedorite care pot produce contaminarea celulelor sau reactivilor.

WASTE

Figura 4 . Organizarea spaiului de lucru steril

Figura prezint organizarea de baz a spaiului, aa cum este ea ntalnit n mod frecvent n majoritatea laboratoarelor. Figura nu este la scal. Figura corespunde pentru persoanele care folosesc cu precdere mna dreapt. Linia din fa: Dreapta pipeta/pompa aspirare medii prevazut la capt cu pipet de unic folosin Centru recipientul cu celule n plan posterior: Stnga vasele cu resturi lichide i respeciv solide etichetate corespunztor 77

Dreapta mediile de cultur Centru- suport pentru tuburi n afara hotei la ndeman - pipete serologice de diferite mrimi; flacon cu ethanol 70%.

3.4. Cultivarea celulelor

dup felul n care cresc n flacoanele de cultur, celulele eucariote pot fi mparite n dou mari categorii: cele care cresc aderent pe vasul de cultur i cele care cresc n suspensie. Modul de lucru este asemntor pentru toate celulele dar exist anumite particulariti de care trebuie inut cont n cazul fiecrei grupe; evaluarea celulelor se face n mod normal n fiecare zi prin vizualizarea lor sub microscopul optic; celulele care cresc aderent trebuie s apar distribuite pe suprafaa de contact cu vasul n care cresc i de cele mai multe ori capt o form poligonal, iar celulele care cresc n suspensie rmn rotunde i uneori (n funcie de linia cultivat) pot forma aglomerri de celule (asemntor cu o ciorchin de struguri); starea de sntate a celulelor este confirmat i de creterea numrului de la o zi la alta; o evaluare de prim instan a celulelor se realizeaz prin vizualizarea macroscopic a culorii mediului din sticlele de cultur; culoarea standard a mediilor este rou-orange; o culoare care vireaz spre galben indic necesitatea schimbrii mediului; subcultivarea celulelor: deoarece aglomerarea celular poate influena negativ vitalitatea celulelor (a se vedea mai sus), se recomand ca celulele s fie subcultivate; aceast procedur care se aplic n faza logaritmic de cretere a celulelor permite obinerea unor cantiti crescute de celule prin mprirea/transferul acestora dintr-un recipient de cultur n mai multe recipiente fiecare reprezentnd o nou surs de celule; exist anumite formule de calcul care permit aflarea cu precizie a combinaiilor optime; de asemenea se pot planifica n acest fel anumite experimente pentru anumite date; n anumite situaii este nevoie de utilizarea unor soluii de tripsina/EDTA pentru crearea suspensiilor unicelulare (vezi Tripsinizarea).

3.5. Separarea prin centrifugare a celulelor din mediul de cultur i stabilirea viabilitii acestora
Pentru a subcultiva celulele/folosi celulele ntr-un anumit protocol este nevoie de stabilirea numrului de celule pe unitatea de volum. Mediul de 78

cultur coninnd celulele este transferat unor tuburi n care se centrifugheaz (centrifuga trebuie echilibrat n prealabil - dac avem un singur tub cu celule va trebui s folosim un al doilea tub cu aceeai greutate care poate s conin ap distilat sau orice alt lichid cu densitate asemntoare). Pentru o separare bun este nevoie de 10 minute la 200-250g/min (ntr-o centrifug de mas cu rotor standard 1000rpm). Celulele vor sedimenta ca i n figura 5. Dup centrifugare celulele se resuspend n mediu proaspt i apoi 10 microlitri sunt combinai cu 10 microlitri de soluie Trypan blue 0,5% i pipetate n camera de numrat. Sub microscopul optic, leucocitele apar ca i celule glbui/transparente cu o membran brun. Soluia de trypan blue va ptrunde n celulele moarte care apar albastre. n funcie de tipul camerei de numrt, exist formule de calcul dup care putem s aflm numrul total de celule. O viabilitate de peste 90-95% este n general acceptat pentru toate manipulrile ulterioare.

Figura 5 . Aspectul celulelor n tub dup centrifugare

3.6. nghearea i dezghearea celuluor

Doi pai critici ai lucrului cu celulele sunt constituii de ctre nghearea i dezghearea celulelor. nghearea este indispensabil din urmtoarele considerente: Celulele sunt supuse n permanen variaiilor n compoziia cromozomilor. De aceea cea mai sigur metod de prezervare a liniilor celulare este cryoprezervarea care oprete procesele metabolice nelsnd astfel loc modificrilor genotipului. n plus, cryoconservarea este o metod practic din punct de vedere economic: este mult mai simplu s pstrezi un tub cu celule ngheate care nu au nevoie dect de o completare periodic a rezervei de azot dect s cultivi n mod repetat celulele n laborator; de aseme79

nea transportul ntre laboratoare este mai uor dac celulele sunt ngheate. Nu n ultimul rnd, metoda face posibil revenirea la celule cu un numr mai mic de pasaje. Este esenial ca nainte de nceperea procedurii respective s notm urmtoarele detalii pe fiecare tub: tipul de celul, numrul de celule, numrul de pasaj i data la care a fost creat stocul. nghearea4 va fi lent i constant pentru a minimaliza efectele adverse asupra viabilitii celulelor. Mediul de ngheare5 cel mai frecvent folosit conine mediul de cultur recomandat pentru linia celular + 20% FCS + 5-10% cryoprotector -Dimethyl sulfoxid (DMSO) sau 10-15% glycerol care are rolul de a scdea temperatura de nghe permind apei s ias din celul i mpiedicnd astfel formarea cristalelor de ghea care ar putea distruge membrana. Dup centrifugarea i verificarea vitalitii (se recomand folosirea celulelor vitale n proporie de >90-95% la colorarea cu trypan blue), celulele vor fi resuspendate direct n mediul de ngheare rcit n prealabil la 4 grade la o concentraie de 1x106-1x107/ml6 i transferate imediat7 la -20 de grade C pentru 1-2 ore. Urmeaz apoi transferul peste noapte la -80 de grade Celsius i apoi stocarea de lung durat n azot lichid. Dezghearea celulelor trebuie fcut extrem de rapid (ideal n mai puin de un minut) prin transferul acestora din recipientul cu azot, pe gheaa uscat, direct n baia de ap la 37 de grade Celsius. Odat ce dezghearea permite pipetarea suspensiei (>75% dezgheat) aceasta se transfer ntr-un tub de 15ml peste care se adaug pictur cu pictur8 o cantitate de mediu prenclzit echivalent cu de dou-trei ori cantitatea suspensiei, dup care se poate aduga mai rapid mediu pn la 10ml. Se centrifugheaz n general la 200rpm timp de 2-5 min pentru a elimina urmele mediului de ngheare. Se resuspend n 10 ml de mediu i se transfera n sticlele de culturp etichetate. Prin micri fine se distribuie celulele. Dup cteva ore (cel trziu a doua zi dimineaa) se verific starea celulelor prin vizualizarea la microscop. Mediul va fi schimbat pentru a nltura celulele moarte i resturile de cryoprotector (DMSO sterilfiltrat sau glycelor - autoclavat).
Exist dispozitive speciale care permit coborarea temperaturii cu un grad pe minut. Exist linii celulare la care se prefer folosirea altor substane n locul DMSO. 6 Numrul de celule/aliquot variaz n funcie de tipul de celule; este important s avem o suspensie omogen unicelular. 7 DMOS este toxic pentru celuele la temperatura camerei. De aceea trebuie limitat contactul acestuia cu celulele. 8 Pentru a preveni socul osmotic; la ngheare apa iese din celule unde presiunea osmotic va crete.
4 5

80

3.7. Subclonarea; tripsinizarea

Celulele formeaz aderene ntre ele i suprafaa vasului de cultur (celule aderente) i/sau ntre ele (celulele aderente, unele celule care cresc n suspensie). Pentru cele mai multe protocoale/manopere este necesar obinerea unei suspensii unicelulare. Cea mai frecvent combinaie folosit n acest scop este tripsina/EDTA. Dac este vorba de celule aderente protocolul de lucru presupune ndeprtarea mediului, splarea cu o soluie salin tampon fr9 calciu i magneziu i adugarea unei cantiti de trispin/EDTA care s acopere stratul de celule. Celulele nu trebuie lsate neacoperite timp ndelungat. Pentru a ajuta separarea este posibil uoara btaie a sticlei de podul palmei. Urmrind sub microscop separarea celulelor (dureaz cteva minute) se poate evita efectul nociv al unei incubri prea ndelungate. Celulele devin rotunde odat ce pierd aderenele. Imediat, aciunea trispinei este antagonizat prin adugarea de ser urmat de transferul ntr-un tub adecvat i centrifugarea. Dup centrifugare celulele sunt resuspendate n mediu pentru a obine o suspensie unicelular i apoi numrate/investigate la microscop prin colorarea cu trypan blue (proporia celulelor moarte). Dac tripsinizarea s-a fcut n cadrul protocolului de subcultivare, celulele sunt apoi transferate vaselor noi de cultur i incubate pn a doua zi. A doua zi se recomand schimbarea mediului care permite nlturarea celulelor moarte i a resturilor de tripsin/EDTA. Dac manopera s-a fcut n alt scop, se urmeaz paii din protocolul respectiv. La celulele neaderente nu se face tripsinizarea; celule pot fi direct numrate iar densitatea lor este ajustat prin adugarea mediului proaspt. La fiecare 2-4 sptmni se centrifugheaz i resuspend celulele neaderente n mediu proaspt.

4.Bibliografie
1. 2. 3. 4. 5. 6. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique; Freshney RI, John Wiley & Sons 5th Edition 2005 Molecular Biology of the Cell 4th ed., Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P - Garland Science, 2002 Short Protocols n Cell Biology 1st ed., Bonifacino JS, Dasso M, Harford JB, Lippincott-Schwartz J, Yamada KM, John Wiley & Sons 2004 Zell- und Gewebekultur 4. Auflage, Lindl T, Spektrum Akademischer Verlag 2000 www.protocol-online.org www.invitrogen.com

Acesti ioni pot scadea eficiena tripsinei/EDTA

81

Culturi celulare partea a II-a

Lect. dr. Mircea Teodor Chiriac

Cuprins
1. Studiul de literatur privind cercetri exploratorii recente ................................... 82 1.1. Producerea proteinelor recombinate n celule mamifere.................................. 88 1.2. Anticorpii monoclonali bio-nano-functionalizai ............................................ 88 2. Adaptarea/importul acestora la tematicile de cercetare ale platformei ................... 93 3. Recomandri pentru abordarea de noi tipuri de experimente i metodologii ......... 94 4. Bibliografie ............................................................................................................. 99

1. Studiul de literatur privind cercetri exploratorii recente

Culturile celulare reprezint una dintre cele mai puternice tehnologii/metodologii utilizate de ctre comunitatea tiinific internaional din domenii ca: biofizic, biochimie, biologie celular i molecular, genetic, biologia dezvoltrii organismelor, evoluionism, medicina molecular, farmacologia, bio-nano-tehnologia, inteligent drug design etc. De asemenea dezvoltarea industriei farmaceutice a profitat din plin de avansarea tehnicilor de lucru cu celulele. n acest context, culturile celulare sunt folosite fie ca mini-bioreactoare pentru producerea diverselor produse biotehnologice fie ca i model organismic pentru testarea efectelor/toxicitii noilor medicamente. Dintre aplicaiile moderne ale culturilor celulare, vom discuta n cele ce urmeaz folosirea celulelor ca i entiti de producie a proteinelor recombinate cu aplicaii n autoimunitate i producerea i caracterizarea anticorpilor monoclonali bio-nano-funcionalizai cu aplicaii n cancere i boli autoimune. Imunologia este tiina care se ocup cu studiul sistemului imun. Acesta este reprezentat de ctre totalitatea celulelor, esuturilor i proceselor biochimice care au funcia de a ne proteja fa de efectele nedorite ale agenilor patogeni din mediu i/sau aciunii duntoare a structurilor proprii 82

alterate (cum ar fi celulele tumorale). Din punct de vedere didactic, rspunsul imun poate cuprinde dou variante: rspunsul nnscut care reprezint o prim barier ntmpinat de ctre agenii patogeni venii din afar (acest tip de rspuns apare pe scara evolutiv nc de la bacterii i plante i este pstrat i la mamiferele superioare inclusiv la om); rspunsul adaptativ numit i specific care este iniiat atunci cnd rspunsurile nnscute nu reuesc s produc efectul dorit. Rspunsurile adaptative apar pentru prima dat pe scara evolutiv la petii cartilaginoi ca o completare a sistemului imun nnscut. Se poate vorbi n acest context despre o mprire judicioas a sarcinilor n sistemul imun al mamiferelor. Exist aa-numitele celule, cum ar fi granulocitele, celulele natural killer etc. care aparin sistemului imun nnscut i alte celule cum sunt limfocitele care aparin sistemului adaptativ. Deoarece sistemul imun adapatativ nu apare n urma unui salt brusc de la sistemul imun nnscut, exist diferite structuri care asigur trecerea lin de la un sistem la altul asigurnd astfel o continuitate ntre cele dou sisteme. Celulele ca i macrofagele, celulele dendritice, celulele B1, NKT sunt considerate a fi cele care prin diveri receptori i ci de semnalizare celular fac posibil comunicarea ntre sistemul adaptativ i cel nnscut. Datorit diversitii extraordinare pe care mediul o ofer, exist diverse mecanisme care au evoulat cu timpul pentru a satisface cu eficien maxim rezolvarea fiecrei situaii ivite. Se vorbete despre un sistem imun cu componente umorale adic cel n care produii celulelor imune circul prin snge sau secreii (lacrimi, sudoare etc.) ntr-o form finit, de sine stttoare i cel cu componente celulare n care celulele sunt cele care ndeplinesc funcia major de aprare (Figura 1, Tabel 1). Dup cum menionam anterior, funcia sistemului imun este s ne protejeze fa de patogenii din mediu i fa de structurile proprii modificate. n ciuda specificitii remarcabile a rspunsurilor imune, recunoaterea structurilor strine se face ntr-un mod indirect. Acest fapt permite apariia unor erori care au ca i rezultat declanarea unor reacii mpotriva propriilor structuri, fenomen caracteristic bolilor autoimune. Dei mecanismul apariiei acestor boli nu este pe deplin neles, exist din ce n ce mai multe date care au permis elaborarea unor teorii i modele experimentale care s-au dovedit utile n caracterizarea acestor boli. Se consider c bolile autoimune constituie un grup heterogen de afeciuni care apar la aproximativ 5% din populaie. Ele pot fi clasificate n boli specifice pentru anumite organe aa cum este spre exemplul pemfigusul vulgar care intereseaz pielea 83

Th

Imunitate nnscut
Imunitate adaptativ
Granulocyte, celule natural killer, macrofage, sistem complement

Tc B (Ig)

Figura 1 Organizarea ierarhic a sistemului imun al mamiferelor. La mamifere, sistemul imun este organizat ierarhic n sensul ca exist o unitate de control care integreaza informatiile primite de la toate celelalte componente i pe baza lor stabilete care este cea mai bun soluie de urmat. Acest centru de control i decizie este reprezentat de ctre celula (limfocitul) T helper (Th). Acesta primete informaii de la sistemul imun nnscut, coordoneaza activarea sistemului imun adaptativ i controleaza mecanismele efectoare ale sistemului innascut inchizand astfel circuitul. Exista totodata schimburi directe intre sistemul innascut i cel adaptativ care au loc cel mai adesea prin intermediul citokinelor, produsi de secretie ai celulelor imune care mijlocesc schimbul de informatii intre acestea (sageata cu doua sensuri).

Tabel 1 Componente ale sistemului imun al mamiferelor

Linia de aprare Primar = imunitatea nnscut Secundar = imunitatea dobndit (adaptativ sau specific)
1

Imunitate celular Granulocite, NK, 1 Limfocitele B i limfocitele T

Imunitate umoral Sistemul complement, Peptide antimicrobiene Anticorpii (imunoglobulinele)

celulele dendritice i monocitele/macrofagele aparin didactic imunitii nnscute dar se gsesc din punct de vedere funcional la grania dintre acesta i sistemul adaptativ n sensul c fac legtura dintre antigen i centrul de comand reprezentat de limfocite.

i mucoasele, diabetul zaharat de tip I care afecteaz celule beta ale pancreasului sau tiroidita Hashimoto care apare la glanda tiroida, i boli autoimnune generalizate care intereseaz mai multe organe sau esuturi aa cum este spre exemplu lupusul sistemic eritematos n care unul dintre au84

toantigenele int este reprezentat de cromatina [1]. Deoarece cromatina se gsete practic n toate celulele nucleate, bolile din grupa celor generalizate au tendina de a se croniciza, adic rspunsul autoimun este ntreinut n permanen de existena unui anumit nivel rezidual al autoantigenului. Fie c este vorba despre boli specifice de organ fie c este vorba despre cele generalizate, lipsa unei nelegeri depline a mecanismelor care iniiaz i mai apoi ntrein distrucia esuturilor proprii se repercut nefavorabil asupra prognosticului i totodat calitii vieii celor afectai. La ora actual, majoritatea pacienilor sunt tratati cu ajutorul cortizonului i derivailor acestuia, substane care produc deprimarea sistemului imun ca mijloc de aparare mpotriva celulelor hiperreactive care ntrein distrucia tisular. Dezavantajul major al acestui tip de tratament se manifest prin aparitia multiplelor atacuri din partea microorganismelor patogene din mediu care gsesc un teren propice pentru dezvoltare ntr-un organism n care sistemul imun este deprimat. Necesitatea nelegerii mecanismelor patogenetice la nivel molecular este esenial nu doar din punctul de vedere al tratamentului dar i din perspectiva unei depistri precoce sau chiar a posibilelor mijloace de prevenie a unor asemenea afeciuni. O grup de boli autoimune care se manifest la nivelul pielii i mucoaselor este caracterizat de prezena autoanticorpilor i celulelor T autoreactive ndreptate fa de autoantigenele de la nivelul pielii i mucoaselor. Bolile din aceast grup, printre care se numar epidermoliza buloas dobndit i pemfigoidul bulos/pemfigoidul cicatricial sunt caracterizate de prezena anticorpilor circulani i a anticorpilor legai la nivelul jonciunii dermo-epidermale care fixeaz complementul in situ. Din punct de vedere clinic aceste boli se caracterizeaz prin prezena bulelor la nivelul pielii i mucoaselor, bule care se sparg lasnd n urm eroziuni acoperite parial de cruste. Paraclinic, autoanticorpii prezint reactivitate cu forme recombinate ale autoantigenelor int att n ELISA ct i n imunoblot. De asemenea, serurile majoritii pacienilor recunosc fomele native ale autantigenelor int att n imunoblot ct i pe seciuni de piele ngheat. Cercetrile din ultimii ani au reuit s precizeze o parte dintre mecanismele efectoare responsabile de patologia observat. Scenariul fazei efectoare propune o succesiune de evenimente care debuteaz cu legarea autoanticorpilor la nivelul autoantigenelor int urmat de fixarea componentelor sistemului complement. Anticorpii recruteaz i activeaz fie direct fie prin intermediul complementului granulocitele in situ. Aceste celule odat activate produc i elibereaz specii reactive de oxigen care activeaz enzime 85

proteolitice prezente n veziculele granulocitare fie direct fie indirect, prin degradarea inhibitorilor acestor enzime. Odat eliberate aceste enzime diger structurile proteice responsabile de asigurarea jonciunii derm-epiderm [2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12] (Figura 2).

Figura 2. Reprezentare schematic a implicrii speciilor reactive de oxigen n patogeneza bolilor subepidermale.

ntr-un model experimental ex vivo, crioseciuni de piele uman sunt incubate cu anticorpi de la (a-c) pacieni cu boli autoimune subepidermale i apoi cu granulocite amestecate sau nu cu diferite substane capabile s influeneze nivelul produciei de specii reactive de oxigen n granulocite. (a) Seciunile incubate cu granulocite n lipsa altor substane rezult n apariia bulei experimentale. Folosirea unui amestec de granulocite cu (b) superoxid dismutaz sau (c) catalaz, dou enzime care sunt responsabile pentru conversia superoxidului n peroxid de hidrogen i respectiv a celui din urm n ap i oxigen nu rezult n inhibarea producerii separrii dermo-epidermale. (d) Controlul nostru negativ, n care am folosit un ser de la un donator sntos n loc de ser de la bolnavi, arat lipsa separrii dintre derm i epiderm. (e) Diagrama prezint lanul de reacii care produce speciile reactive de oxigen cu enzimele implicate (fundal roz i albastru) i respectiv inhibitori ai acestora (pe fundal verde) a-d, mrire 200x (dup [13]). Dei deosebit de util n precizarea posibilelor inte terapeutice specifice lipsite de efectele adverse ale terapiilor actuale, caracterizarea exclusiv a fazei efectuare a rspunsului autoimun nu genereaz nici o indicaie asu86

pra cauzelor care declaneaz reacia autoimun. De aceea eforturile din ultima perioad urmresc reproducerea bolii prin imunizarea activ a animalelor cu proteine recombinate. Pentru aceste modele active de boal, proteinele sunt produse prin tehnologia ADN-ului recombinat i exprimate apoi n celulele mamifere care ofer un sistem de expresie superpozabil cu cel ntlnit in vivo. n cele ce urmeaz vor fi descrise anumite caracteristici i metode utile pentru nelegerea acestor tehnologii. De asemenea tehnologia producerii, caracterizrii i utilizrii anticorpilor (Figura 3) monoclonali ca mijloace moderne de combatere a diverselor afeciuni mergnd de la cancer la boli autoimune sau boli degenerative va fi descris n cele ce urmeaz.
-COOH

Fab

Fc

-NH2

Figura 3. Prezentare schematic a unei imunoglobuline.

Imunoglobulinele sunt glicoproteine heterogene alctuite din dou lanuri grele (cu masa molecular mai mare, situate spre interior n aceast figur) i dou lanuri uoare (situate nspre exterior n partea de sus). Lanurile grele sunt identice ntre ele la fel cum lanurile uoare sunt identice ntre ele. Din punct de vedere funcional, imunoglobulina (numit i anticorp cnd se gasete sub form circulant n snge/secreii) are dou poriuni: zona superioar (N-terminal) Fab are rolul de a recunoate specific antigenul iar zona inferioar (C-terminal) Fc are rolul de a ndeplini funciile efectoare, interaciunea cu diverse componente ale sistemului imun (cum ar fi complementul, receptorii pentru poriunea Fc de pe fagocite, sau cu receptorii de pe celulele placentei permit trecerea anticorpilor de la 87

mam la ft). Ataat de aceste cozi Fc, se gsesc reziduuri de glucide care au rol n modularea interaciunii dintre Fc i receptorii sistemului imun (vezi text).

1.1. Producerea proteinelor recombinate n celule mamifere

Tehnica de baz pentru producerea acestor proteine implic mai multe etape care sunt menionate n tabelul 3. Dup ntocmirea strategiei de lucru, fragmentele de interes sunt amplificate prin tehnica PCR. Pe scurt, esutul care conine antigenul int este prelevat de la sursa de interes dup care ARN-ul mesager obinut n urma extraciei este folosit ca i matri pentru sinteza ADN-ului complementar [14,15]. Cu ajutorul amorselor specifice, folosind acest ADN complementar pot fi amplificate secvenele de interes prin reacia de PCR. Dup clonarea acestor fragmente n celule, urmeaz exprimarea proteinelor codate i purificarea acestora [14,15]. Apoi n funcie de aplicaia dorit, acestea vor fi utilizate fie la imunizarea pentru modelul activ de boal fie pentru cel pasiv.

1.2. Anticorpii monoclonali bio-nano-functionalizai

Terapia biologic cu ajutorul anticorpilor este considerat la ora actual ca fiind cea mai activ bran a industriei farmaceutice[16]. Din punct de vedere istoric, prevenia/terapia cu ajutorul anticorpilor este o procedur folosit de cteva mii de ani. Chinezii i indienii sunt cei crora li se atribuie folosirea terapeutic a serurilor (fraciunea sngelui n care se gsesc anticorpii alturi de alte proteine) nc naintea erei noastre. n urm cu cteva secole, este semnalat folosirea serurilor pentru protejarea persoanelor n Turcia i apoi odat cu experimentele doctorului Edward Jenner de la sfritul secolului al XVIII i n Anglia. Totusi folosirea pe scar mai larg a anticorpilor n scop terapeutic a nceput s fie practicat ncepnd cu secolul XX. n ciuda efectelor terapeutice extraordinare, folosirea anticorpilor a fost ns limitat de anumite aspecte dintre care cele mai neconvenabile au fost: lipsa unei surse constante de anticorpi omogeni; anumite aspecte adverse (apriia unui rspuns imun fa de nsui anticorpii) datorit utilizrii anticorpilor de la alte specii; dificultilor tehnice n izolarea/producerea lor i necunoaterea posibilelor inte terapeutice eseniale pentru diferite afeciuni. 88

Descoperirea antibioticelor n anii 30-40 ai secolului trecut alturi de celelalte inconveniente amintite au dus la intrarea anticorpilor ntr-un con de umbr. ncepnd cu 1975 situaia avea ns s se schimbe. ntr-o lucrare de referin pentru literatura biomedical, doi cercettori anun n revista Nature [17] o metod prin care se pot obine cantiti teoretic nelimitate de anticorpi cu specificitatea dorit. Diferena ntre anticorpii policlonali (cei care erau la acea or n uz medical) i noii anticorpi (numii monoclonali) poate fi comparat, chiar i numai pentru a face lucrurile mai uor de neles, cu diferena dintre dou persoane, prima purtnd haine de diferite mrimi, forme i culori i a doua purtnd haine personalizate de ctre un croitor profesionist, ncepnd de la lenjerie i pn la ultimul nasture al paltonului. Chiar dac uor exagerat i poate nu cea mai potrivit din punct de vedere bio-medical, folosirea acesteia are un substrat uor de neles i anume n literatura de specialitate de limba englez termenii tailor made antibodies sunt folosii pentru a descrie producerea de anticorpi monoclonali specifici pentru diferite situaii [18]. Dezvoltarea acestei noi tehnici, a dus la nlturarea primului din cele dou mari dezavantaje ale folosirii anticorpilor policlonali, i anume lipsa unei surse constante de anticorpi cu caracteristici omogene; de asemenea, cu timpul, noua tehnologie a premis obinerea lor prin tehnici relativ simple i cu costuri substanial diminuate nlturnd astfel cel de-al treilea dintre dezavantajele amintite anterior. Anticorpii monoclonali produi iniial au pstrat neajunsul de a fi produi n alte specii ducnd la declanarea unui rspuns imun masiv din partea primitorului (cel de-al doilea neajuns). Cel mai probabil din acest motiv, lumea bio-medical i industria farmaceutic a fost n prima instan rezervat la posibila utilizare a acestora pe scar larg. Aceast temere a fost dublat i de avansarea tehnicilor industriale de producere a moleculelor cu mas molecular mic care preau s fi rezolvat n sfrit problema inexistenei unor medicamente perfecte. n ciuda acestor piedici, entuziatii au continuat ns lucrul la producerea anticorpilor monoclonali ducnd la aprobarea utilizrii primului anticorp produs n acest fel nu ns mai repede de un deceniu de la publicarea metodologiei de ctre Koehler i Milstein [16]. Totui n anii care au urmat, potenialul imens al noii tehnologii a incitat att curiozitatea comunitii tiinifice (interesat n definirea noilor aplicaii pentru care anticorpii monoclonali reprezentau unealta mult-cutat, cel de-al patrulea neajuns amintit mai sus) ct i de ctre pragmatismul industriei farmaceutice (care gsea o nou min de aur n comercializarea noilor gloane magice aa cum le numea Paul Ehrlich, 89

printele hematologiei i chemoterapiei (acesta din urm fiind un termen pe care l-a introdus chiar el), cu mai bine de un secol n urm) [19]. Dup unii, dezvoltarea tehnologiei producerii anticorpilor monoclonali reprezint inovaia secolului trecut n ceea ce priveste importana terapeutic, diagnostic i preventiv a mbolnvirilor umane [16]. Dac n anul 2000, n topul primelor zece produse folosite n tratamentul diverselor afeciuni existau, cu o singur excepie, doar substane cu greutate molecular mic, se estimeaz c cinci din cele zece substane vor fi reprezentate de anticorpi n 2014 [16]. Desigur aceast turnur a fost posibil prin mbuntirea permanent a protocoalelor de lucru i obinerea unor anticorpi modificai prin tehnologia ADN recombinat, tehnici care au cunoscut o dezvoltare extraordinar n ultimele dou trei decenii. La ora actual, anticorpii sunt n aproape toate situaiile luai n calcul la stabilirea strategiei terapeutice alternative sau cteodat constituie chiar terapia de prim alegere. Dintre cei peste 25 de anticorpi monoclonali aflai la ora actual pe lista medicamentelor aprobate pentru tratamentul afeciunilor umane, majoritatea sunt destinai tratrii cancerelor. De asemenea dintr-un total de 1500 de studii clinice n care sunt testai noi anticorpi monoclonali peste75% sunt axate pe folosirea acestora n tratarea cancerelor. Majoritatea sunt folosii ca atare (neconjugati), urmai de cei conjugai cu material radioactiv i o mic proporie sunt reprezentai de cei conjugai cu toxine. Aceste date au menirea de a sublinia interesul major al comunitii bio-medicale i al guvernelor statelor industrializate (din moment ce majoritatea studiilor sunt finanate din bani publici) pentru gsirea unor strategii terapeutice specifice pentru tratarea acestei maladii. Dup cum aminteam anterior la 11 ani de la publicarea lucrrii lui Koehler i Milstein, n 1986 este aprobat utilizarea primului anticorp monoclonal pentru prevenirea rejetului de transplant. Folosirea pe scar larg a Orthoclone OKT3 (muronomab CD3) a fost ns limitat de faptul c acest anticorp de origine murin (produs n celule de oarece care difer suficient de celulele umane) induce un rspuns imun amplu n organismul uman [20]. Mai mult, administrarea acestui anticorp a dus la apariia sindromului eliberrii sistemice de cytokine [21] datorit interaciunii OKT3 cu receptorii pentru poriunea Fc a IgG. Datorit eecului relativ al utilizrii acestui medicament i datorit timpului ndelungat necesar dezvoltrii unui nou medicament, timpul scurs pn la aprobarea celui de-al doilea anticorp monoclonal a fost de nc opt ani de la aprobarea OKT3. n 1997, rituxan (rituximab), un anticorp monoclonal mpotriva CD20 de pe celulele 90

B devine cel de-al treilea medicament admis pe piaa din SUA pentru tumori ale celulelor B. ntre timp acest medicament este folosit i n tratamentul unor boli autoimune cum ar fi artrita reumatoid, bolile buloase (pemfigusul, pemfigoidul), diabetul zaharat de tip I, anemia hemolitic autoimun, vasculita autoimun etc. Acest anticorp chimer (combinaie ntre uman i murin) are multiple mecanisme de aciune dintre care merit amintite: inducerea toxicitii celulare indus de anticorpi (ADCC) i citotoxicitatea mediat de complement (CDC), alturi de un mecanism de inducere a apoptozei celulelor care exprim CD20 pe suprafa. n general, anticorpii sunt substane care interacioneaz cu structuri extracelulare sau de pe suprafaa celulelor. Mare parte dintre eforturile actuale au menirea de a crete penetrana acestor glicoproteine pentru inte din interiorul celulelor. n plus dac anticorpii iniiali aparineau clasei IgG1, investigaii actuale sunt concentrate asupra diversificrii activitii prin schimbarea clasei i deci a paletei de efecte posibile. Mai mult, exist cteva direcii prin care se urmrete creterea posibilelor interaciuni terapeutice. Dintre acestea amintim: o modificarea poriunii Fc a anticorpilor pentru: - mbuntirea interaciunii cu receptorii Fc sau Fc de tip neonatal (FcRn) de pe celulele efectoare; - mbuntirea proprietilor efectoare prin optimizarea interaciunii cu sistemul complement; prelungirea duratei de injumtire cu efecte favorabile datorate reducerii dozajului fie prin PEG-ylarea fragmentelor (scFv, Fab) fie prin fuzionarea lor pe domenii de Ig;

multispecificitatea, adic adugarea unei alte specificiti n zona de recunoatere a Fab. Utilitatea acestei modificri poate fi exemplificat ca i n figura 4. Pe scurt, anticorpul pstreaz specificitatea pentru care a fost creat pe unul dintre fragmentele Fab cu care se va lega de inta dorit urmnd ca pe celalalt fragment Fab s lege un receptor de pe o celul efectoare (spre exemplu CD3 de pe celula T) care are proprietatea de a distruge celula recunoscut specific. o

91

A Celula tumorala

B Celula tumorala

Celula

imun
Celula

imun

C Celula tumoral

Celula tumoral

Celula

Celula

imun

imun

nano nano

Figura 4. Modul de aciune al anticorpilor bispecifici.

(A) Clasic, anticorpul monoclonal recunoate antigenul specific, n acest caz de pe celula tumoral, de care se leag. Existena a dou fragmante Fab duce la legarea unui anticorp de dou antigene invecinate. Celula imun figurat cu linie punctat ramas la distan nu este capabil s distruga celula tumoral. (B) Modificarea unuia dintre fragmentele Fab poate fi fcut n aa fel nct acesta s nu mai recunoasc inta iniial ci un receptor de pe o celul imun efectoare aducnd-o n imediata vecintate a celulei tumorale. Puntea creat are ca efect reducerea dramatic a spaiului dintre cele dou celule permind celulei imune s distrug celula canceroas n condiii optime. (C) Alternativ poriunea Fc poate fi modificat (funcionalizat) prin ataarea unei nanosfere care poate avea ca atare un efect toxic asupra celulei tumorale. (D) Este de asemenea posibil ca nanosfera s conin un material radioactiv, o toxin, o enzim sau chiar o cytokin care s creasc puterea distructiv a anticorpului fie direct, fie, n cazul cytokinei prin recrutarea altor celule imune n zona respectiv. 92

2. Adaptarea/importul acestora la tematicile de cercetare ale platformei

Este de dorit ca n viitor, caracterizarea precis a mecanismelor patogenetice implicate n distrucia tisular din bolile autoimune sa permit o prevenie, un diagnostic precoce i un tratament specific al acestor afeciuni. n vederea atingerii acestui obiectiv, implementarea metodologiei i tehnicilor moderne este un deziderat al activitii prezente i viitoare a grupului de cercetare. ntr-o prim faz, utiliznd tehnicile i aparatura specific culturilor celulare vor fi produse diverse fragmente recombinate ale unor proteine cu rol cheie n asigurarea adeziunii dintre derm i epiderm. Odat produse aceste fragmente vor fi caracterizate din punct de vedere bio-chimic i folosite apoi fie separat fie n diferite combinaii pentru producerea de anticorpi i/sau pentru reproducerea bolii umane n animalele de experien. Tehnicile de lucru cu celulele mamifere sunt puse la punct n laborator. De asemenea protocoale specifice a cror necesitate poate s apar pe parcursul desfurrii experimentelor pot fi obtinute de la colaboratorii din afara Institutului. De altfel, la ora actual, grupul de cercetare include n preocuprile sale problematica legat de caracterizarea rspunsului autoimun n diferite modele de boal. Desigur importul premanent de know-how relevant pe plan internaional este esenial pentru consolidarea cercetrii locale i recunoaterea validitii datelor obinute de ctre comunitatea tiinific internaional. De asemenea instruirea personalului i co-interesarea i implicarea cercettorilor externi n tematicile de cercetare ale platformei este esenial pentru ntrirea resursei umane cu expertiz n domeniu. Este de ateptat ca o caracterizare precis a mecanismelor patogenetice s necesite o perioad relativ lung de timp. De aceea, n paralel este de dorit abordarea acestei problematici din punct de vedere terapeutic. n acest context, un deziderat este reprezentat de funcionalizarea anticorpilor ndreptai fa de molecule de pe celulele B, celule cu rol cheie n patogeneza autoimun a acestor boli. ntr-un set de experimente menite s caracterizeze potenialul anticorpilor specifici fa de diferii receptori de pe suprafaa celulelor B de a determina distrugerea acestora, vor fi luai n calcul anticorpi consacrai cum ar fi anti-human CD20 alturi de ali anticorpi a cror int se afl tot pe celulele B dar a cror eficien n distrugerea acestor celule este nc necunoscut. Potenialul acestor anticorpi va fi studiat fie n preparaii care conin doar anticorpul pur fie n alte instane cu anticorpul funcionalizat (Tabelul 2).

93

Tabel 2. Strategiile de lucru abordate pentru atingerea celor dou obiective majore.
Obiective Stablilirea dozei 50%1 Model de studiu Culturi celulare ex vivo Strategie Anticorp pur Anticorp funcionalizat cu nanosfere Anticorp funcionalizat cu nanosfere + Rx/toxic Anticorp pur Anticorp funcionalizat cu nanosfere Anticorp funcionalizat cu nanosfere + Rx/toxic

Stabilirea potenialului preventiv/curativ al anticorpilor funcionalizai

1

Model animal n vivo

Este vorba despre doza care provoac moartea a 50% dintre celule.

3. Recomandri pentru abordarea de noi tipuri de experimente i metodologii

Una dintre direciile de cercetare care vor fi abordate n viitor se va concentra pe producerea de fragmente recombinate ale diferitelor proteine autoantigen cu ajutorul culturilor celulare eucariote. Atenia va fi concentrat pe producerea acelor autoantigene a cpror patogenitate este nc incomplet elucidat, contribuind astfel ntr-un mod inovativ la definirea naturii autoimune a diferitelor entiti clinice. Un exemplu n acest sens l constituie clonarea fragmentelor de integrine. Integrinele sunt o clas heterogen de proteine implicate n diverse procese de la asigurarea contactelor dintre celule i mediul nconjurtor, la funcii de recrutare i transducerea semnalului. Un interes primar pentru preocuprile noastre l constituie producerea fragmentelor recombinate ale proteinelor care asigur adeziunea keratinocitelor de stratul dermal. Defecte ale acestor integrine sunt considerate a fi implicate n patogeneza bolilor autoimune. Nu este deocamdat clar n ce fel i n ce masur autoanticorpii fa de aceste molecule sunt implicai n patogeneza autoimun. De aceea, odat produse aceste fragmente ar putea fi folosite n diferite combinaii pentru a reproduce caracteristicile bolii umane n animalele de experien. Ca i metodologie de lucru, producerea unui model de boal i modularea acestuia n scop preventiv/terapeutic implic mai multe etape (Tabelul 3).

94

Tabel 3. Etape recomandate pentru modelare n scop preventiv/terapeutic a unei boli autoimune n animalele de experien Denumire etap Obinerea fragmentelor recombinate ale autoantigenului Activiti Stabilirea planului de clonare Designul i producerea de amorse specifice Izolarea ARN-ului mesager RT-PCR Clonarea produilor obtinui prin PCR Exprimarea proteinelor recombinate Imunizarea animalelor de experien cu diferite combinaii de proteine recombinate Evaluarea clinic i paraclinic a inducerii bolii Dezvoltarea unor strategii de prevenie, diagnostic i tratament a bolii induse: - folosirea diverselor ci de administrare, adjuvani, cantiti variabile de autoanitgen, folosirea autoantigilor modificai - folosirea anticorpilor monoclonali cruzi sau funcionalizai cu nanosfere - folosirea nanosferelor direcionate specific mpotriva celulelor imune autoreactive Imunizarea unor animale intermediare cu diferite combinaii de proteine recombinate i izolarea anticorpilor specifici produi Transferul pasiv al acestor anticorpi n oarecii de laborator Dezvoltarea strategiilor de prevenie, diagnostic i tratament: - folosirea anticorpilor din diferite surse i evaluarea mecanismelor patogenetice specifice fiecruia (sistem complement, granulocite prin FcR etc.) - izolarea claselor i subclaselor din sursa de anticorpi policlonali i investigarea mecanismelor efectoare prin care acetia produc boala - modificarea anticorpilor prin tehnica ADN-ului recombinat (se urmrete n acest fel modularea interaciunii cu diferite mecanisme efectoare prin modificarea spre exemplu a poriunii Fc a anticorpului)

Producerea modelului activ de boal

Producerea modelului pasiv de boal

95

n ultimii ani, un accent deosebit a fost pus pe studierea interaciunilor dintre poriunea Fc a anticorpilor i alte proteine efectoare din sistemul imun (receptorii pentru Fc de la nivelul celulelor imuniti nnscute, sistemul complement). Cercetri recente au artat c exist diferene eseniale ntre aciunea diverilor anticorpi care la prima vedere sunt identici. Explicaia propus a fost c diferena este datorat unor modificri postranslaionale aprute n poriunea Fc a anticorpilor. Este vorba despre adugarea diferitelor lanuri glucidice care fac anticorpii entiti glicoproteice. Dei acest lucru era cunoscut de mai mult vreme, semnificaia funcional a acestui detaliu structural a rmas un mister pn de curnd. S-a dovedit recent c o scdere a syalilarii lanului glucidic din aceast poriune duce la creterea activrii celulelor efectoare cu receptror Fcgamma. De asemenea structura primar a lanului polipeptidic care formeaz poriunea Fc a anticorpilor este implicat n reactivitile diferite observate la folosirea diverselor preparaii de anticorpi. De altfel interesul tot mai mare n explicarea la nivel molecular a susceptibilitii la anumite afeciuni a dus din ce n ce mai frecvent la obinerea secvenelor de nucleotide care codeaz pentru anticorpi. S-a dovedit astfel existena unei concordane ntre aceste secvene i capacitatea lanurilor codate de a activa anumite mecanisme efectoare. Tendina actual este de a grupa aceste polimorfisme de la nivelul ADN n funcie de capacitatea anticorpilor de a activa/inhiba o anumit clas de celule efectoare cu implicare n terapia afeciunilor autoimune i cancerelor. Astfel, interesul extraordinar n gsirea combinaiilor optime de anticorpi care s identifice celulele tumorale int i n acelai timp s angajeze un rspuns prin modificare celui de-al doilea fragment Fab a nceput s fie balansat de interesul pentru modificarea poriunii Fc n vederea creterii efectivitii. Ideea de baz este c un sistem imun acordat perfect reuete s distrug celulele nedorite prin implicarea la timpul i momentul potrivit a potenialului uria pe care celulele imunitii il posed. Se vorbete n acest sens despre anticorpi trispecifici/multispecifici n care pe lng specificitatea poriunii Fab pentru inta dorit, cea de-a doua poriune Fab poart specificitatea agentului terapeutic (nanosfera radioactiv sau toxina; specificitate pentru un alt receptor de pe o celul citotoxic spre exemplu), iar o a treia, patra etc. specificitate este adus de ctre modificarea/modificrile din poriunea Fc astfel nct acestea s poat activa cu succes diverse mecanisme imune (Figura 5). Pe lng specificitatea pentru celula tumoral int i cea pentru nanoparticule, anticorpii multispecifici posed i alte specificiti care s le creasc capacitatea funcional benefic. Spre exemplu, prin modificarea 96

Celula imun

Celula tumoral/ autoimun 4

5,6

Celula imun 3 2 1 nano-r x/tox

ROS, proteaze

CDC

Figura 5. Mecanisme de aciune ale anticorpilor multispecifici.

poriunii Fc pe partea stng a figurii, anticorpul capt proprieti sporite de activare a sistemului complement care fie direct (2) fie indirect (3) duce la distrugerea celulei canceroase/autoimune. n plus, folosirea unei duble specificiti a poriunii variabile a fragmentului Fab face posibil recrutarea n vecintatea tumorii a celulelor T citotoxice (4). De asemenea, prin personalizarea interaciunii fragmentului Fc cu celulele care poart receptori pentru acesta (partea dreapta jos) sunt transduse semnale puternice care pot avea ca rezultat o activare crescut a acestor celule cu producerea speciilor reactive de oxigen i eliberarea proteazelor efectoare (5,6). n prezent se urmrete lrgirea paletei de experimente i metodologii care pot fi oferite la nivelul laboratorului. Numeroi membri ai acestuia se afl n prezent n diverse laboratoare partenere unde deprind metode i tehnici noi pe care dorim s le implementm odat cu reintegrarea acestora n laboratorul de origine. Dintre avantajele folosirii anticorpilor ca i ageni biologici n tratamentul cancerului amintim: - timpul de njumtire crescut fa de moleculele cu greutate molecular mic ceea ce face posibil scderea dozei utilizate - specificitatea i afinitatea mare 97

multiple mecanisme de aciune care pot fi combinate (vezi anticorpi multispecifici pentru ADCC i CDC) posibilitatea folosirii acestora ca i terapie complementar/alternativ oricrei forme de terapie anti-canceroas tradiional utilizarea lor ca i vehicul specific pentru transportul diverselor substane anticanceroase spre diverse destinaii (vezi anticorpi bispecifici) utilizarea lor ca i markeri de diagnostic/prognostic pentru diferite afeciuni n anumite cazuri anticorpii pot per se s controleze creterea tumorii prin interferarea cu cile de semnalizare celular, fie prin inducerea apoptozei fie prin antagonizarea efectelor factorilor de cretere [22].
Tabel 4. Diferite mecanisme de aciune ale anticorpilor monoclonali

Mecanism de aciune propus ADCC1 CDC Inducerea apoptozei Blocarea interaciunii factorilor de cretere cu receptorii specifici Blocarea fizic a dimerizrii receptorilor pentru factorii de cretere Inhibarea neoformrii vaselor sangvine Blocarea factorilor de cretere n forma solubil Funcionalizarea/conjugarea cu radioizotopi, toxine, enzime sau cytokine
1

Reprezentant Anti-CD20 Anti-CD20 Anti-CD20 Anti-EGFR Anti-EGFR Anti-Her2/neu Anti-EGFR Anti-VEGF-A AntiDiveri

Referina bibliografic [23,24] [22] [25] [26] [26] [27] [28,29]

[22]

Majoritatea anticorpilor monoclonali utilizai acioneaz asupra intelor specifice prin acest mecanism; legarea concomitent a Fv (partea a Fab) de antigenul int i a Fc de o celul cum ar fi macrofagul sau celula NK care posed receptori pentru aceast poriune duce la activarea celulei imune urmat de distrugerea celulei intit specific. Cercetri recente au artat c ADCC este mai eficient la acei indivizi care prezint anumite polimorfisme n poriunea Fc (respondeni cu grad nalt) [23,24].

98

4.Bibliografie
1. 2. 3. Murphy KM, Travers P, Walport M (2007) Janeway's Immunobiology. New York and London: Garland. Sitaru C, Zillikens D (2005) Mechanisms of blister induction by autoantibodies. Exp Dermatol 14: 861-875. Chiriac MT, Roesler J, Sindrilaru A, Scharffetter-Kochanek K, Zillikens D, et al. (2007) NADPH oxidase is required for neutrophil-dependent autoantibody-induced tissue damage. J Pathol 212: 56-65. Ujiie H, Shibaki A, Nishie W, Sawamura D, Wang G, et al. (2010) A novel active mouse model for bullous pemphigoid targeting humanized pathogenic antigen. J Immunol 184: 2166-2174. Ujiie H, Shibaki A, Nishie W, Shimizu H (2010) What's new n bullous pemphigoid. J Dermatol 37: 194-204. Liu Z, Sui W, Zhao M, Li Z, Li N, et al. (2008) Subepidermal blistering induced by human autoantibodies to BP180 requires innate immune players n a humanized bullous pemphigoid mouse model. J Autoimmun 31: 331-338. Nishie W, Sawamura D, Goto M, Ito K, Shibaki A, et al. (2007) Humanization of autoantigen. Nat Med 13: 378-383. Nishie W, Sawamura D, Natsuga K, Shinkuma S, Goto M, et al. (2009) A novel humanized neonatal autoimmune blistering skin disease model induced by maternally transferred antibodies. J Immunol 183: 4088-4093. Recke A, Sitaru C, Vidarsson G, Evensen M, Chiriac MT, et al. (2009) Pathogenicity of IgG subclass autoantibodies to type VII collagen: Induction of dermal-epidermal separation. J Autoimmun. Mihai S, Chiriac MT, Takahashi K, Thurman JM, Holers VM, et al. (2007) The alternative pathway of complement activation is critical for blister induction n experimental epidermolysis bullosa acquisita. J Immunol 178: 6514-6521. Mihai S, Chiriac MT, Herrero-Gonzalez JE, Goodall M, Jefferis R, et al. (2007) IgG4 autoantibodies induce dermal-epidermal separation. J Cell Mol Med 11: 1117-1128. Mihai S, Sitaru C (2007) Immunopathology and molecular diagnosis of autoimmune bullous diseases. J Cell Mol Med 11: 462-481. Chiriac MT (2007) Inflammatory Mechanisms of Tissue Damage Induced by Antibodies. Cluj-Napoca: Babes-Bolyai University. 120 p. Sitaru C, Mihai S, Otto C, Chiriac MT, Hauer I, et al. (2005) Induction of dermal-epidermal separation n mice by passive transfer of antibodies to type VII collagen. J Clin Invest 115: 870-878. Csorba K, Sesarman A, Oswald E, Feldrihan V, Fritsch A, et al. (2010) Cross-reactivity of autoantibodies from patients with epidermolysis bullosa acquisita with murine collagen VII. Cell Mol Life Sci 67: 1343-1351. Zhiqiang A (2009) Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic. In: Zhiqiang A, editor. 1st ed. New Jersey: Wiley. Kohler G, Milstein C (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256: 495-497. Chowdhury PS, Wu H (2005) Tailor-made antibody therapeutics. Methods 36: 11-24. Schwartz RS (2004) Paul Ehrlich's magic bullets. N Engl J Med 350: 1079-1080. Kimball JA, Norman DJ, Shield CF, Schroeder TJ, Lisi P, et al. (1995) The OKT3

4.

5. 6.

7. 8.

9.

10.

11. 12. 13. 14.

15.

16. 17. 18. 19. 20.

99

21.

22. 23.

24.

25.

26. 27.

28.

29.

Antibody Response Study: a multicentre study of human anti-mouse antibody (HAMA) production following OKT3 use n solid organ transplantation. Transpl Immunol 3: 212-221. Chatenoud L, Ferran C, Legendre C, Thouard I, Merite S, et al. (1990) n vivo cell activation following OKT3 administration. Systemic cytokine release and modulation by corticosteroids. Transplantation 49: 697-702. Zafir-Lavie I, Michaeli Y, Reiter Y (2007) Novel antibodies as anticancer agents. Oncogene 26: 3714-3733. Cartron G, Dacheux L, Salles G, Solal-Celigny P, Bardos P, et al. (2002) Therapeutic activity of humanized anti-CD20 monoclonal antibody and polymorphism n IgG Fc receptor FcgammaRIIIa gene. Blood 99: 754-758. Weng WK, Levy R (2003) Two immunoglobulin G fragment C receptor polymorphisms independently predict response to rituximab n patients with follicular lymphoma. J Clin Oncol 21: 3940-3947. Shan D, Ledbetter JA, Press OW (2000) Signaling events involved n anti-CD20-induced apoptosis of malignant human B cells. Cancer Immunol Immunother 48: 673-683. Ferguson KM (2004) Active and inactive conformations of the epidermal growth factor receptor. Biochem Soc Trans 32: 742-745. Albanell J, Codony J, Rovira A, Mellado B, Gascon P (2003) Mechanism of action of anti-HER2 monoclonal antibodies: scientific update on trastuzumab and 2C4. Adv Exp Med Biol 532: 253-268. Kim KJ, Li B, Winer J, Armanini M, Gillett N, et al. (1993) Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumour growth n vivo. Nature 362: 841-844. Ferrara N, Hillan KJ, Gerber HP, Novotny W (2004) Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov 3: 391-400.

100

III. MICROSCOPUL CONFOCAL RAMAN Microspectroscopia Raman

Conf. dr. Monica Maria Baia Cuprins
1. Aspecte generale ale spectroscopiei Raman .......................................................... 102 1.1. Efectul Raman ............................................................................................... 102 1.2. Efectul Raman rezonant................................................................................ 103 1.3. Spectroscopia Raman amplificat de suprafa ............................................. 104 1.4. Microspectroscopia Raman confocal ........................................................... 105 2. Aplicaii ale microspectroscopiei Raman.............................................................. 107 2.1. Aplicaii bio-medicale .................................................................................... 107 2.1.1. Analiza medicamentelor anticanceroase .............................................. 107 2.1.2. Cipuri ADN ........................................................................................ 108 2.1.3. Localizarea i identificarea unor bacterii ............................................. 108 2.2. Aplicaii n tiina materialelor ..................................................................... 109 2.2.1. Identificarea fazelor cristaline i a tranziiilor de faz......................... 109 2.2.2. Analiza domeniilor amorfe .................................................................. 109 2.2.3. Structuri alotrope de carbon ................................................................ 110 2.3. Aplicaii n stiinta mediului.......................................................................... 111 2.3.1. Studii structurale ale componentelor solului: Acidul humic .............. 111 2.3.2. Detecia poluanilor din ap................................................................ 111 3. Prezentarea echipamentului de microscopie Raman confocal WITec CRM 200 i a parametrilor optimi de funcionare pentru diverse aplicaii .......................... 112 3.1. Prezentarea echipamentului de microscopie Raman confocal WITec CRM 200 ...................................................................................................... 112 3.2. Parametrii optimi de funcionare .................................................................. 113 3.2.1. nregistrarea spectrelor Raman confocale ........................................... 113 3.2.2. Imagistica Raman confocal................................................................ 115 3.3. Accesorii ....................................................................................................... 117 3.3.1. Modul de microscopie de for atomic model alpha 300 .................... 117 3.3.2. Celula Linkam ..................................................................................... 119 4. Bibliografie ........................................................................................................... 119

101

1. Aspecte generale ale spectroscopiei Raman

1.1. Efectul Raman
O raz de lumin incident pe o prob (de exemplu o celul biologic, un micro-organism, un material, etc.) interacioneaz cu atomii sau moleculele constituiente i poate fi absorbit sau mprtiat [1, 2]. Dac o cuant de lumin h 0 nu este absorbit de o molecul ea poate s sufere fie un proces de mprtiere elastic, n urma cruia rezult o cuant a crei energie rmne neschimbat, h 0 , i care poart numele de mprtiere Rayleigh, fie un proces de mprtiere inelastic care este cunoscut sub denumirea de mprtiere Raman i n urma cruia sunt emise cuante de energie h 0 h s (Fig. 1).
Nivel electronic excitat Energie

h0 h0 h0

h0 - hs h0 h0

h0

h0 + hs

v=1 v=0

Imprastiere Rayleigh

Imprastiere Raman (Stokes)

Imprastiere Rayleigh

Imprastiere Raman (anti-Stokes)

Figura 1. Diagrama tranziiilor care au loc ntre diferite nivele energetice vibraionale i care corespund proceselor de mprtiere Rayleigh i Raman

La temperatura mediului ambiant cea mai mare parte a electronilor se afl pe nivelele vibraionale ale strii electronice fundamentale cu energiile cele mai mici, aa nct, n conformitate cu legea de distribuie a lui Boltzmann, pe nivelele vibraionale ale strii fundamentale cu energii mai mari se va gsi un numr mult mai mic de electroni. De aceea, procesul Raman, n urma cruia este eliberat o cuant de energie h 0 h s (linii Stokes), are o probabilitate de apariie mult mai mare dect cel n urma cruia se elibereaz o cuant de energie h 0 + h s (linii anti-Stokes). Liniile Raman denumite Stokes i anti-Stokes se gsesc simetric, de o parte i de cealalt a liniei Rayleigh [1, 2]. 102

Intensitatea benzilor Raman este n general de 3 5 ordine de mrime mai mic dect intensitatea liniei Rayleigh, care la rndul su reprezint aproximativ 10-4 - 10-3 din intensitatea radiaiei incidente excitatoare, deci doar 10-6- 10-8 din fotonii incideni sunt transformai n fotoni Raman, ceea ce limiteaz detecia unor molecule aflate n concentraie mic. n unele cazuri observarea efectului Raman este impiedicat de apariia fluorescenei, care este mai intens cu cteva ordine de mrime dect semnalul Raman i care apare mai ales la investigarea biomoleculelor i a sistemelor biologice. Aceste neajunsuri pot fi nlturate prin utilizarea unei surse de excitare (laser) cu lungimea de und situat n domeniul infrarou-apropiat (NIR) sau prin utilizarea unor tehnici speciale cum ar fi cea bazat pe efectul Raman rezonant sau spectroscopia Raman amplificat de suprafa (surface-enhanced Raman spectroscopy SERS) [1-4].

1.2. Efectul Raman rezonant

n spectroscopia Raman se folosesc n mod curent ca surse de excitare lasere cu lungimi de und situate n domeniul vizibil (verde i rosu) i infrarou-apropiat care nu au energie suficient pentru a produce prima tranziie electronic a majoritii moleculelor, evitndu-se astfel excitarea fluorescenei [1, 3]. Totui exist substane care au capacitatea de a mprtia radiaia laser cu o intensitate de pn la 106 ori mai mare dect cea a semnalului Raman normal, dac energia laserului este apropiat de valoarea energiei necesare unei tranziii electronice (efect Raman rezonant). Se face distincie ntre dou tipuri de efecte Raman rezonant: efectul pre-rezonant i efectul rezonant (vezi Fig. 2).

h0 h0 h0 - hs

h0 - hs

h0

h0 - hs

(a)

(b)

(c)

Figura. 2. Diagrama tranziiilor care au loc ntre diferite nivele energetice n cazul (a) efectului Raman convenional; (b) efectului Raman pre-rezonant; (c) efectului Raman rezonant.

n cele mai multe cazuri, cu ct energia de excitare este mai apropiat de energia necesar tranziiei electronice cu att este mai mare intensitatea 103

benzilor observate. n plus, se modific regulile de selecie i vor fi amplificate doar anumite tranziii vibraionale Raman. Tranziiile de ordin superior, care de obicei nu se observ ntr-un spectru Raman convenional, sunt deseori observabile ntr-un spectru Raman rezonant. Astfel, apar benzi noi din analiza crora se pot obine informaii structurale suplimentare. Spectroscopia Raman rezonant se folosete mai ales la investigarea moleculelor poliatomice mari, cum sunt cele biologice, unde absorbia este localizat ntr-o anumit zon a moleculei, la aa numiii cromofori. Amplificarea Raman rezonant permite izolarea benzilor Raman datorate acestor cromofori i a unitilor structurale situate n vecintatea lor facilitnd astfel analizarea zonei cromoforice care este de obicei zona activ, n lipsa unor semnale spectrale datorate mediului nconjurtor (ex. proteine). Modificarea regulilor de selecie precum i amplificarea tranziiilor vibraionale specifice de pn la 106 ori permit utilizarea spectroscopiei Raman pre-rezonant ct i rezonana la un numr mare de aplicaii din fizicp, chimie, biochimie i biologie. Pentru folosirea efectului Raman rezonant nu este necesar un echipament special, se folosesc doar lasere cu lungime de und variabil care s permit ajustarea energiei de excitare la valoarea necesar unei absorbii electronice.

1.3. Spectroscopia Raman amplificat de suprafa

Efectul amplificrii semnificative a semnalului Raman al moleculelor adsorbite pe suprafaa rugoas a unui electrod de argint a fost descoperit de Fleischman i colab. si n 1974 [5]. Amplificarea semnalului Raman (de 106-108 ori) este explicat cu ajutorul a dou mecanisme principale de amplificare [1, 4, 5]: electromagnetic (amplificare a semnalului Raman de 104106 ori) i chimic (amplificare a semnalului Raman de 10102 ori). O contribuie major la amplificarea electromagnetic este datorat plasmonilor de suprafa, care sunt asociai oscilaiilor colective ale electronilor de conducie de pe suprafaa particulelor metalice. Amplificarea semnalului Raman rezult din excitarea acestor plasmoni de suprafa de ctre radiaia incident. Cmpurile locale rezultate amplific intensitatea radiaiei Raman emise, care este proporional cu ptratul amplitudinii cmpului electric incident pe molecul. O amplificare suplimentar apare datorit excitrii plasmonilor de suprafa de ctre radiaia Raman emis de molecule. Efectul chimic al amplificrii este asociat suprapunerii funciilor de und ale metalului i adsorbatului, care duce la procese de transfer de sarcin ntre nivelele fundamentale i cele excitate ale moleculelor adsorbite [6]. Ionul negativ obinut are configuraii geometrice de echilibru diferite fa de cele 104

ale moleculei neutre neadsorbite. De aceea, transferul de sarcin duce la apariia unei molecule neutre excitat vibraional i la emisia unui foton Raman. Regulile de selecie ale spectroscopiei Raman amplificat de suprafa (SERS surface-enhanced Raman spectroscopy) sunt n principiu aceleai ca i n cazul spectroscopiei Raman convenionale [7, 8]. n particular, deoarece intensitatea cmpului electromagnetic local este maxim pe direcia perpendicular la suprafa, modurile de vibraie care rezult dintr-o modificare a polarizabilitii perpendicular pe suprafa vor fi amplificate. Acest lucru combinat cu faptul c intensitatea cmpului electromagnetic scade cu creterea distanei fa de suprafa permite determinarea orientrii speciilor adsorbite n raport cu suprafaa. Pentru realizarea unui experiment SERS se folosete n principiu acelai echipament ca i n cazul realizrii unui experiment Raman convenional. Pentru a optimiza amplificarea electromagnetic frecvena laserului trebuie s coincid cu frecvena de rezonan plasmonic. Deoarece amplificarea depinde de proprietile substratului, sunt utilizate mai multe tipuri de substrate active SERS. Cele mai des folosite sunt electrozii de Au, Ag, Cu, suspensiile coloidale de Au i Ag, filmele metalice de Au i Ag, etc. Datorit sensibilitii de detecie remarcabile i a flexibilitii sale de aplicare tehnic SERS este utilizat n mod frecvent pentru a soluiona o mare varietate de probleme cu caracter analitic, biomedical, de mediu, i de securitate global i naional [9]. SERS poate fi exploatat la identificarea selectiv a unor specii moleculare precum i la detecia unei singure molecule [10]. Recent, SERS a fost utilizat ca un mecanism de transpunere a semnalului n senzori chimici. Astfel de exemple sunt analiza unor cantiti reduse de pesticide [11], antrax [12], a unor antigene specifice prostatei [13], glucoza [14] i a unor reziduuri nucleare [15].

1.4.Microspectroscopia Raman confocal

n urm cu aproximativ dou decenii au fost efectuate primele msurtori Raman cu ajutorul unui microscop. mbuntirea major era dat de folosirea unui obiectiv de microscop prin intermediul cruia se realiza att iluminarea probei ct i colectarea luminii mprtiate. Pentru a ntelege mai bine raiunile care au stat la baza evoluiei spectroscopiei micro-Raman este foarte important cunoaterea tuturor factorilor care contribuie la modificarea intensitii semnalului (S ) livrat de detectorul unui spectrometru n cazul unei linii Raman nregistrat la o lungime de und . Astfel, 105

S I L N m T s , unde I L este intensitatea radiaiei laser incident pe prob (Wcm-2), este seciunea specific de mprtiere Raman (cm2sterad-1molecula-1), N m reprezint numrul de molecule din volumul de prob investigat V P , este unghiul solid din care se face colectarea luminii mprtiate Raman, iar T and s reprezint capacitatea de nregistrare a instrumentului i respectiv sensibilitatea detectorului la lungimea de und . Se poate observa c atunci cand se dorete examinarea unui volum V P foarte mic dintr-o prob, doar civa parametrii pot fi modificai astfel nct s se compenseze reducerea numrului de molecule N m . Acetia sunt intensitatea radiaiei laser incident pe proba I L i unghiul solid din care se face colectarea luminii mprtiate Raman. Astfel, utilizarea unei linii laser, a crei putere poate fi reglat ntr-un domeniu relativ larg, i a unui obiectiv de microscop, care focalizeaz radiaia laser i culege lumina mprtiat sub un unghi solid mare, duce att la obinerea unui spectru Raman mai bun din punct de vedere calitativ ct i la localizarea unei anumite zone de interes comparativ cu cazul n care acesta este nregistrat fr obiectiv de microscop [16]. Eficiena de colectare a luminii este aproape n totalitate influenat de apertura numeric NA a obiectivului de microscop care este definit de relaia NA = n sin max n care n este indicele de refracie al mediului dintre obiectiv i prob iar max este unghiul maxim de colectare al obiectivului. Se poate observa c n cazul unor msurtori efectuate cu un obiectiv de microscop imersat ntr-un mediu al crui indice de refracie este apropiat de cel al probei investigate (nu exist o modificare a drumului razelor de lumin la trecerea ntr-un mediu cu indice de refracie diferit) apare o mbuntire a eficienei de colectare i a rezoluiei spaiale. Utilizarea unui astfel de mediu (ap, ulei, etc.) impune utilizarea unor obiective speciale care posed caracteristici diferite pentru fiecare mediu, specificate foarte exact de ctre productor. Important n astfel de situaii ramne faptul ca mediul n care se face imersarea s nu influeneze structura i proprietile probei investigate. n numeroase studii micro-Raman apare un neajuns deoarece informaia spectral obinut nu este culeas dintr-un volum suficient de mic (referirea se face n termeni de rezoluie spaial perpendicular la axa optic sau rezoluie lateral, i rezoluie spaial paralel la axa optic sau rezoluie axial). n microscopul convenional ntregul cmp vizual este uniform 106

iluminat i observat. Spre deosebire de acesta, microscopul confocal utilizeaz o diafragm (pinhol) care izoleaz radiaia luminoas care provine din zona marginal a volumului n care a fost focalizat fascicolul laser (zona din afara focarului). Astfel, prin prezena pinholului se realizeaz o filtrare spaial a radiaiei, la detector ajungnd doar radiaia din volumul n care a fost focalizat laserul [17]. Confocalitatea poate fi de asemenea obinut i prin restrngerea ariei de pe detector unde intensitatea radiaiei Raman este mare (realizarea unei aperturi electronice). Utilizarea primei metode de obinere a confocalitii necesit n general folosirea unor obiective de microscop cu apertur numeric mare (NA = 0.9 0.95) i poate conduce la obinerea de informaie spectral dintr-un tub focal cu un diametru de 1.22/NA i o adncime de 4/NA2 [17].

2. Aplicaii ale microspectroscopiei Raman

Spectroscopia Raman este o tehnic care pe lng faptul c permite obinerea de informaii extrem de rapide despre structura, modificrile structurale i morfologice care apar n diferite tipuri de probe poate oferi i unele avantaje unice n comparaie cu alte tehnici. Astfel, aceast tehnic spectroscopic poate fi considerat, n funcie de tipul aplicaiei, ca fiind neinvaziv, nedistructiv i extrem de puin sensibil la prezena apei. n plus, n cele mai multe cazuri aplicarea ei nu necesit prepararea prealabil a probei. n paragrafele urmtoare sunt prezentate succint principalele informaii care se pot obine n urma aplicrii microspectroscopiei Raman pe diferite sisteme de studiu.

2.1. Aplicaii bio-medicale

2.1.1. Analiza medicamentelor anticanceroase Producerea unor structuri moleculare capabile s se ataeze de diferite secvene ale unui lan de ADN reprezint un domeniu de cercetare intens datorit importanei pe care o are acest subiect n obinerea unor compui noi cu potenial terapeutic. Spectroscopia Raman poate fi utilizat pentru a examina interaciunile dintre molecule mici i ADN. Astfel, n cazul unor medicamente anticanceroase care nu prezint fluorescen, spectroscopia Raman poate fi singura metod care s permit detecia lor n interiorul celulelor n absena unor marcri fluoresceni. Experimentele iniiale const n nregistrarea spectrelor medicamentelor n soluie n vederea realizrii unei caracterizri Raman fundamentale. 107

Urmtorul pas const n efectuarea de studii Raman ale medicamentelor ataate de anumite secvene ale unor oligonucleotide pentru a obine informaii de baz care vor fi mai apoi utilizate cnd se studiaz in vitro aceste procese [18]. n cele din urm, microscopia Raman se poate utiliza pentru a studia medicamentele n interiorul celulelor i a furniza informaii despre: (a) interaciunea dintre compus i mediul celular, (b) localizarea sa ntr-o anumit regiune sub-celular (de ex. nucleu sau citoplasm), (c) forma chimic a compusului n interiorul celulei (de ex. dac sunt posibile formele protonate sau neprotonate) [18]. 2.1.2. Cipuri ADN Biocipurile revoluioneaz diagnosticarea clinic modern i tehnicile farmaceutice datorit rapiditii de testare a probelor i de livrare a rezultatelor. Tehnica SERS poate fi utilizat n semnalarea unirii unui lan de ADN cu lanul complementar i formarea structurii dublu elicoidale. Acest fenomen este cunoscut sub denumirea de hibridizare i st la baza tehnologiei de obinere a cipurilor ADN, n care diagnosticarea pe baza hibridizrii este utilizat n mod eficient pentru a obine informaii despre secvenele de ADN. Astfel, dac exist o secven cunoscut de ADN fixat ntr-o anumit zon a suprafeei cipului i dac apare procesul de hibridizare al unui lan de ADN n acea poziie, se poate determina secvena de ADN din acel lan [18]. Metoda standard de detecie a procesului de hibridizare folosete marcri fluoresceni. Prin nregistrarea spectrului Raman este posibil diferenierea marcrilor fluoresceni care dau benzi Raman specifice, fapt care face posibil testarea diferitelor secvene care exist ntr-o zon a cipului. n plus, pentru a detecta cantiti extrem de reduse ale unui anumit lan de ADN existent ntr-o prob se folosete tehnica SERS [18]. n aceste experimente, suprafaa cipului se folosete att ca imobilizator al lanului de ADN ct i ca substrat activ SERS pentru lanul de ADN marcat care va fi adus n vecintate datorit procesului de hibridizare cu lanul imobilizat. Astfel, dac n spectrul SERS se observ benzile moleculei folosite ca marker nseamn c s-a produs hibridizarea ADN-ului. 2.1.3. Localizarea i identificarea unor bacterii Cercetrile din medicin i biologie se confrunt cu necesitatea identificrii precise a unor micro-organisme, ca de ex. bacterii sau virui. Majorita108

tea metodelor de identificare folosesc o evaluare morfologic combinat cu teste specifice n care se urmrete dezvoltarea micro-organismelor n diferite medii i care dureaz pn la 72 de ore. Spectroscopia Raman confocal ofer posibilitatea identificrii unor bacterii individuale. De exemplu, s-a reuit identificarea unor bacterii care conin un cromofor (-carotina, sarcinaxantin) n citoplasma membranei. Pentru aceasta au fost cultivate mai multe bacterii Rhodotorula rubra i Micrococcus luteus, apoi au fost amestecate i o mostr de analiz a fost investigat cu ajutorul unui echipament Raman confocal. Dup nregistrarea spectrelor Raman i analizarea benzilor date de -carotina, care este prezent n Rhodotorula rubra i a benzilor date de sarcinaxantin, existent n Micrococcus luteus, s-a reuit identificarea celor dou bacterii. Trebuie menionat faptul c prin folosirea laserului care excit rezonant cromoforii se obin doar benzile acestora, contribuiile celorlalte componente nefiind prezente n spectru [3].

2.2. Aplicaii n tiina materialelor

2.2.1. Identificarea fazelor cristaline i a tranziiilor de faz Spectrul Raman a diverse nanostructuri este asemntor spectrului unui monocristal, ceea ce faciliteaz identificarea direct a fazelor cristaline [19]. Cunoaterea spectrelor Raman ale diferitelor faze cristaline permite caracterizarea tranziiilor de faz care apar la modificarea temperaturii sau a presiunii prin analiza comparativ a modificrilor care apar n cazul modurilor de vibraie. n plus, observarea unor moduri vibraionale interzise n spectrele Raman reprezint o dovad a distorilor care apar la nivelul reelei cristaline [19]. Existena unei diferene n energia de suprafa ca urmare a modificrii dimensiunii nanoparticulelor, care uneori este n strns corelare cu tranziiile de faz, poate fi de asemenea evideniat prin spectroscopia Raman. S-a artat faptul c structura cristalin a clusterilor nanometrici de TiO2, obinui prin depunere din faza gazoas, sufer o tranziie de la faza de rutil la anatas atunci cnd dimensiunile lor depesc 5 nm [20]. Un alt studiu a dovedit c temperatura la care are loc tranziia de faz ortorombic-tetragonal a structurii ceramice de BaTiO3 depinde de mrimea grunilor [21]. 2.2.2. Analiza domeniilor amorfe Informaiile obinute prin aplicarea spectroscopiei micro-Raman sunt uneori mult mai utile dect cele determinate din analiza de raze X. Este cazul structurilor preponderent amorfe. Att studiile cristalografice ct i 109

cele de spectroscopie Raman se bazeaz pe a interpreta msura dezordinii n termeni de lrgime a benzii. n timp ce n cazul difraciei de raze X apariia lrgimii benzii este asociat cu abaterile de la periodicitate a reelei cristaline pentru un numr nsemnat de atomi, n cazul spectroscopiei Raman doar modurile de vibraie ale reelei i cele de libraie (care se gsesc la numere mici de und) sunt afectate de dezordinea la mare distan. Lrgimea celorlalte benzi Raman este n principal afectat atunci cnd au loc modificri ale cmpului cristalin local, mai exact atunci cnd apar modificri structurale n ordinea la mic distan, n prima sfer de coordinare (0.1-0.5 nm) i respectiv n cea de a doua (0.5-5 nm) [19]. Dac se ine seama de descrierea molecular a vibraiilor, modurile Raman de deformare sunt influenate de dezordinea geometriei locale, n timp ce modurile de intindere sunt afectate de dezordinea vecintilor, care sunt reprezentate de anumii atomi ai altor subreele sau de defecte care apar ca urmare a substituiei de atomi sau a prezenei vacanelor. Din datele obinute n urma analizei de difracie de raze X se poate evidenia faptul c exist domenii cu structura periodic i dezordonat, cu precdere n cazul structurilor dominate de legturi covalente puternice, dar nu poate fi facut o separare spaial a acestora [22]. Aplicarea spectroscopiei micro-Raman la studiul materialelor i n special al polimerilor poate face uneori distincie ntre domeniile conformaionale submicrometrice cristaline i amorfe. Cel mai rapid mod de a obine componenta amorf i cea cristalin este de a deconvoluiona modurile Raman situate la numere de und mici n vecintatea liniei Rayleigh care conin cele dou componente [23]. Raportul ariilor celor dou benzi ofer o bun estimare a gradului de cristalinitate al probei. Separarea fazelor poate fi de asemenea studiat n cazul sticlelor unde valoarea numrului de und la care apare semnalul Raman este strns legat de conectivitatea unitilor structurale poliedrice constitutive [24]. Atribuirea benzilor n aceste cazuri se face pe baza comparaiei cu spectrele experimentale obinute pe faze cristaline similare compoziional structurii sticlelor sau vitroceramicilor investigate, sau cu cele obinute prin simulri teoretice [25, 26]. 2.2.3. Structuri alotrope de carbon Microspectroscopia Raman a fost des utilizat la studiul structurilor alotrope ale carbonului (diamant, grafit, fulerene, nanotuburi, etc.). Este una dintre puinele tehnici sensibile la modificrile structurale care apar n aceste tipuri de materiale, de la structuri cu grad de cristalinitate extrem de ridicat la structuri amorfe. Astfel, n spectrele Raman ale acestor structuri 110

apar clar definite benzi datorate vibraiilor date de structuri grafitice (notate G) i de structuri dezordonate (notate D i D). Extrem de important este faptul c n cazul nanotuburilor de carbon apar, n regiunea numerelor mici de und (< 200 cm-1), benzile datorate modurilor de respiraie radial (Radial Breathing Mode) cu ajutorul crora se poate determina diametrul nanotubului (relaie de invers proporionalitate cu valoarea frecvenei Raman) [19].

2.3. Aplicaii n tiina mediului

2.3.1. Studii structurale ale componentelor solului: Acidul humic Caracterizarea structural a acidului humic precum i determinarea comportamentului lui de complexare sunt extrem de importante n tiina mediului. Acidul humic apare n sol i n apele subterane i este implicat n numeroase procese chimice i biologice care au loc n mediul terestru i acvatic. Cunoaterea proprietilor chimice este esenial pentru dezvoltarea unor modele ecologice folosite pentru remedierea i detoxificarea de compui antropogenici sau chiar de reziduuri nucleare [3]. Studiile SERS ale acidului humic au condus la obinerea unor informaii legate de mecanismele de legare i/sau configuraiile de complexare ale acidului humic. 2.3.2. Detecia poluanilor din ap Prezena poluanilor organici n ap a devenit o problem de actualitate pentru comunitatea internaional. Compui chimici precum hidrocarburile aromatice, derivaii toxici de azot, fenolii sau derivaii naftalinei sunt prezeni n mediile acvatice datorit utilizrii lor ca pesticide sau n procesele industriale. Persistena precum i efectele toxicologice ale acestor compui i ale produilor lor intermediari sunt semnale de alarm pentru ageniile de resort din lume. Acestea au stabilit o concentraie maxim permis a acestor compui n apa potabil de < 1 g/l. Pentru a detecta aceste concentraii mici este necesar folosirea unor tehnici instrumentale extrem de sensibile. Tehnica SERS datorit sensibilitii sale este capabil s detecteze concentraii extrem de sczute ale acestor substane. Cu ajutorul acestei tehnici este posibil determinarea orientrii i a modului de adsorbie al acestor molecule pe suprafaa substratului activ SERS [27]. Determinarea substratului SERS cel mai potrivit pentru fiecare tip de poluant reprezint un prim pas n dezvoltarea unui senzor bazat pe metoda SERS.

111

3. Prezentarea echipamentului de microscopie Raman confocal WITec CRM 200 i a parametrilor optimi de funcionare pentru diverse aplicaii
3.1. Prezentarea echipamentului de microscopie Raman confocal WITec CRM 200
Echipamentul de microscopie Raman confocal CRM 200 cu scaner este dotat cu un microscop optic care este echipat cu 4 obiective plan acromatizate de apertura numeric (NA) 0.3, 0.45, 0.8 i 1.25 i mrire 10X, 20X, 50X i respectiv 100X (uscat i n ulei de imersie), incluznd de asemenenea un obiectiv (cu cantilever ataat) pentru analiza AFM n lichide i o camer video color. Echipamentul mai conine un sistem de focalizare motorizat cu posibilitate de deplasare pe o distan de 30 mm i o rezoluie de 50 nm (un pas) i o platform de scanare prin acionare piezo-electric cu urmtoarele caracteristici: suprafaa de scanare de 200 m x 200 m x 20 m, acuratee de poziionare pe direciile x i y sub 4 nm iar pe direcia z sub 1 nm, posibilitate de poziionare a probei n planul x-y ntr-o regiune de 20 mm x 20 mm cu o rezoluie mai mic de 1 m. Sistemul de microscopie Raman confocal lucreaz n urmtoarele moduri de operare: - achiziie de spectre din arii selectate (confocal micro-Raman) - achiziie de spectru/pixel (scanare) - imagistica spectral Raman la lungimi de und fixe, pe direciile x-y, x-z i y-z (pn la 1024 x 1024 pixeli) - microscopie confocal n reflexie - microscopie de cmp ntunecat cu obiectiv EC Epiplan-Neofluar 100X/0.9 HDDIC, reflector de cmp intunecat - imagistica de fluorescen confocal (prin montare de filtre adecvate) Sistemul dispune n prezent de 2 lasere, un YAG 532 nm i un He-Ne 633 nm, domeniul lungimilor de und de excitaie 442-785 nm, detecie Raman ntre 150-3500 cm-1, spectrometru UHTS 300, cuplaj cu fibr optic standard SMA, fibre optice multimod (100, 50 i 25 m), conectori, dou reele de difracie cu 600 i respectiv 1800 linii/mm, detector CCD cu rcire Peltier (1340 x 100 pixeli) i iluminare prin spate tip Marconi. Drumul razelor n interiorul echipamentului CRM 200 este prezentat n schema de mai jos (Fig. 3) [28]. Rezoluia optic lateral la linia laserului de 532 nm este de 250 nm. Dimensiunea maxim a probelor care pot fi msurate este de 120 mm n diametru i 20 mm nlime. 112

01. laserul 02. fibra optic standard 03. obiectivul 04. platforma de scanare 05. fibra optic multimod 06. spectrometru UHTS 300 07. lampa cu lumin alb pentru iluminare 08. sistem de focalizare motorizat pe axa z 09. camera video Figura. 3. Drumul razelor n microscopul Raman WITec CRM 200.

3.2. Parametrii optimi de funcionare

3.2.1. nregistrarea spectrelor Raman confocale n echipamentul CRM 200 radiaia laser ajunge n microscop printr-o fibr optic standard iar radiaia Raman mprtiat, colectat cu ajutorul obiectivului de microscop, este transmis spectrometrului echipat cu o camer CCD prin intermediul unei fibre optice multimod. Diametrul acestei fibre joac rolul pinholului cu ajutorul cruia se realizeaz confocalitatea [29]. Fibra este montat n planul imagine al microscopului i poate fi ajustata astfel nct s se obin eficiena maxim de colectare. Echipamentul CRM 200 are n dotarea standard trei fibre multimod cu diametre de 100, 50 i 25 m. Relaia care trebuie ndeplinit n cazul msurtorilor Raman confocal este

d 0 M , unde M este mrirea obiectivului, d0 diametrul NA v P max pinholului, NA apertura numeric a obiectivului de microscop, lungimea

de und, iar vPmax este un parametru variabil a crui valoare trebuie stabilit n funcie de tipul de informaie spectral care se dorete a fi obinut (ex. pentru a obine cea mai mare rezoluie lateral vPmax 0.5, iar pentru vPmax 4 nu se modific semnificativ rezoluia axial). Partea stng a ecuaiei este legat doar de parametrii obiectivului de microscop. 113

Tabelul 1. Raportul M/NA pentru diferite tipuri de obiective de microscop. Obiectiv microscop M/NA 10 / 0,25 53 20 / 0,4 50 40 / 0,6 67 60 / 0,8 75 100 / 0,9 111 100 / 1,25 80 100 / 1,4 71

Tabelul 2. Raportul d0/2,5 pentru diferite lungimi de und i diametre ale pinholului. Lungime de und [nm] d0 = 10 m d0 = 25 m d0 = 50 m d0 = 100 m d0 = 200 m 440 29 71 142 286 571 488 26 64 129 258 515 532 24 59 118 236 472 633 20 50 99 199 397 785 16 40 80 160 320

Cu ajutorul celor dou tabele poate fi determinat mrimea corect a pinholului n msurtorile Raman confocal efectuate cu echipamentul CRM 200. Astfel, pentru msurtori n care este utilizat un laser cu lungimea de und de 532 nm, un obiectiv de microscop cu mrire de 100 i o apertur numeric de 0,9, cea mai mare rezoluie axial s-ar obine pentru un diametru optim al pinholului de 50 m, n timp ce cea mai mare rezoluie lateral s-ar obine pentru un diametru optim al pinholului de 10 m. naintea efecturii msurtorilor propriu-zise, n vederea stabilirii parametrilor optimi, se parcurg urmtoarele etape: - se lucreaz cu fibra de 100 i cu obiectivul de 20X sau 50X. Dac semnalul Raman obinut este bun, se schimb obiectivul de 100X. n anumite situaii se poate schimba i fibra (vezi detaliile despre confocalitate prezentate mai sus) - pentru a stabili puterea laserului, se folosete intensitatea liniei Rayleigh (ar fi bine s nu depeasc 400 ccd cts, fiind indicat s fie chiar mai mic de 200 ccd cts; n cazul n care nu se obine semnal Raman se crete puterea laserului). Puterea laserului trebuie aleas astfel nct s nu induc transformri probei (fotodegradare, etc.), iar spectrele obinute s aib un raport semnal/zgomot multumitor. De exemplu, n experimente SERS pe molecule biologice se folosete o putere a laserului sub 1 mW. n caz contrar, apare riscul de a obine semnal de la contaminani sau se poate degrada molecula. Dac proba de interes nu este predispus la transformri din cauza laserului, se pot utiliza puteri mai mari ( 3 mW). - stabilirea timpului de nregistrare se face n funcie de intensitatea semnalului Raman obinut (se poate alege de ordinul milisecundelor sau de ordinul minutelor) 114

Exemplu: Spectrul SERS al adeninei nregistrat pe substrat solid obinut prin picurarea soluiei coloidale de argint cu adenin pe o sticl de microscop.
35000 30000

25000

Intensity [ccd cts]

20000

15000

10000

5000

0 400 600 800 1000 1200

-1

1400

1600

1800

Raman shift [cm ]

Parametrii folosii: fibra multimode de 100 m obiectivul 100X aer linia laser 632.8 nm puterea laserului 640 W timp de integrare/msurare 60 s 3.2.2. Imagistica Raman confocal Pentru imagistic este indicat utilizarea obiectivului de 100X (n aer sau cu imersie n ulei). naintea efecturii unei scanri se stabilesc parametrii optimi de nregistrare (puterea laserului i timpul de integrare) prin msurarea spectrelor individuale i time series. Referitor la timpul de integrare, ideal este s fie ct mai mic cu puin (ntre 0,1 s i 1 s), iar stabilirea lui depinde de tipul probei, de puterea laserului i de aria scanat. n ceea ce privete stabilirea numrului de linii i de puncte pentru suprafaa pe care dorim s-o scanpm, n general pentru o arie de 10 m x 10 m se utilizeazp minim 75 linii i 75 de puncte pentru fiecare linie (la un numr prea mic de linii i de puncte imaginea este de proast calitate). Exemplu. Harta spectral a intensitii benzii Raman de la 737 cm-1 din spectrul SERS al adeninei nregistrat pe substrat solid obinut prin picurarea soluiei coloidale de argint cu adenina pe o sticl de microscop. 115

500

737

400

Intensity [ccd cts]

300

200

100

0 500 1000 1500

-1

Raman shift [cm ]

n spectrul selectat din imaginea scanat se poate observa semnalul curat de la adenin. Parametrii folosii: fibra optic multimod 100 m obiectivul 100X (aer) linia laser 632.8 nm puterea laserului: 640 W suprafaa scanat: 10 m x 10 m 75 linii; 75 puncte/linie timp de integrare 0.5 s/punct (softul calculeaz timpul de integrare pentru o linie n acest caz 37,5 s (trace) i 0.075 s (retrace) Exemplu. Imagistica Raman pe o seciune dintr-un dinte, la interfaa dintre dinte i plomb

116

Parametrii folosii: fibra optic multimod 100 m obiectivul 100X (aer) linia laser 532 nm putere laser 3 mW. suprafaa scanat 10 m x 10 m nr. de linii 150, puncte 150/linie timp de integrare 0.2 s/punct

3.3. Accesorii
3.3.1. Modul de microscopie de for atomic model alpha 300 Echipamentul de microscopie Raman confocal CRM 200 cu scaner este combinat cu un modul de microscopie de for atomic (AFM) model alpha 300.

01. camera video 02. unitatea de deflexie a razelor 03. lampa cu lumin alb pentru iluminare 04. obiectivul AFM cu cantilever 05. platforma de scanare 06. masa antivibraie

Figura 4. Drumul razelor n microscopul de for atomic alpha300.

Microscopul AFM alpha 300 lucreaz n urmtoarele moduri: contact mod, for lateral, acustic (tapping) mod, contact mod intermitent cu imagistica n faz i amplitudine cu o rezoluie de 16 bit, digitizare 5 MHz, i frecvena 10-500 KHz. Sistemul dispune de un laser de deflexie 980 nm, o unitate de detecie a deflexiei, masa antivibraie 0.7 1000 Hz, > 1000 Hz pasiv. Aria de scanare este de 100 m x 100 m x 20 m. Drumul razelor n interiorul microscopului de for atomic alpha 300 este prezentat n schema de mai sus (Fig. 4) [30]. 117

Parametrii optimi de funcionare 1. Modul acustic (AFM AC-Mode) Este modul de operare uzual, utilizat mai ales n cazul probelor moi (probe biologice). Se folosesc tip-uri de Si3N4 fixate pe cantilever-uri cu frecvena de rezonan mare (200 300 kHz). n vederea realizrii alinierii se efectueaz urmtorii pai: Se determin frecvena liber de oscilaie a cantileverului aplicnd o tensiune de 0.05 0.1 V Se ajusteaz amplitudinea oscilaiilor libere ale cantilever-ului pn la o tensiune de 2 V Se seteaz un setpoint de 1.5 V Se seteaz P-gain (proportional gain) la 5.0 i I-gain (integral gain) la 5.0. Valorile tipice ale parametrilor pentru scanare sunt: Numr puncte pe linie: 256 Numr linii pe imagine: 256 Timpul scanare pe linie: 0.5 2 s n timpul scanrii se ajusteaz P-gain i I-gain astfel nct drumul nainte i drumul napoi s coincid. Apropierea tip-ului de substrat se face automat.

Imagine topografic AFM

Imagine faz AFM

2. Modul contact (AFM contact mode) - Permite nregistrarea de imagini, scanarea de-a lungul unei singure linii sau nregistrarea curbelor de for. - n vederea realizrii alinierii se efectueaz urmtorii pai: - Se utilizeaz tip-ul de AFM dorit. 118

Se seteaz P-gain (proportional gain) la 5.0 i I-gain (integral gain) la 5.0. - Apropierea tip-ului de substrat se face automat. - Valori tipice ale parametrilor pentru scanare: - Numr puncte pe linie: 256 - Numr linii pe imagine: 256 - Timpul scanare pe linie: 0.5 2 s peraturi.

3.3.2. Celula Linkam pentru efectuarea unor msurtori la diferite temDomeniul de temperatur: -196 - 600 C. Stabilitate < 0.1 C. Rata de nclzire: max 150 C/min. Senzor din platin 100 . Sistem de rcire a corpului celulei cu ap pentru temperaturi > 300 C.

4.Bibliografie
I. R. Lewis, H. G.M. Edwards (Eds.), Handbook of Raman Spectroscopy, Marcel Dekker Inc. New York, 2001. 2. S. Astilean, Metode i tehnici moderne de spectroscopie optica, Spectroscopia IR i Raman, Editura Casa Cartii de Stiinta, Cluj-Napoca, 2002. 3. R. Petry, M. Schmitt, J. Popp, Raman SpectroscopyA Prospective Tool n the Life Sciences, ChemPhysChem, 4, 14, 2003. 4. S. Schluecker, (Ed.), Surface Enhanced Raman Spectroscopy: Analytical, Biophysical and Life Science Applications, Wiley VCH, 2010. 5. M. Fleischmann, P. J. Hendra, A. J. McQuillan, Raman spectra of pyridine adsorbed at a silver electrode, Chem. Phys. Lett., 26, 163, 1974. 6. T. Vo-Dinh, SERS chemical sensors and biosensors: new tools for environmental and biological analysis, Sensors and Actuators B, 29, 183, 1995. 7. J. A. Creighton n Spectroscopy of Surfaces, Vol. 21 (Eds.: R. J. H. Clark, R. E. Hester), John Wiley & Sons, New York, 1988. 8. D. A. Weitz, M. Moskovits, J. A. Creighton n Surface-Enhanced Raman Spectroscopy with Emphasis on Liquid - Solid Interfaces, Vol. 2 (Eds.: R. B. Hall, A. B. Ellis),VCH, Deer field Beach, FL, pp. 197- 243, 1986. 9. G. A. Baker, D. S. Moore, Progress n plasmonic engineering of surface-enhanced Raman-scattering substrates toward ultra-trace analysis, Anal. Bioanal. Chem. 382, 1751, 2005. 10. K. Kneipp, H. Kneipp, P. Corio, S. D. M. Brown, K. Shafer, J. Motz, L. T. Perelman, E. B. Hanlon, A. Marucci, G. Dresselhaus, M. S. Dresselhaus, Surface-Enhanced and Normal Stokes and Anti-Stokes Raman Spectroscopy of Single-Walled Carbon Nanotubes, Phys. Rev. Let. 84, 3470, 2000. 11. N. Weissenbacher, B. Lendl, J. Frank, H. D. Wanzenboeck, B. Mizaikoff, R. Kellner, Continuous Surface Enhanced Raman Spectroscopy for the Detection of Trace Organic Pollutants n Aqueous Systems, J. Mol. Struct. 539, 410, 1997. 1.

119

12. X. Zhang, M. A. Young, O. Lyandres, R. P. Van Duyne, Rapid Detection of an Anthrax Biomarker by Surface-Enhanced Raman Spectroscopy, J. Am. Chem. Soc. 127, 4484, 2005 13. D. S. Grubisha, R. J. Lipert, H. Y. Park, J. Driskell, M. D. Porter, Femtomolar detection of prostate-specific antigen: an immunoassay based on surface-enhanced Raman scattering and immunogold labels, Anal. Chem., 75, 5936, 2003. 14. K. E. Shafer-Peltier, C. L. Haynes, M. R. Glucksberg, R. P. Van Duyne, Toward a Glucose Biosensor Based on Surface-Enhanced Raman Scattering, J. Am. Chem. Soc., 125, 588, 2003; C. R. Yonzon, C. L. Haynes, X. Zhang, J. T. Jr. Walsh, R. P. Van. Duyne, A glucose biosensor based on surface-enhanced Raman scattering: improved partition layer, temporal stability, reversibility, and resistance to serum protein interference, Anal. Chem. 76, 78, 2004. 15. L. Bao, S. M. Mahurin, R. G. Haire, S. Dai, Silver-doped sol-gel film as a surface-enhanced Raman scattering substrate for detection of uranyl and neptunyl ions, Anal. Chem. 75, 6614, 2003. 16. J. M. Chalmers and P. R. Griffiths, (Eds.), Handbook of Vibrational Spectroscopy, John Wiley and Sons, Chichester, pp. 1419-1428, 2002. 17. N. J., Everall, Depth Profiling with Confocal Raman Microscopy, Part II, Spectroscopy 19, 16, 2004. 18. C. G. Coates, J. J. McGarvey, On the Pulse: Andor tehchnology, 1(8), 2001. 19. G. Gouadec, P. Colomban, Raman Spectroscopy of nanomaterials: How spectra relate to disorder, particle size and mechanical properties, Progress n Crystal Growth and Characterization of Materials 53, 1, 2007. 20. E. Barborini, I. N. Kholmanov, P. Piseri, C. Ducati, C.E. Bottani, P. Milani, Engineering the nanocrystalline structure of TiO2 films by aerodynamically filtered cluster deposition, Appl. Phys. Lett. 81, 3052, 2002. 21. M. H. Frey, D. A. Payne, Grain-size effect on structure and phase transformations for barium titanate, Phys. Rev. B, 54, 3158, 1996. 22. A. Guinier, Thorie et Technique de la Radiocristallographie, Dunod, Paris, 1956. 23. M. F. Cerqueira, L. Rebouta, M. Andritschky, J.A. Ferreira, M. F. Da-Silva, Microcrystalline silicon thin films prepared by RF reactive magnetron sputter deposition, Vacuum 46, 1385, 1995. 24. D. G. Georgiev, M. Mitkova, P. Boolchand, G. Brunklaus, H. Eckert, M. Micoulaut, Molecular structure, glass transition temperature variation, agglomeration theory, and network connectivity of binary P-Se glasses, Phys. Rev. B, 64, 134204, 2001. 25. D. G. Georgiev, P. Boolchand, K.A. Jackson, Intrinsic nanoscale phase separation of bulk As2S3 glass, Phil. Mag., 83, 2941, 2003. 26. Y. Wang, J. Wells, D. G. Georgiev, P. Boolchand, K. Jackson, M. Micoulaut, Sharp Rigid to Floppy Transition Induced by Dangling Ends n a Network Glass, Phys. Rev. Lett., 87, 185503, 2001. 27. E. A. Carrasco, M. Campos-Vallette, P. Leyton, G. Diaz, R. E. Clavijo, J. V. Garca-Ramos, N. Inostroza, C. Domingo, S. Sanchez-Cortes, R. Koch, Study of the Interaction of Pollutant Nitro Polycyclic Aromatic Hydrocarbons with Different Metallic Surfaces by Surface-Enhanced Vibrational Spectroscopy (SERS and SEIR), J. Phys. Chem. A, 107, 9611, 2003. 28. http://www.witec.de/en/company/witecnews/19/crm200flyer.pdf 29. Manual WITec CRM200. 30. www.witec.de/en/download/AFM/alpha300Aflyer.pdf

120

Microspectroscopia Raman partea a II-a

Conf. dr. Monica Maria Baia Cuprins
1. Stadiul actual al cercetrilor exploratorii prin spectroscopie Raman................... 121 1.1. Substrate SERS ............................................................................................. 122 1.2. Identificarea unor bacterii ............................................................................. 122 1.3. Caracterizarea celulelor ................................................................................. 123 1.4. Diagnosticarea unor boli ............................................................................... 124 1.5. Aplicaii n domeniul farmaceutic................................................................. 125 1.6. Aplicaii n domeniul alimentar .................................................................... 125 1.7. Nanotuburi de carbon ................................................................................... 126 2. Tematici de cercetare ale laboratorului de microscopie Raman confocal din cadrul platformei ICI-BNS................................................................................... 126 3. Tematici de cercetare posibil de implementat n cadrul laboratorului de microscopie Raman confocal al platformei ICI-BNS .......................................... 128 4. Bibliografie ........................................................................................................... 130

1. Stadiul actual al cercetrilor exploratorii prin spectroscopie Raman

n ultima perioad, odat cu dezvoltarea tehnologic a aparaturii aferente care permite nregistrarea rapid a spectrelor Raman folosind diferite linii de excitare laser precum i vizualizarea zonelor cu ajutorul microscopiei de for atomic sau a celei electronice de baleiaj, microspectroscopia Raman este din ce n ce mai mult aplicat n diverse domenii cum ar fi: medicin, biologie, studiul materialelor, geologie i mineralogie, arta, tiina mediului, controlul calitii alimentelor, etc. [1]. Datele bibliometrice furnizate de Thomson Reuters ISI Web of Science confirm faptul c n perioada 2001-2009 numrul publicaiilor referitoare la spectroscopia Raman i aplicaiile ei s-a dublat de la 1931 nregistrate n 2001 la 4078 aprute n 2009 [1]. Aceast cretere a numrului de publicaii este datorat, n principiu, urmtoarelor motive: (a) dezvoltrii continue a metodei SERS; (2) progresului extraordinar nregistrat n domeniul fabricrii controlate a nanomaterialelor i a nanostructurilor; (3) creterii eficienei n imagistica biomedical i de diagnosticare a bolilor; (4) numrului tot 121

mai mare de aplicaii n afara laboratorului (art, arheologie, criminalistic, farmaceutice), (5) designului tot mai sofisticat i controlat al pulsurilor laser ultrarapide utilizate n aplicaii care exploateaz efectele Raman neliniare. Din domeniul vast de aplicabilitate al spectroscopiei Raman se remarc cu precdere aplicaiile biomedicale, axate pe diagnosticarea unor boli, de identificare a unor bacterii, de investigare a unor celule vii, cele din domeniul nanoparticulelor i nanomaterialelor, precum i cele din domeniul artei i arheologiei, farmaceutic i alimentar. Astfel, n continuare vom face o trecere n revist a principalelor domenii de aplicabilitate, fcnd o referire concret la cele mai recente cercetri.

1.1. Substrate SERS

n ultimii ani, metoda SERS s-a dezvoltat considerabil datorit obinerii unor substrate SERS capabile s produc o amplificare important a semnalului Raman al speciilor adsorbite, reproductibil i stabil n timp. Uniformitatea rspunsului SERS al substratelor depinde de morfologia lor. Astfel, s-a dovedit c gradul de amplificare poate fi controlat prin utilizarea unor metode de nanofabricare a structurii suprafeei n termeni de mrime, form i distana dintre formaiunile de pe suprafa, pe care adsorb speciile moleculare. Astfel, n ultima perioad pe lng substratele SERS obinute prin litografie cu fascicul de electroni, litografie cu nanosfere de polistiren [2-4] au fost preparate i substrate constnd din nanoparticule anizotrope de forme diferite [5, 6]. De asemenea, au fost realizate noi substrate constnd din nanotuburi de TiO2 pe care a fost depus Ag, sau nanofire de ZnO pe care a fost depus Au [7, 8] toate manifestnd o activitate SERS remarcabil.

1.2. Identificarea unor bacterii

Identificarea rapid i precis a micro-organismelor a devenit o cerin important nu numai pentru analizele clinice, sau cele ale unor materiale frauduloase, ci i n diferite aplicaii cum ar fi producia de medicamente sau tehnologia de procesare a mncrii. n toate aceste aplicaii este de dorit ca timpul de cultivare a micro-organismelor s fie minimizat pentru a prescrie pacienilor n timp util tratamentul corespunztor sau pentru a reduce timpul n care unitile de producie sunt nchise din cauza unor disfuncionaliti. Majoritatea metodelor convenionale de identificare a bacteriilor se bazeaz pe efectuarea unor teste chimice dup cultivarea microorganismelor n diferite medii i necesit timp ndelungat. Dintre tehnicile 122

care permit identificarea rapid a micro-organismelor spectrosopia Raman a devenit una dintre cele mai promitoare metode [9] . Procedura de caracterizare a unei celule bacteriene cu ajutorul spectroscopiei Raman const n patru etape: colectarea micro-organismelor, localizarea moleculelor biologice cu ajutorul unor markeri fluoresceni, nregistrarea spectrelor Raman i compararea lor cu alte spectre existente n baze de date n scopul identificrii bacteriilor. Combinnd rezultatele Raman cu o metod de clasificare bazat pe chemometrie s-a reuit identificarea subspeciei unor bacterii cu o probabilitate de 98% [10]. O alt modalitate de identificare a bacteriilor i/sau a sporilor este cu ajutorul metodei SERS. n acest caz, se detecteaz prezena unui compus chimic, cunoscut ca biomarker al sporilor sau al bacteriei [11]. Relativ recent, a fost dezvoltat o metod de identificare a unor bacterii pe un cip microfluidic [12]. Prin aplicarea unui cmp electric pe un electrod de aur s-a reuit sortarea bacteriilor, concentrarea lor i apoi, prin nregistrarea specrelor SERS n cip, cercettorii au fost capabili s identifice fiecare bacterie pe baza semnturii sale spectrale. Testele au fost efectuate pentru dou tipuri de bacterii Gram positive (Staphylococcus aureus) i Gram negative (Pseudomonas aeruginosa). Cu ajutorul acestei metode se mbunteste semnificativ timpul i efortul necesar identificrii diferitelor bacterii din mncare sau alt materie organic.

1.3. Caracterizarea celulelor

Spectroscopia Raman este o metod sensibil pentru studiul biochimic al celulei fiind capabil s pun n eviden modificri care apar n urma interaciunii cu diferii ageni [13]. Pe de alt parte, microscopia de for atomic ofer informaii despre topografia suprafeei, adeziunea i elasticitatea celular a unei celule. Prin utilizarea combinat a celor dou metode pot fi investigate proprietile biomecanice i biochimice ale celulelor vii n diferite condiii fiziologice [14]. Spectrele Raman ale celulelor vii const din benzi corespunztoare biopolimerilor existeni n celule (lipide, proteine, ADN, ARN). Cu ajutorul spectrelor Raman este posibil discriminarea celulelor vii de cele moarte. Acest lucru este extrem de important n realizarea unui biosenzor. De asemenea, cu ajutorul spectroscopiei Raman este posibil monitorizarea n timp a interaciunii dintre celule i diverse medicamente, precum i diferite elemente toxice folosite n bioterorism, n vederea stabilirii efectelor acestei interaciuni.

123

1.4. Diagnosticarea unor boli

Dup introducerea spectroscopiei Raman n studiul pielii de ctre Williams et all n 1992 [15] utilizarea ei n acest domeniu a devenit tot mai frecvent. n prezent, spectrele Raman nregistrate pe piele sunt bine analizate i pe baza diferenelor s-a pus n eviden existenta unor boli [16, 17]. Deoarece intensitatea semnalului Raman este sczut, timpii de achiziie sunt extrem de lungi i din aceast cauz aplicaiile clinice sunt reduse. Relativ recent, s-a reuit implemetarea spectroscopiei Raman n aplicaii clinice prin intermediul unui sistem capabil s nregistreze i s analizeze n timp real spectre Raman in vivo [18]. Cu ajutorul acestui sistem s-a reuit efectuarea unei evaluri a pielii unor voluntari precum i diagnosticarea unor boli ale pielii. S-a constatat c exist regiuni spectrale care prezint benzi specifice pentru piele provenit din diferite regiuni ale corpului. De asemenea, s-a constatat c semnturile spectrale specifice ale pielii difer de la un individ la altul. Astfel, prin evaluarea raportului dintre coninutul de lipide i proteine se poate face o evaluare a pielii precum i o diagnosticare cu ajutorul spectroscopiei Raman [19]. De asemenea spectroscopia Raman permite identificarea i monitorizarea melaninei, un pigment natural care acioneaz ca un scut mpotriva radiaiei solare, nltur speciile chimice active i produce radicali activi care afecteaz ADN-ul. Cancerul este o boal complex indus de o instabilitate genetic i o acumulare a unor alternri moleculare multiple [20]. Deoarece diagnosticarea timpurie implic o rat de supravieuire ridicat, un interes deosebit l-a avut dezvoltarea unor metode de detecie molecular care s permit vizualizarea unor biomarkeri sau a unor evenimente celulare i s indice starea de fapt a cancerului. Spectroscopia Raman este o metod util n diagnosticarea cancerului datorit sensibilitii sale de a detecta modificri moleculare extrem de mici care sunt asociate cu cancerul, cum ar fi o cretere a raportului dintre nucleu i citoplasm, existena cromatinei dezordonate, o activitate metabolic crescut i modificri ale cantitilor de lipide i proteine [21]. n principal spectroscopia Raman a fost aplicat la diagnosticarea cancerului de piele, de sn, de tract gastrointestinal i cervical sau de col uterin [21]. Senzorii optici bazai pe metoda SERS au fost n ultima perioad destul de des folosii pentru diagnosticarea in vitro i in vivo a cancerului [22]. Ei sunt capabili s ofere informaii moleculare specifice despre moleculele int de interes, fr o marcare prealabil a acestora.

124

1.5. Aplicaii n domeniul farmaceutic

Spectroscopia Raman a devenit o metod rapid, direct i nedistructiv n analizele farmaceutice, odat cu dezvoltarea aparatelor i a metodelor chemometrice de analiz. Majoritatea studiilor se bazeaz pe investigarea ingredientului farmaceutic activ i n consecin, bazele de date existente conin informaii referitoare la aceste ingrediente. Reletiv recent [23] a fost publicat o baz de date cu spectre Raman ale mediului excipient n care este nglobat ingredientul farmaceutic activ, astfel nct se pot realiza analize complete ale produselor farmaceutice. n ultima perioad, creterea cantitii de medicamente contrafcute pe pia pune n pericol sntatea cetenilor i ridic un semnal de alarm. Aceste produse pot fi duntoare sntii deoarece conin impuriti inodore, pot fi inactive i/sau s aib o absorbabilitate sczut sau chiar inexistent. De asemenea, aceste medicamente pot conine alte ingrediente dect cele dorite, cantiti incorecte ale agenilor farmaceutici activi sau ambalaje necorespunztoare. Cu ajutorul spectroscopiei Raman se pot obine informaii specifice legate de identificarea ingredientului farmaceutic activ, a mediului excipient, precum i informaii utile legate de identificarea elementelor necunoscute [24].

1.6. Aplicaii n domeniul alimentar

Melamina este un ingredient folosit la obinerea plasticului, dar este frecvent adugat n mod abuziv i n mncare, pentru a crea impresia fals a unui coninut ridicat de proteine, deoarece aceast molecul conine un numr mare de atomi de azot. n anul 2007, aproximativ 1700 de cini i pisici din SUA au murit ca urmare a consumului de mncare contaminat cu melamin [25]. n esuturile i urina animalelor moarte au fost detectate, pe lng melamin, i cantiti reduse de acid cianuric, amelina i amelida, care au rezultat cel mai probabil din descompunerea unor derivai ai melaminei [26]. n anul 2008, 54000 de copii au fost intoxicai iar 5 au murit ca urmare a consumului de lapte contaminat, produs n China. Mai trziu s-a aflat c melamina a fost introdus intenionat n multe alte produse lactate produse n China i destinate exportului [25]. Spectroscopia Raman a fost utilizat n analizarea melaminei din gluten, hrana pentru pui, prjituri i tiei [27]. A fost de asemenea identificat melamina din fina contaminat, gluten din porumb, hrana pe baz de soia, lapte praf i a fost stabilit un algoritm de analiz calitativ i cantitativ a melaminei din amestecuri [26]. n plus, spectroscopia Raman mpreun cu 125

imagistica Raman au fost utilizate pentru o testare rapid a hranei n vederea deteciei melaminei pentru a crete sigurana i securitatea public. n toate aceste studii s-a urmrit banda caracteristic a melaminei de la 676 cm-1. Limita de detecie a melaminei a fost de 1%. Spectroscopia micro-Raman confocal a fost utilizat i la stabilirea compoziiei unor sucuri de fructe [28]. S-a determinat existena a trei componente importante ale sucurilor de fructe i anume pectina, fructoza i -carotenul. Acest fapt ar permite utilizarea acestei metode pentru monitorizarea on-line a coninutului acestor substane n sucurile aflate n diferite stagii de producie. Astfel, microspectroscopia Raman poate fi o metod de analiz complementar sau alternativ msurtorilor de turbiditate care sunt de obicei utilizate n industria alimentar n producia berii, monitorizarea apei, etc. n plus, pe lng faptul c ar detecta particule nedorite, aceast metod ar putea oferi informaii i despre caracteristicile lor biochimice. Prin utilizarea combinat a spectroscopiei Raman cu alte tehnici de analiz se pot obtine informaii cantitative referitoare la particulele nedorite prezente n sucurile de fructe [29].

1.7. Nanotuburi de carbon

Spectroscopia Raman este o metod consacrat pentru caracterizarea nanotuburilor de carbon, n general i a celor funcionalizate, n special [30]. Heise i colaboratorii si [31] au caracterizat materiale pe baz de carbon utiliznd spectroscopia Raman prin compararea spectrelor nregistrate pe filtre cu nanotuburi de carbon, nanotuburi de carbon cu un perete sau cu mai muli perei, carbon poros grafitizat i grafit. Spectroscopia Raman a fost de asemenea aplicat la investigarea nanomaterialelor ncapsulate n nanotuburi de carbon pentru a determina procesul de umplere a nanotuburilor cu C60, C59N i antracena. S-a demonstrat modul n care deschiderea sau nchiderea reversibil a nanotuburilor poate fi utilizat pentru a monitoriza cu succes procesul de umplere [32].

2. Tematici de cercetare ale laboratorului de microscopie Raman confocal din cadrul platformei ICI-BNS
n prezent, printre tematicile de cercetare ale platformei se regsesc multe dintre cele prezentate anterior. Astfel, n cadrul grupului care utilizeaz echipamentul de microscopie Raman confocal WITec CRM 200 combinat cu un modul de microscopie de for atomic (AFM) model alpha 300, se desfoar cercetri interdisciplinare axate pe fabricarea i biofuncionalizarea unor nanoparticule de metal nobil, precum i a unor 126

nanostructuri hibride, cu scopul de a permite dezvoltarea unor noi aplicaii spectroscopice i plasmonice. O mare parte a activitii de cercetare este concentrat pe obinerea de noi substrate SERS, ordonate i dezordonate, folosind metode de auto-asamblare. Astfel, n cazul substratelor ordonate s-au folosit nanosfere de polistiren peste care au fost depuse filme metalice [33-36], iar n cazul celor dezordonate au fost obinute diferite tipuri de nanoparticule metalice care au fost asamblate pe substrate solide funcionalizate/nefuncionalizate anterior [37-45]. n figura de mai jos (Fig. 1) este prezentat o selecie a tipurilor de substrate SERS ordonate obinute (Fig. 1a) i a nanoparticulelor sintetizate i testate din punct de vedere a capacitii lor de amplificare a semnalului Raman al unor specii moleculare adsorbite pe suprafaa lor (Fig. 1b).

(a)

(b)

Figura. 1. Selecie de imagini a substratelor SERS ordonate (a) i a nanoparticulelor de metal nobil sintetizate (b).

n cadrul unui studiu, s-a reuit corelarea activitii SERS cu topologia substratului cu ajutorul imagisticii Raman [35]. Prin combinarea imagisticii AFM cu imaginile SERS nregistrate prin microspectroscopie Raman confocal s-a reusit evidenierea implicrii mecanismului plasmonic de amplificare la semnalul de baz SERS [36]. Toate aceste studii contribuie la nelegerea mecanismelor care stau la baza amplificrii SERS. O parte a substratelor SERS obinute, mai ales cele constnd din nanoparticule de metal nobil, s-a dovedit a avea proprieti multifuncionale att ca senzor SERS ct i ca senzor LSPR [33, 41, 42]. S-a studiat interaciunea diferitelor biomolecule (triptofan, glutation etc.), proteine i biopolimeri relevani (PEG, chitosan, albumin, etc.) cu nanoparticule metalice de forme i dimensiuni diferite [39-41, 43, 44]. Cteva dintre nanoparticulele obinute au fost utilizate n aplicaii biomedicale cu impact n nanomedicin bazate pe proprietile optice, chimice 127

i termice ale nanoparticulelor de aur n detecia i tratamentul la nivel celular al cancerului (hipertermie local indus laser) sau n evaluarea profilului de toxicitate a nanopartirculelor n medii celulare. Astfel, s-a demonstrat c o serie de nanobastonae de aur sau alte nanoparticule de metal nobil anizotrope, de obicei nvelite ntr-un strat polimeric biocompatibil, pot fi utilizate n terapia fototermic a cancerului [40]. Au fost de asemenea efectuate studii de detecie SERS intracelulare utiliznd nanoparticule de aur PEGylate i marcate cu colorani [44] Rezultatele obinute demonstreaz faptul c nanoparticulele prezint stabilitate, conservndu-i identitatea Raman in vitro, caracteristici care confer acestui tip de markeri SERS aplicabilitate ca i ageni imagistici n interiorul organismelor vii [44]. n cadrul unui alt studiu s-a dovedit c o serie de nanoparticule de argint de form triunghiular invelite n chitosan posed activitate bactericidal, fiind capabile s distrug Staphylococcus aureus [45]. n majoritatea studiilor spectroscopia Raman a fost acompaniat de imagistica Raman sau AFM.

3. Tematici de cercetare posibil de implementat n cadrul laboratorului de microscopie Raman confocal al platformei ICI-BNS
Avnd n vedere stadiul actual al cercetrilor exploratorii prin spectroscopie Raman precum i dotrile existente n cadrul platformei, n grupul de cercetare care utilizeaz echipamentul de microscopie Raman confocal WITec CRM 200 combinat cu modulul de microscopie de for atomic (AFM) model alpha 300, s-ar putea aborda noi tipuri de experimente bio-medicale de diagnosticare a unor boli cum ar fi cele ale sistemului osos sau arteroscleroza, realizndu-se i studii complementare de absorbie n IR. Exist numeroase studii n literatur referitoare la utilizarea metodelor spectroscopice complementare Raman i de absorbie n IR n analizarea osului i a cartilajelor. Au fost efectuate numeroase investigaii cu scopul nelegerii spectrelor, i corelrii caracteristicilor spectrale cu modificrile care apar datorit vrstei sau a diverselor boli, la animale i n cteva cazuri i la oameni. Doar n ultimii ani, cercettorii au considerat spectroscopia vibraional ca o metod capabil s furnizeze informaii legate de diagnosticarea bolilor care apar la nivelul esuturilor muscularo-scheletale [46, 47]. Au fost investigate dou dintre cele mai importante boli ale oaselor i anume osteoporoza, o boal metabolic, i osteogeneza imperfect, care const dintr-o serie de defecte genetice care afecteaz scheletul. Se tie c 128

un os afectat de osteoporoz are un grad de cristalinitate crescut i un domeniu mai ngust de cristalinitate dect osul sntos. Aceste modificri ale structurii sunt reflectate n spectrele Raman i IR ale probelor [46, 47]. Osteogeneza imperfect este o maladie genetic al crei principal semn clinic este fragilitatea osoas crescut, manifestat n special prin fracturi la nivelul oaselor lungi. Aceast boala apare ca urmare a mutaiilor de la nivelul genelor care codific producerea de colagen tip I. Metodele spectroscopice vibraionale sunt capabile s identifice esuturile anormale afectate de aceast boal [48]. n prezent, maladia se trateaz medical cu aminobisfosfonai iar spectroscopia poate juca un rol important n urmrirea progresului tratamentului. S-a constatat c n principiu metodele spectroscopice vibraionale pot fi att un instrument de diagnosticare ct i o metod care s monitorizeze progresul tratamentului asupra bolii. Arteroscleroza st la baza apariiei majoritii bolilor cardiovasculare (angina pectoral, cardiopatie ischemic, infarct miocardic, accident vascular cerebral, arteriopatie obliterant etc.). Ea se datoreaz prezenei aa-numitelor plci ateromatoase pe pereii arterelor. Aceste plci se formeaz datorit colesterolului i grsimilor prezente n cantiti excesive n snge (datorit greelilor de alimentaie) care se "infiltreaz" n pereii arterelor. n timp, prin depunerea de calciu se formeaz plcile ateromatoase. Ele stnjenesc din ce n ce mai mult circulaia liber a sngelui prin artera afectat: din laminar i fluent, ea devine turbulent i inegal. Metodele spectroscopice complementare Raman i de absorbie n IR sunt capabile s coreleze informaiile histopatalogice ale unei aorte afectate de arteroscleroz cu compoziia chimic a unei aorte sntoase [49-51]. Se pot monitoriza benzile caracteristice proteinelor (colagen, elastina, actina, etc.) i lipidelor, i se pot localiza plcile ateromatoase prin prezena benzilor caracteristice carbonatului de calciu [49-51]. n ultima perioad, spectroscopia Raman s-a dovedit a fi o metod fezabil n studiul materialelor nanostructurate. n cadrul unui studiu a fost analizat dependena deplasrii benzilor Raman n funcie de dimensiunea unor nanocristale [52]. De asemenea au fost investigate prin spectroscopie Raman efectele de confinare a fononilor optici n materialele nanostructurate [53]. Aceast confinare duce la modificri ale spectrului de vibraie al materialelor nanostructurate n comparaie cu cel al materialului bulk, deoarece absena periodicitii la dimesiuni sub cele ale particulei relaxeaz regulile de selecie ale fononilor optici n regiunea central a zonei Brillouin i prin urmare, n spectrul Raman, vor exista contribuii ale fotonilor din afara acestei zone. Studii efectuate pe nanostructuri poroase 129

semiconductoare au dovedit faptul c n cazul unor uniti structurale de civa nanometri, aa cum au fost observate n cazul i sau Ge poros, efectele de confinare pot fi utilizate pentru a determina dimensiunea acestora [54]. Studii Raman ale nanofirelor sau nanoconurilor de GaP au dovedit faptul c exist o dependen ntre intensitatea spectral i caracterul spaial al radiaiei Raman mprtiate i dimensiunea, forma i compoziia nanofirelor [55]. Pe de alt parte, spectroscopia Raman, acompaniat n ultimii ani de microscopie i de tehnica SERS, a devenit o metod de investigare extrem de util n domeniul patrimoniului cultural. Cu ajutorul acestei metode se obin informaii despre compuii moleculari aflai n probele supuse analizei. Metoda este prezent n departamentele de conservare i restaurare a celor mai recunoscute muzee i librrii din lume i este utilizat pentru identificarea unor materiale, de la pigmeni anorganici la biomateriale, utilizate n artifacte ca de exemple manuscrise, picturi, textile, ceramici, sticle, sculpturi, monumente de piatr [56]. De exemplu, un numr de cinci picturi n miniatur achiziionate de Muzeul Victoria i Albert n 2008, presupuse a fi lucrri medievale autentice, s-au dovedit a fi pictate la sfritul secolului al 19-lea sau nceputul secolului 20. Acest lucru a fost confirmat cu ajutorul microspectroscopiei Raman [57]. Li i colaboratorii si [58] au realizat analiza decoraiunilor i au identificat pigmenii folosii la decorarea unui covor chinezesc din secolul al 5-lea cu ajutorul tehnicilor complementare micro-Raman i FT-IR. n acest mod, pot fi difereniate operele de art veritabile de cele contrafcute sau falsificate. Astfel, avnd n vedere aceste considerente i innd seama de echipamentele existente n cadrul platformei, printre tematicile de cercetare care ar putea fi abordate n viitor s-ar putea regsi att studiul unor materiale nanostructurate de tipul nanofirelor i a filmelor nanostructurate ct i al unor obiecte din patrimoniul cultural.

4.Bibliografie
1. 2. L. A. Nafie, Recent advances n linear and nonlinear Raman spectroscopy. Part IV, J. Raman Spectrosc. 41, 1566, 2010. L. A. Dick, A. D. McFarland, C. L. Haynes, R. P Van Duyne, Metal Film over Nanosphere (MFON) Electrodes for Surface-Enhanced Raman Spectroscopy (SERS): Improvements n Surface Nanostructure Stability and Suppression of Irreversible Loss, J. Phys. Chem. B 106, 853, 2002. L. Baia, M. Baia, J. Popp, S. Astilean, Gold Films Deposited over Regular Arrays of Polystyrene Nanospheres as Highly Effective SERS Substrates from Visible to NIR, J. Phys. Chem. B 110, 23982, 2006. M. Sackmann, S. Bom, T. Balster, A. Materny, Nanostructured Gold Surfaces as

3. 4.

130

5. 6. 7. 8. 9. 10.

11. 12. 13. 14.

15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24.

Reproducible Substrates for Surface Enhanced Raman Spectroscopy, J. Raman Spectrosc. 38, 277, 2007. E. N. Esenturk, A. R. HightWalker, Surface-enhanced Raman scattering spectroscopy via gold nanostars, J. Raman Spectrosc., 40, 86, 2009. A. C. SantAna, T. C. R. Rocha, P. S. Santos, D. Zanchet, M. L. A. Temperini, Size-dependent SERS enhancement of colloidal silver nanoplates: the case of 2-amino-5-nitropyridine, J. Raman Spectrosc., 40, 183, 2009. A. Roguska, A. Kudelski, M. Pisarek, M. Lewandowska, M. Dolata, M. Janik-Czachor, Raman investigations of TiO2 nanotube substrates covered with thin Ag or Cu deposits, J. Raman Spectrosc., 40, 1652, 2009. M. A. Khan, T. P. Hogan, B. Shanker, Gold-coated zinc oxide nanowire-based substrate for surface-enhanced Raman spectroscopy, J. Raman Spectrosc., 40, 1539, 2009. J. Popp, Identification of micro-organisms by Raman spectroscopy, SPIE Proceeding, 10.1117/2.1200708.0856. P. Roesch, M. Harz, M. Krause, R. Petry, K.-D. Peschke, O. Ronneberger, H. Burkhardt, A. Schuele, G. Schmautz, R. Riesenberg, A.Wuttig, M. Lankers, S. Hofer, H. Thiele, H.-W. Motzkus, J. Popp, Biophotonics: Vision for a better Health Care, ch. Online monitoring and identification of bioaerosols (OMIB), pp. 89165, Wiley-VCH,Weinheim, 2006. H.-W. Cheng, S.-Y. Huan, H.-L. Wu, G.-L. Shen, R.-Q. Yu, Surface-enhanced Raman spectroscopic detection of a bacteria biomarker using gold nanoparticle immobilized substrates, Anal. Chem., 81, 9902, 2009. I-F. Cheng, C.-C. Lin, D.-Y. Lin, H.-C. Chang, A dielectrophoretic chip with a roughened metal surface for on-chip surface-enhanced Raman scattering analysis of bacteria, Biomicrofluidics 4, 034104, 2010. I. Notingher, Raman Spectroscopy Cell-based Biosensors, Sensors, 7, 1343, 2007. A. H. Zhou, G. D. McEwen, Y. Z. Wu, Combined AFM/Raman microspectroscopy for characterization of living cells n near physiological conditions, Microscopy: Science, Technology, Applications and Education A. Mndez-Vilas and J. Daz (Eds.), FORMATEX 2010, pp. 515-522. A. Williams, H. Edwards, B. Barry, Fourier transform Raman spectroscopy a novel application for examining human stratum corneum, Int. J. Pharm. 81, R11, 1992. P. Caspers, G. Lucassen, G. Puppels, Combined n Vivo Confocal Raman Spectroscopy and Confocal Microscopy of Human Skin, Biophys. J., 85, 572, 2003. C. Lieber, S. Majumder, D. Ellis, D. Billheimder, A. Mahadevan-Jansen, n vivo nonmelanoma skin cancer diagnosis using Raman microspectroscopy, Lasers n Surgery and Medicine, 40, 461, 2008. J. Zhao, H. Lui, D. I. McLean, H. Zeng, New Developments n Biomedical Engineering, Ed. Domenico Campolo, InTech, 2010, pp. 455-474. J. Zhao, H. Lui, D. I. McLean, H. Zeng, Integrated real time Raman system for clinical n vivo skin analysis, Skin Res. And Tech, 14, 484, 2008. D. Hanahan, R.A. Weinberg, The Hallmarks of Cancer, Cell 100, 57, 2000. A. Mahadevan-Jansen, n Biomedical Photonics Handbook, T. Vo-Dinh, Ed. (CRC Press, Washington DC, 2003), pp. 30:130:27. X. M. Qian, S. M. Nie, Single-molecule and single-nanoparticle SERS: from fundamental mechanisms to biomedical applications, Chem Soc Rev, 37, 912, 2008. M. de Veij, P. Vandenabeele, T. De Beer, J. P. Remon, L. Moens, Reference database of Raman spectra of pharmaceutical excipients, J. Raman Spectrosc., 40, 297, 2009. M. R. Witkowski, The use of Raman spectroscopy n the detection of counterfeit

131

25. 26. 27. 28. 29. 30. 31.

32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43.

and adulterated pharmaceutical products, American Pharmaceutical Review, January/February 2005. E. Y. Y. Chan, S. M. Griffiths, C. W. Chen, Public-health risks of melamine n milk products, Lancet, 372, 1444, 2008. Y. Liu, K. Chao, M. S. Kim, D. Tuschel, O. Olkhovyk, R. J. Priore, Potential of Raman spectroscopy and imaging methods for rapid and routine screening of the presence of melamine n animal feed and foods, Appl. Spectrosc. 63, 477, 2009. M. Lin, L. He, J. Awika, L. Yang, D. R. Ledoux, H. Li, A. Mustapha, Detection of Melamine n Gluten, Chicken Feed, and Processed Foods Using Surface Enhanced Raman Spectroscopy and HPLC, J Food Sci, 73, T129, 2008. C. Camerlingo, F. Zenone, I. Delfino, N. Diano, D. G. Mita, M. Lepore, Investigation on Clarified fruit juice composition by using visible light micro-Raman spectroscopy, Sensors, 7, 2049, 2007. H. Martens, T. Noes, Multivariate Calibration, Wiley: New York, 1993. R. Graupner, Raman spectroscopy of covalently functionalized single-wall carbon nanotubes, J. Raman Spectrosc. 38, 673, 2007. H. M. Heise, R. Kuckuk, A. K. Ojha, A. Srivastava, V. Srivastava, B. P. Asthana, Characterisation of carbonaceous materials using Raman spectroscopy: a comparison of carbon nanotube filters, single- and multi-walled nanotubes, graphitised porous carbon and graphite, J. Raman Spectrosc., 40, 344, 2009. H. Kuzmany, W. Plank, Ch. Schaman, R. Pfeiffer, F. Hasi, F. Simon, G. Rotas, G. Pagona, N. Tagmatarchis. Raman scattering from nanomaterials encapsulated into single wall carbon nanotubes, J. Raman Spectrosc.; 38, 704, 2007. V. Canpean, S. Astilean, Multifunctional plasmonic sensors on low-cost subwavelength metallic nanoholes arrays, Lab Chip 9, 3574, 2009. C. Farcau, S. Astilean, Silver half-shell arrays with controlled plasmonic response for fluorescence enhancement optimization, Appl. Phys. Lett. 95, 193110, 2009. C. Farcau, S. Astilean, Mapping the SERS Efficiency and Hot-Spots Localization on Gold Film over Nanospheres Substrates, J. Phys. Chem C 114, 11717, 2010. S. Astilean, C. Farcau, Evidence of a surface plasmon-mediated mechanism n the generation of the SERS background, Chem. Commun. 47, 3861, 2011. S. Boca, C. Farcau , S. Astilean, The study of Raman enhancement efficiency as function of nanoparticle size and shape, Nucl. Instrum. Methods Phys. Res., Sect. B 267, 406, 2009. M. Baia, F. Toderas, L. Baia, D. Maniu, S. Astilean, Multilayer Structures of Self-Assembled Gold Nanoparticles as a Unique SERS and SEIRA Substrate, ChemPhysChem 10, 1106, 2009. M. Iosin, P. Baldeck, S. Astilean, Study of tryptophan assisted synthesis of gold nanoparticles by combining UVVis, fluorescence, and SERS spectroscopyJ. Nanopart. Res. 12, 2843, 2010. S. Boca, S. Astilean, Detoxification of gold nanorods by conjugation with thiolated poly(ethylene glycol) and their assessment as SERS-active carriers of Raman tags, Nanotechnology 21, 235601, 2010. M. Potara, A. Gabudean, S. Astilean, Solution-phase, dual LSPR-SERS plasmonic sensors of high sensitivity and stability based on chitosan coated anisotropic silver nanoparticles, J. Mater. Chem. 21, 3625, 2011. A. Gabudean, D. Biro, S. Astilean, Localized surface plasmon resonance (LSPR) and surface-enhanced Raman scattering (SERS) studies of 4-aminothiophenol adsorption on gold nanorods, J. Mol. Struct. 993, 420, 2011. M. Focsan (Iosin), A. M. Gabudean, V. Canpean, D. Maniu, S. Astilean, Formation

132

44.

45.

46.

47. 48.

49.

50.

51.

52. 53.

54. 55. 56.

57.

58.

of size and shape tunable gold nanoparticles n solution by bio-assisted synthesis with bovine serum albumin n native and denaturated state, Mat. Chem. Phys. 129, 939, 2011. S. Boca, D. Rugina, A. Pintea, L. Barbu-Tudoran, S. Astilean, Flower-shaped gold nanoparticles: synthesis, characterization and their application as SERS-active tags inside living cells, Nanotechnology 22, 055702, 2011. M. Potara, E. Jakab, A. Damert, O. Popescu, V. Canpean, S. Astilean, Synergistic Antibacterial Activity of ChitosanSilver Nanocomposites on Staphylococcus Aureus, Nanotechnology 22, 135101, 2011. M. V. Schulmerich, K A. Dooley, M. D. Morris, T. M. Vanasse, S. A. Goldstein, Transcutaneous fiber optic Raman spectroscopy of bone using annular illumination and a circular array of collection fibers, J. Biomed. Optics, 11, 060502, 2006. P. Matousek, Inverse Spatially Offset Raman Spectroscopy for Deep Noninvasive Probing of Turbid Media, Applied Spectroscopy, 60, 1341, 2006. K. A. Dehring, N. Crane, A. R. Smukler, J. B. McHugh, B. J. Roessler, M. D. Morris, Identifying chemical changes n subchondral bone taken from murine knee joints using Raman spectroscopy, Appl. Spectrosc., 60, 1134, 2006. F. Adar, L. Jelicks, C. Naudin, D. Rousseau, S. Yeh, Elucidation of the atherosclerostic disease process n apo E and wild type mice by vibrational spectroscopy.SPIE 2004, V. 7 5321A-11 (p.1 of 9). G. V. Nogueira, L. Silveira, Jr. , A. A. Martin, R. A. Zngaro, M. T. T. Pacheco, M. C. Chavantes, C. A. Pasqualucci, Raman spectroscopy study of atherosclerosis n human carotid artery, J. Biomed. Opt. 10, 031117, 2005. S. W. E. van de Poll, T. C. Bakker Schut, A. van der Laarse, G. J. Puppels, n situ investigation of the chemical composition of ceroid n human atherosclerosis by Raman spectroscopy, J. Raman Spectroscopy, 33, 544, 2002. M. Salis, P. C. Ricci, A. Anedda, An analytical form for the Raman shift dependence on size of nanocrystals, J. Raman Spectrosc., 40, 64, 2009. A. K. Arora, M. Rajalakshmi, T. R. Ravindran, V. Sivasubramanian, Raman spectroscopy of optical phonon confinement n nanostructuredmaterials, J. Raman Spectrosc.; 38, 604, 2007. G. Irmer. Raman scattering of nanoporous semiconductors, J. Raman Spectrosc.; 38, 634, 2007. L. Cao, L. Laim, P. D. Valenzuela, B. Nabet, J. E. Spanier. On the Raman scattering from semiconductor nanowires, J. Raman Spectrosc.; 38, 697, 2007. H.G.M. Edwards, Raman Spectroscopy n Art and Archaeology: A New Light on Historical Mysteries n Frontiers of Molecular Spectroscopy, J. Laane Ed., Elsevier 2009, pp.133-173. L. Burgio, R. J. H. Clark, R. R. Hark, Spectroscopic investigation of modern pigments on purportedly medieval miniatures by the "Spanish Forger", J. Raman Spectrosc., 40, 2031, 2009. T. Li, Y.-F. Xie, Y.-M. Yang, C.-S. Wang, X.-Y. Fang, J.-L. Shi, Q.-J. He, Pigment identification and decoration analysis of a 5th century Chinese lacquer painting screen: a micro-Raman and FTIR study, J. Raman Spectrosc., 40, 1911, 2009.

133

IV. SPECTROMETRUL IR Spectroscopia de absorbie n infrarou

Lect. dr. Nicolae Leopold

Cuprins
1. Introducere ........................................................................................................... 134 2. Moduri de vibraie ................................................................................................ 135 3. Oscilatorul armonic ............................................................................................. 137 4. Reguli de selecie pentru spectroscopia IR ........................................................... 138 5. Legea Lambert-Beer .............................................................................................. 139 6. Instrumentaia i metodologia obinerii spectrelor IR .......................................... 141 7. Bibliografie ........................................................................................................... 146

1. Introducere
Materia este format din electroni, nuclee, ioni pozitivi i negativi. Fiecare subdiviziune a materiei, cum ar fi un atom, o molecul, sau un solid prezint o distribuie de sarcin specific. Aceste sarcini nu sunt doar sarcini izolate (monopoli), ci sunt sarcini pozitive i negative ce formeaz dipoli i multipoli electrici. n interaciunea luminii cu materia, cmpul electric (i ntr-o msur mai mic i cel magnetic) al undei electromagnetice poate s modifice distribuia de sarcin i n acest fel s induc un moment de dipol. n unda de lumin, cmpul electric oscileaz cu o frecven de aproximativ 1015 Hz, ceea ce nseamn c modificarea distribuiei de sarcin va avea loc 134

cu aceeai frecven n materie. Pe de alt parte, modificri (oscilaii) ale distribuiei de sarcin, precum un dipol oscilator poate genera, la rndu-i, un cmp electric. Aceste procese, ce apar la interaciunea luminii cu materia, sunt n tratarea clasic procesele de baz ale fiecrei metode spectroscopice. De vreme ce distribuia de sarcin este specific pentru un anumit tip de materie, molecula unei anumite substane de exemplu, schimbul de energie ntre unda electromagnetic i materie este de asemenea specific, oferind informaii unice despre materie. n teoria cuantic, procesele sunt descrise de anihilarea unui foton, urmate de tranziia n stri de energie mai mari, sau generarea unui foton cnd sistemul trece de la o stare energetic ridicat la una joas. Probabilitatea specific, ca fotonii s interacioneze cu materia este descris de aa numita seciune eficace a efectului spectroscopic.

2. Moduri de vibraie
Spectroscopia de absorbie n infrarou, pe scurt spectroscopia IR, precum i spectroscopia Raman ofer informaii despre modurile vibraionale i vibraional-rotaionale ale moleculelor. Benzile vibraional-rotaionale sunt observate doar cnd proba se afl n stare de gaz, unde moleculele se pot roti liber. n fazele condensate (lichid sau solid), pot fi observate doar frecvenele de vibraie ale probei. n funcie de simetria moleculei, cele dou tehnici, IR i Raman, pot fi privite ca fiind complementare. O vibraie va fi activ IR dac are loc o variaie a momentului de dipol n timpul vibraiei. n schimb, acele vibraii care duc la o modificare a polarizabilitii moleculare vor fi active Raman. Astfel, activitatea unui mod vibraional depinde de simetria lui i de simetria moleculei. O regul simpl de simetrie este aa numita regula excuziunii mutuale. Conform acesteia, n cazul moleculelor cu centru de simetrie, vibraiile active Raman nu sunt active IR, i invers. Numrul modurilor de vibraie posibile al unei molecule poate fi determinat din numrul atomilor N din molecul i geometria molecular. Geometria molecular este specificat de coordonatele carteziene ale fiecrui atom. Molecula are aadar 3N grade de libertate, trei dintre aceste grade fiind folosite pentru specificarea micrii de translaie a moleculei n spaiu, i alte dou (molecule liniare) sau trei (molecule neliniare) grade sunt necesare pentru a specifica micarea de rotaie. Gradele de libertate rmase corespund numrului modurilor de vibraie: 3N-5 pentru molecule liniare, i 3N-6 pentru moleculele neliniare. 135

De exemplu, vibraiile fundamentale ale moleculei de ap, H2O, sunt prezentate n Figura 1. Apa, fiind o molecul neliniar prezint trei vibraii fundamentale:

ntindere simetric

ntindere asimetric

deformare (forfecare)

Figura 1. Moduri de vibraie de ntindere i deformare ale H2O.

Dioxidul de carbon, CO2, este o molecul liniar, astfel c va prezenta patru vibraii fundamentale (Figura 2). Vibraia de ntindere asimetric a CO2 genereaz o band intens n spectrul IR la 2350 cm-1. De menionat este c aceast band se observ de regul n spectrul IR al background-ului, datorit prezenei CO2 n atmosfer.

ntindere asimetric

deformare (forfecare) perpendicular pe planului foii

ntindere simetric

deformare (forfecare) n planul foii

Figura 2. Moduri de vibraie de ntindere i deformare ale CO2.

Cele dou vibraii de deformare (forfecare) sunt echivalente, vibraia acestora avnd loc la aceeai frecven, fiind astfel numite degenerate, i apar n spectrul IR la 666 cm-1. Vibraia de ntindere simetric a CO2 este inactiv IR deoarece aceast vibraie nu produce modificare n momentul de dipol al moleculei.

136

3. Oscilatorul armonic
Cel mai simplu model pentru vibraia unei molecule diatomice este oscilatorul armonic. n acest model se consider cei doi atomi de mase m1 i m2 ai moleculei legai printr-un resort elastic. Descrierea matematic a micrii de vibraie a acestor dou corpuri cu masele m1 i m2 poate fi simplificat prin considerarea unui singur corp cu masa redus =m1*m2/(m1+m2), ce oscileaz n jurul centrului de mas al moleculei biatomice, ntr-un cmp potenial de tipul kx2/2.

Figura 3. Modelul oscilatorului armonic pentru molecula diatomic. Variaia energiei poteniale cu distana internuclear.

Din punct de vedere fizic, aa cum se poate deduce din Figura 3, o energie mai mare a oscilatorului armonic corespunde unei amplitudini mai mari a oscilaiei, frecvena fiind aceeai pentru toate nivelele de energie. Energiile vibraionale cuantificate se obin n urma rezolvrii ecuaiei Schrdinger pentru oscilatorul armonic: Ev=h(v+

1 ) , v=0,1,2. 2

(1.1)

unde v este numrul cuantic de vibraie, este frecvena de vibraie i h este constanta lui Planck. Frecvena de vibraie a oscilatorului armonic depinde de puterea legturii (constanta de for a legturii k) i masa redus : =

1 2

(1.2)

137

Nivelele de energie vibraionale sunt la distane egale (echidistante) n modelul oscilatorului armonic, diferena ntre dou nivelele de energie adiacente E fiind: E=h= k (1.3)

4. Reguli de selecie pentru spectroscopia IR

O molecul diatomic va absoarbe radiaie IR numai dac momentul ei de dipol se modific n urma variaiei distanei internucleare. Probabilitatea de tranziie depinde de diferena de populaie N dintre dou stri cuantice i ptratul momentului de dipol al tranziiei, M: probabilitatea de tranziie ~ N M
2

(1.4)

unde, pentru o molecul aflat ntr-o stare electronic dat, momentul de dipol al tranziiei pentru o tranziie vibraional este dat de:
* ( M= " 0e) ' d

(1.5)

Funciile de und " i ' reprezint strile vibraionale final i respec( tiv iniial, iar 0e) este momentul de dipol electric permanent n aceast stare electronic. Pentru vibraia unei molecule diatomice, momentul de dipol electric permanent poate fi extins ntr-o serie Taylor dup distana internuclear de echilibru re : ( 0e) =e+ q +

r re

1 2

2 q2+ 2 r re

(1.6)

Aici q=r-re, iar r este distana internuclear la un moment dat, i e este momentul de dipol cnd legatura se afl n poziia de echilibru. Probabilitatea apariiei unei tranziii vibraionale ntr-o molecul diatomic poate fi obinut substituind forma extins a momentului de dipol electric permanent n ecuaia momentului de dipol pentru tranziia vibraional:

*
'

( 0e) d =
'

* e " ' d +

1 * ' q d + 2 r re
'

2 2 r re

*
"

q2 ' d + (1.7)

138

Primul termen din aceast ecuaie este egal cu zero de vreme ce funciile de und vibraionale " i ' sunt ortogonale. Al doilea termen este diferit de zero doar dac momentul de dipol depinde de distana internuclear r

0 r

(1.8)

De aceea, moleculele biatomice prezint absorbie vibraional n spectrul IR doar atunci cnd exist o modificare a momentului de dipol n cadrul micrii de vibraie. Moleculele diatomice homonucleare au momentele de dipol zero pentru toate lungimile legturilor, astfel nu prezint spectru de absorbie vibraional. Astfel, teoria mecanicii cuantice specific faptul c absorbia luminii infraroii va aprea doar dac un mod vibraional implic o modificare a momentului de dipol i c nivelele de energie vibraionale n molecul sunt cuantificate. Teoria ne spune de asemenea i faptul c tranziiile pot avea loc doar ntre nivele de energie adiacente, deoarece integrala din cel de-al doilea termen pentru polinoamele Hermite care descrie funcia de und a oscilatorului armonic, este diferit de zero doar dac v= 1.

5. Legea Lambert-Beer
Domeniul spectral IR al radiaiei electromagnetice este poziionat ntre domeniul vizibil i cel al microundelor. Prin convenie, domeniul spectral IR este subdivizat n domeniul IR apropiat (Near Infrared Region - NIR), IR mijlociu (Mid Infrared Region - MIR) i IR ndeprtat (Far Infrared Region FIR) (Figura 4). Spectrele IR discutate n aceast lucrare sunt toate din domeniul spectral MIR.

Figura 4. Domeniile spectrului electromagnetic i subdiviziunile domeniului IR.

139

Spectrul IR se obine prin nregistrarea intensitii radiaiei n lipsa probei de analiz (spectrul background) i a intensitii radiaiei IR dup ce aceasta trece prin prob. n urma trecerii prin prob, intensitatea fasciculului se va atenua datorit absorbiei de radiaie de ctre analit, precum i a mprtierii radiaiei la interfaa i n interiorul probei (Figura 5a). Astfel, spectrul IR reprezentat va fi dat de mrimea: T= Is/IR unde, T este transmitana, Is intensitatea radiaiei IR dup, iar IR nainte de a traversa radiaia proba. Valorile transmitanei sunt ntre 0 i 1, sau 0100% pentru transmitana exprimat n procente. ntre transmitan i concentraia unui compus relaia este logaritmic. De aceea, pentru o reprezentare mai convenient, n majoritatea cazurilor, n locul transmitanei se folosete o alt mrime, absorbana A:

A = lg

1 = lg T T

Relaia dintre transmitan i absorban n funcie de concentraie este reprezentat n Figura 5b

Figura 5. (a) Atenuarea unui fascicul de radiaie la refelexia interfeei probei, mprtierea de ctre particule i absorbia analitului. (b) Relaia dintre transmitan, T, i absorban, A, n funcie de concentraia unui compus ipotetic.

n mod independent, Bouguer n 1729 i Lambert n 1760, au stabilit c la concentraie constant, absorbana este direct proporional cu grosimea probei, iar Beer n 1852 a observat c dac grosimea probei este constant, absorbana este proporional cu concentraia. Combinarea acestor observaii a dus la legea Lambert-Beer, ce exprim absorbana: 140

(I.2) unde a este absorbtivitatea o constant de proporionalitate a moleculei la o lungime de und specific, d este lungimea drumului optic prin prob, iar c reprezint cocentraia substanei analizate. Concluzionnd, spectroscopia IR ofer att informaii moleculare calitative, prin modurile de vibraie specifice fiecrei molecule, ct i informaii cantitative, aa cum rezult din legea Lambert-Beer.

A = ad c

6. Instrumentaia i metodologia obinerii spectrelor IR

Odat cu introducerea spectroscopiei transformat Fourier (FTIR) principalele dezavantaje ale spectroscopiei clasice dispersive IR au putut fi nlturate. Pe scurt, spectroscopia FTIR nu mai nregistreaz intensitatea la fiecare lungime de und, n mod secvenial, la o lungime de und dup alta, i de asemenea, spre deosebire de spectrometrele dispersive nu necesit prism sau reea de difracie monocromatoare, unde apar pierderi majore n energia emis de sursa IR la trecerea prin diferite fante de intrare i ieire. n spectroscopia FTIR, se aplic modularea interferometric a radiaiei (Figura 6). Pentru aceasta, un divizor de und, de regul din KBr acoperit cu un film de germaniu, mparte radiaia n dou fascicule, un fascicul fiind direcionat ctre o oglind fix, iar cellalt fascicul ctre o oglind mobil (Figura 6). Aceste dou fascicule sunt reflectate napoi pe divizorul de und, dup care se recombin, intensitatea fasciculului variind n timp, datorit alternrii interferenei constructive i destructive n funcie de diferena de drum optic dintre cele dou oglinzi, la fiecare moment de timp. Astfel, fiecare parcurs al oglinzii mobile este caracterizat de o interferogram n funcie de timp. Diferena de drum este proporional cu timpul t, deoarece oglinda mobil se deplaseaz cu vitez constant v, astfel c = 2vt. Prin folosirea unui algoritm de transformat Fourier rapid (Fast Fourier Transform - FFT algorithm), interferograma n funcie de timp, I(), este convertit ntr-o interferogram n funcie de frecven, I( v ), folosind urmtoarea relaie:

I ( ) = 0.5 H (v ) I (v ) cos 2v I ( )
unde H( v ) este un factor de corecie dependent de numrul de und i de caracteristicile spectrometrului. Interferograma convertit n domeniul frecvenelor se numete spectru de tip single-beam.

141

IR-light source

Figura 6. Spectrometrul FTIR. (a) Schema bloc a componentelor de baz ale unui spectrometru IR. (b) Principiul de funcionare a unui interferometru Michelson format din surs de lumin, divizor de und, oglind fix, oglind mobil, detector i prob (panel sus). Oglinda mobil a interferometrului (panel sus) produce un semnal sinusoidal la detector pentru fiecare frecven modulat (panel central). Pentru sursa IR, cu domeniu spectral de frecvene larg, semnalele modulate se suprapun i formeaz o interferogram complex (panel jos).

Spectrometrele FTIR prezint mai multe avantaje fa de instrumentele convenionale IR dispersive, incluznd o mbuntire dramatic a raportului semnal-zgomot (S/N), obinut prin multiplexare (detectarea simultan a tuturor frecvenelor), reducerea timpului de scanare, precum i un ctig mai mare n energia radiativ. Un alt avantaj important este reproductibilitatea excelent n lungimea de und a spectrometrelor FTIR, datorit utilizrii unui laser de referin intern (de regul HeNe, 632.8 nm ), ceea ce permite manipularea datelor spectrale, cum ar fi scderea, adunarea sau scalarea spectrelor cu un grad foarte ridicat de acuratee. De asemenea, progresul spectroscopiei FTIR a fost facilitat i de dezvoltarea calculatoarelor personale, ce permit utilizarea de programe soft complexe, pentru aplicaii calitative i cantitative. Pentru partea practic a acestei lucrri, spectrele au fost nregistrate cu un spectrometru Jasco FTIR-6200 cuplat cu un microscop IR Jasco IRT-5000 (Figura 7). 142

Figura 7. Aparatura IR Jasco: spectrometrul FTIR-6200 i microscopul IRT-5000.

Principalele pri componente ale spectrometrului FTIR sunt sursa de emisie, interferometrul i detectorul. Sursa de emisie IR este componenta cea mai simpl a instrumentului, constnd ntr-un filament incadescent (10000C). Interferometrul este de tip Michelson, iar parcursul maxim al oglinzii mobile determin rezoluia spectral a spectrometrului. Alegerea detectorului este legat de aplicaiile abordate. Astfel dac se urmrete de exemplu cinetica unei reacii chimice, este absolut necesar folosirea unui detector de tip MCT (Mercury Cadmium Telluride). Acestea sunt de dou tipuri: MCT A, detector de foarte nalt sensibilitate n domeniul spectral 650-7800 cm-1 ce permite nregistrarea rapid a spectrelor (pn la ns), i MCT B, detector de nalt sensibilitate n domeniul spectral 400-7800 cm-1, de asemena pentru nregistrri rapide. De menionat c detectoarele MCT necesit rcirea cu azot lichid. Detectoarele de tip DTGS (Deuterated L-Alanine doped Triglycene Sulphate) lucreaz la temperatura camerei ntr-un domeniu spectral larg 10-7800 cm-1, ns sensibilitatea acestora este de pn la dou ordine de mrime mai mic fa de detectoarele MCT. De menionat ns c domeniul spectral de detecie al spectrometrului este limitat de fereastra din faa detectorului (de regul KBr) precum i de divizorul de und (beamsplitter, de regul din KBr acoperit cu un strat de Ge), astfel c spectrometrele IR uzuale nu permit nregistrarea spectrelor sub 400 cm-1. Spectrometrul FTIR-6200 permite nregistrarea spectrelor IR n modul transmisie, pentru acest mod fiind necesar prepararea n prealabil a probe143

lor sub form de dispersie n pastile KBr. Tot pentru msurtori IR n transmisie se poate presa proba ntre dou discuri/ferestre dintr-un material ce nu absoarbe (este transparent) n domeniul IR mijlociu, de exemplu ZnSe, Si, Ge, KBr etc. Microscopul IRT-5000 este dotat cu un obiectiv tip Cassegrain i unul de tip ATR (Attenuated Total Reflectance). Obiectivul de tip Cassegrain se preteaz doar pentru probe plane (filme, suprafee lucioase etc.). n prealabil, la folosirea obiectivului Cassegrain, se nregistreaz spectrul background prin focalizarea pe oglinda de aur, un accesoriu din dotare. Modul de analiz ATR (Attenuated Total Reflection) este utilizat pentru investigarea probelor lichide i solide. De asemenea, modul ATR se preteaz pentru caracterizarea materialelor care sunt fie prea groase sau prea puternic absorbante pentru a fi analizate prin spectroscopie n transmisie. n modul de analiz ATR, radiaia IR trece printr-un cristal transparent n infrarou, cu un indice de refracie ridicat, astfel c fasciculul IR va efectua reflexii interne succesive n cristalul ATR, aa cum este prezentat schematic n Figura 8.

Figura 8. Prezentare schematic a tehnicii de analiz ATR-IR.

n vederea analizei, suprafaa probei este presat astfel nct s fie n contact optic cu suprafaa superioar a cristalului ATR. La reflexia intern a fasciculului, aa numita und evanescent IR ptrunde n afara cristalului ATR, astfel c o mic parte din radiaie penetreaz proba. n modul de analiz ATR nu este necesar o preparare n prealabil a probei n vederea analizei. Dezavantajul const n limitarea spectral datorit cristalului ATR, de exemplu pentru un cristal ATR din ZnSe spectrele se pot nregistra ncepnd de la 650 cm-1. De regul, n prealabil, la folosirea modului ATR, se nregistreaz spectrul background al atmosferei, cristalul ATR fiind n aer. Folosind microscopul IRT-5000 n modul de analiz ATR, au fost nregistrate spectrele FTIR/ATR a urmtoarelor substane de interes farmaco144

logic: aspirina, paracetamol i deferoxamina. Structurile moleculare ale acestora sunt prezentate mai jos.

Aspirina

Paracetamol

Deferoxamina Tabloul spectral din Figura 9 prezint spectrele de absorbie n IR ale celor trei substane analizate.

Figura 9 Spectrele FTIR/ATR ale substanelor de interes farmacologic: aspirina, paracetamol i deferoxamina.

145

Spectrele din Figura 9 sunt caracteristice structurilor moleculare corespunztoare, pentru fiecare substan putndu-se identifica o amprent spectral caracteristic. Atribuirea benzilor de vibraie se poate face pe baza literaturii de specialitate comparnd spectrele cu cele ale compuilor asemntori sau prin calcularea teoretic a spectrelor IR folosind programe dedicate de chimie cuantic.

7. Bibliografie
1. O. Cozar, Teoria Grupurilor n Fizica Atomului i Moleculei. 1986, Litografia Universitii Babe-Bolyai, Cluj-Napoca. 2. Chi, O. Cozar, L. David, Simetrie Molecular. 2007, Napoca Star, Cluj-Napoca. 3. Chi, V. Simon, N. Leopold, Probleme de Fizica Moleculei. 2001, Litografia Universitatii Babes-Bolyai, Cluj-Napoca. 4. T. Iliescu, Spectroscopie Optic Molecular. 2000, Casa Crii de tiin, Cluj-Napoca. 5. T. Iliescu, S. Cnt-Pnzaru, D. Maniu, R. Grecu, S. Atilean, Aplicaii ale spectroscopiei vibraionale. 2002, Casa Crii de tiin, Cluj-Napoca. 6. S. Atilean, Spectroscopia IR i Raman. Metode i tehnici moderne de spectroscopie optic. Vol. I. 2002, Casa Crii de tiin, Cluj-Napoca. 7. N. Leopold, Surface-Enhanced Raman Spectroscopy. Selected Applications. 2009, Napoca Star, Cluj-Napoca. 8. W.E. Smith and G. Dent, Modern Raman Spectroscopy A Practical Approach. 2005, Wiley, Chichester, UK. 9. B. Schrader, Ed. Infrared and Raman Spectroscopy - Methods and Applications. 1998, VCH, Weinheim, Germany. 10. F. Engelke, Aufbau der Molekle. 1992, Teubner, Stuttgart, Germany. 11. J.M. Hollas, Modern Spectroscopy. 2004, Wiley, Chichester, UK.

146

Tendine moderne n spectroscopia de absorbie IR

Lect. dr. Nicolae Leopold

Cuprins
1. Introducere ........................................................................................................... 147 2. Aplicaii analitice ale spectroscopieie IR .............................................................. 148 2.1. Cuplajul on-line cromatografia de lichide (lc)-IR ......................................... 149 2.1.1. mbuniri tehnice recente n cuplajul LC-IR..................................... 150 2.2. Cuplajul on-line electroforeza capilar (CE)-IR ........................................... 150 3. Aplicaii biomedicale ale spectroscopiei IR ........................................................... 151 4. Spectroscopia IR n calitatea i sigurana alimentelor ......................................... 154 5. Aplicaii ale spectroscopiei IR n geotiine.......................................................... 155 6. Bibliografie ........................................................................................................... 157

1. Introducere
Spectroscopia de absorbie n infrarou (IR) reprezint o metod analitic de investigaie molecular utilizat ntr-un numr vast de domenii. Publicaiile din ultimii 5 ani cu tematica legat de spectroscopia de absorbie IR pot fi clasificate pe domenii tiinifice dup cum este prezentat n Figura 1.

147

Figura 1. Clasificarea pe domenii a numrului de publicaii din ultimii 5 ani cu tematica legat de spectroscopia de absorbie IR (www.scopus.com)

Este evident din numrul mare al publicaiilor n domeniile chimiei i a fizicii c spectroscopia de absorbie IR este n continuare o metod experimental de baz n cercetarea fundamental.

2. Aplicaii analitice ale spectroscopieie IR

Aplicaiile analitice ale spectroscopiei IR sunt extrem de diversificate, astfel c pot fi foarte greu cuprinse ntr-o prezentare unitar. De aceea s-a ales n mod reprezentativ cuplarea on-line a deteciei IR n metodele de separare cromatografie de lichide (LC) i electroforeza capilar (CE). 148

Metodele de separare cromatografice i electroforetice sunt tehnici standard n laboratoare analitice privind sigurana i autenticitatea alimentelor, detecia substanelor interzise, laboratoare medicale, sau laboratoare pentru studii farmacologice. De regul, aceste metode de separare sunt cuplate cu metode de detecie ca, absorbia UV-VIS sau spectrometria de mas. Desigur, aceste metode prezint avantaje i dezavantaje n funcie de analizele efectuate. Cert este faptul c n ultimii ani sunt depuse eforturi pentru a cupla cu spectrometria de mas i alte metode de detecie cum ar fi spectroscopia Raman sau spectroscopia de absorbie IR.

2.1. Cuplajul on-line cromatografia de lichide (lc)-IR

Cromatografia de lichide este cea mai uzual metod instrumental folosit n laboratoarele analitice pentru separarea amestecurilor fizice, identificare i cuantificare. Utilitatea spectroscopiei de absorbie IR, n mod special a celei cu transformat Fourier (FTIR) ca i mijloc de detecie on-line n urma separrii cromatografice a fost demonstrat n mod repetat n ultimii ani [1-3]. Cuplarea cromatografiei de lichide cu un sistem de detecie IR se poate realiza fie n modul off-line dup nlturarea solventului, fie on-line folosind celule de curgere (flow-through cells) transparente pentru radiaia infraroie. n dectecia off-line folosirea interfeelor de nlturare a solventului duce la mbuntirea senzitivitii. Totui, abordarea on-line este de preferat datorit unor avantaje majore, incluznd o rezoluie cromatografic mbuntit, furnizarea de informaii n timp real, precum i posibilitatea de a utiliza soluii tampon nevolatile [3-4]. Cuplarea on-line permite totodat nregistrarea de spectre IR pentru analii fr o anumit orientare, cristalizare sau degradare oxidativ, aspecte ce pot interveni la nlturarea solvenilor. Detecia on-line LC-FTIR a fost limitat n trecut de un anumit numr de restricii privind aplicabilitatea n problemele analitice de tip real-life, fiind pus la ndoial n mod frecvent viabilitatea acestui cuplaj. Dou dintre cele mai citate dezavantaje ale cuplajului LC-FTIR sunt urmtoarele: i) dificultatea de a corecta absorbia de fond a solvenilor i a aditivilor folosii pentru prepararea fazei mobile, i ii) senzitivitatea redus datorat utilizrii unui drum optic redus al celulor pentru a evita saturarea semnalului ce intervine datorit absorbiei eluentului. Cele dou subiecte sunt strns corelate, iar atunci cnd sunt ambele luate n considerare este uor de neles numrul limitat de referine cu privire la cuplarea on-line a spectroscopiei de absorie IR cu cromatografia de lichide. 149

2.1.1. mbuniri tehnice recente n cuplajul LC-IR Pentru a crete senzitivitatea cuplajului LC-FTIR i pentru a obine astfel o limit de detecie mai bun s-a realizat interfaarea unui sistem de cromatografie capilar pentru lichide cu spectrometrul FTIR, [5] folosind o micro-celul de curgere [6] cu ferestre transparente n IR mijlociu din CaF2, cu un volum intern al celulei de 7.5 nL, care a fost plasat pe un condensor al fasciculului optic ataat spectrometrului. Au fost pui n micare gradieni liniari n limitele 50:50-35:65 [ap(0.05% TFA-acid trifluoroacetic):acetonitril] timp de 15 min pentru separarea soluiilor standard de nitrofenoli, obinndu-se astfel on-line, pe coloan, limite de detecie ntre 35-94 ng. Folosind tehnica gradienilor s-au putut obine spectre de nalt calitate ale analiilor n urma aplicrii unei corecii ale fondului (semnal background) la datele nregistrate. Acest lucru a fost evideniat de coeficienii de corelare cuprini ntre 89-96% (n regiunea spectral 1700-1050 cm-1) i utilizai pentru compararea spectrelor de referin cu cele obinute n urma injectrii n sistemul cromatografic a unei cantiti ntre 230-270 ng din analii. Un alt factor de limitare pentru detecia IR cuplat cu cromatografia de lichide este legat de absorbia puternic a apei n domeniul spectral MIR. Dezvoltarea din ultimii ani a unei noi tehnologii laser pentru surse IR, QCL - quantum-cascade laser, duce la o nou abordare a deteciei IR on-line [7-10] folosind noi dispozitive [11]. Avantajul surselor IR de tip QCL const n posibilitatea reglrii lungimii de und a laserului prin reglarea temperaturii de funcionare [12]. Prin reducerea dimensiunii i a costurilor aparaturii se contureaz o direcie clar n ceea ce privete detecia on-line IR dedicat cromatografiei de lichide, facilitnd o serie de noi aplicaii. Urmnd studii anterioare [7], Kuligowski et al. [12] au folosit dou lasere QCL pentru detecia on-line n cromatografia de lichide de nalt performan. Un set-up optic bazat pe trei oglinzi de aur i un separator de fascicule din ZnSe a fost folosit pentru a direciona lumina emis de laser printr-o celul fluidic cu un drum optic de 52 m ctre un detector MCT (mercury-cadmium-telluride). Sistemul a fost utilizat pentru separarea a opt constitueni ai vinului i ai sucului de struguri.

2.2. Cuplajul on-line electroforeza capilar (CE)-IR

Electroforeza capilar (CE) a devenit o tehnic de separare important, mai ales n analizele bio-chimice din cauza eficienei mari a separrii ct i consumului redus de substan [13-15]. Separarea apare n urma aplicrii unei tensiuni nalte, fapt care duce la o curgere electro-osmotic n capilar. 150

De obicei, detecia n CE este dificil, din cauza concentraiei mici de substan disponibil pentru detecie, iar n cazul deteciei UV-Vis sensitivitatea este limitat de diametrul mic al capilarului. Pentru detecia prin spectroscopia infraroie mijlocie s-au raportat msurtori att off-line ct i on-line. Recent ns, tot mai multe studii arat c detecia on-line FTIR este utilizat cu succes. n msurtori de transmisie folosind celule transparente manufacturate special pentru IR o parte din spectru este blocat din cauza absorbiei puternice a fazei lichide. Detecia on-line bazat pe tehnica reflexiei totale atenuate ocolete aceast problem prin reducerea eficient a drumului optic. Utilitatea deteciei FTIR on-line a fost demonstrat prin separarea i cuantificarea adenosinei, guaninei i a adenosinei-5 monofosfat n domeniul ng folosind electroforeza capilar convenional [16]. Un alt studiu prezint separarea i detecia IR a 5 analii, rezultatele fiind foarte bune din punct de vedere calitativ i cantitativ [17]. Maturitatea cuplajului CE-FTIR on-line este considerat prin separarea i cuantificarea cu succes a glucidelor din buturi rcoritoare [18]. Informaia molecular specific livrat de spectrul IR poate fi interpretat n mod avantajos, aa cum s-a artat la discriminarea on-line de enantiomeri n timpul separrii chirale ntr-un mediu neapos. Interaciunea moleculelor analit cu selectorul chiral a produs diastereomeri cu un spectru IR clar, distinct, permind discriminarea moleculelo analit [19]. Un alt domeniu n care spectrometria IR poate furniza informaii importante este analiza proteinelor. Aplicaiile principale n acest domeniu sunt cele privind dinamica proteinelor i elucidarea structurii secundare. Acest ultim aspect este cel care face spectroscopia FTIR o metod de analiz biomolecular foarte atrgtoare [20]. Acest articol raporteaz prima separare a unor proteine n electroforeza capilar cu detecia FTIR on-line.

3. Aplicaii biomedicale ale spectroscopiei IR

Analiza FTIR este folosit ntr-o serie larg de studii biologice cuprinznd msurtori pe diverse esuturi ca: piele [21-25], col uterin [26-34], plmn [35-37], sn [38-42], gastrointestinal [43-46], creier [47-49], bucal [50], limfoid [51], limfocite [52], limfon non-Hodgkins [53], prostat [54-55], colon [56-59], fibroblast [60], os [61] sau esut tumoral [62]. Alte studii relevante au fost efectuate pe bacterii [63-64] ADN [65], medicamente anti-cancer [66], sau pentru monitorizarea glucozei [67]. Wood et al. [26] au evideniat potenialul spectroscopiei FTIR ca instrument de biodiagnostic n cancerul de col uterin. Spectrele nregistrate 151

pe celule epiteliale normale prezint benzi intense ale glicogenului la 1022 cm-1 i 1150 cm-1, i totodat o pronunat band atribuit ntinderii simetrice a gruprii fosfat la 1078 cm-1. Caracteristicile spectrale care sugereaz transformri de malignitate sunt n principal modurile de vibraie simetrice i antisimetrice ale gruprii fosfat precum i reducerea n intensitate a benzii atribuite glicogenului. Acest studiu a demonstrat potenialul de aplicabilitate a tehnologiei automatizate FTIR n monitorizarea cancerului de col uterin n mediul clinic. Privind aceeai afeciune, Wood et al. [28] au investigat cu microspectroscopia FTIR tipurile de celule i potenialele variabile care ar duce la confuzii n diagnosticarea malignitii acestui esut. Scopul acestui studiu a fost determinarea eficienei spectroscopiei IR n diagnosticare i n acest sens s-a descoperit c leucocitele, respectiv limfocitele au o caracteristic spectral n zona legturii fosfodiester (1300-900 cm-1), sugernd prin aceasta modificri spre malignitate. Studiul iniiat de Mordechai et al. [30] pe melanom fixat cu formalin i pe celule canceroase de col uterin bazat pe microspectroscopia FTIR a urmrit detecia unor biomarkeri comuni care apar n cele dou afeciuni, ncercnd astfel diferenierea esutului canceros de cel normal. Spectrele nregistrate au fost analizate privind posibilele modificri n ceea ce privete nivelul biomoleculelor: ADN, ARN, fosfai i carbohidrai. Nivelul acestora din urm s-a dovedit a fi un bun indicator n diagnosticarea i detecia cancerului de col uterin. Wang et al. [35] s-au concentrat asupra studiilor microscopice FTIR ale celulelor canceroase din fluidul pleural. Rezultatele lor demonstreaz c sunt diferene semnificative ntre celulele normale din plmn i cele tumorale. Diferena considerabil este reprezentat de raportul benzilor de la 1030 i 1080 cm-1, atribuit glicogenului i gruprii fosfat din acizii nucleici. Un avantaj major al acestei metode l reprezint posibilitatea de a obine rezultate determinante foarte rapid. ntr-un alt studiu, Yano et al. [36] se bazeaz pe posibilitatea de achiziie direct de pe esut de plmn canceros sau normal prin microscopia FTIR, n vederea implementrii acesteia ca i tehnic medical n acest domeniu. Pentru evaluarea cantitativ a malignitii s-au ales intensitile benzilor de la 1045 i 1465 cm-1, atribuite glicogenului i colesterolului. Acestea reprezint un factor discriminant privind esutul de plmn canceros i cel normal. Zona de interes a studiilor comparative de spectroscopie IR pentru Fabian et al. [38] a fost reprezentat de cancerul la sn, a culturilor celulare i a xenogrefelor de acest tip. La nivel macroscopic, probele preau s fie 152

omogene din punct de vedere al esutului conjunctiv care a fost ales ca i amprent spectral. Ulterior s-au detectat modificri n coninutul de colagen i a depozitrii celulelor lipidice. S-a concluzionat c un studiu de spectroscopie IR poate deveni foarte util n interpretarea corect i nelegerea pe deplin a patologiei acestui esut. Lucassen et al. [23] a utilizat spectroscopia ATR-FTIR (spectroscopia IR cu tranformat Fourier n reflexie total atenuat) pentru a msura gradul de hidratare al corneei. Se presupune c pentru aceast apreciere este necesar obinerea de informaii fundamentale privind ptrunderea i pierderea lichidului apos de la nivelul corneei. Astfel, urmrind vibraia de deformare a apei n combinaie cu cea de ntindere a legturii OH n cazul unei suprafee normal hidratat de cornee i a uneia nehidratate suficient din cauza unor ocluzii, s-a reuit determinarea cantitativ a apei n fiecare caz. Fujioka et al. [43] au raportat diferenierea spectroscopic ntre esutul gastric normal i cel tumoral. Utiliznd spectroscopia FTIR s-a realizat aceast discriminare cu o acuratee de 88.6%. Weng et al. [44] au studiat tumori de stomac, intestin subire, colon, rect, ficat i a altor pri ale sistemului digestiv cu ajutorul fibrei optice FTIR i a spectroscopiei FT-Raman, achiziia de informaii avnd loc la contactul cu o sond ATR. Rezultatele au indicat faptul c banda atribuit ntinderii C=O a adipozei poate fi identificat n spectrele probelor de esut normal, ns foarte rar n cele de esut tumoral, urmrindu-se raportul benzilor de la 1460 i 1400 cm-1. Li et al. [46] au realizat o investigare a biopsiilor cu spectroscopia ATR-FTIR privind afeciuni ca i: gastrit superficial, cancer de stomac i gastrit cronic prin comparare cu esut normal i a obinut o acuratee n diagnostic de 90%, 74%, 66%, respectiv 90%. Choo et al. [47] au aplicat spectroscopia IR n diagnosticarea afeciunii Alzheimer investignd spectre achiziionate pe esut uman de sistem nervos central. Prin utilizarea mai multor metode multivariate au artat c este posibil s se clasifice datele spectroscopice non-subiectiv, respectiv s diferenieze materia alb de cea cenuie cu acuratee de 90%. Fukuyama et al. [50] au folosit spectroscopia FTIR pentru a studia diferenele ntre celule canceroase gingivale i celulele epiteliale gingivale normale. Prin comparare cu spectre ale cheratinei pure i ale colagenului s-au obinut rezultate care s susin introducerea acestor investigaii n clinici. Andrus i Strickland [51] au monitorizat gradual tumori limfoide cu ajutorul spectroscopiei FTIR, urmrind absorbia atribuit colagenului. Dovbeshko et al. [62] au ales un studiu de reflexie FTIR prin absorpie amplificat la suprafa a acizilor nucleici din celulele tumorale, dar acest stu153

diu a ridicat anumite probleme, respectiv apariia prin interpretarea spectrelor a unor configuraii ciudate de baze i zaharuri. n concluzie, spectroscopia de absorbie IR reprezint o metod senzitiv n ceea ce privete analiza malignitii esuturilor cu potenial real pentru aplicaii clinice n detecia i diagnosticarea a diverse afeciuni.

4.Spectroscopia IR n calitatea i sigurana alimentelor

Spectroscopia FTIR este o tehnologie promitoare pentru industria agroalimentar deoarece permite msurtori simple, rapide i nedistructive ale compuilor chimici. Progresul n instrumentaia FTIR combinat cu dezvoltarea unor metode statistice multivariate de analiz a datelor fac aceast tehnologie ideal pentru monitorizare rapid ct i caracterizarea compuilor din alimente la nivel de urme, pn la pri pe milliard (ppb). Datorit utilizrii tehnicii FTIR n aplicaii de control a calitii i a procesrii, industria agroalimentar este deja familiarizat cu aceast tehnologie i cu potenialul ei de implementare n monitorizarea alimentelor. Spectroscopia MIR a fost folosit n autentificarea sucurilor cu ingrediente de nalt calitate contrafcute din surse inferioare. Rodiile sunt foarte apreciate pentru activitatea lor antioxidant ct i pentru potenialele efecte chemopreventive mpotriva cancerului de prostat [68]. Spectre MIR au fost folosite pentru a diferenia sucurile concentrate pure din rodii de cele contrafcute cu suc de struguri concentrat (2%-14% v/v) folosind analiza de componente principale (PCA) n regiunea IR 1780-1685 cm-1, atribuit n principal ntinderii C=O [68]. n mod similar, spectroscopia MIR a fost de mare succes n diferenierea varietilor de fructe i a originilor geografice. Un parametru important n monitorizarea autenticitii piureurilor, preparatelor i a gemurilor de fructe este procentul care desemneaz coninutul de fructe, iar pentru fiecare produs s-au stabilit limite inferioare ale acestuia. Regresia de tip parial least-squares (PLS) ce coreleaz coninutul de fructe i spectrele FTIR centrate pe o band la 1729 cm-1 a asigurat o bun calibrare statistic la analizarea gemului de cpuni [69]. He et al. [70] au analizat afine, struguri Concord, merior, nectar de prune i sucuri de mere de la diferii productori. Spectre nregistrate dup extracia fazei solide din sucuri a mbuntit puterea de modelare pentru compararea cu sucul pur i a recunoaterii prin folosirea unui tipar (soft independent analysis of class analogy (SIMCA)) i a permis diferenierea sucurilor de origini diferite. Extracia fazei solide a minimizat interferena zahrului cu spectrele i a izolat componentele fenolice care au oferit o amprent unic n autentificarea sucurilor. Autorii au 154

atras atenia asupra limitrilor acestei metode, inclusiv n procesul de extracie i asupra nevoii unui spectru larg de probe pentru a mbunti repetabilitatea acestui model, dar au subliniat c aceast metod este o mbuntire real comparativ cu ncercrilor anterioare [70]. Metodele tradiionale pentru autentificarea sucurilor de fructe includ cromatografia sau analiza raportului izotopilor de carbon, niciuna dintre ele fiind foarte practic pentru c sunt costisitoare din punct de vedere al timpului necesar efecturii lor i al setrilor pentru controlul de calitate, folosesc solveni duntori i monitorizeaz doar un parametru la un moment dat. Consumatorii sunt tot mai interesai de produse organice i sunt dispui s plteasc un pre mai mare pentru aceste produse. Industria de vinuri a recunoscut acest trend i astfel n multe podgorii se pune accentul pe vinuri organice. Pn n 2009 nu a fost o metod standardizat n industria viticol care s permit determinarea eficient a compoziiei i autenticitii vinurilor organice [71]. Cozzolino et al. [71] au fost primii care au folosit tehnologia IR pentru a clasifica vinuri comerciale provenite de la sisteme de producie organic i anorganic. Aproape 200 de soiuri de vinuri roii i albe din 13 regiuni din Australia au fost analizate folosind spectroscopia MIR combinat cu PCA, regresia PLS discriminant (DPLS), i analiza discriminant liniar (LDA). DPLS a clasificat corect 85% din vinurile organice, iar LDA a reuit s clasifice 75%. n general, rezultatul analizei PCA a separat vinurile organice de cele anorganice, dar a existat o uoar suprapunere [71]. Autorii aduc la cunotin c spectroscopia MIR combinat cu tehnici chemometrice au permis o discriminare bun ntre probele produse n sisteme de producie organic i anorganic. Explorarea rezultatelor analizei PLS nu a desemnat un parametru chimic individual care s fi explicat diferenierea vinurilor, ci mai degrab mai muli compui chimici, incluznd compui fenolici volatili i nevolatili, care ar contribui la discriminarea vinurilor.

5. Aplicaii ale spectroscopiei IR n geotiine

Concentraia i distribuia apei n rocile vulcanice din Sumisu Caldera i Vulcanul Torishima din arcul Izu-Bonin (Japonia) au fost studiate de Wysoczanski i Tani [72]. Rezultatele au fost comparabile cu cele obinute prin metoda convenional bazat pe micro-FTIR, rezultnd o precizie similar i o rezoluie spaial chiar mai bun, estimat la circa 5m [72]. Masa brut a dacitelor din Sumisu Caldera conine ntre 1.2-1.4 % (wt) H2O, iar pentru obsidian 0.2 % (wt) H2O, valori corespunztoare cu saturarea apei la presiunile de erupie. 155

Este bine cunoscut faptul c mineralele anhidride nominale formate n condiii de nalt presiune conin urme de specii hidride [73-74]. Numeroase studii recente au artat c specii volatile ca i CO2 i specii hidride ca i OH i H2O pot fi de asemenea ncorporate n circumstane speciale n majoritatea mineralelor din crust [75-77]. Astfel se susine ideea c o analiz amnunit a speciilor volatile din minerale poate oferi informaii cantitative i calitative privind activitatea apei i a CO2, fugacitatea oxigenului i compoziia fluidelor n sistemele minerale, aceste studii fiind folositoare n determinarea genezei i a evoluiei sistemelor magmatice [78]. Analiza apei n minerale [79] i roci [80] cu ajutorul spectroscopiei FTIR este aproape o tehnic de rutin, analiza spectroscopic a CO2 fiind comun n studiul rocilor, dar teste efectuate pe incluziunile de fluide din minerale sunt rare [81]. Della Ventura et al. [76] au studiat un set de cristale leucite transparente atent selecionate provenind din vulcanul Alban Hills (Roma, Italia). O microanaliz preliminar a acestor probe a dezvluit o absorpie n regiunea 3000-4000 cm-1 datorat vibraiilor de ntindere a apei, fiind 3 peak-uri bine definite la 3604 cm-1, la 3500 cm-1 i la 3245 cm-1. Concluzia lui Della Ventura et al. a fost c imagistica FTIR a distribuiei apei n leucite reprezint un instrument valoros n monitorizarea evoluiei sistemelor magmatice. Pe lng caracterizarea cristalo-chimic, studiul speciilor volatile n minerale are aplicaii i n alte domenii. De fapt, mineralele au o larg rspndire n istoria rocilor ornamentale sau a pigmenilor utilizai n operele de art, de aceea aceste materiale merit ca toat atenia, n special privind studiile arheologice i problemele de conservare. n acest context, coninutul de CO2 din lazurite a fost propus ca i indicator al sursei naturale ultramarine de pigmeni. Aplicnd fluorescena de raze X, colecia de imagini obinute prin scanare a artat, precum era de ateptat, faptul c acel coninut de CO2 depinde puternic de faza mineralului [82]. Studiile care trateaz incluziunile de fluide sunt foarte utile n definirea rolului fluidelor n geneza, procesele de deformare ct i a unui geotermometru privind rocile din crusta terestr [83]. Aceste incluziuni determin totodat i dezvoltarea modelelor restrictive n geneza depozitrii minereurilor i ofer informaii pentru exploatarea geotermal i petrolier n producia la nivel industrial. Mulumiri pentru suportul acordat de Drd. Nicoleta E. Mircescu i Mast. Krisztian Herman la redactarea acestui material.

156

6. Bibliografie
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. G. W. Somsen, C. Gooijer and U. A. T. Brinkman, Journal of Chromatography A 856 (1999) 213-242; M. Gallignani and M. D. Brunetto, Talanta 64 (2004) 1127-1146; M. Kolhed, B. Lendl and B. Karlberg, Analyst 128 (2003) 2-6; I. Surowiec, J. R. Baena, J. Frank, T. Laurell, J. Nilsson, M. Trojanowicz and B. Lendl, Journal of Chromatography A 1080 (2005) 132-139; G. Quintas, J. Kuligowski and B. Lendl, Analytical Chemistry 81 (2009) 3746-3753; P. Svasek, E. Svasek, B. Lendl and M. Vellekoop, Sensors and Actuators a-Physical 115 (2004) 591-599; A. Edelmann, C. Ruzicka, J. Frank, B. Lendl, W. Schrenk, E. Gornik and G. Strasser, Journal of Chromatography A 934 (2001) 123-128; S. Schaden, M. Haberkorn, J. Frank, J. R. Baena and B. Lendl, Applied Spectroscopy 58 (2004) 667-670; B. Lendl, J. Frank, R. Schindler, A. Muller, M. Beck and J. Faist, Analytical Chemistry 72 (2000) 1645-1648; http://www.quantared.com Vienna, Austria http://daylightsolutions.com J. Kuligowski, G. Quintas and B. Lendl, Applied Physics B-Lasers and Optics 99 (2010) 833-840; N. Anastos, N. W. Barnett and S. W. Lewis, Talanta 67 (2005) 269-279; P. G. Righetti, Journal of Chromatography A 1079 (2005) 24-40; M. Lammerhofer, Journal of Chromatography A 1068 (2005) 3-30; M. Kolhed, P. Hinsmann, P. Svasek, J. Frank, B. Karlberg and B. Lendl, Analytical Chemistry 74 (2002) 3843-3848; M. Kolhed, P. Hinsmann, B. Lendl and B. Karlberg, Electrophoresis 24 (2003) 687-692; M. Kolhed and B. Karlberg, Analyst 130 (2005) 772-778; P. Hinsmann, L. Arce, P. Svasek, M. Lammerhofer and B. Lendl, Applied Spectroscopy 58 (2004) 662-666; A. Barth and C. Zscherp, Quarterly Reviews of Biophysics 35 (2002) 369-430; P. T. T. Wong, S. M. Goldstein, R. C. Grekin, T. A. Godwin, C. Pivik and B. Rigas, Cancer Research 53 (1993) 762-765; S. Sukuta and R. Bruch, Lasers n Surgery and Medicine 24 (1999) 382-388; G. W. Lucassen, G. N. V. Veen and J. A. Jansen, Journal of Biomedical Optics 3 (1998) 267-280; L. M. McIntosh, M. Jackson, H. H. Mantsch, M. F. Stranc, D. Pilavdzic and A. N. Crowson, Journal of Investigative Dermatology 112 (1999) 951-956; B. W. Barry, H. G. M. Edwards and A. C. Williams, Journal of Raman Spectroscopy 23 (1992) 641-645; B. R. Wood, M. A. Quinn, F. R. Burden and D. McNaughton, Biospectroscopy 2 (1996) 143-153; L. Chiriboga, P. Xie, H. Yee, V. Vigorita, D. Zarou, D. Zakim and M. Diem, Biospectroscopy 4 (1998) 47-53; B. R. Wood, M. A. Quinn, B. Tait, M. Ashdown, T. Hislop, M. Romeo and D. McNaughton, Biospectroscopy 4 (1998) 75-91; R. Sindhuphak, S. Issaravanich, V. Udomprasertgul, P. Srisookho, S. Warakamin, S. Sindhuphak, R. Boonbundarlchai and N. Dusitsin, Gynecologic Oncology 90 (2003) 10-14; S. Mordechai, R. K. Sahu, Z. Hammody, S. Mark, K. Kantarovich, H. Guterman, A. Podshyvalov, J. Goldstein and S. Argov, Journal of Microscopy-Oxford 215 (2004) 86-91;

157

31. L. Chiriboga, P. Xie, V. Vigorita, D. Zarou, D. Zakim and M. Diem, Biospectroscopy 4 (1998) 55-59; 32. P. T. T. Wong, S. Lacelle, M. F. K. Fung, M. Senterman and N. Z. Mikhael, Biospectroscopy 1 (1995) 357-364; 33. M. F. K. Fung, M. K. Senterman, N. Z. Mikhael, S. Lacelle and P. T. T. Wong, Biospectroscopy 2 (1996) 155-165; 34. U. Utzinger, D. L. Heintzelman, A. Mahadevan-Jansen, A. Malpica, M. Follen and R. Richards-Kortum, Applied Spectroscopy 55 (2001) 955-959; 35. H. P. Wang, H. C. Wang and Y. J. Huang, Science of the Total Environment 204 (1997) 283-287; 36. K. Yano, S. Ohoshima, Y. Gotou, K. Kumaido, T. Moriguchi and H. Katayama, Analytical Biochemistry 287 (2000) 218-225; 37. Y. Yang, J. Sule-Suso, G. D. Sockalingum, G. Kegelaer, M. Manfait and A. J. El Haj, Biopolymers 78 (2005) 311-317; 38. H. Fabian, M. Jackson, L. Murphy, P. H. Watson, I. Fichtner and H. H. Mantsch, Biospectroscopy 1 (1995) 37-45; 39. R. Eckel, H. Huo, H. W. Guan, X. Hu, X. Che and W. D. Huang, Vibrational Spectroscopy 27 (2001) 165-173; 40. N. J. Kline and P. J. Treado, Journal of Raman Spectroscopy 28 (1997) 119-&; 41. K. E. Shafer-Peltier, A. S. Haka, M. Fitzmaurice, J. Crowe, J. Myles, R. R. Dasari and M. S. Feld, Journal of Raman Spectroscopy 33 (2002) 552-563; 42. C. J. Frank, R. L. McCreery and D. C. B. Redd, Analytical Chemistry 67 (1995) 777-783; 43. N. Fujioka, Y. Morimoto, T. Arai and M. Kikuchi, Cancer Detection and Prevention 28 (2004) 32-36; 44. S. F. Weng, X. F. Ling, Y. Y. Song, Y. Z. Xu, W. H. Li, X. Zhang, L. Yang, W. Sun, X. Zhou and J. Wu, American Clinical Laboratory 19 (2000) 20; 45. S. Mordechai, A. O. Salman, S. Argov, B. Cohen, V. Erukhimovitch, J. Goldstein, O. Chaims and Z. Hammody, Proceedings of the SPIE 3918 (2000) 66-77; 46. Q. B. Li, X. J. Sun, Y. Z. Xu, L. M. Yang, Y. F. Zhang, S. F. Weng, J. S. Shi and J. G. Wu, Clinical Chemistry 51 (2005) 346-350; 47. L. P. Choo, J. R. Mansfield, N. Pizzi, R. I. Somorjai, M. Jackson, W. C. Halliday and H. H. Mantsch, Biospectroscopy 1 (1995) 141-148; 48. G. I. Dovbeshko, N. Y. Gridina, E. B. Kruglova and O. P. Pashchuk, Talanta 53 (2000) 233-246; 49. S. Yoshida, M. Miyazaki, K. Sakai, M. Takeshita, S. Yuasa, A. Sato, T. Kobayashi, S. Watanabe and H. Okuyama, Biospectroscopy 3 (1997) 281-290; 50. Y. Fukuyama, S. Yoshida, S. Yanagisawa and M. Shimizu, Biospectroscopy 5 (1999) 117-126; 51. P. G. L. Andrus and R. D. Strickland, Biospectroscopy 4 (1998) 37-46; 52. S. Mordechai, J. Mordehai, J. Ramesh, C. Levi, M. Huleihel, V. Erukhimovitch, A. Moser and J. Kapelushnik C. Nguyen, Application of FTIR microspectroscopy for the follow-up of childhood leukemia chemotherapy 4491 (2001) 243-250; 53. P. G. Andrus, Technology n Cancer Research & Treatment 5 (2006) 157-167; 54. E. Gazi, J. Dwyer, P. Gardner, A. Ghanbari-Siahkali, A. P. Wade, J. Miyan, N. P. Lockyer, J. C. Vickerman, N. W. Clarke, J. H. Shanks, L. J. Scott, C. A. Hart and M. Brown, Journal of Pathology 201 (2003) 99-108; 55. C. Paluszkiewicz and W. M. Kwiatek, Journal of Molecular Structure 565 (2001) 329-334; 56. S. Argov, R. K. Sahu, E. Bernshtain, A. Salman, G. Shohat, U. Zelig and S. Mordechai, Biopolymers 75 (2004) 384-392;

158

57. T. Richter, G. Steiner, M. H. Abu-Id, R. Salzer, R. Bergmann, H. Rodig and B. Johannsen, Vibrational Spectroscopy 28 (2002) 103-110; 58. B. Rigas and P. T. T. Wong, Cancer Research 52 (1992) 84-88; 59. B. Rigas, S. Morgello, I. S. Goldman and P. T. T. Wong, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 87 (1990) 8140-8144; 60. M. Huleihel, A. Salman, V. Erukhimovich, J. Ramesh, Z. Hammody and S. Mordechai, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 50 (2002) 111-121; 61. R. Smith and I. Rehman, Journal of Materials Science-Materials n Medicine 5 (1994) 775-778; 62. G. I. Dovbeshko, V. I. Chegel, N. Y. Gridina, O. P. Repnytska, Y. M. Shirshov, V. P. Tryndiak, I. M. Todor and C. I. Solyanik, Biopolymers 67 (2002) 470-486; 63. M. M. Mossoba, S. F. Al-Khaldi, J. Kirkwood, F. S. Fry, J. Sedman and A. A. Ismail, Vibrational Spectroscopy 38 (2005) 229-235; 64. D. Naumann H. H. J. M. K. A. Mantsch, Infrared and NIR raman spectroscopy n medical microbiology 3257 (1998) 245-257; 65. K. J. Jalkanen, V. W. Jurgensen, A. Claussen, A. Rahim, G. M. Jensen, R. C. Wade, F. Nardi, C. Jung, I. M. Degtyarenko, R. M. Nieminen, F. Herrmann, M. Knapp-Mohammady, T. A. Niehaus, K. Frimand and S. Suhai, International Journal of Quantum Chemistry 106 (2006) 1160-1198; 66. J. Binoy, J. P. Abraham, I. H. Joe, V. S. Jayakumar, G. R. Pettit and O. F. Nielsen, Journal of Raman Spectroscopy 35 (2004) 939-946; 67. M. Tarumi, M. Shimada, T. Murakami, M. Tamura, H. Arimoto and Y. Yamada, Physics n Medicine and Biology 48 (2003) 2373-2390; 68. H. Vardin, A. Tay, B. Ozen and L. Mauer, Food Chemistry 108 (2008) 742-748; 69. R. Fugel, R. Carle and A. Schieber, Trends n Food Science & Technology 16 (2005) 433-441; 70. J. He, L. E. Rodriguez-Saona and M. M. Giusti, Journal of Agricultural and Food Chemistry 55 (2007) 4443-4452; 71. D. Cozzolino, M. Holdstock, R. G. Dambergs, W. U. Cynkar and P. A. Smith, Food Chemistry 116 (2009) 761-765; 72. R. Wysoczanski and K. Tani, Journal of Volcanology and Geothermal Research 156 (2006) 302-314; 73. H. Skogby, Water n Nominally Anhydrous Minerals 62 (2006) 155-167; 74. A. Beran and E. Libowitzky H. S. J. R. Keppler, Water n natural mantle minerals II: Olivine, garnet and accessory minerals 62 (2006) 169-191; 75. E. A. Johnson, Water n Nominally Anhydrous Minerals 62 (2006) 117-154; 76. G. Della Ventura, F. Bellatreccia and M. Piccinini, American Mineralogist 93 (2008) 1538-1544; 77. F. Bellatreccia, G. Della Ventura, M. Piccinini, A. Cavallo and M. Brilli, Mineral. Mag. 73 (2009) 399-413; 78. B. De Vivo, A. Lima and J. D. Webster, Elements 1 (2005) 19-24; 79. E. Libowitzky and G. R. Rossman, Physics and Chemistry of Minerals 23 (1996) 319-327; 80. P. D. Ihinger, R. L. Hervig and P. F. McMillan, Volatiles n Magmas 30 (1994) 67-121; 81. R. L. Linnen, H. Keppler and S. M. Sterner, Canadian Mineralogist 42 (2004) 1275-1282; 82. G. Della Ventura, F. Bellatreccia and M. Piccinini, Rendiconti Lincei-Scienze Fisiche E Naturali 19 (2008) 141-159; 83. T. Andersen, M. L. Frezzotti and E. A. J. Burke, Lithos 55 (2001) IX-XI;

159

V. SPECTROFLUORIMETRUL Spectrofluorimetria
Conf. dr. Dana Maniu Cuprins
1. Consideraii teoretice............................................................................................ 160 2. Tehnica experimental ......................................................................................... 164 3. Avantajele spectrofluorimetriei ............................................................................ 166 4. Aplicaii ale spectrofluorimetriei .......................................................................... 166 5. Aparatura disponibil .......................................................................................... 169 6. Bibliografie ........................................................................................................... 171

1. Consideraii teoretice
Fluorescena este un fenomen de fotoluminiscen (procesul prin care substanele absorb lumin i dup aceea reemit lumin cu o lungime de und diferit). Din aceeai clas fac parte i fosforescena i fosforescena ntrziat. Prin absorbie de radiaie luminoas moleculele pot fi excitate prin trecerea unui electron de pe nivelul fundamental pe un nivel excitat. Energia strii excitate nu poate fi meninut dect o perioad foarte scurt, molecula dezexcitndu-se. Dac molecula se dezexcit (electronul trece din starea excitat n starea fundamental) prin emisie de lumin, procesul se numete fluorescen. Moleculele care au aceast proprietate, se numesc molecule fluorescente sau fluorofori. n starea electronic fundamental moleculele fluorescente se afl ntr-o configuraie stabil, deci nu emit radiaie de fluorescen. Atunci cnd radiaia luminoas ajunge pe o molecul fluorescent, aceasta poate trece ntr-o stare electronic excitat (cu energie mai mare) n urma absorbiei de energie de la radiaia luminoas. Exist o mulime de nivele vibraionale ale strii electronice excitate pe care se poate afla o molecul fluorescent. Energia acestor nivele depinde de energia (lungimea de und) radiaiei luminoase care produce excitarea. Moleculele fluorescente sunt instabile atunci cnd se afl pe un nivel vibraional al strii electronice excitate. De aceea ele 160

trec n cea mai joas stare electronic excitat, care este semi-stabil, pierderea de energie este neradiativ, fcndu-se prin ciocnirea cu alte molecule. Intervalul de timp n care o molecul fluorescent se afl n stare excitat se numete timp de via i are o valoare foarte mic (ntre 10-15 i 10-9 s). Dup acest interval, moleculele fluorescente trec din stare electronic excitat n stare electronic fundamental, excesul de energie dintre cele dou stri regsindu-se n energia radiaiei luminoase emise n procesul de dezexcitare. Radiaia luminoas de fluorescen are energie mai mic dect radiaia luminoas absorbit de molecul. Deci lungimea de und a radiaiei emise este totdeauna mai mare dect lungimea de und a radiaiei absorbite datorit energiei pierdute de molecul n timpul trecerii pe cea mai joas stare electronic excitat. Molecula fluorescent poate absorbi energie luminoas din nou, deci procesul descris mai sus poate fi repetat. De fapt, procesul de fluorescen este ciclic i are loc atta timp ct exist o radiaie luminoas, care s excite molecula. Acest fapt este deosebit de util, deoarece nseamn c o molecul poate emite radiaie de fluorescen de mai multe ori. Aceast proprietate face ca fluorescena s fie o tehnic foarte senzitiv (chiar i o mic cantitate de substan poate fi detectat). n realitate, moleculele fluorescente sunt instabile structural n intervalul de timp ct se afl n stare de excitaie (timpul de via), ceea ce face posibil degradarea ei. O radiaie luminoas de mare intensitate poate provoca modificarea structurii moleculei fluorescente, astfel nct aceasta s nu mai emit radiaie de fluorescen. Acest proces este numit photobleaching. n urma absorbiei unui foton de ctre o molecul, sunt posibile urmtoarele procese (ilustrate n figura 1): - conversia intern (IC) - moleculele aflate pe diferite nivele vibraionale se relaxeaz pe nivelul fundamental al strii electronice respective; relaxarea vibraional se face prin pierderea de energie n urma ciocnirilor dintre molecule (10-14 - 10-11 s). - intersystem crossing (ISC) - unele molecule aflate n prima stare electronic excitat, stare de singlet (S1), pot trece n prima stare de triplet (T1). Acest proces se poate observa la atomii grei (Br, I) sau la metale. - fosforescena - moleculele aflate n starea de triplet pot s se dezexcite prin emisia unui foton. O tranziie triplet-singlet este mult mai puin probabil dect o tranziie singlet-singlet. Timpul de via a unei stri excitate de triplet poate ajunge pn la 10 s, deci emisia de fosforescen poate continua i dup ncetarea iradierii iniiale. De obicei fosforescena apare doar la temperaturi sczute sau n medii cu vscozitate mare (dezexcitatea nivelului T1 se poate face i prin conversie intern sau alte procese neradiative). 161

Figura 1. Diagrama Perrin-Jablonski.

- fluorescena, este proprietatea moleculelor de a emite radiaie electromagnetic la trecerea de pe prima stare excitat de singlet S1 pe un nivel vibraional al strii electronice fundamentale S0. Fluorescena poate s apar doar n timpul absorbiei (timpul de via a unei stri excitate de singlet este ntre 10-9 i 10-15 s). Majoritatea moleculelor nu sunt fluorescente deoarece starea excitat S1 se suprapune cu nivelele vibraionale ale strii fundamentale S0. n acest caz relaxarea vibraional este mai rapid dect relaxarea prin fluorescen. Fluorescena se poate msura cu ajutorul eficienei cuantice Q (randament cuantic): Q = (numrul de fotoni emii) / (numrul de fotoni absorbii) Q are o valoare fix pentru fiecare molecul (pentru aceleai condiii), valoarea maxim fiind 1. De aceea, moleculele fluorescente au spectre de absorbie i de fluorescen caracteristice. Fluorescena observat cu ajutorul spectrofluorimetrelor este cunoscut ca Fluorescena de tip Stokes. Fluorescena de tip Stokes reprezint emisia de fotoni cu lungime de und mai mare (frecven mai mic) de ctre o molecul ce a absorbit fotoni cu o lungime de und mai mic (frecven mai mare). Att absorbia ct i emisia de fluorescen sunt unice pentru fiecare molecul. Lumina emis are totdeauna lungime de und mai mare dect lumina absorbit (figura 2).

162

Figura 2. Spectru de fluorescen (emisie) i de absorbie (excitaie) caracteristic.

Intensitatea radiaiei fluorescente este proporional cu intensitatea radiaiei absorbit de o molecul fluorescent: F = K'(I0-I) unde I0 este intensitatea radiaiei incidente pe prob, I este intenstitatea radiaiei dup ce a traversat un strat de substan de lungime b, iar K' este o constant ce depinde de condiiile experimentale i de eficiena cuantic a fluorescenei. Dac inem cont de legea Beer: I/I0 = 10-bc , unde A = bc este absorbana, atunci printr-o simpl nlocuire se obine legea fluorescenei: F = K' I0 (1 - 10-bc)

Figura 3. Curba de calibrare

163

Spre deosebire de legea Beer, intensitatea radiaiei de fluorescen nu depinde liniar de concentraie. Dac folosim o descompunere n serie Taylor, avem:

(2,3 b c)2 + (2,3 b c)3 .... F = K ' I 0 2,3 b c 2! 2!

Dac bc are o valoare suficient de mic (< 0.05) termenii de ordin superior pot fi considerai nuli, deci putem scrie: F = 2,3K'bcI0 Relaia de mai sus ne arat ca pentru concentraii suficient de mici intensitatea de fluorescent este proporional cu concentraia i cu intensitatea radiaiei excitatoare la frecvena de absorbie. Pentru o concentraie mai mare dect c1 curba de calibrare nu mai este liniar.

2. Tehnica experimental
Pentru a msura fluorescena exist dou tipuri de instrumente: fluorimetre i spectrofluorimetre. Un fluorimetru msoar abilitatea unei probe de a absorbi lumin la o anumit lungime de und i de a emite lumin la o lungime de und mai mare. Fluorimetrele se folosesc pentru msurtori cantitative pentru compui specifici (msurtori de rutin). Spectrofluorimetrele folosesc dou monocromatoare, unul pentru lumina excitatoare i unul pentru radiaia de fluorescen emis. Avantajul spectrofluorimetrelor este faptul c permit variaia controlat a lungimii de und a radiaiei excitatoare. Astfel, proprietile fluorescente ale probei pot fi scanate pentru un domeniu larg de lungimi de und ale radiaiei excitatoare (200-1000 nm). Prile principale ale unui spectrofluorimetru sunt: sursa, monocromator a radiaiei excitatoare, camera probei, monocromator al radiaiei emise, detector (figura 4). Bineneles, orice spectrofluorimetru modern este interfaat cu un computer cu ajutorul cruia se seteaz parametrii de msurare, se nregistreaz i se prelucreaz datele. Primul monocromator analizeaz lungimea de und a radiaiei excitatoare, iar celalalt analizeaz lungimea de und a radiaiei de fluorescen (emise). Semnalul detectat poate fi reprezentat n funcie de cele dou lungimi de und sau numai n funcie de una din cele dou lungimi de und. Radiaia emis este colectat la un 164

unghi de 90 fa de radiaia excitatoare pentru a preveni orice interferen ntre radiaia excitatoare i cea emis.
surs

monocromator

detector prob monocromator

Figura 4. Schema bloc pentru un spectrofluorimetru

Sursa unui spectrofluorimetru emite n domeniul UV i vizibil (de obicei se folosesc lmpi cu Xenon). Lumina emis de surs este focalizat pe fanta de intrare a primului monocromator cu ajutorul unei oglinzi sferice sau eliptice. Fanta de intrare este ajustabil continuu (cu ajutorul soft-ului) pentru a se asigura maximul de rezoluie i reproductibilitate. Primul monocromator descompune radiaia excitatoare n culorile componente. Prin fanta de ieire a monocromatorului radiaiei excitatoare iese lumin cu lungimea de und dorit. Astfel radiaia luminoas incident pe prob poate s aib lungime de und fix pentru tot timpul msurtorii, sau poate s se modifice continuu pe tot domeniul de emisie al sursei. Att intensitatea luminoas a radiaiei incidente, ct i lungimea de und a acesteia este monitorizat i controlat cu ajutorul unui fotodetector suplimentar situat ntre monocromator i camera probei. Camera probei este de obicei destul de spaioas, pentru a permite instalarea diferitelor accesorii pentru probe solide, lichide i gazoase, sau pentru controlarea temperaturii probei. Lumina emis de prob este focalizat pe fanta de intrare al celui de-al doilea monocromator. Acesta descompune radiaia de fluorescen emis de prob n culorile componente. Deoarece radiaia de fluorescen are totdeauna lungime de und mai mare dect radiaia excitatoare, elementul dispersiv al celui de-al doilea monocromator este astfel conceput nct s aib maximul de eficien n domeniul vizibil. Detectorul este poziionat la ieirea din cel de-al doilea monocromator. 165

Toate spectrofluorimetrele moderne sunt controlate de computer. Astfel, prin intermediul computerului se pot seta toi parametri necesari derulrii diferitelor tipuri de msurtori. Datele obinute n urma msurtorilor efectuate se pot prelucra cu ajutorul programelor speciale.

3. Avantajele spectrofluorimetriei
Senzitivitatea: Limitele de detecie depind n mare msur de proprietile probei de msurat. Pentru multe substane fluorescente este obinuit o limit de detecie de pri/miliard sau chiar pri/triliard. Aceast extraordinar senzitivitate permite detecia sigur a substanelor fluorescente (clorofil, hidrocarburi aromatice, etc.) folosind probe foarte mici. De asemenea, studiile pot fi efectuate n soluii apoase fr a fi nevoie ca probele s fie tratate. Spectrofluorimetrele au limite de detecie mult mai bune dect spectrofotometrele. Specificitatea: Spectrofotometrele msoar doar lumina absorbit. Tehnicile spectrofotometrice au probleme de interferen deoarece multe materiale absorb lumina, ceea ce face dificil izolarea semnalului de la materialul de analizat din matricea n care se afl. Spectrofluorometrele au o specificiate ridicat i apar mult mai puine probleme de interferen deoarece substanele fluorescente pot fi incluse n solveni sau matrici care nu sunt fluorescente, sau chiar dac au fluorescent este puin probabil ca dou substane s absoarb i s emit radiaie de fluorescen n acelai domeniu. Domeniu de concentraie: Intensitatea semnalului de fluorescen este direct proporional cu concentraia substanei fuorescente pe un domeniu larg. Fluorimetria poate fi folosit pe un domeniu mare de concentraii fr a fi nevoie de diluia eantioanelor sau de modificarea celulei n care se pune eantionul. Vitez i simplitate: spectrofluorimetria este o tehnic analitic relativ simpl. Senzitivitatea i specificitatea mare a acestei tehnici reduce sau chiar elimin procedurile de preparare a probelor.

4. Aplicaii ale spectrofluorimetriei

Medicin i farmacologie Sensitivitatea deosebit a spectroscopiei de fluorescen, face ca aceast tehnic s fie folosit att pentru cercetri avansate ct i pentru analize de rutin sau controlul calitii n domeniile farmaciei i medicinii. Fluorescena ofer informaii asupra dinamicii, rigiditii i structurii proteinelor, vi166

ruilor, AND-ului, etc. Cu ajutorul fluorescenei se poate identifica prezena unui numr foarte mare de analii chiar dac acetia sunt n cantiti foarte mici (sub picomolar), fapt ce are deosebite aplicaii n imunologie. Mediul nconjurtor Cu ajutorul fluorescenei se poate monitoriza calitatea aerului, a apei i a solului prin detectarea urmelor de substane organice sau inorganice, toxine, mutageni sau substane canceroase. Deoarece probele preluate din mediul nconjurtor sunt deosebit de complexe, pentru detectarea diferitelor substane sunt necesare tehnici de mare senzitivitate i selectivitate care s evite multiplele surse de interferen. Spectrele de fluorescen 3D pot fi folosite ca o amprent unic care duce la identificarea calitativ a compuilor. De asemenea msurtorile de fluorescen 3D sunt folosite pentru determinarea surselor geologice a diferitelor eantioane de petrol. Chimia analitic n chimia analitic se studiaz spectrele de luminescen precum i eficiena cuantic a speciilor flourescente n funcie de matria n care sunt puse. Dup ce sunt determinate caracteristicile de baz (excitaie, emisie, randament cuantic) ale unei substane fluorescente, pot fi elaborate metode i teste de rutin pentru analizele de laboratoar. Prin determinri de fluorescen pot fi determinate: - efectul general de solvent - timpul de via i randamentul cuantic - momentul de dipol al strii excitate - efectul prezenei atomilor grei - efectul temperaturii - reacia la diferite suprafee Industria alimentar i agricultura n industria alimentar este important mbuntirea calitii nutriionale a alimentelor, creterea termenului de garanie precum i a calitii ambalajelor. Culturile de bacterii ce pot s apar pe alimente sunt distructive i periculoase datorit potenialului de contaminare i mbolnvire pe care l au. Pentru a asigura calitatea produselor alimentare, productorii trebuie s identifice contaminani, microorganisme, mucegaiuri, i chiar pesticide utilizate n mod normal pentru a preveni rspndirea unor boli. Calitatea ambalajelor este de asemenea important att ca membran protectoare mpotriva oxidrii alimentelor ct i datorit faptului c sunt o posibil surs de contaminare cu urme de plastic sau de polimeri. Fluores167

cena poate fi folosit i n determinarea randamentului i calitii anumitor culturi n urma aplicrii fertilizatorilor. Industrie Productorii folosesc fluorescena pentru a monitoriza calitatea vopselelor, a plascticelor, a polimerilor, nlbitorilor optici i suprafeelor fosforescente. De asemenea, fluorescena este folosit ca instrument de cercetare n domeniul biotehnologiilor, pentru analiza medicamentelor, hormonilor, proteinelor, vitaminelor, i a altor substane biologice. Fabricanii de instrumentar medical i clinic studiaz sistemele invazive pe baz de fibre optice (ce pot fi introduse n interiorul arterelor sau a altor orificii). Companiile de cosmetice i produse pentru ngrijirea sntii evalueaz eficacitatea unor noi produse cum ar fi loiunile pentru protecie solar, emolientele pe baz de lipide i cremele anti-rid. Fotochimie Mecanismul absorbiei luminii precum i proprietile fotofizice ale unei substane determin rolul su n procesele biologice i chimice. Aplicaiile fotochimice ale fluorescenei includ: - mecanismul molecular de transfer prin membrana de protein a bacteriorhodopsinei (o membran integral de protein care acioneaz ca o pomp de protoni - captureaz energie luminoas i o folosete pentru a transfera protoni n exteriorul celulei); - terapia fotodinamic - o tehnic pentru localizarea, identificarea i controlul tumorilor; - conversia biologic de energie n fotosinteza plantelor verzi; - folosirea "quantum dots"-urilor ca probe biologice n diagnosticarea cancerului i studierea esuturilor; - caracterizarea substanelor fotoreceptoare (flavine, carotenoide, etc). Biologie celular n studiul proceselor biologice sunt implicai o larg varietate de markeri fluoresceni. Acetia pot fi caracterizai cu ajutorul spectrelor de fluorescen de excitaie i de emisie. Una din tehnicile cele mai folosite n acest domeniu este determinarea raportului dintre intensitile semnalului de fluorescen emis de markerul folosit la diferite lungimi de und, tehnic mai avantajoas dect cea clasic n care se msoar intensitatea absolut de fluorescen la o singur lungime de und.

168

5. Aparatura disponibil
Spectrofluorimetru Jasco FP 6500 Spectrofluorimetrul Jasco 6500 are urmtoarele caracteristici: Sursa este o lamp cu xenon de 150 W dotat cu un fotomultiplicator ce monitorizeaz i compenseaz orice variaie n intensitate asigurndu-se astfel maximul de stabilitate. Cele dou monocromatoare sunt echipate cu reele de difracie holografice concave (1500 trsturi/mm) cu unghi de "blaze" optimizat, ceea ce asigur maxim de senzitivitate pe ntregul domeniu de lungimi de und (200-850 nm). Spectrofluorimetrul este echipat cu accesorii pentru modificarea controlat a temperaturi probei i pentru polarizarea luminii incidente, precum i cu suporturi pentru diferite tipuri de probe (solide, lichide i gazoase). Fantele monocromatoarelor au dimensiuni reglabile, att ca lime ct i ca nlime. Alte caracteristici ale spectrofluorimetrului Jasco FP 6500 sunt: - rezoluia monocromatoarelor este de 1 nm; - raportul semnal - zgomot este 200:1 sau mai mare; - viteza de scanare este ntre 20 i 10.000 nm/ min pentru ambele monocromatoare; - acurateea lungimii de und este 2 nm pentru ambele monocromatoare. Calibrarea spectrofluorimetrului se face cu ajutorul kit-ului inclus ce utilizeaz ca prob standard Rodamina B. Cu ajutorul spectrofluorimetrului Jasco 6500 pot fi efectuate urmtoarele tipuri de msurtori: - determinarea concentraiei de substan fluorescent (analiz cantitativ), - determinarea spectrului de fluorescen a unei probe, - determinarea stabilitii intensitii de fluorescen n timp, - msurtori de cinetic, - msurtori la lungimi de und fix, - msurtori 3D de fluorescen, - determinarea spectrului de fosforescen a unei probe, - determinarea timpului de via n cazul probelor fosforescente. 169

Controlul acestor msurtori se face folosind programul "Spectra manager" Modul "Quantitative analysis": pentru a efectua o analiz cantitativ trebuie trasat o curb de calibrare. Aceast aciune presupune msurarea soluiilor etalon, construirea i stocarea curbei de calibrare. Rezultatele msurtorilor probelor de concentraie necunoscut vor fi date n unitatea de msur de concentraie n care a fost construit curba de calibrare.

Modul "Spectrum measurement" permite msurarea fluorescenei probelor prin scanare de spectru. Astfel, se pot face spectre pe tot domeniul sau pe un domeniu selectat de utilizator. Se pot face spectre de excitaie sau de emisie, la viteze diferite de scanare. Modul "3D Fluorescence measurements" permite msurarea n acelai timp a (i) spectrului de fluorescen a unei probe n timp ce se modific lungimea de und a radiaiei excitatoare i (ii) msurarea spectrului de excitaie n timp ce se modific lungimea de und de emisie. Se obin spectre tridimensionale (pe o ax este reprezentat intensitatea semnalului de fluorescen i pe celelalte dou axe avem lungimea de und de excitaie, respectiv de emisie.) Analiza acestor spectre permite determinarea poziiei maximului de excitaie i de emisie, fapt deosebit de util pentru probe necunoscute. Modul "Time course measurement" permite verificarea stabilitii n timp a intensitii fluorescenei soluiilor. Se face citirea la o lungime de und selectabil ntr-un interval de timp selectabil. Modul "Fixed wavelength measurement" permite efectuarea msurrii fluorescenei probelor la maxim 4 lungimi de und simultan, selectabile fie pe excitaie, fie pe emisie. 170

Modul "Phospho. spectrum measurement" permite msurarea spectrului de fosforescen al probelor.

6. Bibliografie
1. 2. 3. Bernard Valeur, Molecular Fluorescence: Principles and Applications, Ed. Wiley-VCH; 2002 Joseph Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Ed. Springer; 2006 http://www.jascoinc.com/Products/Spectroscopy/FP-6000-Series-Spectrophotom eters.aspx

171

Spectrofluorimetria - aplicaii
Conf. dr. Dana Maniu Cuprins
1. Fluorescena n timp real ..................................................................................... 172 2. Microscopia de fluorescen avansat .................................................................. 174 2.1. Microscopia confocal de fluorescen ........................................................... 175 2.2. Microscopia de fluorescen folosind excitaia cu doi fotoni (two-photon excitation fluorescence microscopy) ............................................................... 176 2.3. Microscopia de fluorescen prin scanare optic n cmp apropiat (NSOM) ..... 178 3. Exemple de aplicaii ale spectrofluorimetriei ........................................................ 180 3.1. Determinarea interaciunii dintre albumina bovin i nanoparticule de aur ............................................................................................................ 180 3.2. Evaluarea modificrilor conformaionale induse n albumina bovin adsorbit la suprafaa nanoparticulelor de aur, n urma modificrilor de temperatur i pH. .............................................................................................. 184 3.3. Monitorizarea denaturrii termice a albuminei bovine la diferite valori ale pH-ului ......................................................................................................... 187 4. Bibliografie ........................................................................................................... 190

1. Fluorescena n timp real

Dei msurtorile normale de fluorescen pot fi folosite ca o sond non-invaziv extrem de selectiv i sensibil, pentru a obine informaii chimice mai amnunite trebuie determinat variaia n timp a fluorescenei. Fluorescena n timp real furnizeaz mai multe informaii despre moleculele ce se afl n imediata vecintate a fluoroforului. Deoarece timpul de via de fluorescen a unei molecule este foarte sensibil la vecintatea sa molecular, determinarea acestui timp de via este deosebit de util n determinarea strii fluoroforului. Multe evenimente macromoleculare, cum ar fi difuzia rotaional, transferul rezonant de energie i stingerea dinamic, apar pe aceeai scar temporal cu emisia de fluorescen. Astfel, spectroscopia de fluorescen n timp real poate fi utilizat pentru a investiga aceste procese i a obine informaii despre vecintatea chimic a fluoroforului. Este important s ne amintim c timpul de via de fluorescen este timpul mediu pentru ca o molecul s rmn n stare excitat nainte de a emite un foton. Fiecare molecul individual emite aleatoriu dup excitaie. Unele molecule excitate vor emite radiaie de fluorescen nainte de durata 172

medie de via, iar alte molecule excitate vor emite radiaie de fluorescen mult timp dup durata medie de via. Timpii de via de fluorescen sunt, n general, de ordinul 1-10 ns, dei n unele cazuri pot avea ordinul sutelor de nanosecunde sau s fie mai mici decat 1 ns (sute de femtosecunde). Din aceast cauz este foarte important ca aparatura experimental folosit pentru acest tip de masurtori s aib rezoluie temporal foarte bun. n figura 1 este prezentat un montaj experimental folosit pentru determinri de fluorescen n timp real. O surs laser emite un puls ultra scurt (de ordinul femtosecundelor) cu lungimea de und 1 corespunztoare frecvenei 1. Armonica a doua a acestui puls (frecvena 2) este generat ntr-un cristal neliniar, fiind separat de fundamental cu ajutorul unui divizor de und dicroic. Pulsul de frecven 1 trece printr-un dispozitiv optic ce produce o ntrziere de faz (optical delay line), iar pulsul de frecven 2 este focalizat pe prob (flow cell). Emisia de fluorescen incoerent emis de prob este colectat i mixat cu pulsul de frecven 1 ntr-un cristal neliniar. Aceast mixare ("fluorescence up-conversion") genereaz lumin cu frecvena sum = 1 + fl , ceea ce ne demonstreaz c exist o coinciden temporal i spaial ntre 1 i fl. Cu ct este mai mare decalajul temporar dintre pulsul 1 i emisia de fluorescen fl, cu att intensitatea de fluorescen este mai mic. Intensitatea Isum a pulsului cu frecvena sum pentru un anumit decalaj temporar ntre pulsul de frecven 1 i emisia de fluorescen de frecven fl este proporional cu funcia de corelaie dintre intensitatea de fluorescen Ifl i intensitatea I1 a pulsului de frecven 1:

I sum ( ) I fl (t ) I1 (t )dt

n acest fel se poate determina dependena intensitii de fluorescen de timp prin modificarea timpului de ntrziere (prin intermediul dispozitivului "optical delay line"). De obicei, cristalele neliniare sunt confecionate din potasiu-dihidrogen-fosfat (KDP) sau borat de bariu (BBO). Cristalele din borat de bariu au avantajul transparenei n UV i eficienei cuantice mai mare (cu un factor de 4-6). Pentru o poziie dat a cristalului, numai pentru un domeniu ngust din spectrul de fluorescen apare coincidena temporal i spaial cu pulsul de frecven. Deci dac intereseaz ntreg domeniu de fluorescen, cristalul trebuie rotit la diferite unghiuri.

173

Figura 1. Set-up experimental pentru fluorescen n timp real (Mialocq and Gustavsson, 2001). (DM - oglind dicroic; HW - plac semi-und; GG420 - filtru; CCD - camer video; BBO -cristal neliniar; M - monochromator; PM - fotomultiplicator; lockin - numrtor)

Msurtorile de fluorescen n timp real sunt foarte potrivite pentru investigarea proceselor intramoleculare fotoinduse (charge transfer, proton transfer etc.) i a proceselor intermoleculare (elctron transfer etc.). De asemenea, fluorescena n timp real a fost folosit cu succes n studii ale proceselor biologice care au loc n prezena luminii (proteina galben fotoactiv, proteina albastr fluorescent, proteina verde fotoactiv etc.).

2. Microscopia de fluorescen avansat

Microscopia de fluorescen convenional este folosit, n principal, pentru a investiga celulele i esuturile vii, dar este de asemenea folosit pentru a studia diferite sisteme chimice cum ar fi coloizi, cristale lichide, mixturi polimerice, fotodegradarea polimerilor naturali, colorarea fibrelor etc. Un microscop de fluorescen convenional difer de un microscop standard prin faptul c este folosit o surs de lumin (lamp cu mercur sau oxigen) ce emite i n domeniu UV. Lungimea de und de excitaie este selectat cu ajutorul unui filtru de interferen sau a unui monocromator. Observarea emisiei de fluorescen poate fi efectuat cu ajutorul ochiului observatorului, a unui film fotografic sau a unei camere cu detector CCD (charge- coupled device). Profunzimea de cmp a unui microscop convenional cu fluorescen este 2-3 m, iar rezoluia maxim este aproximativ egal cu jumatatea lungimii de und a radiaiei folosite la excitare. 174

n cazul n care proba este mai subire dect valoarea profunzimii de cmp, imaginea este neclar datorit defocalizrii. n acest caz imaginea se poate mbunti cu ajutorul computerului, dar, de obicei, este de preferat folosirea altor tehnici, cum ar fi microscopia confocal (confocal microscopy) sau microscopia prin excitaia cu doi fotoni (two-photon excitation microscopy). De asemenea, prin folosirea microscopiei optice n cmp apropiat (near-field scanning optical microscopy (NSOM)) se poate lucra dincolo de limita de difracie optic.

2.1. Microscopia confocal de fluorescen

n cazul unui microscop confocal, fasciculul de lumin este focalizat pe prob. Emisia de fluorescen este separat de lumina excitatoare cu ajutorul unei oglinzi dicroice i este focalizat cu ajutorul lentilelor obiectivului pe fanta unui fotomultiplicator. Emisia de fluorescent produs de proba situat n afara planului de focalizare nu va trece prin fanta multiplicatorului deoarece se va lovi de tubul ocularului (figura 2).

Figura 2. Principiul microscopiei confocale (stnga) comparativ cu microscopia convenional (dreapta).

Una din caracteristicile microscopiei confocale de fluorescen este faptul c se pot obine imaginile unor straturi cu o grosime bine definit. Astfel, folosind o lentil cu apertur numeric mare, grosimea seciunilor confocale poate atinge limita teoretic de aproximativ 0,5 m, deci prin deplasarea probei pe vertical se obine imaginea tridimensional a acesteia. Deoarece n microscopia confocal de fluorescen se colecteaz numai 175

o parte din fasciculul de fluorescen emis, energia de excitare necesar trebuie s fie mai mare dect n microscopia de fluorescen convenional. Creterea energiei fasciculului de excitare duce la descompunere fotochimic a fluoroforului, fenomen numit photobleaching. Reducerea efectelor nedorite datorate fenomenului de photobleaching se face prin utilizarea de fluorofori stabili i prin folosirea unui microscop confocal echipat cu detector cu sensibilitate mare i obiectiv cu apertur numeric mare, pentru a putea folosi unui fascicul excitator cu putere mai mic. Microscopia confocal de fluorescen este o tehnic utilizat pe scar larg n biologia celular (vizualizarea celulelor, determinarea distribuiei potenialului electric, imagistica pH, imagistica Ca2+, etc.). De asemenea, microscopia confocal de fluorescen a fost folosit n studii din domeniul coloizilor, a cristalelor lichide i a amestecurilor de polimeri. Microscopia confocal de fluorescen poate fi combinat cu tehnicile domeniu-timp i frecven-timp (time-domain, frequency-domain) pentru a se obine imagini din perioada numit timp de via al fluoroforului (lifetime imaging).

2.2. Microscopia de fluorescen folosind excitaia cu doi fotoni (two-photon excitation fluorescence microscopy)
n spectroscopia de fluorescen convenional, fluoroforul este excitat prin absorbia unui foton a crui energie corespunde cu diferena de energie dintre starea electronic fundamental i starea electronic excitat. Excitaia fluoroforului este, de asemenea, posibil prin absorbia simultan a doi fotoni de energie mai mic (lungime de und mai mare) prin intermediul unei stri virtuale cu timp de via foarte scurt (Figura 3). De exemplu, absorbia a doi fotoni din domeniul rou poate excita o molecul care absoarbe n domeniul UV. Excitaia cu doi fotoni este un proces neliniar, absorbia depinde de ptratul intensitii luminii folosite la excitaie. Dac este folosit un singur laser, cei doi fotoni absorbii sunt identici, iar tehnica se numete microscopia de fluorescen folosind excitaia cu doi fotoni (two-photon excitation fluorescence microscopy). Dac se folosesc dou lasere, atunci fotonii sunt diferii (1/e = 1/1 + 1/2), iar tehnica se numete microscopia de fluorescen folosind excitaia cu dou culori (two-color excitation fluorescence microscopy). Probabilitatea absorbiei a doi fotoni depinde de coincidena temporal i spaial a fotonilor incideni (diferena dintre timpul n care cei doi fotoni ajung la fluorofor trebuie s fie sub 10-18 s). Seciunea eficace a procesului de absorbie a doi fotoni este foarte mic (10-50 cm4s/fotonmolecul pentu rodamina B). n consecin, vor fi excitai numai fluoroforii situai ntr-o 176

regiune unde fluxul de fotoni este foarte mare, deci trebuie folosii laseri cu putere mare i funcionare n impulsuri, cum ar fi laserul cu Ti-safir.

Figura 3. Comparaie ntre excitaia cu doi fotoni i excitaia cu un foton. (Linia punctat reprezint starea virtual care mediaz absorbia a doi fotoni.)

Deoarece intensitatea fasciculului de excitare variaz cu ptratul distanei de la planul focal, probabilitatea de absorbie a doi fotoni n afara regiunii focale scade cu puterea a patra a distanei. Deci, excitarea cu doi fotoni a fluoroforului poate avea loc doar n focar. Folosind un obiectiv cu o apertur numeric de 1,25 i un fascicul de excitare avnd 780 nm, peste 80% din intensitatea total de fluorescen va fi emis dintr-o zon situat la 1 mm n jurul focarului. Volumul de excitaie este de ordinul a 0,1-1 femptolitri. Comparativ cu fluorometrele convenionale, acesta reprezint o reducere a volumului de excitare de 1010 ori. Excitarea cu doi fotoni permite obinerea unei rezoluii tridimensional deosebit n microscopia de fluorescen. Dei efectul secionrii 3-D este comparabil cu cel din microscopia confocal, n cazul excitrii cu doi fotoni avem urmtoarele avantaje: (i) deoarece fasciculul de excitare este concentrat att n timp ct i n spaiu nu apare fenomenul de photobleaching n afara focarului i (ii) fasciculul excitator nu este atenuat de abosorbia din afara focarului, ceea ce duce la creterea adncimii de penetrare a fasciculului excitator. Excitarea cu dou culori se folosete atunci cnd se dorete observarea unor obiecte microscopice situate n medii puternic difuzante. Dei, n ambele tipuri de excitari (cu doi fotoni sau cu dou culori), fenomenul de difuzie duce la scderea intensitii fasciculului de fluorescen emis din focar, n cazul excitarii cu dou culori nu apare dect o cretere minimal a background-ului de fluorescen, nedorit, ceea ce duce la obinerea unui contrast mai bun pentru obiecte de mici dimensiuni. 177

2.3. Microscopia de fluorescen prin scanare optic n cmp apropiat (NSOM)

Rezoluia unui microcop convenional este limitat datorit fenomenelor de interferen i difracie. Limita de rezoluie este de aproximativ /2, unde este lungimea de und a sursei de luminii. Aceast limit poate fi depit prin utilizarea unei surse de lumin cu lungime de und mai mic i prin plasarea probei foarte aproape de aceast surs (n cmp apropiat).

Figura 4. Principiul scanrii n cmp apropiat (conform ideii lui Synge)

Ideea de optic n "cmp apropiat" este atribuit cercettorului E. H. Synge (figura 4). Radiaia luminoas incident trece printr-o fant cu dimensiuni sub-lungime de und. Suprafaa probei este poziionat n imediata apropiere a fantei, astfel nct fasciculul emergent este forat s interacioneze cu proba. Fanta acioneaz ca o sond luminoas de dimensiune sub-lungime de und care poate fi folosit pentru a lumina suprafaa probei nainte ca lumina s fie difractat. Aceast tehnic are o rezoluie spaial foarte mare (de ordinal sub-micrometrilor) i o sensibilitate foarte bun. Majoritatea instrumentelor NSOM sunt construite n jurul unui microscop cu fluorescen inversat, care ofer avantajul de a furniza imagini normale i permite ca regiunea de studiat s fie localizat cu rezoluie mare, de tip NSOM (Figura 5). Fasciculul laser trece printr-o fibr optic uni-modal la ataat de un vrf special pentru determinrile n cmp apropiat (vrf NSOM). Vrful este montat ntr-un cap piezo, care permite deplasarea pe vertical - axa Oz). Proba se afl pe un suport piezo, care permite deplasarea ei n planul xy. Lumina din vrful NSOM ataat fibrei optice excit proba, iar emisia de fluorescen este colectat de obiectivul cu apertur numeric mare, montat sub suportul pe care se afl proba i detec178

tat printr-un filtru (pentru a elimina lumina rezidual de la laserul folosit pentru excitare) i un detector. Acest mod este numit modul iluminare. Alternativ, n modul colectare, proba este iluminat de la un cmp ndeprtat i emisia de fluorescen este colectat de ctre un vrf NSOM. Sistemele care scaneaz piezo i nregistreaz imaginile sunt similare cu cele utilizate n microscopia de for atomic.

Figura 5. Instrument NSOM construit n jurul unui microscop de fluorescenta inversat - mod iluminare.

Pentru a obine imagini de nalt rezoluie este necesar poziionarea precis a vrfului NSOM (de ordinul nm) fa de suprafaa probei. Acest lucru poate fi realizat cu ajutorul feedback-ului bazat n general pe metoda de for-forfecare: vrful este intercalat lateral la una dintre frecvenele sale de rezonan cu o amplitudine de aproximativ 2-5 nm. Cnd vrful NSOM interacioneaz cu cmpul de fore Van der Waals a probei, forele de forfecare atenuez amplitudinea vibraiilor acestuia. Aceast amplitudine poate fi monitorizat i folosit pentru a genera un semnal de feedback cu ajutorul cruia se controleaz distana dintre prob i vrf n timpul scanrii. Tehnica NSOM este remarcabil pentru analiza filmelor subtiri, (polimeri electroluminisceni, cristale lichide, etc.). Microscopia de fluorescen prin scanare optic n cmp apropiat poate oferi noi perspective n studiul sistemelor biologice complexe din cauza rezoluiei mai mari dect n microscopia confocal, a capacitii de cartografiere a topografiei suprafeei i datorit faptului c fenomenul de photobleaching este redus. Cu ajutorul tehnicii NSOM au fost investigate cu succes sisteme fotosintetice, localizarea proteinelor, cartografierea cromozomilor i microstructura membranelor. 179

3. Exemple de aplicaii ale spectrofluorimetriei

3.1. Determinarea interaciunii nanoparticule de aur dintre albumina bovin i

Iosin i colaboratorii [4] au demonstrat interaciunea direct dintre nanoparticulele de aur i albumina bovin. Cunoaterea efectelor biologice ale nanoparticulelor de aur necesit determinarea legturilor ce apar ntre nanoparticule i proteinele cu care interacioneaz. Nanoparticulele de aur (GNP) sunt sonde ideale pentru investigarea proceselor biologice datorit biocompatibilitii lor, ce le permite conjugarea uoar cu diferite biomolecule. Deoarece interaciunea dintre proteine i nanoparticulele de aur este foarte sensibil la starea conformaional a proteinei i la chimia suprafeei nanoparticulelor, este foarte important determinarea modificrilor conformaionale pe care le sufer proteina n urma adsorbiei la suprafaa nanoparticulei. n unele cazuri interaciunea dintre protein i suprafaa nanoparticulelor de aur poate determina modificri de structur ce duc la alterarea proprietilor proteinei. Pe de alt parte conjugarea dintre protein i nanoparticulele de aur nu are ca efect doar stabilizarea sistemului protein-nanoparticul, ci determin biocompatibilizarea (funcionalizarea) acestor nanoparticule pentru alte interaciuni sau cuplaje cu mediul biologic. Albumina bovina (Bovine Serum Albumin) este o protein globular, cu form aproximativ elipsoidal (4nm4nm14nm), folosit des n aplicaii din domeniul bio-nanotehnologiilor. Structura nativ a albuminei bovine (BSA) este caracterizat de un singur lan polipeptidic compus din 583 reziduri de aminoacizi, structura teriar cuprinde trei domenii omoloage (I, II i III), fiecare domeniu fiind format din ase elice, stabilizate de o reea intern de 17 legturi disulfide. Albumina bovin (BSA) se gsete n cantiti mari n plasm, i joac un rol important n procesele fiziologice. Albumina bovin (BSA) este utilizat ca protein model n studiile biologice deoarece are o structur bine cunoscut i posed proprieti de fluorescen specifice, datorit prezenei celor dou reziduuri de triptofan din structura ei. Iosin i colaboratorii [4] au nregistrat spectrele de fluorescen ale bioconjugatelor BSA-nanoparticule de aur cu ajutorul unui Spectrofluorimetru Jasco LP-6500 cuplat cu un dispozitiv pentru controlarea temperaturii (ADP-303T), cu ajutorul cruia temperatura poate fi modificat controlat de la 10 C la +110 C. Semnalul de fluorescen al albuminei (BSA) a fost obinut la 337 nm prin excitarea reziduului de triptofan cu o radiaie avnd lungimea de und 280 nm. Soluia de bioconjugate (nanoparticule de aur i BSA) a fost pus ntr-o cuv de cuar avnd dimensiunea de 10 mm. 180

Din spectrele de fluorescen se pot obine informaii importante (constanta de legtur i numrul siturilor de legtur) referitoare la modul de legare a proteinelor de suprafaa nanoparticulelor de aur. Albumina bovin (BSA) conine trei cromofori: triptofan, tirosina i fenilalanina a cror emisie de fluorescen poate fi stins. n realitate, fluorescena intrinsec a BSA-ului este dat n principal de reziduurile de triptofan, deoarece fenilalanina are un randament cuantic foarte mic, iar fluorescena tirosinei este aproape stins dac este ionizat sau dac este aproape de un grup amino, carboxyl sau triptofan. Triptofanul este deosebit de senzitiv la modificarea vecintii locale, de aceea studiul emisiei de fluorescen a acestuia este deosebit de util n determinarea modificrilor conformaionale ale proteinei i adsorbia la nanoparticule. Spectrele de fluorescen ale unor soluii avnd diferite concentraii de nanoparticule de aur i albumin bovin (BSA) au fost monitorizare n domeniul 290-450 nm, regiune ce coincide cu banda de emisie a triptofanului. Msurtorile de fluorescen au fost efectuate cu o radiaie excitatoare de 280 nm, lungime de und ce este departe de banda plasmonic de rezonan a nanoparticulelor de aur. Soluia apoas de BSA are o band puternic de fluorescen cu maximul situat la 336 nm, band ce este datorat emisiei reziduurilor de triptofan, iar nanoparticulele de aur nu prezint emisie de fluorescen. Dup cum se poate observa n figura 6, Iosin i colaboratorii [4], au monitorizat stingerea semnalului de fluorescen prin creterea concentraiei nanoparticulelor de aur de form sferic. Pe lang efectul evident

Figura 6. Spectrele de fluorescen ale reziduului de triptofan din BSA pentru diferite concentraii ale nanosferelor de aur: (a) 0, (b) 0,5510-11 M, (c) 1,110-11 M, (d) 1,6510-11 M, (e) 2,210-11 M; F0 intensitatea de fluorescen relativ a soluiei apoase de BSA, Fsat intensitatea de fluorescen relativ a soluiei de BSA saturat cu nanosfere de aur, F concentraii intermediare.

181

de stingere a fluorescenei, autorii au observant i o deplasare spre rou a maximului benzii de fluorescen cu 4 nm (de la 336 nm la 340 nm), deplasare ce indic o modificare a polaritii din jurul reziduului de triptofan. n figura 7 sunt prezentate spectrele de fluorescen ale complexului BSA-nanobastonae de aur, pentru diferite concentraii. Se observ c intensitatea benzii de fluorescen descrete odat cu creterea concentraiei de nanobastonae de aur. n cazul complexului BSA-nanobastonae nu se observ nici o deplasare a maximului benzii de fluorescen odat cu modificarea concentraiei. n ambele cazuri, intensitatea emisiei de fluorescen rmne constant dup atingerea unui nivel de concentratie a nanoparticulelor de aur. Aceast comportare se datoreaz unui efect de saturaie (cnd toate moleculele de BSA sunt legate de nanoparticulele de aur, adaugarea n continuare a nanoparticulelor nu duce la apariia de noi legturi BSA-nanoparticule).

Figura 7. Spectrele de fluorescen ale reziduului de triptofan din BSA pentru diferite concentraii de nanobastonae de aur: (a) 0, (b) 1,0610-14 M, (c) 2,1210-14 M, (d) 3,1810-14 M, (e) 4,2410-14 M; F0 intensitatea de fluorescen relativ a soluiei apoase de BSA, Fsat intensitatea de fluorescen relativ a soluiei de BSA saturat cu nanobastonae de aur, F concentraii intermediare.

Din spectrele de fluorescen de mai sus autorii au determinat constanta de legtur (Kb) precum i numrul siturilor de legtur dintre nanoparticulele de aur i BSA, folosind metoda descris de Tedesco et al. [6]: (F0 Fsat)/(F Fsat) = ([M]/Kdiss)n unde F0, Fsat i F sunt intensitile de fluorescen datorate reziduurilor de triptofan din BSA: 182

F0 este intensitatea de fluorescen a soluiei apoase de BSA pur, Fsat este intensitatea de fluorescen a soluiei de BSA saturat cu nanoparticule de aur, F este F intensitatea de fluorescen a soluiilor de BSA avnd concentraii intermediare; [M] reprezint concentraia nanoparticulelor de aur, n reprezint numrul siturilor de legtur dintre nanoparticulele de aur i BSA Kdiss este valoarea reciproc a constantei de legtur Kb. Concentraia nanoparticulelor de aur a fost estimat cu ajutorul relaiei A = [M]d unde: A este absorbana soluiei, [M] este concentraia particulelor (n moli), d este grosimea cuvei folosit pentru nregistrarea spectrelor. e reprezint coeficientul de extincie molar Pentru a calcula parametrii n i Kb autorii au reprezentat grafic log[(F0 - F)/(F - Fsat)] n funcie de log([M]). Din panta graficului au calculat numrul siturilor de legtur n, iar din valoarea lui log[M] pentru care log[(F0 - F)/ (F - Fsat)] = 0 au obinut constanta de disociere (Kdiss). Valorile astfel calculate se gsesc n tabelul 1.
Tabelul 1. Constanta de legtur (Kb) i numrul siturilor de legatur (n) pentru complexul BSA-nanoparticule de aur. nanosfere de aur nanobastonae de aur Kb 2.34 1011 0.5 105 n 1,37 0,38

Valoarea mai mare a constantei de legatur n cazul nanosferelor este datorat faptului c cele dou tipuri de nanoparticule au sarcinii electrice i o chimie a suprafeei diferite: nanobastonaele au sarcin electric pozitiv, iar nanosferele au sarcin electric negativ. n plus nanobastonaele sunt stabilizate cu citrat de sodiu pe cnd nanosferele sunt stabilizate cu CTAB. n concluzie, interaciunea local dintre nanoparticulele de aur i albumina bovin a fost investigat cu ajutorul spectroscopiei de fluorescen, folosind efectul de stingere a emisiei de fluorescen a triptofanului din BSA, indus de suprafaa metalic a nanoparticulei comjugat.

183

3.2. Evaluarea modificrilor conformaionale induse n albumina bovin adsorbit la suprafaa nanoparticulelor de aur, n urma modificrilor de temperatur i pH.
M. Iosin i colaboratorii [5] au monitorizat mecanismul de interactiune ntre albumina bovin (BSA) i nanoparticulele de aur cu ajutorul spectroscopiei de fluorescen. Spectrele nregistrate sugereaz faptul c nanoparticulele de aur inhib emisia de fluorescen a reziduurilor de triptofan din BSA, n principal printr-un mecanism static (constanta de legatur Kb este dependent de valoarea pH-ului). Modificri conformaionale ale proteinelor pot fi induse de variaii ale temperaturii i ale pH-ului. Aceste modificri ale structurii proteinelor pot duce la apariia cancerului, a diabetului i a afeciunilor cardiovasculare, avnd o influen major asupra interfeei dintre nanoparticule i substanele biologice. Structura albuminei bovine este puternic dependent de pH i temperatur, fiecare stare conformaional avnd form i dimensiune proprie. Spectroscopia de fluorescen, datorit senzitivitii mari, poate fi folosit pentru a obine informaii legate de modificrile coinformaionale ale proteinelor induse de interaciunea cu nanoparticulele de aur la diferite valori ale pH-ului i la diferite temperaturi. Valoarea pH-ului afecteaz att structura albuminei bovine ct i sarcina gruprii funcionale a proteinei, determinnd, n consecin, atracia sau respingerea nanoparticulelor de aur, n soluie. Sarcina net a albuminei bovine este puternic dependent de pH-ul soluiei, fiind pozitiv pentru pH< pI, neutr pentru pH= pI i negativ pentru pH> pI, unde pI reprezint punctul izoelectric [6]. n cazul albuminei bovine, punctul izoelectric este 4.7 [7]. Nanoparticulele de aur folosite sunt ncrcate negativ la suprafa datorit faptului c sunt acoperite cu citrat pentru a prevenii agregarea lor. Proprietile fluorescente ale albuminei bovine (BSA) sunt datorate, dup cum am mai amintit, gruprilor de triptofan ce sunt localizate pe suprafaa proteinei (n domeniul I: Trp-134, grupare expus mai puternic influenei vecintii hidrofilice) i n interiorul proteinei (n domeniul II: Trp-213, grupare aflat ntr-o poziie hidrofobic). Dup cum se observ n figura 8, spectrul de fluorescen al soluiei pure de BSA (pH = 6, spectrul c) are maximul benzii de emisie la 337 nm, iar spectrele de fluorescen ale soluiilor de BSA cu valori ale pH-ului 2 (spectrul a), 5 (spectrul b) i 9 (spectrul d) au maximul benzii de emisie la 324 nm, 336 nm respectiv 339 nm. Deplasarea maximul benzii de emisie indic faptul c modificarea pH-ului soluiei duce la obinerea de stri con184

formaionale diferite ale albuminei. Deplasarea maximului benzii de emisie spre lungimi de und mai mici indic faptul c triptofanul din albumina bovin are o vecintate mai hidrofobic (se modific structura teriar), iar deplasarea maximului benzii de emisie spre lungimi de und mari ne indic faptul c triptofanul este mai expus solventului. Astfel, la pH neutru albumina bovin are o form nativ (N-form), n timp ce la pH = 2 i pH = 9 albumina bovin are form extins (E-form) respectiv bazic (B- form). Emisia de fluorescen a albuminei bovine de tipul E-form are maximul deplasat spre albastru, n comparaie cu emisia albuminei bovine de tipul N-form, datorit creterii separaiei inter-domeniu i schimbrii configuraiei proteinei astfel nct gruparea triptofan are o vecintate mai hidrofobic.

Figura 8. Spectre de fluorescen ale albuminei bovine la pH 2 (a), pH 5 (b), pH 6 (c) i pH 9 (d).

Pentru a obine informaii legate de emisia de fluorescen a triptofanului din albumina bovin la diferite valori ale pH-ului n prezena nanoparticulelor de aur, Iosin i colaboratorii [5] au folosit o concentraie fix de BSA titrat n cantiti diferite de soluie de nanoparticule de aur. Spectrele de fluorescen nregistrate (figura 9) demonstreaz scderea drastic a emisiei de fluorescen (quenching) a triptofanului din albumina bovin la pH = 2 odat cu creterea concentraiei nanoparticulelor de aur (de la 0,551011 M la 2,751011 M). Din spectrele de fluorescen, autorii au calculat constanta de stingere a fluorescenei (KSV) folosind ecuaia SternVolmer: F0/F = 1 + Kq0[GNPs] = 1 + KSV[GNPs] unde: F0 i F sunt intensitile relative de flkuorescen ale triptofanului n absena i n prezena nanoparticulelor de aur, 185

Kq este constanta de stingere bimolecular, 0 = 5109 s este timpul de via mediu al albuminei bovine n absena nanoparticulelor de aur, [GNPs] reprezint concentraia nanoparticulelor de aur, KSV este constanta de stingere SternVolmer, ce indic senzitivitatea fluoroforului la molecula ce determin stingerea fluorescenei (quencher).

Figura 9. Spectre de fluorescen ale gruprii triptofan din BSA la pH = 2 pentru diferite concentraii ale nanoparticulelor de aur: (a) 0, (b) 0,551011 M, (c) 1,11011 M, (d) 1,651011 M, (e) 2,21011 M i (f) 2,751011 M. Graficul inserat reprezint curba SternVolmer.

Prin fitare liniar s-a obinut KSV = 1,11109 M1. n mod similar au fost calculate constantele de stingere SternVolmer pentru pH = 6 i pH = 9, obinndu-se valorile KSV = 1,7109 M1 pentru pH = 6 i KSV = 1,6109 M1 pentru pH = 9. Astfel, constanta de stingere bimolecular Kq a fost calculat, obinndu-se valorile: Kq = 0,221018 M1 s1 pentru bioconjugatele BSA GNPs la pH = 2, Kq = 0,341018 M1 s1 la pH = 6, respectiv Kq = 0,321018 M1 s1 la pH = 9. Valoarea obinut pentru constanta de stingere bimolecular Kq este mai mare dect valoarea obinut (2,01010 M1 s1) n cazul stingerii emisiei de fluorescen a macromoleculelor biologice datorit mecanismului de ciocnire. Deci, n cazul bioconjugatelor BSAGNPs stingerea emisiei de fluorescen nu este iniiat de ciocniri dinamice ci de formarea unui complex nefluorescent n urma unui mecanism de stingere static. Iosin i colaboratorii [5] au determinat constanta de legtur la echilibru Kb (indic echilibrul dintre speciile adsorbante i cele resorbante), precum i numrul siturilor de legtur (n) dintre nanoparticule i BSA conform relaiilor din pargraful anterior. n urma calculelor s-au obinut urmtoarele valori pentru numrul siturilor de legtur (n): 1,77 la pH 2, 1,97 la 186

pH 6 i 1,76 la pH 9, respectiv pentru constanta de legtur Kb: 2,6109 M1 la pH 2, 1,81109 M1 la pH 6 i 2,03109 M1 la pH 9. De menionat c valorile mai mari ale constantei de legtur indic o atracie mai puternic ntre cele dou specii. Pentru a mima o vecintate biologic real, autorii au studiat formarea bioconjugatelor la pH = 5. Constanta de stingere SternVolmer i constanta de stingere bimolecular obinute pentru aceast valoare a pH-ului sunt: KSV = 1,74109 M1 i Kq = 0,3481018 M1 s1. Numrul siturilor de legtur i constanta de legtur pentru pH = 5 este: n = 1,85 i Kb = 2,82109 M1, valori ce indic faptul c adsorbia maxim a moleculelor de albumin la suprafaa nanoparticulelor de aur apare pentru o valoare a pH-ului apropiat de punctul izoelectric (pI) al BSA-ului.

3.3. Monitorizarea denaturrii termice a albuminei bovine la diferite valori ale pH-ului
Denaturarea termic a proteinelor este un proces intrinsec, deci determinarea condiiilor n care are loc acest proces este foarte important pentru nelegerea stabilitii proteinelor. De fapt, prin creterea temperaturii forma nativ a proteinei devine mai flexibil. Ca urmare a acestui fapt, gruprile SH libere, sau regiunile hidrofobice devin predispuse la interaciuni intermoleculare noi. Iosin i colaboratorii [5] au studiat modificrile structurale ce apar n cazul denaturrii termice a albuminei bovine, nainte i dup absorbia la suprafaa nanoparticulelor de aur, analiznd emisia de fluorescen a triptofanuluui din BSA. n acest scop, au fost monitorizate modificrile emisiei de fluorescen a triptofanului din BSA pentru temperaturi cuprinse ntre 22 C i 85 C (domeniu n care apare o modificare important a structurii teriare a albuminei). La temperatura camerei, soluia apoas pur de BSA are o emisie de fluorescen puternic, cerntrat la 337 nm. Odat cu creterea temperaturii, maximul benzii de fluorescen datorat triptofanului se deplaseaz spre numere de und mai mici, ajungnd pn la 330 nm (figura 10). Graficul inserat (denaturation curve) indic o relaie neliniar ntre deplasarea maximului benzii de absorbie i temperatur. Dup cum observ i autorii, curba de denaturare a albuminei bovine pure sugereaz existena a dou temperaturi de tranziie: una la 43 C, iar cealalt la 65 C. La aceste temperaturi apare o modificare a vecintii triptofanului din albumin, deci creterea temperaturii duce la apariia de modificri structurale ale proteinei. Platoul curbei de denaturare indic faptul c albumina i menine starea nativ pn la aproximativ 42 C, prima temperatur de tranziie aprnd n 187

jurul pragului maxim admis al febrei ce apare n condiii de boal (42 C). ntre 43 C i 65 C se observ o deplasare spre albastru a maximului emisiei de fluorescen a albuminei bovine, deplasare ce sugereaz tranziia albuminei de la starea nativ (compact) la o stare cu o structur mai deschis. Denaturarea complet a proteinei se face dup 65 C, valoare la care apare un al doilea platou n curba de denaturare.

Figura 10. Dependena de temperatur a emisiei de fluorescen a gruprilor de triptofan din albumina bovin, la pH 6. Inserat: curba de denaturare termic (variaia maximului benzii de fluorescen n funcie de temperatur - la creterea i descreterea temperaturii).

O dat cu creterea temperaturii, pe lng denaturarea proteinei, apare i scderea n intensitate a emisiei de fluorescen a triptofanului. Astfel, creterea temperaturii de la 22 C la 85 C determin descreterea cu 72% a emisiei de fluorescen, datorit expunerii triptofanului la moleculele de solvent. Prin msurarea emisiei de fluorescen a triptofanului din albumin n procesul de rcire, s-a determinat faptul c procesul de denaturare termic a albuminei bovine este ireversibil. Autorii au studiat efectul combinat al pH-ului i al temperaturii nainte i dup conjugarea albuminei bovine cu nanoparticulele de aur, prin compararea denaturrii termice (ntre 22 C i 85 C) a proteinei n soluie pentru diferite valori ale pH-ului (2 - 9). n urma msurtorilor efectuate s-a observat o dependen accentuat de valoarea pH-ului a temperaturii de tranziie la care proteina i modific conformaia. Astfel, n mediu alcalin (pH mare) temperatura de tranziie este mult mai sczut (32 C) dect n mediu neutru (pH = 6) ceea ce indic o denaturare termic mult mai rapid n mediu bazic. n mod contrar, n mediu acid (pH mic) proteina este mai stabil termic, temperatura de tranziie la care ncepe denaturarea termic este mai mare (46 C) dect n mediu neutru. Dup cum se observ n figu188

ra 11, bioconjugarea albuminei bovine cu nanoparticule de aur, modific forma curbei de denaturare, deci modific comportarea termic a proteinei. Dup cum se observ i din figura 11, prezena nanoparticulelor induce o deplasare, a emisiei de fluorescen, spre numere de und mari, rezultnd creterea temperaturii de tranziie indiferent de valoarea pH-ului. De exemplu, pentru pH = 6 temperatura de tranziie crete de la 42 C la 47 C. Deci, prezena nanoparticulelor de aur mbuntete stabilitatea termic a proteinei.

Figura 11. Variaia maximului emisiei de fluorescen a triptofanului din BSA, respectiv din bioconjugatul BSA-nanoparticule, n funcie de temperatur pentru diferite valori ale pH-ului.

Pentru a investiga efectul temperaturii asupra fenomenului de stingere a fluorescenei albuminei bovine de ctre nanoparticulele de aur a fost calculat constanta de stingere KSV pentru diferite temperaturi.

Figura 12. Curbele SternVolmer pentru stin gerea fluorescenei BSA-ului de ctre nanoparticule de aur (pH = 6). Inserat: dependena constantei de stingere SternVolmer de temperatur.

189

Graficul Stern-Volmer ce caracterizeaz stingerea emisie de fluorescen a triptofanului din albumina bovin de ctre nanoparticulele de aur, la pH 6 pentru diferite temperaturi (295, 318, 338, 358 K) ne indic faptul c constanta de stingere KSV scade odat cu creterea temperaturii (figura 12).
Tabelul 2. Constanta de stingere KSV i parametrii termodinamici pentru complexul BSA-nanoparticule de aur. (SD - deviaia standard pentru valorile coeficientului KSV, R - coeficientul de corelaie)
pH 6 T (K) 295 318 338 295 318 338 KSV (L/mol) 1,70x109 1,41x109 9,60x109 1,11x109 6,88x109 5,05x109 SD 0,0651 0,0782 0,0683 0,0601 0,0721 0,0700 R 0,9994 0,9988 0,9980 0,9983 0,9982 0,9975 H(kJ/mol) S(J/mol K) G(kJ/mol) -48,29 -28,96 81,35 -54,70 -64,32 51,11 10,79 132,87 53,59 55,22

Proporionalitatea invers dintre constanta de stingere KSV i temperatur (tabelul 2), confirm faptul c mecanismul de stingere a fluorescenei triptofanului din albumina bovin de ctre nanoparticulele de aur este iniiat de formarea unui complex ne-fluorescent prin adiia moleculelor de albumin bovin la nanoparticulele de aur.

4. Bibliografie
1. 2. 3. Bernard Valeur, Molecular Fluorescence: Principles and Applications, Ed. Wiley-VCH; (2002). Joseph Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Ed. Springer; (2006). J.-C. Mialocq and T. Gustavsson, Investigation of femtosecond chemical reactivity by means of fluorescence up-conversion, Fluorescence Spectroscopy: New Trends n Fluorescence Spectroscopy, Eds B. Valeur, J.-C. Brochon, Springer Verlag, Berlin (2001). M. Iosin, F. Toderas, P. Baldeck, S. Astilean, Study of protein-gold nanoparticle conjugates by fluorescence and surface-enhanced Raman scattering, J. Mol. Struct. 924926 (2009) 196200. M. Iosin, V. Canpean, S. Astilean, Spectroscopic studies on pH- and thermally induced conformational changes of Bovine Serum Albumin adsorbed onto gold nanoparticles, Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry, 217, (2011), 395-401. R.E. Georgescu, E.G. Alexov, M.R. Gunner, Combining conformational flexibility and continuum electrostatics for calculating pKas n proteins, Biophys. J. 83 (2002) 17311748. P.A. Zunszain, J. Ghuman, T. Komatsu, E. Tsuchida, S. Curry, Crystal structural analysis of human serum albumin complexed with hemin and fatty acid, BMC Struct. Biol. 3 (2003) 19.

4. 5.

6. 7.

190

VI. SPECTROMETRUL DE REZONAN MAGNETIC NUCLEAR Spectroscopie de rezonan magnetic nuclear pe solide (RMN-S)
C.S.I. dr. Claudiu Filip C.S.III. dr. Mihaela Alua

Cuprins
1. Principiul metodei............................................................................................................... 191 2. Infrastructura existent la UBB Cluj pentru exprimente RMN-S ..................................... 196 3. Tehnici experimentale de baz pentru aplicaii RMN-S n sisteme moleculare organice ....... 202 4. Bibliografie .......................................................................................................................... 215

1. Principiul metodei
Generarea semnalului RMN Spectroscopia RMN se bazeaz pe fenomenul de rezonan magnetic aplicat asupra momentelor magnetice nucleare i = iS, unde S este numrul cuantic de spin, iar i reprezint factorul giromagnetic, asociate speciei nucleare i. Plasarea probei care conine momente magnetice nucleare ntr-un camp magnetic extern intens, B0 ~ 7-23 T (generat cu ajutorul unei bobine supraconductoare), are dou efecte majore: (i) axa polarizrii de spin efectueaz o micare de precesie cu frecventa Larmor, 0,i = - iB0, n jurul direciei cmpului magnetic static (direcia z), i (ii) polarizrile spinilor, distribuite izotrop n momentul aplicrii lui B0, se vor reorienta sub aciunea cmpurilor magnetice locale fluctuante uor datorit micrii termice, astfel nct dup o perioad de ordinul aa numitului timp de relaxare longitudinal, T1, proba va fi caracterizat de o magnetizare macroscopic orientat de-a lungul direciei cmpului magnetic extern. Principalele proprieti ale ctorva nuclee active RMN, cu relevan n special pentru sisteme moleculare organice, sunt prezentate n tabelul de mai jos: 191

Specia nuclear, i
1H 2H 13C 14N 15N

i
S 1/2 1 1/2 1 1/2 [ 107 rad s-1T-1] 26.8 4.1 6.7 1.9 -2.7

Abundena natural [%] 99.98 0.02 1.1 99.6 0.37

0,i [MHz] B0 = 11.7 T 500 76.5 125 35.5 50 B0 = 21 T 900 137.7 225 63.9 90

Deoarece magnetizarea longitudinal nu poate genera un semnal RMN, este necesar mai nti rotirea polarizrii de spin n planul transversal, xy. Acest lucru se realizeaz prin aplicarea unui cmp magnetic oscilant cu frecvena rf, i amplitudinea B1, perpendicular pe cmpul magnetic extern: el este generat de curentul aplicat asupra unei bobine de transmisie n interiorul creia este plasat proba. Dei n practic B1 << B0, cmpul oscilant (numit i cmp de radiofrecven, rf) va determina o micare de precesie cu frecvena 1,i = iB1 a polarizrii spinilor i n jurul direciei lui B1 dac rf satisface condiia de rezonan, rf = 0,i, sau este apropiat de aceasta: n literatura RMN aceast precesie este deseori denumit nutaie. Pentru valori tipice ale lui B1 utilizate n spectroscopia RMN-S, frecvena de nutatie 1,i = 1,i /2 este de ordinul zecilor de kHz, astfel nct rotirea magnetizrii n plan transversal (1,i tp = /2) necesit aplicarea cmpului rf pe durata tp de ordinul ctorva s, adic sub forma unui puls. Dup ncetarea aciunii pulsului rf magnetizarea

Figura 1

192

transversal va precesa liber n jurul lui B0. Aceast micare induce un curent electric oscilant pe bobina de detecie (aceeai cu bobina de transmisie) ce poart numele de semnal RMN, sau FID (free-induction decay). FID-ul este nregistrat n intervalul de timp t2, numit timp de achiziie, pe durata cruia se produce defazarea polarizrii transversale, astfel nct amplitudinea lui se apropie de zero. Dup o perioad de aproximativ t0 ~ 5T1 polarizarea de spin se reconstruiete de-a lungul direciei z i experimentul poate fi repetat. Descrierea de mai sus se refer la aa-numitul experiment RMN de un puls, i este ilustrat schematic n Fig. 1. Detecia semnalului RMN Aplicnd transformata Fourier asupra FID-ului se obine reprezentarea acestuia n domeniul de frecven, adic spectrul RMN. Att semnalul n domeniul temporal, ct i cel n domeniul de frecven, conin o parte real i una imaginar, corespunztor modului de detecie n cuadratur. Cu ajutorul experimentului din Fig. 1 se obine un spectru RMN 1D (unidimensional) ale crui proprieti (poziii, forme i intensiti de linie) depind n mod esenial de interaciunile la care sunt supui spinii nucleari pe durata t2. Considernd doar interaciunea cu cmpul static extern, B0, spectrul asociat speciei nucleare i ar conine o singur linie la poziia frecvenei Larmor asociate, 0,i, iar coninutul lui de informaii ar fi extrem de srac. n realitate, prezena aa-numitor interaciuni de spin interne conduce la valori ale cmpului magnetic local la poziiile diferitor spini i uor diferite de B0, i deci implicit la apariia mai multor linii n spectrul RMN 1D. Parametrii spectrali, de exemplu deplasrile (fa de 0,i), despicrile i/sau lrgirile liniilor individuale sunt n direct conexiune cu elemente de structur chimic/spaial bine determinate, i constituie astfel baza multiplelor aplicaii ale spectroscopiei RMN n (bio)chimie, tiina materialelor, etc. Frecvenele asociate interaciunilor de spin interne sunt mult mai mici dect frecvenele Larmor, ceea ce face ca pentru fiecare specie nuclear i, s existe o fereastr spectral de lrgime limitat, i << 0,i, n jurul lui 0,i care conine ntregul spectru RMN-1D al speciei nucleare respective. n acest context, soluia practic utilizat n spectroscopia RMN modern corespunde aa-numitului mod de lucru pe canale rf distincte, adic nregistrarea de spectre RMN distincte pentru fiecare specie nuclear n parte, precum este cel ilustrat n Fig. 2 n cazul nucleelor 13C:

193

Figura 2

Interaciunile de spin cu relevan n aplicaiile spectroscopiei RMN-S pe probe organice, sunt interaciunea dipolar (homo- i heteronucleara), interaciunea de ecranare chimic, i interaciunea scalar (cuplajul J). Primele dou sunt dominante n cazul nucleelor cu spin (avnd constante de cuplaj de la civa kHz pn la aproximativ 100 kHz) i au un caracter anizotrop. Ele produc n general spectre cu linii foarte largi caracterizate prin suprapuneri severe ce fac imposibil extragerea de informaii utile. n consecin, au fost dezvoltate o serie de tehnici speciale numite de decuplare: ele acioneaz n sensul atenurii efectului produs de anizotropia interaciunilor de spin i conduc la spectre RMN-S de nalt rezoluie, cu linii suficient de nguste nct s permit identificarea componentelor izotrope ale acestora. De exemplu, poziiile liniilor n spectrul 13C din Fig. 2 sunt determinate de valorile izotrope ale ecranrii chimice, aa-numitele deplasri chimice. Deplasrile chimice reflect deplasrile frecvenei de precesie la diferite poziii ale nucleelor 13C n sistemul molecular investigat fa de valoarea 0,C ca urmare a diferenelor n intensitatea cmpului magnetic local indus de distribuia electronic din vecintate, i sunt prin urmare reprezentative pentru gruparea chimic din care nuceele respective fac parte. n acest mod, spectre RMN 1D precum cel ilustrat n Fig. 2 sunt utile pentru determinarea structurii chimice, prin identificarea gruprilor chimice distincte din molecul n funcie de regiunea spectral specific n care se plaseaz liniile RMN. 194

Noiunile introductive vor fi completate n final cu cteva precizri utile, menite s asigure legtura ntre baza conceptual-teoretic prezentat mai sus i elementele concrete cu caracter aplicativ, privind implementarea lor concret n practica curent: Un spectrometru RMN este caracterizat n mod tradiional prin valoarea frecvenei Larmor a spinilor 1H n cmpul magnetic al acestuia (de exemplu un spectrometru cu un criomagnet care produce un cmp B0 = 11.7 T va fi denumit spectrometru de 500 MHz) Pentru a obine un spectru RMN de calitate (cu raport semnal/zgomot ct mai mic) este n general nevoie de nregistrarea unui numr N de FID-uri, cu un timp de repetiie determinat de valoarea lui t0 (conform Fig. 1), care vor fi adunate pentru a genera semnalul RMN final. Valoarea optim a lui N (denumit numr de scanuri n terminologia de specialitate) depinde pentru fiecare specie nuclear de sensibilitatea asociat. Aceasta din urm este dat n principal de cantitatea de prob, cmpul magnetic static, factorul giromagnetic, abundena izotopic i numrul de poziii chimice distincte n sistemul studiat. Pentru exemplificare, spectrul RMN-S 13C a unui compus n faza policristalin cu izotopul 13C n abunden natural i cu un numr de pn la 10 poziii chimice distincte a carbonilor din molecul necesit acumularea unui numr de ordinul miilor de scanuri pentru a obine un raport semnal/zgomot acceptabil (> 30), n timp ce pentru un spectru 1H de calitate este suficient nregistrarea unui singur scan. Poziiile liniilor ntr-un spectru RMN sunt date fie n uniti absolute de frecven (Hz), ca i deplasare fa de o linie de referin caracteristic fiecrei specii nucleare, fie n uniti relative numite pri pe milion (ppm) care reprezint raportul dintre aceast deplasare fa de frecvena de referin i frecvena Larmor a speciei respective. Cel de-al doilea mod este de obicei preferat pentru c poziiile liniilor ntr-un compus dat vor fi aceleai indiferent de valoarea cmpului magnetic . Un puls rf se caracterizeaz prin trei parametri distinci: (i) unghiul de rotire a magnetizrii fa de direcia z aa-numitul unghi de tilt (de exemplu = /2, , etc.); (ii) faza pulsului, care reprezint unghiul pe care l face B1 fa de axa Ox; i (iii) frecvena de offset, i = rf - 0,i, n cazul n care rf nu este exact n rezonan cu frecvena de precesie Larmor a speciei nucleare i. Fiecare specie nuclear distinct este caracterizat de o aa-numit fereastr spectral de lrgime limitat n interiorul creia se plaseaz toate liniile RMN posibile: de exemplu lrgimile tipice ale acestei 195

ferestre spectrale sunt de aproximativ 20 ppm (pentru 1H), 300 ppm (pentru 13C), i 500 ppm (pentru 15N). Achiziionarea direct a semnalului RMN (pe durata lui t2 n Fig. 1) se realizeaz n mod discret (digital) cu un timp de eantionare numit dwell time. n consecin, transformarea Fourier se va aplica asupra acestui semnal digitizat, i se realizeaz utiliznd aa-numitul algoritm FFT (fast Fourier transform). Exemplul prezentat n Fig. 1 prezint cel mai simplu experiment posibil n spectroscopia RMN. De-a lungul timpului a fost dezvoltat o diversitate foarte mare de tehnici RMN complexe care presupun aplicarea de secvene multi-puls extrem de sofisticate, simultan pe mai multe canale rf, i permit extragerea selectiv a informaiilor dorite. Referine detaliate cu privire la fundamentarea teoretic a acestor tehnici moderne, precum i la implementarea lor experimental, pot fi gsite n literatura de specialitate.

2. Infrastructura existent la UBB Cluj pentru experimente RMN-S

Descrierea componentelor hardware Laboratoarele Centrului Naional de Rezonan Magnetic (CNRM) sunt dotate cu dou spectrometre Bruker, achiziionate n anii 2002 i 2009. Magnetul acestora este autoecranat, aceast tehnologie fiind introdus chiar de firma Bruker n 1996, iar cmpul generat de acesta este de 9,4 Tesla, respectiv 14,1 Tesla cu frecvena de rezonan pentru nucleii de hidrogen de 400 MHz i 600MHz.

Spectrometrul Bruker DRX 400 din dotarea CNRM 196

Spectrometrele Bruker DRX 400 i Bruker DRX 600 sunt complet digitale iar controlul acestora se face n totalitate prin intermediul unui calculator de tip PC. Ambele sisteme pot analiza att probe n stare condensat ct i probe n stare lichid. Pentru studiul probelor solide exist n dotare mai multe capete de sond care permit efectuarea experimentelor la temperaturi ntre -80 C i 200 C, iar rotirea mecanic a probei se poate face la o frecven de rotatie de pn la 35 kHz. Pot fi efectuate msurtori spectroscopice de rezonan magnetic nuclear pe o gam foarte larg de nuclee: 1H, 13C, 15N, 57Fe, 27Al, 69Ga etc.

Magnetul spectrometrului Bruker DRX 600 din dotarea CNRM

Unitatea MAS folosit pentru controlul automat sau manual al rotirii probelor solide la unghiul magic

197

Capul de prob folosit pentru msurtorile pe probe solide introdus n cmpul magnetic static. Se pot observa conectrile acestui cap de prob la surse de aer necesar att pentru rotirea probei la unghiul magic ct i pentru controlul temperatuii probei. Se mai poate observa i conexiunea cablului care servete la detectarea, prin intermediul fibrei optice, a vitezei de rotaie a probei.

n imaginea de mai sus se poate observa rotorul i instrumentaia specific, necesar introducerii i tasrii substanei de msurat precum i scoaterii acesteia din rotor. Descrierea componentelor software Pentru comanda modulelor electronice ale unui spectrometru RMN exist pachete software specializate prin intermediul crora elementele distincte ale unui experiment RMN sunt transpuse n comenzi specifice. n cazul spectrometrelor Bruker, soft-ul de comand se numete XWin NMR (pn la generaia Avance II), i respectiv TopSpin, ncepnd cu generaia de spectrometre Avance III. Corespunztor echipamentelor existente la UBB Cluj, primul este instalat pe spectrometrul Bruker DRX 400, iar programul TopSpin comand spectrometrul Bruker DRX 600. Cele dou versiuni ale soft-ului de comand Bruker difer prin interfaa grafic i prin numrul 198

sporit de scripturi pentru calibrarea parametrilor experimentali existente n TopSpin dar, n rest, ele sunt echivalente la nivel conceptual. De aceea, n continuare vom face o foarte scurt prezentare axat pe evidenierea principiior fundamentale, comune ambelor programe: Comanda unui experiment RMN se realizeaz prin intermediul aa numitului program de pulsuri (pulse program) care specific aciunile aplicate n cadrul experimentului, durata fiecruia dintre acestea i, n funcie de tipul aciunii, o serie de proprieti specifice Primul tip de aciuni corespunde elementelor standard ale unui experiment RMN (precum cel ilustrat n Fig. 1), respectiv: pulsuri rf, perioade de evoluie liber i perioada de achiziie direct. Ele au asociate urmtoarele comenzi specifice n programul de pulsuri: pn (p puls, n = 0 ... 31 indicele asociat), dn (d delay, n = 0 ... 31 indicele asociat), i go=n (go este un script care transmite comenzi specifice receptorului pentru achiziionarea digital a semnalului RMN, iar n este eticheta liniei de comand care va fi efectuat dup ncheierea achiziiei) n programul de pulsuri prezentat mai jos (care implementeaz experimentul RMN de un puls n Fig. 1), comanda referitoare la aplicarea pulsului rf este p1:f1 ph1. Ea specific durata acestuia, p1, precum i faptul ca este aplicat pe canalul f1, cu faza ph1. Valorile lui p1 i f1 sunt introduse explicit de ctre utilizator n aa numita tabela de achiziie (acquisition table), prin intermediul unor variabile care poart acelai nume. Faza ph1 este n schimb explicitat la sfritul programului de pulsuri (valorile corespund conveniei Bruker n care 0, 1, 2 i 3, reprezint fazele 0, 90, 180 i respectiv 2700, iar n reprezentarea modelului vectorial, x, y, -x i y). Pentru o privire complet a modului de lucru cu fazele, incluznd cazul general n care acestea nu sunt multipli de 900, se recomand consultarea manualului de utilizare Bruker. Sensibilitatea spectral maxim se obine pentru o valoare = 900 a unghiului de tilt pentru pulsul p1 (asa-numitul puls de 900). n practic, calibrarea acestui puls se realizeaz prin fixarea duratei lui p1, de exemplu la 2.5 s, dup care se ajusteaz puterea la ieire a transmitorului astfel nct curentul transmis pe bobin s produc o intensitate B1 a cmpului rf care s corespund unui puls de 900 (n cazul exemplificat, 1 trebuie s fie 100 kHz, conform relaiei 21tp = /2). n mod similar se procedeaz i n cazul n care se calibreaz un puls cu orice alt valoare a unghiului de tilt, , necesar n experimentul considerat. 199

Nivelul de putere al unui puls rf este cel specificat n programul de pulsuri anterior comenzii de aplicare a pulsului respectiv, n exemplul nostru, pl1, iar valoarea lui este introdus explicit n tabela de achiziie. n convenia Bruker, valorile pln sunt date n decibeli (dB), i corespund atenurii care trebuie aplicat la ieirea transmitorului pentru a obine valoarea dorit a cmpului rf pe bobina. Linia de comand 2 d1 din programul de pulsuri de mai jos reprezint o perioad de durat d1 (a crei valoare este introdus explicit n tabela de achiziie) n care intensitatea cmpului rf transmis/receptat este zero. Ea reprezint aa numitul delay, iar n exemplul nostru concret d1 corespunde unei valori rezervate, respectiv recycle delay, adic timpul necesar reconstruirii magnetizrii longitudinale dup detecia sa. Din acest motiv, linia de comand are n fa indicele 2, ce reprezint punctul de unde experimentul RMN se repet, pentru a achiziiona un nou scan: acest fapt este explicitat n linia de comand asociat achiziiei semnalului RMN, go=2 ph31, unde ph31 este faza receptorului). n experimente multi-puls mai complexe, n afar de recycle delay vor exista mai multe perioade de evoluie liber a sistemului, de exemplu ntre pulsuri rf consecutive, care vor fi specificate prin comenzi de tipul dn. Al doilea tip de aciuni specificate ntr-un program de pulsuri nu au echivalent n schema standard a unui experiment RMN. Ele corespund n general unor comenzi care se aplic asupra modulelor electronice, cu scopul comutrii lor ntre diferite regimuri de funcionare, i sunt necesare pentru implementarea practic a elementelor componente n experimentul RMN dat (de exemplu comutarea frecvenelor de offset, a fazelor, a nivelurilor de putere la ieirea transmitorului, scrierea datelor achiziionate etc.) i au asociat un timp (ideal ct mai scurt) pe durata cruia comutarea se poate realiza din punct de vedere fizic. n exemplul de mai jos, aceste tipuri de aciuni sunt reprezentate de comenzile: 1 ze (efectueaz resetarea tuturor modulelor electronice la valorile lor iniiale), 2us pl1:f1 (pe durata unui delay fixat la 2 s se seteaz atenuatorii la ieirea transmiterului la valoarea specificat prin parametrul de achiziie pl1, astfel nct orice comand pn care apare dup aceasta linie va aplica un puls rf de durata pn i cu un nivel de putere pl1), wr #0 (scrie n memorie datele achiziionate, adic semnalul RMN digitizat), i exit (comanda de ncheiere a experimentului).

200

Liniile care ncep cu ; reprezint linii de comentarii: ele sunt necesare (n special n cazul experimentelor multi-puls mai complexe) pentru a explicita semnificaia parametrilor inclui n programul de pulsuri asociat. Dup cum s-a precizat mai sus, valorile numerice ale parametrilor inclui n programul de pulsuri sunt specificate n tabela de achiziie. n afar de acetia, tabela de achiziie va mai conine n mod obligatoriu i ali parametri caracteristici experimentelor RMN, care ofer informaii cu privire la: tipul de experiment (1D, 2D, etc.); numele programului de pulsuri utilizat n experimentul considerat (pulprog); tipul nucleului asociat cu canalele rf utilizate n experimentul dat ( f1, f2, etc.); numrul de scanuri (ns) numrul de semnale RMN achiziionate direct i adunate ntre ele n scopul reducerii nivelului de zgomot la un nivel acceptabil; dewll time (dw) durata de eantionare a semnaluilui RMN digitizat, adic durata ntre dou puncte consecutive; tipul de achiziie direct (qsim n cuadratur, colectnd simultan puncte n partea real i imaginar a semnalului RMN, qseq n cuadratur, dar colectnd altenativ puncte n partea real i imaginar a semnalului RMN, etc.); domeniul temporal (td) numrul de puncte achiziionate, exprimate de obicei n multiplii de 16; frecvenele de offset pe canalele pe care se lucreaz (o1, pe canalul f1, o2, pe canalul f2, etc.) se exprim n Hz sau ppm, i reprezint devierea (cu + sau -) fa de frecvena de baz pe canalul respectiv (sf1, sf2, etc. : pentru fiecare nucleu aceasta este fixat n momentul configurrii spectrometrului). Acetia sunt parametri cei mai importani n cadrul unui experiment RMN tipic, ns reprezint doar o mic parte din numrul total de parametri posibili (ci anume dintre acetia sunt utilizai efectiv ntr-un experiment dat depinde de complexitatea lui). Pentru o descriere detaliat, se recomand consultarea manualelor Bruker. Dup achiziionarea semnalului RMN, acesta trebuie supus transformrii Fourier pentru a genera spectrul RMN. Parametri specifici acestui proces sunt inclui n aa numita tabel de procesare, iar tipul i numrul acestor parametri depinde de complexitatea experimentului avut n vedere. Pentru detalii, de asemenea, se recomand consultarea manualelor Bruker.

201

# 1 "C:/Bruker/XWIN-NMR/exp/stan/nmr/lists/pp/zg" ;1D sequence # 1 "C:/Bruker/XWIN-NMR/exp/stan/nmr/lists/pp/Avance.incl" 1 ;Avance2.incl 1 ze 2us pl1:f1 2 d1 p1:f1 ph1 go=2 ph31 wr #0 exit ph1=0 2 2 0 1 3 3 1 ph31=0 2 2 0 1 3 3 1 ;pl1 : f1 channel - power level for pulse (default) ;p1 : f1 channel - high power pulse ;d1 : relaxation delay; 1-5 * T1

3. Tehnici experimentale de baz pentru aplicaii RMN-S n sisteme moleculare organice

Tehnici specifice de nalt rezoluie n solide: rotirea n jurul unghiului magic (MAS Magic Angle Spinning), decuplarea homonuclear, i decuplarea heteronuclear Aspectul liniilor de rezonan dintr-un spectru RMN 1D, obinut spre exemplu cu ajutorul experimentului de un puls ilustrat n Fig. 1 difer fundamental n funcie de starea de agregare a probei, respectiv lichid sau solid. Spectrele compuilor n soluie sunt caracterizate de o rezoluie foarte bun, datorat micrii moleculare rapide: prin aceasta, efectul componentelor anizotrope ale interaciunilor de spin prezente n sistem este mediat la zero, pstrndu-se doar partea lor izotrop. n stare solid micarea rapid de reorientare molecular este absent, fapt care duce la meninerea caracterului anizotrop al interaciunilor de spin i, implicit, la lrgirea liniilor de rezonan. Anizotropia interaciunilor prezint pe de o parte dezavantajul de a conduce la pierderea rezoluiei prin suprapunerea liniilor RMN: n Fig. 3 este ilustrat comparaia dintre un spectru 1H RMN tipic al unui compus organic n soluie, caracterizat de rezoluie nalt, adic un spectru cu linii de rezonan nguste i bine separate n funcie de deplasrile chimice izotrope, i spectrul aceluiai compus aflat n stare solid, n 202

care se observ cu usurin pierderea complet a rezoluiei prin suprapunerea sever a liniilor RMN.

Figura 3 Comparaie ntre spectrul 1H RMN static al unui compus organic tipic n stare solid (a) i n stare lichid (b)

Pe de alt parte, manifestarea caracterului anizotrop al interaciunilor de spin n probe solide prezint i avantaje de ordin practic, deoarece componentele anizotrope conin informaii importante cu privire la structura i dinamica din sistem. n mod explicit, anizotropia ecranrii chimice furnizeaz informaii despre structura electronic (prin tipul orbitalilor moleculari) i legturile dintre atomi, iar anizotropia cuplajului dipolar conine informaii despre distanele internucleare. Avnd n vedere toate aceste considerente, rezult necesitatea dezvoltrii de metode specifice ale spectroscopiei RMN-S care s conduc n cadrul aceluiai experiment la dou efecte distincte: (i) pe durata anumitor perioade ale experimentului s se obin medierea componentelor anizotrope ale interaciunilor de spin, care s conduc la separarea liniilor RMN-S n funcie de deplasrile chimice izotrope ale diferitelor grupri chimice din sistemul molecular investigat, adic la rezoluie spectral nalt i (ii) reintroducerea selectiv pe durata celorlate perioade ale exeprimentului a unor componente anizotrope ale interaciunilor de spin (care s afecteze mrimi spectrale altele dect lrgimile de linie), pentru a codifica n spectrul obinut i informaii specifice cu privire la structura i/sau dinamica molecular din sistem n acest scop sunt aplicate aa numitele metode de recuplare, care vor fi introduse n raportul urmtor. Pentru a diminua efectul negativ al anizotropiei interaciunilor de spin n spectroscopia RMN-S, la mijlocul anilor 50 a fost introdus tehnica MAS 203

(Magic Angle Spinnining) n cadrul creia proba este rotit n jurul unei axe nclinate la un unghi, numit unghiul magic, n raport cu direcia cmpului magnetic static. Aceast metod, ilustrat schematic n Fig. 4, mediaz efectul anizotropiei interaciunilor de spin prin faptul c rotaia mecanic a probei determin oscilaia n timp a termenilor anizotropi i prin aceasta micoreaz efectul lor de lrgire asupra liniilor RMN.

Figura 4

Majoritatea metodelor RMN-S moderne de nalt rezoluie sunt aplicate n condiii de rotaie a probei n jurul unghiului magic. Conform descrierii teoretice de mai sus, mecanismul de ngustare prin MAS a liniilor RMN n solide se bazeaz pe manipularea prii spaiale a hamiltonianului de interaciune: termenii anizotropi ai acestuia n proba rotit se descompun ntr-o component static, care devine zero cnd axa de rotaie este nclinat la unghiul magic n raport cu direcia cmpului magnetic static, i dou componente dependente de timp ce corespund unei modulri periodice cu frecvenele R, i respectiv 2R. Dup cum se va prezenta n continuare, efectul termenilor modulai devine din ce n ce mai mic cu creterea frecventei de rotaie a probei: n perioada scurs de la introducerea metodei MAS i pn n prezent tehnologia n domeniu a avansat extrem de mult, permind rotaii de pn la 70 kHz ale probei n jurul unghiului magic. De asemenea, trebuie menionat c, n funcie de forma explicit a hamiltonienilor asociai acestor interaciuni, efectul lor asupra dinamicii de spin, i implicit asupra lrgirii liniilor RMN, va fi diferit. Din acest punct de vedere, se pot evidenia dou cazuri distincte: (i) interaciuni neomogene (deplasarea chimic i interaciunea dipolar heteronuclear pentru care [ H (t1 ), H (t2 )] = 0, t1 , t2 i (ii) interaciuni omogene (interaciunea dipola204

r homonuclear n [ H (t1 ), H (t2 )] 0, t1 , t2 .

sisteme

multi-spin)

pentru

care

Pentru a ilustra efectul interaciunilor omogene asupra formei i lrgimii liniilor de rezonan, n Fig. 5 sunt prezentate spectrele 1H RMN pentru diferite frecvene de rotaie R n cazul a doi compui organici, caracterizai prin dinamica molecular complet diferit, respectiv adamantanul i policarbonatul. n aceste dou cazuri, se consider aciunea Hamiltonienilor de tip omogen, datorai interaciunii dipolare homonucleare n sisteme multi-spin. Evoluia lrgimii liniilor RMN, pornind de la cazul static pn la domeniul de frecvene nalte (35 kHz), exemplific modalitatea prin care frecvena de rotaie acioneaz asupra caracterului omogen al interaciunilor de spin din sistem. Astfel, n cazul static se obine doar un spectru foarte larg, fr rezoluie, iar pentru R ~ 3 kHz, ncep s se contureze att linia central de rezonan, precum i benzile de rotaie laterale, care apar la multiplii ntregi ai frecvenei de rotaie. Mergnd spre limita superioar a frecvenei de rotaie, forma spectrelor se apropie de cea ntalnit n cazul n care predomin interaciunile neomogene.

Figura 5 Spectele 1H RMN-MAS ale adamantanului (a), respectiv ale policarbonatului (b), pentru frecvene de rotatie n intervalul 0 35 kHz

Un pas foarte important n mbuntirea rezoluiei spectrale pentru sisteme de tip multi-spin, n care datorit numrului mare de protoni inter205

aciunea dipolar homonuclear, de tip omogen, este predominant, const n combinarea tehnicii MAS cu metode de decuplare homonuclear. Acestea presupun aplicarea pe canalul 1H (care este i canalul de detecie) a unor secvene de pulsuri adecvate care s conduc la medierea efectului produs de interaciunile dipolare homonucleare. De exemplu, una dintre secvenele intens utilizate n prezent, deoarece este aplicabil n cazul rotirii probei cu frecvene nalte de ordinul a 65 70 kHz, se numete DUMBO. n Fig. 6 este prezentat spectrul 1H al dipeptidei -L-Asp-L-Ala obinut rotind proba cu R= 65 kHz (a), iar apoi prin aplicarea celor dou tehnici - MAS i decuplare homonucler cu ajutorul secvenei DUMBO (b). Comparnd spectrele obinute se observ o cretere apreciabil a rezoluiei spectrale n cazul decuplrii homonucleare, astfel nct lrgimea liniei gruprii metil scade de la 1.1 ppm n cazul (a), la 0.32 ppm n cazul (b).

Figura 6

n clasa metodelor de decuplare homonucler, pe lng mai sus amintita metod DUMBO, mai pot fi enumerate i FSLG, PMLG, precum i RNn i SAM (Smooth Amplitude Modulation), ultimele dou metode fiind aplicate n timpul perioadei de evoluie indirect a experimentelor de tip bidimensional. n cazul sistemelor de spini cu factor giromagnetic mic (de exemplu 13C sau 15N) n abunden natural (adic separai prin distane mari) cuplajele dipolare devin neglijabile, astfel nct interaciunea dominant din sistem rmne ecranarea chimic (cu componentele ei izotropa, respectiv anizotropa). 206

n acest caz, este de ateptat n principiu ca odat cu creterea frecvenei de rotaie a probei s se obin spectre cu rezoluie i sensibilitatea spectral din ce n ce mai nalte. Din punct de vedere teoretic, evoluia cu frecvena de rotaie a liniilor ntr-un spectru RMN 1D ntr-un sistem de trei spini 13C care nu interacioneaz dipolar dar sunt supui ecranrii chimice este prezentat n Fig. 7. Spectrul static al L-Alaninei prezint caracteristicile tipice ntlnite n cazul unui sistem de spini izolai, n care se consider doar efectul ecranrii chimice, liniile de rezona fiind largi, centrate la valori ale deplasrii chimice izotrope asociate fiecrei grupri chimice. Forma liniilor este dat de valoarea parametrului de asimetrie, adic =1 n cazul gruprii COO-, 0.5 pentru CH2, respectiv 0.3 pentru CH3. La o frecven de rotaie mic, R= 1 kHz, liniile celor trei grupri se descompun ntr-o serie de benzi de rotaie laterale, situate la multiplii ntregi ai frecvenei de rotaie. Odat cu creterea lui R pn la valori mari, intensitile benzilor rotaionale se reduc semnificativ astfel nct un spectru MAS de nalt rezoluie va conine cu o bun aproximaie doar linii poziionate la valori ale deplasrilor chimice izotrope corespunztoare gruprilor chimice din prob. Situaia prezentat n Fig. 7 corespunde unui model teoretic idealizat, care ilustreaz comportarea n condiii de MAS a unor interaciuni de spin de tip pur neomogen: n realitate, nucleele 13C (15N) sunt Figura 7 Evoluia cu frecvena de nconjurate n compuii organici de un rotaie a liniilor de rezonan din numr mare de protoni, astfel nct efectul spectrul RMN 13C al L-alaninei, n interaciunilor suplimentare datorate acesprezena ecranrii chimice tora nu poate fi neglijat n practic. Chiar i n cazul frecvenelor de rotaie mari se vor obine linii de rezonan ale 13C (15N) cu lrgimi reziduale mari dac se folosete doar tehnica MAS. Pentru a crete rezoluia spectral n aceste cazuri este nevoie de combinarea teh207

nicii MAS cu o tehnic suplimentar numit decuplare heteronuclear n scopul de a se limita efectul de lrgire produs de protonii din vecintate. n esen, aceast tehnic const n aplicarea pe canalul 1H a unui cmp rf intens, sub form continu sau de pulsuri cu modulaie n faz, n timpul achiziionrii semnalului RMN pe canalul 13C (15N).

Figura 8

Dup cum se observ n Fig. 8 pentru cazul spectrului RMN pe 13C al L-alaninei msurat la o frecven de rotaie de 10 kHz, utilizarea decuplrii heteronucleare n condiii de MAS conduce la linii de rezonan nguste, bine separate, poziionate la valori ale deplasrii chimice izotrope caracteristice fiecrei grupri structurale, asemntoare celor simulate pentru cazul idealizat al interaciunilor pur neomogene (Fig. 7). Lrgimile liniilor pentru toate cele trei grupri sunt n intervalul 20 50 Hz, cu o diferen de un ordin de mrime fa de valorile ntlnite n mod uzual n cazul compuilor n stare lichid. Calibrarea parametrilor pe canalul 1H cu ajutorul experimentului de un puls Pentru calibrarea nivelului de putere (sau echivalent, valoarea B1 a cmpului rf exprimat n kHz) generat de transmiter pe canalul 1H n funcie de valoarea atenurii (in dB) se utilizeaz experimentul simplu de un puls din Fig. 1, al crui program de pulsuri este listat la finalul Seciunii 2. Din punct de vedere practic, procedura const n urmtoarele: Se utilizeaz adamantanul drept prob standard pentru calibrarea nivelurilor de putere pe canalul protonilor deoarece spectrul 208

RMN-S 1H al acestui compus const dintr-o singur linie, cu lrgime mai mic dect a altor compui organici n faz solid (sub 1 kHz pentru frecvene de rotaie a probei mai mari dect 10 kHz). Aceste proprieti favorabile conduc la o sensitivitate i o rezoluie foarte bun care permit calibrarea rapid i precis a pulsului de 1800 (dup cum se va descrie mai jos), i se datoreaz faptului c molecula de adamantan nu este rigid n reeaua cristalin ci efectueaz micri rapide de rotaie simultan n jurul a trei axe de simetrie, ceea ce reduce foarte mult tria cuplajelor dipolare 1H-1H Dup plasarea probei n magnet, i stabilizarea rotaiei la frecvena aleas, se procedeaz la operaiunile preliminare standard de acordare a frecvenei de rezonan i a impedanelor (aa numitele tuning i matching). n funcie de capul de prob folosit, se recomand utilizarea unor frecvene de rotaie cuprinse ntre 10 i 30 kHz Se ncepe apoi procedura de calibrare a puterilor pe canalul protonilor prin rularea repetat a experimentului de un puls (programul de pulsuri redat mai sus, i se utilizeaz comanda zg), n cadrul cruia se modific durata pulsului (p1) i nivelul de putere asocial (pl1) i se nregistreaz spectrul RMN-S 1H al adamantanului. Modificarea acestor parametri se poate face nscriind valorile dorite n tabela de achiziie, sau direct prin comenzile p1 <valoare> (in us), i respectiv pl1 <valoare> (in dB) Mai nti se fixeaz durata pulsului p1 astfel nct aceasta s corespund unui puls de 1800 pentru un set de valori dorite ale cmpului rf pe canalul 1H (de exemplu, p1 = 5, 6.67, i 10 us, pentru cmpuri de 100, 75 i 50 kHz). Pentru fiecare dintre aceste valori fixe se baleieaz parametrul pl1 pn cnd intensitatea liniei din spectrul RMN-S nregistrat devine zero. Se recomand calibrarea n ordinea descresctoare a cmpului rf , caz n care se va putea ncepe cu o valoare de strat pl1 = 2-0 dB care va fi sczut n pai mai mari la nceput (de exemplu 0.5 dB) pn se constat anularea (sau inversarea) liniei RMN-S. n cazul inversrii, se scaneaz pl1 cu pai mai mici (0.1 dB) n jurul valorii pentru care acesta s-a obinut, i se determin n final valoarea exact a pl1 pentru care intensitatea liniei se anulaz complet: aceast valoare va corespunde deci pulsului de 1800 pentru cmpul rf considerat. Se repet apoi n mod identic procedura de baleiere a nivelurilor de putere pl1 descris mai sus pentru toate valorile cmpului rf (implicit, p1) considerate. Trebuie avut ns n vedere c scznd cmpul 209

rf valoarea de start a parametrului pl1 crete n mod corespunztor, pentru a se evita de exemplu s se porneasc cu o valoare care deja corespunde unui puls > 1800. n practic se prefer calibrarea prin intermediul pulsului de 1800 i nu 900, deoarece monitorizarea rezultatului prin intermediul unui semnal care se anuleaz este mai sensibil dect dac s-ar urmri valoarea maxim a acestuia.

Calibrarea parametrilor pe canalul 13C cu ajutorul experimentului CP-MAS Secvena de pulsuri asociat experimentului de Cross-Polarizare n condiii MAS (CP-MAS) este ilustrat n Fig. 9 utiliznd reprezentarea schematic convenional din RMN, descris n Fig. 9. Pentru a face mai uoar o comparaie direct ntre aceasta reprezentare schematic, i implementarea ei pe spectrometrul Bruker, n figur sunt menionai explicit parametrii de timp (pulsuri, pn, i delay-uri, dn, sau <valoare> us), de putere, pln, i respectiv de faz, phn, inclui n programul de pulsuri cp-const asociat acestei secvene, i listat mai jos.

Figura 9

# 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/cp-const" ;cp (TopSpin 2.0) ;basic cp experiment 1 ze 2 d1 do:f2

210

1u pl3:f2 (p3 ph3):f2 (1u pl1:f1) (1u pl2 f2) (p15 ph1):f1 (p15 ph2):f2 1u pl12:f2 ;go=2 ph31 cw:f2 go=2 ph31 cpd2:f2 1m do:f2 wr #0 HaltAcqu, 1m exit ph3= 1 3 ph1= 0 0 2 2 1 1 3 3 ph2= 0 ph31= 0 2 2 0 1 3 3 1

;pl12 is used here with cw ;pl12 is used here with tppm, and p30 the pulse

CP-MAS este un experiment de dubl rezonan, deoarece presupune aplicarea de cmpuri rf (pulsuri) simultan pe dou canale distincte (f1: 13C i f2: 1H n cazul particular ilustrat mai sus). El este un experiment standard n spectroscopia RMN-S care se utilizeaz att pentru nregistrarea spectrelor 1D convenionale ale nucleelor cu factor giromagnetic mic, precum 13C sau 15N, ct i ca parte component n experimente multi-dimensionale mai complexe. n cadrul prezentului raport, se va considera n detaliu doar primul aspect, i vom ncepe prin a explica de ce se prefer n practic experimentul CP-MAS pentru a nregistra spectre RMN-S 1D ale 13C(15N) n locul experimentului mult mai simplu de un puls. Procesul de transfer de polarizare 1H <-> 13C(15N) prin aa-numitul mecanism de polarizare ncruciat (cross-polarization, CP) este un proces coerent generat de interaciunile dipolare heteronucleare 1H- 13C(15N) i se desfoar n condiiile iradierii simultane cu cmpuri rf pe canalele asociate (aa numitele pulsuri de contact: Fig. 9). Procesul de transfer prezint maxime de eficien dac amplitudinile celor dou cmpuri rf de contact satisfac aa-numita condiie Hartmann-Hahn de matching, 1H = 13C +(-) nR, unde n=1,2. n general se lucreaz cu valori ale cmpului n jur de 50 kHz pe canalul protonilor, la condiia de matching n =1: aceasta nseamn c valoarea cmpului pe canalul 13C(15N) va fi astfel calibrat nct s fie mai mare (sau mai mic) cu valoarea frecvenei de rotaie a probei. De exemplu, pentru o rotaie cu R = 15 kHz (o valoare uzual pentru nregistrarea spectrelor 13C) a probei n jurul unghiului magic, este necesar calibrarea unui cmp rf pe canalul carbonului de 35 sau 65 kHz pentru a asigura un transfer maxim de 211

polarizare 1H -> 13C. De asemenea, valorile optime pentru durata pulsului de contact (p15) n cazul nucleelor de 13C este cuprins ntre cteva sute de s, pn la 1-2 ms: aceast durat depinde direct de tria medie a cuplajelor dipolare dintre fiecare spin 13C din prob i protonii cei mai apropiai. Deoarece, cuplajul dipolar 1H- 13C este de aproximativ 2.5 ori mai mare dect cuplajul 1H- 15N la aceeai distan internuclear, i valoarea optim a pulsului de contact va crete corespunztor (n acest caz se obine un transfer maxim de polarizare la valori ale p15 cuprinse ntre 3-7 ms). Avantajele principale ale unui experiment CP-MAS rezult din faptul c polarizarea iniial care conduce la formarea semnalului RMN-S este cea transferat de la spinii 1H, i nu polarizarea asociat nucleelor 13C(15N). Deoarece la echilibru termic raportul dintre aceste polarizri este proporional cu raportul factorilor giromagnetici corespunztori, rezult o amplificare de aproximativ patru ori n intensitatea semnalului RMN-S 13C, i respectiv de zece ori n cazul spinilor 15N, comparativ cu intensitatea care s-ar obine printr-un experiment de un puls. n realitate aceti factori teoretici sunt rareori obinui n practic datorit proceselor de relaxare care se desfoar pe durata pulsului de contact, ns i n aceste condiii ctigul n intensitate al semnalului RMN este semnificativ. Utilizarea polarizrii transferate de la protoni mai are nc un avantaj important care este determinat de valorile mult mai mici ale timpului de relaxare longitudinal T1 n cazul nucleelor 1H n comparaie cu cei asociai 13C(15N): deoarece aceti timpi practic guverneaz valoarea duratei de repetiie a experimentului (aa-numita recycle delay, d1, n Fig. 9), rezult c ntr-un anumit interval dat se pot acumula mult mai multe scanuri cu ajutorul CP/MAS dect ar fi posibile n cazul utilizrii experimentului simplu de un puls. Ambele mecanisme conduc la creterea substanial a sensibilitii spectrale n cazul utilizrii metodei CP/MAS. Plecnd de la secvena de pulsuri ilustrat schematic n Fig. 9, i respectiv programul de pulsuri asociat, un experiment CP/MAS standard (sau convenional) se deruleaz n modul urmtor: mai nti se aduce polarizarea longitudinal a spinilor nucleari 1H n planul transversal (de exemplu de-a lungul direciei x, prin aplicarea pulsului p3 de 900 cu faza y pe canalul f2 asociat protonilor). Aceast polarizare este apoi blocat aa-numitul spin locking cu ajutorul pulsului de contact p15 aplicat pe canalul f2 cu faza x (deoarece direcia cmpului rf asociat i direcia polarizrii trebuie s coincid). Simultan se aplic pulsul de contact de aceeai durat p15 i pe canalul carbonului cu un nivel de putere corespunztor unui transfer maxim de polarizare 1H->13C (adic s satisfac una dintre condiiile de matching Hartmann-Hahn descrise mai sus). Polarizarea transferat pe 212

durata lui p15 se construiete de-a lungul direciei cmpului de contact aplicat pe canalul f1: aceasta reprezint n fapt o polarizare transversal a spinilor 13C astfel c, n momentul ncetrii aciunii pulsului de contact, ea evolueaz liber i poate fi achiziionat ca i semnal RMN (FID). n mod uzual un experiment CP/MAS se efectueaz cu un phase cycling de 8 pai, care conine dou subcicluri suprapuse: (i) alternarea cu 1800 a fazei pulsului p3, respectiv ph3 = 90 i 2700, pentru a elimina contribuia polarizrii iniiale a spinilor 13C la semnalul detectat, i (ii) alternarea n pai de 900, respectiv 0, 90, 180 i 2700, a fazei receptorului n sincronie cu faza ph1 a pulsului de contact pe canalul f1 (aa-numitul Cyclops phase cycling) pentru a elimina eventualele imperfeciuni ale circuitelor de detecie n cuadratur. n final trebuie menionat c detecia FID-ului se face n condiii de decuplare heteronuclear, adic prin utlizarea unor tehnici speciale care au drept scop minimalizarea efectelor produse de interaciuniile dipolare 1H-13C i 1H-1H (n special efectul de lrgire a liniilor spectrale) pe durata achiziionrii semnalului RMN 13C. n principiu, toate tehnicile de decuplare heteronuclear constau n aplicarea unui cmp rf pe canalul protonilor de-a lungul ntregii durate de achiziie a semnalului RMN, cmp ce trebuie s satisfac anumite cerine n funcie de condiiile experimentale concrete: n cadrul celei mai simple metode, numite Continuous Wave CW, cmpul se aplic n mod continuu cu faza arbitrar, iar n cadrul unei metode mai recente, cu performane mbuntite, numita TPPM (Two Pulse Phase Modulation) cmpul se aplic sub form de trenuri de dou pulsuri cu faze alternante, = + , cu avnd valori cuprinse n general ntre 15 i 300. TPPM este tehnica de decuplare heteronuclear cel mai des utilizat pentru nregistrarea de spectre 13C RMN-S pe compui organici cristalini, ns i metoda CW este preferat uneori, de exemplu n scopul calibrrii experimentului CP/MAS, sau la nregistrarea de spectre 15N RMN-S, adic n cazurile n care nu este necesar aplicarea unor cmpuri rf de decuplare foarte intense. Pentru a obine spectre RMN-S 13C de calitate ale compusului studiat, parametrii caracteristici ai experimentului CP/MAS trebuie mai nti calibrai cu ajutorul unor compui de referin (standard). Compuii standard cel mai des utilizai n acest scop sunt adamantanul (calibrarea nivelelor de putere pe canalul carbonului) i glicina (ajustarea valorii unghiului magic). Ca i n cazul calibrrii puterilor pe canalul 1H, adamantanul prezint avantajul c se obin linii 13C RMN-S relativ nguste (2-3 Hz), ceea ce conduce la o sensibilitate spectral foarte bun, respectiv la un timp de acumulare scurt, de ordinul zecilor de secunde, pentru un experiment CP/MAS: n acest fel, adamantanul este considerat un compus ideal pentru procesul de calibrare a experimentului CP/MAS, deoarece acesta necesit n general 213

achiziionarea unui numr mare de spectre pn cnd sunt determinate valorile optime ale tuturor parametrilor de interes. n cazul fiecrui parametru optimizarea se face prin maximizarea intensitii liniilor RMN n spectrul achiziionat (n cazul particular al adamantanului avem dou linii poziionale la 29.5 i 38.5 ppm, determinate de gruprile CH i CH2 din molecul). Conform schemei experimentale din Fig. 9, intensitatea spectral obinut este maxim dac sunt ndeplinite simultan urmtoarele trei condiii: (i) pulsul p3 pe canalul protonilor este un puls 900, (ii) nivelurile de putere ale pulsurilor de contact p15 pe cele dou canale sunt astfel ajustate nct s ndeplineasc condiia Hartmann-Hahn de matching descris mai sus, i (iii) tehnica de decuplare utilizat s conduc la ngustarea maxim posibil pentru compusul dat. Corespunztor acestor elemente, trebuie deci calibrate puterile pl3, pl1, pl2 i pl12 (n condiiile n care se consider fixate valorile pulsurilor p3 i p15, iar metoda de decuplare utilizat pentru adamantan este CW). Plecnd de la aceste considerente, procedura de calibrare a experimentului CP/MAS poate fi descris pe scurt n felul urmtor: Pentru valorarea fixat a lui p3 se seteaz puterea pl3 (determinat anterior n procesul de calibrare a puteriolor pe canalul protonului) astfel nct aceasta s corespund unui puls de 900. Se seteaz valorile pl2 i pl12, pentru pulsul de contact pe canalul protonului, i respectiv cmpul de decuplare prin CW, astfel nct acestea s corespund unei valori a cmpului rf de 50 kHz: i n acest caz se utilizeaz rezultatele anterioare ale calibrrii puterilor pe canalul 1H. Pentru a evita posibile efecte de offset, frecvena de iradiere pe canalul f2 va fi cea corespunztoare frecvenei de rezonan a liniei adamantanului din spectrul 1H RMN-S. Se ajusteaz valoarea puterii pl1 a cmpului de contact pe canalul carbonului pn cnd se obine o intensitate maxim a liniilor RMN n spectrul CP/MAS achiziionat. Aceasta este etapa cea mai laborioas din cadrul procedurii. n particular, se pornete de la valori mari ale lui pl1 (de exemplu, 5 dB) i se scaneaz acest parametru n pai de 0.1 dB mergnd nspre valori mici. Setul de spectre obinut astfel furnizeaz aa-numit curba de matching Hartmann-Hahn, respectiv dependena puterii pe canalul 13C a intensitii spectrale, respectiv a eficienei procesului de transfer de polarizare prin CP. Curba de matching Hartmann-Hahn prezint cinci maxime corespunztoare celor cinci condiii menionate anterior. Valorile particulare ale parametrului pl1 pentru care se obin aceste maxime se transform n valori ale cmpului rf asociat utiliznd relaia 13C = 50 kHz +(-) nR, cu n = 0, 1, 2. 214

n final, pentru o ajustare mai fin a pulsului iniial de 900 pe canalul protonului se revine la primul pas, prin modificarea uoar a puterii pl3 n jurul valorii fixate iniial, i se reine acea valoare pentru care intensitatea spectral atinge un maxim absolut. Aceast etap este necesar deoarece valorile cmpului rf pe canalul 1H n general sunt determinate cu un grad de eroare mai mare prin experimentul de un puls dect cu ajutorul experimentului CP/MAS.

Experimentul CP/MAS cu parametri calibrai pe adamantan din punct de vedere al nivelurilor de putere, se utilizeaz n continuare pe glicin pentru ajustarea valoarii unghiului magic i pentru optimizarea pulsurilor p31 asociate decuplrii prin metoda TPPM. Alegerea acestui compus standard este motivat de faptul c el are un spectru RMN-S simplu care conine doar dou linii (deci sensibilitate spectral mare) dintre care una corespunde gruprii carbonil a crei lrgime este foarte sensibil la deplasri mici ale nclinrii axei de rotaie a probei fa de valoarea unghiului magic: acest efect se datoreaz anizotropiei mari a deplasrii chimice. n practic, se modifica uor nclinarea axei rotorului pn ce se obine un spectru 13C RMN-S a glicinei n care linia carbonilului (de la 176.5 ppm) are lrgime minim (implicit, amplitudine maxim). Dup acest pas este trecut se procedeaz n continuare la ajustarea pulsului p31 n secvena de decuplare heteronuclear prin TPPM pentru a se obine n final ngustarea maxim posibil a liniilor spectrale. Datorit faptului c glicina este o molecul relativ rigid n reeaua cristalin (aa cum sunt majoritatea compuilor organici) decuplarea prin CW la cmpuri mici, de ordinul a 50 kHz, nu mai poate produce o rezoluie spectral satisfctoare, astfel nct se prefer metoda TPPM la cmpuri intense (ideal pl12 ar trebui s corespund unor cmpuri de cel puin 100 kHz). Pentru valoarea setat a lui pl12, durata optim a pulsului p15 se apropie n general de cea a unui puls de 1800, astfel nct calibrarea lui p31 se face pornind de la aceast valoare de referin.

4.Bibliografie
1. 2. 3. 4. 5. 6. R.R. Ernst, G. Bodenhousen, A. Wokaun, Principles of Nuclear Magnetic Resonance n One and Two Dimensions, Oxford University Press, Oxford 1987 M.H. Levitt, Spin Dynamics: Basics of Nuclear Magnetic Resonance, Wiley 2008 J. Keeler, Understanding NMR Spectroscopy, Wiley 2010 T. Gullion, Introduction to High-Resolution Solid-State NMR, Elsevier Science 2007 H. Guenther, NMR Spectroscopy, Wiley 2001 Bruker Biospin Group, TOPSPIN User Manual, 2008

215

Spectroscopie de rezonan magnetic nuclear pe solide (RMN-S) Implementarea de metode avansate RMN-S pentru aplicaii pe sisteme moleculare organice n faza solid
C.S.I. dr. Claudiu Filip C.S.III. dr. Mihaela Alua Cuprins
1. Introducere ..........................................................................................................................216 2. Metode RMN-S 2D de separare pentru pe investigarea dinamicii transferului de polarizare 1H-13C .................................................................................................................219 3. Metode RMN-S 2D de corelare 13C-13C ..............................................................................226 4. Metode RMN-S 2D de corelare DQ (Double Quantum) SQ (Single Quantum) ............237 5. Bibliografie ..........................................................................................................................245

1. Introducere
n acest raport se vor prezenta n mod detaliat o serie de experimente RMN-S avansate, cu aplicaii n investigarea structurii sistemelor moleculare organice cristaline, metode ce au fost pn n prezent implementate i testate experimental pe infrastructura existent la UBB Cluj. Accentul va fi pus pe experimente RMN-S de dubl rezonan pe 13C. Vor fi ilustrate de asemenea tehnici bazate pe detecia 1H, ns doar n cazul acelor compui unde se obine o rezoluie spectral satisfctoare n condiiile tehnice date. Drept urmare, nu vor putea fi prezentate o serie de metode RMN-S intensiv utilizate n domeniu, de exemplu cele care implic lucrul simultan pe trei canale rf [1] (metode de tripl rezonan), sau metode de nalt rezoluie pe 1H, care necesit o electronic adaptat secvenelor de decuplare homonuclear [2] i/sau capuri de prob de tip ultra-fast MAS, care s permit rotaii ale probei pn la 70 kHz. Deoarece acestea sunt considerate ca fcnd parte din arsenalul de baz al metodologiei moderne RMN-S pe sisteme moleculare organice, recomandm studenilor aprofundarea lor cel puin la nivel teoretic (consultnd bibliografia indicat mai sus), chiar dac nu pot fi utilizate n practic la UBB Cluj. Introducerea metodelor se va face progresiv, n ordinea creterii complexitii lor: se vor descriere mai nti experimente care necesit nregistrarea de seturi de date bidimensionale (2D), dar care nu necesit transformarea lor n spectre 2D, i vom ajunge n final la prezentarea de metode care 216

furnizeaz informaii structurale pe baz de spectre RMN-S 2D de corelaie. n fiecare caz, se presupune c mai nti au fost parcuri paii prezentai n raportul anterior, respectiv c toi parametri experimentali relevani, i n special nivelurile de putere pe fiecare canal rf, au fost calibrate corespunztor. De asemenea, este de menionat c, pentru fiecare tehnic RMN-S avut n vedere, n afar de aspecte pur practice se va face i o scurt prezentare a fundamentelor teoretice pe care aceasta se bazeaz. Spre deosebire de varianta unidimensional, unde spectrul RMN se obine prin transformarea Fourier a FID-ului, n spectroscopia RMN bidimensional (2D), semnalul RMN este descris de o funcie care depinde de dou variabile de timp, t1 (corespunztor dimensiunii indirecte F1) i t2 (corespunztor dimensiunii directe F2). Pentru a se obine spectrul n frecven, n acest caz transformata Fourier trebuie aplicat de dou ori. Schema general pentru un experiment RMN bidimensional este redat n Fig. 1.

Figura 1: Schema de principiu a unui experiment RMN bidimensiuonal (2D)

n prima perioad, cea de preparare, se aplic unul sau mai multe pulsuri rf, n urma crora se genereaz o mrime fizic asociat sistemului de spini (de ex. polarizare transversal, coerente de mai multe cuante, etc.) care va evolua pe durata t1. Urmtoarea perioad perioada de mixing, const n aplicarea celui de-al doilea puls (sau pulsuri) de radiofrecven. Secvena de mixing are rolul cel mai important ntr-un experiment 2D, deoarece ea definete corelaiile care se stabilesc ntre mrimile care evolueaz n t1 i polarizarea transversal asociat fiecrui spin care se detecteaz n mod direct, prin intermediul semnalul RMN, pe durata lui t2. Aceast succesiune de perioade poart denumirea de secven de pulsuri 2D, iar informaia care se regsete n spectrul RMN depinde concret de tipul interaciunii care a fost selectat n perioadele de preparare i de mixing. Un spectru RMN 2D se obine n urmtorul mod: se aplic secvena de pulsuri pentru t1 = 0, se nregistreaz i se stocheaz FID-ul corespunztor acestei valori. Apoi se repet aceeai procedur pentru t1 egal cu multiplii ntregi ai perioadei de sampling t1 (adica t1, 2t1, 3t1nt1, unde n este de obicei cuprins ntre cteva zeci i cteva sute). n consecin, semnalul RMN bidimensional const dintr-un set de n FID-uri, i va depinde explicit de ambele variabile temporale, t1 i t2.

217

Figura 2: Exemple de spectre RMN 2D i modalitatea n care apar peakurile diagonale, respectiv cross-peakurile

Modul de apariie a peak-urilor n spectre RMN bidimensionale i interpretarea acestora vor fi descrise pe scurt n cele ce urmeaz. Astfel, dac ntr-un spectru 2D va aprea un peak poziionat la A n dimensiunea F1 i la B n dimensiunea F2 (aa numitele cross-peakuri), atunci pe durata perioadei de preparare s-a format un semnal care a evoluat cu frecvena A de-a lungul lui t1, iar pe durata perioadei de mixing acelai semnal a fost transformat cu ajutorul unei anumite secvene de pulsuri ntr-un alt semnal care evolueaz cu frecvena B pe durata t2. Un alt tip de peak-uri care se pot obine ntr-un spectru RMN 2D, numite peak-uri diagonale, corespund cazului n care frecvena de rezonan a unui semnal generat n timpul perioadei de preparare va rmne neafectat de pulsul (sau pulsurile) care alctuiete perioada de mixing. Multe dintre tehnicile RMN 2D utilizate n mod curent, genereaz spectre care conin ambele tipuri de peak-uri, de exemplu Fig. 2(c). n practic, n funcie de succesiunea de pulsuri aleas, se pot obine dou tipuri distincte de spectre RMN 2D: de separare, i respectiv de corelare [3]. n cazul spectrelor bidimensionale de separare, n dimensiunea F2 se obine spectrul izotrop al compusului studiat, iar n dimensiunea indirect, F1, se obine spectrul anizotrop al interaciunii recuplate, separat, pentru fiecare linie izotrop. Conform schemei generale a unui experiment 2D, ilustrat n Fig. 1, o secven de pulsuri specific spectroscopiei RMN 2D de separare corespunde cazului particular n care domeniul temporal indirect, t1, i perioada de mixing coincid. Spre deosebire de spectrele RMN 2D de separare, n cazul spectrelor de corelare ambele dimensiuni codific deplasrile chimice izotrope, iar interaciunea recuplat va genera peakuri de corelatie (cross-peakuri) ntre nucleele diferitelor grupri chimice dintr-un anumit compus. n funcie de tipul de experiment RMN de corelare utilizat, vor exista diferene n ceea ce privete (i) mrimea fizic asociat sistemului de spini (de exemplu coerente de una sau mai multe cuante), care va evolua n dimensiunea indirect F1, i (ii) interaciunea de spin recuplat pe durata perioadei de mixing. De 218

asemenea, experimentele bidimensionale pot fi clasificate i n funcie de tipul de nuclee implicate, i anume experimente de corelare homonucleare sau heteronucleare.

2. Metode RMN-S 2D de separare pentru pe investigarea dinamicii transferului de polarizare 1H-13C

Metoda RMN-S 2D bazat pe secvena CP-MAS clasic Exemplul cel mai ilustrativ al unei metode RMN-S 2D de separare este reprezentat de experimentul de recuplare a interaciunii dipolare heteronucleare C H cu ajutorul secvenei clasice CP-MAS ce are drept efect un transfer de polarizare ntre protoni i nucleele 13C din vecintate, cu eficiene care depind de distanele dintre spinii nucleari implicai. Secvena de pulsuri asociat acestui experiment este redat mai jos n Fig. 3, utiliznd reprezentarea schematic convenional din RMN, descris n raportul anterior. Pentru a face mai uoar o comparaie direct ntre aceast reprezentare schematic, i implementarea ei pe un spectrometru Bruker, n figur sunt mentionai explicit parametrii de timp (pulsuri, pn, i delay-uri, dn, sau <valoare> us), de putere, pln, i respectiv de faz, phn, inclui n programul de pulsuri cp-var asociat acestei secvene, i listat mai jos. Referitor la notaiile att n reprezentarea schematic, ct i n programul de pulsuri, se folosete aceeai convenie ca i n raportul anterior, i anume, variabilele notate cu albastru, rou i verde reprezint durate, niveluri de putere ale pulsurilor rf, i respectiv faze asociate acestor pulsuri. Toate celelalte elemente (comenzi, parametri adimensionali, etc.) sunt reprezentate cu negru.

Figura 3: Reprezentarea schematic a experimentului RMN 2D de investigare a transferului de polarizare 1H-13C prin intermediul secvenei CP-MAS clasice

219

# 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/cp-var" ;cp (TopSpin 2.0) ;basic cp experiment 1 ze 2 d1 do:f2 1u pl3:f2 (p3 ph3):f2 (1u pl1:f1) (1u pl2 f2) (vp ph1):f1 (vp ph2):f2 1u pl12:f2 ;go=2 ph31 cw:f2 go=2 ph31 cpd2:f2 1m do:f2 wr #0 HaltAcqu, 1m 1m if 1m ivp lo to 2 times td1 exit ph3= 1 3 ph1= 0 0 2 2 1 1 3 3 ph2= 0 ph31= 0 2 2 0 1 3 3 1

;pl12 is used here with cw ;pl12 is used here with tppm, and p30 the pulse

n esen, experimentul descris n Fig. 3 presupune nregistrarea unui set de date 2D, care const dintr-un numr N de semnale RMN 13C distincte, achiziionate prin intermediul secvenei CP-MAS clasice: la fiecare dintre cele N repetiii ale experimentului, secvenele CP-MAS efectiv utilizate difer ntre ele prin durata pulsului de contact. Valorile acestor pulsuri sunt stocate ntr-o aa-numit list de pulsuri (variable pulse list) care este apelat n cadrul programului de pulsuri prin comanda vp (variable pulse). Lista este cuprins n fiierul care este specificat n tabela parametrilor de achiziie. n programul de pulsuri, modul de achiziie 2D este specificat prin comenzile de incrementare i de repetiie (loop) specifice: if (increment file trece la un nou fiier unde va fi stocat urmtorul FID din cadrul setului de date 2D); ivp (increment variable pulse trece la urmtoarea valoare a pulsului de contact specificat n lista de pulsuri); lo to 2 times td1 (loop la linia 2, de un numr de ori specificat prin parametrul de achiziie td1) repet experimentul de N ori (N = td1) pentru a acumula toate datele prevzute n experimentul 2D. Dup achiziionarea celor N semnale RMN distincte, urmeaz procesarea datelor: concret, se aplic transformata Fourier de-a lungul dimensiunii directe (F2) prin intermediul comenzii xf2, i se obine astfel 220

setul de date 2D. Acesta este format din N spectre 13C CP-MAS, aezate n ordinea cresctoare a duratei pulsurilor de contact p15 utilizate. Pentru fiecare dintre liniile RMN din spectru, se reprezint grafic evoluia intensitii de linie n funcie de durata lui p15, obinndu-se n final aa-numitele curbe CP-MAS; proprietile caracteristice ale unei asemenea curbe descriu, pentru fiecare poziie chimic distinct a atomilor de carbon din sistemul molecular investigat, dinamica procesului de transfer de polarizare de la protonii nvecinai (n principiu, contribuii nsemnate vor avea cei situai pn la o distan de 2.5-3 ). n practic, innd cont de caracteristicile procesului de transfer de polarizare 1H -> 13C, pentru durate ale pulsului de contact p15 cuprinse n intervalul 0 200 s e preferabil utilizarea unei eantionri n pai egali (de exemplul, 5 10 s), deoarece n interiorul acestui domeniu temporal caracterul coerent al procesului de transfer este dominant, i se manifest prin apariia aa-numitelor oscilaii dipolare n curbele CP-MAS corespunztoare. Peste aceast valoare a lui p15 se pot utiliza creteri cu pai din ce n ce mai mari, astfel nct numrul de N de repetiii ale experimentului, care coincide cu numrul de puncte ce definesc curbele CP-MAS nregistrate, s fie meninut la o valoare rezonabil, 30-50. Pentru a putea caracteriza i parametrii relaxrii spin-reea n sistemul rotitor, care afecteaz dinamica procesului de transfer de polarizare 1H -> 13C la durate de ordinul milisecundelor, se recomand de asemenea nregistrarea curbei pn la valori ale pulsului de contact de 3 5 ms. n Fig. 4 este prezentat un set de date bidimensional nregistrat utiliznd tehnica descris mai sus n cazul particular al L-Alaninei. Transformata Fourier s-a aplicat doar n dimensiunea direct, obinndu-se spectrul izotrop al compusului, cu cele trei linii de rezonan caracteristice gruprilor CH, CH3, respectiv COOH. Considernd variaia intensitilor de linie cu poziia spectrului CP-MAS din setul de date 2D, n dimensiunea indirect se obin curbele de transfer de polarizare (CP) corespunztoare fiecrei grupri chimice: forma specific a fiecrei dintre aceste curbe reflect tria cuplajelor dipolare heteronucleare recuplate. Astfel, cu ct rata de cretere a unei astfel de curbe CP este mai mare i oscilaiile dipolare mai pronunate (vezi curba CP corespunztoare gruprii CH comparativ cu cele pentru CH3, respectiv COOH), cu att cuplajul dipolar heteronuclear asociat este mai puternic. Dac transformata Fourier se aplic i de-a lungul lui t1, n locul curbelor CP se vor obine aa-numitele spectre dipolare: cele dou modaliti de a extrage informaii despre parametrii interaciunii dipolare sunt ns echivalente. Procedura descris mai sus face parte dintr-o clas mai larg de metode RMN-S numite 221

de tip SLF (Separated Local Field Spectroscopy): n cadrul acestora, tehnica CP-MAS de recuplare a interaciunii dipolare heteronucleare este n general nlocuit cu tehnici mai sofisticate [4, 5], care s in cont de detaliile structurale dorite, i de prezena sau nu a ordonrii n probele investigate. n general, prin combinarea tehnicii de recuplare heteronuclear CP cu metode de decuplare homonuclear a protonilor, cum ar fi metodele LG (Lee-Goldburg) sau FSLG (Frequency-Switched Lee-Goldburg), se obine o recuplare eficient a interaciunii dipolare heteronucleare, n condiii de rotire a probei la unghi magic.

Figura 4: Set de date 2D obinut n cazul compusului L-alanina. n dimensiunea direct se aplic transformata Fourier i se obin liniile de rezonan ale gruprilor chimice din compus, iar n dimensiunea indirect sunt ilustrate curbele CP corespunztoare acestor grupri. Aceste curbe au fost nregistrate dup ce n prealabil puterile pe cele dou canale rf au fost calibrate la condiia n = -1 de matching Hartmann-Hahn.

Metoda Remote Protons CP-MAS O nou metod RMN-S 2D de separare este bazat pe experimentul anterior, ns extinde domeniul acesteia de aplicabilitate prin ncorporarea unei noi secvene n perioada de preparare; aceast secven numit CPPI (Cross-Polarization Polarization-Inversion) are drept scop generarea unei 222

stri iniiale diferit de polarizarea uniform 1H, cum este cazul experimentului CP-MAS clasic. Noua stare iniial const ntr-o distribuie neuniform a polarizrii protonilor, care poate fi creat cu ajutorul configuraiei experimentale format din cele dou blocuri CP ale secvenei CPPI de durate bine determinate, p15 i p16, iar faza celui de-al doilea bloc este inversat n raport cu faza primului.

Figura 5: Reprezentarea schematic a experimentului RMN 2D Remote Protons CP-MAS de investigare a transferului de polarizare 1H-13C de la protonii nelegai chimic de catonii din prob

# 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/rem_prot_cp" ;cp (TopSpin 2.0) ;remote protons CP-MAS experiment 1 ze 2 d1 do:f2 1u pl3:f2 (p3 ph3):f2 (1u pl1:f1) (1u pl2 f2) (p15 ph1):f1 (p15 ph2):f2 (p16 ph1):f1 (p16 ph6):f2 (vp ph1):f1 (vp ph8):f2 1u pl12:f2 ;go=2 ph31 cw:f2 go=2 ph31 cpd2:f2 1m do:f2 wr #0 HaltAcqu, 1m 1m if 1m ivp

;pl12 is used here with cw ;pl12 is used here with tppm, and p30 the pulse

223

lo to 2 times td1 exit ph3= 1 3 ph1= 0 0 2 2 1 1 3 3 ph2= 0 ph4= 2 ph31= 0 2 2 0 1 3 3 1

Alternnd fazele celor dou pulsuri CP care formeaz secvena CPPI se creeaz o stare iniial de polarizare egal cu zero att pentru nucleul 13C, ct i pentru protonii direct legai chimic de acesta. Ca o condiie necesar pentru ca n curbele de transfer de polarizare s fie cuantificat doar procesul de transfer de la protonii ndeprtai, secvena CPPI trebuie s aduc simultan la zero polarizarea spinului central 13C i a protonilor direct ataai, n timp ce polarizarea protonilor ndeprtai este meninut la o valoare ct mai mare. Pentru a verifica n ce msur aceast condiie este ndeplinit, am efectuat simulri numerice utiliznd programul Spinevolution. n acest scop, sistemul de spini ales este format dintr-un nucleu 13C nconjurat de 7 protoni, care aparin moleculei de L-Alanina. Pentru cazul gruprii CH rezultatele analizei sunt prezentate n Fig. 6: n aceste grafice este ilustrat evoluia polarizrii pentru fiecare spin din sistem n funcie de creterea timpului de inversie, p17, i pentru trei valori diferite ale frecvenei de rotaie, R = 5; 8, respectiv 15 kHz. Pentru sistemul de spini utilizat, primul bloc CP are o durata fix, p16 = 70 s, corespunztoare transferului maxim de polarizare de la protonul legat chimic de spinul central 13C. Dependena curbelor de polarizare

Figura 6: Simulri ale dependenei polarizrii de spin de timpul de inversie 2 din secvena de pulsuri CPPI pentru R = 5; 8 respectiv 15 kHz, n cazul gruprii CH din L-Alanina. Prin linie continu sunt reprezentate curbele de inversie ale polarizrii pentru spinul 13C (cu negru), respectiv a protonului legat chimic de acesta (cu rou). Cu linie punctat este reprezentat polarizarea remanent pe protonii ndeprtai, care aparin gruprii CH3 (albastru), respectiv NH3 (verde) din sistemul de spini considerat.

224

din Fig. 6 arat c polarizrile din cadrul gruprii CH (adic nucleului 13C i a protonul sau direct ataat) pot fi aduse simultan la zero pentru frecvene de rotaie a probei mai mari dect 5 kHz, iar valoarea efectiv a duratei pulsului p17 pentru care aceast condiie este ndeplinit depinde n mod explicit de valoarea frecvenei de rotaie: de exemplu pentru R = 8 kHz se obine un puls de contact p17 cu o durat de 42 s. n msura n care starea iniial dorit poate fi generat cu ajutorul secvenei CPPI, curbele de transfer de polarizare nregistrate experimental prin incrementarea duratei celui de-al treilea bloc CP din Fig. 5 se consider ca reflect doar contribuia protonilor ndeprtai. Pentru a verifica acest lucru, prediciile teoretice referitoare la procesul de transfer de polarizare de la protonii ndeprtai realizat prin noua metod Remote Protons CP-MAS, au fost testate experimental [6]. n acest scop, am extins configuraia utilizat n simulri numerice la un sistem de 10 spini (9 protoni i un nucleu 13C) din L-Alanina, iar curbele CP simulate au fost comparate cu cele experimentale. Molecula de L-Alanina a fost ales deoarece poziiile protonilor, i implicit distanele H-H i C-H, sunt determinate precis, prin difracie de neutroni (cu precizie de 0.003 ). Simulrile numerice au fost efectuate considernd dou cazuri distincte i anume: n primul caz se consider gruparea NH3 ca fiind rigid, iar n cel de-al doilea caz aceeai grupare se consider n regim de rotaie rapid n jurul axei sale. n ambele situaii gruparea CH3 este considerat a efectua o micare de rotaie rapid. Prin compararea curbelor CP-MAS simulate cu cele experimentale (Fig. 7)

Figura 7: Comparaia ntre curbele CP/MAS teoretice i experimentale corespunztoare nucleului 13C din gruparea CH din L-Alanina, obinute prin utilizarea secvenei CP clasice (curbele roii), respectiv a secvenei de transfer de la protonii nelegai (curbele cu albastru). Curbele experimentale sunt reprezentate prin cercuri, iar cele simulate prin linie punctat (pe un sistem format din 8 spini), respectiv linie continu (sistem format din 10 spini). Gruparea CH3 se consider a efectua o micare de rotaie rapid n ambele cazuri, iar gruparea NH3 se consider n aproximaie rigid n (a), respectiv n regim de rotaie rapid n (b).

225

se observ o foarte bun concordan n cazul n care gruparea NH3 este considerat quasi-rigid. Totui, exist unele mici diferene ntre curba calculat i cea msurat, diferene care cel mai probabil se datoreaz faptului c gruparea NH3 efectueaz n realitate o micare de rotaie lent (la scal de timp a procesului de transfer de polarizare, de ordinul s). Cea mai important concluzie care rezult n urma comparrii efectuate este sensibilitatea crescut a curbei Remote CP-MAS la dinamica molecular prezent n sistemul molecular studiat, n timp ce curba CP clasic nu este att de sensibil la detalii ale micrii moleculare caracteristice gruprii NH3.

3. Metode RMN-S 2D de corelare 13C-13C

Metoda Proton Driven Spin-Diffusion Metoda RMN-S 2D numit Proton Driven Spin Diffusion (PDSD) este o metod de corelare: dup cum se observ din schema experimental asociat acestui experiment (Fig. 8), pe durata ambelor perioade de evoluie indirect i direct, t1 i t2, magnetizarea transversal 13C evolueaz n condiii de decuplare heteronuclear prin TPPM aplicat pe canalul protonilor i rotaie a probei n jurul unghiului magic, astfel nct ambele dimensiuni spectrale n spectrul RMN 2D vor codifica preponderent informaii cu privire la deplasrile chimice izotrope ale carbonilor din sistemul molecular investigat (cu o lrgire rezidual determinat de imperfeciunea metodei de decuplare). Pe durata perioadei de mixing, se genereaz o stare de polarizare longitudinal

Figura 8: Reprezentarea schematic a experimentului RMN 2D Proton Driven Spin-Diffusion (PDSD) de investigare a transferului de polarizare 13C-13C mediat de interaciunea dipolar cu protonii

226

diferenial, care va fi transferat ntre spinii 13C ntre care exist cuplaje dipolare suficient de puternice. Din aceast cauz, n afar de peakurile diagonale, n spectrul RMN 2D obinut prin metoda PDSD apar i cross-peakuri de corelaie ntre oricare dou poziii chimice distincte ntre care se stabilete transfer de polarizare (spin diffusion), cu intensiti care depind de distana la care se afl nucleele 13C corespunztoare.
# 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/sp-diff" ;cp (TopSpin 2.0) ;13C-13C spin diffusion experiment 1 ze 2 d1 do:f2 1u pl3:f2 (p3 ph3):f2 (1u pl1:f1) (1u pl2 f2) (p15 ph1):f1 (p15 ph2):f2 1u cpd2:f2 1u pl12:f2 d0 pl4:f1 1u do:f2 (p1 ph4):f1 d5 (p1 ph5):f1 1u pl12:f1 go=2 ph31 cpd2:f2 1m do:f2 wr #0 HaltAcqu, 1m 1m if 1m in0 lo to 2 times td1 exit

; tau mix ;pl12 is used here with tppm, and p30 the pulse

ph3= 1 3 ph1= (4) 0 0 2 2 ph2= 0 ph4= 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 2 2 2 2 2 2 ph5= 1 1 1 1 3 3 3 3 ph31= 0 2 2 0 1 3 3 1

Transferul de polarizare 13C-13C n experimentul PDSD este iniiat de interaciunile dipolare homonucleare ntre spinii nucleari corespunztori, ns el se produce prin intermediul protonilor situai ntre aceti carboni. Deoarece aceste cuplaje dipolare C-C sunt n general slabe, durata perioadei de mixing, d5 n secvena de pulsuri ilustrat mai sus, trebuie s fie 227

relativ mare, ntre cteva sute de s pn la 10-100 ms, pentru a avea un transfer eficient n domeniul de distante 2-5 . Din aceast cauz, metoda este preponderent utilizat pe probe marcate uniform cu 13C: cu toate acestea, exist i cteva cazuri n care PDSD a fost demonstrat i pe probe cu 13C n abunden natural, ns n aceste cazuri este nevoie de durate de mixing de ordinul secundelor pentru a identifica cross-peakuri cu intensiti msurabile. Cu privire la implementarea practic a unui experiment RMN 2D, introduse prin acest exemplu, trebuie menionate urmtoarele aspecte: (i) sintaxa ph1= (4) 0 0 2 2 utilizat n programul de pulsuri asociat secvenei PDSD pentru faza pulsului de contact p15 pe canalul 13C specific procedura numit TPPI (Time Proportional Phase Incrementation) aplicat pentru nregistarea semnalului n cuadratur pe dimensiunea indirect n practic nseamn c la fiecare experiment nou n dimensiunea indirect fazele vor fi incrementate cu 3600/4 = 900 fa de experimentul anterior (adic dac pentru primul FID din setul de date 2D se utilizeaz fazele 0 0 2 2 pentru pulsul p15, al doilea FID va avea fazele 1 1 3 3, i aa mai departe; (ii) pasul temporal n dimensiunea indirecta este denumit in0 (increment delay 0), iar durata total de achiziie indirect este notat cu aq1, i se calculeaz nmulind incrementul in0 cu numrul de puncte al semnalului nregistrat n dimensiunea indirect, respectiv td1.

Figura 9: Spectru 13C CP-MAS pe L-Tirozina HCl, i o reprezentare schematica a atribuirii liniilor pentru cele 7 poziii chimice distincte ale carbonilor din molecula

228

n final vom ilustra utilizarea metodei PDSD cu rezultatele experimentale obinute n cazul particular al compusului L-Tirozina HCl, marcat uniform cu 13C. Mai nti prezentm n Fig. 9 spectrul 13C RMN-S 1D obinut prin CP-MAS la o frecven de rotaie a probei de 10 kHz. Atribuirea liniilor spectrale corespunde indexrii poziiilor de carbon din reprezentarea schematic a moleculei de L-Tirozina inclus n aceeai figur. Am ales acest caz particular pentru c ne permite comportaii n cadrul unor domenii de distane internucleare 13C-13C scurte (1.5 ntre carboni direct legai chimic), medii (3-4 , de exemplu ntre carbonii alifatici i cei de pe inelul benzenic), i respectiv lungi (4-5.5 , ntre C1 i C7 sau C8). Posibilitatea de a estima astfel de distante C-C din spectre PDSD de corelaie 13C-13C este ilustrat n continuare prin exemplele prezentate n Fig. 10. Primul corespunde unei durate de mixing scurte, de 300 s, i evideniaz faptul c la aceast scal de timp transferul de polarizare este eficient doar pe distane scurte, ntre carbonii direct legai chimic. Utilitatea practic a unui asemenea spectru este evident, respectiv identificarea conectivitilor chimice n cazul unui compus nou, i pe aceast cale este un instrument extrem de util n procesul de atribuire spectral.

Figura 10: Spectre RMN 2D de corelaie 13C-13C obinute pe L-Tirozina aplicnd metoda PDSD; ele ilustreaz dinamica procesului de transfer de polarizare la durate de mixing scurte (300 s), i respectiv lungi (5 ms)

Cel de-al doilea spectru PDSD ilustrat n Fig. 10 corespunde unei perioade de mixing mult mai mari, de 5 ms, i este reprezentativ pentru situaia n care transferul de polarizare se reduce pe distane mult mai mari, pn la 5 , dup cum se poate observa din prezena peakului de corelaie C1-C7. Astfel de spectre sunt utile pentru a extrage constrngeri structurale utile pentru investigarea conformaiei moleculare n sistemul investigat. 229

Metoda CHHC Metoda CHHC pe care o vom discuta n continuare permite determinarea distanelor 1H-1H, cu rezoluie nalt datorit implementrii n cadrul spectroscopiei RMN-S 2D de corelaie 13C-13C. Metoda este demonstrat efectiv pe L-TirozinaHCl sintetizat sub form poli-cristalin i marcat uniform cu 13C. L-TirozinaHCl a fost aleas drept sistem model deoarece spectrul 13C RMN-S 1D prezint o rezoluie suficient de bun pentru a putea separa liniile corespunztoare tuturor gruprilor chimice din molecula (Fig. 9), iar structura sa cristalin este bine caracterizat. n Fig. 11 este ilustrat secvena de pulsuri asociat metodei CHHC. Experimentul ncepe cu prepararea unei stri iniiale prin transfer de polarizare prin CP de la 1H la 13C. Polarizarea transversal astfel creat evolueaz sub influena deplasrilor chimice izotrope al carbonilor pe durata perioadei de evoluie indirect, t1, n condiii de decuplare heteronuclear prin TPPM pe canalul 1H. Polarizarea 13C care a evoluat cu deplasrile chimice izotrope corespunztoare fiecrei poziii distincte din molecul este apoi transferat prin intermediul unei perioade scurte (65 s) de cross-polarizare (CP) a protonilor direct conectai chimic. Polarizarea transversal astfel obinut este apoi adus de-a lungul direciei z (este transformat n polarizare longitudinal) prin aplicarea unui puls /2 asupra spinilor 1H. Deoarece polarizrile 1H astfel obinute nu au aceeai valoare la toi protonii, pe durata perioadei de mixing, tmix, se va realiza o redistribuire a acestora prin intermediul aa-numitului proces de schimb de magnetizare, i se genereaz astfel cross-peakuri a cror intensitate este proporional cu cantitatea de

Figura 11: Reprezentarea schematic a experimentului RMN 2D CHHC de investigare a transferului de polarizare 1H-1H codificat n spectre de corelaie 2D 13C-13C

230

polarizare schimbat de protonii corelai. Deoarece schimbul de magnetizare se datoreaz interaciunilor dipolare 1H-1H, intensitatea fiecrui cross-peak obinut codific informaii cu privire la tria cuplajului dipolar dintre protonii implicai si, implicit, cu privire la distanele internucleare dintre acetia. Dup parcurgerea etapei de mixing urmeaz transformarea polarizrii longitudinale n polarizare 1H transversal (prin aplicarea a inc unui puls /2 pe canalul 1H), iar aceasta apoi transferat ctre nucleele 13C direct conectai chimic (prin intermediul unei perioade scurte de CP, similar celei prin care s-a realizat transferul 13C->1H iniial). n final, polarizarea transversal 13C este detectat sub form de semnal RMN pe durata perioadei de evoluie direct, t2. Detecia semnalului se face de asemenea n condiii de nalt rezoluie, adic se urmrete evoluia polarizrii transversale 13C sub aciunea deplasrilor chimice izotrope asociate carbonilor din prob, n condiii de decuplare heteronuclear prin TPPM.
# 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/chhc" ;cp (TopSpin 2.0) ;13C-13C spin diffusion experiment 1 ze 2 d1 do:f2 1u pl3:f2 (p3 ph3):f2 (1u pl1:f1) (1u pl2 f2) (p15 ph1):f1 (p15 ph2):f2 1u cpd2:f2 1u pl12:f2 d0 1u do:f2 1u pl2:f2 (p16 ph5):f1 (p16 ph4):f2 1u pl3:f2 p3:f2 ph8 d5 p3:f2 ph9 1u pl2:f2 (p16 ph7):f1 (p16 ph6):f2 1u pl12:f1 go=2 ph31 cpd2:f2 1m do:f2 wr #0 HaltAcqu, 1m 1m if 1m in0

; tau mix

;pl12 is used here with tppm, and p30 the pulse

231

lo to 2 times td1 exit ph3= 0 0 2 2 1 1 3 3 ph1= (4) 1 ph2= 3 3 3 3 0 0 0 0 ph4= 3 1 ph5= 1 ph6= 1 ph7= 1 1 3 3 2 2 0 0 ph8= 0 ph9= 2 ph31= 3 1 3 1 0 2 0 2

Un spectru CHHC tipic este ilustrat n Fig. 12, unde este considerat cazul particular al spectrului 2D de corelaie 13C-13C nregistrat la o valoare tmix de 50 s, utiliznd o fereastr spectral care se limiteaz la carbonii protonai (indexai conform schemei din Fig. 9). Corelaiile care se stabilesc ntre protonii asociai diferitelor poziii de carbon din molecul sunt identificate n spectrul CHHC prin apariia cross-peakurilor care conecteaz poziiile chimice corespunztoare. Deoarece mecanismul de stabilire a corelaiilor n spectre CHHC se bazeaz pe schimbul de magnetizare longitudinal 1H-1H determinat de interaciunea dipolar, amplitudinea fiecrui cross-peak va fi o msur a triei acestui cuplaj i, implicit, a distanei internucleare dintre protonii asociai poziiilor de carbon corelate. Acest mecanism este exemplificat n Fig. 12 cu corelaii ale carbonului A (a se vedea liniile punctate). n particular, se observ apariia unui cross-peak intens ntre A i carbonul C, ns este de remarcat de asemenea lipsa uni peak de corelaie similar cu carbonul din poziia B. Din punct de vedere calitativ, acest rezultat este n perfect concordan cu distanele intra-moleculare dintre protonii conectai chimic de acetia, i anume: 3.2 ntre protonii cei mai apropiai de carbonii A i C, i respectiv de 4.8 pentru ceilali doi protoni prezentai n exemplul din Fig. 12. O analiz cu caracter cantitativ relevant pentru determinarea de distane 1H-1H cu ajutorul metodei CHHC trebuie ns s ia n considerare i alte efecte care influeneaz intensitile cross-peakurilor din spectru: pentru aceasta am elaborat un model teoretic al dinamicii de spin n condiii specifice experimentului CHHC [7]. Rezultatele modelrii ne-au permis mbuntirea procesului de analiz a datelor experimentale, prin introducerea de corecii adecvate pentru o serie de procese perturbative, i anume: (i) caracterul neselectiv al transferului de polarizare 1H<->13C pe durata blocurilor CP care flancheaz perioada de transfer de magnetizate (tmix n Fig. 11), (ii) efectul protonilor care nu contribuie direct la semnalul RMN-S detectat (protonii care nu sunt legai chimic de carbon, i respectiv protonii din molecule nemarcate izotopic cu 13C), i 232

Figura 12: Spectru RMN 2D de corelaie 13C-13C obinute pe L-Tirozina marcat uniform cu 13C aplicnd metoda CHHC; spectrul a fost obinut pentru o durat de mixing de 50 s i ilustreaz modul n care dinamica procesului de transfer de polarizare 1H-1H (si implicit distana dintre protonii implicai) este codificat prin intensitatea cross-peakurilor corespunztoare din spectrul de corelaie 2D.

Figura 13: Curbe CHHC reprezentative pentru protoni cu contacte intermoleculare scurte (de exemplu protonul legat de C5 de pe inelul aromatic), i respectiv lungi (protonii ataai lui C2) n urma mpachetrii moleculelor de L-Tirozina n reeaua cristalin (figura din dreapta)

233

(iii), efectul multiplicitii protonice pentru diferite grupri chimice din sistem (CH, CH2, CH3). Coreciile introduse conduc la creterea semnificativ a gradul de precizie cu care sunt estimate distanele proton-proton din spectre RMN-S de tip CHHC, n particular prin intermediul aa-numitelor curbe CHHC extrase dintr-un set de astfel de spectre nregistrate pentru diferite valori ale timpului de mixing (Fig. 13). n aceast figur ilustrm comportamentul observat pentru transferul de polarizare n care sunt implicai protonii ataai poziiilor de carbon C2, i respectiv C5 din molecula de L-Tirozin. Metoda CHCC Avnd n vedere rezoluia spectral limitat a protonilor n experimente RMN-S 2D de tip HETCOR, care sunt utilizate n mod tradiional pentru investigaii structurale bazate pe determinarea de distante C-H, am proiectat i implementat practic un nou tip de experiment de corelare 13C-13C, numit CHCC: acesta prezint avantajul de a cuantifica pe ambele dimensiuni spectrale deplasri chimice ale nucleelor 13C, adic spectre de nalt rezoluie. Informaia codificat n acest tip de spectre se refer tot la cuplajele dipolare 1H-13C, iar procesul care st la baza experimentului CHCC este i n acest caz transferul de polarizare proton-carbon. n mod similar cu metoda CHHC, unde transferul de polarizare este utilizat pentru a codifica cuplajele dipolare 1H-1H, metoda CHCC se aplic n cazul compuilor uniform marcai cu 13C.

Figura 14: Reprezentarea schematic a experimentului RMN 2D CHCC de investigare a transferului de polarizare 1H-13C codificat n spectre de corelaie 2D 13C-13C

# 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/chcc" ;cp (TopSpin 2.0)

234

;13C-13C spin diffusion experiment 1 ze 2 d1 do:f2 1u pl3:f2 (p3 ph3):f2 (1u pl1:f1) (1u pl2 f2) (p15 ph1):f1 (p15 ph2):f2 1u cpd2:f2 1u pl12:f2 d0 1u do:f2 1u pl2:f2 (p16 ph5):f1 (p16 ph4):f1 (p17 ph7):f1 (p17 ph6):f2 1u pl12:f1 go=2 ph31 cpd2:f2 1m do:f2 wr #0 HaltAcqu, 1m 1m if 1m in0 lo to 2 times td1 exit ph3= 1 3 1 3 1 3 1 3 ph1= (4) 0 ph2= 0 ph4= 1 ph5= 0 ph6= 1 ph7= 1 1 3 3 2 2 0 0 ph31= 1 3 3 1 2 0 0 2

;pl12 is used here with tppm, and p30 the pulse

Secvena de pulsuri corespunztoare metodei CHCC (Fig. 14) const n trei blocuri CP distincte, dintre care ultimele dou formeaz perioada de mixing a experimentului. Pentru a obine rezoluie nalt, astfel nct liniile de rezonan specifice fiecrei grupri chimice s fie separate, att n dimensiunea direct, ct i n cea indirect, polarizarea de spin va evolua n condiii de decuplare heteronuclear prin TPPM. Informaii cu privire la eficiena procesului de transfer de polarizare de la nuclee individuale 1H la toate nucleele 13C aflate n vecintate sunt codificate n perioada de mixing. Primul bloc CP din perioada de mixing este unul de durat scurt, astfel nct polarizarea fiecrui 13C este transferat n mod selectiv doar ctre protonul (protonii) direct legai. Pe durata celui de-al doilea bloc CP din secvena de mixing transferul de polarizare 1H-13C se realizeaz n mod clasic, 235

ctre toate nucleele de carbon aflate n vecintate, n funcie de distanele carbon-proton individuale. Deoarece selectivitatea metodei CHCC poate fi afectat de influena polarizrii iniiale a carbonului, Sz, i de polarizarea rmas pe canalul carbonilor dup pulsul CP scurt (din cauza c aceast polarizare nu se transfer n ntregime protonilor direct legai) se impune ca asupra secvenei CHCC s se aplice procedeul de phase cycling, conform programului de pulsuri asociat schemei experimentale din Figura 14. Ca i n cazul celorlalte dou metode de corelare prezentate mai sus, informaiile extrase n urma aplicrii schemei experimentale CHCC sunt codificate n spectre 2D de corelaie 13C-13C, Fig. 15. Cross-peakurile CHCC sunt generate conform urmtoarei scheme: (i) primul pas este format dintr-un bloc CP standard, urmat de evoluia pe durata t1 a polarizrii 13C sub aciunea interaciunii de ecranare chimic i n condiii de decuplare heteronucler prin TPPM; (ii) aplicarea unui bloc CP de durat scurt, aleas astfel nct polarizarea de spin s fie transferat de la nucleele de 13C doar la protonii direct legai; (iii) incrementnd durata ultimului puls CP (tmix) polarizarea 1H

Figura 15: Spectru RMN 2D de corelaie 13C-13C obinute pe L-Tirozina marcata uniform cu 13C aplicnd metoda CHCC pentru valori ale ultimului puls de contact (p17) de 0.5 ms (a), i respectiv 1 ms (b); spectrele 1D de mai jos reprezint felii de-a lungul dimensiunii directe ce corespund poziiilor de carbon C2 i C8, iar prin asterisk este marcat n fiecare caz evoluia cross-peakului specificat.

236

se transfer att nucleelor 13C direct legate de protonii polarizai, ct i celor aflate n vecintate, rata de transfer fiind proporional cu 1/r3, unde r este disanta 1Hi - 13Cj. Eficiena transferului de polarizare ctre nuclee 13C individuale este reflectat n intensitatea cross-peakurilor obinute. Spectrele bidimensionale CHCC ale L-TyrozineiHCl uniform marcate 13C pentru timpi de mixing de 0.5 ms, respectiv 1 ms sunt prezentate n cu Fig. 5.6(a), respectiv (b). Distanele intra-moleculare 1H-13C acoper un interval larg de valori, de la 2.13 (H7-C8), la 5.65 (H3-C8). Discuia rezultatelor experimentale se va concentra doar pe distane intermoleculare proton-carbon mai mici de 6 . La o analiz atent a spectrelor CHCC se poate observa c cross-peakurile cele mai intense (C7-C8, C3-C5, C2-C4) corespund celor mai mici distane internucleare 1H-13C, situate n intervalul 2.15 2.20 . Acest lucru arat c pentru timpii de mixing alei (tmix = 0.5, respectiv 1 ms) spectrele codific informaii structurale despre contactele intramoleculare scurte, fiind n bun concordan cu datele teoretice (Figura 5.6 b). Totui, cross-peakurile datorate corelaiilor ntre spini aflai la distane mai mari sunt i ele bine conturate, spre exemplu C7-C5(C4) (pentru distana C7-H5(H4) de 2.7 ), C3-C4 (3.9 ), i C2-C7 (4.68 ).

4. Metode RMN-S 2D de corelare DQ (Double Quantum) SQ (Single Quantum)

Metoda INADEQUATE Metoda numit INADEQUATE (Incredible Natural Abundance Double Quantum Transfer Experiment) este o metod RMN-S 2D de corelatie 13C-13C n cadrul creia n perioada de preparare se genereaz coerente de dou cuante (DQ Double Quantum), utiliznd cuplajul J dintre diferite poziii chimice n molecula investigat. Secvena de pulsuri asociat experimentului INADEQUATE este redat n Fig. 16. Experimentul genereaz polarizare transversal a spinilor 13C prin secvena CP-MAS: cu ajutorul pulsului de 900 aplicat dup pulsul de contact pe canalul carbonului, aceasta este transformat n polarizare longitudinal care apoi este utilizat pe durata aplicrii secvenei INADEQUATE (Fig. 16b) pentru a genera coerenele DQ. Secvena INADEQUATE const n dou pulsuri de 900 separate de o evoluie liber pe durata perioadei de mixing, tmix, iar la jumtatea acestei perioade se aplic un puls de 1800, pentru a refocaliza evoluia cu deplasarea chimic 13C la sfritul procesului de generare a coerenelor DQ. n dimensiunea indirect, aceste coerene evolueaz cu o frecven egal cu suma deplasrilor chimice asociat spinilor corelai, 1+2, iar n dimensiunea direct ele dau natere semnalelor izotrope corespunztoare ambilor spini, adic 1 i 2. n prealabil, se mai aplic o dat secvena INADEQUATE care va reconverti coerenele DQ care au evoluat pe durata lui t1 n coerene 237

de tip Single Quantum (SQ). n cazul nucleelor 13C, cuplajul J are valori semnificative pentru a produce coerente DQ n general ntre poziii direct conectate prin legturi chimice: din aceasta cauz, n exemplul de spectru INADEQUATE prezentat n Fig. 17 nu va aprea cross-peakul corespunztor coerentei 1+3, adic ntre nucleele C1 i C3.

Figura 16: Reprezentarea schematic a experimentului RMN 2D INADEQUATE utilizat pentru investigarea eficienei procesului de generare a coerenelor Double Quantum (DQ) 13C-13, codificat n spectre de corelaie 2D 13C-13C

# 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/inadequate" ;cp (TopSpin 2.0) ;13C-13C INADEQUATE experiment 1 ze 2 d1 do:f2 1u pl3:f2 (p3 ph3):f2 (1u pl1:f1) (1u pl2 f2) (p15 ph1):f1 (p15 ph2):f2 1u (pl12:f2) (pl4:f1) (p1 ph4):f1 1u cpd2:f2 (p1 ph5):f1 d5 (2p1 ph6):f1 d5 (p1 ph7):f1

238

d0 (p1 ph8):f1 d5 (2p1 ph9):f1 d5 (p1 ph10):f1 1m do:f2 wr #0 HaltAcqu, 1m 1m if 1m in0 lo to 2 times td1 exit ph3= 1 1 1 1 3 3 3 3 ph1= 0 ph2= 0 ph4= 3 3 3 3 1 1 1 1 ph5= (8) 0 2 4 6 ph6= (8) 0 2 4 6 ph7= (8) 4 6 0 2 ph8= 1 ph9= 1 ph10= 3 ph31= 0 2 0 2 2 0 2 0

Figura 17: Exemplu ilustrativ de spectru RMN 2D INADEQUATE: peakurile de corelaie ntre dou poziii chimice, i i j, corespund formrii unei coerene DQ care evolueaz n dimensiunea indirect cu frecvena i + j i indic conectivitatea chimic direct ntre carbonii corespunztori

239

Datorit particularitilor sale, metoda INADEQUATE este intens utilizat n investigaiile structurale din chimia organic, n scopul stabilirii conectivitilor chimice dintre diferitele grupri prezente n molecula investigat. Un exemplu relevant pentru acest tip de aplicaii practice ilustrat n Fig. 18 corespunde spectrului 13C INADEQUATE nregistrat pe acetatul de colesteril (C29H48O2), n abunden natural. n stare solid, aceast molecul prezint o structur cristalin puternic ordonat, care conine dou molecule n unitatea asimetric. Datorit acestui fapt, spectrul 13C unidimensional conine 58 de linii RMN (fiecrei poziii individuale a unui nucleu 13C ii va aparine o linie de rezonan dublat), majoritatea situate n regiunea spectral 10 60 ppm. n urma analizei spectrului 2D INADEQUATE s-au determinat toate corelaiile posibile ntre nucleele de carbon din molecul, concluzionndu-se asupra acurateei metodei INADEQUATE n caracterizarea conectivitilor chimice n sisteme moleculare complexe, n abunden natural [8].

Figura 18: Spectrul RMN 2D de corelare corespunztor acetatului de colesteril n abunden natural (2 molecule pe unitatea asimetric) obinut cu ajutorul secvenei de pulsuri INADEQUATE

240

Metoda 1H-1H DQ-MAS Metodele bazate pe excitarea coerentelor DQ se pot aplica i n cazul protonilor, unde rezoluia spectral este asigurat prin rotaia rapid n jurul unghiului magic. Spre deosebire de experimentul INADEQUATE prezentat anterior, n cazul metodelor 1H-1H DQ-MAS coerenele de dou cuante se genereaz interaciunile dipolare homonucleare 1H-1H recuplate pe durata perioadei de excitare i reconversie cu ajutorul unor secvene de pulsuri specifice. Drept urmare, schema general a experimentului 1H-1H DQ-MAS (Fig. 19) este aceeai ca i n cazul INADEQUATE, singura deosebire fiind secvena de pulsuri aplicat pentru a genera coerene DQ, i respectiv de a le reconverti la coerene SQ, detectabile direct. n practic, au fost dezvoltate numeroase metode de excitare DQ pentru protoni, unele implicnd aciunea continu a cmpurilor rf, iar altele aplicarea de pulsuri rf intense: toate au ns n comun sincronizarea duratei secvenei de excitare DQ cu perioada de rotaie a probei n jurul unghiului magic, condiie necesar pentru a realiza o recuplare eficient a interaciunilor dipolare 1H-1H. n prezentul raport vom considera aa-numita secven BABA (Back to Back) [9], i respectiv o versiune perfecionat a ei, BABA2, care conine dou cicluri BABA cu fazele relative astfel proiectate nct s minimizeze efectul evoluiei sub aciunea deplasrilor chimice 1H pe

Figura 19: Reprezentarea schematic a experimentului RMN 2D 1H-1H DQ-MAS utilizat pentru investigarea eficienei procesului de generare a coerenelor Double Quantum (DQ) 1H-1H , codificat n spectre de corelaie 2D 1H-1H; pentru excitarea coerenelor ilizeaz secvena numita BABA2

241

durata perioadei de excitare/reconversie. Fiecare ciclu BABA conine dou perechi de pulsuri de 900 alipite ntre ele, avnd o separare ntre ele egal cu o jumtate de perioad de rotaie, astfel nct duratele implicate n Fig. 19 sunt tmix = 2tBABA = 2R
# 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/dq-baba" ;cp (TopSpin 2.0) ;1H-1H DQ-MAS experiment 1 ze 2 d1 1u pl1:f1 (p1 ph1):f1 d1 (p1 ph1):f1 1u (p1 ph2):f1 d1 (p1 ph3):f1 1u (p1 ph1):f1 d1 (p1 ph1):f1 1u (p1 ph3):f1 d1 (p1 ph2):f1 d0 1u (p1 ph4):f1 d1 (p1 ph4):f1 1u (p1 ph5):f1 d1 (p1 ph6):f1 1u (p1 ph4):f1 d1 (p1 ph4):f1 1u (p1 ph6):f1 d1

242

(p1 ph5):f1 go=2 ph31 wr #0 HaltAcqu, 1m 1m if 1m in0 lo to 2 times td1 exit ph1= (4) 0 2 4 6 ph2= (4) 2 4 6 0 ph3= (4) 4 6 0 2 ph4= 0 ph5= 1 ph6= 3 ph7= 1 1 3 3 2 2 0 0 ph31= 1 3 3 1 2 0 0 2

Aplicaiile practice ale metodei 1H-1H DQ-MAS vor fi ilustrate n continuare, considernd cazul relativ simplu al spectrului de corelaie 1H-1H nregistrat pe L-alanina (Fig. 20), unde am utilizat secvena BABA2, la o frecven de rotaie a probei n jurul unghiului magic de R = 30 kHz. Eficiena maxim s-a obinut pentru o singur secven BABA2. Analiznd spectrul se constat i similariti cu un spectru tipic INADEQUATE, dar i deosebiri. Concret, asemnrile sunt legate de faptul c liniile de rezonan corespunztoare spinilor 1H corelai, de exemplu i i j n dimensiunea direct, evolueaz cu o frecven egal cu suma deplasrilor chimice asociat spinilor, i+j, n dimensiunea indirect (DQ). n spectrul DQ-MAS al L-alaninei acesta este cazul pakurilor de corelaie (1,2), (1,3) i (2,3) corespunztoare coerenelor DQ care se genereaz ntre protoni aparinnd gruprilor (CH3, CH), (CH3, NH3), i respectiv (CH, NH3). Deosebirile sunt legate de faptul c n spectre 1H-1H DQ-MAS pot aprea i peakuri diagonale, datorit multiplicitii protonilor dintr-o anumit grupare chimic, cum este cazul gruprilor CH3 (1) i NH3 (3) n spectrul din Fig. 20, dar i din cauza triei mari a cuplajelor dipolare 1H-1H care permit evidenierea corelaiilor dintre protonii CH (2) aparinnd la dou molecule vecine (corelaii intermoleculare): n cazul peakurilor diagonale j, frecvena de evoluie n dimensiunea DQ va fi de 2j.

243

Figura 20: Spectrul RMN 2D de corelare 1H-1H DQ-MAS achiziionat utiliznd secvena BABA2 pe L-Alanina.

Informaii mai cantitative cu privire la distanele internucleare dintre protonii din prob se pot obine din analiza spectrelor 1H-1H DQ-MAS comparnd intensitile relative ale peakurilor de corelaie. De exemplu, peakului diagonal (21, 1) a crui intensitate n uniti arbitrare este de 20 u.a., corespunde unor distane intranucleare mici, de ~1.7 , ntre protonii gruprii CH3, care formeaz o reea compact de spini. Pentru cross-peakurile (1+ 2, 2) i (3+ 2, 2), intensitile sunt comparabile, i anume 19 u.a. n primul caz, pentru coerenele de dou cuante generate ntre gruprile CH-CH3, care implic o distan intramolecular de ~2.3 , i respectiv de 18.5 u.a n cazul gruprilor CH-NH3 cu distana intramoleculara de ~2.6 . Prin comparaie, intensitatea de ~ 4 u.a. obinut pentru peakul diagonal (2, 2), reflect o distan semnificativ mai mare de ~2.3 ntre protonii gruprii CH aparinnd la dou molecule vecine din reeaua cristalin a L-Alaninei. n consecin, o analiz riguroas a intensitilor relative ale peakurilor din spectrul 2D 1H-1H DQ-MAS ne poate conduce la 244

cuantificarea tuturor proximitilor proton-proton din proba investigat, rezultnd caracterul aplicativ al acestei metode n caracterizarea structural a compuilor moleculari n faz solid.

5. Bibliografie
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. T. Gullion, Introduction to High-Resolution Solid-State NMR, Elsevier Science 2007 P. K. Madhu, SolidSate Nuclear Magnetic Resonance 35 (2009) 2-11 R.R. Ernst, G. Bodenhousen, A. Wokaun, Principles of Nuclear Magnetic Resonance n One and Two Dimensions, Oxford University Press, Oxford 1987 C.H. Wu, A. Ramamoothy, S.J. Opella, J. Magn. Reson A 109 (1994) 270-272; D.K. Lee, T. Narasimhaswami, A. Ramamoorthy, Chem. Phys. Lett. 408 (2005) 118-122; C. Tripon, M. Aluas, X. Filip, C. Filip, J. Magn. Reson., 183 (2006) 68; M. Aluas, C. Tripon, J.M. Griffin, X. Filip, V. Ladizhansky, R.G. Griffin, S. P. Brown, C. Filip, J. Magn. Reson., 199 (2009) 173; G. De Paepe, A. Lesage, S. Steuernagel, L. Emsley, ChemPhysChem 5 (2004) 869-875; M. Feike, D.E. Demco, R. Graf, S. Hafner, H.W. Spiess, J. Magn. Reson., A 122 (1996) 214;

245

Rezonana magnetic nuclear pe sisteme lichide

Lect. dr. Mihai Vasilescu Cuprins
1. Prezentarea principiului tehnicii experimentale .................................................................246 2. Prezentarea informaiilor care se pot obine pe diferite sisteme de studiu ...........................253 3. Prezentarea aparaturii disponibile i stabilirea parametrilor optimi de funcionare pentru diverse tipuri de experimente ..................................................................................264 4. Bibliografie ..........................................................................................................................265

n dotarea Facultii de Fizic a Universitii Babe-Bolyai din Cluj-Napoca se afl dou spectrometre de rezonan magnetic nuclear (RMN) performante i anume: - spectrometrul Bruker Avance 400 cu cmp central de 9.4 Tesla i posibiliti de analiz att a probelor lichide ct i a celor solide - spectrometrul Bruker Avance 600 cu cmp central de 14 Tesla i posibiliti de analiz att a probelor lichide ct i a celor solide Utilizarea acestor spectrometre de ctre studenii Facultii de Fizic presupune o stpnire temeinic a noiunilor i principiilor de baz din RMN, cunoaterea prilor componente ale unui spectrometru, precum i nelegerea modului n care acestea funcioneaz i a rolului fiecrei pri. n scopul facilitrii activitilor de practic experimental pentru utilizarea acestor echipamente de ultim generaie, prezentm mai jos protocolul de lucru pentru aceste echipamente.

1. Prezentarea principiului tehnicii experimentale

Rezonana magnetic nuclear este un fenomen ce apare atunci cnd nucleele de un anumit tip se gsesc ntr-un cmp magnetic static i sunt expuse la un al doilea cmp magnetic, oscilant. Spectroscopia de rezonan magnetic nuclear are loc n regiunea undelor radio i este asociat cu tranziiile energetice ale spinilor nucleari. O particularitate important asociat cu tehnica RMN este sensibilitatea sa la mediul chimic. Deoarece legturile chimice sunt asociate cu valena ionilor i structura molecular, doar acele spectroscopii care au scala lungimilor apropiat frecvenelor de rezonan caracteristice, vor rspunde acestor efecte. 246

Spectroscopia RMN d date despre toate nucleele rezonante din sistem; tipic, ele vor fi multe de acest fel, n diverse medii chimice. Spectroscopia RMN este o metod foarte util pentru studiul structurii locale i a dinamicii constituenilor compuilor. Toate nucleele cu moment magnetic sunt capabile s ofere informaii detaliate despre ordinea local. Astfel se pot obine date despre unghiurile dintre legturi i lungimea legturilor, despre atomii nvecinai (din prima i a doua sfer de coordinare), simetria local i numerele de coordinare, precum i despre procesele dinamice. Pe lng cmpul magnetic static, cmpul efectiv din zona nucleului este influenat i de cmpurile locale interne, care conin informaii specifice structurii locale. Cele mai importante interacii sunt interacia de deplasare chimic pentru toate nucleele i interacia cuadrupolar pentru nucleele cu I>1/2. De obicei, n experimentele de RMN, cmpul magnetic este n domeniul 2.3-14 T. Pentru proton aceasta corespunde unor frecvene de rezonan ntre 100-600MHz. Domeniul corespunztor pentru C13 este 25-150MHz. Aceste diferene mari ale frecvenelor de rezonan (unele exemple sunt date n Tabelul 1) fac posibil observarea nucleelor diferitelor elemente relativ independent unele de altele. ntr-un spectru RMN pot fi nregistrate semnale de la un singur tip de nuclee, alte posibile nuclee rezonante fiind excluse prin reglarea spectrometrului pe domeniul de frecvene de interes. Tabel 1. Proprieti RMN ale unor nuclee ntr-un cmp de 9.395 T:
Izotop 1H 2H 13C 14N 15N 17O 31P 35Cl 37Cl 43Ca Frecvena RMN (MHz) 400 61 100 29 40 54 161 39 32 27 Abundena natural (%) 99.98 0.015 1.108 99.63 0.37 0.037 100 75.53 24.47 0.145

Rezonana magnetic nuclear, ca orice metod spectroscopic, presupune reprezentarea grafic a unui bilan energetic. Valorile frecvenelor cu care se lucreaz n RMN fac ns folosirea lor foarte anevoioas. Pentru 247

simplificare s-a ales ca prim soluie folosirea unor etaloane, substane de referin, a cror frecven de rezonan s fie considerat nivelul zero al scalei energetice. Ulterior s-a recurs la un artificiu, acum reprezentndu-se n loc de scal energetic propriu-zis, o scal a deplasrilor chimice date de formula:

0 0

Unitatea de msur pentru deplasrile chimice este "partea per milion" sau "ppm". Deplasrile chimice ntlnite n RMN sunt, de obicei, de ordinul zecilor sau sutelor de ppm. ngustimea extraordinar a liniilor RMN este cea care face ca efectele deplasrilor chimice mici s fie msurabile i utile, ea fiind rezultatul energiei foarte joase implicate n experimentele RMN. ngustimea liniilor n cazul lichidelor se datoreaz micrii moleculare rapide [1]. Baza experimentului de rezonan magnetic este plasarea probei ntr-un cmp magnetic uniform intens i asigurarea iradierii ei cu un cmp electromagnetic printr-un sistem potrivit de emisie i recepie a frecvenelor radio sau de microunde. De obicei, pentru rezonana magnetic nuclear, acesta va fi un sistem de bobine acordate. Pentru a observa semnalele pot fi urmate dou strategii. Prima este similar ca i concepie cu alte forme dispersive de spectroscopii i implic o analiz (sweep) spectral n care fiecare condiie de rezonan posibil (echivalent absorbiei) este cutat secvenial. De obicei, aceasta nu se face prin parcurgerea domeniului de frecvene, ci prin iradierea cu un cmp electromagnetic slab, de frecven fixat, i modificnd cmpul magnetic principal. Aceast abordare este mai uoar din punct de vedere tehnic i are la baz ecuaia:

0 = -B0
echivalent cu parcurgerea frecvenelor. Aceast abordare este adesea utilizat n RES, dar a devenit rar n spectroscopia RMN. A doua abordare demonstreaz chiar mai clar distincia dintre rezonana magnetic nuclear i alte spectroscopii i exemplific folosirea descrierii clasice a cmpului de radiaie. Pentru a urmri experimentul este necesar s folosim un sistem de coordonate care se rotete cu frecvena Larmor 0. Acesta este cunoscut ca sistemul rotativ (the rotating frame). n aceste 248

condiii magnetizarea nuclear poate fi descris de un vector paralel cu direcia z, care este direcia cmpului magnetic principal. Radiaia electromagnetic este descris de componenta sa magnetic ca un vector la un anumit unghi fa de direcia cmpului. Dac radiaia electromagnetic este de aceeai frecven cu frecvena Larmor, atunci va prea static n sistemul de coordonate astfel ales. Situaia este ilustrat n figura 1(a) [2]. n sistemul rotativ, B0 poate fi ignorat i este necesar doar s considerm efectele cmpului de radiaie, B1. Cnd aplicm B1 magnetizarea rspunde precesnd n jurul lui B1 cu o frecven 1 dat de:

1 = - B1
Unghiul la care se mic magnetizarea este , dat de:

= 1 t = - B1 t
aa c magnetizarea poate fi nclinat la orice unghi doar prin simpla aplicare a unui puls electromagnetic de putere i durat cunoscute. Figura 1(b) ilustreaz acest proces pentru un unghi de 1800.

Figura 1. (a) Magnetizarea (M0) n sistemul rotativ n prezenta cmpului de radiofrecvena (B1); (b) Magnetizarea dup un puls de 1800; (c) Magnetizarea dup un puls de 900.

Dup un puls de 180 sensul magnetizrii se inverseaz complet. Aceasta corespunde unei inversii a populaiei nivelelor energetice i este, n mod clar, o situaie de non-echilibru. Revenirea la echilibru este caracterizat de un timp, T1, cunoscut ca timp de relaxare spin-reea sau timp de relaxare longitudinal. Dac, n loc s aplicm un puls de 180, aplicm un puls cu durata jumtate, atunci magnetizarea se rotete cu 90 de grade n planul xy, cunoscut ca plan transversal (fig 1c). n aceast situaie fiecare vector nuclear individual (vectori care sunt nsumai pentru a da magnetizarea macroscopic) 249

este forat de cmpul de radiaie s se roteasc coerent cu frecvena Larmor 0. Imediat dup ce aplicarea pulsului nceteaz, sistemul ncepe s se relaxeze. Efectele de cmp aleatoare, dependente de timp, vor produce variaii aleatoare ale frecvenei Larmor, care vor face ca vectorii nucleari individuali s se mite cu viteze diferite fa de viteza sistemului rotativ. Cum aceste cmpuri sunt aleatoare, vom avea tot attea nuclee ce se mic mai rapid ca i numrul celor ce se mic mai lent. Pe msura trecerii timpului suma vectorilor se va reduce la zero. Acest proces, numit relaxare spin-spin sau transversal, este ilustrat n figura 2. n lichide, aceast relaxare poate fi adesea caracterizat ca un proces exponenial cu constanta de timp T2, numit timp de relaxare spin-spin sau timp de relaxare transversal.

Figura 2. Relaxarea transversal fiecare sgeat reprezint un vector magnetizare nuclear. (a), (b), (c) i (d) arat evoluia n timp dup un puls de 900.

Cnd apar deplasarea chimic (chemical shift) sau rezonanele cuplate scalar, atunci setul de spini nucleari, corespunznd liniilor deplasate, oscileaz cu o frecvena egal cu diferena dintre frecvena de referin i frecvena de rezonan a semnalelor deplasate. Acolo unde avem un numr de rezonane deplasate se obine un semnal oscilator complicat al relaxrii. Semnalul obinut prin relaxare se refer de obicei la relaxarea liber a magnetizrii (free induction decay, FID) i poate fi transformat ntr-un spectru printr-un proces matematic cunoscut sub numele de transformare Fourier. Acest proces este ilustrat n figura 3. Exist o relaie important ntre relaxarea transversal i lrgimea liniei. Pentru o descretere exponeniala spre echilibru, T2 este legat de lrgimea liniei la jumtatea nlimii peak-ului, , prin: 250

 = 1/(T2)
de aceea, cu ct relaxarea se produce mai rapid, cu att linia observat este mai larg. n multe cazuri, din cauza lrgimii liniei deplasarea chimic sau informaiile privind cuplajul sunt obscure sau chiar pierdute.
intensitate

(a)

timp

(b)

frecventa

Figura 3. Transformarea Fourier a unui FID (a) ntr-un spectru (b)

Tehnica transformrii Fourier, care este acum metoda aleas n cele mai multe experimente RMN, este un exemplu de metod multiplex. Principiul unei astfel de metode este ca, respectnd condiia ca pulsul excitaiei s acopere o lrgime de band potrivit, toate frecvenele sunt excitate n mod 251

egal i toate contribuie la toate punctele din FID. Dimpotriv, n metoda undelor continue (continous wave, CW) frecvenele sunt excitate secvenial. Ca rezultat al acestei metode, CW tinde s fie mult mai lent dect metoda transformatei Fourier. n cazuri ideale, avantajul semnal/zgomot al metodei transformatei Fourier asupra metodei CW pentru acelai timp de achiziie este N unde N este numrul de frecvene. Deoarece N este de obicei mii sau zeci de mii, acest avantaj este foarte consistent. Metoda transformatei Fourier nu este ns lipsit de probleme. Prima este durata FID-ului. Dac aceasta este foarte scurt, atunci liniile spectrale sunt foarte largi i digitizarea devine o problem, iar partea iniial a semnalului este distorsionat de revenirea sistemului de recepie dup pulsul de radiaie. n cazul RES, aceasta limiteaz metoda transformatei Fourier la doar un grup restrns de sisteme, cu linii foarte nguste. n RMN pot apare dificulti cu semnalele solidelor. A doua problem este direct legat de avantajul multiplexului. Cum toate frecvenele contribuie la fiecare punct, un semnal foarte intens n anumite pri ale spectrului va crete intensitatea tuturor punctelor din FID. Ca o consecin, pot aprea probleme cu digitizarea semnalului, deoarece semnalele mici, de interes, vor avea doar o mic contribuie la FID. Dac nu avem o rezoluie suficient n convertorul analog digital, atunci contribuia semnalelor mici poate fi pierdut cu totul. Aceasta poate fi o problem important n spectrele RMN pentru protoni, atunci cnd se fac analize pe alimente, de exemplu, unde apa este adesea componentul majoritar i poate domina spectrul. n aceste condiii s-ar putea s fie avantajoas folosirea metodei CW cuplat cu tehnici de scanare rapid.

Figura 4. Vedere generala asupra spectrometrului

252

Magnetul cea mai scump parte a spectrometrului electromagnet din fire supraconductoare civa km de fir solenoid, bobina, bobine helmholtz heliu lichid (T = 4.2 K) straturi termoizolante i ecranante azot lichid (T = 77.4 K) straturi termoizolante i ecranante orificiu central vertical (ngust sau larg)

Figura 5. Seciune schematic printr-un magnet RMN

2. Prezentarea informaiilor care se pot obine pe diferite sisteme de studiu

Cel mai adesea analizele probelor lichide se concentreaz pe studiul spectrului RMN corespunztor nucleelor de hidrogen sau carbon, anume a izotopilor 1H i 13C. Interpretarea acestor spectre ne permite identificarea structurii probelor analizate. Analizele se fac utiliznd recipieni speciali pentru analize RMN, eprubete de quartz de 5 mm diametru. Dizolvarea probelor se face n solveni deuterai, spectrometrul realiznd fixarea cmpului cu ajutorul nucleelor de deuteriu. 253

n acelai timp, solvenii au i rol de referin. Astfel: CDCl3 (cloroform deuterat) are frecvena de rezonan de 7.26 ppm pentru 1H, respectiv triplet la 77.01 ppm pentru 13C; D2O (apa deuterat) are frecvena de rezonan de 4.78 ppm pentru 1H; C6D6 (benzen deuterat) are frecvena de rezonan de 7.156 ppm pentru 1H, respectiv 128.032 ppm pentru 13C; DMSO (dimetilsulfoxid deuterat) are frecvena de rezonan de 2.512 ppm pentru 1H, respectiv 39.47 ppm pentru 13C; TMS (tetrametilsilandeuterat) are frecvena de rezonan de 0 ppm pentru 1H, respectiv 0 ppm pentru 13C i 0 ppm pentru 29Si; C3D6O (acetona deuterata) are frecvena de rezonan de 2.16 ppm pentru 1H, respectiv 30 ppm i 206 ppm pentru 13C. Redm mai jos i cteva exemple de analize 1H NMR pe probe relativ simple [3]:

Figura 6. Proba: ciclohexan (C6H12) ; Solvent: CDCl3

Figura 7. Proba: benzen (C6H6); Solvent: CDCl3

254

Figura 8. Proba: toluen (C6H5CH3); Solvent: CDCl3

Figura 9. Proba: etil benzen (C6H5CH2CH3); Solvent: CDCl3

Figura 10. Proba: acetona (CH3(C=O)CH3) ; Solvent: CDCl3

255

Figura 11. Proba: metil etil cetona (CH3(C=O)CH2CH3); Solvent: CDCl3

Figura 12. Proba: apa (H2O) ; Solvent: D2O

Figura 13. Proba: etanol (CH3CH2OH) ; Solvent: CDCl3

256

Figura 14. Proba: etanol (CH3CH2OH); Solvent: D2O

Figura 15. Proba: 1-propanol (CH3CH2CH2OH); Solvent: CDCl3

Figura 16. Proba: 2-propanol ((CH3 )2CHOH); Solvent: CDCl3

257

Figura 17. Proba: t-butanol ((CH3 )3COH); Solvent: CDCl3

Figura 18. Proba: 2-butanol (CH3CH2CH(OH)CH3 ); Solvent: CDCl3

Figura 19. Proba: piridina (C5H5N); Solvent: CDCl3

258

Pentru aceste exemple identificarea corespondenei ntre semnalele de rezonan i poziia protonilor n molecul se face relativ simplu. Informaii suplimentare se obin dac calculm integralele liniilor de rezonan, acestea reprezentnd de fapt intensitatea relativ a semnalelor i fiind, n general, proporionale cu numrul de nuclee care produc semnalele respective, aa cum se vede n figura 20:

Figura 20. Integrarea semnalelor pentru proba: metil etil cetona (CH3(C=O)CH2CH3); Solvent: CDCl3

Raportul relativ al celor trei integrale este 2:3:3, corespunztor numrului de protoni legai de fiecare dintre nucleele de carbon. Pentru a identifica semnalele celor doua grupri CH3 vom ine cont de faptul c protonii gruprii legate de C=O dau semnal simplu (singlet), n timp ce protonii gruprii legate de CH2 dau semnal despicat (n+1), deci triplet. Astfel, identificarea corespondenei celor trei semnale de rezonan este complet. Senzitivitatea spectrometrului RMN este o msur a numrului minim de spini detectabili. Cum semnalul RMN crete odat cu creterea diferenei de populaie dintre nivelele energetice, senzitivitatea este mbuntit de creterea cmpului magnetic utilizat [5]. De asemenea, diferena de populaie poate fi crescut prin scderea temperaturii probei. Analizele de tip 13C NMR vor utiliza diferite metode ce conduc la mbuntirea semnalului RMN. Redm mai jos i cteva exemple de analize 13C NMR pe probe relativ simple:

259

Figura 21. Proba: ciclohexan (C6H12) ; Solvent: CDCl3

Figura 22. Proba: benzen (C6H6); Solvent: CDCl3

Figura 23. Proba: toluen (C6H5CH3); Solvent: CDCl3

260

Figura 24. Proba: etil benzen (C6H5CH2CH3); Solvent: CDCl3

Figura 25. Proba: acetona (CH3(C=O)CH3) ; Solvent: CDCl3

Fiurag 26. Proba: metil etil cetona (CH3(C=O)CH2CH3); Solvent: CDCl3

261

Figura 27. Proba: etanol (CH3CH2OH) ; Solvent: CDCl3

Figura 28. Proba: etanol (CH3CH2OH); Solvent: D2O

Figura 29. Proba: 1-propanol (CH3CH2CH2OH); Solvent: CDCl3

262

Figura 30. Proba: 2-propanol ((CH3 )2CHOH); Solvent: CDCl3

Figura 31. Proba: t-butanol ((CH3 )3COH); Solvent: CDCl3

Figura 32. Proba: 2-butanol (CH3CH2CH(OH)CH3 ); Solvent: CDCl3

263

Figura 33. Proba: piridina (C5H5N); Solvent: CDCl3

n toate spectrele de mai sus, acolo unde s-a utilizat ca solvent CDCl3, se observ i semnalul corespunztor solventului la 77.01 ppm, semnal foarte util i pentru a calibra spectrul n funcie de referin.

3. Prezentarea aparaturii disponibile i stabilirea parametrilor optimi de funcionare pentru diverse tipuri de experimente
n dotarea Facultii de Fizic a Universitii Babe-Bolyai din Cluj-Napoca, utilizabil pentru analiza probelor lichide, se afl spectrometrul de rezonan magnetic nuclear (RMN) Bruker Avance 400 cu cmp central de 9.4Tesla i posibiliti de analiz att a probelor lichide ct i a celor solide. Etapele nregistrrii spectrului RMN pe probe lichide la spectrometrul Bruker Avance 400 din dotarea laboratorului: se ia o eprubeta de 5 mm diametru, special pentru analize RMN, curat se pune proba n eprubet (circa 0.1-0.4 grame proba); se pune solventul n eprubet, peste prob, pn cnd coloana de lichid are aproximativ 4 cm nlime (circa 0.5 ml solvent); se agit pentru dizolvarea probei; la nevoie se nclzete uor eprubeta pentru a facilita dizolvarea; se pune eprubeta n suportul special: se aeaz eprubeta cu suportul n dispozitivul special de reglaj al distanei i se aeaz eprubeta astfel nct ulterior proba s fie n centrul cmpului magnetic; se d comanda lift on de la BSMS pentru a crea perna de aer pentru eprubeta; 264

se aeaz eprubeta pe perna de aer; se d comanda lift off i proba coboar n magnet; se centreaz semnalul de lock n fereastra de control a BSMS-ului; se d comanda lock i se alege solventul potrivit; spectrometrul va intra n modul lock, deci cmpul va fi fixat i stabilizat, fcndu-se automat coreciile variaiilor externe; se realizeaz reglajele de shimm fcnd coreciile necesare de la BSMS, modificnd n principal cmpurile Z1 i Z2; la nevoie se modific i Z3, Z4, X sau Y. se alege programul de pulsuri dorit i nucleul pe care se dorete realizarea analizei RMN; se d comanda wobb i din uruburile speciale ale capului de sond se regleaz frecvena de rezonan pentru nucleul studiat; se seteaz parametrii de achiziie; se realizeaz msurtoarea efectiv alegnd un numr de achiziii potrivit pentru obinerea unui raport semnal/zgomot suficient de bun; se d comanda efp pentru a trece din semnal timp (FID) n semnal frecvena (spectru); se fazeaz corespunztor; se calibreaz spectrul n funcie de referina aleas; se analizeaz spectrul, marcnd peak-urile de rezonan, msurnd integrala lor i atribuind n final semnalele nucleelor, funcie de structura molecular. Anterior nregistrrii unui spectru este posibil ca parametrii de achiziie s necesite o optimizare. Aceasta se realizeaz cu comanda popt i se refer n general la setarea duratei pulsului de excitare (p1) i respectiv a timpului de relaxare dintre dou achiziii consecutive (d1).

4. Bibliografie
1. 2. 3. 4. 5. P.S. Belton, Annual Reports on NMR Spectroscopy, Vol. 31, p. 1-18, Academic Press, (1995); R. Grimmer and B. Blumich, NMR Basic Principles and Progress, Vol. 30, p. 1-60, (1994); Joseph P. Hornak; http://www.cis.rit.edu/htbooks/nmr/ Mihai Vasilescu, Teza de doctorat, 2007 Carrington, A.D. McLachlan, Introduction to Magnetic Resonance, Chapman and Hall, London (1967)

265

VII. MSURTORI TERMICE

Analiz termic diferenial. Analiz calorimetric diferenial

Conf. dr. Raluca Ciceo-Luccel
Analiza termic a materialelor acoper o categorie larg de metode prin care sunt determinate proprietile fizice i chimice ale acestora, n funcie de temperatur sau timp pe baza efectelor termice care nsoesc transformrile din prob n timpul supunerii acesteia la procese de nclzire, rcire, tratamente izoterme, etc. Fenomenele fizice i chimice, constantele de material detectabile sau msurabile prin analiza termic sunt: comportarea materialelor la topire, cristalizare, fierbere, sublimare, de-vitrificare etc.; temperaturile caracteristice ale transformrilor de faz; cldurile de topire, cristalizare, de reacie etc.; cinetica reaciilor i a formrii fazelor; oxidarea, reducerea, descompunerea, hidratarea dehidratarea etc.; coroziunea metalelor n diferite atmosfere; puritatea i compatibilitatea materialelor; tranziii vitroase ale solidelor ne-cristaline; capaciti calorice, clduri specifice; re-cristalizarea sticlelor metalice etc. Metodele de analiz termic diferenial reprezint varianta modern a metodelor clasice de investigare a efectelor termice induse de variaia temperaturii unui corp fiind pentru prima dat folosite de ctre W.C.Robert Austin n anul 1899. Termenul de metoda diferenial provine de la fap266

tul c aceste tehnici permit determinarea diferenelor dintre variaiile unor mrimi fizice ale probei n raport cu cele ale unui etalon. [1] Concret, metoda const n nclzirea sau/i rcirea n condiii identice a unei probe i a unui material de referin inert din punct de vedere termic, concomitent nregistrndu-se continuu temperatura cuptorului T i diferena de temperatur T (la metodele DTA) sau de flux termic (dQ / d ) (la metodele DSC) care apare ntre prob i materialul de referin. Graficele obinute n urma determinrilor se numesc curbe de analiz termic sau termograme. Analiza termic diferenial (DTA) este suficient de sensibil pentru a determina variaii foarte mici de temperatur i este capabil s sesizeze transformrile lente ce se produc n intervale largi de temperatur. De aceea, DTA poate fi folosit si pentru a studia proprietile termice i transformrile de faze care nu se produc cu modificarea entalpiei materialului. Linia de baz a unei nregistrri DTA prezint astfel discontinuiti la temperaturile de tranziie, iar panta curbei n orice punct va depinde de microstructura probei la temperatura respectiv. Suprafaa de sub aria curbei este proporional cu modificarea entalpiei i nu depinde de capacitatea caloric a probei.[2]

Figura. 1. Principalele componente ale unui sistem termic diferenial

Principalele componente ale unui sistem termic diferenial (Fig. 1) sunt: 1. Suportul pentru probe coninnd termocuplurile i containerele pentru probe plasate ntr-un bloc ceramic sau metalic. 2. Cuptorul. 3. Programatorul de temperatur. 267

4. Sistemul de nregistrare. 5. Sistemul de furnizare a gazelor, n scopul meninerii unei atmosfere inerte n cuptor (pentru inhibarea oxidrii probei, eliminarea volatilelor i asigurarea unui transfer termic ct mai bun). Orice proces endoterm sau exoterm (cum ar fi topirea sau cristalizarea) care are loc n prob la nclzire este nregistrat ca un peak n direcia negativ, respectiv pozitiv a axei X, pe care este reprezentat diferena de temperatur (semnalul DTA) (Fig. 2).

Figura. 2 Schema idealizat a unei curbe DTA

Calorimetria dinamic diferenial (DSC) este o tehnic n care diferena de energie dintre o substan (i/sau produii de reacie) i un material de referin este msurat ca funcie de temperatur (sau timp) n timp ce substana i materialul de referin sunt supuse unui program de temperatur controlat - conform IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry). Termenul calorimetrie se refer exclusiv la msurarea cldurii. Cldura poate fi o cantitate de energie schimbat sub forma unui flux de cldur ntre dou corpuri ntr-un interval de timp. Calorimetrele cu baleiaj diferenial sunt tehnici mbuntite ale DTA (analiza termic diferenial) n sensul c ele au fost calibrate pentru msurtori de energie caloric, nu de temperatur. Efectul termic care se produce n cazul unei tranziii termice sau a unui proces fizico-chimic este nregistrat ca diferen de flux caloric ntre prob i referin i la rndul lui este tradus n semnal electronic, amplificat i 268

apoi prelucrat de componenta software a instrumentului. nregistrarea se red sub forma unei curbe numit termogram DSC care reprezint o dependen a fluxului caloric msurat funcie de temperatur (analiz n regim dinamic) sau timp (analiz n regim izotermal). Semnalul msurat redat n termograma DSC este direct proporional cu capacitatea caloric a probei, astfel c orice diferen ce apare n capacitatea caloric a probei conduce la modificarea termogramei DSC. Dac proba de analizat nu sufer o transformare fizico-chimic sau o tranziie termic, atunci semnalul DSC va arta ca o linie dreapt. Fa de aceast linie se vor msura intensitatea i temperatura la care se manifest procesele termice din prob, drept pentru care linia servete ca i referin i este numit linie de baz. Schematic este prezentat o termogram DSC n care linia de baz prezint multiple modificri datorate proceselor i tranziiilor termice din prob (fig. 3).

Figura. 3 Tipuri de procese care pot aprea ntr-o nregistrare DSC

Exist dou tipuri de tehnici DSC utilizate n analizele termice: calorimetre DSC cu flux de cldur (heat flux DSC), calorimetre DSC cu compensarea puterii calorice (power compensated DSC). Dei n ambele tipuri semnalul msurat reprezint diferena de temperatur generat de senzori, fluxul diferenial de cldur de la cuptor spre prob i referin este msurat pe ci complet diferite. Sistemul heat flux DSC nregistreaz diferena de temperatur ntre prob i referin care apare n cursul unei transformri fizico-chimice, iar power compensated DSC transform aceast diferen de temperatur n puterea caloric necesar restabilirii echilibrului termic dintre prob i referin. n continuare vom prezenta pe scurt cteva detalii pentru fiecare tehnic in parte. 269

Heat flux DSC msoar diferena de temperatur dintre prob i etalon, care este convertit n flux de cldur printr-o construcie special (Fig. 4). Cldura transportat la prob i referin printr-un platan din argint sau constantan, care este i parte integrant a sistemului de nregistrare a temperaturii, este controlat n timp ce se nregistreaz diferena de temperatur dintre cele dou. Semnalul msurat este folosit ulterior la msurarea diferenei de flux de cldur. Dac n cuptor fluxul de cldur este echilibrat, diferena de temperatur este zero, iar graficul nregistreaz aa-numita linie de baz n funcie de timp sau temperatur. Dac n prob au loc transformri de faz sau alte procese care se produc la o anumit temperatur, se modific gradientul de temperatur al probei fa de etalon, iar n grafic apare o deviere de la linia de baz sub forma unor peak uri endoterme sau exoterme, n funcie de tipul procesului.

Figura. 4. Schema de principiu a metodei heat flux DSC

Power compensated DSC (Fig. 5) msoar diferena de flux termic proba-etalon indirect, prin diferena de putere electric introdus n rezistenele de nclzire aezate n imediata vecintate a probei i etalonului, pentru a menine diferena de temperatur zero. Proba i referina sunt meninute la aceeai temperatur printr-un sistem electric format din dou rezistene de nclzire.

270

Figura. 5. Schema de principiu a metodei power compensated DSC

Dac n prob are loc un proces (exo- sau endoterm), pentru ca temperatura probei s nu difere de cea a referinei se cupleaz sau decupleaz rezistena de nclzire a acesteia pn la egalizarea temperaturilor. Semnalul electric dat de diferena de putere dintre cele 2 rezistene este proporional cu diferena de flux termic i este nregistrat sub forma curbei de analiz termic. Din punct de vedere experimental, exist o serie de factori care influeneaz n mod direct efectele termice analizate i implicit forma termogramelor. Principalii astfel de factori de influen sunt [3]: 1. Viteza de cretere sau descretere a temperaturii n cuptor: viteza de nclzire afecteaz nlimea i limea efectelor termice nregistrate de curbele DTA i DTG. Influena vitezei de nclzire asupra curbelor se explic prin aceea c odat cu creterea ei crete i cantitatea de produi sub form de gaz care genereaz o diferen de temperatur mai mare ntre prob i cuptor. La o vitez mai mic efectele termice au loc la temperatur mai joas, dar peak-urile nregistrate sunt mai largi. La viteze de nclzire mai mari efectele termice sunt evideniate mai bine, cu peak-uri mai nguste, ns pot aprea suprapuneri de peak-uri. 2. Rolul formei i al materialului din care este format locaul pentru probe Materialele folosite la construcia locaelor sunt de dou categorii: metalice sau ceramice. Metalele cele mai frecvente utilizate le temperaturi nalte sunt nichelul, oelul inoxidabil la temperaturi nalte, metalele nobile i seminobile. Materialele ceramice utilizate la confecionarea locaurilor sunt 271

alumin cu adaus de silice, argil arse, sticle rezistente la temperatur i, de multe ori, grafitul. Locaurile metalice, care sunt mai frecvent utilizate, au avantajul c pot fi mult mai uor de confecionat, nu sunt poroase i dau mici deviaii ale fluxului de cldur, deci ale liniei de baz a curbei DTA. Dar dezavantajul lor este c intensitatea efectelor termice tinde s fie mic, din cauz c transferul de cldur care are loc se face rapid prin pereii lor i ntre aceti perei i masa probei. Locaurile ceramice, pe de alt parte, dau efecte termice cu intensiti mari, pentru aceeai cantitate de material reactant ca i n cazul celor metalice, din cauz c transferul de cldur are loc ncet prin pereii lor. Dar au i acestea dezavantajele lor . Cum ar fi, aezarea lor n cuptor este dificil din cauza faptului c au o slab conductibilitate termic iar atunci trebuie foarte bine centrate. Un alt dezavantaj este acela c datorit structurilor poroase, ele pot influena forma efectelor termice sau s se impurifice, n cazul cnd n prob se afl un compus care se topete. n ceea se privete forma locaelor pentru probe, n decursul timpului, s-au impus dou tendine: utilizarea locaurilor n form de blocuri i utilizarea locaurilor n form de creuzet. 3. Rolul acoperirii sau descoperirii probei Acoperirea probei poate s ajute, n anumite cazuri, la obinerea unei linii de baz a curbei DTA sub forma unei linii drepte sau prin acoperirea probei se protejeaz unele reacii violente ca de exemplu: fierberile sau descompunerile n urma crora ar iei o cantitate de prob afar din loca, n timpul procesului termic. Cu toate acestea este bine s se lucreze, pe ct posibil, cu probele descoperite. Aceast precauie de a se lucra cu proba descoperit se ia pentru a nu influena admisia i emisia gazelor i a vaporilor de ap care nsoesc reaciile termice i care dac ar fi ntr-un sistem nchis ar duce la suprimarea unor reacii, fapt ce denatureaz foarte mult forma curbelor termice. 4. Influena gradului de mojarare a probei: cu ct granulaia probei este mai mic cu att temperaturile de descompunere sunt mai joase, iar suprafeele efectelor termice sunt mai mici (cu excepia oxidrilor). 5. Densitatea sau gradul de tasare a probei n loca: diferenele n densitatea sau gradul de tasare a probei n loca sunt cauzele cele mai obinuite ale devierilor de la linia de baz a curbei DTA. 6. Cantitatea de prob luat n lucru: greutatea probei luat n lucru poate s varieze ntre 0.2 i 1g, fr ca aceast variaie s aib prea mare influen asupra rezultatelor. Cantitatea de prob ce trebuie luat n lucru este de 272

obicei determinat de sensibilitatea aparaturii i de intensitatea proceselor termice care au loc n substana cercetat. 7. Substana termic inert. n analiza termic se folosete o substan termic inert n vederea determinrilor fenomenelor care au loc la nclzirea unui produs solid, comparativ cu aceast substan termic inert. Alegerea substanei termice inerte este foarte important. Cele mai bune materiale inerte sunt acelea care au aceeai conductivitate termic ca i materialul de cercetat, dar, oricare ar fi materialul folosit, el trebuie s aib aceeai mrime granular i s se ia aceeai cantitate n lucru ca i proba de cercetat. 8. Aciunea atmosferei din cuptor asupra desfurrii reaciilor: oricare ar fi procedeul experimental de reglare a presiunii din cuptor, presiunea trebuie meninut constant pe tot parcursul determinrilor. 9. Natura i proprietile termocuplelor: un termocuplu este format din doi conductori de compoziie diferit, sudai la un capt ntre ei i care au proprietatea ca prin nclzire la locul sudurii s dea natere unui curent electric proporional cu cantitatea de cldur aplicat. Termocuplele ideale sunt cele constituite din metale nobile, care sunt rezistente la atacul termic i au o durat de utilizare lung n comparaie cu cele confecionate din metale inferioare. Pentru temperaturi cuprinse ntre 100-2200C se folosesc termocuple confecionate dintr-un fir de Pt i cellalt dintr-un aliaj de Pt cu rodiu; ntre 100-800C se pot folosi termocuple confecionate din aliaje speciale de Ni i Cr. Institutului de Cercetri Experimentale Interdisciplinare n Bio-Nano-tiine deine dou aparate performante destinate analizelor termice. Msurtorile de analiz termic diferenial se realizeaz cu un derivatograf termic Shimadzu tip DTG-60/60H. Materialul de referin i probele de analizat sunt puse n celule standard din alumin (avnd dimensiunile : 5.8 mm x h: 2.5 mm). Se lucreaz n atmosfer de azot i aer la un flux de 70 ml/min. fiecare, cu o rat de nclzire a cuptorului de 5-10C/min (uzual) n domeniul maxim de temperatur de la 23 C (sau temperatura camerei) pn la 1600 C. Msurtorile de analiz calorimetric se realizeaz pe un calorimetru diferenial Shimadzu tip DSC-60. Materialul de referin i probele de analizat sunt puse n celule standard din 273

aluminiu Se lucreaz n atmosfer de azot i aer la un flux de 70 ml/min fiecare (avnd dimensiunile : 5.8 mm x h: 1.5 mm). Rata de nclzire a cuptorului este de 5-10C/min (uzual), n domeniul maxim de temperatur 23C (sau temp. camerei) pn la 600C. O baie de azot lichid permite determinri la temperaturi sczute (de la -150C). Accesul la aceste aparate este deschis tuturor studenilor, masteranzilor, doctoranzilor, cadrelor didactice, cercettorilor din UBB sau din Universiti, Centre de Cercetare partenere. Informaii importante privind proprietile termice ale unor materiale, obinute prin msurtori efectuate la ICIBNS se regsesc n o serie de lucrri de licen, dizertaie , teze de doctorat si lucrri tiinifice cotate ISI (anexa I).

Bibliografie
1. 2. 3. Michael E. Brown, Introduction to thermal analysis: techniques and applications, Second edition, Kluwer Academic Publishers, 2001. Todor D.N., Analiza termic a mineralelor, Ed. Tehnic, Bucureti, 1972. V.Pop, I. Chicina, N. Jumate, Fizica Materialelor.Metode Experimentale, Ed. Presa Univ. Clujean, Cluj Napoca, 2001.

274

Ghid de utilizare a aparatelor de analiza termic diferenial si analiz calorimetric diferenial. Ghid de interpretare a msurtorilor DTA/TG si DSC
Conf. dr. Raluca Ciceo-Luccel Cuprins
1. Ghid de utilizare a aparatelor de analiz termic diferenial i analiz calorimetric diferenial..................................................................................... 275 2. Ghid de interpretare a msurtorilor DTA/TG i DSC ...................................... 279 3. Bibliografie ........................................................................................................... 285

1. Ghid de utilizare a aparatelor de analiz termic diferenial i analiz calorimetric diferenial

Metodele termice difereniale constau, ca principiu, n nclzirea sau/i rcirea n condiii identice a unei probe i a unui material de referin inert din punct de vedere termic, concomitent nregistrndu-se continuu temperatura cuptorului T i diferena de temperatur T (la metodele DTA) sau de flux termic (dQ / d ) (la metodele DSC) care apare ntre prob i materialul de referin. Graficele obinute n urma determinrilor se numesc curbe de analiz termic sau termograme, care prezint pe abscis timpul sau temperatura iar pe ordonat diferena de temperatura prob-referin (la DTA) sau diferena de flux termic (la DSC). n cele ce urmeaz sunt prezentai paii necesari efecturii msurtorilor DTA/TG i DSC, raportat la cele dou aparate de msura existente n cadrul Institutului de Cercetri Interdisciplinare n Bio-Nano-tiine, Cluj Napoca. Analiza termic diferenial simultan (DTA/TG) aparat Shimadzu tip DTG-60/60H cu termogravimetria

Specificaii aparat: Intervalul de temperatur pe care se pot face msurtori: temp. camerei 1500C Acurateea balanei: 1% Detectorii: termocuplu de Pt plus 10% Pt/Rh 275

Interval msurabil semnal DTA: 1 la 1000 V Nivel de zgomot: < 1V Materialul de referin (-alumina) i proba de analizat se pun n cellule standard din alumin (avnd dimensiunile 5.8 mm x h 2.5 mm);

Se lucreaz n atmosfer de aer i azot la un flux de ~ 50-70 ml/min; Rata de nclzire a cuptorului: 0,150,0C/min pe un domeniu de temperatur de la temperatura camerei (minim) pn la 1500 C (maxim); Cantitatea de prob folosit: max. 1 g Pai n efectuarea unei msurtori DTA: 1. Se deschid recipientele de gaze pentru a asigura atmosfera n cuptor. 2. Se deschid aparatele i se ateapt 30 min pentru a permite gazelor s formeze o atmosfer inert n cuptor. 3. Se pregtesc dou creuzete curate: unul pentru proba de referin (-alumina) altul pentru proba de analizat. 4. Se deschide cuptorul apsnd pe tasta [OPEN/CLOSE] de pe afiajul digital al aparatului. 5. Se pune creuzetul cu materialul de referin pe suportul din partea stng, iar creuzetul gol pe suportul din partea dreapt. 6. Se apas tasta [OPEN/CLOSE] de pe afiajul digital al aparatului pentru a nchide cuptorul. 7. Se apas o dat pe tasta [DISPLAY] cnd ecranul digital al aparatului afiajeaz valoarea masei. Se ateapt un timp pentru stabilizarea semnalului, apoi se apas tasta [ZERO] pentru aducerea la valoarea zero a balanei. 8. Se deschide cuptorul apsnd tasta [OPEN/CLOSE], se ia creuzetul 276

gol de pe suport i se pune n el o cantitate optim de prob, apoi se pune din nou creuzetul pe suportul de prob. 9. Se nchide cuptorul. Valoarea afiat dup stabilizarea semnalului TG reprezint masa de prob. 10. Se apas de dou ori pe tasta [DISPLAY]; ecranul digital al aparatului afieaz valoarea semnalului DTA, care se aduce la zero prin apsarea tastei [ZERO]. 11. Se deschide programul de analiz al aparatului, TA-60WS Collection Monitor i se introduc valorile parametrilor de analiz (programul de temperatur i informaii despre fiier) n fereastra [Measure] [Setting Parameters]. 12. Pornirea msurtorii se face cu butonul [Start], unde se poate alege numele fiierului i directorul unde va fi salvat, ca i greutatea probei. 13. Oprirea msurtorii se face n condiii normale, fiierul de analiz fiind salvat automat n directorul specificat. Dac se dorete oprirea msurtorii nainte de finalizarea programului stabilit se apas butonul [STOP], existnd posibilitatea salvrii datelor nregistrate pn n acel moment. Analiza datelor (pierderi de mas, identificare temperaturi evenimente termice etc.) se poate face din programul de analiz TA60 care permite asemenea prelucrri ale termogramelor ca i convertirea i salvarea datelor n format text pentru prelucrri ulterioare n alte tipuri de programe de prelucrare date. Aparatul este conectat la un sistem de purjare a unui gaz inert (n cazul de fa azotul) care asigur o atmosfer inert pentru protejarea probelor la oxidare, dar i la un sistem de gaz care asigur evacuarea elementelor volatile, asistarea transferului de cldur i protejarea detectorilor (n cazul de faz aerul). Analiza calorimetric (DSC) calorimetru diferenial Shimadzu tip DSC-60. Specificaii aparat: Intervalul de temperatur pe care se pot face msurtori: temp. camerei 500C sau minus 150C 500C cnd se folosete baia de azot lichid. Interval msurabil semnal DSC: 40 mW Nivel de zgomot flux de cldur: < 1W

277

 Materialul de referin (-alumina) i proba de analizat se pun n celule standard din aluminiu (avnd dimensiunile 5.8 mm x h 1.5 mm); Se lucreaz n atmosfer de aer i azot la un flux de ~ 50-70 ml/min; Rata de nclzire a cuptorului: 1 50 C/min; Proba: substane n form solid sau lichid la temperatura camerei. i acest aparat este conectat la sistemul de purjare a unui gaz inert (n cazul de fa azotul) care asigur o atmosfer inert pentru protejarea probelor la oxidare, i la sistemul de gaz care asigur evacuarea elementelor volatile, asistarea transferului de cldur i protejarea detectorilor (n cazul de faz aerul). Pai n efectuarea unei msurtori DSC: 1. Se deschid recipientele de gaze pentru a asigura formarea atmosferei n cuptor. 2. Se deschid aparatele i se ateapt 30 min pentru a permite gazelor s formeze o atmosfer inert n cuptor. 3. Se pregtesc dou creuzete curate. ntr-un creuzet se pune o cantitate de referin (-alumina), iar n cellalt creuzet se pune proba, cntrit n prealabil pe o balan digital. 4. Se pune creuzetul cu materialul de referin pe suportul din partea stng, iar creuzetul gol pe suportul din partea dreapt. 5. Se apas o dat pe tasta [DISPLAY]; ecranul digital al aparatului afieaz valoarea semnalului DSC. Se apas tasta [ZERO] pentru aducerea la valoarea zero a semnalului. 6. Se deschide programul de analiz al aparatului, TA-60WS Collection Monitor i se introduc valorile parametrilor de analiz (programul de temperatur i informaii despre fiier) n fereastra [Measure] [Setting Parameters]. 278

7. Pornirea msurtorii se face cu butonul [Start], unde se poate alege numele fiierului i directorul unde va fi salvat, ca i greutatea probei. 8. Oprirea msurtorii se face n condiii normale, fiierul de analiz fiind salvat automat n directorul specificat. Dac se dorete oprirea msurtorii nainte de finalizarea programului stabilit se apas butonul [STOP], existnd posibilitatea salvrii datelor nregistrate pn n acel moment. n mod identic cu datele obinute de la analiza DTATG, datele salvate ntr-o msurtoare DSC pot fi analizate cu programul TA60.

2. Ghid de interpretare a msurtorilor DTA/TG i DSC

La modul general, fenomenele fizice i chimice, constantele de material detectabile sau msurabile prin analiza termic sunt: comportarea materialelor la topire, cristalizare, fierbere, sublimare, de-vitrificare etc.; temperaturile caracteristice ale transformrilor de faz; cldurile de topire, cristalizare, de reacie etc.; cinetica reaciilor i a formrii fazelor; oxidarea, reducerea, descompunerea, hidratarea-dehidratarea etc.; coroziunea metalelor n diferite atmosfere; puritatea i compatibilitatea materialelor; tranziii vitroase ale solidelor ne-cristaline; capaciti calorice, clduri specifice; cristalizarea sticlelor metalice etc. Cnd probele cristalizeaz, rearanjarea atomic este un proces exotermic, iar proba elibereaz mai mult cldur dect n referina. Modificri subtile ale semnalului DTA pot indica prezena unui peak exotermic asociat cu o separare de faze. n cadrul laboratorului de analize termice de la Institutul de Cercetare Interdisciplinar n Bio-Nano-tiine au fost abordate o parte din aceste tipuri de msurtori, mai jos fiind prezentate cteva exemple semnificative cu scopul de a oferi o imagine ct mai exact a modului de intepretare a datelor furnizate de metodele termice difereniale:

279

1. Analiza DTA/TG a unui sistem aluminosilicatic cu Fe60SiO220Al2O320Fe2O3 preparat prin metoda sol-gel la pH 8.5

TGA mg 12.00

DTA uV

-1.382% -1.38%
Weight Loss -52% -52.094 %

20.00

274.4
10.00

274.37 C

10.00

0.00 8.00

132 57.8

169.7

-10.00 6.00 -20.00

260
100 200 Temp [C] 300

Semnalul DTA prezint patru peak-uri endoterme: Tendo = 58C; pierdere de mas n TG ~ 1,38% dehidratarea probei prin pierderea apei adsorbite pe suprafaa probei; Tendo = 132C; fr pierdere de mas transformare structural a NH4NO3 format n prob din precursorii azotai i hidroxidul de amoniu introdus pentru cataliza bazic a hidrolizei din procesul sol-gel Tendo = 169.7C; fr pierdere de mas topirea NH4NO3 Tendo = 260C; pierdere de mas de ~ 52% suprapunerea unor evenimente termice cum ar fi: descompunerea NH4NO3, eliminarea altor reziduuri volatile din prob. Texo = 274.4C; fr pierdere de mas nceputul procesului de cristalizare a fazelor magnetit i hematit, identificate prin analiza XRD dup un tratament termic la 500C.

280

2. Analiza DSC a unor sisteme aluminosilicatice cu Fe(80-x)[SiO2] 20Al2O3 x[Fe2O3], x = 0, 15, 20, prin metoda sol-gel, la pH 8.5.

DSC mW x=0

129 230 93 128.6 169.7

x=15

55

x=20

93.4 56 129 171

221

241.6
0 100 200 300 Temp [C] 400 500

Semnalele DSC ale probelor prezint cinci peak-uri endoterme: Tendo = 54C i 56C dehidratarea probei prin pierderea apei adsorbite pe suprafaa probei; Tendo = 93.4C eliminarea apei rezultate din reacia hidroxidului de amoniu (introdus n soluie pentru obinerea unui pH de 8.5) cu acidul azotic, HNO3, rezultat din precursorul folosit pentru Al [Al(NO3)39H2O]: NH4OH + HNO3 NH4NO3 + H2O Tendo = 128C i 129C transformare structural a NH4NO3 Tendo = 169.7C i 171C topirea NH4NO3 Tendo = 221C i 241C suprapunerea unor evenimente termice cum ar fi: descompunerea NH4NO3, eliminarea altor reziduuri volatile din prob. Linia semnalului DSC pentru cele 2 probe ce conin Fe este aceeai, diferind doar temperaturile la care au loc evenimentele (n special cele dou evenimente care indic descompunerea, respectiv topirea NH4NO3), cele pentru 20% Fe fiind deplasate mai sus cu cteva grade, indicnd faptul c prezena n matrice a unei cantiti mai mari de Fe influeneaz schimburile energetice i cauzeaz ntrzierea producerii anumitor evenimente termice n prob. 281

3. Analiza DTA/TG a unei argile minerale cu structur majoritar de caolinit

TGA mg 8.00

DTA uV

-0.353%

-14.765%

993.4
10.00

7.50

1046
0.00

7.00

-10.00

505 -0.542%
-20.00 6.50 0 500 Temp [C] 1000

Pierderea iniial de mas de ~0.3% n intervalul de temperatur 30-109C corespunde dehidratrii probei prin pierderea apei adsorbite la suprafaa probei. n intervalul de temperatur 354660C se observ un peak endoterm foarte larg, care corespunde unui proces tipic de dehidratare prin dehidroxilarea caolinitului cu producerea fazei dezordonate metakaolinit, Al2Si2O7, avnd un maxim la 505C i nsoit de o pierdere de mas de ~14 % din totalul masei probei. Dar pierderi continue de hidroxil sunt observate pn la 900C (~0.5%) i pot fi atribuite deprotonrii graduale prin oxolare a metakaolinitului. n intervalul 977 C 1007 C, semnalul DTA etaleaz un peak exoterm (cu maximul la 993.4C), fr pierdere de mas n TG, corespunztor unei tranziii structurale de stare solid, o conversie structural a metakaolinitului n alt stare polimorf aluminosilicatic. Faza dezordonat de metakaolin, Al2Si2O7, se transform la temperatura la 995.5 C (unde apare peak-ul exoterm ngust) ntr-o faz aluminiu-siliciu spinel, Si3Al4O12, care este considerat o structur tip -alumin [1]: 2 Al2Si2O7 > Si3Al4O12 + SiO2

282

4. Analiza DTA/TG a dou probe de hidroxiapatit (cu 30%Fe i 50%Fe) tratate termic la 450 C
TGA mg -12.786% 20.00 DTA uV 20.00

10.00 -12.026% 15.00 83.5 491 491.18C HA+50%Fe - t

HA+30%Fe-t

0.00

-10.00

10.00 -8.907% -20.00 -13.554% 507 507.68C -30.00 5.00 100 200.00 400.00 Temp [C] 600.00

Semnalul DTA prezint dou peak-uri endotermice clare: la 83.C i 100C, cu pierderi de mas n TG dehidroxilare la 491 C i la 507 C, cu pierdere de mas descompunerea termic propriu-zis n TCP (fosfat tricalcic) i TTCP ( fosfat tetracalcic): Ca 10 ( PO 4 ) 6 ( OH ) 2 2 Ca 3 ( PO 4 ) 2 + Ca 4 P2 O 9 + H 2 O gas 5. Analiza DTA/TG a unei probe de corn de cerb deproteinat
TGA mg 9.00 DTA uV

371 371.32C
-6.838%
50.00

-22.530%
8.00

445.94C 445
7.00

0.00 6.00

85 84.90C

-13.417%

5.00

-50.00 4.00 0.00 200.00 400.00 Temp [C] 600.00 800.00 1000.00

283

Procedeul de deproteinare a probei a constat n degresare n aceton timp de 48 h i cu eter etilic timp de 30 min, apoi uscare n cuptor la 40C pn la ndeprtarea complet a solventului. Semnalul DTA etaleaz trei evenimente termice: un peak endoterm avnd maximul la 85C, asociat cu o scdere a masei probei n curba TG (pe intervalul 50C150C), eveniment care ar corespunde denaturrii structurii triplu helix a colagenului din matricea osoas, eveniment dependent i de gradul de hidratare al materialului, dar i eliminrii apei libere ataate n matricea de hidroxiapatit. un eveniment exoterm de intensitate mare n intervalul de temperatur 350500C, format din dou peak-uri cu maximele la 371C i la 446C, nsoite de pierderi de mas considerabile. Aceste evenimente pot corespunde degradrii i respectiv arderii matricii organice a osului nsoit de volatilizarea compuilor gazoi rezultai din acest proces.[2,3,4] 6. Analiza DTA/TG a unor materiale compozite polimer-sticle[5]

Semnalele TG prezint patru trepte de pierdere de mas: I intervalul de temperatur 20-400C volatilizarea apei de pe suprafaa probelor 284

II intervalul de temperatur 400-500C nsoit n DTA de un peak exoterm cu maximul la ~T = 450C o reacie de dehidroxilare aferent restructurrii reelei polimerice a compozitelor. Pe de alt parte, intensitatea acestor peak-uri poate fi legat de efectul interaciunii mutuale dintre produii de hidratare cu polimerul utilizat n sintez. III intervalul de temperatur 500-800C curba DTA prezint la T ~ 740 C un peak endotermic pronunat care poate fi atribuit unui proces de disociere fr pierdere de mas IV la aproximativ 810-830 C apare un peak exotermic mic, acompaniat de o pierdere de mas. Acesta este, cel mai probabil datorat formrii unei faze cristaline n structura compozitelor.

Menionm c toate aceste msurtori au fost publicate i/sau prezentate n cadrul unor conferine naionale/internaionale de specialitate.

3.Bibliografie
1. Bellotto, M., Gualtieri, A., Artioli, G., and Clark, S.M., Kinetic study of the kaolinite-mullite reaction sequence. Part I: kaolinite dehydroxylation, Phys. Chem. Minerals 22, 207-214 , 1995. M. Tman, M. Bciu, V. Coman, V. Simon, Thermal kinetics analysis of bone tissue organic phase, Journal of Optoelectronics and Advanced Materials, Vol. 11, No. 4 (2009), 479-483. L.F. Lozano, M.A. Pena-Rico, A. Heredia, J. Ocotlan-Flores, A. Gomez-Cortes, R. Velazquez, I.A. Belio, L. Bucio, Thermal Analysis study of human bone, Journal of Materials Science 38 (2003) 4777-4782 M.E. Bahrololoom, M. Javidi, S. Javadpour, J. Ma, Characterisation of natural hydroxyapatite extracted from bovine cortical bone ash, Journal of Ceramic Processing Research, vol. 10, no. 2 (2009), 129-138. T. Radu, S. Simon, C. Prejmerean, V. Simon, A. Colceriu, C. Tamas, L. Silaghi-Dumitrescu, Thermoanalytical characterisation of new dental ionomer biocomposites, Journal of Optoelectronics and Advanced Materials, Vol. 10, No. 4 (2008), 958-960.

2.

3.

4.

5.

285

VIII. DIFRACTOMETRUL DE RAZE X

Difracie de raze X pe pulberi

C.S.I. dr. Gheorghe Borodi Cuprins

1. Principiul metodei ...............................................................................................................286 2. Informaiile care se obin din difracia de raze X pe pulberi ................................................289 2.1. Analiza calitativ de faze cristaline ..............................................................................289 2.2. Analiza cantitativ de faze ...........................................................................................290 2.2.1. Metode bazate pe utilizarea de standarde ...........................................................290 2.2.2. Metoda bazat pe analiza Rietveld .....................................................................292 2.3. Analiza microstructural.............................................................................................292 2.3.1. Metoda Scherrer .................................................................................................292 2.3.2. Metoda Warren-Averbach..................................................................................293 2.3.3. Metode bazate pe analiza Rietveld .....................................................................294 2.4. Determinarea structurii cristaline din pulberi ............................................................294 2.4.1. Indexarea Difractogramelor ...............................................................................295 2.4.2. Rafinarea Pawley sau Le Bail .............................................................................296 2.4.3.1. Metoda de cutare n spaiul direct...........................................................297 2.4.3.2. Aplicarea unor procedee de calcul pe monocristale la pulberi ...................299 2.4.4. Rafinarea structurilor cristaline prin metoda Rietveld ......................................300 3. Prezentarea aparaturii disponibile i stabilirea parametrilor optimi de funcionare pentru diverse tipuri de experimente .................................................................................................302 4. Bibliografie ..........................................................................................................................303

1. Principiul metodei
Difracia de raze X este una dintre metodele cele mai utilizate pentru investigarea compuilor n faza solid cristalin. Principiul de funcionare a unui difractometru de raze X este urmtorul: Cu ajutorul unui generator de nalt tensiune se obine tensiune de ordinul zecilor de kV. Aceast tensiune se aplic ntre catodul i anodul tubului de raze X.

286

Catodul tubului de raze X este alctuit dintr-un filament care este de asemenea alimentat la o surs de joas tensiune i care face ca filamentul s emit electroni. Electronii respectivi sunt accelerai ntre catodul i anodul tubului. Electronii care lovesc anodul fac s se emit radiaii X sub forma unui spectru continuu i a unui spectru caracteristic. Spectrul continuu nu depinde de natura anodului n schimb spectru caracteristic depinde de anodul folosit. Anozii tuburilor de raze sunt din urmtoarele materiale: Cu, Co, Fe, Cr, Mo, Ag etc. Liniile caracteristice pentru elementele grele cum sunt Mo i Ag au lungimi de und mic, iar liniile caracteristice pentru Cr si Co au lungimi de und mari. Cu are lungimea de und intermediar i este cel mai utilizat. Dintre lungimile de und emise de un tub de raze X cea mai intens este radiaia K . Pentru aplicaiile practice de difracie pe pulberi este necesar s folosim o radiaie ct mai monocromatic. Monocromatizarea radiaiei X se face cu ajutorul filtrelor de raze X sau cu ajutorul monocromatoarelor de raze X. Radiaia X emis de tubul de raze X intr ntr-un goniometru, trece printr-un sistem de fante care sunt montate pe goniometru dup care radiaiile X ajung la detector unde este nregistrat. Proba este aezat pe un suport plan, unghiul dintre radiaia incident i prob este egal cu unghiul dintre radiaia difractat i planul probei. n timp ce proba se rotete cu un anumit unghi, detectorul se rotete cu un unghi dublu n aa fel nct tot timpul unghiul de inciden este egal cu unghiul de reflexie. Acest lucru se realizeaz n cazul montajului , 2 , dar exist i alte tipuri de montaje experimentale. Difracia razelor X se poate explica n mai multe feluri. Cea mai uzual interpretare este difracia Bragg pe planele cristalografice. Orice compus cristalin cristalizeaz ntr-un anumit sistem cristalografic cu parametrii de reea bine precizai, un anumit grup spaial i un mod de aranjare a atomilor n celula elementar. n celula elementar se pot construi diverse seturi de plane cristalografice fiecare set fiind caracterizat prin indicii Miller corespunztori. Astfel, un set de plane cristalografice echidistante are indicii Miller (h, k, l) dac cel mai apropiat plan cristalografic fa de origine intersecteaz axele cristalografice la distanele: a/h, b/k, c/l. Se poate considera difracia pe astfel de plane cristalografice dup cum este artat n figura urmtoare: 287

Condiia de difracie este dat de relaia: 2dsin = (1) unde d este distana interplanar, unghiul de difracie, iar lungimea de und. De aici se observ c fiecare set de plane cristalografice corespunde unui anumit unghi de difracie. Distana interplanar este determinat de sistemul cristalografic, de parametrii celulei elementare i de indicii Miller. De exemplu, pentru sistemul ortorombic avem 1/d2 = h2/a2 + k2/b2 + l2/c2. Pentru alte sisteme cristalografice avem alte formule de calcul a distanelor interplanare. De aici rezult c poziiile maximelor de difracie depind exclusiv de tipul reelei cristaline i de parametrii celulei elementare. S vedem n continuare de cine depind intensitile de difracie. Radiaia X const din unde electromagnetice n care componenta vectorului cmp electric i magnetic oscileaz perpendicular pe direcia de propagare a undei. Vibraiile vectorului cmpului electric produc oscilaii ale electronilor atomilor. Dar orice sarcin care oscileaz produce la rndul ei unde electromagnetice, iar n cazul acesta, radiaii X. Intensitatea radiaiei X mprtiate de ctre un singur atom este caracterizat prin factorul de mprtiere atomic. Factorii de mprtiere atomici depind de numrul de electroni din componenta atomului dat. Factorii de mprtiere atomici scad cu unghiul de mprtiere. Dependena intensitii factorilor de mprtiere de sin / este dat n tabelele internaionale sub forma unor relaii empirice. Dac radiaia X cade pe prob, atunci fiecare atom din celula elementar mprtie radiaiile incidente. Aceste unde electromagnetice produse de atomii din celula elementar se suprapun i se compun, iar rezultanta este dat de factorul de structur. Expresia factorului de structur este dat de relaia: Fhkl=

fj exp 2 i(hxj+kj+lzj)

(2)

Intensitile de difracie sunt proporionale cu ptratul factorilor de structur. Prin urmare, intensitile de difracie vor depinde de natura i 288

poziia atomilor n celula elementar. n concluzie, poziiile maximelor de difracie depind de celula elementar, iar intensitile de difracie de poziiile atomilor n celula elementar. Intensitile de difracie depind i de ali factori. Astfel se demonstreaz c intensitatea radiaiei difractate de ctre un mic monocristal care se rotete cu viteza unghiular este dat de relaia [1] : Ihkl = ( 3/ V2).(e2/mc2)2VcrI0LpATIFhklI2 unde (3)

este lungimea de und viteza unghiular cu care se rotete monocristalul

V volumul celulei elementare I0 intensitatea fasciculului incident Lp este factorul Lorentz-polarizare A factorul de absorbie T factorul de temperatur, iar Fhkl este factorul de structur. Pulberile constau din foarte multe cristalite mici de ordinul zecilor pn la ordinul miilor de orientate haotic unele n raport cu altele. Probele se pun de obicei pe suporturi plane. Vom obine difracie numai de la planele cristalografice care sunt paralele cu suprafaa suportului de prob. De aceea, numrul de cristalite care particip la difracie este foarte mic. Deoarece n general , , V, Vcr, I0 sunt constante pentru un experiment de difracie, iar (e2/mc2) sunt constante universale, e fiind sarcina electronului, m masa acestuia, iar c viteza luminii, toate acestea se pot grupa mpreun sub forma unei constante notat cu K. n felul acesta intensitatea de difracie corespunztoare unui set de plane cristalografice este dat de relaia: Ihkl=KmLpATIFhklI2 (4) n aceast relaie s-a introdus i m care este factorul de multiplicitate. Acesta rezult din aceea c pot s existe mai multe plane cristalografice care s produc difracie la acelai unghi .

2. Informaiile care se obin din difracia de raze X pe pulberi

2.1. Analiza calitativ de faze cristaline
Analiza cantitativ de compui chimici n faza solid se poate face prin metode chimice, dar acestea necesit o abordare mai laborioas i timp mai mult. 289

n prezent, analiza calitativ de produi chimici cristalini se face n cea mai mare msur prin difracie de raze X pe pulberi. Se tie c acelai compus chimic poate s se prezinte n diferite forme polimorfice sau, cum se mai spune, n diferite faze cristaline. Difracia de raze X pe pulberi deosebete cu uurin diferite forme polimorfice ale unui anumit compus. Analiza de faze cristaline se bazeaz pe compararea difractogramei de raze X experimental cu difractogramele care se gsesc n bazele de date. Deci, din analiza de faze putem s identificm o anumit faz numai dac aceasta a fost catalogat n prealabil. Identificarea fazelor cristaline se bazeaz pe urmtoarele considerente: fiecare faz cristalin aparine unui anumit sistem cristalografic, are parametrii de reea bine determinai sau care variaz ntr-un interval relativ mic, aparine unui anumit grup spaial, iar atomii compusului se plaseaz n anumite poziii n celula elementar. Aceasta face ca fiecare faz cristalin s aib intensitile de difracie i unghiurile la care apar aceste intensiti bine determinate. Compararea difractogramei experimentale cu cele din catalog se face utiliznd bazele de date, n special PDF-2, PDF-4. Dac avem la dispoziie baza de date CSD sau o alt baz de date, care ne d datele cristalografice complete pentru compuii care ne intereseaz, atunci putem s simulm difractograma acelui compus i s o comparm cu difractograma experimental.

2.2. Analiza cantitativ de faze

n foarte multe cazuri, cnd avem un amestec de faze cristaline, ne intereseaz compoziia procentual a fiecrei faze din amestec, deoarece proprietile fizico-chimice depind de compoziia procentual. Obinerea componentei procentuale a fazelor dintr-un amestec se poate face att prin metode chimice, ct i prin difracie de raze X. n anumite cazuri difracia de raze X pe pulberi cristaline poate s fie o metod rapid i eficient. Analiza cantitativ de faze se bazeaz pe faptul c fiecare faz cristalin produce propria difractogram, iar dac avem mai multe faze, difractograma rezultat va fi o suprapunere a difractogramelor individuale, cu luarea n considerare a coeficienilor de absorbie a fazelor componente. 2.2.1. Metode bazate pe utilizarea de standarde ntre intensitile de difracie i fracia n greutate W, pentru o anumit faz exist relaia: 290

I i = C i

W
x m

(5)

unde Ci este o constant pentru reflexie (sau un grup de reflexii) i a fazei , x este densitatea fazei , iar m este coeficientul de absorbie masic pentru ntreaga prob [2]. Pentru aplicarea acestei relaii este necesar (i) determinarea constantei Ci prin prepararea de standarde cu compoziie procentual a fazei bine x determinat i estimarea coeficientului de absorbie masic m a probelor
x standard (ii), msurarea lui Ii i estimarea lui m pentru probe necunoscute. O alt metod este aceea a standardului intern care presupune includerea unui standard intern n proba de compoziie procentual cunoscut Ws. Intensitatea de reflexie Ijs este dat de relaia:

I js = C js

Ws
x sm

(6)

mprind cele dou relaii rezult:

is W = K sWs

I i I js

(7)

ij unde K s =

C js Ci s

ij K s poate fi determinat fcnd un amestec cunoscut de faz standard i faz de analizat. O alt metod este aceea a raportului intensitii de referin (RIR) (Reference Intensity Ratio). Ca standard extern se alege n general corundum.

Se definete RIRs =

I isWs . I jsWd

Fracia W pentru faza necunoscut se determin n funcie de fracia Ws pentru proba standard, i de raportul dintre intensitatea liniei i a probei de analizat i intensitatea liniei j a probei standard dup relaia:

W =

I i W s I js RIRs

(8)

291

2.2.2. Metoda bazat pe analiza Rietveld Analiza cantitativ de faze se poate face i cu analiza Rietveld [3]. Se filtreaz toi parametrii de care depinde intensitatea de difracie, inclusiv procentul de faz necunoscut. Astfel, din analiza Rietveld rezult fracia de faze din prob. Factorii care limiteaz precizia analizei de faz sunt: dimensiunea diferit pentru particulele aparinnd la diferite faze de analizat, orientarea preferenial a cristalitelor, microabsorbia. Intensitile de reflexie pentru probele cu coeficient mai mare de absorbie vor fi mai intense. Erorile sunt cu att mai mici cu ct dimensiunea particulelor este mai mic i cu ct coeficienii de absorbie vor fi mai mici. Reducerea coeficienilor de absorbie se poate face prin utilizarea tuburilor de raze X cu lungime de und mai mic.

2.3. Analiza microstructural

Analiza microstructural include determinarea dimensiunilor microcristalitelor i eventual distribuia acestora dup dimensiune, a deformrii reelei cristaline i a probabilitilor de defecte. Se tie c pulberile cristaline sunt formate din mici monocristale, numite cristalite, distribuite haotic unele n raport cu altele. Dimensiunile acestor cristalite sunt de ordinul zecilor pn la ordinul miilor de . Dac dimensiunile cristalitelor sunt sub 20 , se consider c compusul respectiv este sub form amorf. Cu ct dimensiunile cristalitelor sunt mai mici cu att liniile de difracie sunt mai largi. Dar la lrgimea liniilor de difracie contribuie i deformrile reelei cristaline i probabilitile de defecte. Dac reeaua este mai deformat sau dac avem mai multe defecte, liniile de difracie de asemenea se lrgesc. Trebuie menionat c dimensiunile particulelor sunt diferite de dimensiunile cristalitelor. ntr-o particul pot s existe mai multe cristalite (monocristale) orientate diferit ntre ele. 2.3.1. Metoda Scherrer Scherrer a artat pentru prima dat c dimensiunile cristalitelor sunt legate de lrgimea de difracie prin relaia [2]:

D=

K cos

(9)

D este dimensiunea microcristalitelor, este lrgimea liniilor de difracie 292

corectat de lrgimea instrumental, iar este unghiul de difracie. K este o constant care depinde de modul cum se definete dimensiunea D, dac aceasta se definete ca fiind dimensiunea liniar sau rdcina de ordinul 3 din volum, precum i de ali factori. Cea mai utilizat valoare a lui K = 0,89. Lrgimea instrumental se obine din lrgimea de difracie experimental astfel: = B-b, dac profilul de difracie este o funcie de tip Lorentz i 2 = B2 b2, dac profilul de difracie este o funcie de tip Gauss. n aceast relaie B este lrgimea de difracie msurat, iar b este lrgimea de difracie instrumental. Pentru a obine b, se folosete o prob foarte bine cristalizat i se msoar lrgimea maximelor de difracie pentru unghiurile de difracie apropiate cu cele ale probei de msurat. Lrgimea liniilor de difracie crete cu unghiul. Ca msur a lrgimii liniilor de difracie se consider lrgimea la seminlime. Unii autori iau ca lrgime a liniilor de difracie lrgimea integral, care se definete ca fiind aria maximului de difracie mprit la intensitatea maxim pentru maximul respectiv. Precizia legat de determinarea dimensiunilor cristalitelor scade odat cu creterea acestora, deoarece cu ct dimensiunile sunt mai mari lrgimea liniilor de difracie se apropie de lrgimea instrumental i depinde foarte mult ct de corect am ales lrgimea instrumental. Domeniul pe care precizia determinrii dimensiunilor cristalitelor se consider acceptabil este de la aproximativ 20, pn la 1000. 2.3.2. Metoda Warren-Averbach Am amintit c lrgimea liniilor de difracie scade att cu scderea cristalitelor ct i cu creterea deformaiilor reelei cristaline. Dependena de unghiul a lrgimii liniilor de difracie datorat dimensiunilor cristalitelor este diferit de dependena de unghiul a lrgimii liniilor de difracie datorat deformrii reelei cristaline. Astfel avem relaia:

cos =

0,9 + 4 sin D

(10)

n cazul n care profilul liniei de difracie este de tip Lorentz, unde este un parametru care reflect deformaia reelei cristaline i reprezint deplasarea medie a atomilor fa de poziia de echilibru. 293

Reprezentnd grafic cos n funcie de sin, ar trebui s obinem o dreapt, dac considerm diferite linii de difracie. Ordonat la origine pentru aceast dreapt reprezint

0,9 , iar panta D

dreptei reprezint 4. De aici putem s determinm i D. Dac profilul liniilor de difracie este de tip Gauss, atunci avem relaia:

2 cos 2 =

2
D2

+ 16 2 sin 2

(11)

Din reprezentarea grafic a lui 2cos2, n funcie de sin2, rezult dimensiunile cristalitelor i deformrile reelei. 2.3.3. Metode bazate pe analiza Rietveld O alt modalitate de determinare a dimensiunilor cristalitelor i a deformrii reelei cristaline se poate face prin analiza [4] Rietveld. Conform formulei lui Caglioti, lrgimea la seminlime depinde de unghiul , astfel:

L =

X + Y tg cos

(12)

pentru un profil de tip Lorentz, unde L este lrgimea la seminlime, iar X si Y parametrii de fit. Pentru un profil de tip Gauss avem:

G = Utg 2 + Vtg + W +

P cos

(13)

Din fitarea Rietveld rezulta X, Y, U, V, W si P. n continuare dimensiunile cristalitelor i deformaiile reelei se calculeaz n funcie de aceti parametrii. Dimensiunile cristalitelor se mai pot determina i din analiza Fourier a liniilor de difracie.

2.4. Determinarea structurii cristaline din pulberi

Determinarea structurii cristaline se face n general din datele de difracie obinute din monocristale. Numrul intensitilor de difracie care se pot obine din difracia pe monocristale este de ordinul zecilor de mii. Numrul intensitilor de difracie care se pot obine din pulberi cristaline este de ordinul zecilor, dar poate ajunge i pn la 200. Se obin mai puine intensiti de difracie deoarece liniile de difracie pot s se suprapun i de ase294

menea unele intensiti de difracie sunt foarte slabe i nu se pot observa. Deoarece numrul de intensiti de difracie care se pot colecta din difractograma pe pulberi este mult mai mic dect pentru monocristale, determinarea structurii cristaline este mult mai dificil pentru pulberi dect pentru monocristale. Dar exist situaii cnd anumii compui nu se pot cristaliza i totui ne intereseaz structura lor cristalin. n acest caz se apeleaz la determinarea structurii cristaline din pulberi. Determinarea structurii cristaline pentru un anumit compus nseamn determinarea sistemului cristalografic, a parametrilor celulei elementare, a grupului spaial i a poziiilor atomilor n celula elementar. Etapele principale pentru determinarea structurii cristaline din pulberi sunt: 2.4.1 Indexarea Difractogramelor A indexa o difractogram nseamn a determina sistemul cristalografic n care cristalizeaz compusul, a determina parametrii celulei elementare i a atribui fiecrui maxim de difracie indicii Miller corespunztori. Din reflexiile interzise se pot atribui grupurile spaiale cele mai probabile. Dup cum se tie, difracia razelor X poate fi privit ca difracia de pe planele cristalografice. Orice compus este caracterizat de o anumit celul elementar care este un paralelipiped cu muchiile a, b, c i unghiurile dintre ele , , . Parametrii care caracterizeaz celula elementar se numesc parametrii celulei elementare. n funcie de a, b, c, , , , avem apte sisteme cristalografice. Pentru o anumit celul elementar putem s definim planele cristalografice. Un plan cristalografic de indicii Miller h, k, l este un plan care intersecteaz axele cristalografice la distanele a/h, b/c si c/l de origine. Se tie c difracia razelor X pe atomi poate fi privit ca difracie pe planele cristalografice. Se obin maxime de difracie dac este ndeplinit condiia lui Bragg: Maximele de difracie au intensiti mai mari sau mai mici n funcie de modul de distribuie a atomilor n celula elementar. Numrul de maxime de difracie n cazul pulberilor care se observ este foarte mic comparativ cu numrul de maxime de difracie observate pentru monocristal. De asemenea, unele maxime de difracie se suprapun n cazul pulberilor. Numrul mai mic de maxime de difracie observat n cazul pulberilor precum i suprapunerea unor maxime provenite de la plane cristalografice diferite este motivul pentru care este mult mai dificil de determinat structura cristalin din pulberi fa de monocristale. Concordana dintre poziiile maximelor de difracie calculate i obser295

vate se caracterizeaz i prin aa numite figuri de merit. Exist mai multe moduri de definire ale figurilor de merit sau gradului de ncredere n indexarea respectiv. Una dintre figurile de merit se datoreaz lui P.M. de Woolf [5]:

M 20 =

Q 20 2 < Q > N 20

(14)

Q20 este valoarea lui Q pentru a 20-a linie de difracie, N20 este numrul de linii diferite calculate pn la linia corespunztoare lui Q20, iar <Q> este abaterea medie dintre liniile de difracie calculate i observate. Dac avem M20 > 10, indexarea este probabil corect. Un alt factor de ncredere datorat lui Smith si Snyder [6] se definete astfel: FN=

N < 2 > .N (g )

(15)

unde N( g ) este numrul de linii de difracie calculate pn la g, care este valoarea n pentru limita superioar selectat, < 2 > este abaterea medie dintre liniile de difracie calculate i observate. Cea mai utilizat figur de merit este M20. Exist mai multe metode de indexare dintre care cele mai importante sunt: Metoda Ito[7], metoda Dicvol [8] X-Cel [9] si metoda Treor [10]. 2.4.2. Rafinarea Pawley sau Le Bail Rafinarea Pawley sau Le Bail este utilizat pentru extragerea intensitilor de difracie, rafinarea celulei elementare i atribuirea grupului spaial cel mai probabil. Au fost dezvoltate dou metode de extragere a intensitilor de difracie din pulberi, i anume: Metoda Le Bail i metoda propus de Pawley. Exist o suprapunere sistematic a intensitilor de difracie i o suprapunere accidental. Suprapunerea exact a intensitilor de difracie are loc mai ales pentru sistemele cristalografice de nalt simetrie. De exemplu, reflexiile 333 i 511 pentru sistemul cubic sau 43l i 50l pentru sistemul tetragonal. Suprapunerea accidental are loc att pentru sisteme cu simetrie ridicat, dar mai ales pentru sisteme cristalografice cu simetrie joas i se datorete creterii numrului de reflexii independente. Suprapunerea reflexiilor este cu att mai probabil cu ct celula elementar are volumul mai mare. Metoda Le Bail [11] de extragere a intensi296

tilor de difracie este inspirat din metoda Rietveld. Rietveld a propus un algoritm simplu de evaluare a factorilor de structur observai pentru o suprapunere parial sau total a maximelor de difracie. Rezultatele intensitilor de difracie extrase nu depind de valoarea intensitilor iniiale. Ca intensiti de pornire se pot considera valorile calculate ale intensitilor de difracie. Dei metoda este n general robust, exist i cazuri cnd prezint instabiliti, mai ales atunci cnd fondul de difracie este supraestimat. Dar cel mai important aspect care a contribuit la creterea popularitii metodei Le Bail este c aceasta poate s fie uor ncorporat n tehnica Rietveld de rafinare. Pawley [12] a elaborat o metod pentru determinarea intensitilor de difracie din difractograma de raze X fr a avea un model structural. Aceasta este o metod de analiz prin cele mai mici ptrate, n care mrimile care trebuie determinate sunt intensitile de difracie. n timp ce metoda Le Bail este o metod iterativ, metoda Pawley rezolv problema de extragere a intensitilor de difracie printr-o tehnic matricial. Mrimea matricei nu este o problem deoarece matricea este cvasidiagonal, termenii nediagonali diferii de zero provin de la suprapunerea maximelor de difracie vecine. Dei procesul de rafinare este n general stabil, maxime de difracie foarte apropiate pot duce uneori la apariia de maxime de difracie negative. Experiena arat c aceasta are loc cnd poziiile a dou maxime de difracie sunt mai apropiate unele de altele cu 0.5 dintr-un pas de nregistrare a difractogramei. Unii autori [13,14] au cutat s elimine maximele negative prin rafinarea mrimii factorilor de structur n schimbul intensitilor de difracie. 2.4.3. Obinerea unui model structural 2.4.3.1. Metoda de cutare n spaiul direct Metoda de cutare n spaiul direct sau metoda grid search este o metod de localizare a unitilor structurale n celula elementar, astfel ca difractograma calculat s se suprapun ct mai bine cu difractograma experimental. Aceast metod nu cere extragerea factorilor de structur din difractogram. Tipul unitilor structurale care trebuie s fie localizate n celula elementar depinde de natura compusului. Putem s avem atomi, grupe de atomi aranjai ntr-o anumit configuraie, molecule, fragmente din molecule. Pentru compuii anorganici avem atomi sau grupe de atomi aranjai sub diverse forme, ca de exemplu, tetraedrii, octaedrii etc. 297

Pentru moleculele organice ca uniti structurale putem s considerm ntreaga molecul ca fiind rigid sau fragmente rigide din molecula care se mic unele n raport cu altele, modificndu-i configuraia prin modificarea unghiurilor de torsiune, eventual a unghiurilor de valen i a distanelor dintre atomi. Astfel pentru fiecare compus avem un numr de grade de libertate care trebuie s fie modificate pn cnd difractograma calculat se suprapune ct mai bine peste difractograma experimental. Pentru moleculele organice, n celula elementar putem avea o molecul sau mai multe n unitatea asimetric, celelalte molecule fiind generate prin operaiile de simetrie ale grupului spaial care caracterizeaz compusul respectiv. Exist diverse tehnici Monte Carlo de cutare a configuraiei optime, dintre care amintim: Rcire simulat (simulated annealing), o variant a acesteia numit Parallel tempering i Tehnica algoritmilor genetici. n cazul metodei de rcire simulat se genereaz configuraii ntmpltoare n spaiul parametrilor de cutare, se testeaz potrivirea dintre difractograma calculat i cea experimental. Ca o msur a potrivirii dintre difractograma calculat i cea experimental, se consider funcia de cost CF. Funcia de cost CF se poate alege n diverse moduri. Una dintre posibiliti este s se aleag ca fiind rezidiul R, definit n felul urmtor:

i wi ( y
Rwp=[

obd i

calc i

)2
]1/2 (16)

i wi ( y ) 2

obs

Dac funcia de cost CF este mai mic dect cea precedent, atunci se reine noua configuraie. Dac CF este mai mare dect cea precedent, atunci se reine noua configuraie cu probabilitatea exp(- CF/T). Probabilitatea relativ a celor dou configuraii de ncercare respect legea lui Boltzman: P1/P2 = exp[(CF2-CF1)/T], T fiind temperatura distribuiei. n timpul procesului de cutare temperatura se scade treptat. Astfel, n faza iniial a procesului de cutare a configuraiei optime se poate uor trece de la un minim local la un alt minim n scopul determinrii minimului absolut, dar n faza final, cnd T este foarte mic, probabilitatea de a gsi un alt minim este de asemenea mic. Exist mai multe programe de calcul care au implementat aceast modalitate de determinare a minimului global, dintre care amintim Powder Solve [15], Fox [16,17]. Totui, pentru a evita s cdem ntr-un minim local, un alt algoritm a fost dezvoltat, i anume Parallel Tempering (PT) [18]. n schimbul utilizrii unui singur lan de configuraii, cu descreterea temperaturii se aleg de la 298

nceput mai multe configuraii (un numr mic de configuraii), fiecare configuraie pornete cu o anumit temperatur care scade treptat. Periodic se testeaz configuraiile paralele i se alege configuraia optim prin aceeai schem ca n cadrul unui singur proces. n felul acesta, posibilitatea de a se obine minime locale este mai mic. 2.4.3.2. Aplicarea unor procedee de calcul pe monocristale la pulberi Dup extragerea intensitilor de difracie prin metoda Le Bail sau Pawley, pentru obinerea modelului structural se poate urma procedeul care se folosete pentru monocristale. Dificultatea adaptrii procedeului de calcul pentru monocristale la pulberi provine din aceea c metodele de calcul sunt metode statistice i necesit un numr mare de intensiti de difracie. n timp ce pentru monocristale se pot colecta cteva mii de intensiti, numrul de intensiti care se pot obine pentru pulberi este de ordinul zecilor, pn la 3 sau 4 sute. Cu toate acestea, n unele cazuri s-au obinut rezultate bune. Paii care trebuie urmai sunt: corectarea intensitilor de difracie de diveri factori, dintre care amintim: Factorul Lorentz, factorul de polarizare, factorul de absorbie, factorul de extincie. Aceste corecii pot s fie fcute i n cadrul extragerii intensitilor de difracie. Determinarea factorului de scal i a factorului global de temperatur. Datorit faptului c atomi oscileaz n jurul poziiilor de echilibru, intensitile acestora se reduc cu un factor de temperatur. Deoarece intensitile de difracie se msoar n uniti arbitrare, intervine un factor de scal K care trebuie determinat. Determinarea fazei factorilor de structur [19,20]. Dac se fac coreciile intensitilor de difracie, se determin factorul de scal i de temperatur, se obine modulul factorilor de structur. Dar factorii de structur sunt numere complexe, faza acestor numere complexe este arbitrar pentru structuri necentrosimetrice i are valoarea 0 sau pentru structuri centrosimetrice, deci n acest caz factorii de structur sunt numere reale pozitive sau negative. Determinarea fazei factorilor de structur cnd se cunoate modulul factorilor de structur este cea mai complex problem n procesul de determinare a structurilor cristaline pentru monocristale. Metodele de determinare a fazei factorilor de structur se numesc n cristalografie metode directe i se bazeaz pe metode statistice aplicate invarianilor i semiinvarianilor. Sinteza Fourier i sinteza Patterson. Cunoscnd factorii de struc299

tur, putem s determinm densitatea electronic de sarcin n celula elementar cu ajutorul urmtoarei relaii:

( x, y , z ) =

1 V

F
hkl

hkl

exp( 2i ( hx + ky + lz ))

(17)

Densitatea electronic de sarcin se exprim direct n uniti electronice astfel nct, unde densitatea electronic este mai mare, exist o probabilitate mai mare s avem atomi i ne indic aproximativ i numrul de atomi Z pentru maximul de densitate electronic respectiv. Pe baza densitii electronice se poate construi un model structural aproximativ. Dac nu s-au determinat fazele factorilor de structur i avem numai modulul acestora, atunci putem face sinteza Patterson, dup relaia: P(u,v,w)=

1 V

h , k ,l

h , k ,l

cos( 2 ( hx + ky + lz ))

(18)

Cu ajutorul acestei relaii putem s determinm distane dintre atomi i mai ales distanele dintre atomii grei. Cu ajutorul sintezei Patterson putem localiza poziiile atomilor grei din celula elementar dac acetia exist. - Rafinarea modelului structural prin metoda celor mai mici ptrate. 2.4.4. Rafinarea structurilor cristaline prin metoda Rietveld Dup obinerea unui model structural este necesar rafinarea parametrilor de care depinde difractograma experimental n aa fel nct difractograma calculat s se suprapun ct mai bine peste difractograma experimental [21]. Ajustarea parametrilor de care depinde difractograma experimental se face prin metoda celor mai mici ptrate. n cazul obinerii modelului structural s-a fcut o cutare global potrivindu-se parametrii de structur astfel nct difractograma calculat s concorde ct mai bine cu difractograma observat. Dintre programele de calcul cel mai utilizat este GSAS [22]. n cazul metodei Rietveld de rafinare se presupune c suntem n apropierea unui minim, de aceea este posibil ajustarea parametrilor prin metoda celor mai mici ptrate, deoarece nu sunt necesare variaii mari ale acestor parametrii. Funcia ce trebuie minimizat este:

S y = wi ( y i y ci ) 2
i

(19)

unde: wi - factorul de pondere i este wi=1/yi, 300

yi - intensitatea observat la pasul i, yci - intensitatea calculat la pasul i. Forma funciei de profil a liniilor de difracie depinde i de semilrgimea la seminlime a liniei de difracie respective. Lrgimea la seminlime se noteaz cu FWHM (full width half maximum) i are urmtoarea dependen unghiular, exprimat prin funcia lui Caglioti [23]:

H 2 = U tan 2 + V tan + W

(20)

unde, H este lrgimea la seminlime i U, V, W sunt parametri care se pot rafina. Calitatea rafinrii se apreciaz pe baza unor indici de rezidiu, care iau n considerare concordana dintre modelul calculat i cel experimental i care se definesc n felul urmtor:

RP =

| y y y
i i

ci

(21)
1/ 2

RWP

wi ( y i y ci ) 2 = 2 wi ( y i )

(22)

unde wi=1/yi i se numesc factori de pondere. Pentru o reuit n rafinarea Rietveld trebuie adoptat o anumit strategie referitoare la ordinea n care se rafineaz diferii parametrii de care depinde difractograma[24]. Din literatur i din experien proprie am constatat c este necesar s se adopte urmtoarea strategie. La nceput se rafineaz factorul de scal, factorul de temperatur i coeficienii polinomului care descriu fondul. n general, fondul difractogramei se descrie cu un polinom a crui grad poate fi ntre 10 i 40. Urmeaz rafinarea deplasrii punctului de zero pentru difractogram. Pentru o difractogram orict de perfect maximele de difracie calculate sunt uor deplasate fa de cele experimentale. n continuare se rafineaz parametrii de reea dup care urmeaz parametrii care descriu profilul liniilor de difracie, factorul care descrie absorbia razelor X, i factorul de polarizare. Profilul liniilor de difracie depinde de parametrii ce caracterizeaz dimensiunile cristalitelor, deformaiile de reea, factorii care descriu asimetria liniilor de difracie etc. n ultimele etape, se rafineaz poziiile atomilor n celula elementar i eventual factorii de ocupare pentru atomi. n ceea ce privete rafinarea poziiilor atomilor n celula elementar, n general trebuie impuse constrngeri, mai ales dac avem un numr mare 301

de atomi pe celula elementar. Exist dou tipuri de constrngeri: constrngeri slabe sau soft restrain [25] i rigid body [26]. Constrngerile slabe este necesar s fie impuse asupra distanelor dintre atomi deoarece exist distane standard dintre atomi, de exemplu CC, CO pentru legturi simple sau duble. Totui, aceste distane pot s varieze ntre anumite limite. La fel se pot impune constrngeri slabe pentru unghiurile de legtur i pentru unitile structurale care sunt planare. De exemplu, pentru ciclu benzenic se impun constrngeri slabe referitoare la planeitatea acestui ciclu [27]. Constrngerile puternice sau rigid body se aplic atunci cnd urmrim ca o grupare de atomi s se mite mpreun sau s se modifice distanele dintre atomi, dar forma ansamblului s nu se schimbe. Acest fel de constrngeri urmrete s se reduc numrul parametrilor ce trebuie rafinai i obinerea unui model de structur realist. De exemplu, n procesul de rafinare a complecilor de incluziune, fiecare din cele apte uniti glicozidice care intr n componena ciclodextrinei mpreun cu atomii de oxigen secundari au fost considerate ca rigid body, permind translaia i rotaia acestora. Unitile glicozidice au fost legate ntre ele prin constrngeri slabe.

3. Prezentarea aparaturii disponibile i stabilirea parametrilor optimi de funcionare pentru diverse tipuri de experimente
Aparatura de difracie disponibil este un difractometru Shimadzu XRD600 prevzut cu un monocromator pentru fasciculul difractat. Difractometru este prevzut cu o baz de date pentru efectuarea de analize calitative i cu software pentru determinarea raportului cristalin-amorf. Suporii de prob adui de firm nu au permis analiza unor cantiti mici de prob, de aceea, au fost adaptai ali supori de prob care s permit difracie pentru cantiti foarte mici de prob. Este recomandat ca difractometrul s fie aliniat n fiecare diminea nainte de a ncepe experimentele. Pe lng aceasta, mai este necesar o calibrare mai complect la fiecare lun. Modul de aliniere i calibrarea lunar se gsesc n documentaia de folosire a difractometrului. Pentru o mai mare siguran referitoare la punctul de zero al difractometrului, este necesar ridicarea unei difractograme pentru un etalon de siliciu. Aceasta ar trebui fcut sptmnal. Timpul de nregistrare pentru difractograme i fantele folosite depind de tipul de msurtori efectuate. Pentru analiza calitativ, timpul de nregistrare este suficient s fie 0/minut. n cazul n care se fac msurtori pentru compui anorganici cu 2 302

celula elementar mic, msurtorile trebuie s se fac aproximativ ntre 10 si 800, iar pentru compui organici care au celula elementar mai mare ntre 3 si 450. Pentru analiza cantitativ de faze este indicat s se lucreze cu metoda standardului intern, care poate fi chiar proba cntrit din etalonul de Si. n cazul n care se ncearc determinarea structurii pentru un nou compus, timpul de nregistrare trebuie s fie mare, eventual s se lase aparatul s funcioneze i peste noapte, adic timpul de nregistrare s fie n jur de 20 ore. n acest caz, fantele trebuie s fie ct mai nguste. Pentru indexarea compuilor i determinarea parametrilor de reea este indicat s se foloseasc i standard intern deoarece n acest caz se poate evalua mai precis punctul de zero al difractometrului i se pot determina mai exact poziiile liniilor de difracie. Pentru analiza microstructural nu este necesar nregistrarea difractogramei pe ntreg domeniul, ci doar nregistrarea maximelor de difracie care trebuie s se fac ct mai precis. Dac se lucreaz cu probe care conin Fe sau Mn este de dorit s se foloseasc tub de Cr care exist n dotarea laboratorului. Tubul de Cu d fluorescen pentru probele care conin Fe sau Mn. De asemenea, adncimea de ptrundere a razelor X este mult mai mic n cazul utilizrii tubului de Cr, de aceea, cnd dorim s vedem efectele structurale de suprafa sau cnd avem prob puin, este avantajos utilizarea tubului de Cr. Din punct de vedere tehnic, este indicat s se controleze filtrele pentru ap odat la 3 luni i, dac este cazul, s fie curate. Nu este indicat achiziionarea de tuburi de raze X care s nu se utilizeze deoarece tuburile de raze X se deterioreaz n timp, chiar dac acestea nu funcioneaz.

4. Bibliografie
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Fundamentals of crystallography, Ed. C. Giacovazzo, Oxford University Press 2002. H.P. Klug and L.E. Alexander X-Ray Diffraction Procedures J. Willey& Sons, Inc 1974. Eds D.L.Bish and J.E. Post, Powder Diffraction Reviews in Mineralogy Vol 20 1989. Ed. R.E. Dinnebier and S.J.L. Billinge, Powder diffraction, R.S.C Publishing 2008. P.M. de Woolff. J. Appl. Cryst. 1, 108-113 (1968). G.S. Smith and R.L. Snyder J. Appl. Cryst. 10, 252-255 (1977). J.W. Visser J. Appl. Cryst. 2, 89 (1969). A. Boultif, D.Louer J. Appl. Cryst. 24, 987-993 (1991). M. Neumann J. Appl. Cryst. 36, 356-365 (2003).

303

10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27.

P.E. Werner, L.Eriksson, M. Westdahl J. Appl. Cryst. 18, 367-370 (1985). A. Le Bail, H. Duroy, J.L. Fourquet Mater. Res. Bull. 23, 447-452 (1988). G.S. Pawley J. Appl. Crystallogr. 14, 357-361 (1981). G.E. Engel, S. Wike, O. Konig, K.D.M. Harris, F. Leuse. J. Appl. Crystallogr. 32, 1169-1179 (1999). Coelho J. Appl. Crystallogr. 33, 899-908 (2000). G.E.Engel, S.Wilke, O. Koning, K.D.Harris, F.J. Leusen J. Appl. Cryst. 32, 1169 (1999). V. Favre-Nicolin and R. Cerny J. Appl. Cryst. 35, 734-743 (2002). V. Favre-Nicolin and R. Cerny Z. Kristallogr. 219, 847-856 (2004). M. Falcioni, M.W. Deem J. Chem. Phys. 110, 1754-1766 (1999). Fundamentals of crystallography, Ed. C. Giacovazzo, Oxford University Press 2002. C. Giacovazzo, Direct phasing in crystallography, Oxford Science Publications 1999. H.M Rietveld J. Appl. Cryst. 2, 65-71 (1969). A.C. Larson & R.B. Von Dreele General Structure Analysis System (GSAS). Report LAUR 86-748. Los Alamos National Laboratory, NM, 87545, USA. The Rietveld Method, Ed. R.A. Young Oxford University Press (1993). L.B. McCusker, R.B. Von Dreele, D.E. Cox, D. Louer and P.Scardi J. Appl. Cryst. 32, 36-50 (1999). H. Nowell, J.P. Attfield and J.C. Cole Acta Cryst. B B58, 835-840 (2002). R.E. Dinnebier Powder Diffraction 14, 84-92 (1999). D. Mentzafos, I.M. Mavridis, G. Le Bas, G. Tsoucaris Acta. Cryst. B47, 746-757 (1991).

304

Determinarea structurii cristaline prin difracie de raze X

C.S.I. dr. Gheorghe Borodi Cuprins
1. Indexarea difractogramelor ................................................................................................. 306 1.1. Condiiile pe care trebuie s le ndeplineasc o difractogram pentru a putea fi indexat corect ............................................................................................................. 307 1.2. Algoritmi de indexare .................................................................................................. 307 1.3. Cteva metode uzuale de idexare ................................................................................. 309 2. Obinerea modelului structural .......................................................................................... 311 2.1. Metodele pentru monocristale aplicate la pulberi ........................................................ 311 2.1.1. Extragerea intensitilor de difracie.................................................................. 311 2.1.2. Aplicarea unor procedee de calcul pe monocristale la pulberi ............................ 312 2.2. Metoda de cutare n spaiul direct ............................................................................. 314 3. Rafinarea structurilor cristaline prin metoda Rietveld ....................................................... 316 4. Exemple privind determinarea structurii cristaline din pulberi ......................................... 319 4.1. Determinarea structurii cristaline pentru complexul de incluziune Atenolol + ciclodextrina. ........................................................................................ 319 4.2. Structura cristalin pentru N-(5-etil-[1,3,4]-tiadiazol-2-il0-toluensulfonamida........ 322 5. Bibliografie .......................................................................................................................... 325

Determinarea structurii cristaline este foarte important, att n diferitele ramuri ale tiinei, ct i n industrie i tehnologie, deoarece proprietile materialelor n stare solid depind de structura cristalin i molecular a acestora. Pentru orice compus nou preparat ntr-un anumit fel este de dorit s se determine structura cristalin. A determina structura cristalin pentru un anumit compus nseamn determinarea sistemului cristalografic n care acesta cristalizeaz, a parametrilor celulei elementare, a grupului spaial i a poziiilor atomilor n celula elementar. Determinarea structurii cristaline se face n principal prin difracie de raze X, dar de foarte mare ajutor sunt metodele spectroscopice i de modelare molecular care pot s furnizeze informaii structurale deosebit de utile. n general, structura cristalin se determin din monocristale. n cazul n care nu se pot obine monocristale se ncearc determinarea structurii cristaline din pulberi. Determinarea structurii cristaline din pulberi este mai dificil deoarece, n timp ce la monocristale se pot colecta mii de intensiti de difracie, n cazul pulberilor, se obin doar cteva zeci. Pe lng aceasta, foarte multe intensiti de difracie se suprapun, iar extragerea acestora este dificil i afectat de erori. Totui, 305

n ultimul timp, datorit creterii puterii de calcul i rezoluiei difractometrelor, foarte multe structuri cristaline au fost determinate din pulberi. Deoarece n cadrul ICE exist difractometru pentru pulberi ne vom ocupa doar de determinarea structurii cristaline din pulberi cristaline. Etapele principale pentru determinarea structurii cristaline din pulberi sunt: indexarea difractogramelor, obinerea modelului structural i rafinarea Rietveld a modelului obinut. Vom descrie aceste etape, iar la final se vor da cteva exemple de determinare a structurii cristaline din pulberi.

1. Indexarea difractogramelor
A indexa o difractogram nseamn a determina sistemul cristalografic, parametrii celulei elementare i atribuirea fiecrei linii de difracie a indicilor Miller corespunztori. Celula elementar este un paralelipiped n interiorul cruia se gsesc atomii sau moleculele i dac acesta se translateaz dup cele 3 direcii, atunci se obin poziiile tuturor atomilor din celula elementar. n general, o celul elementar se poate defini n mai multe moduri, dar se alege acea celul care are volumul ct mai mic i simetria ct mai mare. Indexarea difractogramelor este primul pas n determinarea structurii cristaline, dac aceasta nu este fcut corect, nu se poate determina structura cristalin. Dificultatea indexrii provine din faptul c, n cazul pulberilor, datele experimentale sunt proiecia unidimensional a reelei reciproce care este tridimensional. Astfel, din difractogramele pe pulberi se determin unghiurile de difracie din care rezult modulul unui numr limitat de vectori din reeaua reciproc din care se dorete s se reconstituie ntreaga reea reciproc. Aceasta este total diferit fa de cazul determinrii structurii cristaline din monocristale, unde se determin att modulul, ct i direcia pentru un numr foarte mare de vectori din reeaua reciproc. Astfel, n timp ce n cazul difraciei pe monocristale se obin mii de vectori din reeaua reciproc, la difracia pe pulberi se obin doar cteva zeci de unghiuri de difracie din care se determin modulul vectorilor corespunztori din reeaua reciproc. Dificultile n indexarea difractogramelor provin din erorile legate de determinarea poziiilor maximelor de difracie, dac poziiile maximelor de difracie ar fi determinate exact, indexarea ar fi imediat. De asemenea, trebuie menionat c indexarea este cu att mai dificil cu ct simetria este mai sczut. Astfel, cel mai uor se indexeaz compuii care cristalizeaz n sistemul cubic i, cel mai dificil, compuii care cristalizeaz n sistemul triclinic. Aceasta deoarece, cu ct sistemul cristalografic are simetrie mai joas, cu att are mai multe linii de difracie, dintre care unele se suprapun 306

parial, ceea ce face ca s nu se poat determina precis poziiile maximelor de difracie.

1.1 Condiiile pe care trebuie s le ndeplineasc o difractogram pentru a putea fi indexat corect sunt:
a) S existe linii de difracie observabile la unghiuri ct mai mici. Aceasta deoarece la unghiuri mici peak-urile de difracie sunt mai rare i ansele de a se suprapune sunt mai mici. b) Numrul de extincii pentru maximele de difracie la unghiuri mici s nu fie foarte mare. Dac, de exemplu, unul dintre indicii Miller este tot timpul par din cauza reflexiilor interzise, atunci la indexare s-ar putea s avem o celul cu o constant de reea dubl fa de cea real. c) S avem o precizie mare pentru determinarea poziiilor de difracie. Erorile sistematice sunt mai nefavorabile pentru indexare dect erorile ntmpltoare. Cele mai importante erori sistematice sunt poziia de zero a difractometrului i deplasarea probei. Erorile sistematice pot s fie minimizate prin alinierea difractometrului. Pentru corectarea erorilor sistematice se poate folosi att standard extern, ct i standard intern. Cea mai precis corecie se face prin utilizarea de standard intern. Aceasta presupune introducerea n proba de analizat a unui compus pentru care se tiu exact poziiile maximelor de difracie. d) S nu existe impuriti n proba de analizat. Acest lucru este foarte important deoarece nu se poate distinge ntre liniile de difracie ale compusului i liniile de difracie ale impuritii. n general, dac avem impuriti, obinem o celul elementar incorect. n programele de calcul elaborate n ultimul timp se poate face indexarea chiar cnd exist un numr mic de reflexii care aparin impuritilor i acestea sunt excluse dac celelalte linii de difracie se potrivesc cu celula elementar gsit. Indexarea este cu att mai dificil cu ct simetria reelei cristaline este mai joas. Astfel, definirea celulei elementare pentru sistemul cubic depinde de un singur parametru, pentru sistemul ortorombic depinde de trei parametrii, iar pentru sistemul triclinic depinde de ase parametrii. Indexarea difractogramelor se face n mod automat folosind diferii algoritmi de calcul[1].

1.2 Algoritmi de indexare

Exist dou abordri pentru algoritmii de indexare i anume cutarea n spaiul direct i n spaiul reciproc. n cazul cutrii n spaiul direct, se variaz parametrii celulei elementare ntr-un anumit mod i se aleg acele 307

valori pentru care poziiile maximelor de difracie calculate se potrivesc ct mai bine cu cele observate. La cutarea n spaiul reciproc se caut s se gseasc vectorii elementari ai celulei reciproce folosind unghiurile de difracie. Vectorii reelei reciproce sunt legai de unghiurile de difracie prin relaia (2sin )/ =1/d. Deci se cunosc un numr limitat de vectori ai reelei reciproce i se urmrete s se gseasc vectorii elementari ai reelei reciproce care s genereze ntreaga reea reciproc. Din vectorii elementari ai reelei reciproce rezult imediat vectorii elementari ai reelei directe. Timpul de calcul, dac se lucreaz n spaiul direct, este mult mai mare dect n spaiul reciproc. n cazul indexrii, utiliznd spaiul direct, se variaz parametrii celulei elementare a,b,c cu aproximativ 0.01 i unghiurile , , cu 0.10 i se caut cea mai bun potrivire dintre poziiile calculate i observate ale unghiurilor de difracie. Aceast metod este metoda direct de cutare n spaiul direct. O alt posibilitate de cutare este utilizarea metodei Monte Carlo. Exist i posibilitatea utilizrii algoritmilor genetici pentru indexarea difractogramelor. Aceasta este tot o variant a metodei Monte Carlo. Dintre programele de calcul care utilizeaz cutarea n spaiul direct, merit menionate urmtoarele: Autox [2], McMaille [3] i SVDIndex [4] care se bazeaz pe metode de cutare de tip Monte Carlo. O alt tehnic de indexare foarte puternic i care este implementat n programul de calcul de ctre firma Bruker Topas, este o metod iterativ i Monte Carlo ce utilizeaz poziiile liniilor de difracie pe baza descompunerii difractogramei i extragere a intensitilor de difracie LSI (Least Square Indexing) and LP-Search [5]. Metodele de indexare care utilizeaz spaiul reciproc sunt mai eficiente dect cele de cutare n spaiul direct, mai ales n cazul compuilor cu simetrie sczut. Cutarea n spaiul reciproc poate fi implementat n dou variante, i anume: metoda de ncercare i eroare i metoda de cutare pe zone. Prima este mai eficient pentru sisteme cu simetrie ridicat de la cubic la ortorombic, iar a doua variant este mai eficient pentru sisteme cu simetrie joas, n special pentru sistemul triclinic i monoclinic. Metoda de ncercare i eroare se bazeaz pe atribuirea de indici Miller la un numr minim de peak-uri de difracie, care se numete setul de baz i care sunt liniile de difracie cu cele mai mici unghiuri. Numrul unghiurilor de difracie din setul de baz este egal cu numrul parametrilor ce caracterizeaz celula elementar. Astfel, pentru sistemul cubic numrul unghiurilor din setul de baz este 1 pentru sistemul tetragonal, este 2 i aa mai departe, pentru sistemul triclinic fiind 6. Valoarea indicilor Miller variaz ntre 0 308

i valori maxime preselectate pentru h,k, l notate cu hm, km, lm. Aceste valori sunt ntre 2 i 4. Pentru fiecare permutare a indicilor se determin parametrii celulei elementare, se genereaz unghiurile de difracie i se verific dac unghiurile calculate se potrivesc cu cele experimentale. Se rein acei parametrii de reea pentru care unghiurile calculate se potrivesc cel mai bine cu unghiurile experimentale i care indexeaz toate sau aproape toate unghiurile experimentale. Se testeaz toate sistemele cristalografice ncepnd de la sistemul cubic pn la sistemul triclinic. Metoda cutrii pe zone ncepe prin cutarea zonelor unidimensionale, adic de tipul h,0,0; 0,h,0; 0,0,l i bidimensionale, adic de tipul h,k,0; h,0,l; 0,k,l i construirea zonelor tridimensionale utiliznd liniile comune din zonele bidimensionale. Cnd o zon tridimensional (reeaua) a fost construit, se ncearc atribuirea indicilor Miller pentru toate reflexiile Bragg observate.

1.3 Cteva metode uzuale de idexare

Metoda Treor. Aceast metod este o metod de cutare n spaiul reciproc i se bazeaz pe atribuirea unor indici Miller la primele linii de difracie, dup care se calculeaz parametrii celulei elementare [6]. Avnd parametrii celulei elementare, se genereaz toate poziiile posibile ale maximelor de difracie i se verific dac poziiile unghiulare ale maximelor de difracie observate sunt incluse n cele calculate n limita unor erori de msur, dup care se calculeaz factorul de ncredere. Operaia se repet atribuind ali indici Miller primelor maxime de difracie i se ordoneaz soluiile n ordinea descresctoare a factorilor de ncredere. Se rein acele valori ale parametrilor de reea care se potrivesc cel mai bine cu valorile experimentale i se calculeaz pentru acestea factorul de ncredere. Cu acest program se poate indexa orice sistem cristalografic, dar cele mai bune rezultate se obin pentru sistemele cu simetrie ridicat. Metoda Dicvol. Metoda Dicvol [7] este o metod de cutare n spaiul direct i se bazeaz pe metoda dihotomiei care const n variaia lungimilor celulei elementare i a unghiurilor dintre axe ntre anumite limite i reducerea intervalelor respective, dac n intervalul respectiv se gsete soluia elementar. Programele de calcul care fac indexarea prin metoda Dicvol ncep de la sistemul cubic, care este de simetria cea mai ridicat i termin cu sistemul triclinic. Dac difractograma experimental are i impuriti, atunci aceast metod nu poate s fac corect indexarea deoarece nu are posibilitatea s dis309

ting ntre liniile de difracie ale compusului i ale impuritilor. O metod asemntoare cu Dicvol i care se bazeaz tot pe procedeul dihotomiei, dar care nu este foarte sensibil la impuriti se numete X-cel [8]. Cu aceast metod de indexare se obine i grupul spaial la care aparine compusul. Metoda Ito. Aceast metod de calcul, mpreun cu programul aferent, realizeaz o cutare a zonelor n spaiul reciproc i transformare a axelor celulei pentru a gsi o celul ct mai potrivit [9]. Cele mai comune versiuni sunt ITO13 i ITO15. Pentru a se indexa cu aceast metod se parcurg urmtorii pai: a) Gsirea potenialelor zone utiliznd primele 20 unghiuri Bragg; b) Construirea reelelor tridimensionale prin gsirea de zone bidimensionale care au o zon unidimensional comun; c) Reducerea celulei gsite i transformarea acesteia n una din cele 14 reele Bravais; d) Atribuirea indicilor Miller pentru toate maximele observate i calcularea figurilor de merit. Programul Ito este folosit n special pentru indexarea sistemelor cu simetria joas, n special triclinic i monoclinic. Programul cere cel puin 20 de reflexii Bragg i nu funcioneaz cu mai puine linii de difracie. Un numr de 30-35 de reflexii Bragg este recomandat. Pe lng aceste programe de calcul am mai elaborat i noi un program [10] care se bazeaz pe cutarea n spaiul direct pentru parametrii reelei cuprini ntr-un anumit interval i cu un anumit pas. Pentru fiecare combinaie de parametrii ai celulei elementare se genereaz poziiile maximelor de difracie. Maximelor de difracie experimentale li se pun n coresponden cele mai apropiate maxime de difracie calculate, se calculeaz eroarea medie dintre poziiile maximelor calculate i cele experimentale i se trece la pasul urmtor. Se ordoneaz soluiile n ordinea descresctoare a erorii medii. Programul mai ine cont de densitatea aproximativ a compusului i de numrul posibil de molecule pe celula elementar. Ca o remarc general: cu ct poziiile liniilor de difracie sunt determinate mai precis i cu ct proba de analizat este mai pur, cu att ansa de a obine mai repede soluia corect la indexare este mai mare. n general, din programele de indexare rezult mai multe soluii foarte diverse ntre ele. O prim observaie este c dac nu au fost indexate toate liniile de difracie, rmnnd una sau dou linii de difracie neindexate, s-ar putea ca soluia s fie corect, cu condiia ca liniile de difracie neindexate s fie de mic intensitate i, n acest caz, acestea s aparin unor impuriti, dar aceasta trebuie confirmat. O alt observaie n alegerea soluiei corecte se refer la densitatea calculat. Dup indexare cunoatem volu310

mul celulei elementare i dac presupunem un anumit grup spaial putem determina numrul de molecule pe celula elementar i de aici densitatea. Densitatea calculat trebuie s aib o valoare rezonabil n funcie de elementele care se gsesc n compus. Dac s-a determinat densitatea experimental, atunci o putem compara cu densitatea calculat i s confirmm dac indexarea poate fi corect cu soluia aleas. Un alt criteriu foarte important este valoarea figurii de merit. Dac indexarea se face cu Dicvol, Treor sau Ito, figura de merit trebuie s fie neaprat mai mare ca 4. Dac indexarea este corect, atunci putem s mergem mai departe pentru a obine modelul structural i s-l rafinm, n caz contrar, modelul structural obinut nu va putea fi rafinat.

2. Obinerea modelului structural

Pentru obinerea modelului structural exist dou posibiliti, i anume: metode utilizate n cazul monocristalelor i metode de cutare n spaiul direct. Vom descrie pe scurt cele dou tipuri de metode.

2.1 Metodele pentru monocristale aplicate la pulberi

n acest caz, mai nti se extrag intensitile de difracie deoarece se tie c n cazul difraciei pe pulberi foarte multe intensiti de difracie se suprapun. Exist dou tehnici de extragere a intensitilor de difracie, i anume, metoda Le Bail i metoda Pawley. Vom descrie pe scurt cele dou metode. 2.1.1 Extragerea intensitilor de difracie Metoda Le Bail de extragere a intensitilor de difracie este inspirat din metoda Rietveld. Rietveld a propus un algoritm simplu de evaluare a factorilor de structur observai pentru o suprapunere parial sau total a maximelor de difracie. Le Bail a extins aceast metod pentru estimarea valorilor absolute a factorilor de structur, cnd nu exist un model structural. Le Bail a propus o metod iterativ de determinare a intensitilor de difracie observate. Intensitile de difracie pentru iteraia (r+1) se exprim n funcie de intensitile de difracie pentru iteraia r. Rezultatele intensitilor de difracie extrase nu depind de valoarea intensitilor iniiale. Ca intensiti de pornire, se pot considera valorile calculate ale intensitilor de difracie. Dei metoda este n general robust, exist i cazuri cnd prezint instabiliti, mai ales atunci cnd fondul de difracie este supraestimat. Dar cel mai important aspect care a contribuit la creterea popularitii metodei 311

Le Bail este c aceasta poate s fie uor ncorporat n tehnica Rietveld de rafinare. Metoda Pawley este o metod pentru determinarea intensitilor de difracie din difractograma de raze X, care nu necesit un model structural. n timp ce metoda Le Bail este o metod iterativ, metoda Pawley rezolv problema de extragere a intensitilor de difracie printr-o tehnic matricial. Mrimea matricei nu este o problem deoarece matricea este cvasidiagonal, termenii nediagonali diferii de zero provin de la suprapunerea maximelor de difracie vecine. Dei procesul de rafinare este n general stabil, maxime de difracie foarte apropiate pot duce uneori la apariia de maxime de difracie negative. Experiena arat c aceasta are loc cnd poziiile a dou maxime de difracie sunt mai apropiate unele de altele cu 0.5 dintr-un pas de nregistrare a difractogramei. Unii autori au cutat s elimine maximele negative prin rafinarea mrimii factorilor de structur, n schimbul intensitilor de difracie. 2.1.2 Aplicarea unor procedee de calcul pe monocristale la pulberi Dup extragerea intensitilor de difracie prin metoda Le Bail sau Pawley, pentru obinerea modelului structural se poate urma procedeul care se folosete pentru monocristale. Dificultatea adaptrii procedeului de calcul pentru monocristale la pulberi provine din aceea c metodele de calcul sunt metode statistice i necesit un numr mare de intensiti de difracie. n timp ce pentru monocristale se pot colecta cteva mii de intensiti, numrul de intensiti care se pot obine pentru pulberi este de ordinul a zecilor pn la 3 sau 4 sute. Cu toate acestea, n unele cazuri s-au obinut rezultate bune. Paii care trebuie urmai sunt: (i) Corectarea intensitilor de difracie. Primul pas, dup ce au fost obinute intensitile de difracie, este corectarea acestora de factori fizici sau geometrici care afecteaz intensitile de difracie. Acetia sunt: Factorul Lorentz, factorul de polarizare, factorul de absorbie i factorul de extincie. Aceste corecii pot s fie fcute i n cadrul extragerii intensitilor de difracie. (ii) Determinarea factorului de scal i a factorului global de temperatur. Datorit faptului c atomii oscileaz n jurul poziiilor de echilibru, intensitile acestora se reduc cu un factor de temperatur. (iii) Determinarea fazei factorilor de structur. Dac se fac coreciile intensitilor de difracie, se determin factorul de scal i de temperatur i se obine modulul factorilor de structur. Dar factorii de 312

structur sunt numere complexe, faza acestor numere complexe este arbitrar pentru structuri necentrosimetrice i are valoarea 0 sau pentru structuri centrosimetrice, deci n acest caz factorii de structur sunt numere reale pozitive sau negative. Determinarea fazei factorilor de structur cnd se cunoate modulul factorilor de structur este cea mai complex problem n procesul de determinare a structurilor cristaline pentru monocristale. Metodele de determinare a fazei factorilor de structur se numesc n cristalografie metode directe i se bazeaz pe metode statistice i probabiliti condiionate. (iv) Sinteza Fourier i sinteza Patterson. Cunoscnd factorii de structur, putem s determinm densitatea electronic de sarcin n celula elementar, cu ajutorul relaiei:

1 Fhkl exp( 2i(hx + ky + lz )) V hkl Densitatea electronic de sarcin se exprim direct n uniti electronice astfel nct, dac densitatea electronic este mai mare, exist o probabilitate mai mare s avem atomi i ne indic aproximativ i numrul de atomi Z pentru maximul de densitate electronic respectiv. Pe baza densitii electronice se poate construi un model structural aproximativ. Dac nu s-au determinat fazele factorilor de structur i avem numai modulul acestora, atunci putem face sinteza Patterson, dup relaia: 2 1 P(u,v,w) = Fh , k ,l cos( 2 ( hx + ky + lz )) V h , k ,l unde u, v, w reprezint respectiv x, y, z. Cu ajutorul acestei relaii putem s determinm distane dintre atomi i, mai ales, distanele dintre atomii grei. Cu ajutorul sintezei Patterson putem localiza poziiile atomilor grei din celula elementar, dac acetia exist. (v) Rafinare Fourier. Modelele structurale obinute prin metodele directe sau metoda Patterson sunt adesea incomplete chiar i pentru monocristale, iar pentru pulberi cu att mai mult pentru c numrul de intensiti experimentale este mult mai mic. Pentru a mbunti i completa modelul se apeleaz la tehnici de rafinare Fourier. Cele mai importante tehnici de rafinare Fourier sunt: Sinteze Fourier succesive i Sinteza Diferen.

( x, y , z ) =

313

2.2. Metoda de cutare n spaiul direct

Metoda de cutare n spaiul direct sau metoda grid search este o metod de localizare a unitilor structurale n celula elementar, astfel ca difractograma calculat s se suprapun ct mai bine cu difractograma experimental. Aceast metod nu cere extragerea factorilor de structur din difractogram. Tipul unitilor structurale care trebuie s fie localizate n celula elementar depinde de natura compusului. Putem s avem atomi, grupe de atomi aranjai ntr-o anumit configuraie, molecule, fragmente din molecule. Pentru compuii anorganici avem atomi sau grupe de atomi aranjai sub diverse forme, ca de exemplu, tetraedrii, octaedrii etc. Pentru moleculele organice ca uniti structurale putem s considerm ntreaga molecul ca fiind rigid sau fragmente rigide din molecula care se mic unele n raport cu altele, modificndu-i configuraia prin modificarea unghiurilor de torsiune, eventual a unghiurilor de valen i a distanelor dintre atomi. Astfel, pentru fiecare compus avem un numr de grade de libertate care trebuie s fie modificate pn cnd difractograma calculat se suprapune ct mai bine peste difractograma experimental. Pentru moleculele organice, n celula elementar putem avea o molecul sau mai multe n unitatea asimetric, celelalte molecule fiind generate prin operaiile de simetrie ale grupului spaial care caracterizeaz compusul respectiv. S presupunem c avem doar o molecul pe celula elementar. n acest caz, avem n mod obligatoriu 3 grade de libertate de translaie, 3 grade de libertate de rotaie. La aceasta se adaug gradele de libertate interne legate de modificarea configuraiei moleculare prin modificarea unghiurilor de torsiune, unghiurilor de legtur dintre atomi i, mai rar, distane. S presupunem c la cele 6 grade de libertate (translaii i rotaii) se adaug doar 4 grade de libertate interne i s avem n total 10 grade de libertate. Dac, de exemplu, presupunem c pentru fiecare grad de libertate corespunde doar 10 zece pai de cutare, rezult c numrul total de configuraii care trebuie s fie testat este de 10x10=1010, ceea ce cere un timp foarte mare de calcul. Aceasta nseamn c nu se pot testa toate configuraiile i de aceea se apeleaz la metode probabilistice, ca de exemplu, metoda Monte Carlo invers [11]. Exist diverse tehnici Monte Carlo de cutare a configuraiei optime, dintre care amintim: Rcire simulat (simulated annealing), o variant a acesteia numit parallel tempering i tehnica algoritmilor genetici. n cazul metodei de rcire simulat, se genereaz configuraii ntmpltoare n spaiul parametrilor de cutare, se testeaz potrivirea dintre difractograma calculat i cea expe314

rimental. Ca o msur a potrivirii dintre difractograma calculat i cea experimental, se consider funcia de cost CF. Funcia de cost CF se poate alege n diverse moduri. Una dintre posibiliti este s se aleag ca fiind reziduul R, definit n felul urmtor: Rwp=[

i wi ( y

obd i

calc i

)2

i wi ( y )

obs 2

]1/2

Dac funcia de cost CF este mai mic dect cea precedent, atunci se reine noua configuraie. Dac CF este mai mare dect cea precedent, atunci se reine noua configuraie, cu probabilitatea exp(- CF/T). Probabilitatea relativ a celor dou configuraii de ncercare respect legea lui Boltzman: P1/P2=exp[(CF2-CF1)/T], T fiind temperatura distribuiei. n timpul procesului de cutare, temperatura se scade treptat. Astfel, n faza iniial a procesului de cutare a configuraiei optime, se poate uor trece de la un minim local la un alt minim, n scopul determinrii minimului absolut, dar n faza final, cnd T este foarte mic, probabilitatea de a gsi un alt minim este de asemenea mic. Exist mai multe programe de calcul care au implementat aceast modalitate de determinare a minimului global, dintre care amintim, Powder Solve [12], Fox [13,14]. Totui, pentru a evita probabilitatea s cdem ntr-un minim local, un alt algoritm a fost dezvoltat, i anume, Parallel Tempering (PT) [15]. n schimbul utilizrii unui singur lan de configuraii cu descreterea temperaturii, se aleg de la nceput mai multe configuraii (un numr mic de configuraii), fiecare configuraie pornete cu o anumit temperatur care scade treptat. Periodic se testeaz configuraiile paralele i se alege configuraia optim prin aceeai schem ca n cadrul unui singur proces. n felul acesta, posibilitatea de a se obine minime locale este mai mic. n procesul de cutare a minimului global ca i Cost Function, poate s se introduc ca i criteriu pentru modelul obinut, n afar de potrivirea dintre difractograma calculat i cea observat, minimizarea energiei poteniale de interaciune inter - i intramolecular. Pentru ca unitile structurale s nu se apropie foarte mult unele de altele, se poate introduce un factor numit anti-bump. Difractogramele pot fi modelate ca o sum de dou funcii, i anume, funcia care descrie fondul (background) i o funcie care sumeaz liniile de difracie, fiecare linie de difracie fiind centrat corespunztor. Profilul liniilor de difracie se descrie de obicei prin funcii standard de tipul Gaussiana, Lorentziana sau pseudos-Voigt. Orientarea preferenial poate fi descris prin funcii de tip March-Dollase. 315

3. Rafinarea structurilor cristaline prin metoda Rietveld

Dup obinerea unui model structural, este necesar rafinarea parametrilor de care depinde difractograma experimental n aa fel nct difractograma calculat s se suprapun ct mai bine peste difractograma experimental [16]. Ajustarea parametrilor de care depinde difractograma experimental se face prin metoda celor mai mici ptrate. n cazul obinerii modelului structural, s-a fcut o cutare global, potrivindu-se parametrii de structur astfel nct difractograma calculat s concorde ct mai bine cu difractograma observat. Dintre programele de calcul, cel mai utilizat este GSAS [17]. n cazul metodei Rietveld de rafinare se presupune c suntem n apropierea unui minim, de aceea este posibil ajustarea parametrilor prin metoda celor mai mici ptrate, deoarece nu sunt necesare variaii mari ale acestor parametrii. Funcia ce trebuie minimizat este: (1) S y = wi ( y i y ci ) 2

unde yi si yci sunt intensitile observate i calculate la pasul i, iar wi=1/yi este factorul de ponderare. yci depind de o serie de factori, i anume: de factorii de structur i indicii Miller corespunztori factorilor de structur respectivi, factorul de scal, factorul Lorentzpolarizare, factorul de absorbie, funcia de profil pentru liniile de difracie, fondul de difracie n punctul respectiv etc. Cu alte cuvinte, yci este difractograma care se calculeaz la pasul i pentru c difractograma se calculeaz n pai, dndu-se intensitatea de difracie la fiecare pas. Expresia factorilor de structur este dat de relaia:

Fhkl

B sin 2 = N j f j exp[2(hx j + ky j + lz j )]exp 2 j

(2)

unde: Nj - factorul de ocupare, fj - factorul de structur pentru atomul j; xj, yj, zj - coordonatele atomului j; B - factorul de temperatur (care se datorete vibraiilor termice). Forma liniilor de difracie este o convoluie datorat probei i efectelor instrumentale. Profilul liniei de difracie, , se poate aproxima prin diverse funcii: de tip Gauss, Lorentz, pseudo-Voigt, etc. Dintre acestea, cea mai utilizat este funcia pseudo Voigt, pV, care este descris ca fiind o combinaie a funciei Gauss i Lorentz:

316

pV = L + (1-)G unde: pV - funcia pseudo-Voigt , L fiind funcia Lorentz, G funcia Gaus iar parametru de amestecare a celor dou funcii. Forma funciei de profil a liniilor de difracie depinde i de semilrgimea la seminlime a liniei de difracie respective. Lrgimea la seminlime se noteaz cu FWHM (full width half maximum) i are urmtoarea dependen unghiular, exprimat prin funcia lui Caglioti[18]:

H 2 = U tan 2 + V tan + W

(3)

unde, H este lrgimea la seminlime i U, V, W sunt parametri care se pot rafina. PK este funcia care descrie orientarea preferenial. Orientarea preferenial are loc cnd cristalitele din prob tind s se orienteze preferenial dup anumite direcii. Aceasta face ca unele maxime de difracie s fie mai intense, iar altele mai puin intense fa de cazul cnd nu ar exista orientare preferenial. Orientarea preferenial poate fi modelat matematic cu ajutorul unor funcii, ca de exemplu, March-Dollase [19]:

I cor = I obs (G 2 cos2 K +

1 2 sin K ) 3 / 2 G

(4)

unde, Icor - intensitatea corectat pentru orientare preferenial, Iobs - intensitatea msurat, K - unghiul ascuit dintre vectorul de mprtiere pentru reflexia K i direcia preferenial de orientare a planului cristalitelor fa de planul probei, G - coeficientul March care variaz ntre 0 i 1, unde 0 se refer la 100% orientare preferenial a cristalitelor n prob i 1 se refer la orientare complet ntmpltoare a cristalitelor. Calitatea rafinrii se apreciaz pe baza unor indici de rezidiu, care iau n considerare concordana dintre modelul calculat i cel experimental i care se definesc n felul urmtor:

RB = RP =

| I

K ( obs )

| y y y
i i

I K ( calc) |

(5) (6)

K ( obs ) ci

317

RWP

2 wi ( y i y ci ) = 2 wi ( y i )

1/ 2

(7)

Cei mai utilizai indici sunt RP si RWP. Pentru o reuit n rafinarea Rietveld trebuie adoptat o anumit strategie referitoare la ordinea n care se rafineaz diferii parametrii de care depinde difractograma [20]. Din literatur i din experiena proprie, am constatat c este necesar s se adopte urmtoarea strategie. La nceput se rafineaz factorul de scal, factorul de temperatur i coeficienii polinomului care descriu fondul. n general fondul difractogramei se descrie cu un polinom a crui grad poate fi ntre 10 i 40. Urmeaz rafinarea deplasrii punctului de zero pentru difractogram. Pentru o difractogram orict de perfect, maximele de difracie calculate sunt uor deplasate fa de cele experimentale. n continuare se rafineaz parametrii de reea dup care urmeaz parametrii care descriu profilul liniilor de difracie, factorul care descrie absorbia razelor X i factorul de polarizare. Profilul liniilor de difracie depinde de parametrii ce caracterizeaz dimensiunile cristalitelor, deformaiile de reea, factorii care descriu asimetria liniilor de difracie etc. n ultimele etape se rafineaz poziiile atomilor n celula elementar i eventual factorii de ocupare pentru atomi. n ceea ce privete rafinarea poziiilor atomilor n celula elementar, n general trebuie impuse constrngeri, mai ales dac avem un numr mare de atomi pe celula elementar. Exist dou tipuri de constrngeri: constrngeri slabe sau soft restrain[21] i rigid body[22]. Constrngerile slabe este necesar s fie impuse asupra distanelor dintre atomi deoarece exist distane standard dintre atomi, de exemplu C-C, C-O, pentru legturi simple sau duble. Totui, aceste distane pot s varieze ntre anumite limite. La fel se pot impune constrngeri slabe pentru unghiurile de legtur i pentru unitile structurale care sunt planare. De exemplu, pentru ciclu benzenic se impun constrngeri slabe referitoare la planeitatea acestui ciclu. Dac rafinarea se face innd cont de constrngerile slabe, atunci la funcia din formul (5), care trebuie minimizat, mai trebuie s adugm i termenii care iau n considerare constrngerile slabe. n acest caz, funcia ce trebuie minimizat este: SyR=

w (y
i
i

oi-yci)

2+C

w (R -R
j oj

cj(x))

; wi=1/

(yoi)

; wj=1/

(Roj)

(8)
(yoi)

unde yoi i yci sunt intensitile observate i calculate la pasul i; 318

este

deviaia standard a intensitii lor msurate; Roj este valoarea ateptat pentru mrimea stereochimic respectiv care poate fi lungime de legtur, unghiuri etc (aa numita pseudo observabil), iar Rcj(x) este valoarea calculat din poziiile atomilor (x,y,z); (Roj) este deviaia standard a pseudo-observabilei; cw este un factor de ponderare care permite s se varieze contribuia constrngerilor n procesul de rafinare. Cu ct cw este mai mare, cu att constrngerile sunt mai puternice. n general, se pornete cu un cw mare, de ordinul miilor, i se tot reduce n procesul de rafinare. n cazul programului de rafinare GSAS [17], constrngerile puternice rigid bodies sunt incompatibile cu constrngerile slabe, aceasta nseamn c atomilor care aparin unui corp rigid nu le pot fi aplicate constrngerile slabe n acelai timp. n cazul n care exist i grupri plane, atunci este necesar aplicarea constrngerilor de planeitate [23], ca de exemplu, pentru ciclu benzenic, cnd n afar de constrngerile slabe se aplic i constrngeri ca molecula s fie planar. Constrngerile puternice sau rigid body se aplic atunci cnd urmrim ca o grupare de atomi s se mite mpreun sau s se modifice distanele dintre atomi dar forma ansamblului s nu se schimbe. Acest fel de constrngeri urmrete s se reduc numrul parametrilor ce trebuie rafinai i obinerea unui model de structur realist. De exemplu, n procesul de rafinare a complecilor de incluziune, fiecare din cele apte uniti glicozidice care intr n componena ciclodextrinei, mpreun cu atomii de oxigen secundari, au fost considerate ca rigid body, permind translaia i rotaia acestora. Unitile glicozidice au fost legate ntre ele prin constrngeri slabe.

4. Exemple privind determinarea structurii cristaline din pulberi

4.1 Determinarea structurii cristaline pentru complexul de incluziune Atenolol + ciclodextrina.
Complecii de incluziune cu -ciclodextrina se folosesc pentru a mbunti biodisponibilitatea, solubilitatea i stabilitatea diferitelor medicamente n soluii apoase. -ciclodextrina este compus din 7 uniti glicosidice, una dintre aceste uniti este prezentat n figura 1. Aceasta are o form toroidal n care se pot ncapsula diferii compui bioactivi i se poate realiza eliberarea treptat a acestora. 319

Figura 1 Unitate glicozidic din componenta

Ciclodextrina

Noi am urmrit s determinm structura cristalin pentru Atenolol cu -Ciclodextrina, adic s determinm sistemul cristalografic, grupul spaial, celula elementar i modul n care interacioneaz i se cupleaz cele dou molecule pentru a forma complexul de incluziune. Formula structural pentru Atenolol este prezentat n figura 2.

Figura 2 Formula structural pentru Atenolol

Dup determinarea poziiilor maximelor de difracie, indexarea s-a fcut cu ajutorul programului de calcul Ito [9]. Structura cristalin pentru Ciclodextrin se cunotea. Dar la interaciunea cu atenololul structura cristalin se modific total n sensul c se schimb grupul spaial, celula elementar i configuraia molecular. Structura cristalin pentru atenolol nu a fost cunoscut la acel moment. De aceea, configuraia molecular pentru atenolol a fost calculat cu ajutorul programului de modelare molecular Cerius 2.0 [20]. Configuraia molecular pentru ciclodextrin a fost luat din baza de date Cambridge Structural Database [29]. n urma indexrii s-a stabilit c, complexul de incluziune cristalizeaz n sistemul monoclinic avnd grupul spaial C2 cu 4 molecule de 320

ciclodextrin i 4 molecule de atenolol pe celula elementar i urmtorii parametrii de reea: a= 18.914, b=24.450, c=15.649 , =900, =110.640, =900. Volumul celulei elementare este V=6772.553. Densitatea calculat este =1.375g/cm3, o valoare plauzibil pentru compuii organici care conin C, O, N, H.. Obinerea modelului structural s-a fcut cu ajutorul programului de calcul, utiliznd tehnica simulated anealling i paralel tempering. n urma modelrii s-a constatat c molecula de atenolol intr n cavitatea -ciclodextrinei. Ca grade de libertate au fost translaiile i rotaiile pentru molecula de ciclodextrin i molecula de atenolol, unghiurile de torsiune pentru molecula de atenolol, unghiurile de torsiune dintre unitile glicizidice i unghiurile dintre unitile glicozidice. n continuare, s-a procedat la rafinarea modelului structural prin metoda Rietveld. Pentru aceasta s-a utilizat programul de calcul GSAS. Pentru obinerea unui model structural realist s-a procedat la aplicarea unor serii de restrngeri i constrngeri. Fiecare unitate glicozidic, mpreun cu atomii de oxigen O4, a fost considerat ca rigid bodies. Pentru unitile glicozidice, s-a permis rotaia i translaia, unele n raport cu altele, iar oxigenii de la captul gruprilor glicozidice au fost legai ntre ei prin restrngeri slabe (soft restrains). De asemenea, cu ajutorul restrngerilor de planeitate, s-a pus condiia ca toi cei 7 atomi de oxigen O4 s fie aproximativ n acelai plan. Reamintim c n cadrul unui grup de atomi care au fost definii ca rigid bodies nu se permite nici o micare a atomilor din cadrul grupului. n schimb, pentru restrngerile slabe este permis micarea atomilor, dar ntre anumite limite, rigidizarea este cu att mai mare cu ct factorii de pondere pentru restrngerile slabe sunt mai mari. Astfel, restrngerile slabe referitoare la planeitatea atomilor (O4)n a fost n cazul ciclodextrinei de 0.05 . Au fost aplicate restrngeri de planeitate pentru gruparea fenil din cadrul atenololului. De asemenea, au fost aplicate restrngeri slabe pentru toate distanele dintre atomi i unghiurile de legtura dintre acetia. Restrngerile slabe nu se pot aplica pentru atomii din cadrul unui grup aparinand la rigid body. Iniial, factorii de pondere pentru restrngerile slabe au fost: fd=fa=fp=5000, fd fiind factorul de pondere pentru restrngerile de distane, fa pentru restrngerile de unghiuri, iar fp pentru restrngerile de planeitate. Profilul de difracie a fost aproximat prin funcii de tip pseudo-Void. Pentru funciile de profil s-au folosit 12 parametrii. Au fost rafinai de asemenea parametrii termici, parametrii de reea, background-ul, adic fondul de difracie care a fost aproximat cu un polinom, punctul de zero pentru 321

difractogram i, bineneles, parametrii de poziie, care au fost n numr de 288. n final, s-a obinut un rezidiu Rp=7.8% i Rwp=11.58%. Configuraia molecular pentru complexul de incluziune vzut dup axa b i dup axa c este prezentat n figura 3. Se observ ca moleculele de ciclodextrin i cele de atenolol se grupeaz ntre ele prin legturi de hidrogen, formnd un fel de dimeri.

Figura 3 Configuraia molecular pentru complexul de incluziune atenolol- CD, vedere dup axa b i c.

n mod asemntor s-a determinat structura cristalin pentru complexul de incluziune Acid Mefenamic- -Ciclodextrina.

4.2. Structura cristalin pentru N-(5-etil-[1,3,4]-tiadiazol-2-il0-toluensulfonamida

Structura cristalin pentru acest compus a fost determinat prin combinarea difraciei de raze X pe pulberi cu informaii obinute din RMN pen322

tru 13C i din modelare molecular. Deoarece deplasarea chimic obinut din RMN pe solide este sensibil chiar i la mici modificri de mpachetare molecular i modificare conformaional din spectrul RMN, se obin informaii structurale foarte importante. Difractograma de raze X pe pulberi a fost obinut cu difractometrul de raze X, D8 Advance, echipat cu un monocromator de Ge (111) pentru fasciculul incident pentru nlturarea radiaiei K 2 i, prin urmare, s-a utilizat radiaia Cu K 1 9 =1.54056. S-a lucrat varianta geometria Bragg-Brentano -2 prin reflexie. Noi vom descrie n special aportul difraciei de raze X la determinarea structurii cristaline pentru acest compus. Indexarea compusului s-a fcut utiliznd programul de calcul Dicvol [9]. Cea mai bun soluie corespunde sistemului ortorombic cu urmtorii parametrii de reea: a=8.5364, b=15.0148 si c=21.3846 i volumul celulei elementare fiind V=2740.914 3. Prin examinarea difractogramei cu ajutorul programului de calcul Checkcell [28], cel mai probabil grup spaial a fost gsit ca fiind Pbca. n continuare s-a fcut fitarea Le Bail a difractogramei experimentale pentru confirmarea grupului spaial selectat. S-a obinut un fit cu Rp=0.05 i Rwp=0.072, ceea ce confirm grupul spaial ales din reflexiile interzise. Menionm c, n cele mai multe cazuri, pentru un anumit grup de reflexii interzise corespund mai multe grupuri spaiale. La acest grup spaial corespund un numr de 8 poziii generale. Deoarece nu exist nici un motiv ca moleculele s se plaseze n poziii speciale, rezult c numrul de molecule pe celula elementar este 8. Considernd 8 molecule pe celula elementar, s-a calculat densitatea ca fiind =1.37g/cm3, care reprezint o valoare rezonabil. Modelul structural de pornire a fost obinut cu ajutorul programului de calcul Molden. Determinarea structurii cristaline s-a fcut prin metoda cutrii n spaiul direct, folosind programul de calcul Dash [30], prin ajustarea a 10 grade de libertate, dintre care 6 corespund pentru poziia moleculei i orientarea acesteia, iar 4 la unghiurile de torsiune pentru molecul. Modelul obinut n acest mod a fost n continuare rafinat prin metoda Rietveld, utiliznd programul de calcul GSAS [17] combinat cu interfaa grafic EXPGUI [31] . Un factor de temperatur global a fost rafinat pentru toi atomii. Pentru a avea un model structural realist n timpul rafinrii, s-au aplicat o serie de restrngeri slabe pentru distane, unghiuri i planeitate a gruprii fenil. Factorii de pondere corespunztori restrngerilor pentru distane fd, unghiuri fa i planeitate fp au fost redui treptat n cursul ciclurilor de rafinare de la 500 la 100. Profilul maximelor de difracie de pe ntregul interval 2 = 3.5-500 au fost modelate cu funcii de profil de 323

tipul pseudo-Voight cu 18 termeni. Fondul de difracie a fost modelat cu un polinom Chebyshev de ordinul nti. n continuare, modelul a fost mbuntit utiliznd tehnici de modelare molecular combinat cu informaii obinute din msurtori de deplasare chimic din spectul RMN. n final, s-au obinut urmtorii factori care caracterizeaz figura de merit a modelului structural: Rp=0.079, Rwp=0.113, Rexp= 0.053, 2=6.71. n figura 4 este prezentat mpachetarea n celula elementar pentru compusul studiat i aranjarea supramolecular sub form de dou uvie formate din molecule puse cap la cap. n figura 5 este prezentat difractograma experimental, difractograma calculat i diferena dintre difractograma calculat i cea experimental. Se observ o potrivire foarte bun ntre cele dou difractograme, deci modelul structural este corect.

Figura 4 mpachetarea n celula elementar i aranjarea supramolecular

Un alt compus pentru care s-a determinat structura cristalin prin combinarea difraciei pe pulberi cu spectroscopie RMN i modelare molecular a fost Etoxiazolamida [27]. 324

Figura. 5 Comparaie dintre difractograma observat i cea calculat

5. Bibliografie
1. P.-E.Werner, Autoindexing. in: Structure determination from powder diffraction data. IUCr monographs on crystallography , W. I. F. David, K. Shankland, L.B. McCusker, and Ch. Baerlocher, Eds., Oxford University Press, Oxford, New York (2002) J. Appl. Cryst. 25, 69 (1992). A. Le Bail, Monte Carlo indexing with McMaille, Powder Diffraction, 19, 249 (2004) J. Appl. Cryst. 36, 86 (2003). A.A. Coelho, A. Kern, The Third Pharmaceutical Powder X-ray Symposium (PXRD-3). (2004). A. Altomare, C. Giacovazzo,A. Guagliardi, A.G.G. Moliterni, R. Rizzi, P.-E. Werner J. Appl. Cryst. 33, 1180 (2000). A. Boultif and D. Louer, J. Appl. Cryst. 37, 724 (2004) J. Appl. Crystallogr, 36, 356 (2003). J.W. Visser, Appl. Cryst. 2, 89 (1969) Gh. Mihailescu, Gh. Borodi, I. Bratu, J.M. Gavira Roumanian Reports in Physics, 51(7-10) 983 (1999) R.L.McGreevy, L.Pusztai ,Mol.Simul. 1,359 (1988) G.E.Engel, S.Wilke , O.Koning, K.D.Harris , F.J.Leusen, J.Appl. Cryst. 32, 1169,(1999) V.Favre-Nicolin and R.Cerny J.Appl.Cryst. 35, 734, (2002) V.Favre-Nicolin and R.Cerny Z.Kristallogr. 219, 847-856, (2004) M.Falcioni, M.W.Deem J.Chem.Phys. 110 , 1754 (1999) H.M Rietveld , J.Appl. Cryst. 2, 65, (1969)

2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16.

325

17. A.C.Larson & R.B. Von Dreele General Structure Analysis System (GSAS). Report LAUR 86-748, Los Alamos National Laboratory, NM, 87545, USA. 18. The Rietveld Method edited by R.A. Young Oxford University Press (1993) 19. W.A. Dollase, J.Appl. Cryst. 19, 267, (1986) 20. L.B. McCusker, R.B. Von Dreele, D.E. Cox, D.Louer and P.Scardi J. Appl.Cryst., 32, 36, 21. H.Nowell, J.P. Attfield and J.C.Cole, Acta Cryst.B B58 835,(2002 22. R.E. Dinnebier Powder Diffraction 14, 84,. (1999) 23. D. Mentzafos, I.M.Mavridis, G. le Bas, G. Tsoucaris, Acta. Cryst. B47, 746 (1991) 24. G. Borodi, I. Bratu, F. Dragan, R. Peschar, R. B. Helmbholdt, A. Hernanz, Spectrochimica Acta A,70, 1041, (2008) 25. M.Pop, K. Goubitz, G. Borodi, M. Bogdan, D.J.A. De Ridder, R. Peschar, H. Shenk Acta Cryst. B58, 1036, (2002), 26. A. Hangan, G. Borodi, X. Filip, C. Tripon, C. Morari, L. Oprean and C. Filip, Acta Cryst. B66, 615, (2010) 27. X. Filip, G. Borodi and C. Filip, Phys. Chem. Chem. Phys. DOI, 10.1039/c1cp21878f. 28. J.Laugier,and B.Bochu CHECKCELL, Colaborative Computational Project Number 14 (CCP14). Laboratoire des Materaux et du Genie Physique de lEcole Superieur de Physique de Grenoble, France. 29. T. Steiner and G. Koeller J.Am.Chem. Soc. 116,5122,(1994) 30. W.I.F. David, K.Shankland, J. Van de Streek, E.Pidcock, W.D.S. Motherwell, J.C.Cole, J.Appl. Cryst.,39, 910, (2006). 31. B.H. Toby, J. Appl. Cryst. 34,210, (1001)

326

IX. MICROSCOPUL ELECTRONIC DE BALEAJ I DE TRANSMISIE Microscopia electronic

ef lucrri dr. Lucian Barbu-Tudoran Cuprins
1. Generaliti ......................................................................................................................... 327 2. Microscopia electronic de transmisie (Transmission Electron Microscopy TEM) ......... 328 3. Microscopia electronic de baleiaj (Scannig Electron Microscopy SEM) ........................ 338

1. Generaliti
Microscoapele sunt instrumente utilizate pentru a facilita observarea unor obiecte la o mrire mai mare dect cea a obiectului observat. Cel mai comun microscop este lupa, obiect ce utilizeaz lentila pentru a focaliza lumina reflectat de un obiect ntr-o imagine mai mare. Microscoapele optice (figura 1) sunt instrumente mai complexe care conin un set de lentile care mresc imaginea. Limitrile microscopiei optice const n rezoluia obinut prin aceast tehnic (aprox. 250 nm). Rezoluia este limitat de lungimea de und a fotonilor utilizai ca surs de iluminare a specimenului, ceea ce nseamn c dou caracteristici aflate la o distan mai mic de 250 nm nu vor putea fi difereniate. Pentru observarea detaliilor mai mici a fost necesar crearea unui microscop care s utilizeze o surs de iluminare caracterizat printr-o lungime de und mult mai mic. Accelerarea electronilor permite reducerea lungimii de und a unui fascicul de electroni ceea ce face posibila vizualizarea detaliilor cele mai fine. Printre alte surse se numr razele X i neutronii. n 1931, fizicianul Ernst Ruska i inginerul Max Knoll au construit un microscop electronic prototip. Doi ani mai trziu, Ruska a creat primul microscop a crui rezoluie era superioar unui microscop optic. Compania Siemens a patentat invenia celor doi germani, iar n 1939 primul microscop electronic de transmisie a fost produs n scopuri comerciale. 327

1 ocular 2 revolver 3 obiective 4 viza macrometric 5 viza micrometric 6 platina 7 surs de lumin 8 - diafragma i lentila condensor

Figura 1. Microscopul optic

2. Microscopia electronic de transmisie (Transmission Electron Microscopy TEM)

Prin intermediul TEM imaginea observat este proiecia probei n grosimea ei, incluznd suprafaa i structurile interne. Electronii ptrund prin prob, interacioneaz cu aceasta n grosimea ei, acetia putnd fi deviai sau nu. Astfel obiectele avnd structur intern diferit pot fi difereniate deoarece proieciile acestora vor fi diferite. Ca limitare se amintete natura bidimensional a proieciei rezultate, informaiile aparinnd axei z se vor pierde. Probele analizate trebuie s fie foarte subiri deoarece ar absorbi o mare parte a fasciculului de electroni. Organizarea unui microscop electronic 328

Principiile funcionrii unui croscop electronic de transmite nu difer cu mult fa de cele ale unui microscop optic. n vrful coloanei exist un emitor de electroni cu voltaj nalt care va genera fasciculul de electroni care va traversa coloana. Aceti electroni vor penetra proba i vor trece printr-o serie de lentile magnetice, iar n final vor fi focalizai pe ecranul situat la captul coloanei. Pentru a modifica mrirea i punctul focal al unei imagini se pot utiliza diferite lentile. Aperturile de pe traseul fasciculul de electroni au rolul de a schimba contrastul i rezoluia imaginii. n interiorul coloanei se va stabili un vid nalt pentru a minimaliza interaciunile dintre electroni i molecuFigura 2 - Seciune prin coloana unui TEM lele de aer. Tunul de electroni Electronii sunt emii de un filament supranclzit de un curent electric pn cnd suficient energie va fi produs (aprox. 2500K) pentru a nvinge the work function a metalului, de obicei tungsten sau hexaborid de lantaniu. Electronii emii au o distribuie Boltzman a energiei i trebuie s fie concentrai pentru ca fasciculul rezultat s strbat coloana, prin prob, lentile i aperturi. Tunul de electroni are mai multe componente: filamentul, circuitul de interferen (biasing circuit), un vrf Wehnelt i un anod de extracie. Prin conectarea filamentului de partea negativ a generatorului de energie, electronii pot fi pompai de ctre filament spre placa anodic i coloana microscopului, astfel circuitul fiind complet. Prin construirea unui cilindru Wehnelt, care este ncrcat mult mai negativ dect filamentul n sine, se asigur convergena optim a electronilor nc din momentul emisiei. Cele mai comune microscoape sunt cele de emisie termionic si FEG (Field Emission Guns).

329

Figura 3. Schema unui tun de electroni

Tipuri de tunuri de electroni Tungsten: filamentul este fabricat din tungsten, iar principiul de funcionare se aseamn cu cel al funcionrii unui bec, pe msur ce filamentul se nclzete electronii vor fi emii. Hexaborid de lantaniu: este tot un filament de emisie termionic, dar are the work function mai mic, de aceea este mai eficient. FEG: filamentul nu este unul termic. Emisia de electroni este asigurat de aplicarea unui puternic cmp electric imediat n vecintatea vrfului filamentului. Mrimea i gradul de apropiere a cmpului electric cauzeaz desprinderea electronilor de pe filament.

Figura 4. Tipuri de tunuri de electroni: filament de tungsten i cristal de hexaborid de lantaniu

330

Fasciculul de electroni se caracterizeaz prin coeren. Coerena temporal. Deoarece electronii emii sunt supranclzii, distribuia energiei nu este sub forma unui singur peak, n schimb distribuia este de tip Boltzman i difer n funcie de natura filamentului. n cazul unui microscop performant se dorete ca raportul E/E s fie ct mai mic, adic distribuia energiei s fie o mic fraciune din energia medie a electronilor. Coerena spaial. Se refer la intensitatea fasciculului. Dac electronii emii sunt paraleli atunci fasciculul va fi coerent o mai mult perioad. Faza electronilor afecteaz coerena fasciculul, ideal toi electronii emii ar trebui s fie n faz. Dac electronii sunt n faz ei vor interfera constructiv. Dac electronii sunt defazai, vor interfera distructiv, iar fasciculul va pierde din intensitate. Lentilele Lentilele utilizate n microscopia electronic sunt bobine magnetice care au scopul de a focaliza i direciona fasciculul de electroni. Deoarece lentilele sunt reglate pentru o anumit lungime de und acestea vor concentra electronii cu alte lungimi de und mai puin uniforme. Prin urmare n urma trecerii fasciculului printr-o lentil acesta va suferi o scindare. Aceast aberaie cromatic se aseamn cu scindarea luminii cnd o raz traverseaz o prism, lumina fiind descompus n radiaii cu lungimi de und diferite. n cazul prismei lumina este refractat sub diferite unghiuri. n cazul lentilelor electro-magnetice acestea pot roti fasciculul de electroni dac sunt ajustate corespunztor. Cnd acest fenomen are loc imaginea se va roti pe msur ce vor fi introduse n coloan alte lentile. Pentru formarea imaginii se folosesc 3 tipuri de lentile. Lentila obiectiv are rolul de a realiza primul pas de mrire i focalizare a unei imagini. Cuplat cu apertura obiectiv va genera contrastul de amplitudine. Lentila intermediar controleaz, prin poziia i puterea ei, mrirea imaginii sau pattern-ul de difracie. Ultima lentil lentila proiector - focalizeaz i proiecteaz imaginea final pe suprafaa folosit pentru vizualizare. Aperturile Aperturile sunt guri de-a lungul coloanei microscopului care pot limita mrimea fasciculul de electroni. Funcia unei aperturi este determinat de poziia acesteia n coloana microscopului. Prima apertur, apertura condensator, este localizat n vecintatea tunului de electroni i este utilizat pentru concentrarea electronilor i meninerea coerenei fasciculului. A doua apertur, apertura obiectiv, este localizat sub prob imediat dup lentila obiectiv. Aceast apertur controleaz contrastul unei imagini. 331

Exteriorul microscopului Consola utilizatorului const dintr-un ecran pe care se vor afia parametrii sub care funcioneaz microscopul precum: mrirea, valoarea defocalizrii, voltajul curentului etc. Pe consol se mai afl butoane care controleaz poziia specimenului n interiorul coloanei, luminozitatea fasciculului, curentul, alinierea, focalizarea i mrirea. Microscoapele electronice de nou generaie au interfee cu computerele ceea ce confer utilizatorului o mai mare flexibilitate i control. n cazul microscopiei electronice de transmisie proba analizat este depus pe o gril de metal, iar aceasta ntr-un holder de metal (fig.5). Acest holder de metal, prin intermediul goniometrului, va asigura introducerea probei n vidul din coloana microscopului cu o scdere minim a presiunii din interiorul coloanei.

Figura 5 - Holder utilizat n microscopia electronic de transmisie

Dac se dorete vizualizarea unei probe sub diferite unghiuri sau realizarea unei tomograme, goniometrul se poate roti pentru a schimba unghiul probei. Principii ale formrii imaginii n momentul n care fasciculul trece prin grosimea unui specimen au loc mai multe fenomene. Dac electronul nu lovete un atom din prob acesta va avea o traiectorie nedeviat pn la ecranul care va colecta imaginea. Dac electronul intr n contact cu atomi din prob poate suferi o ciocnire elastic, nu va pierde din energie, iar legea conservrii momentului va determina unghiul la care acesta a fost deviat de la traiectorie. Acest electron va conferi o rezoluie nalt imaginii. n cazul unei ciocniri inelastice electronul va ceda o cantitate variabil de energie specimenului, astfel cnd electronul va ajunge la nivelul ecranului va avea energia diminuat i un unghi de inciden necunoscut. Acest electron va cauza apariia zgomotului n imagine. 332

Electronii pot fi deviai la unghiuri mai mari de 90, astfel de electroni nu sunt folosii n microscopia electronic. Contrastul dintr-o imagine ia natere n urma interferenei electronilor ce au unghiuri diferite. Electronii care vor fi deviai de la traiectoria iniial n urma interaciunii cu atomii specimenului vor interfera constructiv sau distructiv cu fasciculul principal de electroni. Dac se utilizeaz o apertur obiectiv mic electronii care sunt deviai sub un unghi mare nu vor contribui la formarea imaginii, iar contrastul este mbuntit. Electronii cu deflecie mare conin informaii importante legate de rezoluie, aceste informaii fiind pierdute. ntr-un microscop electronic de transmisie electronii trec prin prob nainte de a impresiona ecranul i conin informaii cu privire la structura intern a acestei probe. Spre exemplu, dac privim o sfer goal pe dinuntru sau una plin, proieciile acestora vor diferi (figura 6). Sfera solid va genera un disc ntunecat la interior, intensitatea diminundu-se spre marginile discului. n cazul sferei goale gradientul va fi n direcia opus, marginea fiind cea mai nchis. Aceste proiecii difer deoarece gradul de ntunecare a unei imagini este direct proporional cu capacitatea materialului de a absorbi electronii.

Figura 6. Diferena dintre proieciile unei sfere solide i a unei sfere goale n momentul vizualizrii la TEM

Microscoapele electronice pot fi utilizate pentru vizualizarea pattern-urilor de difracie a probelor. Un pattern de difracie poate fi colectat din probe care conin un motiv care se repet, de exemplu din cristale bidimensionale. Pattern-ul de difracie se formeaz in the back focal plane al lentilei obiectiv. Lentila intermediar determin vizualizarea imaginii sau a pattern-ului de difracie pe ecran. Colectarea imaginilor se poate face n diverse moduri. Observarea direct a imaginii de ctre utilizator are loc la nivelul unui ecran de fosfor. Pentru a nregistra imaginea se utilizeaz negative care sunt impresionate de fasciculul de electroni sau camere CCD (Charge Coupled Device) care traduc n format digital interaciunile electronilor cu senzorul camerei. 333

Tehnici de preparare a probelor Grile n cazul microscopiei electronice de transmisie specimenele sunt depozitate pe grile. Grilele sunt discuri de metal (cupru, aur, nichel, platin) avnd un diametru de 3.05 mm care prezint o reea. Ochiurile reelei pot avea diferite dimensiuni i forme (ptrat, hexagon). Pe aceast gril se va depozita un film care va conferi suport specimenului.

Figura 7. Gril de microscopie electronic, vedere superioar i seciune

Filme de suport Filmul Formvar este un film de natur polimeric (formal de polivinil), fiind des folosit n microscopia electronic. Substana se gsete sub form solid i este solubil n solveni organici, cei mai utilizai fiind cloroformul i dioxanul. Pentru a obine un film continuu de Formvar o lam de sticl pentru microscopia optic este curat i scufundat uniform n soluia de Formvar. Exist dou metode pentru depozitarea filmului pe grile: una implic aezarea grilelor pe suprafaa filmului flotat pe ap, iar a doua depunerea pe grile a filmului flotat. Filmele de carbon Probele trebuie depuse pe un film care este foarte stabil sub aciunea fasciculului de electroni. Filmele de carbon sunt foarte stabile. Principiul evaporrii carbonului este unul foarte simplu. O foaie de mic este proaspt clivat, iar noile plci sunt introduse cu partea proaspt clivat n interiorul unei camere n care se va stabili un vid nalt. Deasupra platoului pe care sunt aezate cele dou foie de mic se afl un fragment de sfoar de carbon conectat la un circuit de mare voltaj. Feele proaspt clivate ale mici sunt perfect plate din punct de vedere atomic ceea ce mbuntete proprietile filmului de carbon. Dup stabilirea vidului un 334

curent se aplic sforii de carbon pn cnd aceasta devine incandescent, n acest moment carbonul se va evapora i depozita pe mic formnd un film continuu. Grilele sunt aezate pe o sit de metal ntr-un vas plin cu ap. Plcile de mic sunt imersate treptat n ap ceea ce permite filmului hidrofob s se desprind. Depozitarea filmului de carbon are loc prin evacuarea vasului de ap. Carbonul este o substan hidrofob, iar dac o pictur de ap este depus pe suprafaa unui astfel de film aceasta va avea tendina de a-i micora suprafaa care ntr n contact cu carbonul. Pentru a face filmele mai accesibile substanelor aflate n soluie apoas carbonul trebuie hidrofilizat. Aceasta se poate realiza fie prin tratarea cu UV a grilelor sau prin glow discarching. n cazul glow discharching grilele sunt introduse ntr-o camer parial evacuat, iar cnd voltajul este aplicat ntre anod i catod potenialul electronic ionizeaz aerul din ncpere. Ionii negativi se vor depozita pe suprafaa filmului de carbon. Microscopia electronic de transmisie utilizeaz un fascicul de electroni de nalt energie pentru a bombarda specimenul. n funcie de cantitatea de energie absorbit intensitatea fasciculului care va impresiona ecranul difer i se va forma o imagine. n cazul probelor biologice care sunt formate din atomi precum carbon, oxigen, azot i hidrogen, acestea nefiind foarte dense, cantitatea de energie absorbit este foarte mic comparativ cu energia fasciculului. De aceea, pentru o vizualizare mai bun, probele sunt impregnate cu sruri de metale grele. Dup coloraie, proba se va usca i va putea fi examinat la microscop. n ultimii ani, datorit descoperirii graphene-ului i a remarcabilelor sale proprieti se investigheaz aplicaia acestui film n microscopia electronic. Coloraia negativ n cazul microscopiei, contrastul specimenului este prea slab pentru ca ochiul uman s diferenieze marginile i detaliile probei observate. Pentru a mbunti contrastul se folosesc diferite tehnici. n cazul microscopiei optice se aplica contrastul de faz, n cazul acestei tehnici lumina care penetreaz proba sufer o schimbare a fazei, aceast nou raz va interfera cu fasciculul iniial i contrastul se creeaz. Alte metode se bazeaz pe colorarea probelor pentru evidenierea unor caracteristici. Coloranii se bazeaz fie pe vopsele sau pe materiale foarte absorbante. Pentru ca o coloraie s aib efect trebuie s se lege de preferenial anumite pri ale probei. Coloraia n cazul microscopiei electronice de transmisie se bazeaz pe sruri de metale grele derivate din molibden, uraniu sau tungsten. Ionii de 335

metale grele vor interaciona cu electronii. Coloraia cu aceti atomi grei se numete coloraie negativ deoarece n microscop se va observa o zona neacoperit de colorant nconjurat de coloraia negativ. Zona este neacoperit deoarece proba (proteina de exemplu) mpiedic depunerea srii pe filmul de carbon. Contrastul optim se obine cnd coloraia nconjoar complet specimenul si zonele adiacente. Tehnica este una simpl: proba este depus pe gril i lsat cteva zeci de secunde urmat fiind de splarea grilei cu 3 picturi de colorant. Excesul va fi ndeprtat cu ajutorul unei hrtii de filtru, iar dup uscare grila poate fi examinat. Contrastul apare n urma interaciunii electronilor cu specimenul. n figura 8 se observ o protein colorat negativ, electronii ce vor interaciona cu atomii de metale grele vor fi puternic deviai, iar apertura obiectiv i va elimina pe cei care vor fi deviai la un unghi prea mare, ceea ce va determina contrastul i rezoluia imaginii.

Figura 8. Interaciunea dintre un specimen (coloraie negativ) i fasciculul de electroni

Avantaje i dezavantaje ale coloraiei negative Pro Contrast foarte mare. Colorantul absoarbe electronii mult mai bine dect mediul nconjurtor, de aceea diferite regiuni ale probei pot avea diferite densiti de electroni i pot fi difereniate n proieciile obinute. Alterarea datorit radiaiei este irelevant deoarece srurile metalice nu sunt la fel de susceptibile la efectele electronilor precum molecule organice. Pregtirea probei nu necesit aparatur i nu ia mult timp (aprox. 4 minute). 336 Contra n timpul colorrii particulele pot fi distorsionate. n timpul uscrii specimenul i pierde nveliul hidratant. n cazul proteinelor meninerea unei stri hidratate este important pentru pstrarea configuraiei. Ca urmare a distribuiei inegale a coloraiei pot s apar artefacte. Rezoluia este limitat la 20 n condiii optime. Aceasta corespunde cu mrimea granulei srii folosite pentru coloraia negativ.

nghearea probei metoda cryo Microscopia cryo este o tehnic prin care proba este ngheat ntr-un refrigerent pentru o mai bun pstrare i protecie n timpul observaiei. nghearea se face prin dropping a unei grile pe care proba este deja depozitat, apa din jurul probei va nghea, iar proba va fi protejat. Procesul este laborios deoarece plonjarea grilei n recipientul de etan lichid trebuie s fie suficient de rapid pentru a mpiedica formarea gheii cubice, cristaline care va estompa detaliile specimenului. Azotul lichid are o temperatur ideal (aprox. -195), dar capacitatea caloric este foarte mic, n momentul introducerii unei grile aflate la temperatura camerei fierbe ceea ce favorizeaz formarea gheii cristaline. De aceea se prefer utilizarea etanului lichid. Pentru a vizualiza proba n cryo-electronmicroscopie trebuie foloFigura 9. Schem a instalaiei utilizate pt. sit o doz minim de electroni pennghearea probei tru a evita alterarea probei datorit radiaiei. Doza recomandat e de 6-10 electroni/2. Avantaje i dezavantaje ale cryo-electronmicroscopiei fa de coloraia negativ Avantaje Specimenul este tot timpul n soluie i nu intr n contact cu suprafee, prin urmare forma observat este cea real n stare nativ. Nu exist colorant care s distorsioneze preparatul. Proba poate s aib o orientare preferenial pe gril n cazul Dezavantaje Raportul semnal/zgomot este foarte mic deoarece absorbia electronilor e sczut. nregistrarea imaginilor pentru tomografie e dificil deoarece prin rotire stratul de ghea expus este prea gros. Pregtirea probelor necesit mult 337

coloraiei negative, ceea ce se evit timp, iar obinerea gheii vitroase n cazul cryo. poate fi problematic. Se folosete doza minim de electroni, ceea se asigur prezervarea probei.

3. Microscopia electronic de baleiaj (Scannig Electron Microscopy SEM)

n cazul SEM, specimenele sunt acoperite cu un strat subire de metal pentru ca electronii s fie reflectai. Acest nveli metalic asigur o suprafa conductoare, astfel se evit ncrcarea electric a probei. Fasciculul de electroni este concentrat i utilizat pentru a scana suprafaa obiectului observat. Imaginea se formeaz pe un ecran datorit electronilor care sunt reflectai de nveliul metalic. Prin intermediul microscopiei electronice de baleiaj se pot observa detalii de pe suprafaa unui specimen, iar informaiile privitoare la structura intern lipsesc.

Microscopul electronic scanning (SEM) permite observarea i caracterizarea materialelor organice i anorganice heterogene la o scar cuprins ntre nanometri (nm) i micrometri (m). Popularitatea SEM-ului e datorat capacitii sale de a obine imagini aparent tridimensionale ale suprafeelor unei game largi de materiale. Imaginile SEM sunt utilizate ntr-o mare varietate media, de la jurnale tiinifice la reviste de popularizare i filme. Dei principala lui utilizare este de a obine imagini topografice la o mrire cuprins ntre de 10-10000 de ori, SEM-ul are o adaptabilitate mare. 338

La SEM, suprafaa de examinat sau microvolumul de analizat este iradiat cu un fascicol ngust de electroni, care poate fi trecut n raster (linie cu linie) deasupra suprafeei specimenului pentru a forma mai multe imagini, sau care poate fi static pentru a obine analiza unei singure poziii. Tipurile de semnale rezultate din interaciunea fascicolului cu prob includ electroni secundari, electroni reflectai, raze X caracteristice i ali fotoni cu energii variate. Aceste semnale se obin din emisii de volum specifice probei i pot fi folosite pentru a examina multe caracteristici ale probei (topografia, cristalografia, compoziia etc.). Semnalele de imagine de cel mai mare interes sunt electronii secundari i reflectai, pentru c acetia variaz n primul rnd datorit diferenelor topografice. Emisia de electroni secundari, regsii ntr-un volum foarte mic n apropierea zonei de impact a fascicolului, aleas la diferite valori ale energiei razei de electroni, permite formarea de imagini la o rezoluie apropiat de cea a mrimii fascicolului de electroni. Aparena tridimensional a imaginii se datoreaz unei adncimi mari a cmpului microscopului electronic, precum i efectului de umbr dat de contrastul electronilor secundari i reflectai. La SEM, se emit i raze X caracteristice, ca i rezultat al bombardamentului de electroni. Analiza acestor raze emise de ctre prob poate scoate n eviden att caracteristici calitative ct i informaii cantitative de element, din regiuni ale unui specimen avnd mrimea de 1m n diametru i 1m n adncime (n condiii normale de operare). Evoluia SEM-ului i capacitile specifice ale instrumentelor comerciale moderne se vor discuta n cele ce urmeaz. Capaciti de imagistic Microscopul electronic scanning este unul dintre cele mai versatile instrumente disponibile pentru examinarea i analizarea caracteristicilor microstructurale ale obiectelor solide. Un motiv puternic pentru utilitatea SEM-ului este rezoluia mare ce poate fi obinut cnd sunt examinate obiecte voluminoase; rezoluii instrumentale cu ordin de 1-5 nm (10-50 ) se folosesc azi ca rutin la instrumente comerciale. O alt caracteristic important a SEM-ului este adncimea cmpului, care e cea responsabil n parte pentru aparena tridimensional a imaginii specimenului. Cu ct e mai mare aceast adncime a cmpului cu att se furnizeaz mai multe informaii despre specimen, aceast calitate a SEM-ului fiind cea mai apreciat de ctre un utilizator. Cele mai multe micrografii SEM se efectueaz la mriri sub 8000 de ori, unde aparatul ope339

reaz bine n limitele propriilor capaciti de rezoluie. n plus, SEM-ul are capacitatea de a analiza la mriri foarte mici, proprietate foarte util n studii de criminalistic i nu numai, pentru c imaginea SEM vine cu informaii adiionale imaginii obinute la microscopul optic. Principalele componente ale SEM-ului sunt sistemele de lentile, tunul, colectorul de electroni, tubii catodici fotocolectori de raze, i prile electronice asociate. Prima lucrare recunoscut ca descriind conceptul de microscop electronic scanning este cea a lui Knoll (1935). A urmat apoi von Ardenne (1938) care a construit microscopul electronic scanning de transmisie (STEM) prin adugarea unei lentile de baleiere la microscopul electronic de transmisie (TEM). Att aspectele teoretice ct i cele practice ale STEM-ului au fost explicate n detaliu de ctre von Ardenne, iar aparatul su includea multe instrumente care de atunci au devenit standard. Primul SEM utilizat s examineze specimene dense a fost descris de Zwokyn i col. (1942). Autorii au realizat c emisia de electroni secundari este cea responsabil pentru contrastul topografic. Colectorul a fost nclinat pozitiv aproximativ cu 50 V nspre specimen i al doilea curent acumulat n el a produs o cdere de tensiune de-a lungul unui rezistor, astfel s-a obinut o rezoluie de aproximativ 50 nm. Dar, prin comparaie cu performanele obinute atunci cu TEM-ul n continu perfecionare, aceast metod a fost considerat neincitant i dezvoltarea pe aceast ramur a stagnat. n urmtorii civa ani, C. W. Oatley i studentul su D. Mc.Mullan au construit primul lor SEM care pn n 1952 a atins rezoluia de 50 nm. Mc.Mullan a fost urmat de Smith (1956) care a observat c procesarea semnalului ar putea mbunti micrografiile, i a introdus amplificarea neliniar a semnalului. De asemenea a mbuntit sistemul de scanare prin introducerea de scanare prin dubl deflecie, i a fost primul care a inclus un stigmator n SEM. (Smith, 1956) Urmtorul pas nainte a fost refacerea detectorului secundar de electroni, de ctre Everhart i Thornley (1960). Ei au adugat un scintilator pentru a converti electronii n lumin, care a fost apoi transmis printr-o eav de lumin direct pe suprafaa fotomultiplicatorului. Schimbarea multiplicatorului de electroni cu mult mai eficientul fotomultiplicator a crescut cantitatea semnalului colectat i a rezultat un mai bun raport semnal-zgomot. Astfel, mecanisme de contrast mai slab ar putea fi mai bine studiate. Alte utilizri ale SEM-ului au fost dezvoltate n aceast perioad. Spre exemplu, Oatley i Everhart au putut observa pentru prima dat contrastul de voltaj, mai trziu Wells (1959) a fcut primele studii ale efectelor penetrrii fascicolului cu scopul formrii imaginii la SEM, i primul care a utilizat perechi 340

stereografice pentru a produce imagini tridimensionale la SEM. (Wells, 1960) Pease a construit un sistem cunoscut ca SEM V, cu trei lentile magnetice, care coninea i sistemul detector Everhart-Thornley. Acest aparat a devenit primul prototip comercial numit ,,Stereoscan (Cambridge Scientific Instruments Mark I). A. D. G. Stewart i coechipierii de la compania Cambridge Scientific Instrument au finalizat design-ul comercial i mpachetarea produsului (Oatley, 1972). n anii ce au urmat mai mult de 50 000 de uniti SEM au fost vndute de ctre productori din S.U.A., Marea Britanie, Olanda, Japonia, Germania i Frana. De la primul aparat comercial din 1965 s-au fcut numeroase mbuntiri, una din ele fiind dezvoltarea surselor de lumin puternic precum catodul de hexaborid de lantan (LaB6). Cu aceast surs o mai mare cantitate de electroni au putut fi concentrai pe o suprafa mai mic, obinndu-se astfel o rezoluie mai bun. Sursa de emisie de electroni, utilizat pentru prima dat la SEM n 1942, s-a dezvoltat n aa msur nct poate fi acum folosit pentru imagini de cea mai nalt rezoluie, la nivel de rutin. Avantajul tunului de emisie este dimensiunea sa mic astfel nct poate fi obinut o imagine a unei probe de 1 nm. Aceast lumin puternic permite ptrunderea a de 1000 de ori mai muli electroni pe cele mai mici dintre probe, dect filamentele convenionale de tungsten. Sursele de electroni au nevoie totui de vid de ordinul a cel puin 10-8 Pa pentru a opera ntr-un mod de ncredere, i astfel de nevoi cer o atenie special tehnologiei de vidare. Cu toate c au crescut costurile i complexitatea SEM-urilor cu emisie de curent, aceste microscoape i-au gsit utilitatea n numeroase domenii de cercetare i tehnologie n care rezoluia nalt i energia mic a sursei sunt importante. Majoritatea SEM-urilor sunt dotate cu capacitatea de a stoca imagini digitale, dei n aparatele mai vechi imaginile nc se mai fac prin fotografierea tubului catodic de raze. Imaginile pot fi observate pe un ecran, printate sau reinute pe un CD sau alte uniti de memorie. Odat stocat n format digital imaginea poate fi procesat n multe moduri, precum prin amplificare non-linear, difereniere etc. Disponibilitatea unor computere puternice i ieftine dotate cu capacitate de stocare mare i pachete de soft capabile de o varietate mare de procesri i funcii pentru imagini digitale, ofer microscopistului o mare flexibilitate i uurin n utilizarea SEM-ului. Alte avansri n utilizarea SEM-ului includ mecanismele de contrast precum contrastul prin canalizarea electronilor produs prin variaii n orientarea cristalografic i contrast magnetic produs din domenii magnetice din materiale uniaxiale i cubice. 341

Printre primele micrografii scanate au fost cteva materiale biologice precum carcasa unor insecte sau fibre lemnoase, care au fost suficient de puternice pentru a rezista procesului de vidare fr s se deformeze (Smith i Oatley, 1955). Mai trziu Thornley a prezentat imagini SEM ale materialelor uscate prin ngheare i analizate la 1 keV pentru a evita ncrcarea electrostatic. Totui, dezvoltrile n domeniul biologic au depins de avansarea n prepararea specimenului. Majoritatea materialelor biologice sunt umede, sensibile la radiaii, termolabile, de contrast mic i emisivitate de electroni slab i sunt, aadar, slabi conductori. S-a dat mult atenie la stabilizarea materialelor organice delicate, ndeprtrii sau imobilizrii fluidelor celulare, i acoperirii lor cu un strat subire de material conductor. Dezvoltarea procesrilor la temperaturi sczute a ajutat la reducerea pierderii de mas i a distrugerilor termice la specimenele sensibile (Echlin, 1992). Una dintre cele mai importante descoperiri recente este microscopul electronic scanning cu presiune variabil (VPSEM). Acest tip de aparat permite examinarea suprafeelor a aproape oricrui tip de specimen, uscat sau umed, pentru c mediul nconjurtor specimenului nu mai este nevoie s fie la vid nalt (Danilatos, 1991, 1993). Mediul poate fi alctuit din vapori de ap sau alte gaze n intervalul de 25-2500 Pa (0,2- 20 torri). Un sistem diferenial de pompare a vidului este folosit pentru a menine tunul de electroni la vid nalt n timp ce specimenul este sub o presiune mai mare. n formatul su modern, VPSEM-ul poate detecta electroni secundari i retromprtiai la fel de bine precum razele X. Probele biologice sunt ideale pentru studiul la acest aparat. n plus, se pot efectua experimente n aparat n care suprafaa specimenului poate interaciona cu atmosfera gazoas. Dimensiunea mare a adncimii cmpului ntlnit la SEM face posibil observarea tridimensional a obiectelor utiliznd stereoscopia. Imaginile tridimensionale permit interpretarea corect a caracteristicilor morfologice i msurarea lor. Au aprut echipamente care permit evaluarea cantitativ a suprafeei i urmrirea n timp real i de nalt rezoluie a specimenului prin intermediul SEM-ului. Analiza structural Una din cele mai promitoare dezvoltri din domeniul SEM-ului este abilitatea de a determina structura cristalin i orientarea lor pe suprafaa specimenelor preparate. Aceast capacitate se folosete de difracia electronilor reflectai de pe suprafaa specimenului (Schwartz i col., 2000), i este cunoscut sub numele de difracie electrono-reflectat (EBSD). Pentru a colecta maximum de intensitate n modelul de difracie, suprafaa specime342

nului este dintr-o dat rsucit la un unghi de 70 fa de orizontal. Intensitatea modelului reflectat Kikuchi este relativ mic, precum i contrastul semnalului, de aceea e nevoie de camere ultrasensibile i senzori fini de captare a contrastului. Cea mai recent descoperire n aplicaia modelului Kikuchi la volume de analizat este dezvoltarea sistemului de nregistrare a modelului folosind o camer video de nalt sensibilitate sau mai recent o camer video tensio-cuplat (CCD). Aceste pattern-uri sunt mai apoi analizate printr-o metod de indexare asistat de computer. Indexarea automat a modelelor i cartarea orientrii straturilor de cristale asistat electronic permite identificarea fazelor de cristalizare i arat orientarea greit printre limitele cristalelor. Analiza elemental SEM-ul poate fi utilizat pentru a obine informaii legate de compoziie folosind razele X caracteristice. Dezvoltarea unui instrument de analiza chimic localizat a probelor solide (EPMA) s-a produs deodat cu apariia SEM-ului. Conceptul unui microanalizator electronic de probe a aprut n anii 1940 (Hillier, 1947), i de abia n 1949 R. Castaing sub ndrumarea lui A.Guinier au descris i construit un instrument numit ,,microsond electronica(Castaing, 1951). n teza sa de doctorat, Castaing nu numai c a demonstrat c o analiz chimic localizat poate fi desfurat pe suprafaa specimenului, dar a i subliniat modul n care aceast informaie poate fi cuantificat. Recunoaterea complexitii transformrii intensitii razelor X n compoziie chimic a dus la perfecionarea analizei cantitative de ctre numeroi investigatori pe parcursul ultimilor 50 de ani. n timpul anilor 1950 cteva aparate EPMA au fost dezvoltate n laboratoare din Europa i S.U.A., iar primul aparat comercial a fost introdus de CAMECA n Frana n 1956. Optica electronic era format dintr-un tun electronic urmat de lentile convergente ce formau o sond electronic cu un diametru de 0,1- 1 m pe specimen. De asemenea mai fcea parte din aparat i un microscop optic pentru gsirea corect a punctului de analiz i una sau mai multe spectrometre WDS pentru analizarea intensitii radiaiei X emise n funcie de energie. Cosslett i Duncumb (1956) au construit primul microanalizor electronic scanning de probe la Laboratoarele Cavendish n Cambridge. Dac pn atunci microprobele electronice operau cu fascicole statice de electroni, cei doi oameni de tiin treceau fascicolul brusc pe suprafaa probei, aa cum se face azi n SEM-rile actuale. Dei conceptul de analiz local cu raze X este n sine un stimulent pentru folosirea microanalizatorului, adugarea 343

conceptului de scanare a fost o contribuie foarte semnificativ. SEM-ul i EPMA-ul au fost considerate aparate separate pentru nc un deceniu, dar azi EPMA-ul este considerat a fi un echipament aparinnd SEM-ului, avnd i lentile optice i una i mai multe uniti WDS. Adugarea unui spectrometru EDS la microanalizorul electronic pentru a msura razele X a atras atenia asupra nevoii utilizrii lui i n cadrul SEM-ului (Fitzgerald i col.,1968). Detectorii de raze X se bazau pe o form solid de silicon derivat de litiu [Si (Li)]. Spectrometrele dispersive de energie moderne sunt capabile de detectarea razelor X caracteristice ale tuturor elementelor cu numr atomic mai mare dect 4, la cureni tipici utilizai la imagistica electronic secundar a SEM-ului. Marea majoritate a SEM-urilor vndute azi sunt echipate cu capaciti EDS. Sistemul EDS ofer o modalitate rapid de analiz a elementelor constituente n prob. n plus, pe lng analiza calitativ rapid, prin spectrometrie EDS de raze X se mai poate realiza i o analiz cantitativ foarte fin. ntr-un SEM tipic echipat cu detectori EDS i WDS, EDS-ul e utilizat pentru a analiza razele X caracteristice elementelor majore (>10 wt%), pe cnd WDS-ul este utilizat pentru detecta razele X ale elementelor minore (<10 wt%) sau chiar pentru a le recunoate n prob. Dup ce pentru muli ani principalele linii de concentrare au fost n direcia dezvoltrii tehnologiilor existente, cteva descoperiri recente au dat noi tendine n conceptele de detectori i design. Cteva dintre acestea cuprind microcalorimetria n raze X, detectorii din derivai de silicon, i utilizarea de spectrometre de cristale plate mpreun cu optic capilar X-ray, toate gsind o tot mai mare utilizare n cadrul SEM-ului. Un EPMA modern are n mod normal capacitile unui SEM, dou sau mai multe spectrometre de lungime de und (WDS), un microscop optic pentru observarea suprafeei specimenului i un fascicol de curent de electroni care se stabilizeaz prin analiza de raze X. Proba este analizat fr a fi afectat i analiza cantitativ poate fi obinut la o rezoluie spaial de 1 m pe prob. Pentru probe plate lefuite, printr-o analiz normal cu fascicolul de electroni se obine o acuratee de 1-2% (5-10% la probele biologice) din cantitatea respectivului element prezent. O alt nsuire important a SEM-ului cu EDS i WDS este capacitatea de cartare compoziional folosind raze X caracteristice. Atracia acestei forme de acumulare a informaiei este detaliul microcompoziional ce poate fi corelat cu metalografia optic i electronic. n anii ce au urmat de la prima apariie a EPMA-ului, s-au fcut numeroase mbuntiri, printre care o descoperire a fost de mare importan: difracia cristalelor din moleculele organice cu spaieri mari interplanare 344

(Henke, 1965). Aceste cristale elibereaz raze X cu lungime mare de und din elementele cu numr atomic mic (B, C, N, O) ce pot fi msurate de spectrometre dispersive de lungime de und. Recent au fost dezvoltai difractori mari de spaii interplanare ce utilizeaz depunerea fizic alternativ de straturi de vapori de elemente grele i uoare. Capacitatea de a detecta elemente cu numr atomic mic le d utilizatorilor de EPMA posibilitatea de a investiga numeroase noi probleme ale aparatului. n ultima vreme, aparatele au fost construite s permit posibilitatea unei analize de ncredere cu fascicol de electroni si raze X de energie mic. Avantajul energiei mici a fascicolului de electroni este c apare posibilitatea minimizrii dimensiunii sursei de raze X i a minimizrii efectului de absorbie n procedura cantitativ. Efectele de suprafa pot fi mai uor de msurat, dei intervine problema contaminrii cu carbon din cauza vacumizrii slabe a SEM-ului. Microanaliza n raze X a materialelor biologice i polimerice ntlnete aceiai problem n examinarea probelor la SEM, n plus preparatorul trebuie s fie foarte atent ca elementele pentru msurat s rmn n cadrul punctului de analiz i s nu se ndeprteze sau s dispar pe parcursul preparrii. Dei prepararea specimenului biologic este mult mai exact dect procedura pentru alte tiine, metodele cantitative sunt n principiu simple. Ele se bazeaz pe analiza unor seciuni subiri, n care efectele absorbiei i de fluorescen sunt neglijabile. Totui materialele biologice sunt mult prea uor afectate de fascicolul de electroni i astfel c n deceniile trecute s-a depus mult efort n instrumentare precum i n procedurile preparative i analitice cum sunt analiza la temperatur sczut. Dup ce s-a observat capacitatea de msurare a razelor X care poate fi extins i la specimene nonmetalice, a aprut ipoteza folosirii i altor tipuri de fenomene de excitaie. De exemplu, culoarea luminii vizibile (catodluminiscena), produs din interaciunea electronilor cu specimenul a fost asociat cu prezena unor impuriti n material (Long i Agrell, 1965). n plus, se mai poate studia i emisia de fotoni vizibili din recombinarea excesului de perechi de goluri de electroni dintr-un semiconductor (Kyser i Wittry, 1966). Msurarea catoluminiscenei a devenit azi o parte important a SEM-ului mai ales n industria microelectronicelor. Utilizarea tot mai intens a computerului mpreun cu SEM-ul a crescut calitatea i cantitatea de informaii adunate prin intermediul aparatului. S-au creat programe care pot s converteasc raportul intensitii razelor X n compoziii chimice, n primul rnd datorit faptului c unii parametri de corecie sunt funcie de concentraie i, prin urmare, fac aproximrile succe345

sive necesare. Aceste programe deruleaz calcularea compoziiei n cteva secunde i astfel operatorul se bucur de mai mult flexibilitate n obinerea rezultatelor. n plus programele pot acum s controleze fascicolul de electroni, micarea specimenului, i spectrometrele. Automatizarea e de mare ajutor n operaiunile repetitive, crete numrul analizelor efectuate, i i permite operatorului s se concentreze pe evaluarea analizelor. Dezvoltarea cartrii compoziiei cantitative este un alt punct forte n legtura dintre imagistic, capacitatea de analiz cantitativ a elementelor i utilizarea automatizat computaional a SEM-ului. Se face cte o analiz complet executat de calculator, la cartarea cantitativ de compoziie, pentru fiecare raz discret din suprafaa scanat. Valorile concentraiilor corespunztoare poziiei razelor pe specimen sunt asamblate ntr-o imagine digital cu un procesor de imagini prin codificarea axelor concentraiei cu nuana de gri corespunztoare. Imaginile rezultate sunt hri compoziionale i au la fiecare element constitutiv (pixel) valoare numeric complet a concentraiei. n acest fel analistul poate s revad analizele corespunztoare fiecrui pixel sau ir de pixeli, iar hrile pot fi corelate cu imagini SEM preparate prin oricare alt fel de semnal.

346

Microscopia electronic - partea a II-a

ef lucrri dr. Lucian Barbu-Tudoran Cuprins
1. Microscopia electronic de transmisie................................................................................. 349 2. Microscopia electronic de baleiaj ....................................................................................... 359

Din pcate, problemele preparrii probelor biologice au rmas mult n urma mbuntirilor aduse performanelor microscoapelor electronice. Dezvoltarea unui microscop electronic de baleiaj i transmisie (STEM) de nalt rezoluie (0,2 nm) a permis vizualizarea unui singur atom de metal greu, performan uor de atins acum pentru materiale anorganice, n timp ce detaliile probelor biologice, n general, nu sunt mai bune de 1,5 2,0 nm. Depirea barierei de 1,5 nm pentru specimenele biologice s-ar putea realiza prin utilizarea acestui STEM, ce ofer un contrast superior i mai multe tipuri de informaii simultan sau prin utilizarea cmpului ntunecat ntr-un TEM convenional, eliminndu-se astfel nevoia contrastrii. O imagine electronomicroscopic este diferit de situaia real din organismul viu, gradul alterrii probei depinznd foarte mult de tehnica de pregtire a materialului biologic. Plaja efectelor induse de diferitele tratamente premergtoare analizei electronomicroscopice este foarte larg, iar nelegerea acestora este esenial pentru extrapolarea detaliilor oferite de microscop la situaia existent in vivo. Atta vreme ct artefactele inevitabile sunt interpretabile, acestea sunt acceptate, fiind necesar, deci, luarea n calcul a tratamentelor la care este supus proba pn la ajungerea n faza de examinare, rspunztoare de acurateea interpretrii imaginilor. Pe lng metodele clasice de contrastare a probelor biologice, absolut necesare pentru obinerea unor imagini utilizabile, coloraia negativ este cea mai utilizat metod pentru vizualizarea topografiei i structurii bacteriilor, virusurilor, organitelor celulare izolate (inclusiv membrane) i macromoleculelor, fiind una din cele mai uoare i mai rapide proceduri pentru detectarea virusurilor. Cnd microscopia imunoelectronic este folosit n conjuncie cu coloraia negativ, virusuri cu ultrastructuri similare pot fi difereniai cu sensibilitate mare, iar marcarea antigenilor de suprafa se poate realiza cu uu347

rin prin colorarea imunonegativ. Marcarea imunogold n combinaie cu coloraia negativ au un potenial considerabil n detectarea virusurilor, antigenilor virali i a anticorpilor. Un marker de aur coloidal este util, n special, pentru detecia virusurilor foarte mici, picornavirus i parvovirus, precum i n cazul nivelelor sczute de virusuri. Coloraia negativ a probelor deshidratate prin ngheare ar putea evidenia ultrastructura virusurilor i a membranelor fr colapsul specimenului. O alt abordare este utilizarea coloraiei negative n combinaie cu vitrificarea pentru realizarea unui contrast crescut, pe lng beneficiile crioproteciei. De asemenea, crioelectron - microscopia probelor colorate negativ este o metod important pentru investigarea structurii tridimensionale a proteinelor cristalizate. Criotehnicile, ce includ rcirea ultrarapid a celulelor i esuturilor, sunt o alternativ la fixarea chimic, scopul acestora fiind de a stabiliza ultrastructura celulei aa cum exist in vivo, dei, i aici exist pericolul producerii de artefacte n intervalul de temperatur dintre cea fiziologic i cea de imobilizare, vitrificarea nefiind uor de realizat. Fixarea pieselor de dimensiuni mari prin metode convenionale prezint un gradient de calitate a fixrii, astfel, straturile superficiale pot fi suprafixate, n timp ce cele din zona profund vor fi subfixate. n plus, artefactele dependente de timp, cum ar fi contractarea sau umflarea probelor i extracia componentelor celulare datorate difuziei lente a fixatorilor, apar destul de des. Unele din acestea pot fi evitate prin fixarea cu aldehide ntr-un cuptor cu microunde. Microundele sunt unde electromagnetice generate, obinuit, cu o frecven de 2,45 GHz (1 GHz = 109 cicluri / sec) i prezentnd o lungime de und de 12,4 cm, oscilaia dielectric a moleculelor de ap i o energie a fotonului de 10-5 eV, energie prea mic pentru a afecta legturile covalente, dar suficient pentru a interaciona cu cele necovalente cum sunt legturile sterice (legturi de H i interaciuni van der Waals), eseniale funciilor biologice. Undele electromagnetice sunt radiaii neionizante ce produc deplasri moleculare prin migrarea ionilor i rotirea moleculelor dipolare. Dintre avantajele fixrii cu cldura microundelor menionm: capilarele pulmonare interstiiale nu colapseaz cum se ntmpl n cazul fixrii cu formaldehid, cromatina este mult mai distinct n esuturile tumorale, iar ca dezavantaje: deteriorarea eritrocitelor din esuturile nefixate, chiar la 370C, dilatarea excesiv a seciunilor anumitor esuturi (limfoid). Cea mai bun soluie rmne combinarea celor dou metode, respectiv, fixarea cu glutaraldehid ntr-un cuptor cu microunde. 348

1. Microscopia electronic de transmisie

Principalele etape de a cror acuratee depinde foarte mult obinerea unor informaii ct mai apropiate de situaia real din celula vie, sunt urmtoarele: recoltarea, fixarea, deshidratarea, includerea, ncapsularea, modelarea, secionarea, contrastarea, examinarea i developarea suporturilor fotografice. RECOLTAREA Recoltarea fragmentelor de esut trebuie efectuat foarte rapid (1-2 min) dup sacrificarea animalelor pentru a se mpiedica instalarea unor alterri morfo-funcionale la nivelul esutului. Pentru meninerea neschimbat a ultrastructurii deci pstrarea ei identic cu cea din momentul sacrificrii animalului, fragmentele recoltate la rece (pe ghea), se trec rapid pe glutaraldehid 2,7-3% (primul agent fixator). Este indicat pipetarea soluiei de glutaraldehid peste organul ce urmeaz a fi recoltat, nainte de prelevarea acestuia din organismul animal. Din fragmentele aflate pe glutaraldehid se taie foarte repede cuburi mici, cu latura de maxim 1 mm. Dimensiuni mai mari nu ar permite penetrarea pieselor de ctre tetraoxidul de osmiu, principalul agent de fixare utilizat n microscopia electronic de transmisie. Acesta nu fixeaz corespunztor la o profunzime mai mare de 0,5 mm. Se preleveaz fragmente suficiente pentru prepararea a cte 3 blocuri/prob (adic cel puin 6 cuburi). Pentru decuparea cuburilor se recomand folosirea a dou lame de ras noi, acionate n sens contrar pentru a se evita lezarea mecanic (zdrobirea/sfierea) esutului. FIXAREA Procesul de fixare asigur stabilizarea structurii biologice ct mai aproape de starea nativ, cu ajutorul unor ageni capabili s creeze legturi ncruciate ntre moleculele constitutive ale materialului prelucrat, nepermindu-se deteriorarea arhitectonicii ultrastructurale. ncepnd cu aceast etap, toate celelalte operaii, pn la secionare, se vor desfura sub ni, datorit toxicitii mari a reactivilor cu care se lucreaz. Se realizeaz o fixare chimic a pieselor, cu doi ageni fixatori la 4C. A. Prefixarea Prefixarea se efectueaz cu o soluie de glutaraldehid 2-6% (2,7%) n Tampon fosfat 0,1 M. Rezultate foarte bune se obin dac, nainte de recoltare, se pipeteaz soluia de glutaraldehid pe suprafaa organului de inte349

res. Exist, de asemenea, posibilitatea perfuziei esuturilor cu fixator, respectiv introducerea fixatorului n circulaie, asigurndu-se astfel o rspndire rapid a acestuia la nivelul esuturilor. Glutaraldehida este primul fixator utilizat curent, deoarece este mai puin toxic, permite o mai uoar manipulare a preparatului, ptrunde mai uor i acioneaz rapid asupra ultrastructurii preparatului. Dup obinerea cuburilor de esut, acestea sunt trecute n tuburi de sticl i pstrate timp de 15-30 minute n 1-1,5 ml glutaraldehid. Dup 15-30 minute se schimb glutaraldehida i se continu fixarea timp de nc 1-2-3 ore n funcie de consistena esutului. Glutaraldehida [O=CH-(CH2)3-CH=O] are proprietatea de a lega gruprile active de hidrogen, n special de la alcooli i gruprile amino- (din moleculele proteice) i imino-, formnd puni ncruciate i puni intermoleculare, conferind astfel o mare stabilitate structurilor celulare cu care vine n contact. Prin urmare va prezerva foarte bine ultrastructura celular i activitatea enzimatic a celulelor. Glutaraldehida pur prezint un singur vrf de absorbie n UV, la 280 nm. Dac este inut la temperatura camerei, n soluie apar polimeri ai glutaraldehidei, care vor avea un nou vrf de absorbie la 235 nm. Deci glutaraldehida 25% (sau 50%) stoc se va pstra numai la frigider, prepararea soluiei 2,7% se va face extemporaneu, iar fixarea se va face la 4C. Tuburile de sticl cu care se lucreaz vor fi foarte curate (bine splate cu detergent i amestec sulfocromic, urmate de splare abundent cu ap distilat). Ele se acoper cu dop (de cauciuc rezistent) care nu se va frmia sub aciunea substanelor ce se vor folosi. Glutaraldehida se utilizeaz n soluie apoas 2,7% preparat extemporaneu dup reeta: - Glutaraldehid (25%) pentru microscopie electronic - Tampon fosfat 0,1 M pH 7,4 - Ap distilat Tamponul fosfat 0,1 M se prepar dup reeta: - NaH2PO4 H2O (NaH2PO4 2H2O) - Na2HPO4 anhidru (Na2HPO4 12H2O) - ap distilat 350 1,37 g (1,56 g) 7,154 g (18,036 g) Pn la 500 ml 2 ml 10 ml 4,2 ml

B. Splarea Dup prefixare, este foarte important a se nltura prin splare orice urm de glutaraldehid, ale crei reziduuri vor mpiedica legarea osmiului. Prin reacia posibil ntre cele dou substane fixatoare aplicate succesiv, poate rezulta un precipitat electron-dens care duneaz calitii preparatului. n plus, dac urmele de aldehide nu sunt eliminate din esut, la post-fixare lipidele din membrane nu se vor fixa bine cu OsO4. Dup ndeprtarea glutaraldehidei se adaug peste piese (care nu vor rmne niciodat neacoperite) tampon fosfat 0,1 M, pH 7,4 n 4 bi succesive a cte o or (n a patra baie piesele se pot ine peste noapte). Dac prefixarea s-a fcut la frigider, i splarea se va face n aceleai condiii. C. Postfixarea Postfixarea se realizeaz cu tetraoxid de osmiu (OsO4) 1-4% n funcie de consistena esutului de studiat. Rolul acidului osmic este de a stabiliza att proteinele ct i bistraturile lipidice, dar i de a mri contrastul la nivelul ultrastructurii esutului, pe care o coloreaz prin depunerea osmiului. Dup nlturarea tamponului fosfat, n tuburile cu piesele prefixate i splate se adaug cel de-al doilea agent fixator, i anume, o soluie 1% (sau 2%) de OsO4 n Tampon Fosfat 0,15 M, pH 7,4, pentru 15 minute. Se nltur aceast soluie, se adaug o soluie proaspt de OsO4 n care piesele vor mai sta timp de 85 minute. Tamponul fosfat 0,15 M se prepar dup reeta: - NaH2PO4 H2O (NaH2PO4 2H2O) 2,064 g (2,366 g) - Na2HPO4 anhidru (Na2HPO4 12H2O) 10,765 g (27,139 g) - ap distilat Pn la 500 ml

OsO4 2% se prepar astfel: 1 g OsO4 se trece ntr-o sticl foarte curat, cu dop rodat, coninnd 50 ml tampon fosfat 0,15 M pH 7,4. Se nchide sticla i se agit puternic pn la spargerea fiolei, dup care se las 24 ore la 4C pentru dizolvarea complet. Se va evita contactul soluiei cu obiecte metalice, iar trecerea soluiei n alte flacoane se va face numai prin rsturnare. Culoarea unei soluii proaspete de OsO4 este galben pal. Prin procedura de fixare menionat se urmrete stoparea proceselor metabolice din esturi, prezervarea structurii fine a celulelor i stabilizarea acestora pentru a face posibile etapele ulterioare de preparare n scopul vizualizrii n microscopul electronic de transmisie. Exist cazuri cnd fixarea a fost prelungit peste noapte pentru fiecare fixator. 351

D. Splarea Dup terminarea procesului de fixare pe cale chimic trebuie s urmeze imediat splarea pentru nlturarea total a excesului de fixator din esut. n cazul fixrilor succesive duble, splarea trebuie efectuat dup fiecare fixator folosit. Prezena urmelor de fixator n esut faciliteaz reacii ntre acesta i soluiile de solveni organici folosite la deshidratare, cu urmri asupra polimerizrii blocurilor la includere. Dup ndeprtarea tetraoxidului de osmiu se adaug peste piese (care nu vor rmne niciodat neacoperite) Tampon Fosfat 0,15 M, pH 7,4, n 4 bi succesive de cte o or (n a patra baie piesele se pot ine peste noapte). Dac fixarea s-a fcut la frigider, i splarea se va face n aceleai condiii. DESHIDRATAREA n vederea includerii pieselor (pentru a se putea efectua seciunile ultrafine) se utilizeaz rini epoxidice: Vestopal W sau Epon 812 care sunt substane organice hidrofobe. Deci, pentru o ct mai bun includere, este necesar ca toat apa introdus n timpul splrii n piese s fie extras fr a produce modificri n structura molecular a celulelor. Pentru deshidratare se utilizeaz acetona (pentru epon se poate folosi i alcoolul etilic) i n unele cazuri oxidul de propilen, dioxan sau toluol n etapele finale, n soluii apoase de concentraii cresctoare: 30% timp de 15 minute; 50% timp de 15 minute; 70% timp de 30 minute; 80% timp de 30 minute; 90% timp de 30 minute; 100% (anhidr) timp de 15 minute; 100% (anhidr) timp de 15 minute; 100% (anhidr) timp de 15 minute; La includerea n Epon 812 pot urma dou bi de oxid de propilen de cte 15 minute fiecare. Extragerea apei se face treptat i n timpi scuri pentru ca procesul s nu fie nsoit de alterri structurale (eventuale extracii de proteine din esut). Pn la concentraia de 70% se lucreaz la temperatura de 4C dup care tuburile vor putea fi pstrate la temperatura camerei. Cantitatea de soluie folosit pentru fiecare etap de deshidratare trebuie s fie de 2-5 ml n funcie de numrul pieselor din fiecare flacon. Cnd se ajunge la etapele finale, nlocuirea solventului trebuie fcut foarte rapid, deoarece alcoolul sau acetona se evapor uor i piesele pot suferi procese 352

de strngere, urmate de modificri nedorite. Este recomandabil ca alcoolul sau acetona folosite n ultimele bi s fie anhidre, ceea ce se poate realiza introducnd n vase o cantitate oarecare de sulfat de sodiu anhidru. ntre soluiile de deshidratare i cele de includere este bine s se intercaleze cteva bi cu solveni de tranziie. n cazul includerii cu rini epoxidice, cel mai bun intermediar este oxidul de propilen care acioneaz ca deshidratant i fixator i, fiind foarte fluid i miscibil cu aceste rini, asigur o foarte bun infiltrare a esuturilor. n cazul cercetrilor de localizare enzimatic, acest solvent trebuie evitat deoarece inhib unele enzime. Tot ca intermediar este recomandat xilolul sau toluolul, fiind mai volatil. n paralel cu deshidratarea se prepar soluie de Vestopal sau Epon pentru includere. INCLUDEREA Obinerea seciunilor ultrafine care, prin grosimea lor redus s permit transmisia electronilor i deci obinerea imaginilor n TEM este condiionat de includerea pieselor ntr-un mediu suficient de dur care s faciliteze secionarea pieselor, dar care, prin infiltrarea n esut, s nu altereze structurile. Specimenele sunt infiltrate n toat masa lor cu materialul de includere, care nlocuiete substana n care se efectueaz deshidratarea, respectiv acetona (sau dac este cazul alcoolul etilic). Din categoria mediilor de includere hidrofobe fac parte cele pe baz de metacrilat, rini poliesterice i unele rini epoxidice. Exist i medii de includere hidrofile, care nu necesit deshidratarea pieselor dup fixare i splare. Din aceast categorie pot fi amintite: durcupanul, glicol-metacrilatul sau aquonul. Dintre rinile poliesterice, cel mai frecvent utilizat este Vestopalul W; din aceeai clas mai fac parte lacul poliesteric ME 6611, rigolacul, selectronul etc. Dintre rinile epoxidice se pot enumera: Araldita, Eponul 812, Maraglas 655 DER 732, DER 332 DER 732, Epon 812 Araldit, etc. Pentru includera n Vestopal sau Epon piesele sunt inute cte 1 or n soluii de Vestopal (Epon)/aceton (anhidr) n concentraii cresctoare: 1:2; 1:1; 2:1; 3:1 i n Vestopal (Epon) pur, fr dop, peste noapte. Toate operaiile de includere i ncapsulare se desfoar n ni. A. Vestopal W Vestopalul W este o rin poliesteric un copolimer format dintr-un poliester nesaturat i stiren, prepolimerizai mpreun pn la starea unui 353

sirop consistent, uor glbui. Fiind parial polimerizat, nu produce procese de strngere a esuturilor. Vestopalul W nu este miscibil cu alcoolul, i pentru deshidratare trebuie s se foloseasc acetona, stirenul, dioxanul sau chiar glicometacrilatul. Pentru includere i ncapsulare, se prepar vestopalul astfel: se adaug n puin Vestopal peroxidul de benzoil (iniiator al polimerizrii Vestopalului) pentru predizolvare i se amestec foarte bine cu o baghet de sticl; se adaug Vestopal n cantitate de 1 g/bloc, se omogenizeaz din nou foarte bine i se adaug 8 picturi de activator (la 3 probe) (octoat de cobalt) cu o pipet la care 1 ml corespunde pentru 20 de picturi. Att rinile ct i iniiatorul i activatorul se pot pstra la rece. n timp ce rina poate fi pstrat cteva luni la rece, iniiatorul i activatorul, chiar la rece, i pierd activitatea n decurs de o lun. De aceea, acetia din urm trebuie rennoii n fiecare lun, altfel blocurile vor fi moi i de slab calitate. Cel care expir mai repede este activatorul, care i schimb culoarea. Blocurile se pot seciona uor cu cuitul de sticl. Seciunile sunt rezistente la fasciculul de electroni, se pot monta pe grile fr pelicule suport i permit obinerea unei nalte rezoluii. Pentru 3 probe (15 blocuri) reeta de preparare a Vestopalului este urmtoarea: - Vestopal W - Peroxid de benzoil - Octoat de cobalt preparat astfel: 1 ml -metil stiren + 7 picturi de octoat de cobalt 15 g 150 mg 8 picturi (0,4 ml)

Peroxidul de benzoil se activeaz n prealabil prin recristalizarea din cloroform. Substana activat se depune sub form de cristale incolore pe pereii vasului respectiv, cristale care se rzuiesc i se mrunesc, dup care se pun n tuburi. n timpul lucrului se va avea grij s nu se amestece direct iniiatorul cu activatorul, deoarece amestecul este exploziv. B. Epon 812 Eponul 812 este o rin epoxi-alifatic pe baz de glicerol, obinut prin condensarea epiclorohidrinei cu glicerol. Ca amestec de includere, ptrunde repede n esuturi, duritatea blocurilor poate fi modificat dup dorin, se secioneaz uor cu cuitul de sticl, esuturile au un contrast ridicat i sunt excelent prezervate, iar seciunile sunt foarte rezistente la fascicolul de electroni. 354

Reeta de preparare a Eponului este urmtoarea: Soluia A Epon 812 (Epitoke 212) DDSA (anhidrida dodecenil-succinic) ml 66 100 Soluia B (d duritatea) Epon 812 NMA (anhidrida metil-nadic) ml 100 84

Soluiile A i B pot fi pstrate timp de peste 6 luni la 4C n sticle bine nchise i ferite de umezeal. nainte de amestecarea celor dou soluii, ele trebuie scoase de la frigider i inute la temperatura camerei timp de cteva ore pentru a evita condensarea vaporilor de ap pe ele, ceea ce ar afecta polimerizarea, deci includerea corect. Pentru dou probe (6 blocuri), raportul de combinare A:B = 5:5 la care se adaug 150 l DMP 30 (2,4,6-dimetil-aminometil fenol) acceleratorul polimerizrii. Se amestec foarte bine cu o baghet de sticl i apoi se centrifugheaz pentru eliminarea bulelor de aer. Raportul 5:5 duce la obinerea unor blocuri potrivit de dure; dac predomin soluia A (7:3), blocurile vor fi mai moi, iar dac predomin soluia B (3:7), blocurile vor fi mai dure. NCAPSULAREA ncapsularea specimenelor se face n capsule de gelatin foarte bine uscate (inute cteva ore la etuv la 60C) n fiecare capsul se pune o pictur de mediu de includere i apoi cte dou cuburi dintr-o prob pentru fiecare bloc. Se completeaz cu Vestopal (Epon) circa 3/4 din volumul capsulelor, pentru ca blocul s fie relativ scurt, spre a intra aproape n ntregime n suportul ultramicrotomului. Ulterior se face etichetarea capsulelor (pe etichete se scrie cu creionul chimic pentru Vestopal i cu creion obinuit pentru Epon pentru a se evita tergerea simbolurilor la contactul cu mediul de includere) i completarea concomitent a tuturor capsulelor de gelatin. Dup ncapsulare se induce polimerizarea mediului de includere prin introducerea capsulelor la etuv la o temperatur de 60C timp de 24-48 de ore. Temperatura mai ridicat poate duce la polimerizarea neomogen, cu preponderen la periferia blocurilor, sau chiar la spargerea acestora. n urma polimerizrii se obin blocuri dure, transparente, coninnd n interior piesele de culoare neagr. MODELAREA BLOCURILOR Blocurile de rin se fasoneaz cu ajutorul unei lame de ras nou, sub o lup binocular cu posibiliti de mrire de 70-100. n vrful blocurilor, 355

la nivelul probei se execut un trunchi de piramid care s poarte n vrf o suprafa trapezoidal cu laturile de aproximativ 0,1-0,2 mm. Se modeleaz cte dou blocuri pentru fiecare prob, cte un bloc fiind pstrat ca rezerv. Operaiunea de modelare a blocurilor este necesar pentru ca n momentul secionrii s se obin seciuni trapezoidale care vor forma benzi rectilinii. SECIONAREA Aceast operaie este necesar pentru obinerea seciunilor ultrafine, cu o grosime care s permit strbaterea lor de ctre fasciculul de electroni accelerai la tensiuni de 50-100 kW n TEM. Cu ct seciunile sunt mai groase, cu att tensiunea de accelerare a electronilor va trebui s fie mai mare pentru a se putea obine imaginea pe ecranul fluorescent al microscopului. Pentru secionare se pot folosi cuite de diamant sau cele de sticl, mult mai accesibile. S-a demonstrat c dac nu exist sticl special pentru cuite, poate fi folosit orice sticl alb plan, cu grosimea de 5-8 mm. Pentru tierea sticlei nu se folosesc cuite de diamant, deoarece acestea ptrund prea adnc, i la fracturare sticlei se produc tensiuni care afecteaz calitatea cuitului. Cele mai potrivite sunt rondelele de metal din comer. Apsarea pe foaia de sticl trebuie s fie uoar, de aceeai intensitate pe toat linia de tiere. Tierea se va face pe o folie de cauciuc. Se poate ntinde nainte de tiere o urm de petrol cu ajutorul unui tampon de vat, asigurndu-se astfel o tiere uoar i o rupere a benzilor de sticl fr tensiuni. Din barele de sticl se vor tia n prima faz ptrate, pe diagonala crora se va face o nou tietur, rezultnd cte dou cuite de form triunghiular, prismatic. Pentru realizarea cuitelor se poate utiliza aparatul special conceput pentru aceasta (knife maker), pentru care se folosete ca materie prim, sticla pentru cuite, sub form de bare, lungi de 400 mm, late de 25 mm i groase de 5,5 mm. nainte de confecionarea cuitelor, barele de sticl se cur uor cu un tampon de vat cu aceton anhidr dup care se terg cu o bucat de tifon curat. Folosirea knife-maker-ului are ca rezultat obinerea de cuite cu ti drept; n cazul tierii manuale, cuitele pot avea muchia de tiere oblic. Din cauza tensiunii de fracturare, imediat sub tiul cuitului se formeaz o linie curb, aa-zisa linie Wallner, cu ajutorul creia se poate detecta zona util a cuitului. Aceasta ncepe n punctul unde linia Wallner se curbeaz: zona cea mai ascuit examinat la microscopul stereoscopic al ultramicrotomului, la o mrire de 50-100, apare ca o linie alb, strlucitoare, n timp ce zonele nvecinate prezint dini de fierstru. Cuitele selecionate pentru secionare se pstreaz ferite de praf. nainte de folosire este necesar pregtirea suplimentar a cuitelor. La marginea 356

prismei unde se afl suprafaa de secionare se construiete un bazin prin lipirea unei benzi adezive n poziie perfect orizontal. Cuitul se instaleaz n ultramicrotom raportat la limitatorul din stnga locaului cuitului i la un unghi de 3. Se spal de cel puin 3 ori cu alcool (10% sau aceton 10%) sau cu ap distilat, apoi se face oglinda. La nivelul bazinului se va ajusta cantitatea de alcool 10% astfel nct, prin reglarea poziiei lmpii fluorescente, reflexia luminii s se realizeze ct mai uniform la suprafaa bii, pe o suprafa ct mai mare posibil (ideal este complet) a acesteia. De asemenea, oglinda de ap trebuie s fie orizontal, s nu prezinte menisc, ceea ce ar putea determina udarea blocului i compromiterea secionrii. Pentru secionare blocurile se monteaz pe rnd n dispozitivul barei de naintare al ultramicrotomului LKB. Blocurile se monteaz astfel ca baza mare a trapezului din vrful piramidei s fie perfect paralel cu lama cuitului, n zona cea mai ascuit a acestuia. Pentru realizarea acestui lucru se regleaz angrenajele intermediare care ajut la fixarea suportului care poart blocul de bar de naintare a ultramicrotomului. n poziia blocat a barei de naintare, piramida realizat la nivelul probei trebuie s se afle la nivelul gurii cuitului (n plan vertical). Se apropie ct mai mult posibil cuitul de bloc prin manevrarea voxelor macrometric, i apoi micrometric a ultramicrotomului, micnd uor, n paralel, bara de naintare n sus i n jos prin acionarea manual a acesteia de la viza de pe panoul de comand. Bara de naintare va efectua micri succesive n plan vertical, astfel nct suprafaa de secionare a blocului cade pe faa de tiere a cuitului de sticl sau de diamant. Dup fiecare micare de tiere, bara nainteaz cu o distan reglabil, egal cu grosimea seciunii (500-1000 ). n cazul ultramicrotomului LKB avansul este controlat prin dilatarea termic a unei tije metalice (aliaj de nichel). Pentru aceasta, temperatura camerei trebuie s fie ct mai sczut posibil. Seciunile obinute vor pluti la suprafaa apei distilate din baia cuitului (care formeaz oglinda), grosimea acestora fiind apreciat dup culoarea lor: Cenuie Cenuiu-argintie Argintie Argintiu-glbuie Galben pai 100-200 300-400 500 600 650-700 Galben intens-maroniu Maro Maro albstrui Albstrui Verde 700-800 800-850 900-1000 1000-1100 1300-1500

357

Pentru cercetri de rutin, seciunile de culoare argintie sunt foarte convenabile. Grosimea seciunilor se va alege i innd cont de caracteristicile microscopului n care se va face examinarea. Seciunile sunt preluate pe grile electrolitice de cupru (200 mesh) acoperite n prealabil cu o pelicul fin de parlodion. Din fiecare bloc se vor culege seciuni pe cel puin cte 2 grile. Uscarea grilelor se face cu hrtie de filtru prin tamponarea lateral a grilelor. Grilele se pstreaz n cutii Petri cu capac pentru a fi ferite de praf (pe hrtie de filtru pe care se trec simbolurile corespunztoare specimenelor). Grilele electrolitice sunt reele de cupru cu cadrul de 3 mm, obinute prin electroliz. Numrul de ochiuri pe care le poate avea o gril variaz ntre 50 i 1000, ns n mod curent sunt folosite grile cu 100-200 de ochiuri. Pentru obinerea peliculei de parlodion, n mijlocul unui cristalizor cu ap bidistilat se pipeteaz o pictur de parlodion. Se evapor diluantul rmnnd o pelicul de 100 grosime. Pe aceast pelicul se aeaz grilele, cu faa n jos. Grilele sunt apoi scoase cu ajutorul unor rondele de hrtie. Dup uscarea peliculei la temperatura camerei, grilele fiind ferite de praf, se trece la acoperirea cu carbon (un strat de circa 100 ) a grilelor ntr-un evaporator cu vid (metalizor). Stratul de carbon are rolul de a proteja pelicula de parlodion de aciunea distrugtoare a fasciculului de electroni. CONTRASTAREA esuturile biologice incluse n mase plastice, datorit fineei lor i a compoziiei chimice, au putere mic de mprtiere a electronilor, i ca urmare, contrastul acestora este foarte sczut. Contrastarea urmrete creterea capacitii de mprtiere difereniat a electronilor de ctre materialul biologic secionat. Contrastul imaginii obinute n microscopul electronic depinde de numrul atomic al elementelor din care este alctuit specimenul: cu ct acest numr este mai mare, cu att dispersia electronilor i implicit contrastul imaginii sunt mai mari. Deoarece moleculele din structurile biologice sunt constituite din atomi cu numr atomic mic (C, N, O, H), pentru a le evidenia sunt contrastate cu sruri ale metalelor grele. n cazul de fa contrastarea se face n dou etape, cu doi contrastani diferii: A. Contrastarea cu acetat de uranil. Soluia de acetat de uranil se prepar dup reeta: - Acetat de uranil - Alcool etilic 50% n ap distilat 358 2,6 g 20 ml

Se pipeteaz acetatul de uranil n godeurile unei plci de parafin (cear), dup care s-au lsat grilele cu seciunile n jos pe picturile de contrastant. Se in grilele pe acetat de uranil 15-20 minute dup care se spal la jet de piset cu ap distilat-alcool i se iau pe hrtie de filtru spre a nu adera la vrful pensei fine cu care se lucreaz. B. Contrastarea cu citrat de plumb. Se pipeteaz citratul de plumb n godeurile plcii de parafin (cear), dup care se las grilele cu seciunile n jos pe picturile de contrastant. Se in grilele pe citratul de plumb maxim 9 minute (timp dup care apar precipitate), dup care se spal la jet de ap distilat. Pentru evitarea apariiei precipitatelor (reprezentate de carbonatul de plumb ce apare la contactul citratului de plumb cu CO2 atmosferic), se va evita contactul contrastantului cu aerul atmosferic. Cel mai bine este s se foloseasc o soluie proaspt preparat, filtrat, iar colorarea s se fac n apropierea ctorva granule de NaOH care s absoarb CO2. Soluia de citrat de plumb se prepar dup reeta: Citrat de plumb (GM 1053,85) NaOH 1N Se agit timp de 5 minute Ap distilat Se aduce pH-ul la valoarea 12 Se completeaz pn la 50 ml 1,410 g 8 ml

Se dizolv n 30 ml ap distilat i se agit puternic timp de 5-10 minute

2. Microscopia electronic de baleiaj

Microscopul electronic de baleiaj sau scanning (SEM) difer fundamental de microscopul electronic de transmisie n privina modului de formare a imaginii. n microscopul electronic de transmisie clasic imaginea se formeaz n ntregime, simultan, n timp ce la cel de baleiaj, imaginea se formeaz punct cu punct n forma rasterului. Electronii emii de tunul de electroni al microscopului i accelerai de o tensiune nalt (0,530 kV) sunt concentrai, ntr-un sistem cu mai multe lentile, ntr-un fascicul ngust al crui diametru n locul de ncruciare are, pe suprafaa probei cercetate, sub 10 nm. Imaginea final, care se compune din numrul total al liniilor, se numete raster. Raza primar (incident) a electronilor accelerai i concentrai ce cade pe suprafaa probei, interacioneaz cu materialul, interaciune n urma creia apar urmtoarele semnale: 359

 Electroni secundari (SE) Electroni reflectai (BE) Electroni Auger Electroni absorbii de prob (AE) Electroni transmii prin prob (TE) Fotoni Radiaii X. Neavnd de a face cu electroni transmii prin prob, pentru SEM dimensiunile preparatelor pot depi 3 cm grosime, limitarea fiind dat doar de mrimea incintei probei, dar pentru probele biologice este necesar acoperirea acestora cu un strat foarte subire de metal (prin evaporare n vid), capabil de a genera electroni secundari sub impactul fasciculului incident provenit din filamentul microscopului. Ca i n cazul TEM, i aici probele trebuiesc deshidratate, ndeprtndu-se orice urm de solvent sau a vreunei substane volatile din materialul biologic, examinarea desfurndu-se, de asemenea, n condiii de vacuum nalt. Dei rezoluia acestui microscop nu permite observarea unor detalii de ordinul celor din TEM, o deshidratare natural a materialului biologic produce alterri ale suprafeei probelor datorate tensiunii superficiale, suficient de profunde pentru a nu mai nregistra un aspect normal al acestora. Pentru fixarea probelor biologice cu coninut ridicat de ap se folosete aceeai combinaie de fixatori ca i pentru microscopia electronic de transmisie: - prefixarea cu glutaraldehid 2,7% n tampon fosfat 0,1M, pH 7,4 pentru 60 90 minute la 4 0C; - ndeprtarea fixatorului n exces prin trecerea probei n tampon fosfat 0,15M, pH 7,4 - trei bi consecutive a cte 60 minute fiecare, a patra peste noapte, toate la 4 0C; - postfixarea cu acid osmic (Os O4) 1% n tampon fosfat 0,15M, pH 7,4 timp de 75-90 minute, de asemenea la 4 0C. Timpii de lucru ai acestor etape vor fi adaptai tipului de esut organic i, n special, dimensiunilor probei. DESHIDRATAREA LA PUNCT CRITIC Deshidratarea la punct critic reprezint o metod de eliminare a oricrei substane volatile, generatoare de vapori (ce pot diminua nivelul vidului din microscop) dintr-o prob biologic n vederea examinrii acesteia la microscopul electronic cu baleiaj. 360

n 1952, Anderson a dezvoltat aceast metod folosind CO2 lichid, dar se pot folosi i alte gaze lichefiate ca i fluid de tranziie, metod superioar sublimrii apei n vid. n acest sens, studierea morfologiei suprafeelor probelor biologice implic prezervarea detaliilor de suprafa. Deshidratarea normal prin evaporare la temperatura camerei induce deformri ale majoritii specimenelor, cauza primar a acestora fiind efectele tensiunii superficiale, proba fiind supus forelor prezente la limita fazei lichid vapori. Cel mai comun mediu al probelor biologice este apa, care prezint o tensiune superficial la aer foarte mare, spre deosebire de aceton, unde aceasta este de cteva ori mai mic. Tensiunea superficial poate fi redus prin substituirea cu un lichid ce are o tensiune superficial mult mai mic dect a apei, ateptndu-se deformri minore ale suprafeei probei n timpul deshidratrii. Totui, intervenia aa-numitei continuiti de faz sugereaz o metod de deshidratare pentru care tensiunea superficial poate fi redus la zero, cu pstrarea nealterat a detaliilor de suprafa. Prin creterea temperaturii gazului lichefiat, meniscul devine plat, indicnd o reducere a tensiunii superficiale. Dac tensiunea superficial scade foarte mult, suprafaa lichidului devine foarte instabil i, n final, trece n faza de gaz. Cnd este atins punctul critic este posibil trecerea de la faza de lichid la faza de gaz fr modificri dramatice. Dac proba biologic a fost n lichid, va parcurge aceast tranziie spre un mediu gazos uscat fr a fi n contact cu suprafaa, evitnd astfel posibilitatea apariiei deformrilor datorate tensiunii superficiale.

361

Graficul indic faptul c, la atingerea punctului critic (caracterizat de valori ale presiunii i temperaturii foarte precise), proprietile strii de lichid i ale strii de gaz (vapori) ale aceleiai substane, devin similare i, n final, coincid. Acest fapt este realizat pe izoterma de 31,1 oC pentru CO2, aceasta fiind temperatura critic creia i se asociaz o presiune critic, valori la care are loc tranziia. Dac lichidul a fost nclzit ntr-o incint nchis, aa nct presiunea critic s poat fi atins la temperatura critic, orice menisc vizibil va disprea, tensiunea superficial fiind zero avnd, deci, o continuitate de stare. Deasupra acestei temperaturi gazul nu poate fi lichefiat prin aplicarea presiunii, astfel, o substan poate fi clasificat drept gaz doar deasupra temperaturii critice, sub aceast valoare, unde poate fi lichefiat, este mult mai precis termenul de vapori. Chiar dac valorile critice ale diferitelor substane pot fi atinse practic, n cazul probelor biologice la unele dintre acestea ar interveni modificri termice suplimentare, cel mai utilizat fiind, n consecin, dioxidul de carbon. CONSTANTE CRITICE Substana Temperatura critic (oC) HIDROGEN -234,5 OXIGEN -118 AZOT -146 DIOXID DE CARBON +31,1 MONOXID DE CARBON -141,1 AP +374 Presiunea critic (atm) 20 50 33 73 36 219

Deci, CO2 rmne cel mai utilizat mediu pentru deshidratarea la punct critic i este numit fluid de tranziie. Nefiind miscibil cu apa, apa din proba biologic trebuie nlocuit cu un alt fluid miscibil cu CO2. Acest fluid intermediar, de regul, schimb apa din esut i este miscibil cu CO2, dei se pot utiliza i variante cu dou fluide intermediare. naintea acestor etape se realizeaz fixarea probei, tipic pentru microscopia electronic, procedura glutaraldehid osmium. Aa cum s-a menionat, stadiul intermediar implic deshidratarea probei biologice cu ajutorul lichidului intermediar: (proba umed) H2O > Aceton > CO2 > DPC (proba uscat) 362

Specimenul este trecut prin diferite concentraii cresctoare ale fluidului intermediar, culminnd cu nlocuirea complet a apei din esut cu acest fluid, deoarece prezint o tensiune superficial foarte sczut, fiind mai puin susceptibil deformrilor datorate evaporrii fluidului de tranziie ce-l va nlocui. _______________aceton________________________ H2O > 30% > 50% > 60% > 70% > 80% > 90% > 100% > CO2 ------------------- cte 10 minute fiecare --------------------- - trei schimbri FLUIDE INTERMEDIARE / DESHIDRATANTE
Substana ETANOL ACETON FREON (113) AP Tensiunea superficial (dyne/cm) 23 24 19 73

Principalele etape ale deshidratrii la punct critic: 1. fixarea probei cu glutaraldehid 2,7% i OsO4 1% n tampon fosfat; 2. deshidratarea cu aceton; 3. imersia probei n aceton n incinta aparatului; 4. substituirea acetonei cu CO2 lichid sub presiune operaie repetat n funcie de dimensiunile probelor; 5. nclzirea incintei pn la atingerea punctului critic; 6. eliberarea vaporilor de CO2. ACOPERIREA CU METALE Toate probele neconductive necesit acoperirea cu un film subire de material conductiv. Aceast acoperire este necesar pentru eliminarea sau reducerea ncrcrii electrice ce se instaleaz rapid la suprafaa unei probe neconductive la baleierea acesteia de ctre un flux de electroni de energie nalt. Materialul uzual pentru acoperirea probelor este aurul. n absena stratului de acoperire, specimenele nonconductive examinate la parametri optimi prezint invariabil fenomenul ncrcrii electrice ce conduce la distorsionarea imaginii i la distrucii termice, avnd drept rezultat pierderi semnificative de material din prob. n situaii extreme, specimenul poate acumula o ncrctur suficient de mare pentru a decelera fluxul primar, proba acionnd n acest caz ca oglind pentru electroni. 363

Cnd scopul analizei nu este achiziia unui spectru de raze X, aurul este cel mai utilizat element pentru acoperirea probelor. Acoperirea se realizeaz prin evaporarea metalului n vid, ce presupune legarea metalului la polul pozitiv i a probei la cel negativ, la capete aplicndu-se o tensiune continu de 1 3 kV, dispozitiv instalat ntr-o incint ce menine un nivel de vacuum (10-2 Pa) suficient pentru a asigura o depunere a atomilor de aur ntr-un strat uniform i foarte subire, de cteva sute de nanometri. EXAMINAREA DIFERITELOR PROBE IN SEM Probele pentru examinarea n SEM sunt montate pe suporturi conductive din cupru cu ajutorul unor discuri de carbon adezive pe ambele fee. Orientarea probei pe suport n aceasta faz este foarte important, innd cont de posibilitatea limitat de nclinare a probei n microscop, aa nct zona de interes s fie expus direct fasciculului de electroni ce baleaz proba. Astfel, montarea probelor se va realiza sub lupa binocular unde, probe de tipul microfosilelor (foraminifere) sau segmente de aparate bucale, antene, palpi (insecte), pot fi aranjate n ordine pe un singur suport. Pulberile, sporii sau alte probe ce nu pot fi manipulate cu pensa, vor fi presrate pe suportul adeziv, surplusul fiind ndeprtat n momentul introducerii n vid pentru metalizare. Probe biologice de tipul insectelor chitinoase, precum i cele cu un coninut nesemnificativ de ap (frunze uscate) pot fi montate pe suport i metalizate fr deshidratare, n timp ce, la celelalte probe este obligatorie uscarea la punct critic pentru prevenirea deformrilor datorate unei deshidratri brutale n aer, abia apoi realizndu-se acoperirea cu metale a acestora. Probele astfel pregtite se introduc n microscop si se examineaz la diferite mriri, imaginile fiind preluate n format digital sau clasic pe film. O anex important a SEM este sistemul de microanaliza elemental cu raze X (EDX). Detectorul special al EDX identific, pe baza radiaiei X (specific fiecrei specii chimice) generate din prob, compoziia chimic a probei analizate att calitativ ct i cantitativ, putndu-se realiza chiar hri cu distribuia fiecrui element chimic n zona luat n studiu.

364

X. MICROSCOPUL DE FOR ATOMIC Microscopia de for atomic

Conf. dr. Ioan Burda Cuprins
1. Microscopia de Scanare a Probei ......................................................................................... 365 2. Microscopia de For Atomic ............................................................................................ 369 3. Spectroscopia de For Atomic .......................................................................................... 371 4. Aplicaii ale Microscopiei de For Atomic ....................................................................... 371 5. Nanolitografie cu Microscopul de For Atomic ............................................................... 373 6. Nanomanipularea cu ajutorul Microscopului de For Atomic ........................................ 374 7. Avantajele i Limitele Microscopiei de For Atomic ........................................................ 375 8. Bibliografie .......................................................................................................................... 376 Quantum mechanics predicts an exponential dependence of tunneling current with a separate distance between the two electrodes. An observation of this dependence between a W-tip and Pt surface by G. Binnig, H. Rohrer, Ch. Gerber and E. Weibel in 1981 was marked as the invention of STM.

1. Microscopia de Scanare a Probei

Microscopia cu scanarea probei (Scanning Probe Microscopy - SPM) este o microscopie mecanic ce acoper cteva tehnici de vizualizare a suprafeei unui eantion (morfologia suprafeei) cu o rezoluie la nivelul moleculelor sau a grupurilor de atomi. n cazul celor mai performante echipamente SPM disponibile n prezent, se poate vizualiza dintr-un eantion maxim 150 X 150 um dac rugozitatea n zona scanat este 365

Figura 1. Imagine SEM x1000 pentru un cantiliver tip.

mai mic de 10 um. Tehnologia SPM are la baz un concept simplu: scanarea unei suprafee cu ajutorul unui vrf (tip) foarte ascuit (sharp, vrf cu raza de curbur de circa 3-50 nm, Figura 1). Acest tip este ataat de o grind (cantilever) flexibil, astfel nct s poat fi urmrit profilul suprafeei scanate. n funcie de mecanismul de interaciune dintre prob (vrf, tip) i eantionul scanat, se definesc tehnicile SPM. n prezent, cele mai multe sisteme SPM utilizeaz un fascicol laser pentru a determina deflexia cantilever-ului. Acest fascicul laser se reflect de partea opus tip-ului (fabricat din Si sau Si3N4) pe un fotodetector sensibil la poziie (Figura 2). Cu ajutorul unui astfel de sistem de detecie este posibil msurarea indirect a forei dintre tip i suprafaa eantionului studiat. Pentru a calcula fora de interacie utilizm legea lui Hook (F = kz), unde k este constanta de elasticitate a cantilever-ului, iar z este distana pe care cantilever-ul a suferit o Figura 2. Detecia deflexiei cu ajutorul deflexie. Cunoaterea acestor fore este unui fascicul laser i a unui fotodetector. important pentru interpretarea imaginilor SPM sau pentru a determina proprieti mecanice locale ale eantionului. Un alt element de baz al unui SPM este scanner-ul piezoelectric. De performanele mecan- electrice ale scanner-ului piezoelectric depind n ceea mai mare msura performanele ntregului SPM. Mai mult, se poate spune c este singurul element puternic limitativ n evoluia viitoare a microscopiei mecanice. Scanner-ul SPM este realizat din material piezoelectric (PZT) care se expandeaz i contract proporional cu tensiunea aplicat, respectiv cu polaritatea acesteia. De regul, scanner-ul este construit sub forma unui tub (Figura 3) cu electrozi pentru deplasarea pe X, Y i Z iar cu ajutorul lui se poate poziiona proba (tip-ul) cu extrem precizie n 3D (3 Dimensiuni). Scanner-ele sunt caracterizate Figura 3. Scanner piezoelectric de forma prin sensibilitatea lor (raportul dintre tubulara. deplasarea pe o direcie i tensiunea aplicat pe acea direcie) adic, att ct se extinde sau contract un material piezoelectric per volt. Pentru valori mari ale tensiunii, deplasarea nu este 366

liniar cu tensiunea aplicat i aceast dependen difer de la scanner la scanner. Efectul final al acestei situaii este identificat prin rezultate diferite funcie de direcia de scanare. Desigur c acest efect poate fi limitat prin aplicarea unei tensiuni neliniare pentru scanare (identificat n procesul de calibrare a scanner-ului). Poate cel mai neplcut lucru legat de scanner este procesul exponenial de mbtrnire ce determin o scdere a sensibilitii n timp. Pentru a limita efectele date de procesul de mbtrnire, fabricantul utilizeaz cel putin 48 de ore scanner-ul nainte de a fi livrat pentru o aplicaie. Cu toate acestea, o recalibrare frecvent a scanner-ului se impune mai ales n primul an de utilizare. Cele mai comune tehnici SPM sunt: Scanning Tunneling Microscopy (STM) este tehnica SPM de baz care a generat ntreg domeniul acoperit azi de microscopia mecanic. Principiul STM-ului este dat de efectul de tunelare al electronilor ntre doi electrozi n prezena unui cmp electric. Pentru a putea msura efectul de tunelare distan dintre cei doi electrozi trebuie s fie de aproximativ 1 nm. Aceast situaie experimental este posibil n cazul unor suprafee conductoare curate (practic fr rugozitate) precum i n lipsa vibraiilor ambientale. Atomic Force Microscopy (Microscopia de For Atomic) a aprut ca o extensie n utilizarea microscopiei mecanice (1986) pentru eantioanele nu foarte conductoare. Din aceast cauz, aceast tehnic a cunoscut o dezvoltare rapid (n comparaie cu STM), fiind extrem de util n multe domenii de cercetare. Practic, toate eantioanele de material de orice tip (inclusiv de natur biologic) pot fi investigate/msurate cu AFM. Pe lng morfologia suprafeei, AFM-ul a fost dezvoltat n ultimele decenii pentru a msura o mare varietate de proprieti pe suprafaa eantionului cum ar fi proprietile electrice, magnetice si mecanice. Aceast diversitate este bazat pe principiul de funcionare care implic existena unui tip (prob) n contact sau foarte apropiat de suprafaa eantionului, aa c, orice interaciune dintre tip i suprafaa eantionului este msurabil. Near-Field Scanning Optical Microscopy (NSOM) utilizeaz o surs de lumin de foarte mici dimensiuni ca mecanism de formare a imaginii. Prin utilizarea unei surse cvasi-punctiforme, cu un diametru mai mic dect lungimea de und, poate fi obinut o rezoluie dincolo de limita de difracie. Proba (un tip de fibr optic plus o apertur) trebuie s fie foarte aproape de suprafaa eantionului; 367

mai aproape dect lungimea de und. Aceast regiune limitat de proba i eantion este numit Near-Field de unde i numele acestei microscopii. Rezoluia imaginii este limitat de dimensiunea aperturii detectorului i nu de lungimea de und a luminii incidente. Tipic, n cazul unui NSOM avem o rezoluie lateral de circa 20 nm i o rezoluie vertical de 2-5 nm. La fel ca n orice microscopie optic, mecanismele de contrast pot fi uor adaptate pentru studierea diferitelor proprieti, cum ar fi indicele de refracie, structura chimic si stress-ul local. De regul, lumina laserului, prin intermediul unei fibre optice, parcurge o apertur realizat prin acoperirea ei cu metal (cum ar fi Al) i microfabricat la fel ca o prob AFM. Dimensiunea punctului de lumin determin rezoluia maxim ce poate fi obinut. n cazul NSOM, feedback-ul necesar n sistem, pentru a menine o distan de lucru dintre prob i suprafaa eantionului, se realizeaz prin dou metode. O prima metod este echivalent cu cea din cazul AFM, adic prin intermediul unui cantilever i a unui sistem de detecie al deflexiei cu fascicul laser. Un al doilea mod este un mod rezonant (tuning fork) i este monitorizat amplitudinea oscilaiei cnd tip-ul se mic deasupra suprafeei eantionului. Mutarea lateral a tip-ului este denumit shear-force feedback. n funcie de modul de obinere a imaginii, i n acest caz, avem mai multe moduri de operare: Transmisie: lumina care vine prin apertura probei este transmis prin eantion; sunt necesare eantioane transparente. Reflexie: lumina care vine prin apertura probei se reflect pe suprafaa eantionului. n acest caz, eantionul poate fi opac, dar intensitatea lumini este sczuta si dependent de forma probei. Colectare: eantionul este iluminat dintr-o surs extern cu arie mare de iluminare, iar proba colecteaz lumina reflectat. Iluminare/Colectare: Proba este responsabil att de iluminare, ct i de colectarea luminii reflectate. Detecia semnalului se realizeaz prin: spectrometru, APD (Avalanche Photo Diode), tub fotomultiplicator sau CCD (Charge Coupled Devices). Pentru a vizualiza imaginile, sunt utilizate cteva mecanisme de contrast: polarizare, topografie, birefringenta, indice de refracie, fluorescen, dependena de lungimea de und i reflectivitate. 368

2. Microscopia de For Atomic

Microscopia de For Atomic (AFM, 1986) a fost dezvoltat ca o soluie tehnic pentru STM, de a msura prin microscopie mecanic eantioanele neconductoare. Marele avantaj al AFM-ului este capacitatea acestuia de a investiga practic orice tip de suprafa inclusiv polimeri, ceramici, materiale compozite, sticle i materiale biologice. Versatilitatea AFM-ului a dus n timp la o diversitate de moduri de operare i adaptri, modificri la situaii specifice: msurtori in lichide, n medii chimice corozive sau medii biologice termostatate. Potenialul Lennard-Jones (Figura 4) este un model aproximativ pentru cazul izotropic (repulsie i Figura 4. Potentialul Lennard-Jones versus modurile de operare AFM. atracie) al forei Van der Waals ca o funcie de distan. Relativ la natura forelor implicate i interaciunea dintre tip i suprafaa eantionului definim cele mai importante moduri AFM de operare (clasice): Contact Mode (modul contact), tip-ul este meninut (de obicei) la o for constant puternic de respingere, iar cantilever-ul este mutat n sus sau n jos pe timpul scanrii. Se poate, de asemenea, pentru suprafee ale eantionului cu rugozitate sczuta s se opereze n modul distan constant. Acesta a fost de altfel primul mod de operare AFM implementat ca o adaptare la STM. Capabilitatea de a urmrii suprafaa eantionului n acest mod este limitat doar de circuitul de feedback. Tip-ul este n contact puternic cu suprafaa eantionului i n modul distan constant este posibil rezoluia atomic, dac eantionul este special preparat. Microscopia de For Lateral (Lateral Force Microscopy - LFM) msoar forele de frecare dintre tip i suprafaa eantionului. Aceste fore sunt msurate indirect prin deflecia lateral (twist) a cantilever-ului. n acest scop, cantilever-ul este optimizat pentru sensibilitate mare la forele de frecare lateral; tocmai de aceea, cantilever-ul este foarte subire. LFM este util n vizualizarea forelor de frecare pe suprafaa eantionului, care sunt determinate de neomogenitile materialului, precum i pentru a pune n eviden muchiile de pe suprafaa eantionului. Modul de operare LFM este 369

un mod derivat din modul de operare Contact Mode; tipul este n contact constant cu suprafaa eantionului. NonContact Mode este un concept ce descrie familia modurilor AC (moduri de curent alternativ). n acest caz, cantilever-ul este oscilat in regim de atracie, ceea ce nseamn c tip-ul este apropiat de suprafaa eantionului, dar nu este n contact cu aceasta. Desigur c forele de interaciune dintre tip i suprafaa eantionului sunt foarte mici, n acest caz, de ordinul pN. Detecia se bazeaz pe msurarea diferenelor de cuplaj cu suprafaa eantionului care determin schimbarea frecvenei de rezonan a cantilever-ului i/sau a amplitudinii de oscilaie. Contact Intermitent (Dynamic Force, Tapping Mode) este denumirea clasic, iar mai recent este denumit DFM (Dynamic Force Mode). i n acest mod, cantilever-ul este oscilat n apropierea suprafeei eantionului, dar pri ale oscilaiei sunt extinse n regimul de respingere, n aa fel nct, tip-ul intr intermitent n contact cu suprafaa eantionului. Avantajul acestui mod de operare este legat de rezoluia lateral mai ridicat fr apariia unor fore de dragare. Force Modulation este un mod AFM de operare ce se refer la utilizarea proprietilor materialului probei pentru a controla interaciunea cu suprafaa eantionului. Tip-ul este oscilat i pus n regim de respingere, iar slop-ul, fora-distan este msurat determinnd astfel elasticitatea eantionului. Aceste date pot fi culese simultan cu topografia suprafeei eantionului. Prin acest mod de operare AFM se pot determina i compara simultan morfologia i proprietile locale. Phase Imaging este un mod n care sunt culese informaii despre shift-ul de faz a cantilever-ului aflat n oscilaie n raport cu semnalul de excitaie. Acest shift de faz se coreleaz cu proprieti specifice suprafeei eantionului (frecare, adeziune, vscoelastice). Acest mod de operare este un mod msurat simultan cu modurile AC enumerate mai sus.

Modurile de operare din Microscopia de For Atomic sunt rezumate n Tabelul 1 cu referire la fora de interaciune pentru fiecare mod. Tabelul 1 este departe de a fi complet (doar modurile eseniale) i mai mult, n fiecare an se aduga noi moduri de operare sau noi versiuni ale acestora.

370

Tabelul 1. Mod de Operare contact mode non-contact mode intermittent contact mode lateral force mode magnetic force thermal scanning Fora de Interacie puternic de respingere fora constant sau distana constant slab de atracie - vibrarea probei puternic de respingere - vibrarea probei forele de frecare exercit o torsiune a cantileverului folosit n scanare cmpul magnetic de la suprafaa eantionului poate fi vizualizat distribuia conductivitii termice pe suprafaa eantionului este vizualizat.

3. Spectroscopia de For Atomic

O alt aplicaie major AFM este Spectroscopia de For Atomic (FS, Force Spectroscopy) i se refer la msurarea direct a interaciunii dintre tip i suprafaa eantionului n funcie de distana de separare. n aceast metod, tip-ul este mpins n fa i apoi retras de la suprafaa eantionului, iar deflexia cantilever-ului este monitorizat n funcie de deplasarea scanner-ului. Aceast metod este util n msurarea contactului la dimensiune nano (legturi atomice, fore Van der Waals, fore Casimir) cum ar fi fora de rupere a moleculelor de suprafaa eantionului. Limita de msurare este n domeniul pN, iar distana pe axa Z este mai bun de 0.1 nm. Spectroscopia de For Atomic poate fi implementat ca i deflexie static sau mai recent n mod dinamic, situaie n care cantilever-ul este vibrat (metoda AC). O alt metod modern de investigare mediat de AFM este nanoidentarea (nanoidentation). Aceasta tehnic inovativ este combinat cu probe specializate i este corelat cu intensitatea spectral (Raman) n timp real pentru a vizualiza legturile chimice. AFM-ul poate aplica un stres mecanic controlat pe suprafaa eantionului (raza de curbur a tip-ului este de civa nm aa c P = F/A determin presiuni ridicate, megapascali) care produce un shift n semnalul Raman corelat cu stresul aplicat.

4. Aplicaii ale Microscopiei de For Atomic

Datorit faptului c AFM-ul poate investiga practic orice tip de material fr o preparare special a eantionului, aceast tehnic experimental a devenit n timp cea mai utilizat tehnic n studierea macromoleculelor sau 371

eantioanelor biologice (proteine, ADN, cromozomi, bacterii). De asemenea, este frecvent utilizat n studierea suprafeelor n industria electronic (Silicon wafers, medii de stocare a datelor, circuite integrate), precum i n studierea unor nanostructuri (suprafaa polimerilor, reele de difracie, ceramici, rini naturale). Modul de lucru AFM trebuie ales n funcie de caracteristicile ce prezint interes n investigare, precum i de natura suprafeei eantionului. Modul contact este o bun alegere pentru suprafeele dure, de exemplu, dar nu este o alegere potrivit pentru suprafeele moi, deoarece poate produce o contaminare a tip-ului sau poate ndeprta material de pe suprafaa eantionului. Dac alegem un contact apropiat atunci AFM-ul va deveni foarte sensibil la zgomote (vibraii) externe, dar va deforma mai puin sau deloc eantioanele moi. Murdria i efectele de capilaritate induse de apa de pe suprafaa eantionului vor avea un rol dominat si, n final, vor degrada calitatea imaginii obinute. Modurile AC (cu vibrarea probei) sau intermitente au fost imaginate pentru a investiga suprafaa unor eantioane biologice. Performanele unui AFM sunt limitate de un numr de factori dintre care amintim: capacitatea elementelor mecanice de a muta tip-ul cu precizie i de a msura poziia acestuia, calitatea tip-ului, liniaritatea scanner-ului i vibraiile ambientale. Marii productori de echipamente de microscopie mecanicp au reuit n ultimul timp s elimine o mare parte din limitrile anterioare prin mbuntirea componentelor mecanice i electronice. Calibrarea automat tridimensional a uurat mult munca operatorului, nct multe din articolele tiinifice de ieri au devenit azi automatizare. Reinem din aceste timpuri istorice cteva distorsiuni induse de forma tip-ului care merit nelese. La rezoluii ridicate, imaginea obinut este practic convoluia dintre forma tip-ului i morfologia local. n aceste situaii, este important cunoaterea formei tip-ului (geometria acestuia) pentru o interpretare corect a imaginilor obinute. Distorsiuni ale imaginii induse de prob. Pentru a vizualiza atomi sau molecule este necesar ca interaciunea s fie numai ntre tip i atomul/molecula cea mai apropiat (acest lucru se poate realiza pentru rezoluia atomic numai n tehnologia STM). Acest lucru nu este posibil n cazul AFM i este limitat att fizic (Van der Waals), ct i tehnologic prin limita de ascuire a tip-ului. Aa c, n general, ceea ce vedem ntr-o imagine AFM este mai degrab o imagine mediat a morfologiei suprafeei eantionului. Restaurarea Imaginii (Deconvoluia Probei). Vizualizarea cu AFM a suprafeelor pentru eantioane cu relief nalt implic utilizarea unui 372

tip foarte ascuit. n caz contrar, ceea ce vedem poate fi imaginea tip-ului reflectat de suprafa. n aceste situaii, trebuie s apelam la metode matematice pentru a restaura imaginea (deconvoluie). Metoda efectiv de deconvoluie depinde de caracteristicile suprafeei eantionului i de geometria tip-ului (un subiect frecvent prezent n literatura tiinific).

5. Nanolitografie cu Microscopul de For Atomic

Nanolitografia se refer la fabricarea de structuri nanometrice mai mici de 100 nm. n prezent, aceast tehnic de utilizare a unui AFM este utilizat (nu foarte frecvent) n realizarea de circuite integrate (nanocircuite) sau de sisteme nanoelectromecanice (NEMS). Nanolitografia nu se rezum la utilizarea AFM, aa c, o descriere sumar a principalelor tehnici este util: Scanning Probe Lithography (SPL) este o unealt/tehnologie promitoare pentru realizarea de pattering la scal nano. De exemplu, atomi individuali pot fi manipulai prin utilizarea tip-ului unui STM. Dip-Pen Nanolithography (DPN) a fost prima metod SPL disponibil comercial pentru AFM. Atomic Force Microscopic Nanolithography (AFMN) este o metod de pattering pe o suprafa chimic-mecanic pentru AFM. Patter-ul poate fi creat manual sau automat. Trebuie menionat c pe lng nanolitografia de scanare a mai fost dezvoltat n ultimul timp i litografia vectorial. n figura 5, se pot vedea cteva exemple clasice de nanolitografie.

Figura 5. Nanolitografie vectorial de la procedeu (a) la rezultat (b), litografie AFM (5 um).

373

6. Nanomanipularea cu ajutorul Microscopului de For Atomic

Diverse structuri nanometrice, cum ar fi nanotuburi i nanofire care sunt pe suprafaa unui eantion, pot fi manipulate pentru a realiza circuite electrice sau pentru a msura proprietile lor mecanice, implicate n manipularea lor. Trebuie menionat c AFM-ul poate fi utilizat ca un robot 3D (manipulator 3D) care are spaiul de lucru la scal nano. Dup cum am menionat, pattern-ul poate fi realizat manual sau automat, sau mai recent, prin utilizarea unei interfee haptic i a unei aplicaii de realitate mbuntit. Prin utilizarea AFM-ului ca sistem nanorobotic, nanomanipularea poate deveni o operaie relativ uor de realizat. Un exemplu de nanomanipulare a unor particule de aur (nano cuburi) cu diametrul de 100 nm pe o suprafa de sticl se poate vedea n figura 6.

Figura 6. Nanomanipularea unor nano cuburi de aur pe o suprafa de sticl.

Un alt exemplu de nanomaipulare este prezentat n figura 7 a unor particule de latex cu diametrul de 100 nm ntr-o structur complicat.

Figura 7. Nanomanipularea unor particule de latex cu diametrul de 100 nm.

374

AFM-ul ca nano robot este extrem de util n nanomaipularea unor celule sau molecule, n special nanomanipularea moleculelor ADN. Aceste molecule cunoscute de mai mult de o jumtate de secol au atras atenia, n ultimul timp, pentru aplicaii n nanotehnologie, cum ar fi realizarea unor circuite electronice (motivat de studierea proprietilor electrice). Molecula de AND are un diametru de circa 2.4 nm i este n esen o structur scurt (3.6 nm) care se repet. Dup aproximativ 15 ani de controverse relativ la mecanismul de conducie (transfer de sarcin) este acum bine demonstrat dependena de distan (tunelarea ntr-un singur pas sau hopping termic mai muli pai). Ambele mecanisme (tunelarea sarcinii, hopping termal) au fost studiate i verificate indirect experimental. n acelai timp, n literatura de specialitate ADN-ul rmne pentru moment un subiect neelucidat, unele rezultate sugereaz c avem un bun conductor (chiar supraconductor la temperaturi joase), alte rezultate l prezint ca fiind un semiconductor, iar altele ca un izolator. Elucidarea acestor situaii nu se poate face dect prin experiene de nanomanipulare a ADN-ului; un exemplu este prezentat n figura 8.

Figura 8. Nanomanipularea ADN-ului pe o plac de polycarbonat (aria de scanare este de 5 um).

7. Avantajele i Limitele Microscopiei de For Atomic

La fel ca orice alt echipament, Microscopul de For Atomic are n aceeai msur avantaje i limite. Cunoaterea acestor limite, respectiv a avantajelor, este important n luarea unei decizii corecte nainte de a apela la acest echipament pentru investigarea unui eantion. Microscopia concurenta SPM (AFM) este SEM (Scanning Electron Microscopy) dar spre deosebire de SEM unde avem o proiecie 2D sau mai exact o imagine 2D pentru eantion, n cazul AFM avem un profil 3D. Mai mult, eantionul nu necesit un tratament special (acoperirea cu metal sau carbon) care poate compro375

mite, n unele situaii, eantionul. Un alt avantaj este posibilitatea de a investiga eantionul n condiii ambientale, lucru foarte important pentru eantioanele biologice, asigurnd n principiu o rezoluie mai bun dect SEM, comparabil cu rezoluia unui TEM (Transmission Electron Microscopy). Marele dezavantaj al AFM fa de SEM se refer la aria scanat, care n cazul SEM este de ordinul milimetrilor, cu posibilitatea de scanare simultan a unor arii diferite, toate acestea la o vitez mult mai mare. Datorit faptului c timpul de scanare n cazul AFM-ului este mare, drift-ul termic poate induce distorsiuni pe imagine, fcnd lipsit de precizie msurarea unor structuri. Aceste limitri sunt un subiect fierbinte n cercetarea instrumental din acest domeniu i cteva succese au fost obinute prin utilizarea n paralel a mai multor cantilevere sau, mai recent, AFM cu rata de scanare video. Imaginile obinute cu AFM pot fi, de asemenea, distorsionate de efectul de hysteresis al materialului piezoelectric, precum i de efectele de mixare ntre axele X,Y,Z care necesit refacerea n software a imaginii. Din pcate, aceast post-filtrare poate elimina unele caracteristici ale eantionului. Aceste limitri au fost eliminate n cazul microscoapelor AFM moderne prin scannere n bucla nchis sau scanner-e ortogonale. La fel ca i n orice alt tehnic bazat pe realizarea de imagini este posibil apariia de artefacte care pot fi induse de tip-ul instabil sau mediul ambiental impropriu sau chiar de eantionul studiat. Este, de asemenea, bine cunoscut limitarea puternic indus de existent pe eantion a unor perei drepi sau anuri foarte adnci i nguste a cror morfologie nu poate fi pus n eviden dect prin utilizarea unor tip-uri speciale i extrem de scumpe.

8. Bibliografie
1. 2. Giessibl, Franz J. (2003). "Advances n atomic force microscopy". Reviews of Modern Physics 75: 949. Roiter, Y; Minko, S (Nov 2005). "AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: n situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains". Journal of the American Chemical Society 127 (45): 156889 Zhong, Q (1993). "Fractured polymer/silica fiber surface studied by tapping mode atomic force microscopy". Surface Science Letters 290: L688. M. Hoffmann, Ahmet Oral, Ralph A. G, Peter (2001). "Direct measurement of interatomic force gradients using an ultra-low-amplitude atomic force microscope". Proceedings of the Royal Society a Mathematical Physical and Engineering Sciences 457: 1161.

3. 4.

376

5.

R. V. Lapshin (1998). "Automatic lateral calibration of tunneling microscope scanners", Review of Scientific Instruments (USA: AIP) 69 (9): 32683276. 6. J C Wolfe and B P Craver, "Neutral particle lithography: a simple solution to charge-related artefacts n ion beam proximity printing", J. Phys. D: Appl. Phys. 41 (2008) 024007 (12pp) 7. R. C. Davis et al. (2003). "Chemomechanical surface patterning and functionalization of silicon surfaces using an atomic force microscope". Appl. Phys. Lett. 82 (5): 808810. 8. G.Y. Li, N. Xi, M. Yu, W. K. Fung, 3-D nanomanipulation using atomic force microscopy, Proceeding of the 2003 IEEE International Conference on Robotics and Automation, May, 2003, Taiwan. 9. V.M. Ayres, N. Xi, F. Salam, K.Gilgenbach, H.Saglik and D. Wang, SPM-Based Investigation of Site Specific Biological Interactions, Proceedings of the 2001 1st IEEE Conference on Nanotechnology 10. V. M. Ayres, H. Hummert, B. Goolsby, F. Salam, Ning Xi Micro/Nano Motion Control for Biological Specimen Handling, Proceedings of International Symposium on Smart Structures and Microsystems, Hong Kong, October, 2000.

377

Microscopia de for atomic partea a II-a

Conf. dr. Ioan Burda Cuprins
1. Tehnici Experimentale - Scanning Probe Microscopy ........................................................378 2. Bibliografie ..........................................................................................................................385 3. Implementarea Noilor Tehnologii........................................................................................386 4. Bibliografie ..........................................................................................................................393

1. Tehnici Experimentale - Scanning Probe Microscopy

Introducere. O evaluare obiectiv a tehnicilor microscopice (Tabelul 1) pune n eviden elemente de performan favorabile pentru SPM (Scanning Probe Microscopy). Dintre acestea, n primul rnd merit remarcat informaia 3D real a topologiei suprafeei dublat de msurarea unor mrimi fizice pe suprafa, de regul, n microscopia modern prelevate odat cu informaia topografic. Tabel 1.
Optical microscope Scanning electron microscope Electron scattering Transmission electron microscope Electron absorption Atomic force microscope Forces of probe-sample interaction 1-200 m 0.5-20 m

Mechanism of contrast formation Range in XY Range in Z

Light absorption (diffraction, polarization, scattering etc) or fluorescence 200nm 1mm 500nm 10 mm

1nm-10 mm

1-100m

What is studied Complicated sample preparation

optical slice optional

10 nm-1 mm limited by ultratome (10 nm-1 m) surface real thin slice necessary necessary

surface optional

378

Dac ne referim la modul de preparare a probelor pentru SPM, atunci cuvntul optional nu sugereaz ntotdeauna ceva facil. La o extrem, orice material (de exemplu, un fir de pr) este suficient de potrivit dac nu are o rugozitate comparabil cu capacitatea de deplasare a scanner-ului pe direcia Z (perpendicular pe eantion). Obinerea unor imagini unice n coninut si performan, nu de puine ori, ne oblig s apelm la o preparare complex a eantioanelor; respectiv apelarea la instrumente SPM complexe (izolare la vibraii avansat, temperatur sczut, atmosfer controlat, ). n condiii experimentale adecvate, SPM-urile moderne pot pune n eviden un singur atom, dar n cazul unor eantioane biologice (molecule), acest lucru nu este posibil datorit lipsei de rigiditate a acestora. Aa c, nu ne putem atepta s vedem diferite domenii n moleculele de protein, mari schimbri de conformaie (myosin) sau forme spiralate ale moleculelor DNA. Tehnica experimental la nivel de detecie a interaciunii dintre un tip (sond) i eantion se bazeaz pe un cantilever. Merit s reinem c detectorul este mecanic i de asemenea, s reinem c acest detector mecanic este capabil s pun n eviden atomii. Consecina acestei situaii se reflect n performana final a experimentelor n care apelm la un SPM i putem spune c n mare msur performana este dependent de iscusina experimentatorului. Sistemul optic nu are alt rol dect de a msura deflexia cantileverului, respectiv amplitudinea de oscilaie sau faz. Mrimea specific de interes ntr-o situaie particular este detectat (Figura 1.1) de un sistem opto-electronic bazat pe reflexia unui fascicul laser pe cantilever. Fasciculul este poziionat n centrul unui foto-detector cu patru cadrane (fotodiod). Viteza de scanare depinde de caracteristicile mecanice ale scanner-ului i tot de calitile mecanice ale acestuia depinde i aria maxim ce poate fi scanat. Rezoluia sistemului este asigurat de sistemul de control (electronic, Digital Anolog Converter DAC) cantilever i sond (tip). Performana sistemului de control i achiziie este esenial n performana final a SPM-ului, dar nu poate elimina limitrile mecanice Figura 1.1. Scaning Probe Microscope, subsistem pentru (din construcie), nici limitdetectia inneractiuni sonda (tip) si esantion. 379

rile induse de proprietile materialelor folosite la construcia SPM-ului, acestea fiind parte din limitele fizice ale unui SPM. Informaiile care se pot obine pe diferite sisteme de studiu cu ajutorul unui SPM, n general, nu pot fi considerate complementare cu alte tehnici experimentale, dup cum rezult din Tabelul 1. Specific i unic n cazul SPM este capacitatea acestuia de a pune n eviden topoFigura 1.2. Latice HPOG (stanga) grafia molecular, interaciunile respective latice MoTe2. moleculare, imaginea celulelor, reconstrucia 3D i nanomanipularea. SPM poate include n platforma sa tehnici optice n special n cazul AFM, cum ar fi: AFM plus microscopie laser confocal, imagini SNOM, sau imagine i spectroscopie Raman. Tehnologia experimental actual se bazeaz masiv pe conceptul de imagine, respectiv imagine 3D. Aceast situaie este produsul unei lungi evoluii a tehnologiilor de laborator i asigur maximul de informaie posibil n acest moment. Tocmai de aceea, performana unei tehnici experimentale sau a unui echipament modern este complet definit de imaginea obinut pentru un eantion dat; o imagine mai bun este echivalent cu mai mult informaie, cu o mai
Figura 1.3. DNA (sus), Proteine (Seleno Protein, Treponema Pallidum (Tp) antigens), Virus Ebola, Bacterii (Anabaena Variabils, Helicobacter Pilory).

380

bun calitate, cu un mai bun raport semnal zgomot, cu o mai bun liniaritate n sistemul de msur, adic toate mrimile fizice istorice se regsesc n final n calitatea imaginii. n acest sens, sunt prezentate n continuare, prin imagini, exemple cu ceea ce poate vedea un SPM (Figura 1.3). SPM-ul a fost primul echipament (STM) care a pus n eviden atomii i acest lucru este posibil fr echipamente complexe pe eantioane cu rugozitate sczut (monostrat atomic). n Figura 1.2 se poate vedea la rezoluie atomic o latice de MoTe2, respectiv HOPG. De mare interes sunt imaginile ce pot fi obinute pe eantioane biologice, dat fiind interesul crescut pentru biologie i biotehnologii. n acest sens, SPM are un rol bine definit prin capacitatea sa unic de a putea asigura o rezoluie ridicat pentru eantioane superficial pregtite (Figura 1.3). De asemenea, capacitatea de nanomanipulare simultan a acestor eantioane asigur premisele unui nano laborator ntr-un singur echipament. Lrgirea platformei cu elemente specifice microscopiei optice, SNOM i spectroscopiei Raman ntregete aceast tehnic modern. Interaciunea dintre sond (tip) i eantion, baza funcionrii SPM-ului, este exploatat i n spectroscopia local de distan. ntr-o msurtoare local, este uor de pus n eviden curba for distan atunci cnd o legtur specific apare. Dup cum se poate vedea n Figura 1.4, dou situaii distincte pot fi observate n interaciunea dintre sond (tip) i eantionul studiat: a) nu exist o adeziune la suprafaa eantionului; b) ntre sond i suprafaa Figura 1.4. Nu exista adesiune (jos), adesiune intre sonda si suprafta esantionului. eantionului, ntr-o poziie dat (x,y), este pus n eviden o adeziune. 381

Bazat pe observaia anterioar, se poate imagina un sistem de recunoatere molecular, plecnd de la tria adeziunii pentru o situaie dat; sonda funcionalizat (molecula ligant) interacioneaz cu un eantion biologic special preparat. n Figura 1.5 este reprezentat schematic un astfel de experiment care printr-o tehnic specific permite discriminarea unor receptori pe suprafaa unei celule. n general, fiecare experiment n care este implicat SPM ul, din Figura 1.5. Discriminarea unor receptori pe suprafaa unei perspectiva utilizrii acescelule. tuia, are multe elemente particulare care, n final, depind n mod esenial de experiena utilizatorului. Cu toate acestea, avem cteva reguli generale, cum ar fi: a) celula este un sistem prea labil pentru a putea observa o singur protein pe suprafaa ei; b) acest lucru este dificil i n cazul unei topologii moleculare. Tehnica sond-ligant i analiza unei situaii particulare prin intermediul curbelor locale for distan sunt de mare folos n diferite experimente de recunoatere a proteinelor. Progresele recente privind rezoluia spaial a tehnologiei AFM au fcut din obinerea unor imagini topografice a unei singure proteine o operaiune de rutin. Sunt nc dificil de recunoscut proteine specifice, cum sunt receptorii, numai pe baza acestor informaii topografice. Deoarece interaciunea dintre liganzi i receptori este foarte specific, tehnica funcionalizrii cu anumite biomolecule (proteine, proteoglicani, glicani, acizi nucleici) a unui vrf AFM a deschis o cale promitoare pentru recunoaterea unor molecule particulare. S-a dovedit c receptori independeni pot fi recunoscui de un vrf AFM funcionalizat cu anticorpi, printr-o tehnic de cartare a forei. Toate aceste rezultate au fost obinute prin observarea unor probe corespunztor preparate pe suprafee substrat i nu n condiii fiziologice. Platforma Integrat pentru Nanotehnologii combin toate tehnologiile cunoscute n Scanning Probe Microscopy (SPM) ntr-un singur produs, genernd astfel un nou i performant echipament n acest domeniu. Sistemul NTegra produs de NT-MDT Inc. este cel mai recent echipament i singurul 382

pe plan mondial care poate fi ncadrat n conceptul de NanoLaborator. Acest concept este sugerat i prin numele echipamentului format din grupul de litere cheie NT care sunt prescurtarea de la NanoTechnology i un al doilea grup de litere cheie care sunt prescurtarea de la intEGRA, care nseamn perfect. Sistemul NTegra (Figura 1.6) a fost special proiectat pentru a permite nglobarea unor tehnici de analiz tiinific (spectroscopie si/sau prepararea probelor) pe lng cele specifice SPM. Toate sistemele integrate n platforma NTegra utilizeaz acelai suport electronic i acelai program. Rezultatul acestui concept permite reconfigurarea sistemului pentru orice aplicaie particular (Figura 1.7), doar prin program (mouse - click). Sistemul NTegra se prezint utilizatorului ca fiind o soluie complet pentru cercetare, industrie i nanotehnologie. Programul de aplicaie nglobeaz lunga experien NT-MDT Inc. n producerea de echipamente i programe pentru nanotehnologii, mbiFigura 1.6. Sitemul nnd simplitatea utilizrii cu facilitile oferite, Ntegra- Vita. astfel nct, chiar dac sistemul este foarte complex, acesta este uor de neles i utilizat. Programul NOVA (NT-MDT) controleaz ntreaga platform, de la achiziia de imagine la arhivarea acesteia, inclusiv procesarea de imagine 3D, msurarea caracteristicilor probei i generarea automat de rapoarte. Aproape toate setrile sistemului sunt controlate de programul NOVA. n acest moment, Laboratorul de Nanotehnologii Fizice are n dotare un sistem NTegra Vita care integreaz dou microscoape optice performante, un sistem SPM i un controler de temperatur pentru msurarea probelor biologice n aer sau lichid (inclusiv n mediul de cultur, cu posibilitatea schimbrii acestuia pe durata msurtorilor). Nu n ultimul rnd, trebuie menionate metodele avansate de litografie disponibiFigura 1.7. Subsitem scanner integrat le (scratching, current); pentru litografie,
in microscopul optic.

383

programul NOVA are aplicaii, faciliti de generare automat de imagini sau mai mult, pot fi preluate imagini gray level i transpuse pe suprafaa de investigat. n proiectele noastre, utilizm intensiv facilitatea open software a programului NOVA care permite, prin Vbscript, realizarea unor extensii sau automatizarea unor secvene de genul msurare, procesare imagine i generare de rapoarte. n acest fel, programul poate fi extins pentru orice aplicaie utilizator fr a fi nevoie de cunotine de programare avansat. Metodele de baz SPM, ct i unele performane ale sistemului NTegra Vita sunt enumerate in Tabelul 2.
Tabel 2 SPM methods in air and liquid AFM(contact, semi-contact, non-contact); LFM (Lateral Force Microscopy); AFI(Adhesion Force Imaging); Force Modulation; Phase Imaging; AFM Lithography (scratching); Forces-Distance Curves STM/MFM (Magnetic Force Microscopy); Electrostatic Force Microscopy; Scanning Capacitance Microscopy; Kelvin Probe Microscopy; Spreading Resistance Imaging; Lithography: AFM (current), STM by sample 40 mm, 15 mm in height and 100mm , 15 mm in height by probe by sample up to 14x14x2.5 mm and by probe up to 15x15x3 mm 100x100x10 m up to 200x200x20 m in DualScan mode from RT to 60 C +/- 0.005 C (typically), <= +/- 0.01 C

in air only

Sample size

in air in liquid

Scan Range Temperature control (for operation in fluid environment ) Range Stability

O pagin help bine documentat cu descrierea funciilor de baz i cteva exemple de utilizare asigur accesul utilizatorului la semnale de baz din sistem. Ntegra Vita are facilitai de excepie pentru investigarea de probe biologice cum ar fi: incinte nchise/deschise stabile chimic care pot opera cu discuri Petri, controlul temperaturii pentru lichide, diverse tipuri de nclzitoare pentru lichid i msurarea probelor biologice cu schimbarea lichidului cu flux controlat pe parcursul experimentului, sau ntre experimente. 384

2. Bibliografie
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Drexler KE, Molecular nanomachines: physical principles and implementation strategies, Ann Rev Biophys Biomol Struct, 23, 377-405, 1994. Goodsell DS, Bionanotechnology: lessons from nature, Wiley-Liss, Inc., Hoboken, New Jersey, 2004. Rubio-Sierra FJ, Heckl WM, Stark RW, Nanomanipulation by atomic force microscopy, Adv Eng Mater, 7, 193-196, 2005. Ferreira A, Mavroidis C, Virtual reality and haptics for nanorobotics, IEEE Robot Autom Mag, 13, 78-92, 2006. Heckl WM, Molecular self-assembly and nanomanipulation - two key technologies in nanoscience and templating, Adv Eng Mater, 6, 843-847, 2004. Hench LL, Polak JM, Third-generation biomedical materials, Science, 295, 1014-1017, 2002. Polak JM, Bishop AE, Stem cells and tissue engineering: past, present, and future, Ann NY Acad Sci, 1068, 352366, 2006. Hu Q, Tan Z, Liu Y, Tao J, Cai Y, Zhang M, Pan H, Xu X, Tang R, Effect of crystallinity of calcium phosphate nanoparticles on adhesion, proliferation, and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, J Mater Chem, 17, 4690-4698, 2007. Winfree E, Liu F, Wenzler LA, Seeman NC, Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals, Nature, 394, 539-544, 1998. Dufrene YF, Hinterdorfer P, Recent progress in AFM molecular recognition studies, Pflugers Arch - Eur J Physiol, 456, 237-245, 2008. Dammer U, Popescu O, Wagner P, Anselmetti D, Guntherodt HJ, Misevic GN, Binding strength between cell adhesion proteoglycans measured by atomic force microscopy, Science, 267, 1173-1175, 1995. Hards A, Zhou C, Seitz M, Brauchle C, Zumbusch A, Simultaneous AFM manipulation and fluorescence imaging of single DNA strands, Chem Phys Chem, 6, 534-540, 2005. Revyakin A, Ebright RH, Strick TR, Single-molecule DNA nanomanipulation: Improved resolution through use of shorter DNA fragments, Nat Methods, 2, 127-138, 2005. Liu Z, Li Z, Wei G, Song Y, Wang L, Sun L, Manipulation, dissection, and lithography using modified tapping mode atomic force microscope, Microsc Res Tech, 69, 998-1004, 2006. Lu J, An H, Li H, Li X, Wang Y, Li M, Zhang Y, Hu J, Nanodissection, isolation, and PCR amplification of single DNA molecules, Surf Interface Anal, 38, 1010-1013, 2006. Li B, Zhang Y, Yan SH, Lu JH, Ye M, Li MQ, Hu J, Positioning scission of single DNA molecules with nonspecific endonuclease based on nanomanipulation, J Am Chem Soc, 129, 6668-6669, 2007. Hu J, Zhang Y, Li B, Gao HB, Hartmann U, Li MQ, Nanomanipulation of single DNA molecules and its applications, Surf Interface Anal, 36, 124-126, 2004. Crocker JC, Golden handshake, Nature, 451, 528-529, 2008. Kufer SK, Puchner EM, Gumpp H, Liedl T, Gaub HE, Single-molecule cut-and-paste surface assembly, Science, 319, 594-596, 2008. Nykypanchuk D, Maye MM, van der Lelie D, Gang O, DNA-guided crystallization of colloidal nanoparticles, Nature, 451, 549-552, 2008. Peng L, Stephens BJ, Bonin K, Cubicciotti R, Guthold M, A combined atomic force/fluorescence microscopy technique to select apatamers in a single cycle from a small pool of random oligonucleotides, Microsc Res Tech, 70, 372-381, 2007.

9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21.

385

3. Implementarea Noilor Tehnologii

Introducere. Nevoia unei interaciuni om-main naturale, intuitive i a unui feedback senzorial multi-modal a determinat proiectarea unor maini care asigur utilizatorului generarea unor comenzi prin micarea minilor. n acelai timp, utilizatorul primete informaii despre fore sau coliziuni ale minilor sale, pentru a crea acestuia o percepie natural. Aceste maini sunt denumite interfee haptice, unde prin haptic nelegem tiina pipitului. Deoarece cercetrile iniiale au fost promitoare, acestea au generat o adevrata competiie n ncercarea de a dezvolta o interfa haptic natural. O problem major legat de sistemul tactil uman const n faptul c nu este foarte bine cunoscut, spre deosebire de alte modaliti de interaciune: percepia vizual, vorbirea sau sistemul motor. Studiul abilitailor tactile umane este o ncercare recent i multe din sistemele disponibile astzi nu incorporeaz cunotine din domeniile psihofizicii, biomecanicii i elemente neurologice ale percepiei haptice. Dezvoltarea unor interfee i dispozitive haptice moderne necesit studii extensive pentru a nelege legtura dintre fenomenele perceptuale i msurtorile biologice, urmat de ncorporarea acestor cunotine n ingineria interfeelor haptice. Aceste dispozitive bazate pe interfaa haptica prezint o mare oportunitate n dezvoltarea unor aplicaii generic asistative care s permit manipularea nano-obiectelor precum i imersia total n realitatea virtual a utilizatorului. Motivare. Cnd noi suntem prezeni undeva, privim n jurul nostru, privim ctre lucruri din diverse unghiuri, simim lucruri interesante cu ajutorul minilor, privim comportamentul lucrurilor care se mic sau se schimb, putem lua lucrurile pentru a le rearanja i putem interaciona cu acestea pentru a vedea rspunsul lor. Interfaa ideal dintre om i SPM trebuie s prezinte utilizatorului suprafaa investigat ca o reprezentare 3D mrit pe care s o poat pipi i care s poat fi modificat cu ajutorul unor unelte controlate de mn. Sistemul de control va translata micarea uneltei n micarea sondei SPM-ului i va translata parametrii msurai ai suprafeei sub forma unei fore aplicate uneltei simultan cu informaii vizuale i/sau audio despre parametrii suprafeei. Cnd este utilizat un astfel de sistem, cercettorul percepe c poate interaciona direct cu suprafaa de investigat. Micarea natural a capului sau minilor poate fi utilizat pentru a investiga i modifica suprafaa care este afiata la scala cercettorului. Aceast metod va asigura cercettorului posibilitatea de a se concentra pe investigarea suprafeei i proprietarilor asociate i nu asupra programrii unei interfee. n viitorul apropiat, noi vom avea mult de nvat despre lumea la scal 386

nano, inclusiv despre modul cum proprietile mecanice, transportul de sarcin i dinamica acestor proprieti sunt afectate de structura la scal atomic a nano-obiectelor, precum i legat de interfaa cu obiectele la scal nano. Nanomanipularea d o semnificaie aparte acestor probleme, oferindu-ne posibilitatea de a investiga individual nano-obiecte cu facilitai de excepie obinute prin combinarea caracteristicilor unor proprieti fizice cu informaiile structurale. Interfaa utilizator avansat va juca un rol crucial prin modul transparent de a experimenta la scal nano, oferind cercettorului posibilitatea de a fi virtual n dimensiune nano. Sistemul de Nanomanipulare. Nanomanipulatorul este obinut prin integrarea unui microscop de scanare a probei mpreun cu controller-ul, un dispozitiv SPIDAR (Space Interface Devices for Artificial Reality, Figura 3.1) cu feedback de for mpreun cu controller-ul i o reea de calculatoare PC cu faciliti grafice avansate. Acest cluster local format din cel puin trei calculatoare comunic printr-o reea IP.

Figura 3.1. Interfaa SPIDAR.

Scopul unei interfee SPIDAR este de a asigura cercettorului imersia virtual n lumea la scal nano. Prin combinarea unui SPM cu o interfa de realitate virtual asigurm o afiare intuitiv a datelor produse de instrument, precum i un control natural al funciilor acestuia. Semnificaia interfeei de realitate virtual a SPM-ului este aceea de a simula prezena cercettorului pe suprafaa de investigat. Beneficiile unei asemenea tehnologii sunt: 387

a) mbuntirea percepiei structurilor 3D, b) explorarea efectiv a suprafeei de investigat, c) abilitatea de a observa procese dinamice aproape n timp real d) i posibilitatea de a modifica interactiv suprafaa. Microscopul de scanare a probei (SPM) este un instrument extrem de rafinat pentru explorarea i manipularea la scal nanometric. Multe experimente au fost realizate prin controlul preprogramat sau n bucl deschis a probei SPM-ului, urmat de un feedback al parametrilor pe durata modificrilor i utiliznd pseudo-culori sau imagini ale liniilor, pe msura ce se colecteaz datele. Pe lng datele despre topografia suprafeei, SPM-ul poate colecta multe alte date despre parametrii fizici specifici eantionului. Acestea includ msurtori de conductan i msurarea de curbe curent/distan (STM), fore laterale i de adeziune (AFM), transmisia laser a diverse lungimi de und i polarizri (NFOM near field optical microscopy), proprieti magnetice (MFM magnetic force microscopy), temperatur sau ali parametri fizici. Civa dintre aceti parametri sunt reprezentai natural pe canalele vizuale ca informaie de culoare sau nlime, dar aceast afiare nu permite cercettorului s vad corelarea dintre aceste informaii i topografia suprafeei. n acest caz, este util s afim aceti parametri ntr-un spaiu virtual, ntr-un mod nerealist, dar ntr-o manier util. Pentru vizualizarea tiinific, utilitatea unei tehnici este mult mai important dect realismul.

Figura 3.1. Interfaa SPIDAR.

388

Sistemul Multimodal. Au fost studiate i dezvoltate cteva moduri de vizualizare a unor seturi de date. A fost revzut problema relativ simpl a rendering-ului 3D pentru o suprafa, ca un exemplu a consideraiilor implicate. ntr-un caz simplu, setul de date pentru o abordare prin interfaa SPIDAR este de fapt topografia suprafeei (Figura 3.2). O afiare natural a unui set de date 3D este posibil prin iluminarea direcionat a suprafeei. Utiliznd procesarea de imagine 3D, este acum posibil s crem un rendering n timp real al suprafeei, pe msur ce datele sunt achiziionate de SPM. Se poate asigura interaciunea n timp real cu parametrii de vizualizare cum ar fi direcia iluminrii, unghiul de vizualizare i scalarea, prin interfaa haptic, a feedback-ului de for. O procesare de imagine 3D utilizeaz un mixaj de imagini ntr-un head-mounted display (HMD). Implementarea unei componente de vedere cu raze X la programul nanomanipulatorului SPM, tehnologie bine cunoscut n cteva aplicaii de avionic, introduce conceptul de realitate mbuntit. Acest concept genereaz noi aplicaii n nanomanipulare i asigur, pe timpul unor situaii complexe, efectiv o vedere cu raze X utilizatorului, prin combinarea unui rendering grafic computerizat cu elementele ascunse. n aceast etap tehnologic, acest concept este foarte elegant n simplitatea sa i foarte util pentru o unitate de nanomanipulare.

Figura 3.2. Interfaa SPIDAR in timpul unei operaii de nano-manipulare.

389

Vizualizarea 3D nu este ntotdeauna cea mai bun soluie pentru suprafee cu mici denivelri; de regul o vedere prin pseudo-culoare este superioar unei vizualizri 3D prin umbre. Acest lucru este adevrat din dou considerente: pseudo-colorarea dedic ntreg domeniul de intensitate adncimii i sunt, de asemenea, netezite micile fluctuaii cauzate de zgomotul coninut n imaginea suprafeei. Pentru caracteristicile care sunt semnificative numai prin diferena mare de nlime fa de suprafaa imaginii, imaginile pseudo-colorate au dedicat ntreg domeniul de intensiti pentru a evidenia aceste diferene. Folosirea umbrelor este echivalent cu desenarea suprafeei, utiliznd numai o lumin ambiental cu intensitatea funcie de nlime. Aceast tehnologie poate lucra bine pentru imagini lipsite de zgomot, dar imaginile din lumea real conin ntotdeauna zgomot. Pentru imaginile SPM, o suprafa plat are un mare coninut de zgomot i acesta este exprimat ca o fracie, din caracteristicile imaginii. Acest zgomot va determina o fluctuaie a iluminrii caracteristicilor cu aceeai magnitudine, uneori reuind, din pcate, s le fac neobservabile. De asemenea, micile caracteristici de pe suprafa coninute n alte mari variaii sunt mai bine puse n eviden prin utilizarea unei hri de culoare i iluminarea puternic a suprafeei 3D (acestea ar fi imperceptibile ntr-o reprezentare 2D). Abilitatea cercettorului de a recunoate structuri moleculare specifice n prezena zgomotului este mbuntit prin vedere stereoscopic, grafica 3D bazat pe umbre cu hri de culoare iluminate puternic. Asigurnd afiarea stereoscopic i nu cea monoscopic, pentru cercettor este mai uor s perceap adncimea obiectelor virtuale apropiate. Percepia spaial 3D a datelor SPM cu acuratee face posibil pentru cercettor utilizarea cunotinelor sale tiinifice la recunoaterea unor structuri i caracteristici de interes. Este neateptat s ne imaginm c putem acum oferi posibilitatea cercettorului nu numai de a vedea nano suprafee cu ajutorul SPM, dar s i acioneze asupra lor i s le ating. Conceptual, acest sistem este echivalent cu un sistem tele-robotic care opereaz ntre dou scale foarte diferite, spre deosebire de sistemele tele-robot utilizate n chirurgie. Noi utilizm o interfa haptic cu feedback de for care sesizeaz poziia 3D a o-ring-ului SPIDAR (cu capabiliti adiionale pentru a sesiza 3DOF grade de libertate) i aplic forele de la nivel nano adecvat scalate n mna utilizatorului. Poziia o-ring-ului n spaiu poate controla diferite caracteristici afiate, cum ar fi controlul unghiului de vizualizare a suprafeei. De asemenea, pe perioada modificrilor suprafeei, un feedback de for asigur un control intuitiv al probei i permite sesizarea contururilor de pe suprafa. Aceast abilitate 390

asigur controlul precis al suprafeei i deschide calea unor noi experimente. Feedback-ul de for este esenial n gsirea structurilor ce urmeaz a fi modificate, gsirea traseului pentru modificare i asigurarea unei atingeri fine care s permit nceperea unui ciclu experimental n secvena scanare-modificare-scanare. De asemenea, fedback-ul de for asigur utilizatorului posibilitatea de a localiza obiecte i caracteristici ale suprafeei, simind cnd proba SPM se apropie de punctul de la care sunt posibile modificrile. n final, sistemul de nanomanipulare nregistreaz toate datele, incluznd topografia suprafeei i canalele externe, cum ar fi conductana cu secvena de timp pe care o numim fiier stream. Acest fiier poate fi redat mai trziu pentru a revedea ntregul experiment, inclusiv corelarea cu proprietile msurate cu o up-datare a imaginilor structurii. Utilizatorului ii este extrem de util s revad experimentul pentru a vedea ce decizii a luat pe parcursul desfurrii acestuia (analiza post-expriment). Percepia Multimodal i Intermodal. O abilitate deosebit a oamenilor este aceea de a dezvolta capabiliti de coordonare intermodal i de procesare a modelelor. De exemplu, numai dac privim un obiect, noi putem face o predicie despre caracteristicile lui tactile cu o acuratee rezonabil. Un sistem automat cu abilitatea de a face o predicie despre cum simim obiectele de tipul celor reprezentate prin valori ale pixelilor are multiple aplicaii n generarea automat a datelor haptice. Un astfel de sistem poate fi de exemplu unul care construiete nano-blocuri i un dispozitiv care asist cercettorul i asigur generarea de date haptice despre nano-mediul apropiat. Abilitatea de a sesiza i percepe obiecte dincolo de zona accesibil (Figura 3.3) este extrem de important n activitile zilnice cum ar fi conducerea mainilor, navigaia i aa mai departe. Vederea asigur fiecruia abilitatea de a plnui i executa activiti spaiale (zon cunoscut ca fiind kinesfer). Mai mult, corelarea dintre vz , auz i senzaiile tactile determin redundanta n reprezentarea spaial care asigur fiecruia dintre noi utilizarea transferului intermodal i coordonarea mecanic pentru activitile spaiale. Studiile efectuate pe persoane nevztoare arat c au abilitai eficiente n cteva activiti spaiale, n special n discriminarea texturilor, n descrierea acestora, descrierea formelor, discriminarea formelor, recunoaterea obiectelor i descrierea acestora. Cu toate acestea, o limitare major a percepiei tactile este dat de dimensiunea kinesferei. n al doilea rnd, persoanele nevztoare construiesc modele intercorelate ntre canalul auditiv i cel haptic, iar cercetrile psihologice au artat c aceste modele nu sunt adaptate pentru percepia de stimuli la distan, aa cum avem n cazul vzului. 391

Figura 3.3. Interfata SPIDAR in timpul unei operatii de recunoastere haptica a unei structuri create anterior prin nano-manipulare.

Nevoia de noi experimente i dezvoltarea de algoritmi care pot mbunti percepia n lumea de scal nano prin stimulare n timp real vizual, audio i haptic este un domeniu fascinant de cercetare. Feedback-ul de for captureaz procese din SPM i acest lucru este denumit n literatura explorare haptic a nano-obiectelor. Explorarea haptic a nano-obiectelor se refer n esen la micarea minii, utilizat de cercettor pentru a percepe un nano-obiect. Gesturile utilizate de cercettor pentru a percepe caracteristicile unui nano-obiect au o structur logic i asigur nelegerea caracteristicilor unui nano-obiect. Captura vizual SPM poate fi ajutat prin stocarea profilului haptic sau de atingere al unui obiect sub forma miscrilor minii. Odat ce un obiect a fost capturat vizual, n faza de antrenament, utilizatorul urmeaz s categoriseasc perceptual forma, dimensiunea, greutatea, textura i materialul nano-obiectului haptic. Aceste modele computaionale sunt dezvoltate pe baza modelelor neuropsihologice i cognitiv psihologice ale analizei caracteristicilor vizual-haptice. Modelele computaionale sunt dezvoltate la nivelul tehnologic actual ca i prototipuri vizual-haptice. Aceste structuri de date care stocheaz att caracteristicile vizuale ct i pe cele haptice ale obiectului sunt baza dezvoltrii unor cartografieri automate dintre diferite caracteristici vizuale i haptice. Aceste prototipuri stocate ntr-o baz de obiecte haptice mpreun cu strategiile de explorare haptic 392

asigur baza de date pentru nano-spaiu, fiind suportul oferit de tehnologia actual pentru viitoare aplicaii n nano-robotic.

4. Bibliografie
1. 2. 3. Jeffrey W. Roberts, BIOCHEMISTRY: RNA Polymerase, a Scrunching Machine, Science 17 November 2006 314: 1097-1098. Guangyu Zhang, Xin Jiang, and Enge Wang, Tubular Graphite Cones, Science 18 April 2003 300: 472-474. Aurlien Bancaud, Natalia Conde e Silva, Maria Barbi, Gaudeline Wagner, Jean-Franois Allemand, Julien Mozziconacci, Christophe Lavelle, Vincent Croquette, Jean-Marc Victor, Ariel Prunell, Jean-Louis Viovy, Structural plasticity of single chromatin fibers revealed by torsional manipulation, Nature Structural & Molecular Biology 13, 444 - 450 (01 May 2006). Peter Karageorgiev, Dieter Neher, Burkhard Schulz, Burkhard Stiller, Ullrich Pietsch, Michael Giersig, Ludwig Brehmer, From anisotropic photo-fluidity towards nanomanipulation in the optical near-field, Nature Materials 4, 699 - 703 (01 Sep 2005). Andrey Revyakin, Richard H Ebright, Terence R Strick, Single-molecule DNA nanomanipulation: Improved resolution through use of shorter DNA fragments, Nature Methods 2, 127 - 138 (01 Feb 2005). Luthi, R., Meyer, E., Haefke, H., Howald, L., Gutmannsbauer, W., and Guntherodt, H. J., Sled-Type Motion on the Nanometer Scale: Determination of Dissipation and Cohesive Energies of C60, Science 266 (December 23), 1979 - 1981, 1994. Resch, R., Baur, C., Bugacov, A., Koel, B. E., Madhukar, A., Requicha, A. A. G., and Will, P., Building and manipulating three-dimensional and linked two- dimensional structures of nanoparticles using scanning force microscopy, Langmuir 14 (23), 66136616, 1998. Taylor II, R. M. and Superfine, R., Advanced Interfaces to Scanning Probe Microscopes, in Handbook of Nanostructured Materials and Nanotechnology, Nalwa, H. S. Academic Press, New York, 1999, pp. 271-308. Falvo, M. R., Clary, G., Helser, A., Paulson, S., Taylorr II, R. M., Chi, V., Brooks Jr., F. P., Washburn, S., and Superfine, S., Nanomanipulation experiments exploring frictional and mechanical properties of carbon nanotubes, Microsc. Microanal. 4, 504-512, 1998.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

393

XI. SPECTROMETRUL DE FOTOELECTRONI DE RAZE X (XPS) I ULTRAVIOLETE (UPS) Spectroscopia fotoelectronic

C.S.III. dr. Maria Teodora Radu Cuprins
I.Concepte de baz .................................................................................................... 395 1. Analiza de suprafa ............................................................................................ 395 2. Spectroscopia fotoelectronic cu radiaie UV (UPS) ............................................ 396 2.1. Caracteristici generale .................................................................................. 397 2.2. Spectrele UPS i energia de rezoluie ........................................................... 398 3. Spectroscopia fotoelectronic de raze X ................................................................ 400 II. Design-ul i principiul de funcionare al spectrometrului de electroni ............... 401 1. Analizorul de energie emisferic de tip PHOIBOS ............................................... 402 1.1. Caracteristici generale ................................................................................... 402 1.2. Descrierea Analizorului ................................................................................ 402 1.2.1. Sistemul de lentile ............................................................................... 405 1.2.2. Analizorul Emisferic (HSA) ............................................................... 410 1.2.3. Izolarea Magnetic .............................................................................. 412 1.2.4. Mecanismul de tiere a orbitei ............................................................ 412 1.2.5. Detector Multicanal MCD ................................................................. 414 1.2.5.1. Principiile Deteciei .................................................................. 414 1.2.5.2. Coerena ntre i pas ...................................................... 415 1.2.5.3. Multiplicarea Electronic ......................................................... 415 2. Sursa de raze X pentru FOCUS 500 (XR50 M) ................................................. 416 2.1. Principiu de funcionare................................................................................ 416 2.2. Descrierea sursei ........................................................................................... 417 2.2.1. Generarea fotonilor de raze X ............................................................. 417 2.2.2. Monocromatorul ................................................................................. 417 2.2.3. Informaii generale n legtur cu sursa XR 50 M ............................ 421 2.2.3.1. Modul de focalizare................................................................... 421 2.2.3.2. Rcirea cu ap ........................................................................... 422 3. Flood-Gun 15/40 .................................................................................................. 422 3.1. Informaii generale ........................................................................................ 422 3.1.1. Componente ........................................................................................ 422 4. Bibliografie ........................................................................................................... 423

394

I. Concepte de baz 1. Analiza de suprafa

Spectroscopia fotoelectronic a fost stabilit ca una din cele mai importante metode de studiu a structurii electronice a moleculelor, solidelor i suprafeelor [1-2]. Mai mult, are pe scar larg implicaii practice n diferite domenii ca de exemplu fizica i chimia suprafeelor sau tiina materialelor, i a contribuit semnificativ la nelegerea principiilor fundamentale din fizica corpului solid [1-5]. Principiul fundamental al procesului de fotoemisie este prezentat schematic n fig.1 Aceast figur simplificat arat atractivitatea spectroscopiei de fotoemisie, pentru c proprietile fotoelectronilor emii reflect n principal strile electronice proprii ale sistemului investigat. n principiu se poate face distincie ntre fotoemisia cu radiaie n ultraviolet (UPS) utilizat n principal pentru investigaii ale strilor din benzile de valent i spectroscopia de fotoemisie cu raze X (XPS) care permite identificarea atomilor la suprafaa solidelor i determinarea deplasrilor n energiile de legtur ale core-level-urilor care sunt legate de diferite moduri de legturi chimice, la energii de legtur mai mari. Aceast separare se bazeaz n principal pe cele dou tipuri diferite de surs de excitare cvazi-monocromatic disponibile n laboratoarele de cercetare i anume: spectrul liniei UV a lampei de descrcare pentru energii n domeniul de aproximativ 10-50 e.V. cu gaze rare ca heliu (He I: 21.23 eV si He II: 40.82 eV) i liniile ceraracteristice ale unei surse de raze X care utilizeaz de obicei ca materiale pentru anod aluminiul (Al - K1,2: 1486.6 eV) sau magneziul (Mg K1,2:1253.6 eV). Dei lrgimea liniei este de obicei suficient de mic pentru multe aplicaii, de ex. civa meV pentru lampa de descrcare i aprox. 1 eV pentru anozii sursei de raze X, folosirea unui monocromator suplimentar poate fi un avantaj att pentru energia de rezoluie ct mai ales pentru suprimarea background-ului i a intensitilor sateliilor care pot s apar n spectru. Electronii cu energia de legtura EB pot fi excitai deasupra nivelului E de ctre fotoni cu energia h > EB + 0. Distribuia fotoelectronilor I(Ekin) poate fi msurat de analizor i reprezint n prima aproximaie o imagine a densitii strilor electronice ocupate N(EB) n proba analizat. n general, suprapunerea dintre rezultatele experimentele de spectroscopie de fotoemisie i teorie este necesar pentru investigarea a numeroase proprieti a strii solide, inclusiv dispersia benzii de valen magnetismul

395

Figura 1. Prezentare schematic a procesului de fotoemisie n modelul uni-particul.

i suprafaa Fermi. Investigarea experimental a acestor proprieti necesit o energie de rezoluie de ordinul meV. n acest context, n ultimii ani s-au efectuat mbuntiri remarcabile d.p.d.v. tehnic n domeniul spectrometrelor de nalt rezoluie.

2. Spectroscopia fotoelectronic cu radiaie UV (UPS)

Aceast tehnic este folosit pentru a studia nivelele de energie din banda de valen i legturile chimice corespunztoare. Mai mult, n cazul chemosorbiei metoda ne permite studierea nivelelor electronice de energie derivate din orbitali moleculari ai sistemului substrat absorbit. Metoda a fost dezvoltat iniial n 1962 de David W. Turner pentru studierea moleculelor n faza gazoas[6] i ulterior dezvoltat pn la nivelul actual. n prezent, UPS joac un rol important n obinerea structurii benzii de valen a unui numr mare de solide i suprafee, furniznd informaii despre dispersia fononilor n solide, aproape la fel ca difracia de neutroni. De asemenea, trebuie menionate cteva exemple pentru caracteristici many-body ce pot fi puse n eviden pe scala meV n spectrele de fotoemisie UPS a sistemelor solide: (111) stri de suprafa de tip Shockley pentru Cu(1 1 1) [7-8], gap-ul supraconductor al unui supraconductor conven396

ional (V3Si), [9] i rezonan Kondo n sistemele cu fermioni grei, (CeCu2Si2) [10-11]. Aceste exemple sunt reprezentative pentru nelegerea unor probleme mult mai complexe n fizica strii solide cum ar fi supraconductivitatea de temperatur nalt (HTSC) i compuii cu fermioni grei.

2.1. Caracteristici generale

Fluxul fotonilor emii de sursa de-a lungul axei optice poate fi determinat utiliznd formula

= I ph * ,
unde (1) - fluxul fotonilor (sec-1); Iph - densitatea fotonilor (sec-1sr-1); - unghiul solid (sr-1); n prima aproximaie unghiul solid rezult din zona iluminat a probei i distana dintre capilar i prob:
=

+ r2
d2

(2) (3)

R=

d (1 2d*cr )

R - raza ariei excitate din proba; d - distana de la capilar la prob (aprox 40 mm); dc - diametrul capilarului (1.3 mm).

Figura 2. Schema pentru aproximaia unghiului solid

Fluxul de fotoni poate fi calculat folosind formula:

1 e* r

, unde

(4)

I- curentul fotonic pe prob; - randamentul total de electroni 397

Din (1) si (4) rezult:

d I ph = I * dc / e * * r 2 * 1 2*r
2

(5)

Pentru o arie iluminat a probei de aprox. 2.22 mm diametru i un curent pe proba de 55 nA, densitatea fotonilor este calculat ca fiind: Iph= 8.3 * 1015 fotoni sr-1sec-1

2.2. Spectrele UPS i energia de rezoluie

Sursa UV de tipul UVS 10/35 este n principal utilizat pentru studiul densitii de stri a electronilor de valent. Descrcarea VUV acoper un interval de energie al fotonilor de la 10 la 50 eV. Limea liniei de excitare, este n general de civa meV de aceea monocromatizarea suplimentar nu este necesar n cele mai multe cazuri. Datorit caracterului cvasimonocromatic al liniilor de excitare se poate obine energie de rezoluie nalt (aprox. 0.01 eV) ceea ce permite rezolvarea structurilor vibraionale moleculare. n intervalul VUV de energii joase (<20 ev, sau< 12 eV energie a fotonilor) spectrele fotoelectronilor UV excitai, forma i structura lor, depind puternic de energia fotonilor excitani. Pentru energiile fotonilor VUV n intervalul 20 - 40 eV structurile electronilor de valen s-like sunt suprimate n comparaie cu orbitalii p-like. Dac energia fotonilor este 40 eV structurile d-like sunt generate cu o probabilitate de excitare mare. De aceea, n plus fa de XPS, spectrele UV ale fotoelectronilor excii pot fi comparate cu rezultatele teoretice obinute din calculul structurilor de benzi, i folosite pentru determinarea unor informaii specifice suplimentare n analiza de suprafa.

Figura 3. Determinarea funciei de lucru, , cu UPS

398

Potrivit figurii 3, funcia de lucru, , este exprimat astfel: = Evac - EF, unde (6) Evac- nivelul de energie al vidului; EF- nivelul Fermi. n general, pentru un electron emis de la un nivel de energie EB < EF: Ekin= h * (EB - ) (7) unde, h este energia fotonului. Pentru un electron emis de la nivelul Fermi (figura 3B), pentru energia de legtur i energia cinetic avem: EB= 0 Emax= h * , unde Emax este cea mai mare energie cinetic. Un electron emis de la un nivel de energie Ex < Ef (figura 3C) are o energie cinetic minim (Emin= 0). Acest electron ar aprea n poziia A n figura 4. (8) (9)

Figura 4. Determinarea funciei de lucru, , prin msurtori UPS

Diferena dintre energiile cinetice ale electronilor la poziiile A i B este Emax - Emin adic: Emax - Emin= h * (10) Aceast diferen este egal cu distana de la A la B, adic limea spectrului cu E= constant n figura 4. Prin urmare, funcia de lucru poate fi calculat folosind formula: = h * (Emax - Emin) (11) 399

3.Spectroscopia fotoelectronic de raze X

n XPS, n general suntem preocupai de o form special de fotoemisie, adic de emiterea unui electron de la un nivel de baz datorit aciunii unui foton de raze X de energie hv. Energia fotoelectronului emis este apoi analizat de un spectrometru de electroni i datele sunt prezentate ca un grafic de intensitate funcie de energia fotoelectronilor emii. Energia cinetic a electronilor (EK) este experimental msurat cantitativ de spectrometru, dar acest lucru depinde de energia fotonilor razelor X implicate i de aceea nu este o proprietate a materialelor intrinseci. Energia de legtur a electronilor (EB) este parametrul care identific specificul electronilor. Relaia dintre parametrii implicai n XPS este: EB = hv - EK - W, unde hv este energia fotonilor, EK este energia cinetic a electronilor i W (cst) este funcia de lucru a spectrometrului. Cantitile din dreapta relaiei sunt cunoscute sau msurabile. n practic, acest lucru va fi efectuat de ctre sistemul de control sau de sistemul de date asociat cu spectrometrul. Operatorul doar selecteaz o scal de energie cinetic sau de legtur, care este considerat mai adecvat. Spectrul de fotoelectroni va reproduce structura electronic a unui element destul de precis, deoarece toi electronii cu o energie de legtur mai mic dect energia fotonilor vor fi cuprini n spectru. Acest lucru este ilustrat n figura urmtoare, unde, spectrul XPS al plumbului este suprapus pe o reprezentare a orbitalilor electronici.

Figura 5. Spectru fotoelectronic al plumbului care arat modul n care electronii scap din solid, contribuind la vrfuri discrete, sau pot suferi pierderi de energie i s contribuie la fundal; spectrul este suprapus pe o structur electronic schematic a plumbului pentru a studia modul n care fiecare orbital d natere la linii fotoelectronice.

Aceti electroni care sunt excitai i scap fr a pierde energie, contribuie la vrfurile caracteristice n spectru; cei care sunt supui unei mprtieri inelastice i sufer pierderi de energie, contribuie la fondul spectrului. Odat ce fotoelectronul a fost emis, atomul ionizat trebuie s se relaxeze. Acest lucru poate fi realizat prin emisia unui foton de raze X, cunoscut sub 400

numele de fluorescen de raze X. O alt posibilitate o constituie ejecia unui electron Auger. Astfel, electronii Auger sunt produi ca urmare a procesului XPS, adesea denumit X-AES (X-ray induced Auger electron spectroscopy). X-AES, cu toate c nu se practic la scar larg, poate conduce la informaii chimice valoroase despre un atom.

II. Design-ul i principiul de funcionare al spectrometrului de electroni

Figura 6. Sistemul de analiz a suprafeelor SPECS

n cel mai simplu mod, spectrometrul de electroni conine urmtoarele componente: Analizor de energie a electronilor de tip PHOIBOS 150 Sursa de raze X, XR50 Sursa de raze X cu monocromator FOCUS 500 Sursa UV UVS 10/35 Sursa sputter IQE 11/35 cu ioni de Ar Neutralizator de tip Flood Gun FG 15/40 Acestea sunt cuprinse ntr-o camer de vid, care funcioneaz n regim de vid ultra-nalt (UHV). Sursa de radiaii primare pentru spectroscopia fotoelectronilor de raze X face uz de razele X, n general cu catodul de aluminilu (Al K) sau catodul de magneziu (Mg K). Camera de vid si de preparare poate fi dotat cu diferite instalaii pentru prepararea probelor i facilitai analitice auxiliare (neutralizator de sarcin, sistem de tiere a probelor, sistem de curare cu ioni de Ar etc.). Un sistem computerizat este folosit pentru achiziia datelor i de procesarea ulterioar. 401

1. Analizorul de energie emisferic de tip PHOIBOS

1.1. Caracteristici generale
Analizorul SPECS de energie emisferic electrostatic de tip PHOIBOS permite nregistrarea spectrelor de energie pentru particulele negative (electroni) i particulele pozitive (ioni) n intervalul energiilor cinetice de la 0 eV la 3.5 keV. Lentilele de intrare sunt proiectate pentru a se potrivi cu o gam larg de aplicaii. Analizorul PHOIBOS 150, este echipat cu 9 canale detectoare. Partea electronic pentru detecie include un discriminator, un preamplificator, un numerator i o interfa bus. Toate prile sunt integrate ntr-o singur cutie compact din aluminiu protejat RF. Partea electronic de detecie este alimentat mpreun cu unitatea analizoare de control. Analizorul de acest tip poate detecta energii ale electronilor i ionilor n intervalul 0-3500 eV cu o lrgime minim a pasului de 7 meV. Unitatea poate fi folosit i pentru aplicaii la nivele mai mari de energie folosind un mod de operare corespunztor. Un ansamblu de lentile de transfer n doi pai poate fi folosit n diferite moduri pentru rezolvarea spaial i unghiular. Toate modurile lentilei pot fi setate electronic. Un mecanism de tiere a orbitei i o lentil multi-mod fac selectabile zona de pe proba de analizat i unghiul de recepie. De aceea, analizorul permite msurtori rezolvate spaial cu un diametru minim de 100 m i, de asemenea, cercetarea unor suprafee largi asociate diferitelor unghiuri de recepie ale lentilelor. Toate componentele sunt controlate de un program SPECS. Generatorul HSA3500 pentru analizatorul PHOIBOS este controlat n totalitate cu ajutorul computerului, nefiind necesar intervenia celui care o folosete. Acesta are patru moduri de operare pentru diferite intervale de voltaj: - Intervalul 3500 V. Voltajul emisferelor (ntre - 400 i 400 V) variaz cu voltajul de ntrziere (ntre -3500 i 3500 V); - Intervalul 1500 V. Voltajul emisferelor (ntre -400 i 400 V) variaz cu voltajul de ntrziere (ntre -1500 i 1500 V); - Intervalul 400 V. Voltajul emisferelor (ntre -400 i 400 V) i voltajul de ntrziere (ntre -400 i 400 V) sunt schimbate independent; - Intervalul 40 V. Voltajul emisferelor (intre -40 si 40 V) i voltajul de ntrziere (ntre -40 i 40 V) sunt schimbate independent.

1.2. Descrierea Analizorului

Analizorul PHOIBOS este format dintr-un sistem de vidare i patru componente majore interne care sunt artate n figurile de mai jos. Toate aceste 402

componente sunt introduse ntr-un mediu de vid ultra-nalt (UHV), pentru a evita ciocnirea particulelor emise de pe suprafaa probei cu moleculele de gaz.

Figura 7. Schema de conectare a componentelor PHOIBOS

Figura 8: Principalele componente ale analizorului i principiul voltajului

U0 voltajul principal de ntrziere, U0 = Ekin(kinetic energy) + Ep(pass energy) + WF(work function); Uchannel HV/ Base potenialul pe anod/catod pentru canale; 403

UHVUBase voltajul detectorului; UChannelBase-U0 voltajul de conversie; LALE potenialele pe lentile; IH, OH emisfera interioar/exterioar; T1T10 electrozi ai lentilei de transfer multi-mod; S1 intrarea de tiere a capacitorului emisferic; S2 planul de ieire al capacitorului emisferic; r0 raza nominal a capacitorului (100 sau 150 mm); C1C9 - detectori mono/multi-canal de colecie discret (1,5 sau 9 canale); Componentele interne sunt: Sistemul lentilelor de intrare, pentru recepionarea particulelor ncrcate; Analizorul emisferic de 180 (HSA) cu un diametru de 150 mm pentru msurtori spectroscopice de energie; Ansamblul detector pentru particule individuale; Mecanism de tiere a orbitei cu o interconexiune rotaional exterioar; Apertur iris cu interconexiune rotaional exterioar. Sursa excitatoare depinde de tehnica folosit, dar de obicei se folosesc razele X sau alte tipuri de fotoni, ioni, sau electroni. nainte ca particulele s treac prin analizorul semisferic, trec mai nti printr-un sistem de lentile electronic care taie fasciculul de particule. Sistemul de lentile electronic i prile tiate (intrarea i ieirea) au efecte importante asupra mprtierii energiei detectate de analizor. Sistemul de lentile de intrare include zece segmente de lentile. Pentru obinerea unei imagini nedegenerate, sistemul de lentile nu conine sau nu are interfranje. Succesiunea de lentile definete suprafaa de analiz i acceptana unghiular prin imagistica particulelor emise la intrarea n analizor. Particulele care trec prin lentile sunt focalizate n poarta de tiere S1, unde sunt ntrziate n lentile pentru o analiz energetic ulterioar. n plus, panourile de lentile definesc acceptana unghiular i suprafaa pentru o anumit mrime a tierii de intrare. Sistemul de lentile poate fi operat n diferite moduri pentru situaii de rezolvare spaial i unghiular pentru a adapta analizorul la diferite cerine. Toate modurile lentilei pot fi setate electronic. Pentru analiza cu un spot mic este disponibil o rezoluie colateral de pn la 100 m, folosind modul de amplificare puternic si o apertur iris corespunztoare. n modurile de amplificare rezolvarea unghiular este realizat cu o apertur iris n planul de difracie al sistemului de lentile. 404

Folosind irisul, rezoluia unghiular poate fi ajustat continuu meninnd suprafaa de recepie a probei constant. Modurile de transmisie sunt optimizate pentru transmisii nalte la mrimi diferite ale spotului. Rezoluia colateral este nrutit i suprafaa de recepie nu este definit n mod normal de lentile. n modurile unghiulare dispersive, distribuia emisiei dup unghiuri este vizualizat n locul imaginii reale. Toat rezoluia colateral este pierdut, dar, informaia dat de unghiurile de emisie este obinut uor. Aceste moduri sunt concepute pentru schiarea benzilor UPS, suprafeelor Fermi sau experimente similare. n capacitorul semisferic, particulele care intr n S1 sunt focalizate n planul de ieire al capacitorului S2. Poziia radial a imaginii tiate n planul S2 depinde de energia cinetic a particulelor n capacitor. Particulele de pe traiectoria central au energia de trecere optim. Ele sunt focalizate pe poziia central radial a ieirii plane S2. Particulele cu o energie cinetic mai mare sunt focalizate mai departe spre exterior, iar particulele cu o energie cinetic mai mic, sunt focalizate mai n interiorul planului S2. Aceasta permite posibilitatea folosirii detectorilor multi-canal, cu nregistrarea simultan a unei benzi de energie n jurul valorii de trecere optime a energiei. Particulele care trec prin planul de ieire al capacitorului S2 sunt accelerate n sistemul de detectori C. Cu detectorul multi-canal, fiecare canal este conectat la un preamplificator separat, montat n afara vidului. Preamplificatorii sunt citii de ctre detectorii multi-canal (MCD), cu interfaa pentru programul de achiziie de date SPECS. 1.2.1. Sistemul de lentile Ansamblul de lentile de transfer n doi pai a fost conceput pentru a oferi randament de transmisie foarte bun i proprieti optice bine definite. Acesta poate fi folosit n diferite moduri care pot fi setate electronic, pentru rezolvarea spaial i unghiular. Un sistem de lentile cu un mecanism variabil de tiere a orbitei este necesar pentru: a vizualiza planul probei pe intrarea plan HSA; a defini zona probei analizat i unghiul solid de recepie de pe prob; a accelera/decelera particulele la energia de trecere. Distana standard de lucru de 40 mm i partea frontal de form conic la un unghi de 44 al lentilei furnizeaz accesul optim la prob pentru toate tipurile de surse excitatoare. La nivelul lentilei particulele ce ies de pe pro405

ba S sunt vizualizate n intrarea de tiere S1, proba fiind n planul focal al sistemului de lentile, de exemplu, 40 mm n faa primului electrod al lentilei T1. n interiorul primei lentile, particulele trec printr-o imagine intermediar nainte s fie focalizate n intrarea de tiere S1 a capacitorului emisferic (figura 4). La nivelul S1 particulele sunt ntrziate de diferena de energie dintre particulele cu energia cinetic preponderent Ekin i energia preponderent de trecere Epas. Dac S1 are diametrul D1, atunci, conform teoriei, suprafaa vizualizat a probei va avea dimensiunea DS egal cu: DS = D1 / M (1) Puterea de amplificare a planului de lentile poate fi selectat. Amplificarea este schimbat electric, conectnd la electrozii lentilelor voltajul optim. Valorile voltajului sunt dependente de voltajul spectrometrului U0 care este preponderant egal cu Ekin - Epas + funcie de lucru. Ekin este negativ pentru electroni i pozitiv pentru ioni. Sistemul PHOIBOS poate funciona ntr-un nivel stabilit de ntrziere (fixed retarding ratio FRR) sau n transmisie stabilit de analiz (fixed analyzer transmission FAT). n modul FAT, voltajul aplicat pe emisfere este dat de ecuaia: Epas = (-q)kV n modul FRR, energia de trecere are valoarea: Epas = Ekin / R, R fiind rata de ntrziere. Mrimea real a suprafeei probei de analizat DS este n principiu dat de ecuaia (1). Cu toate acestea, datorit aberaiei sferice a intrrii lentilei, imaginea n planul de intrare este difuz. Gradul de difuzie crete, pentru o amplificare dat, cu unghiul de recepie al intrrii lentilei. Aceasta nseamn c zona observat n planurile focale ale intrrii sistemului de lentile este tot mai mprtiat cu creterea unghiului, rezultnd astfel dimensiuni mai mari ale probei dect cele date de ecuaia (1). Din aceast cauz unghiul de recepie al lentilei este selectabil prin modurile de amplificare, innd aberaia sferic la o valoare cunoscut i acceptabil. Amplificarea nalt, (figura 9), este n mod special potrivit pentru studii de rezolvare spaial. Planul imaginii probei este n coinciden cu planul intrrii analizorului. Utilizatorul poate defini zona de recepie a analizorului cu ajutorul intrrii de tiere deoarece traiectoriile electronilor emii 406

Figura 9. Mod de transmisie nalt

Figura 10. Mod de arie medie

de ctre prob sunt influenate de ctre cmpurile electrice din jurul probei,T1 avnd un potenial fix care este setat ca fond la schimbarea sursei de alimentare. Datorit aberaiilor lentilei, razele care intr n lentil deprtate fa de axa ei la unghiuri mari, pot s gseasc un drum spre intrarea analizorului. Cu o apertur iris, aceste raze rele pot fi eliminate. Mai mult, apertura iris poate fi utilizat pentru ajustarea unghiului de recepie a analizorului. Pentru analiza cu spoturi mici, o rezoluie lateral de pn la 100 m este disponibil, utiliznd modul de amplificare nalt i apertur iris. Modurile de amplificare au fost optimizate pentru a permite unghiuri foarte mari de recepie pentru surse punctiforme cu transmisie puternic (moduri de transmisie punctiform). n aceste moduri, rezoluia unghiular este realizat cu ajutorul aperturii iris n planul de difracie al sistemului de lentile. Folosind irisul, rezoluia unghiular poate fi ncontinuu ajustat ntre 10 i 90 , meninnd zona de recepie a probei constant. Razele apropiate de axa 407

lentilei (raze paraxiale) sunt focalizate n focarul Gaussian. Razele care intr n lentil la unghiuri mai mari, converg mai puternic. Discul cu cea mai mic dezordine se afl unde tubul de raze emergente are cel mai mic diametru. Focalizri mici sub lentil, implic deplasarea discului de cea mai mic dezordine, n planul imaginii. De aceea este realizat un unghi mare de recepie, dar rezoluia spaial este nrutit. Asta face ca modurile de transmisie punctuale s fie cele mai potrivite pentru AES, ISS i studii de sincroton.

Figura 11. Modul de amplificare nalt

Tabelul 1: Unghiul de recepie versus diametrul irisului pentru o surs punctiform

Unghiul de recepie 1 2 3 4 5 6 Diametrul irisului 3.5 mm 7 mm 10 mm 13 mm 15.5 mm 17.5 mm

n noul mod de suprafa medie cu unghiuri rezolvate, electronii care prsesc proba la o anumit distan unghiular sunt focalizai pe aceeai 408

zon a intrrii analizorului indiferent de poziia lor din prob. Modurile unghiulare permit utilizatorului s optimizeze rezoluia unghiular pn la 0.050 cu mecanismul de tiere a orbitei. Cu un sistem de detecie 2-D se pot obine unghiuri de rezoluie mare pe direcia dispersiei, a analizorului, fr restricionarea unghiului de recepie; acest mod este alegerea ideal pentru studii de dependen unghiular. La PHOIBOS, amplificarea i apertura unghiular sunt selectabile. Exist mai multe combinaii diferite disponibile. Setrile lentilelor pot fi combinate cu diferite combinaii ale tierii, rezultnd astfel un numr de combinaii egal cu produsul dintre modurile de setare a lentilei i numrul de tieri. Pentru o analiz cu spoturi mici, apertura iris poate fi folosit pentru micorarea suprafeei de analizat. Setarea optim a aperturii iris depinde de mrimea tierii i de calitatea dorit a suprafeei de analizat. Funcia intensitate-poziie a analizorului este o Gaussian, dar cu intensiti mai mari n regiunile de margine. Folosind apertura iris, aceste intensiti pot fi suprimate. Suprafaa de analizat a fost definit pentru a include ntre 90-99% din totalitatea semnalului fotoelectric.

Figura 12. Profilul tipic intensitate-poziie cu apertur iris

Cozile de intensitate mic formeaz un disc. Intensitatea sa integrat poate atinge acelai ordin de magnitudine ca intensitatea peak-ului. Folosind apertura iris, aceste intensiti pot fi suprimate. 409

1.2.2. Analizorul Emisferic (HSA) Analizorul emisferic PHOIBOS (HSA) cu o raz R0 (100mm/150mm) msoar energia particulelor ncrcate. Particulele ncrcate care intr n HSA prin intrarea de tiere S1, sunt deviate pe traiectorii eliptice de cmpul electric radial ntre emisfera intern Rin i emisfera extern Rout. Razele emisferelor PHOIBOS sunt 1.25 R0 i 0.75 R0. Intrarea de tiere S1 i planul de ieire S2 sunt centrate n jurul razei R0:

R0 =

R in + R out = 150 mm 2

(2)

Pentru un gradient fix al cmpului electric, numai particulele cu energie cinetic cuprins ntr-un anumit interval, pot s treac integral prin devierea unghiular de la intrarea de tiere S1 la planul de ieire S2. Particulele cu energie cinetic mai mare se vor apropia de emisfera exterioar n timp ce particulele cu energie cinetic mai mic sunt deviate spre emisfera interioar. Acele particule care intr n HSA perpendicular pe S1 i se mic prin emisfere pe o traiectorie circular central, au energia de trecere preponderent Epass: Epass = (-q) kV, q sarcina electric a particulei; V diferena de potenial aplicat pe emisfere (Vout - Vin); k constanta de calibrare;
k= R in R out = 0.9375 2R0 (Rout R in )

(3)

(4)

Aceste particule ajung pe S2, parcurgnd un arc de cerc de raz R0. Dac HSA accept jumtatea unghiului pe direcia dispersiei, rezoluia HSA sau FWHM (full width at half maximum), a liniei transmise Ean este dat de :
Ean S 2 = + Epas 2R0 4

(5)

unde S = (S1 + S2)/2. Aceast valoare (S) este o constant a analizorului. Exist contribuii n plus la lrgimea liniei observate n spectru. Pentru liniile de fotoemisie cele mai importante contribuii adiionale sunt: a) Lrgimea proprie a liniei pentru nivelul atomic Elevel (de exemplu O 1s, C 1s), b) Lrgimea natural a liniei pentru radiaia caracteristic folosit la excitare Ephoto (de exemplu Mg K, Al K). FWHMtotal observat este dat de convoluia FWHM - urilor individuale, de exemplu, pentru lrgimea Gaussian a liniilor: (6) FWHMtotal =(Ean 2 +Elevel2 +Ephoto2 )1/2 =E 410

FWHMtotal este de obicei stabilit folosind o prob de argint curat prin mprtiere ionic i nregistrarea nivelului Ag 3d5/2, dup extracia liniar a fondului. Pentru excitarea Mg K, rezoluia HSA la nivelele joase ale energiei de trecere pentru Ag 3d5/2 este : HMMgKa= 0.8 eV (7) n practic, o rezoluie de 0.9 eV este de obicei suficient pentru msurtori la rezoluie mare. Pentru o rezoluie mai mare a instrumentului, este posibil folosirea radiaiei X monocromatice de excitare, de exemplu radiaie Al K monocromatic n mare parte. Pentru radiaie Al K monocromatic i pentru nivelul Ag 3d5/2 rezoluia extrem este: (8) FWHMextreme = 0.44 eV Pentru a atinge rezoluia extrem de 0.44 eV, FWHM-ul razelor X trebuie s fie foarte mic, folosind doar o mic parte din suprafaa spotului monocromatic de radiaii X (datorit dispersiei energiei pe suprafaa spotului), cu costul unei mari pierderi n intensitate. n practic, o rezoluie de 0.65 eV este de obicei suficient pentru studii de nalt rezoluie cu o excitare monocromatic a Al K. Pentru radiaia monocromatic, FWHMtotal este uneori determinat nregistrnd nivelul Si 2p3/2 n loc la Ag 3d5/2, de unde rezult valori mai mici pentru FWHMextreme, datorit ngustrii lrgimii liniei proprii a nivelului Si 2p. Intensitatea semnalului integral I al particulelor msurate (suprafaa cuprins n interiorul peak-ului pn la nivelul fondului) este proporional cu produsul dintre unghiul solid de recepie S, suprafaa de recepie a probei AS i rezoluia HSA, Ean :
I:Ean SAS =Ean 0A0 Epass Epass 2 , : Ekin Ekin

(9)

sunt valorile de recepie pentru HSA. Ele sunt constante ale unde analizatorului. Ecuaia rezult din teorema lui Liouville. Analizorul poate fi operat n dou moduri diferite: a) Gradul de ntrziere fix (Fixed retarding ratio (FRR)), gradul de ntrziere R este definit ca:
R= Ekin Epas

(10)

n acest mod toate particulele sunt decelerate cu acelai factor constant. De aceea, energia de trecere este proporional cu energia cinetic. Intensitatea crete cu creterea energiei cinetice:

I Ekin ,
n timp ce rezoluia energetic scade.

(11)

411

b) Transmisie fix a analizorului (fixed analyzer transmission(FAT)), n care Epass i Ean din ecuaia (5) sunt constante ajustabile. Semnalele date de toate particulele, indiferent de energia lor cinetic, sunt msurate cu aceeai scdere a rezoluiei i intensitii cu energia cinetic:
I 1 Ekin

(12)

Cele dou moduri sunt disponibile pentru toate tipurile de msurtori. Exist unele aplicaii n care unul dintre ele este de obicei preferabil. Modul FRR este folosit cel mai mult n AIS, ISS i este preferabil pentru msurtori ale survey-ului. Modul FAT este folosit preponderent n XPS i UPS, unde este necesar o informaie detaliat i rezoluia nu trebuie s depind de energie. Dac Ekin este constant i acelai peak este msurat pentru diferite energii de trecere, rezult c:

I Epass 2
1.2.3. Izolarea Magnetic

(13)

Particulele ncrcate sunt influenate de cmpul magnetic rezidual, (inclusiv cmpul magnetic al pmntului) de aceea este esenial s eliminm aceste cmpuri n volumul nchis al analizatorului. Analizatorul, sistemul de lentile i detectorul sunt nconjurate de un strat de 1.5 mm grosime -metal pentru a ecrana cmpurile magnetice la un nivel minim. Factorul de izolare pentru regiunea analizatorului este de aproximativ 35. Pentru o performan maxim a analizatorului i sistemului de lentile, acestea sunt construite, n ntregime, din materiale non-magnetice ntr-o carcasa de -metal. 1.2.4. Mecanismul de tiere a orbitei Mecanismul de tiere a orbitei este folosit pentru a schimba manual deschiderea intrrii i ieirii analizorului. Mecanismul poziioneaz o deschidere de intrare i ieire de o mrime adecvat n planul de intrare i ieire al analizorului. Raza de intrare este definit de dou seciuni care sunt la circa 6 mm deprtare. Tierea posterioar se afl n planul intrrii i definete energia de rezoluie a analizorului (vezi ecuatia (5)), n timp ce tierea anterioar servete la compararea mprtierii unghiulare pentru analizor. Pentru o rezoluie energetic dat, o zon de analiz tolerat i un unghi de recepie, tierea maxim posibil poate fi selectat. Aceasta face posibil cea mai mare rat de numrare permis pentru aceti parametrii i de aceea rezult un timp scurt de msurare i un raport bun semnal-zgomot. Inelul de intrare poate fi poziionat direct prin rotirea cadranului (vezi fi412

gura 10). Pe de alt parte, inelul de ieire este poziionat indirect prin intermediul inelului de intrare (vezi figura 11). Prin acest aranjament se pot alege puterile de intrare i ieire independent, folosind acelai sistem rotaional. Analizorii PHOIBOS, ncepnd cu ieirea 5, au 8 tieri de intrare i 2 de ieire n configuraia standard. Poziiile tierii de intrare sunt indicate cu numere (1-8) pe cadranul rotaional exterior. Poziiile tierilor de ieire sunt indicate cu litere (A-B, sau A,B sau C). Aceti indicatori corespund celor care apar n setrile programului de control al analizatorului SpecsLab2. Cnd deschiderea intrrii i ieirii este schimbat, poziiile trebuie introduse n zona de editare a datelor. Aranjamentul propriu-zis n analizor apare n seciunea de tiere a programului de control livrat mpreun cu analizorul.

Figura 13. Selecia fantei de ieire

413

1.2.5. Detector Multicanal MCD Detectorul este format din urmtoarele pri: Un aranjament de multiplicatori de electroni MCD O punte ceramic multi-pin, de voltaj nalt, situat n vid Preamplificatori MCD. 1.2.5.1. Principiile Deteciei Datorit simetriei sferice a HSA, exist o imagine 1:1 a intrrii circulare de tiere cu o raz de curbur R0, n planul ieirii pentru electroni monocromatici cu energia preponderent de trecere Epass. Imaginile electronilor, avnd diferite energii n HSA, sunt cercuri concentrice. ntr-o prim aproximaie raza de poziie R a electronilor cu energia cinetic Ek, este dat de:

R R0 Ek Epass D = R0 E pass R0
unde D este dispersia la HSA. Valoarea teoretic a lui D este: D = 2R0

(16)

(17)

Valoarea experimental determinat pentru dispersie poate fi puin diferit, n principal datorit cmpurilor de refringen existente pe marginea analizorului. Detecia multicanal se realizeaz aranjnd corespunztor 9 CEMs (multiplicator de electroni cu canale) ca i colectori, cu 9 ieiri de tiere n cercuri concentrice n planul de ieire. Distana radial ntre ieiri de tiere vecine R, este selectat pentru a corespunde cerinelor unei diferene de energie cinetic constant ntre canalele vecine Ek. Numrul particulelor Nn care sosesc la fiecare colector Cneste numrat separat, iar aceste numere sunt stocate i procesate ntr-o unitate de achiziie a datelor. Schimbnd tensiunea spectrometrului U0, traiectoria electronului este mutat ntre fiecare analizor pas cu pas, i n acest fel fiecare colector nregistreaz un spectru corect, cu o compensare fix a energiei ntre canalele vecine. n principiu, balend spectrul odat peste suprafaa detectorului, 5 sau 9 spectre paralele sunt nregistrate simultan. Energia cinetic En a particulelor ce ajung la colectorul Cn, fiind tiut din ecuaia (16), numrul particulelor din fiecare canal, aparinnd aceleiai energii cinetice, poate fi adugat, rezultnd numrul total de particule pentru fiecare energie cinetic.

414

1.2.5.2. Coerena ntre Epass i pas Din ecuaia de dispersie energetic pentru analizor, diferena de energie ntre canalele vecine, la distana R unul de cellalt, este:
Ek = R D D R Epass

(18)

sau:
Epass =

Ek

(19)

unde D este dispersia pe analizor. n special n modul FRR, unde energia de trecere se schimb n spectru (i diferena de energie dintre canalele nvecinate), un calcul al energiei detectate a particulelor este necesar. Pentru asta, un program calculeaz numrul de particule Nn n canalul Cn, la energia cinetic nominal, prin interpolarea ntre numerele msurate n canalul Cn la energiile msurate cel mai apropiat dedesubt i deasupra energiei nominale. Algoritmul este uniechivoc, deoarece nu exist niciodat mai mult dect o energie nominal ntre dou poziii ale energiei msurate. Datorit procesului de interpolare, nu exist o restricie a pasului energiei datorat performanei analizorului. Performana acumulatorului (DAC steps, etc) limiteaz lrgimea i distana posibil a pailor. Programul valideaz valorile la cele mai apropiate valori. 1.2.5.3. Multiplicarea Electronic Un multiplicator de electroni cu canale (CEM) este un dispozitiv de achiziie nalt pentru detectarea particulelor energetice, cum ar fi electronii i ionii, sau radiaia. CEM este format dintr-un tub mic i curbat de sticl. Peretele interior este cptuit cu un material de rezisten nalt. Materialul rezistiv devine o dinod (o serie de electrozi incorporai ntr-un fotomultiplicator) continu cnd un potenial este aplicat la capetele acestui tub. Impactul particulelor ncrcate formeaz electroni secundari care sunt eliberai din peretele CEM. Aceti electroni sunt accelerai de ctre voltajul nalt, conectat la CEM, i elibereaz noi electroni secundari prin impactul n continuare de-a lungul peretelui CEM. Acest efect este repetat succesiv, pn cnd, n final, un nor electronic se formeaz la ieirea din CEM. Numrul mediu de electroni care pleac din ansamblul CEM pe particula incident, se numete ctigul G. Pentru detectarea unei singure particule, ctigul trebuie selectat destul de nalt pentru a folosi CEMs n modul 415

saturat, de exemplu, fiecare particul incident elibereaz un nor electronic la ieirea aranjamentului CEM, a crui sarcin este independent de micile schimbri n voltajul multiplicator. Operaia de saturare este necesar pentru o reflexie a zgomotului suficient, n detectarea unei singure particule. De obicei, ctigul minim pentru operaia de saturare este de aproximativ 107, de exemplu, un nor electronic format din mai mult de 107 electroni prsete CEM. Norul electronic emis, este accelerat n electrodul conectorului CEM, i pulsul sarcinii purtate de norul electronic este detectat ca provenind de la una din particulele incidente i numrate n canalul preamplificatorului. Unul sau un grup de CEM este folosit ntr-un aranjament special, ca o component de multiplicare electronic pentru analizorii PHOIBOS. Toate CEMs sunt montate ntr-o unitate paralel pe o flan cu rol de punte. Particulele ce trec de ieirea aperturii, sunt accelerate la o energie cinetic corespunztoare n interiorul CEM.

2. Sursa de raze X pentru FOCUS 500 (XR50 M)

2.1. Principiu de funcionare
Monocromatorul FOCUS 500 de raze X este echipat cu o versiune special a sursei de raze X XR-50, numit XR 50 M. La fel ca i XR 50, aceast surs este o surs cu doi anozi, avnd ca materiale constituente Al i Ag. Fiecare anod poate fi operat n modul de focalizare sau non-focalizare. Dac modul de focalizare este activat de ctre acumulatorul XRC 1000 M, spotul sursei de raze X pe anod este de 3.5 x 0.5 mm2 (corespunde la 3.5 x 0.2 mm2 pe prob). Datorit mrimii mici a sursei, rezoluia maxim a monocromatorului de 0.25 eV poate fi atins pentru Al K. Puterea maxim este restricionat la 150 W n modul de focalizare. n modul de non-focalizare, mrimea spotului de raze X pe anod este de 3.5 x 4 mm2 (corespunde la 3.5 x 1 mm2 pe prob) i sursa de raze X poate fi operat la puterea maxim de 400 W ( 600 W pentru Ag L) la lrgimea liniei de 0.4 eV pentru Al K. Selecia ntre anodul 1 i anodul 2 acceseaz fie radiaia Al K la 1486.74 eV, fie radiaia Ag L la 2984.3 eV. Dac anodul de argint este activat, monocromatorul este folosit n reflexia Bragg de ordinal 2, iar XR 50 M trebuie s fie mutat cu 16 mm. Cum este menionat mai sus, modul focalizare/non-focalizare este utilizabil pe amndoi anozii. 416

Efectul de focalizare este obinut cu ajutorul unei lentile electronice adiionale, amplasat n capul sursei, care nu exist n XR-50 standard. Voltajul de focalizare este generat de ctre un amplificator XRC 1000 M i este transferat la sursa de raze X printr-un cablu de filament prin cele 4 puni. Modulul XR-50 M (cu alimentarea de ap i protecia HV scoase) poate fi nclzit pn la 250C, permind o operaie UHV. Conectorii de filtrare rapid permit ndeprtarea rapid a liniilor de rcire cu ap i HV (de nalt tensiune).

2.2. Descrierea sursei

2.2.1. Generarea fotonilor de raze X Dac un material n stare solid este bombardat cu electroni de nalt energie, are loc un proces de ionizare al nivelelor electronice. Dac aceste locuri vacante sunt umplute cu electroni cu o caracteristic energetic mai nalt, vor fi generate raze X sau electroni Auger. n afar de aceste dou procese, va fi produs i o radiaie cu o frecven continu a spectrului, de ctre electronii ntrziai. Diagrama bloc a sursei de raze X este prezentat mai jos, artnd voltajul i curenii pe surs.

Figura 14. Diagrama bloc a principiului de funcionare a sursei

2.2.2. Monocromatorul Radiaia caracteristic este generat pe anodul XR-50 M i pleac de la surs sub un unghi de 15. Aceasta este reflectat dup legea lui Bragg pe oglinda elipsoidal din cuar n monocromatorul FOCUS 500 i focalizat pe prob.

417

A) Descrierea general a monocromatorului: Ansamblul cristalului este compus dintr-o oglind din cristal de cuar i un manipulator al oglinzii. Oglinda este fcut dintr-un suport monolitic de nclzire, cu plane de cristal monoatomice orientate precis. Manipulatorul oglinzii poate genera trei moduri de micare: translaie (focalizare) i dou direcii de nclinare. Este folosit pentru poziionarea oglinzii n vederea obinerii unui fascicul de raze X monocromatic.

Figura 15. Prezentarea schematica a monocromatorului FOCUS 500

n anodul dual sunt produse raze X Al K (1486,74 eV) sau Ag L (2984,3 eV). Sursa de raze X XR 50 M este montat pe un manipulator dup cele trei axe. Sursa este alimentat de ctre un acumulator XRC 1000 M i de ctre o unitate de rcire CCX60. Monocromatorul aduce urmtoarele avantaje sursei de raze X: Distribuia energetic a razei X cu benzi energetice nguste mbuntete selectivitatea chimic, ngustnd peak-urile spectrului; Un background mai mic; Eliminarea razelor X nedorite de la satelii i impuritile anodului, care simplific analiza spectral; Eliminarea Bremsstrahlung i a radiaiei termale de la sursa de raze X, care reduce semnificativ uzajul indus asupra sursei; Un spot de raze X focalizat pe prob crete sensibilitatea n XPS pe probe mici. 418

B)

Monocromatizarea prin difracia pe cristal

Figura 16. Configuraia monocromatorului cristalin elipsoidal

Cristalele de cuar individuale sunt folosite n procesul de monocromatizare. Cnd razele X, de lungime de und cad pe cristal sub unghiul de inciden , are loc o interferen constructiv dup mprtiere numai dac drumurile pariale ale undelor pe plane difer printr-un numr ntreg de lungimi de und. Situaia este explicat de ecuaia lui Bragg: 2d cos = n n termenii energiei avem: 2dE cos = n 1239,8419 nm eV Din cele dou ecuaii rezult, lund 2d = 0,851243 nm, pentru Al K unghiul de difracie 2 = 23,149 i pentru Ag L, 2 = 25,096. O surs de raze X divergent, va fi focalizat dac sursa, focarul i suprafaa oglinzii, se afl pe un cerc. Cercul Rowland este o condiie geometric pentru reflexie. Exist dou cerine pentru ca difracia de raze X s aib loc n concordan cu legea lui Bragg: 1. Toate punctele de pe suprafaa cristalului, unghiurile de inciden 1 i unghiurile de reflexie 2, trebuie s fie la fel ca i cele din planul de reflexie. 2. Toate punctele de pe suprafa i unghiul de reflexie 2 al razei, trebuie s fie constante. 419

Condiia de reflexie necesit ca sursa i proba s se afle pe cercul Rowland, iar planele reflectoare ale cristalului s fie concave, cu raza egal cu diametrul cercului Rowland i s fie tangeniale la cercul Rowland n punctul c (figura 15). Legea lui Bragg presupune ca unghiul de reflexie s fie independent de punctul reflexiei. Ambele condiii sunt ndeplinite doar pentru reflexia simetric din punctul c. Sursa de raze X, XR M 50 este echipat cu o lentil electrostatic care focalizeaz electronii pe anod. Poate fi operat n dou moduri diferite. Pentru fluxuri nalte, poate fi operat n modul non-focalizare, unde se produce o lrgire datorat diametrelor finite ale spotului sursei de raze X. n modul de focalizare, lrgirea datorat sursei este neglijabil. Exist numeroase ajustri date pentru montajul optic. Aliniatorul sursei de raze X i d voie utilizatorului s poziioneze anodul pe cercul Rowland. Ansamblul cristalului poate fi nclinat n dou direcii i mutat pe direcia y pentru a duce suprafaa cristalului pe cercul Rowland.

Figura 17. Profilul Gaussian al peak-ului de difracie al unei raze monocromatice (Al K)

Curba intensitate-unghi de difracie pentru un anumit tip de cristal este cunoscut sub numele de rocking curve. Pentru monocromatorul elipsoidal FOCUS 500 sunt folosite doar cristale cu = 10" . Diferena din ecuaia Bragg duce la expresia pentru rezoluia intrinsec a oglinzii: Rezoluia energetic intrinsec la o anumit aliniere a planurilor cristalelor este
E=n (cos)2

1456,7 eV

Pentru Al K, rezoluia energetic intrinsec a FWHM este 167 meV, iar pentru Ag L este de 344 meV.

420

2.2.3. Informaii generale n legtur cu sursa XR 50 M 2.2.3.1. Modul de focalizare

n contrast cu sursa standard XR-50, sursa XR-50 M este echipat cu o lentil electronic n capul sursei. Aceast lentil poate focaliza electronii care se fixeaz pe anod i astfel este obinut un spot de raze X de mrime variabil. Fiecare anod poate opera n modul de focalizare sau non-focalizare. Aceasta d un total de patru moduri de operare pe anod: 1. Ag non-focalizat (anod 1N); 2. Al non-focalizat (anod 2N); 3. Ag focalizat (anod 1F); 4. Al focalizat (anod 2F). Dac modul de focalizare este activat, spotul sursei de raze X pe anod este de 3.5 x 0.5 mm2. Datorit mrimii mici a sursei, rezoluia maxim a monocromatorului de 0.25 eV poate fi atins pentru Al K. n modul non-focalizare, mrimea spotului de raze X pe anod este 3.5 x 4 mm2 i sursa de raze X poate fi folosit la putere maxim. Figura urmtoare arat lrgimea spotului pe prob n funcie de tensiunea de focalizare, UL:

Figura 18. Lrgimea spotului de raze X n functie de

Puterea maxim i tensiunea corespunztoare UL pentru anozii de Al i Ag, pot fi setate n interiorul sursei XRC 1000 M. Pentru condiiile optime de focalizare, UL trebuie s varieze liniar cu tensiunea pe anod. Aceast relaie este setat automatic de ctre sursa XRC 1000 M.

421

2.2.3.2. Rcirea cu ap Ca agent de rcire pentru XR-50 M se folosete apa. Disiparea maxim de putere pe anod a sursei de raze X, poate fi obinut doar dac presiunea de rcire a apei este mai mare dect 3.5 bar (de obicei 5-6 bar) i dac debitul este de aproximativ 2.5-3.5 l/m. Temperaturi mai mici dect temperatura camerei vor duce la condensarea apei i fenomene de descrcare n interiorul conductei de ap sau al nveliului de protecie. Temperaturile nalte au ca i consecin suprasolicitarea, de exemplu evaporarea materialului anodului sau n cel mai ru caz, fisurarea anodului i eliberarea apei n camera de vid.

3. Flood-Gun 15/40
3.1. Informaii generale
Flood-Gunul FG 15/40 a fost conceput pentru neutralizarea general a sarcinilor probelor, a izolatorilor ncrcai pozitiv, sau semiconductorilor, i este folosit special pentru aplicaii XPS. Fasciculul de energie poate varia ntre 0 i 500 eV. Curentul de emisie poate varia de la 0 la 5 mA. 3.1.1. Componente:

1. Filament; 2. Lentile extractoare; 3. Anod. Tensiunea i curenii necesari pentru operaia FG-ului sunt asigurate cu PS FG 20. Diagrama operaional i conexiunile electrice ale Flood-Gun-ului sunt artate n figura urmtoare:

Figura 19. Diagrama operaional

422

Energia este controlat manual;

Voltajul de extracie nu este selectabil de ctre utilizator; Curentul de emisie este independent de energie i este controlat manual

4. Bibliografie
Cardona M and Ley L (ed) 1978 Photoemission n Solids I (Topics n Applied Physics vol 26) (Berlin: Springer) 2. Hfner S 2003 Photoelectron Spectroscopy.Principles and Applications 3rd edn (Berlin: Springer) 3. Feuerbacher B, Fitton B and Willis R F 1978 Photoemission and the Electronic Properties of Surfaces (Chichester: Wiley) 4. Kevan S D (ed) 1992 Angle Resolved Photoemission - Theory and Current Applications (Studies n Surface Science and Catalysis) 74) (Amsterdam: Elsevier) 5. Schattke W and Van Hove M A (ed) 2003 Solid-State Photoemission and Related Methods: Theory and Experiment (Weinheim: Wiley-VCH Dec.) 6. Turner, D. W.; Jobory, M. I. Al (1962). "Determination of Ionization Potentials by Photoelectron Energy Measurement". The Journal of Chemical Physics 37:3007 7. Shockley W 1939 On the surface states associated with a periodic potential Phys. Rev. 56 317-23 8. Davison S G and Steslicka M 1992 Basic Theory of Surface States (Oxford: Oxford University Press) 9. Reinert F, Eltner B, Nicolay G, Forster F, Schmidt S and Hfner S 2004 The electron-phonon selfenergy of metallic systems determined by angular resolved high resolution photoemission Physica B 351 229-34 10. Ashcroft N W and Mermin N D 1988 Solid State Physics (Philadelphia, PA: Saunders College) 11. Matzdorf R, Meister G and Goldmann A 1993 Temperature-dependent photoemission spectra from Cu(1 0 0) and Cu(1 1 1) surfaces Surf. Sci. 286 56-65 1.

423

Studiul prin spectroscopie fotoelectronic de raze X a suprafeelor diferitelor tipuri de materiale

C.S.III. dr. Teodora Maria Radu, C.S.dr. Emilia Sabina Varga Cuprins
1. Introducere ..........................................................................................................................424 2. Bibliografie ..........................................................................................................................436

1. Introducere
Spectroscopia XPS este o tehnic de analiz foarte util n domeniul cercetrii avansate n tiina i tehnologia materialelor. Aceast metod permite determinarea elementelor care contamineaz o suprafa i uniformitatea compoziiei elementale la suprafa sau n adncime (depth profiling). De asemenea se poate folosi n analiza modificrilor care apar n chimia suprafeei unui material dup ce acesta a fost supus unor tratamente fizico-chimice. nregistrarea energiei cinetice i a numrului de electroni emii de la suprafaa materialului datorit aciunii razei X de energie h duc la obinerea spectrului XPS. Fiecare element determin un numr caracteristic de vrfuri XPS la valori caracteristice ale energiei de legtur care ne permit identificarea direct a elementelor care exist pe suprafaa investigat. Pentru a detecta numrul de electroni la fiecare valoare a energiei de legtur (energie cinetica) cu eroare minim, msurtorile XPS trebuie efectuate n condiii de vid ultra-nalt (UHV) din cauza distanei la care se afl instrumentele de detecie n instalaiile XPS, fa de suprafaa iradiat cu raze X. Este important de reinut c XPS detecteaz numai acei electroni care ajung n vidul din incinta echipamentului; mai exact cei care pleac din material de la o adncime de aproximativ 10-12 nm. Toi electronii fotoemii de la adncimi mai mari n urma penetrrii materialului de ctre radiaia X (aprox. 1-5 m) sunt recapturai sau blocai n diferite stri de excitare n interiorul materialului. Pentru majoritatea aplicaiilor este de fapt o metod nedistructiv prin care se determin chimia suprafeei oricrui material. La baza cuantificrii unui spectru XPS obinut st presupunerea c numrul electronilor nregistrai este proporional cu numrul de atomi ntr-o stare dat. Instrumentul de baz pentru msurarea numrului de 424

electroni nregistrai pentru o stare atomic este regiunea de cuantificare. n marea majoritate a cazurilor primul pas n analiza probei este acela de a nregistra spectrul pe scala energetic maxim disponibil a spectrometrului pentru a determina elementele prezente pe suprafa (survey analysis). Resursele software ajut la o analiz cantitativ (concentraia relativ a tuturor elementelor prezente pe suprafa ) cu o precizie acceptabil dup 2-3 baleiaje a scalei energetice. Trebuie menionat c acest tip de analiz se realizeaz maximiznd semnalul obinut (sensibilitatea) cu preul degradrii rezoluiei. Spectrele de nalt rezoluie se nregistreaz pe domenii energetice restrnse (10-15 eV) micornd fereastra energetic, prin aceasta micornd transmisia analizorului i, n consecin, crescnd rezoluia energetic. n acest caz numrul de scan-uri pe aceast plaj energetic ngust va fi mai mare (1020 baleiaje) pentru c sensibilitatea scade cu creterea rezoluiei. Cu ajutorul acestor spectre (high resolution spectra) se identific strile chimice ale elementelor detectate (deplasrile chimice) din poziia i forma liniilor spectrale. n aceste spectre de nalt rezoluie apar structurrile secundare care ne permit studiul complex al elementelor n nconjurarea lor chimic i structural. n figura 1 este ilustrat un spectru survey analizat folosind un tabel de cuantificare din baza de date a software-ului de prelucrare a datelor (Casa XPS) pentru regiunile selectate. Obiectivele principale ale regiunii de cuantificare sunt: definirea domeniului de energie n care semnalul poate fi atribuit tranziiei de interes i specificarea tipului de aproximaie adecvat pentru eliminarea semnalului de fond care nu aparine vrfului de interes. Aadar, din spectrele XPS se pot obine concentraiile relative ale elementelor pe suprafa ca de exemplu: x%Si, Y%C, Z%O, etc., concentraiile relative ale strilor de oxidare ale unui singur element ( x% Si4+, Y%Si3+, z%Si2+, t%Si1+) sau concentraiile relative ale strilor chimice prezente pe suprafa (x%Si4+, y%Si3+, z%O, t% C-C). Pentru a realiza msurtori de ncredere i pentru a putea face intercompararea rezultatelor cu alte laboratoare, calibrarea cu exactitate a scalei energetice i a scalei de intensitate este crucial. Mai mult, capacitatea de calibrare a scalei de energie este dependent de capacitatea de compensare a sarcinii pozitive acumulate la suprafaa probei n timpul msurtorii i de disponibilitatea unei linii spectrale la o energie de legtur cunoscut care s poat constitui un etalon pentru deplasarea scalei de energie. Cu excepia cazului cnd electronii emii sunt nlocuii, proba se va ncrca relativ la suportul de prob avnd ca efect apariia unui cmp electric de ntrziere la suprafaa probei care determin deplasarea spectrului spre energii cinetice 425

Figura 1 Exemplificare spectru XPS cuantificat pe o prob cu coninut de C, O, Ca, B, Si i Mg.

mai mici (energii de legtur mai mari). Pentru probe conductoare conectate electric la suport echilibrul de sarcin este restabilit uor; pentru materialele izolatoare electronii emii trebuie nlocuii de la o surs extern - un tun de electroni de energie joas (flood gun) pentru a restabili o stare de echilibru d.p.d.v. electric. Pentru ilustrarea acestui efect, figura 2 prezint spectrul unei probe nregistrat nainte i dup compensarea de sarcin [1]. Linia spectral a carbonului, C1s, este deplasat cu 120 eV ntre cele doua situaii (cu compensare de sarcina i fr). n absena compensrii efective de sarcin , energia masurat pentru o linie fotoelectric poate varia n funcie de energia cinetic a electronilor. Este important de menionat c, compensarea de sarcin nu nseamn neaprat neutralizarea suprafeei probei ci mai mult stabilizarea suprafeei probei a. . forma liniilor spectrale sa fie cea mai bun concomitent cu asigurarea c distana dintre vrfuri ntre tranziii este inde426

pendent de energia la care sunt msurai electronii. Obinerea unei energii de legtur corecte pentru o tranziie cunoscut nu e neaprat un indicator al unei bune neutralizri de sarcin. Un experiment n care compensarea de sarcin este fcut corespunztor necesit de obicei deplasarea n energia de legtur folosind pagina Calibration property din programul de cuantificare al spectrelor, Casa XPS, ns forma vrfurilor este bun i poziiile relative ale vrfurilor sunt stabile. Straturile de oxid pe materialele metalice pot transforma un material conductor ntr-o suprafa izolatoare care astfel necesita tratarea lor ca un material izolator. De exemplu, metalul Al oxideaz chiar i n vid iar stratul subire de oxid se comport ca un izolator.

Figura 2 Efectul compensrii de sarcin n spectrul XPS, [1], pe o proba cu coninut de C, Si i O: a) n absenta neutralizrii (flood gun off), spectrul este deplasat cu 120eV i distorsionat b) n prezena neutralizatorului de sarcina dar cu parametrii de lucru selectai incorect, vrfurile sunt largi, acumularea de sarcina este compensat insuficient c) Suprafaa probei neutralizat corect; vrfurile au forma foarte ngust

Msurtorile XPS prezentate mai jos reprezint sinteza unor studii complexe pe diferite tipuri de materiale, concretizate deja n lucrri tiinifice importante, cu scopul de a pune n eviden performanele tehnice ale echipamentului folosit. Mai mult, aceste msurtori furnizeaz informaii relevante despre limitele i posibilitile de mbuntire ale acestei tehnici de analiz. Msurtorile au fost realizate cu ajutorul unui echipament de tip SPECS PHOIBOS 150 MCD echipat cu o surs AlK monocromatic (h=1486.6 eV). Avantajele utilizrii monocromatorului sunt: reduce semni427

ficativ fondul de radiaie, elimin sateliii din spectru (vrfuri secundare care nsoesc tranziiile de interes) , asigur o rezoluie energetic i spaial foarte bun. Proba care urmeaz a fi analizat este fixat pe un suport de molibden cu ajutorul unei benzi dublu adezive de carbon. Msurtorile se realizeaz utiliznd o surs de raze X de putere 250 W. Presiunea n camera de analiz este n intervalul 10-9- 10-10 mbar. Materialele oxidice cu structur vitroas pe baz de Bi2O3 prezint interes foarte mare att din punct de vedere tiinific ct i tehnologic deoarece prezint proprieti fizice mai bune dect alte sticle: coeficieni de expansiune termic mari, temperatur de topire joas, transmisie n ultraviolet (UV) i caracteristici optice. n acest studiu sunt comparate rezultatele XPS obinute pentru sistemul (1-x) B2O3xBi2O3 cu x = 25 65 cu echipamentul descris mai sus, cu cele obinute i publicate recent [2] n literatura de specialitate cu un echipament similar, pe acelai tip de probe. Autorii au propus descompunerea spectrelor O1s obinute pentru acest sistem n dou componente : O1 asociat legturilor de tip B-O-B i O2 atribuit legturilor B-O-Bi i Bi-O-Bi. n Fig. 3a este prezentat descompunerea spectrului O1s urmrind scenariul propus n literatur. Prin msurarea probei B2O3 autorii au determinat poziia vrfului O1s la o valoare a energiei de legtur de 533.2 eV, indicat n fig.3a prin linia punctat. Se observ c, cu creterea lui x, spectrul O1s se deplaseaz spre energii de legtur mai mici, a. . prezena
O1s as prep x=0.875

O1s

as prep x=0.875

Intensitate ( u. a. )

x=0.6

x=0.6

x=0.375
O3 O2

x=0.375

(a)

O1

(b)

540 535 530 525 520 Energie de legatura (eV)

540

535

530

525

520

Energie de legatura (eV)

Figura 3 Deconvoluia spectrului O1s de nalt rezoluie: (a) aa cum a fost sugerat in literatur; (b) propus n studiul nostru

428

componentei B-O-B n spectru, nu mai poate fi clar evideniat. innd cont de echipamentul de nalt rezoluie utilizat n achiziionarea acestor spectre (sursa -AlK- monocromata) n laboratorul nostru, i de valorile energiilor de legtur ale oxigenului n B2O3 i Bi2O3 raportate n literatur [3], s-a reuit o analiz mult mai detaliat a tipurilor de legturi i a modificrilor care apar la nivelul acestora n probe cu creterea coninutului de Bi. n Fig. 3b este prezentat deconvoluia spectrului O1s cu trei componente: O1, O2 i O3 atribuite legturilor de tipul B-O-B, Bi-O-B i Bi-O-Bi. Se observ c, cu creterea coninutului de Bi, concentraia legturilor de tip Bi-O-Bi crete, n timp ce componenta atribuit legturilor de tip B-O-B scade continuu a. . pentru proba cu x = 0.875, spre deosebire de [3], aceast component nu mai poate fi pus n eviden. Spectrul O1s pentru aceast prob const din dou componente atribuite legturilor de tipul Bi-O-B i Bi-O-Bi. Bi2O3 devine aadar formator de reea vitroas ceea ce determina creterea stabilitii chimice a probelor. Astfel, acest studiu confirm faptul c rezoluia spectrelor nregistrate are un rol foarte important n analiza i modul de interpretare a datelor. O categorie de probe pe care au fost efectuate msurtori XPS n scopul evalurii modificrilor structurale induse la suprafaa acestor sisteme prin aplicarea tratamentelor termice o reprezint nanocompozitele pe baz de Si i Ti preparate prin combinarea metodei sol-gel cu metoda uscrii prin pulverizare. Acest tip materiale a atras o atenie deosebit n ultimii ani [4, 5] n special pentru aplicaii de fotocataliz, deoarece prezint o fotoactivitate mult crescut fa de oxidul de titan pur. Rezultatele XPS obinute pentru sistemul cu raport Ti:Si 1:2, indic prezena oxigenului i a carbonului de contaminare, mpreun cu Ti, Si i Gd, dup cum se poate observa din spectrul survey prezentat n Fig. 4A. Fotopicul O1s prezint o form complex, asimetric datorit suprapunerii mai multor componente specifice oxigenului din structura sistemului investigat (Fig. 4B). Prin creterea temperaturilor de tratament termic acesta se deplaseaz de la 530.84 eV pentru proba netratat termic, la 532.83 eV pentru cea tratat la 1400 eV. ncepnd cu proba tratat termic la 700C, vrful corespunztor oxigenului din reeaua TiO2 (Ti-O-Ti) prezent n jurul valorii de 530.5 eV i cel corespunztor oxigenului n reeaua SiO2 (Si-O-Si) observat la 532.8 eV sunt bine separate (Fig. 4B), indicnd o segregare a celor doua faze, cu preponderena fazei de siliciu la suprafa. Analiza fotopicului Si 2p (102 eV) identific formarea SiO2 (Fig. 4C), iar spectrul de nalt rezoluie corespunztor Ti 2p pentru substratul de Ti:Si 1:2 (Fig. 4D), indic prezena TiO2 evideniat 429

Ti LMM

C KLL Gd 3d

O KLL

O 1s
Gd 4d

(A )
Si 2p
C 1s

(B) (f) (e) (d) (c) (b) (a) 545 540 535 530 525

Intensitate (u.a.)

Ti 2p

(f) (e ) (d ) (c ) (b ) (a ) 1200 900 600 300 0

E n e r g ie d e le g a t u r a ( e V )

Energie de legatura (eV)

(C)

(D) (f) (e) (d) (c) (b) (a)

Intensitate (u.a.)

(f) (e) (d) (c) (b) (a) 110 105 100 95 90

470

465

460

455

450

Energie de legatura (eV)

Energie de legatura (eV)

Figura 4A: Spectrele XPS survey pentru sistemul Ti:Si 1:2 (a) netratat termic, respectiv tratat termic la (b) 350C, (c) 700C, (d) 900C, (e) 1100C i (f) 1400C .Spectrele XPS de nalt rezoluie corespunztoare (B) O 1s, (C) Si 2p, (D) Ti 2p, pentru (a) proba netratat termic precum i pentru probele tratate termic la (b) 350C, (c) 700C, (d) 900C, (e) 1100C i (f) 1400C.

prin peak-ul de la 459.0 eV (Ti 2p3/2) i 464.5 eV (Ti 2p1/2). Formarea celor doi oxizi (SiO2 i TiO2) este confirmat i de forma vrfului O 1s (Fig. 4B). Dup cum se poate observa din Tabelul 1, cantitatea de Ti 2p la suprafa descrete de la 12.28 % pentru proba netratat termic, la 2.89 % pentru proba tratat termic la 1100C, n timp ce cantitatea de Si 2p crete de la 16.87 % la 38.05 %. Acest fapt poate fi explicat printr-o migrare a titanului de la suprafa spre interior i a siliciului din interior spre suprafa, reflectndu-se astfel o substituie a atomilor de Ti de ctre atomi cu o electronegativitate mai mare i polarizabilitate mai mic, cum sunt atomii de Si n reeaua SiO2. Cantitatea de oxigen la suprafaa probelor descrete odat cu creterea temperaturii de tratament, fapt datorat ndeprtrii oxigenului specific compuilor organici sau gruprilor OH, dar mai ales separrii celor dou faze.

430

Tabel 1. Concentraia relativ a principalelor componente, nainte i dup tratamentul termic, pentru sistemul Ti:Si 1:2.
Temperatura de tratament termic (C) Netratat termic 350 700 900 1100 1400 Compoziia elemental (% at.) O 1s 70.688 64.428 62.684 62.640 58.829 59.331 Ti 2p 12.281 11.260 9.367 7.549 2.894 5.498 Si 2p 16.875 24.164 27.76 29.653 38.057 34.798 Gd 3d 0.156 0.148 0.18 0.15 0.22 0.37

Spectrele de nalt rezoluie corespunztoare Si 2p (Fig. 4B) sunt de asemenea deplasate spre energii de legtur mai mari, de la 101.43 eV pentru proba netratat termic la 102.9 eV pentru proba tratat termic la 1400C. Motivul acestei deplasri este corelat cu deplasarea spectrelor O1s i cu migrarea atomilor de Si spre suprafa odat cu creterea temperaturii de tratament termic. XPS ne permite de asemenea studiul biocompatibilitii diferitelor tipuri de materiale. Biocompatibilitatea este dictat de modul n care proteinele se adsorb la suprafaa materialului odat ce acesta intr n contact cu mediul biologic. Pentru exemplificare sunt prezentate caracteristicile de adsorbie a albuminei serice bovice (BSA) i a fibrinogenului (Fg) la suprafaa unui compus aluminosilicatic cu coninut de Fe i Y preparat prin metoda sol-gel (60%SiO220%Al2O310%Fe2O310%Y2O3 - procente molare). Ceramicele vitroase aluminosilicatice sunt foarte stabile n organism iar prin adugarea oxidului de fier i ytriu ele pot fi optimizate pentru aplicaii simultane de hipertermie i radioterapie [6]. Experimentele de adsorbie a proteinelor s-au realizat prin imersarea compusului aluminosilicatic n lichid biologic simulat (SBF) mbogit cu BSA, precum i n soluie tampon fosfatic (PBS) mbogit cu Fg. BSA i Fg reprezint principalele componente plasmatice i proteinele relevante care se adsorb la suprafaa biomaterialelor care intr n contact cu sngele. Dup procedura de imersie, probele splate i uscate au fost analizate cu ajutorul spectroscopiei XPS. Spectrul XPS survey nregistrat nainte de imersie prezint doar fotopicuri corespunztoare elementelor care intr n compoziia sistemului (Y 3p, Fe 2p, Si 2p i Al 2p) pentru toate probele investigate, excepie fcnd fotopicul de C 1s (Fig. 5 (A, B)). Prezena carbonului se explic prin expunerea probei la atmosfer, dar i datorit benzii dublu adezive de carbon pe care a fost imobilizat proba pentru msurare. Pentru msurtori ulterioare pe probe funcionalizate cu diverse tipuri de proteine este reco431

mandat utilizarea benzii de In n locul celei de C. Este de remarcat faptul c pentru suprafeele funcionalizate cu proteine, detecia elementelor Y 3p, Fe 2p, Si 2p i Al 2p a fost mai puin evident datorit stratului de protein format (Tabel 1, 2). Rezultate similare au fost obinute pentru ambele proteine (BSA/Fg) utilizate pentru funcionalizare.
O 1s O KLL C KLL

N 1s Y 3p C 1s Si 2s Si Al 2p 2p

(A)
O KLL C KLL Fe 2p

O 1s C 1s

(B)
N 1s

Intensitate (u.a.)

Fe 2p

Y 3p

Intensitate (u.a.)

(d) (c) (b) (a)

Si 2s Si 2p Al 2p O 2s

(d) (c)

(b) (a)

1200

800

400

1200 1000 800

600 400

200

Energie de legatura (eV)

Energie de legatura (eV)

Figura 5 Spectrele XPS survey nainte de imersie (a) i dup 5 minute (b), 2 ore (c) i 24 ore (d) de imersie n soluiile de SBF/BSA (A) i PBS/Fg (B).

n acelai timp, analiza spectrelor survey indic fotopicuri corespunztoare N 1s, datorit azotului prezent n fiecare aminoacid component al proteinelor. Msurtorile XPS de concentraie de azot pot fi utilizate i ca metod indirect de determinare a cantitii de protein adsorbit la suprafa [7]. Deoarece, concentraia de azot a fost practic zero nainte de imersie n soluiile cu protein (Tabel 2, 3), azotul poate fi utilizat ca un indicator sigur al atarii proteinelor. Rapoartele N:C de 0.2 respectiv 0.5, nregistrate deja dup un timp de imersie de 5 minute, denot o ataare rapid a proteinei la suprafaa compusului. Deconvoluia spectrelor de N 1s (Fig. 6) de nalt rezoluie scoate n eviden dou componente, centrate la 398.2 i 400 eV, caracteristice gruprilor C-NH2. Fotopicul N 1s nregistrat la aproximativ 400 eV este tipic pentru azotul din compuii organici [8].
Tabel 2. Concentraia relativ a principalelor componente, nainte i dup imersia n soluiile de SBF/BSA.
Timpul de imersie 0 5 min 2 ore 24 ore C 6.92 28.43 28.93 33.21 N 5.68 6.46 6.67 Compoziia elemental (% at.) O Al Si 53.08 37.7 37.21 35.16 2.3 2.19 1.71 1.54 36.77 25.47 25.2 23 Fe 0.18 0.04 0.03 Y 0.75 0.49 0.46 0.42

432

Tabel 3. Concentraia relativ a principalelor componente, nainte i dup imersia n soluiile de PBS/Fg.
Timpul de imersie 0 5 min 2 ore 24 ore Compoziia elemental (% at.) C 6.92 43.11 51.81 48.53 N 10.69 11.5 13.52 O 53.08 29.26 23.25 27.83 Al 2.3 0.8 0.41 0.1 Si 36.77 15.96 13.02 10.02 Fe 0.18 0.02 0.01 Y 0.75 0.16 -

Analizele XPS confirm creterea coninutului de azot dup diferite perioade de imersie. n plus, aa cum este de ateptat, proteina mai mare, (Fg), produce un semnal de azot mai intens dect proteina mai mic, (BSA).
Intensitate (u.a.) (c)

(c)

410

405

400

395

390

410

405

400

395

390

Energie de legatura (eV)

Energie de legatura (eV)

(b) (b)

Intensitate (u.a.) 410

405

400

395

390

410

Energie de legatura (eV)

(a)
Intensitate (u.a.)

405 400 395 Energie de legatura (eV)

390

(a)

410

405

400

395

390

410

405

400

395

390

Energie de legatura (eV)

Energie de legatura (eV)

Figura 6 Deconvoluia spectrelor XPS de nalt rezoluie ale N 1s pentru BSA/Fg liofilizat (a) dup 5 minute (b), i 24 ore (c) imersie n soluiile de SBF/BSA (coloana stng) i PBS/Fg (coloana dreapta).

433

Potrivit rezultatelor publicate anterior privind adsorbia proteinelor, o cantitate de 14% N, n cazul Fg-ului (Tabel 3), este un indicativ al formrii unui monostrat complet de protein [9].
(A)

(B)

Intensitate (u.a.)

(e) (d) (c) (b) (a)

Intensitate (u.a.)

(e) (d) (c) (b) (a)

292 288 284 280 276 272 Energie de legatura (eV)

292 288 284 280 276 272 Energie de legatura (eV)

Figura 7 Spectrele XPS de nalt rezoluie ale C 1s nainte de imersie (a), ale C 1s pentru BSA/Fg liofilizat (b) precum i dup 5 minute (c), 2 ore (d) i 24 ore (e) imersie n soluiile de SBF/BSA (A) i PBS/Fg (B).

n cazul probelor imersate n soluiile cu protein, semnalele de nalt rezoluie ale C 1s (Fig. 7) sunt mai largi i prezint o form asimetric, semnalnd formarea unor noi tipuri de legturi specifice carbonului n proteine [8]. Dup imersia n soluiile cu proteine, fotopicul O 1s este evident lrgit i se deplaseaz spre energii de legtur mai mici, pe baza componentei BSA-ului de la 530.3 eV, respectiv Fg-ului la 531.2 eV (Fig.8). Dup imersia n soluiile cu protein, coninutul semnificativ diminuat al O 1s (Tabel 2, 3) corespunde n mare parte oxigenului peptidic constituent al proteinelor, datorit atarii la suprafa a BSA/Fg-ului cu un coninut sczut n oxigen fa de compusul oxidic utilizat (Fig.8B) Astfel spectroscopia XPS a fost utilizat cu succes n acest studiu, evideniind ataarea proteinelor la suprafaa materialului i totodat biocompatibilitatea materialului investigat [10-12].
(A) Intensitate (u.a.) (e) (d) (c) (b)
Intensitate (u.a.) (B) (e) (d) (c) (b)

(a) 545 540 535 530 525

545 540 535 530

(a) 525

Energie de legatura (eV)

Energie de legatura (eV)

Figura 8 Spectrele XPS de nalt rezoluie ale O1s nainte de imersie (a), ale O 1s pentru BSA/Fg liofilizat (b) precum i dup 5 minute (c), 2 ore (d) i 24 ore (e) imersie n soluiile de SBF/BSA (A) i PBS/Fg (B).

434

Biomaterialele dopate cu particule nano ( Au, Ag) prezint un interes crescut datorit caracteristicilor remarcabile ale acestora, ce deschid noi oportuniti n medicin. Acest tip de materiale furnizeaz avantaje valoroase i n diagnosticarea cancerului sau imagistica biomedical. Mai jos sunt prezentate rezultatele XPS cu privire la nucleaie i procesul de cretere a nanoparticulelor de Au n sticla bioactiv CaO-SiO2-P2O5 tratat termic la diferite temperaturi. Spectrul Au4f este caracterizat de dou componente spin-orbit, Au 4f7/2 i Au 4f5/2, avnd despicarea, E = 3.67 eV. Deconvoluia spectrului Au4f nregistrat pentru probele tratate termic la 300 i respectiv 500 C prezint trei dublei la energiile de legtur: 82, 83.72 i 85.95 eV, atribuii la trei specii de Au diferite: Au-, Au0 i Au+. Identificarea speciilor de Au prezente n probe este foarte important deoarece studii recente au demonstrat faptul c toxicitatea nanoparticulelor de Au n tratamentul cancerului depinde de sarcina acestora [13]. Acest studiu publicat recent, [14], are importan tiinific mare datorit faptului c demonstreaz foarte clar legtura care exist ntre dimensiunea nanoclasterilor care se formeaz n matrice i modificrile observate n spectrul Au4f i cel al benzii de valen cu creterea temperaturii de tratament a probei. Aceste rezultate furnizeaz dovezi experimentale complete pentru corelaia dintre dimensiunea i structura electronic a nanoparticulelor de Au care a fost prezis teoretic.
Au4f
0
E

0.6
T (C)

Au 5d
T(C) 500

500

0.3 0.0 0.6

Intensitate (u. a. )

300

300

0.3 0.0 0.6 0.3 0.0 16

(b)

110

(a) 92 90 88 86 84 82

110 80

12

Energie de legatura (eV)

Energie de legatura ( eV )

Figura 9(a) Spectrul XPS obinut pentru Au 4f pe proba 0.3Au2O399.7[61.5SiO230.8CaO7.7P2O5] tratat termic la 110, 300 i 500C; Deconvoluia liniilor spectrale indica prezena speciilor de Au Au+, Au0 i Au- n fiecare proba; (b) Spectrul XPS al benzii de valena (Au 5d) obinut pe aceleai probe. Linia gri reprezint spectrul obinut pentru fiecare din cele trei probe fr nanoparticule de Au.

435

2. Bibliografie
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Dual-Beam Charge Neutralisation for monoXPS T. Honma et al., Phys. Chem. Glasses, 43,32-40, 2002. V. Dimitrov et al., J. of Solid State Chem. 163, 100-112 (2002). V. Simon, O. Ponta, S. Simon, M. Neumann, J. Opt. Adv. Mat., vol. 10, No. 9, (2008) 2325 Oana Ponta, Structural characterization of some silicate xerogels and microspheres, PhD Thesis, December 2010 Overgaard J, Gonzalez Gonzalez D, Hulshof MCCH, Arcangeli G, Dahl O, Mella O, et al. Int J Hyperther 2009; 25:323-334. A. Arvidsson, F. Currie, P. Kjellin, Y.T. Sul, V. Stenport, J Mater Sci: Mater Med; 20:1869-1879, 2009. A. P. Serro, M.P. Gispert, M.C.L. Martins, P. Brogueira, R. Colaco, B. Saramago, J Biomed Mater Res;78A:581-589, 2006. R. Michel, S. Pasche S, M. Textor, D. G. Castner, Langmuir 2005; 21:1232712332. V. Simon, S. Cavalu, S. Simon, H. Mocuta, E. Vanea, M. Prinz, M. Neumann, Solid State Ionics, 180, 76476, 2009. V. Simon, S. Cavalu, M. Prinz, E. Vanea, M. Neumann, S. Simon, European Cells & Materials, 16, S1, 55, 2008. E. Vanea, V. Simon, XPS study of protein adsorption onto nanocrystalline aluminosilicate microparticles, Applied Surface Science, 257(2011) 2346-2352 L. C. Kennedy, L. R. Bickford, N. A. Lewinski, A. J. Coughlin, Y. Hu, E. S. Day, J. L. West, R. A. Drezek, A New Era for Cancer Treatment: Gold-Nanoparticle-Mediated Thermal Therapies. Small 7, 169-183, 2011 T. Radu, D. Benea, R. Ciceo-Lucacel, O. Ponta and S. Simon, J. Appl. Phys., doi:10.1063/1.3681307

14.

436

XII. SPECTROMETRUL DE REZONAN ELECTRONIC DE SPIN Spectroscopia de rezonan electronic de spin

C.S. dr. Milica Todea

3000

3100

3200

3300

3400

3500

3600

3700

m agnetic field

Cuprins
1. Consideraii teoretice .......................................................................................................... 437 1.1. Interaciunea Zeeman ................................................................................................. 438 1.2. Hamiltonianul de Spin ............................................................................................... 441 2. Obinerea i analiza spectrelor RES .................................................................................... 443 3. Caracterizarea instalaiei experimentale RES ..................................................................... 447 3.1. Principiul de funcionare al unui spectrometrul RES................................................. 447 3.2. Spectrometrul portabil RES ADANI PS8400 ............................................................ 447 3.3. Exemple de spectre RES achiziionate cu ajutorul spectrometrului portabil ADANI PS8400 ......................................................................................................... 449 4. Bibliografie .......................................................................................................................... 451

1. Consideraii teoretice
Rezonana electronic de spin este o metod larg utilizat n descrierea strilor fundamentale i caracterizarea efectelor vecintii asupra nivelelor energetice ale centrilor paramagnetici. RES este o metod sensibil la poziiile atomilor n structur i permite studiul simetriei locale. Metoda const 437

n studiul tranziiilor dintre nivelele electronice ale atomilor n prezena unui cmp magnetic extern [1,2]. Astfel, spectroscopia RES este capabil s furnizeze detalii de structur molecular inaccesibile altor metode analitice. Aceasta se datoreaz faptului c momentul magnetic de spin al electronului nemperecheat este foarte sensibil la cmpurile magnetice locale din interiorul probei. Aceste cmpuri de obicei provin de la momentele magnetice nucleare ale diferiilor nuclei care pot fi prezeni n vecinti (de exemplu, atomii interstiiali dintr-un cristal sau matricea unei sticle, etc.). n cazul experimentelor de Rezonan Magnetic Nuclear (RMN), frecvenele utilizate sunt de ordinul megahertzilor (MHz) din domeniul vizibil la cel ultraviolet. Frecvena de ordinul gigahertzilor (GHz), n domeniul microundelor, este folosit n cazul experimentelor RES. De-a lungul anilor, spectroscopia RES a fost cu succes aplicat n diverse domenii ca biologie, fizic, geologie, chimie, tiinele medicale, tiina materialelor, antropologie, etc. Solidele, lichidele i gazele sunt deopotriv accesibile spectroscopiei RES. Prin utilizarea unor tehnici specializate variate (cum ar fi metoda capcanelor de spin i a radicalilor nitroxidici, ESEEM i ENDOR) n conjuncie cu RES este posibil s se obin informaii detaliate privind unele teme de interes tiinific. De exemplu, procesele de cinetic, schimbul electronic, procesele electrochimice, structura cristalin, cataliza i reaciile de polimerizare au fost toate studiate cu mare succes. Sistemele tipice care pot fi studiate prin RES sunt: 1. Radicalii liberi n stare solid, lichid sau gazoas; 2. Defecte punctuale (imperfeciuni localizate n cristale) n solide; cel mai cunoscut din aceast clas este centrul F, un electron prins ntr-o vacan ionic negativ; 3. Biradicalii (molecule ce conin doi electroni nemperecheai, suficient de deprtai unul de altul, astfel nct interaciunea lor s fie slab); 4. Sisteme cu stare fundamental de triplet (cu doi electroni nemperecheai care interacioneaz puternic); 5. Sisteme cu trei sau mai muli electroni nemperecheai; 6. Ioni ai metalelor tranziionale i ai pmnturilor rare [1, 2]; 7. Sisteme cu electroni de conducie (metale i semiconductori).

1.1. Interaciunea Zeeman

Metoda RES const n studiul tranziiilor induse ntre dou subnivele Zeeman vecine, sub aciunea unui cmp de microunde cu o anumit frec438

ven numit frecven de rezonan [1]. Diferena de energie n spectroscopia RES este predominant datorat interaciunii electronilor nemperecheai din probe cu cmpul magnetic produs de un magnet, efect denumit efect Zeeman. n urma absorbiei de energie electronii trec de pe nivelul de energie inferior pe unul superior, orientarea spinului trecnd din cea paralel cu cmpul n poziia antiparalel cu acesta. Astfel, se cunoate faptul c electronul posed o proprietate cuantic numit spin, care este privit clasic ca o rotaie n jurul propriei axe. Ca urmare a acestei rotaii electronul posed un moment cinetic de spin S cruia i se asociaz un moment magnetic S :

S = g S

(1)

unde g este factorul Land care pentru electronul liber are valoarea 2.0023, iar este raportul giromagnetic electronic; S - este momentul cinetic de spin. Introdus ntr-un cmp magnetic static B, spinul electronului poate avea dou orientri, paralel sau antiparalel cu cmpul magnetic. Diferena dintre cele dou direcii ale spinului, n energie, depinde de intensitatea cmpului magnetic aplicat. Energia interaciunii Zeeman a unui electron ntr-un cmp magnetic aplicat B este dat de relaia:

E Zeeman = s B = g B M S
unde este magnetonul Bohr, netic de spin care poate lua valoarea M
S

(2)

= , iar MS este numrul cuantic mag= 1 2 . Astfel, ecuaia (2) poate

avea doar dou forme pentru o orientare dat a cmpului magnetic B:

1 E = + g B 2

1 E = g B 2

(3)

Regula de selecie pentru tranziia unui spin electronic este M S = 1 . Asemenea tranziii corespund la o schimbare n momentul unghiular de spin de ( ). Un foton are momentul unghiular intrinsec egal cu . Din aceast cauz dac M S = + 1 cnd un foton este absorbit

M I (numrul cuantic magnetic nuclear) trebuie s rmn neschimbat

pentru ca momentul unghiular total s se conserve. Astfel regulile de selecie impuse sunt M
S

= 1 i M I = 0 .

439

Cu alte cuvinte, spectrul RES msoar energia necesar tranziiei electronului (E) ntre cele dou nivele energetice, ntr-un cmp magnetic exterior. Aceast energie, de obicei se obine de la o surs de energie electromagnetic, avnd o frecven fix de oscilaie i deci energia (h). Rezult de aici condiia de rezonan: h = g B (4) unde h este constanta lui Planck, frecvena de rezonan, iar B cmpul magnetic aplicat. Parametrul g determin poziia liniei de absorbie. De obicei linia de absorbie nu este singular aprnd uneori un spectru de multiplei datorit existenei nucleelor magnetice n specia paramagnetic.

Figura 1. Nivelele energetice i absorbia de rezonan RES pentru interacia Zeeman a unui electron (S = 1/2)

n (Fig. 1) sunt reprezentate schematic energiile Zeeman funcie de magnetizarea cmpului aplicat B, n cazul unui electron nemperecheat (S=1/2). De asemenea, figura ilustreaz tranziia ntre nivelul de energie inferior spin jos i nivelul de energie superior spin sus indus prin introducerea probei n cmpul de microunde de frecven . Spectrul de absorbie msurat la condiia de rezonan este schematic reprezentat n partea de jos a figurii.

440

1.2. Hamiltonianul de Spin

Fenomenul RES poate fi tratat teoretic prin dou metode: tratarea clasic cu ajutorul teoriei lui Bloch i tratarea cuantic. Cel mai simplu formalism pentru interpretarea spectrelor RES este cel al hamiltonianului de spin. Starea unui ion paramagnetic avnd spinul nuclear nenul, introdus ntr-o reea cristalin i aezat ntr-un cmp magnetic static, este descris printr-un hamiltonian compus din mai muli termeni [1], i anume: H=H0+HLS+HSS+HZ+HN+HQ+HD+HC unde, H0 - reprezint energia ionului liber care nu depinde de spin; HLS este interaciunea spin orbit; HSS reprezint interaciunea de structur fin n aproximaia de ordin II (sau termenul de despicare n cmp nul); HZ reprezint interaciunea electronului cu cmpul magnetic exterior (termenul Zeeman); HN reprezint termenul interaciunii hiperfine; HQ interaciunea electrostatic cu momentul de cuadrupol q al nucleului; HD descrie proprietile diamagnetice; HC termenul cmpului cristalin i reprezint influena cmpului electrostatic cristalin. n esen hamiltonianul de spin este un operator echivalent care acioneaz numai asupra coordonatelor de spin conducnd la aceleai rezultate ca i hamiltonianul total al sistemului. Hamiltonianul de spin conine o serie de coeficieni care sunt mrimi tensoriale, deci depind de forma funciei de und i de cmpul cristalin. Toi coeficienii tensoriali din expresia hamiltonianului de spin se exprim prin matrici care pot fi diagonalizate. Folosind teoria perturbaiilor se ajunge la forma bine cunoscut a hamiltonianului de spin: 1 2 2 Hs = ( g xx S x Bx + g yy S y By + g zz S z Bz ) + D S z2 S (S + 1) + E (S x S y ) (6) 3 Primul termen din acest hamiltonian este aa numita interaciune Zeeman, iar ultimii doi sunt termenii ce dau structura fin. D i E reprezint constantele de despicare n cmp nul, axial, respectiv rombic. Dac simetria este axial, rmn n hamiltonian numai termenul Zeeman i termenul n D, termenul E fiind 0. 441 (5)

Cea mai simpl form a hamiltonianului de spin este pentru un singur electron cu g izotrop, fr interaciuni hiperfine corespunztor ecuaiei (4), i are urmtoarea form: H = g B SZ (7)

unde direcia cmpului magnetic este aleas ca fiind axa z, SZ este operatorul de spin corespunztor proieciei acestuia dup axa z. Pentru un singur electron cu g anizotrop hamiltonianul de spin este mai complicat din cauza diferiilor operatori ai proieciei spinului. De exemplu, pentru o simetrie axial hamiltonianul de spin are urmtoarea form: H = g // B Z S Z + g B X S X (8)

unde BZ este componenta cmpului magnetic de-a lungul axei z (paralel), BX este componenta cmpului magnetic de-a lungul direciei perpendiculare (x). Dac cmpul magnetic este direcionat paralel cu direcia axelor moleculare atunci situaia este identic cu relaia (7). Interaciunea dintre momentul magnetic de spin i un moment magnetic nuclear se numete interaciune hiperfin. Termenul HN (ecuaia 5) reprezint termenul interaciunii hiperfine. Hamiltonianul de structur hiperfin produce o despicare simetric a nivelelor energetice i are urmtoarea form: HN
~ = S A I

(9)

unde A este tensorul interaciunii hiperfine. Ordinul de mrime al energiei hiperfine este de 0 10-2 cm-1. Acest termen reprezint interaciunea momentului cinetic de spin I cu momentul de spin electronic S . Tocmai aceast interaciune produce structura hiperfin a nivelelor energetice de spin, descris de hamiltonianul de mai sus. Hamiltonianul de spin care descrie starea energetic a unui centru paramagnetic electronic n interaciune cu n nuclee cu spinul nuclear diferit de zero va fi: H =

~ B g S + S Ai I i
i =1

(10)

unde, n cazul unor simetrii nesferice att g, ct i Ai sunt mrimi tensoriale.

442

2. Obinerea i analiza spectrelor RES

n experimentele RES cele mai utilizate benzi de frecvene de microunde sunt benzile X ( 9.5 GHz) i Q ( 35 GHz). Deoarece sensibilitatea instrumentului crete proporional cu ptratul frecvenei, rezult c se obine o rezoluie spectral mult mai bun o dat cu creterea frecvenei de microunde. Totui, exist limitri tehnice legate de utilizarea benzilor de frecven ridicate: folosirea de probe de dimensiuni mici; dificulti de obinere a omogenitii cmpului (H/H) la frecvene mari; creterea absorbiei o dat cu creterea frecvenei, pentru probe sub form de soluii, ceea ce duce la scderea sensibilitii. Msurtorile RES se pot efectua pe probe gazoase, soluii ngheate, pulberi i monocristale. Probele se introduc de obicei n tuburi i, avnd n vedere posibilitile de absorbie i de a da semnal RES al sticlei obinuite, este indicat a se folosi cuarul. Tuburile au diametre de civa milimetri i lungimi de ordinul centimetrilor. Spectrul RES al unui centru paramagnetic cu spinul este bine definit dac se cunosc tensorii g (factorul de despicare spectroscopic) i A (constanta de despicare hiperfin). Aceti tensori dau cele mai importante informaii cu privire la structura centrului paramagnetic studiat. Factorul g este o mrime tensorial caracterizat prin trei valori principale. n expresia factorului g, n afara unei mrimi constante intervine o mrime care d abaterea factorului g de la valoarea corespunztoare electronului liber. Pentru un electron liber, valoarea factorului g este ge = 2.0023. Cu toate acestea n probele care conin centri paramagnetici intervin o serie de factori care abat valoarea factorului g de la valoarea amintit mai sus. Unul din factori este datorat faptului c electronul posed n plus un moment unghiular orbital cruia i se asociaz un moment magnetic. n felul acesta n sisteme cu un electron nemperecheat i legtur , momentul de spin i cel orbital se pot combina. Astfel, abaterea factorului g de la valoarea 2,0023, notat g, se datoreaz unui slab cmp perturbator indus, provocat de micarea orbital. Acest cmp perturbator se poate aduga sau scdea la cmpul exterior, obinnd o valoare a lui g pozitiv sau negativ. n sistemele chimice, electronii nemperecheai ocup un orbital care poate fi localizat pe un singur atom sau poate fi delocalizat pe o ntreag molecul sau pe un radical. Pentru radicalii liberi, g rmne apropiat de valoarea electronului liber. n celelalte cazuri, trebuie luate n considerare contribuiile la momentul magnetic ale micrii orbitale a electronului. Valoarea lui g definit prin 443

relaia g =

h , cunoscut i sub denumirea de g efectiv (gef ), poate fi B

diferit de 2,00 , mai rar scade mult sub aceast valoare, dar poate ajunge la 9,00 sau mai mult. n acest caz valoarea factorului g depinde de numerele cuantice J, L i S astfel:
g =1+ J ( J + 1) + S ( S + 1) L ( L + 1) 2 J ( J + 1)

(11)

unde J numrul cuantic total; S numrul cuantic de spin; L numrul cuantic orbital, iar aceast ecuaie reprezint formula lui Lande. n experimentele RES uzuale efectuate n und continu se fixeaz frecvena i se variaz inducia cmpului magnetic aplicat. De obicei se lucreaz n banda X, fiind necesar un cmp magnetic de 3300 G, pentru semnale cu g ~ 2.0. Astfel, factorul g este calculat din condiia de rezonan, utiliznd valorile msurate ale frecvenei i cmpului la rezonan. Valoarea lui g depinde de orientarea cmpului magnetic extern n raport cu cel electric cristalin i este o mrime tensorial. Pentru a determina valoarea factorului g mai uor, se poate introduce n cavitatea de rezonan pe lng proba de studiat i un etalon. Cel mai uzual radical utilizat ca etalon pentru marcarea cmpului magnetic este DPPH (difenilpicrilhidrazil), pentru care g = 2,0036. Astfel, valoarea lui g pentru un sistem paramagnetic oarecare se calculeaz utiliznd urmtoarea relaie:

g =

g etalon B etalon B proba

(12)

Exist posibilitatea de a combina metode n care pot fi ndeplinite mai multe condiii de rezonan pe lng cele referitoare la spinul electronic, de exemplu ENDOR (Electron Nuclear DOuble Resonance) i ELDOR (Electron Electron DOuble Resonance). Acestea sunt exemple de tehnici neliniare, deoarece ambele depind de saturaie [3]. n ceea ce privete forma i lrgimea semnalului RES, acestea sunt influenate att de caracteristicile fizico-chimice ale substanei paramagnetice, ct i de condiiile experimentale. Liniile de rezonan ale probelor solide sunt considerabil distorsionate de anizotropia factorului g sau de cuplajul dintre spinii electronici i nucleari. Prezena anumitor tipuri de interaciuni are ca efect lrgirea sau ngustarea liniei de rezonan. Impuritile paramagnetice pot de asemenea distorsiona semnalul RES, n particular prin alterarea timpului de relaxare spin-reea. 444

Dintre factorii instrumentali care pot influena forma semnalului RES, avem: neomogenitatea cmpului magnetic static B0, saturarea sistemului de spini cu o putere excesiv, neliniaritatea amplificatorului sau a detectorului, diversele scheme de modulaie utilizate pentru a crete detecia. Lrgirea liniei RES poate fi omogen sau neomogen. n cazul lrgirii omogene toi spinii din prob rspund ca o unitate aciunii cuantelor de microunde, absorbind cuantele la o valoare bine determinat a cmpului magnetic.

Figura.2 Forma Lorentzian i gaussian a liniilor RES

Dac numai anumite grupuri de spini sau pachete de spini din prob pot absorbi direct cuantele de o frecven particular, atunci linia este lrgit neomogen. Liniile lrgite omogen, aprute n urma unor fluctuaii dinamice n sistemul de spini (variabile n timp), sunt simetrice i au o form aproximativ Lorentzian (Fig.2). Aceast linie este ngust n zona central i are o descretere lent spre extreme. Cauzele care determin lrgirea neomogen sunt : interaciunea dipolar ntre spinii de acelai tip, relaxarea spin reea, interaciunea dintre spinul electronic i cmpul de microunde, difuzia de spin, fluctuaiile datorate micrii spinilor n cmpul magnetic local. Liniile lrgite neomogen sunt nfurtoarele liniilor lrgite omogen corespunztoare diferitelor pachete de spini, linii care au maxime de absorbie uor diferite ntre ele datorit distribuiei de cmp magnetic local n prob. Liniile lrgite neomogen, atunci cnd lrgirea nu este provocat de interaciunile anizotrope, se apropie de o form Gaussian. Cauzele lrgirii neomogene sunt fluctuaii spaiale de cmp magnetic i sunt datorate prezenei unor interaciuni hiperfine, dipolare dintre spini cu frecvene Larmour diferite, anizotropiei tensorilor g i de structura fin, neomogenitilor cmpului magnetic static. Pentru sistemele reale, linia de rezonan are n general o form intermediar ntre cele dou cazuri limit. 445

n cazul radicalilor liberi generai prin iradiere n sisteme biofarmaceutice i de interes biomedical, structura hiperfin a spectrelor RES (cnd este bine rezolvat) furnizeaz informaii mai importante despre radicali dect valoarea factorului g, deoarece majoritatea radicalilor detectai sunt radicali centrai pe carbon sau azot, iar poziia spectrelor este aproximativ aceeai n cmpul magnetic [4]. Studiile efectuate au pus n eviden la spectrele de rezonan ale radicalilor liberi, o serie de particulariti [1]: I. Factorul de despicare spectroscopic g are valoarea foarte apropiat de cea corespunztoare electronului liber (g = 2.0023); II. Prezena unei structuri hiperfine caracteristice, care permite n multe cazuri identificarea radicalilor liberi; structura fin lipsete pentru c spinul este egal cu ; III. Lrgimea liniei este de obicei mic. I. Valoarea factorului de despicare spectroscopic g apropiat de cea a electronului liber, arat c la radicalii liberi exist o interaciune spin-orbit foarte slab i electronii cu spinii nemperecheai au un grad mare de localizare. Factorul g nu permite identificarea radicalilor liberi, totui unele msurtori RES, foarte precise, au reuit s pun n eviden dependena factorului g de structur ntr-o serie de substane organice [2]. II. Prezena structurii hiperfine la radicalii liberi se datoreaz interaciunii magnetice a electronului cu spin nemperecheat cu momentul magnetic al nucleelor cuprinse n orbita acestui electron. Fiecare radical liber are o structur hiperfin caracteristic, determinat de numrul de nuclee cuprinse n orbita electronului i de gradul de localizare al electronului la fiecare dintre aceste nuclee. Prin aceasta, structura hiperfin permite, n majoritatea cazurilor, identificarea radicalului liber studiat. Numrul liniilor de structur hiperfin, intensitatea lor i valoarea despicrii hiperfine depind de numrul nucleelor cuprinse n orbita electronului paramagnetic, de faptul dac aceste nuclee sunt identice sau nu, i de densitatea de electroni cu spini nemperecheai la fiecare dintre aceste nuclee. Cnd orbita electronului cuprinde cu egal probabilitate un numr n de nuclee identice, caracterizate printr-un numr cuantic I, spectrul va avea (2nI+1) linii de structur hiperfin, aezate la intervale egale i cu intensiti care sunt mai mari n centrul spectrului i descresc spre margini. n cazul cnd electronii paramagnetici nconjoar mai multe nuclee cu spini nucleari diferii, descifrarea structurii hiperfine a spectrelor este destul de complicat, cci apar (2I1+1)(2I2+1)..(2In+1) linii de egal intensitate, dar situate la intervale neegale. 446

Exist dou tipuri de interaciuni hiperfine: interaciunea hiperfin anizotrop i interaciunea hiperfin izotrop. Interaciunea hiperfin anizotrop este interaciunea de tip dipol magnetic ntre electronul cu spin nemperecheat i nucleul cu moment magnetic diferit de zero. Interaciunea hiperfin izotrop sau interaciunea hiperfin de contact (interaciunea de contact Fermi), are loc ntre nucleul cu moment magnetic nenul i electronii cu spini nemperecheai, a cror densitate la locul nucleului este diferit de zero. Interaciunea hiperfin izotrop este partea principal a interaciunii hiperfine n radicali liberi, deoarece n multe cazuri interaciunea hiperfin anizotrop nu se rezolv i are ca efect doar o lrgire a liniilor de rezonan sau o anizotropie a formei i lrgimii liniei. Structura hiperfin a spectrelor apare n special n cazurile cnd electronii cu spin nemperecheat sunt electroni s sau . Structura fin lipsete n cazul radicalilor liberi cu un singur electron nemperecheat. III. Lrgimea liniei fiind mic permite determinri foarte precise de concentraie a radicalilor liberi i separarea efectelor diferiilor radicali prezeni n acelai timp n proba studiat. De asemenea lrgimea mic a liniilor faciliteaz studiul structurii hiperfine, n general despicarea hiperfin fiind mai mare dect lrgimea componentelor hiperfine.

3. Caracterizarea instalaiei experimentale RES

3.1. Principiul de funcionare al unui spectrometru RES
Funcionarea spectrometrului se bazeaz pe nregistrarea ntr-un cmp magnetic static al polarizrii induse de o prob electromagnetic n cmp de microunde datorit tranziiilor cuantice ntre nivelele Zeeman ale particulelor paramagnetice. Astfel, spectrometrul RES se compune dintr-un electromagnet capabil s creeze un cmp magnetic static B, un generator de microunde, un detector, o cavitate de microunde i un sistem computerizat pentru nregistrarea i observarea fenomenului de rezonan. Toate aceste elemente se gsesc cuplate prin intermediul probei de studiat care se afl sub aciunea cmpului magnetic static i al cmpului de microunde.

3.2. Spectrometrul portabil RES ADANI PS8400

n cazul tuturor experimentelor, msurtorile se efectueaz folosind capilare speciale de sticl, cu lungimea de 20 cm i diametrul interior de 1mm, n care se introduce proba. Spectrele RES se nregistreaz la temperatura camerei cu ajutorul spectrometrului ADANI Portable EPR Spectrometer PS8400, care opereaz n banda X (9.1 GHz 9.6 GHz) i 447

care este echipat cu un sistem de achiziie al datelor, computerizat. Spectrometrul poate opera n urmtoarele condiii : temperatura mediului cuprins ntre (+18C) i (+28C) ; umiditatea relativ ntre 20% i 80%, i presiunea atmosferic (840 GPa 1066 GPa), (630 mmHg - 800mmHg) (Fig.3). Parametrii spectrometrului utilizai la achiziionarea spectrelor RES sunt diferii, n funcie de probele care urmeaz a fi studiate. Schema bloc a spectrometrului portabil ADANI PS8400 este redat n (Fig. 4). Sursa de radiaie electromagnetic i detectorul de afl ntr-o cavitate numit punte de microunde. Puntea de microunde este o cutie de metal care ajut la amplificarea semnalelor slabe provenite de la probe. Sursa de microunde este reprezentat de un oscilator GUNN.

ADANI PS8400

Figura. 3 ADANI Portable EPR Spectrometer PS8400

Cavitatea de microunde este de form rectangular, lucreaz n modul TE102 i are un factor de calitate Q = 5000. Factorul de calitate Q indic ct de eficient stocheaz cavitatea energia de micround. Cu creterea factorului de calitate Q, sensibilitatea spectrometrelor crete. Factorul de calitate este dat de relaia Q =

res , unde res este frecvena

de rezonan, iar lrgimea la seminlime a rezonanei. Modulaia se realizeaz cu un semnal de frecven = 100 kHz. Sensibilitatea spectrometrului RES tip ADANI PS8400 este 5106 spin /Gauss, iar rezoluia este de 0.07 Gauss /cm. Canalul de semnal cuprinde partea electronic necesar detectrii senzitive n faz. Valorile de offset ale cmpului magnetic i timpul de baleiere sunt controlate de ctre sistemul de achiziionare computerizat. O baleiere a cmpului este divizat n 4096 de pai discrei. 448

Figura.4 Schema bloc a spectrometrului Portable ADANI PS8400

La fiecare pas, o tensiune de referin corespunztoare valorii de offset a cmpului magnetic este trimis ctre acea parte a controlerului care regleaz bobinele de baleiere. Rata de baleiere este controlat prin varierea timpului de ateptare ntre paii individuali. Toate aceste componente lucreaz mpreun pentru achiziionarea unui spectru de rezonan electronic de spin (RES).

3.3. Exemple de spectre RES achiziionate cu ajutorul spectrometrului portabil ADANI PS8400
a) spectrele RES ale unor probe de hidroxiapatit cu fier

449

b) spectrele RES ale unor probe vitroase i vitroceramice care conin fier [5]:
g = 4.3

x (mol %)

70
60

g = 4.3

x (mol %) 70 60

Intensitate (u.a.)

Intensitate (u.a.)

50 40 30 20 10
1000 2000 3000 4000 5000

50 40
g = 2.0

30 20 10

Camp magnetic (G)

1000

2000

3000

4000

5000

Camp magnetic (G)

c) spectrele RES ale unor medicamente:

spectrul experimental

spectrul experimental

spectrul simulat

spectrul simulat

3250

3300

3350 B(G)

3400

3450

3250

3300

3350 B(G)

3400

3450

d) spectrele RES ale unor radicali liberi [6]:

T im p (zile)

7
E (92 z)

E (ini)

3320

3340

3360 B (G )

3380

3400

3250

3300

3350 B (G)

3400

3450

450

4. Bibliografie
1. 2. 3. 4. 5. 6. I.Ursu, Rezonana electronic de spin, Ed. Academiei R.S.Romnia, (1965) Al. Nicula, Rezonana magnetic, Editura Didactic i Pedagogic, Bucureti, 61-64 (1980) L. David, C. Crciun, O. Cozar, V. Chi, Rezonana electronic de spin, Presa Universitar Clujean, Cluj-Napoca, (2001) A-S. Crucq, Study of radicalizing mechanisms of irradiated drugs (Radiosterilization of pharmaceuticals: radicals), Chimie Nouvelle, 12: 1356 -1359, (1994) S. Simon, M. Todea, Spectroscopic study on iron doped silica-bismuthate glasses and glass ceramics, J. Non-Cryst. Solids, 352, 28-29, (2006) 2947. Dina Petrior, G. Damian, S. Simon, Gamma-irradiated ExtraVit M nutritive supplement studied by EPR spectroscopy , submis la Radiation Physics and Chemistry, 2007

451

Spectroscopia de rezonan electronic de spin partea a II- a

C.S. dr. Milica Todea

3000

3100

3200

3300

3400

3500

3600

3700

m agnetic field

Cuprins
1. Introducere ..........................................................................................................................452 2. Aplicaii ale spectroscopiei de rezonan electronic de spin (RES) ....................................453 3. Exemple de aplicaii ale rezonanei electronice de spin ........................................................454 4. Bibliografie: .........................................................................................................................465

1. Introducere
Spectroscopia de rezonan electronic de spin (RES) este una dintre cele mai eficiente metode, non-distructive si non-invazive, folosit pentru caracterizarea ordinii locale i a interaciunilor magnetice n materiale organice si anorganice. Spectrele RES nregistrate de asemenea n cazul: sistemelor necristaline, monocristalelor, pulberilor policristaline, soluiilor congelate sau n cazul soluiilor lichide aduc contribuii importante cercetrilor din domeniul materialelor, fizicii, chimiei, biologiei, mineralogiei si geologiei. Centrii paramagnetici, care pot fi investigai prin RPE sunt ionii metalelor de tranziie i elemente ale pmnturilor rare sau centrii asociai cu sarcinile electrice sau cu defectele neutre. Rezonana electronic de spin este o metod larg utilizat n descrierea strilor fundamentale i caracterizarea efectelor vecintii asupra nivelelor 452

energetice ale centrilor paramagnetici. RES este o metod sensibil la poziiile atomilor n structur i permite studiul simetriei locale. Metoda const n studiul tranziiilor dintre nivelele electronice ale atomilor n prezena unui cmp magnetic extern [1,2]. Astfel, spectroscopia RES este capabil s furnizeze detalii de structur molecular inaccesibile altor metode analitice. Aceasta se datoreaz faptului c momentul magnetic de spin al electronului nemperecheat este foarte sensibil la cmpurile magnetice locale din interiorul probei. Aceste cmpuri de obicei provin de la momentele magnetice nucleare ale diferiilor nuclei care pot fi prezeni n vecinti.

2. Aplicaii ale spectroscopiei de rezonan electronic de spin (RES)

Spectroscopia RES are aplicaii n cadrul cercetrilor din diferite domenii cum sunt: fizic, biologie, chimie, studiul materialelor, medicin, mediu, geologie, nanomateriale, nanotiinelor, aplicaiile industriale etc. Cu ajutorul rezonanei paramagnetice electronice (RES) pot fi studiate: a. n domeniul fizicii concentraii de spin ioni paramagnetici ai metalelor de tranziie, pmnturilor rare i actinidelor defecte paramagnetice, centrii de culoare, deformri locale electroni de conducie n conductori i semiconductori interacii magnetice i cristaline procese de recombinare la temperaturi sczute b. n domeniul chimiei radicali liberi cataliza procese de oxidare si reducere stri de triplet a moleculelor compui organo-metalici i zeolii cinetica de reacie i reacii de polimerizare c. n domeniul biologiei, medicinii i mediului markeri de spin antioxidani i ageni de contrast oximetrie radicali liberi n esuturi, radicali ai oxigenului, NO n sisteme biologice fotosinteza 453

 detecie de droguri, metabolism i toxicitate factori poluani d. n domeniul aplicaiilor industriale controlul calitii produselor alimentare iradiate dozimetrie pentru procesele de iradiere vrste i datri de materiale cu aplicaii n arheologie, geologie detecia radicalilor n polimeri iradiai i procese de coroziune prospeimea uleiurilor vegetale controlul calitii sticlelor optice speciale procese oxidative n vopsele utilizate n industria auto e. n domeniul caracterizrii materialelor proprieti ale polimerilor defecte n fibre optice materiale laser conductori organici i anorganici cu dimensionalitate redus influena impuritilor i defectelor n semiconductori proprieti ale noilor materiale magnetice proprieti ale materialelor utilizate n spintronic, optoelectronic manganii cu magnetorezistena colosal supraconductori oxidici cu temperatur de tranziie ridicat semiconductori f. n domeniul nanomaterialelor i nanotiinelor efecte ale reducerii dimensionalitii dinamica de spin n nanomateriale, nanocompozite efecte miez interior - strat superficial ale nanoparticulelor magnetice proprieti ale nanoparticulelor i nanofirelor magnetice interacii magnetice dipolare i de schimb: efectele dimensiunii nanometrologie: dimensiune medie a nanoparticulelor metalice i magnetice caracterizare nanotuburi de carbon, fullerene i compui derivai proprieti ale conduciei electrice i transportului polaronic

3. Exemple de aplicaii ale rezonanei electronice de spin

Spectrele RES au fost nregistrate pe pulberi la temperatura camerei cu ajutorul unui spectrometru portabil RES ADANI Portable EPR Spectrometer PS8400, care opereaz n banda X (9.1 GHz 9.6 GHz) i este 454

echipat cu un sistem de achiziie a datelor, computerizat. Funcionarea spectrometrului se bazeaz pe nregistrarea ntr-un cmp magnetic static a polarizrii induse de o prob paramagnetic n cmp de microunde datorit tranziiilor cuantice ntre nivelele Zeeman ale centrilor paramagnetici. Exemplul1. Fe3+ Spectrele RES nregistrate, pentru probele vitroase din sistemul 0.01Fe2O30.99[xSiO2(100-x)Bi2O3], sunt reprezentate n figura 1. Sticlele i vitroceramicile studiate conin ionul paramagnetic Fe3+ (3d5 6S5/2), acesta fiind n stare S i frecvent utilizat n investigaiile RES ale sticlelor. Spectrul conine o linie principal de rezonan relativ larg cu gef 4.3 i o linie foarte slab rezolvat la gef 2.0. Linia de la gef 4.3 este specific tuturor sticlelor ce conin ioni Fe3+ ca impuritate sau ca dopant n concentraii mici [5-8].
g = 4.3

x (mol %)

70
60

Intensitate (u.a.)

50 40 30 20 10
1000 2000 3000 4000 5000

Camp magnetic (G)

Figura. 1 Spectrele RES nregistrate pentru probele netratate termic

Caracteristicile spectrului RES pentru diferite rapoarte Bi2O3/SiO2 sunt complet similare pentru toate probele netratate termic (Fig. 1) artnd c vecintatea ionilor Fe3+ nu depinde foarte mult de compoziia matricilor vitroase. Liniile de la gef=2.0 sunt atribuite ionilor paramagnetici izolai n poziii caracterizate de cmpuri cristaline relativ slabe, pentru care termenul Zeeman este dominant , n timp ce liniile cu gef>2.0 sunt atribuite ionilor paramagnetici aflai n poziii caracterizate de cmp cristalin relativ puternic unde termenii de cmp cristalin sunt comparabili sau mai mari dect termenii Zeeman [9, 12]. Dependena lrgimii acestor linii de la gef 4.3 de compoziia probelor este ilustrat n Fig. 2. Observm c linia de rezonan de la gef=4.3 se ngusteaz pe msur ce nlocuim Bi2O3 cu SiO2 (Fig. 2). ngustarea liniei de 455

rezonana pentru x>20 indic o vecintate a ionilor Fe3+ mai uniform n sticlele bogate n siliciu. Forma liniilor RES descrie i dezordinea din jurul ionilor de fier rezonani i caracteristicile structurale ale matricilor vitroase n care sunt ncorporai aceti ioni de fier. Caracteristicile spectrelor RES pentru ionii Fe3+ n probele tratate termic sunt evident modificate aa cum se poate vedea n Fig. 3. Pentru un coninut sczut de SiO2 (x 30) linia dominant se gsete la gef 2.0 n timp ce linia mai puin intens se situeaz la gef 4.3.
230 220 210 200

B (G)

190 180 170 160 10 20 30 40 50 60 70

x (mol%)

Figura. 2 Dependena lrgimii liniilor de rezonan de la gef 4.3 de compoziia probelor

Pentru probele cu un coninut mai ridicat de SiO2 (40 x 50) i n cazul crora a fost identificat prin difracia de raze X faza cristalin Bi5.6Si0.5O9.4, semnalul de la gef 2.0 este slab evideniat iar linia dominant fiind cea de la gef 4.3. n cazul probelor cu coninut ridicat de siliciu (60 x 70) sunt prezente ambele linii, att cea de la gef 2.0 ct i cea de la gef 4.3. Lrgimea liniei de la gef 2.0, nregistrat pentru probele cu un coninut sczut de SiO2, scade cu x aa cum se observ n Fig. 4. n probele tratate termic, spectrele RES ale Fe3+ (Fig. 3) arat schimbrile aprute n ordinea local n jurul ionilor de fier. Semnalul de la gef = 4.3 este nregistrat pentru toate probele i lrgimea liniei este de aproximativ 200 G pentru toate compoziiile. Acest rezultat indic faptul c ordinea la scurt distant, din jurul ionilor Fe3+ responsabili pentru acest semnal, este caracterizat de un cmp cristalin relativ puternic i poate fi asociat cu poziiile fierului n reeaua necristalin bogat n siliciu.

456

g = 4.3

x (mol %) 70 60

Intensitate (u.a.)

50 40
g = 2.0

30 20 10

1000

2000

3000

4000

5000

Camp magnetic (G)

Figura. 3 Spectrele RES pentru probele vitroceramice

Linia cu gef = 2.0 este linie rezolvat numai pentru coninut sczut de SiO2 , pn la x = 30 i este atribuit ionilor Fe3+ situai n poziii cu cmp cristalin slab cu simetrie octaedral. Lund n considerare razele ionice pentru ionii Bi3+ i Fe3+ i starea lor identic de valent, este de ateptat ca ionii Fe3+ s ocupe poziiile Bi3+ din faza cristalin Bi12SiO20. Remarcm de asemenea c linia se ngusteaz cu creterea coninutului de SiO2 (Fig. 4) ceea ce denot tendina de ordonare structural n jurul ionilor Fe3+ rezonani dispui n aceste poziii.
160

150

140

B (G)

130

120

110

100

90

10

20

30

x (mol %)

Figura. 4 Dependena lrgimii liniei de la g 2.0 de compoziia probelor

457

Linia de rezonan slab rezolvat atribuit ionilor de fier dispui n cmp cristalin slab pentru probele vitroceramice cu 40 x 50 mol % arat c doar o mic parte dintre ionii de Fe3+ sunt situai n poziiile Bi3+ ale fazei (Bi5.6Si0.5O9.4), vecintatea lor fiind puternic distorsionat [3, 4, 10, 11]. Probabil c majoritatea ionilor Fe3+ s fie dispui n faza rmas necristalin bogat n Si [13, 14]. n probele n care se dezvolt faza cristalin de tipul Bi2SiO5 ( x = 60, 70) spectrele RES prezint att linia cu g 4.3 specific ionilor de Fe3+ n poziii cu cmp cristalin intens din matrici necristaline, ct i o linie larg la g 2.0 specific ionilor din poziii n cmp cristalin slab dar n vecintate distorsionat sau ntre care se manifest interaciuni dipolare [15]. Exemplul 2: Gd3+ a) Analizele de rezonan paramagnetic electronic au pus n eviden compoziii diferite ale ionilor de gadoliniu n probe cu coninut mai mare de bismut (Fig. 5). Astfel, dac n probele cu x = 0 i x = 0.14 spectrele RES ale ionilor de Gd3+ sunt similare i reflect o vecintate relaxat a acestora n matricea amorf, odat cu creterea coninutului de bismut, pe lng asemenea poziii, gadoliniul ocup poziii in regiuni cvasicristaline n acord cu modificarea difractogramelor acestor probe. Dup tratamentul termic la 400oC ionii de gadoliniu ocup poziii n interiorul fazei cristaline de tip Bi5.6Si 0.5O9.4 (Fig. 6).
2.8 5.9 2.0

5.9

2.8

2.0

x=0

x=0
x = 0.14

x = 0.14
x = 0.33

x = 0.33
x = 0.5
4.3

x = 0.5

1000

2000

3000

4000

5000

B(G)

1000

2000

3000

4000

5000

B(G)

Figura 5 Spectrele RES ale probelor preparate prin metoda sol-gel

Figura 6 Spectrele RES ale probelor tratate termic 30 minute la 400oC

b) Gd3+, Ti3+, vacante de oxigen Spectrele RES nregistrate n cazul microsferelor netratate termic sunt dominate de o linie larg centrat la g 2.0 care reflect o vecintate relaxat n matricea amorf, dar se observ i linii mici la 5.9 i2.8. Acestea indic faptul c exist poziii n matricea amorf unde ionii de Gd3+ se afl n 458

cmp intermediar. Lrgimea liniei de la g 2.0 din spectrele RES, care reflect n mod direct schimbrile n rata de relaxare spin-reea i cel mai important n dinamica medie a anizotropiei factorului g, se modific n intervalul de temperatur investigat. Linia de la g 4.3 este atribuit fierului (III) i apare datorit tuburilor de sticl n care se pune proba pentru a efectua msurtoarea RES. Modificrile structurale induse n probele titano-silicatice amorfe prin tratamentele termice sunt bine puse n eviden n spectrele RES ale probelor parial i total cristaline (Fig. 7-14). Linia larg de la g 2.0 din spectrele probelor tratate termic la 350, 700 i 900C ne indic c ionii de Gd3+ sunt preponderent dispui n faza rezidual necristalin, n cmp cristalin slab, rezultat n urma relaxrii structurale dar nc cu un grad mare de dezordine n jurul lor. Se observ i spectrul n U cu linii la g 5.9, g 2.8, g 2.0, specific matricelor policristaline dezordonate care conin ioni de Gd3+ destul de omogen distribuii. Spectrele RES pentru microsferele tratate termic n intervalul 350 1400C sunt caracterizate printr-un semnal ngust, suprapus peste componenta spectral, la g 2, care crete n intensitate odat cu creterea temperaturii de tratament. n conformitate cu Kolodiazhnyi i Petric am atribuit aceste linii vacanelor de oxigen la titan (VTi) cu spin electronic nemperecheat. Spectrele RES prezint o uoara asimetrie a liniei de rezonan (se abat de la o funcie pur Lorentzian) care poate fi explicat prin prezena unei anizotropii uoare i/sau a unui fundal de rezonan relativ larg de o foarte joas amplitudine. Lrgimea liniei spectrelor RES, care reflect n mod direct schimbrile n rata de relaxare spin-reea i cel mai important n dinamica medie a anizotropiei factorului g, se modific n intervalul de temperatur investigat [16]. Prin aplicarea tratamentului termic, oxigenul difuzeaz din interior spre suprafa i se formeaz n regiunea de sub-suprafa vacante de oxigen, n timp ce titaniul difuzeaz de la suprafa spre interior, unde se formeaz ionii de Ti3+. n timp ce atomul de O difuzeaz el genereaz doi atomi de titan cu configuraie incomplete, legai anterior de atomul de oxigen. Unul dintre aceti atomi de Ti capteaz un electron i rmne n configuraia tetraedral, iar cellalt atom de Ti se relaxeaz ntr-o configuraie planar trigonal.

459

2.8 2.0

5.9

4.3

Ti:Si 1:2
Ti:Si 1:2

Ti:Si 1:1

Ti:Si 1:1

1000

2000

3000 B(G)

4000

5000

1000

2000

3000 B(G)

4000

5000

Figura 7 Spectrele RES ale microsferelor preparate prin metoda sol gel.

Figura 8 Spectrele RES ale microsferelor tratate termic la 350C, 30 minute.

Ti:Si 1:2

Ti:Si 1:2

Ti:Si 1:1

Ti:Si 1:1

1000

2000

3000 B(G)

4000

5000

1000

2000

3000 B(G)

4000

5000

Figura 9 Spectrele RES ale microsferelor tratate termic la 700C, 30 minute.

Figura 10 Spectrele RES ale microsferelor tratate termic la 900C, 30 minute.

(a)

(b)

2.004 1.98

Ti:Si 1:2
Ti:Si 1:2
2.004 1.98

Ti:Si 1:1

Ti:Si 1:1

1000

2000

3000 B(G)

4000

5000

3000

3200

3400 B(G)

3600

3800

Figura 11 Spectrele RES ale microsferelor tratate termic la 1100C, 30 minute, utiliznd un baleiaj de (a) 4000 G, (b) 600 G.

460

(a)

(b)

Ti:Si 1:2

Ti:Si 1:2
Ti:Si 1:1

Ti:Si 1:1

1000

2000

3000 B(G)

4000

5000

3000

3200

3400 B(G)

3600

3800

Figura 12 Spectrele RES ale microsferelor tratate termic la 1400C, 30 minutes, utilizand un balaj de (a) 4000 G, (b) 600 G.

Spectrele RES ale probelor tratate termic la 1400C sunt caracterizate doar prin semnalul din jurul valorii g1.98, atribuit ionilor de Ti3+, neexistnd vacane de O din cauza atmosferei reductoare. Centrii de Ti3+ sunt de obicei detectai la temperaturi sub 120K [17,18], dar au mai fost detectai n literatura de specialitate [19] la temperatura camerei.
(a)
o 1400 C 1100oC o 900 C 700oC o 350 C as-prep.

(b)
2.004 1.98

1400oC

1100oC

900oC 700oC

1000

2000

3000 B(G)

4000

5000

3000

3200

3400 B(G)

3600

3800

Figura 13 Spectrele RES ale sistemului Ti:Si 1:2 preparate prin metoda sol gel si supuse diferitelor tratamente termice, utilizand un baleaj de (a) 4000 G si respectiv (b) 600 G.
(a)
o 1400 C o 1100 C o 900 C o 700 C o 350 C

(b)
2.004 1.98

o 1400 C

o 1100 C o 900 C o 700 C

as-prep.

1000

2000

3000 B(G)

4000

5000

3000

3200

3400 B(G)

3600

3800

Figura 14 Spectrele RES ale sistemului Ti:Si 1:1 preparate prin metoda sol gel i supuse diferitelor tratamente termice, utiliznd un baleiaj de (a) 4000 G i respectiv (b) 600 G.

461

Din spectrele RES prezentate n Fig.13, 14 se observ faptul c tratamentul termic joac un rol important n formarea de centrii paramagnetici adiionali, ambele sisteme avnd o dependen oarecum similar n raport cu tratamentul termic. n Figurile 13 si 14 sunt evideniate evoluiile vacanelor de oxigen (pentru g2.004) si Ti3+ (pentru g1.98), n urma tratamentelor termice. n cazul microsferelor preparate prin metoda sol gel, semnalul RES provine numai de la ionii de Gd3+. n cazul microsferelor tratate termic la 350, 700, 900 si 1100C, peak-ul de la g2.004 poate fi atribuit vacanelor de oxigen, n bun concordan cu literatura de specialitate i rezultatele obinute prin spectroscopie Raman unde a fost obinut un semnal de fluorescen n cazul probelor tratate termic pn la temperatura de 900C. Nakamura i col. [20] au raportat faptul c semnalul RES la g2.004 detectat pe plasma de TiO2 tratat termic provine de la un electron captat la o vacan de oxigen. Serwicka [21] a observat un astfel de semnal la g2.003 pe TiO2 redus n vid i l-a atribuit unui defect, cel mai probabil un electron captat la o vacan de oxigen. Semnale similare au fost observate i n TiO2 anatase dopate cu C [22-24], ct si n TiO2 dopat cu B [25]. Au mai fost raportate astfel de semnale RES de ctre Li i col. [22] la g2.0055 n spectrele RES n probe de titan dopat cu C, dup ce au fost folosite n teste fotocatalitice, ct i de ctre Feng i col. [26] n probe de TiO2 dopat cu N, iar Serpone [27] a atribuit semnalele din intervalul g = 2.003 2.005 unui electron captat la o vacan de oxigen. Acest studiu este focusat n special pe efectul adiiei oxidului de galiu n sisteme, deoarece evoluia defectelor: vacane de oxigen (g2.004) i Ti3+ (g1.98) este similar cu cea discutat anterior. Pentru microsferele tratate termic la 1100C si 1400C se observ efectul galiului n sensul preveniei formrii vacanelor de oxigen. n cazul microsferelor cu coninut de galiu se dezvolt dup tratamentul termic la 1400C o nou faza, Ga2TiO5, n concordan cu difraciile de raze X. Spectrele RES evideniaz integrarea ionilor de Ti3+ n aceast faz. Vor fi prezentate doar spectrele RES ale sistemului Ti:Si 1:2, deoarece sistemul Ti:Si 1:1 nu prezint modificri eseniale.
Ga2O3
Ga2O3
20% 10% 5% 1% 0%
20% 10%

5% 1% 0%

1000

2000

3000

4000

5000

1000

2000

3000

4000

5000

B(G)

B(G)

Figura 15 Spectrele RES ale microsferelor preparate prin metoda sol gel.

Figura 16 Spectrele RES ale microsferelor tatate termic la 350C.

462

Ga2O3

(a)

Ga2O3
(b)

20%

20% 10% 5%
10% 5% 1% 0%

1% 0%
3000

3200

3400

3600

3800

1000

2000

3000

4000

5000

B(G)

B(G)

Figura 17 Spectrele RES ale microsferelor tatate termic la 700C, utilizand un baleaj de (a) 4000 G, (b) 600 G.

Ga2O3

(a)

20%

(b)

20%

10%

10%

5%

5% 1% 0%
1000 2000 3000 4000 5000

1% 0%

Ga2O3
3000 3200 3400 3600 3800

B(G)

B(G)

Figura 18 Spectrele RES ale microsferelor tatate termic la 900C, utilizand un baleaj de (a) 4000 G, (b) 600 G.

Ga2O3

(a)

Ga2O3

(b)

20% 10% 5% 1%

20% 10% 5% 1%

0%
1000 2000 3000 4000 5000

0%
3000 3200 3400 3600 3800

B(G)

B(G)

Figura 19 Spectrele RES ale microsferelor tatate termic la 1100C, utilizand un baleaj de (a) 4000 G, (b) 600 G.

463

Ga2O3

(a)

Ga2O3

(b)

20%

20% 10%

10%
5%

5% 1%
1% 0%

0%
1000 2000 3000 4000 5000
3000 3200 3400 3600 3800

B(G)

B(G)

Figura 20 Spectrele RES ale microsferelor tatate termic la 1400C, utilizand un baleaj de (a) 4000 G, (b) 600 G.

c) Gd3+ Prin rezonana paramagnetic electronic a fost investigat ordinea structural din jurul ionilor de Gd3+ si interaciunea magnetic dintre ei. Prezena n probe a ionilor de Gd3+ ne d informaii cu privire la modificrile structurale care au loc n vecintatea lor, n funcie de compoziia matricii i este util n caracterizarea locurilor n care s-ar putea distribuii alte pmnturi rare neparamagnetice, introduse n aceeai matrice. Spectrele RES ale probelor investigate sunt prezentate n figura 21. Spectrele constau din linii relativ largi cu g = 2,0 fapt ce denot c vecintatea ionilor de Gd3+ se confrunt cu cmpuri cristaline slabe, ceea ce nseamn c acetia nu sunt inclui n reeaua silicatic sau germanat unde au avut o vecintate mult mai distorsionat [28]. Aceast lrgire a liniei de rezonan este n mod normal atribuit interaciunii dipol-dipol dintre ionii de Gd3+, dar i dezordinii locale [29-32]. Liniile largi preconizate pentru o concentraie att de sczut (0,5% mol Gd2O3), considernd c gadoliniu ar fi distribuit omogen n ntregul volum de prob, sprijin ipoteza distribuiei sale pe suprafaa nanoparticulelor. n acest caz, distana medie dintre ionii de gadoliniu este mai mic dect n cazul distribuiei uniforme n ntregul volum i se confrunt cu interaciuni magnetice puternice. Diferenele observate n forma liniilor, n funcie de compoziia probelor, arat c aceast distribuie pe suprafaa nanoparticulelor nu este uniform, fiind mult mai grupat pentru probele cu raportul Si/Ge 1:2 i 1:3, unde efectul interaciunii de schimb este clar evideniat [33].

464

Figura. 21. Spectrele RES ale probelor aparinnd sistemului 0.005Gd2O30.995[(1x)SiO2xGeO2]

4. Bibliografie:
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. I.Ursu, Rezonana electronic de spin, Ed. Academiei R.S.Romnia, (1965) Al. Nicula, Rezonana magnetic, Editura Didactic i Pedagogic, Bucureti, 61-64 (1980) A. Witkowska, J. Rybicki, A. DiCicco, 6-thInternational Conference on Intermolecular Interactions n Matter, Gdask Poland, 10-13 September 2001 T. Nanba, H. Tabuchi, Y. Miura, Proceedings of XX Int. Congress. Glass, Sept. 27Oct. 1, 2004, Tokyo, Japan, P-10-011 R.H. Sands, Phys. Rev., 99 (1955) 1222 R. Ster, M. Notz, Glastechn. Ber. Glass Sci. Technol., 67 (1994) 156 S. Simon, R. Pop, V. Simon, M. Coldea, J. Non-Cryst. Solids, 331 (2003) 1 R. Berger, J. Kliava, E.M. Yahiaoui, J.-C. Bissey, P.K. Zinsou, P. Beziade, J. Non-Cryst. Solids 180 (1995) 151 T. Castner, C.S. Newell, W.C. Holton, C.P. Schlichter, J. Chem. Phys., 32 (1960) 668d Y. Wu, M.J. Forbess, S. Seraji, S.J. Limmer, T.P. Chou, C. Nguyen, G. Cao, J. Appl. Phys, 90, 10 (2001) 5296 Pan, A. Ghosh, J. Chem. Phys., 112, 3 (2000) 1503 I. Ardelean, M. Peteanu, V. Simon, F. Ciorcas, V. Ioncu, Journal of Materials Science Letters, Volume 20, Number 10, 2001, 947-949(3). S. Simon, M. Todea, J. Non-Cryst. Solids, 352 (2006) 2947. M. Todea, S. Simon, J. Optoelectronics and Advanced Materials, 9 (2007), 621-624. M. Todea, V. Simon, S. Simon, J. Optoelectronics and Advanced Materials, Vol. 10, No. 12 (2008), 3336 3340. N. Guskos, E. A. Anagnostakis, G. Zolnierkiewicz, J. Typek, A. Biedunkiewicz, P. Figiel, A. Guskos, K. A. Karkas, Rev. Adv. Mater. Sci. 23 (2010) 189-195. O. I. Micic, Y. Zhang, K. R. Cromack, A. D. Trifunac, M. C. Thurnauer, J. Phys. Chem. (1993), 97, 7277. M. Anpo, M. Yabuta, S. Kodama, Y. Kubokawa, Bull. Chem. Soc. Japan 59 (1986) 259. E. A .Konstantiniva, A. I. Kokorin, S. Sakthivel, H. Kisch, K. Lips, Chimia 12 (2007) 61. I. Nakamura, N. Negishi, S. Kutsuna, T. Ihara, S. Sugihara, K. Takeuchi, J. Mol. Catal. A: Chem. 161 (2000) 205212. E. Serwicka, Colloids Surf. 13 (1985) 287293. Y. Li, D.S. Hwang, N.H. Lee, S.J. Kim, Chem. Phys. Lett. 404 (2005) 2529.

465

23. V. Gombac, L. D. Rogatis, A. Gasparotto, G. Vicario, T. Montini, D. Barreca, G. Balducci, P. Fornasiero, E. Tondello, M. Graziani, Chem. Phys. 339 (2007) 111123. 24. E. A. R. Garcia, Y. Sun, K. R. R. Gil, D. Raftery, Solid State Nucl. Mag. Reson. 35 (2009) 7481. 25. M. Fittipaldi, V. Gombac, T. Montini, P. Fornasiero, M. Graziani, Inorg. Chim. Acta 361 (2008) 39803987. 26. C. Feng, Y. Wang, Z. Jin, J. Zhang, S. Zhang, Z. Wu, Z. Zhang, New J. Chem. 32 (2008) 10381046. 27. V. N. Kuznetsov, N. Serpone, J. Phys. Chem. C 113 (2009) 1511015123. 28. S. Simon, J. Optoelectr. Adv. Mater. 8 (2006) 99101. 29. J. Kliava, I.S. Edelman, A.M. Potseluyko, E.A. Petrakovskaja, R. Berger, I. Bruckental, Y. Yeshurun, A.V. Malakhovskii, T.V. Zarubina, J. Phys.: Condens. Matter 15 (2003) 66716681. 30. J. Kliava, A. Malakhovskii, I. Edelman, A. Potseluyko, E. Petrakovskaja, S. Melnikova, T. Zarubina, G. Petrovskii, Y. Bruckental, Y. Yeshurun, Phys. Rev. B 71 (2005) 104406. 31. J. Kliava, I. Edelman, A. Potseluyko, E. Petrakovskaja, R. Berger, I. Bruckental, Y. Yeshurun, A. Malakhovskii, T. Zarubina, J. Magn. Magn. Mater. 272276 (2004) 16471649. 32. S. Simon, I. Ardelean, S. Filip, I. Bratu, I. Cosma, Solid State Commun. 116 (2000) 8386. 33. Diana-Louisa Trandafir, R.V.F. Turcu, S. Simon, Materials Science and Engineering B 172 (2010) 6871

466

XIII. METODE ELECTROCHIMICE Elaborarea, testarea i verificarea protocoalelor de practic experimental pentru echipamente de investigare prin metode electrochimice
Conf. dr. ing. Graziella Liana Turdean Cuprins
1. Introducere .......................................................................................................................... 467 2. Voltametrie cu baleiaj liniar de potenial (LSV) ................................................................. 467 3. Voltametria ciclic (sau CV) ............................................................................................... 471 4. Voltametria ciclic fr cuplu redox activ........................................................................... 474 5. Voltametria ciclic cu un cuplu redox activ........................................................................ 474 6. Bibliografie .......................................................................................................................... 488

1. Introducere
Metodele electrochimice moderne ofer chimistului electroanalist o varietate de tehnici pentru a rezolva problemele analitice. Una dintre aceste metode este voltametria, n care curnetul este msurat ca o funcie de potenialul aplicat i este utilizat la studiul cineticii reaciei de transfer de electroni i proprietile de transport ale reaciilor. n principal, exist dou tipuri de metode voltametrice: * voltametrie cu baleiaj liniar de potenial (LSV); * voltametrie ciclic (CV).

2.Voltametrie cu baleiaj liniar de potenial (LSV)

n voltametria cu baleiaj liniar de potenial (LSV), potenialul este baleiat ntr-un domeniu fix de potenial cu o vitez constant, de obicei, de la o limit inferioar la o limit superioar a potenialului, aa cum se arat in figura 1.

467

Figura 1. Forma semnalului de excitare n voltametria cu baleiaj liniar de potenial.

Figura 2. Voltamograma cu baleiaj liniar de potenial.

Viteza de scanare (v) se calculeaz din panta dreptei din figura 1. n mod clar prin schimbarea timpului necesar pentru a baleia domeniul de potenial se modific viteza de baleiaj (scanare). Caracteristicile voltamogramei nregistrate (figura 2) depind de o serie de factori, cum ar fi: * viteza reaciei de transfer de electroni; * reactivitatea chimic a speciilor electroactive; * viteza de baleiaj a potenialului. Exemplu: Rezultatul msurtorilor de LSV este rRESezentarea grafic a curentului obinut versus potenialul baleiat cu o vitez constant. Pentru sistemul Fe3+/Fe2+, unda aparut se datoreaz reaciei 1. (1) Presupunem c scanarea ncepe din partea stng a graficului curent/potenial, unde iniial nu este curent. Cnd potenialul este baleiat spre dreapta (spre valori de reducere), ncepe s apar un curent care, eventual, poate atinge i un maxim nainte s scad. Pentru a nelege acest comportament, trebuie s se ia n considerare influena potenialului asupra echilibrului stabilit la suprafaa electrodului. Dac avem n vedere reducerea electrochimica a Fe3+ la Fe2+, viteza reaciei de transfer de electroni este mai rapid n comparaie cu viteza de baleiaj a potenialului. Prin urmare, la suprafaa electrodului se stabilete un echilibru identic cu cel prezis de termodinamic. n echilibrul electrochimic, ecuaia lui Nernst este cea care prezice relaia dintre concentraie i potenial (diferen de potenial), unde E este diferena de potenial aplicat i Eo este potenial standard de electrod, conform ecuaiei 2: 468

(2) Deci, cnd potenialul este baleiat de la valoarea V1 la V2, poziia de echilibru se modific de la nici o conversie (la V1) la conversia complet (la V2) a reactantului la suprafaa electrodului. Forma exact a voltamogramei poate fi neleas prin luarea n considerare i a efectelor potenialului i transportului n mas. Cnd potenialul este baleiat de la valoarea iniiala V1, echilibrul la suprafaa electrodului ncepe s se modifice i, ca urmare, apare un curent, conform ecuaiilor 3: (3)

Aa cum curentul crete cu potentialul, poziia de echilibru se deplaseaz continuu n sensul conversiei reactantului. Peak-ul (vrful, maximul) apare deoarece la un moment dat stratul de difuzie a crescut suficient nct fluxul de reactant la electrod nu este suficient de rapid pentru a satisface cerinele impuse de ecuaia lui Nernst. n aceast situaie curentul ncepe s scad. De fapt, scderea curentului urmeaz acelai comportament ca i cel estimat prin ecuaia Cottrell. n cazul n care se modific viteza de baleiaj, alura voltamogramei se modific i ea (Figura 3).

Figura 3. Influena vitezei de baleiaj asupra voltamogramelor cu baleiaj liniar de potenial.

Fiecare curb are aceeai form, dar este evident c curentul crete cu creterea vitezei de baleiaj, datorit dimensiunilor stratului de difuzie i a 469

timpului necesar pentru a nregistra voltamograma. n mod clar, voltamograma se va obine mai ncet, cu ct viteza de baleiaj este mai mic. Prin urmare, grosimea stratului de difuzie de la suprafaa electrodului va fi diferit n funcie de viteza de baleiaj folosit. La o vitez de baleiaj mic, stratul de difuzie va crete mai mult n comparaie cu cazul n care viteza de scanare este mare. n consecin, fluxul de la suprafaa electrodului este considerabil mai mic la viteze de baleiaj mici, fa de cele de la viteze de baleiaj mari. Cum mrimea curentului este proporional cu fluxul spre electrod, valoarea curentului va fi mai mic la valori mici ale vitezei de baleiaj. Acest lucru evideniaz un punct important atunci cnd se examineaz LSV (i CV): dei nu exist o ax a timpului pe grafic, viteza de balaiaj a potenialului (i, prin urmare, timpul necesar pentru a nregistra o voltamogram) influeneaz puternic comportamentele observate. O alt observaie este poziia curentului de peak: este clar c peak-ul apare la aceeai valoare de potenial (figura 3) i aceasta este o caracteristic a reaciilor de electrod, care au o cinetic rapid de transfer de electroni. Aceste procese rapide sunt adesea menionate ca reacii reversibile de transfer de electroni. n consecin, se poate formula ntrebarea referitoare la ce s-ar ntmpla n cazul n care procesele de transfer de electroni au fost "lente" (n raport cu viteza de baleiaj a potenialului). Pentru aceste cazuri, reaciile sunt menionate ca reacii cvasi-reversibile sau ireversibile de transfer de electroni. Figura 4 arat o serie de voltamograme nregistrate la o singur vitez de baleiaj pentru diferite valori ale constantei vitezei reaciei de reducere (kred).

Figura 4. Voltamograma cu baleiaj liniar de potential, pentru diferite constante ale vitezei reactiei de reducere. Conditii experimentale: viteza de baleiaj identica.

n aceast caz, potenialul aplicat nu va duce la generarea concentraiilor la suprafaa electrodului conform estimrilor din ecuaia Nernst, deoarece 470

cinetica de reacie este "lent" i, astfel, echilibrele nu sunt stabilite rapid (n comparaie cu viteza de baleiaj). n aceast situaie, forma general a voltamogramei nregistrate este similar cu cea de mai sus, dar spre deosebire de reacia reversibil, poziia curentului de peak/maxim se schimb n funcie de constanta vitezei de reducere (i, de asemenea, de viteza de baleiaj a potenialului). Acesta are loc deoarece curentul apare mai ncet dect n cazurile reversibile.

3.Voltametria ciclic (sau CV)

Este metoda electrochimic poteniodinamic foarte similar cu LSV. ntr-un experiment de voltametrie ciclic, potenialul electrodului de lucru este baleiat liniar n funcie de timp, ca i n cazul voltametriei liniare. Spre deosebire de voltametria cu baleiaj linear, care se ncheie atunci cnd se ajunge la un potenial stabilit (V2), n cazul CV, dei potenialul este baleiat tot ntre dou valori (V1 i V2), cnd potenialul atinge V2 sensul de baleiaj este inversat, iar potenialul este baleiat napoi la V1. Aceast inversare se poate produce de mai multe ori n timpul unui singur experiment. Voltamograma ciclic obinut este rRESezentarea grafic a curentul obinut la electrodul de lucru (i) fa de potenialul aplicat (E). Voltametria ciclic este folosit, n general, pentru a studia proprietile electrochimice ale unui analit ntr-o soluie. n voltametrie ciclic, potenialul de electrod este baleiat liniar fa de timp (figura 5), panta dreptei fiind cunoscut ca viteza de baleiaj (v [V/s]). Potenialul este msurat ntre electrodul de referin i electrodul de lucru, iar curentul este msurat ntre electrodul de lucru i electrodul auxiliar. Dup cum se observ n voltamograma din figura 6, n scanarea n sens direct se obine un curent de peak pentru orice specie care poate fi oxidat n domeniul de potenial baleiat. Curentul va crete pe msur ce potenialul atinge potenialul de oxidare a analitului, dar apoi va scdea deoarece concentraia analitului se va epuiza n vecintatea suprafeei electrodului. n cazul n care cuplul redox este reversibil, atunci cnd potenialul aplicat este invers, se va ajunge la potenialul la care se va reduce produsul format n prima reacie de oxidare i se va produce un curent de polaritate invers fa de scanarea direct. De obicei, peak-ul de reducere va avea o form similar cu peak-ul de oxidare. Ca urmare, din astfel de experimente se obin informaii despre potenialul redox i despre vitezele reaciilor electrochimice. Dac transferul de electroni la suprafa este rapid i curentul este limitat de difuzia speciilor spre suprafaa electrodului, atunci curentul de peak 471

(vrf) va fi proporional cu rdcina ptrat a vitezei de scanare. Aceast relaie este descris de ecuaia Cottrell.

Figura 5. Semnalul de excitare n cazul voltametriei ciclice.

Figura 6. Voltamograma ciclic pentru un rectant participnd la o reacie monoelectronic de transfer de electroni.

O voltamogram ciclic tipic, nregistrat pentru o reacie reversibil monoelectronic, este prezentat n figura 6. Rspunsul la baleiajul n sens direct este identic cu cel de la LSV. Cnd sensul de baleiaj este inversat, poziia echilibrului se modific n sens invers, convertind produsul (Fe2+) napoi la reactant (Fe3+). Curentul apare din nou datorit speciilor din soluie care difuzeaz spre electrod i are sens invers dect procesul din prima etap. Reacia de electrod i capacitatea electrodului Figura 7 descrie procesul care are loc n reacii de electrod simple. n cazul reducerii, specia (Ox) capabil de a primi un electron de la electrod difuzeaz spre suprafa, primete un electron i difuzeaz de la suprafa. Curentul de la suprafa este generat prin transferul de electroni de la electrod la speciile redox. n soluie, curentul este transportat prin migraia ionilor. Se pune ntrebarea dac un curent poate aprea dac nu exist nici o specie n soluia care poate transfera electroni la suprafa electrodului, la potenialul de interes? Rspunsul este c un curent tranzitoriu poate circula deoarece interfaa electrod-soluie se va comporta ca un condensator. Cnd potenialul electrodului este variat, ionii se mic spre suprafaa electrodului pentru a forma un strat dublu electric, aa cum se arat n figura 8. O interfa electrod-soluie, n absena unui cuplu redox nu este un condensator cu plci paralele pur, ci se comport mai degrab ca i cum ar fi, iar pentru descrierea sistemelor electrochimice se prefer acest model 472

care permite s se neleag comportamentul electrozilor n absena unui cuplu redox.

Figura 7. Sistem electrochimic care include transferul de electroni i circuitul echivalent corespunztor.

Figura 8. Schema stratului dublu electric.

Astfel, pentru un condensator cu plci paralele, sarcina condensatorului (Q) este proporional cu cderea de tensiune n condensator (E): Q=CE (4) Constanta de proporionalitate C este capacitatea mediului. Cea mai simpl descriere a capacitii electrochimice este dat de modelul Helmholtz:

C 0 = A

(5)

unde: este constant dielectric a materialului de separare a plcilor; o este permitivitatea spaiului liber, este distana de separare ntre plcile paralele, iar A este aria de electrod. Acest model nu descrie n mod adecvat toate interfeele electrochimice dac capacitatea depinde att de potenial, ct i de electrolitul suport. Capacitatea este un factor esenial n experimentele electrochimice pentru c d natere la un curent n timpul de ncrcare al condensatorului. Destul de logic (i fr imaginaie), numim aceast mrime curent de ncrcare. Pentru a calcula mrimea acestui curent, se difereniaz ecuaia (1) n raport cu t i presupune c capacitatea este o mrime constant:

dQ dE =C dt dt

(6) 473

Identificnd dQ/dt ca o expresie a curentului i dE/dt cu viteza de baleiaj a potenialului (v), se obine: I = C*v (7) Prin aceast derivare simpl, se obine o expresie pentru curentul de ncrcare n stare staionar, atunci cnd se aplic o treapt de potenial. Astfel, prin msurarea curentului de ncrcare la o anumit vitez de scanare, se poate determina capacitatea sistemului. Dac nu exist nici o posibilitate de transfer de electroni ntre soluie i electrod (nu exist un cuplu redox), atunci acest curent este singurul care va fi observat.

4. Voltametria ciclic fr cuplu redox activ

Dac se consider cazul foarte simplu al voltametriei ciclice, n care nu este prezent nici un cuplu redox activ (experimentul prezentat n figura 9), i se aplic semnalul de excitare a potenialului avnd forma din figura 9a, voltamograma obinut are forma din figura 9b. Rezultatul excitrii sistemului este o cretere brusc a curentului din cauza schimbrii brute a vitezei de scanare (). Curentul atinge o stare de echilibru, care se menine att ct se menine variaia de potenial. La inversarea vitezei de scanare, curentul i schimb semnul, iar cnd se oprete scanarea, curentul revine la zero.

Figura 9. Experiment de voltametrie ciclic, n absena speciei redox active.

5. Voltametria ciclic cu un cuplu redox activ

Dei curenii capacitivi n voltametrie ciclic sunt o realitate, puterea real a acestei tehnici const n capacitatea sa de a investiga mecanismul reaciei de electrod. De obicei, se vor folosi condiii n care curentul capacitiv este mic n comparaie cu curentul de transfer de electroni (denumit curent faradaic). Curentul faradaic depinde de doi factori: cinetica transferului de electroni i viteza la care specia redox difuzeaz spre suprafaa electrodului. 474

Pentru cuplul redox Fe(CN)63-/4-, care particip la reacia 8 a crei cinetic de transfer de electroni este destul de rapid, aa c se presupune c la suprafeele electrodului, concentraiile de Fe(CN)63- i Fe(CN)64- respect ecuaia lui Nernst 9: Fe (CN)6 3- + 1 e- Fe(CN)6 4- ;

o = 0.356 V vs. ENH (8)

(9)

E = E o' 0.0592 log

4 [Fe(CN)6 ]

[Fe(CN)3 ] 6

unde: E este potenialul aplicat i E0 este potenialul formal de electrod. Se poate observa c, deoarece potenialul aplicat devine mai negativ, concentraia de Fe(CN)63- trebuie s scad la suprafaa electrodului, prin reacia de reducere la Fe(CN)64-. Chiar i n cazul asumrii comportamentului nernstian, rRESoducerea fidel a voltamogramei cuplului Fe(CN)63-/4(figura 6) necesit o soluie analitic la dou ecuaii difereniale. (Detalii cu privire la simulri n voltametria ciclic pot fi gsite n Anal. Chem, 1964, 36, 706 i Anal. Chem., 1965, 37, 1351). Interpretri calitative. Dac presupunem c concentraiile de la suprafaa electrodului sunt reglementate prin ecuaia lui Nernst, concentraia de specii oxidate la suprafa va scdea odat cu negativarea potenialului. Presupunnd c viteza de transfer de electroni este foarte rapid, curentul i care este msurat cnd potenialul scade va fi direct proporional cu fluxul speciilor oxidate care difuzeaz spre suprafaa electrodului, conform ecuaiei 10: i=nFAJ Fluxul este guvernat de legea lui Fick: (10)

(C * C x = 0 ) dC D J = D x dx x = 0

(11)

unde: D este coeficientul de difuzie a speciilor; x este distana de la suprafaa electrodului; (dC/dx)x=0 este gradientul de concentraie la suprafaa electrodului, C* este concentraia de specie oxidat n volumul soluiei, i Cx=0 este concentraia sa la suprafaa electrodului. Dup cum se observ din ecuaia 11, cu ct este mai mare gradientul de concentraie, cu att este mai mare fluxul J i, prin urmare, conform ecuaiei 10, cu att este mai mare curentul catodic. 475

Schimbarea gradientului de concentraie pentru regiunea catodic din voltamograma ciclic este prezentat n figura 10. nainte ca un potenial s fie aplicat la electrod (t = 0), nu exist nici un gradient de concentraie, iar soluia are concentraia uniform din faza de volum C*. n momentul n care se aplic un potenial, concentraia speciei oxidate se epuizeaz la suprafa. Aceast concentraie mai mic la suprafa d un gradient de concentraie mai mare (cel puin iniial), astfel nct n conformitate cu legea de difuzie a lui Fick (ec. 11), fluxul spre suprafa i, prin urmare, curentul catodic vor fi mai mari. Dac se va continua negativarea potenialului, concentraia speciilor oxidate la suprafaa electrodului va tinde spre zero. n acelai timp, faza de volum a soluiei care este epuizat n specia oxidat va crete i gradientul de concentraie va ncepe s scad. Cu ct scade gradientul de concentraie, cu att va scdea fluxul spre suprafaa electrodului i curentul va ncepe s scad. Toate acestea vor duce la obinerea unei curbe curent-potenial care are forma din figura 11.

Figura 10. Profilul de concentraie la diferite momente de timp, n cadrul experimentului de CV (numai baleiaj negativ).

Figura 11. Alura voltamogramei ciclice pentru o reacie electrochimic nernstian. Parametrii electrochimici caracteristici.

Dac se inverseaz potenialul de scanare (nu este artat n figura 10), nc mai exist un strat epuizat de specie oxidat, dar concentraia de suprafa ncepnd s creasc, curentul va scdea n continuare. n cele din urm, vom ajunge la o regiune unde curentul anodic ncepe s domine (figura 11). Apoi sistemul va trece prin intermediul profilelor de concentraie similare pentru speciile reduse. Se va obine un curent de peak negativ i apoi curentul va scdea n amplitudine, cu ct epuizarea stratului de specie redus va crete.

476

Caracterizarea Aceasta a fost o descriere foarte calitativ a voltametriei ciclice. n 1964, Nicholson i Shain au efectuat simulri cantitative ale voltametriei care au dus la schimbri majore n domeniul electrochimiei. Parametrii importani pentru o voltamogram ciclic sunt potenialele de vrf (Ep ) i curenii de vrf (ip), care se cuantific conform figurii 11. Proces redox reversibil Utilitatea voltametriei ciclice este foarte dependent de analitul studiat. Analitul trebuie s fie o specie redox n domeniul de potenial experimentat. De asemenea, este foarte de dorit ca analitul s prezinte peak-uri reversibile. Dac un sistem redox rmne n echilibru pe ntreg domneiul de potenial scanat, procesul redox este numit reversibil (echilibru impune ca concentraiile de suprafa de Ox i Red s fie meninute la valorile prezise prin ecuaia Nernst). Un peak reversibil se obine atunci cnd un analit este redus sau este oxidat pe un sens al baleiajului de potenial i apoi este reoxidat sau redus pe sensul invers al baleiajului, conform reaciei 12: Ox + e-

Red

(12)

Toate voltamogramele reversibile arat la fel i au forma tipic indicat n figura 11. Simulrile cantitative arat mai multe aspecte pentru un sistem nernstian. Curentul de peak ntr-o voltamogram ciclic care conine o singur specie este descris de ecuaia Randles-Sevcik (ec. 13), la 25 C: ip = (2.687 *105) n3/2 A D1/2 v1/2 C* (13) unde: ip este curentul de peak (n A); n este numrul de electroni transferai; A este aria electrodului (n cm2), D este coeficientul de difuzie (n cm2 s-1); v este viteza de baleiaj (n V/s) i C* este concentraia n faza de volum a speciei (n mol/cm3). Chiar i cuplurile reversibile conin suprapoteniale de polarizare i astfel prezint o histerez ntre potenialul absolut de reducere (Epc) i de oxidare (Epa). Acest suprapotenial reiese dintr-o combinaie a vitezelor de difuzie a analitului i bariera intrinsec de activare a transferului de electroni de la electrod la analit. O descriere teoretic a suprapotenialului de polarizare este inclus n ecuaia Butler-Volmer i ecuaia Cottrell. Urmtorii parametrii sunt folosii pentru a caracteriza voltamograma ciclic a unui proces reversibil: a. Separarea potenialului de peak Ep (= Epc - Epa) = 59/n [mV], la toate vitezele de scanare, la 25 oC. Este foarte dificil pentru a atinge o sepa477

rare a peak-urilor n valoare de 59/n [mV], pe majoritatea electrozilor solizi. (Se consider o valoare mulumitoare aceea de 70 mV. Aceasta este o funcie de pregtire a electrozilor, precum i de vitez de scanare). b. Diferena ntre potentialul de peak (Ep) i potentialul la care curentul este jumtate dect la Ep, (Ep/2), este de 56.5/n [mV] la 25 C, unde: n este numrul de electroni transferai. c. Poziia potenialului de peak nu se modific cu viteza de scanare. d. Raportul curenilor de peak este unitar (ipa/ipc = 1) la toate vitezele de scanare. Acest raport poate fi perturbat pentru cuplurile reversibile n prezena unei reacii chimice, n experimentele de stripare sau n prezena unui fenomen de nucleaie. e. Curenii de peak (ip) sunt proporionali cu rdcina ptrat a vitezei de scanare (v), iar conform ecuaiei 13, funcia ip/v1/2 este independent de v. Influena vitezei de scanare asupra curentului pentru un transfer de electroni reversibil, ilustrat n figura 12, poate fi explicat ca i n cazul LSV, ca funcie de grosimea stratului de difuzie. f. n cazul n care valorile constantelor de difuzie pentru speciile oxidate i reduse sunt similare, valoarea Eo poate fi estimat ca media aritmetic a valorilor potenialelor de peak anodic i catodic (Eo = (Epa + Epc )/2). g. Atunci cnd se obin peak-uri reversibile, se pot determina informaii termodinamice, cum ar fi: potenialul de semi-und (E01/2).

Figura 12. Influena vitezei de baleiaj asupra voltamogramelor ciclice ale unui cuplu redox monoelectronic reversibil.

Figura 13. Voltamograma pentru o reacie cvasi-reversibil pentru diferite valori ale constantelor vitezelor de reducere i de oxidare.

Procese redox cvasi-reversibile Pentru sistemele cvasi-reversibile (cu 10-1> k > 10-5 cm/s), curentul este controlat att de transferul de ncrcare, ct i de transportul de mas. 478

Forma voltamogramei ciclice este funcie de raportului k/(nFD/RT)1/2. Pe msur ce acest raport crete, procesul se apropie de cazul reversibil. De asemenea, pentru valori mici ale acestuia, sistemul va prezenta un comportament ireversibil. n general, voltamogramele unui sistem cvasi-reversibil sunt mai extinse i prezint o separare mai mare, potenial de peak n comparaie cu un sistem reversibil. Deviaiile de la comportamentul reversibil sunt identificate prin variaii de la parametrii expui anterior (a-g). Exist dou cazuri de comportament ireversibil descrise mai jos. Sistemele nernstiane de transfer de electroni la electrod complete sunt greu de gsit n practic i moleculele redox-active sunt adesea destul de lente. Comportamentul unui electrod se poate apropia de cel al un sistem nernstian prin ncetinirea vitezei de scanare. Cu ct curentul este mai mic, viteza de transfer de electroni are o ans mai mare de a fi mai rapid, comparativ cu difuzia. Cu toate acestea, dac electrozii nu sunt curati (sau sunt acoperii cu monostraturi), sistemele devin mai lente i sunt apte s prezinte control cinetic. n aceste cazuri se observ c separarea de peak este o funcie de vitez constant a transferului de electroni, care scade cnd cuplurile redox nu sunt n msur s ajung la suprafaa electrodului. Cnd se efectueaz o voltamogram ciclic pe un electrod modificat cu un monostrat auto-asamblat, se poate demonstra rolul esenial pe care l joac curenia electrodului prin compararea voltamogramelor obinute cu electrodul curat i modificat. 1) Cinetica transferului de electroni lent Aa cum s-a menionat anterior, reversibilitatea impune ca cinetica de transfer de electroni s fie suficient de rapid pentru a menine concentraiile de suprafa ale Ox i Red, la valorile cerute de ecuaia lui Nernst. Prin urmare, reversibilitatea depinde de valorile relative ale constantelor de vitez a transferului de electroni eterogen (ks) i viteza de schimbare a potenialului (viteza de scanare, v). Dac raportul ks/v este suficient de mic nct concentraiile nernstiene nu pot fi meninute, atunci procesul se spune c este cvasi-reversibil. Un proces cvasi-reversibil se caracterizeaz prin: A) Separarea potenialelor de peak are o valoare care depaete 58/n mV i care crete cu creterea v (Ep > 58/n mV). Atta timp ct reversibilitatea depinde de valoarea raportului ks/v, este posibil ca n scopul de a schimba un proces cvasi-reversibil ntr-unul reversibil s se micoreze viteza de baleiaj v (ceea ce permite ca ntr-un timp mai ndelungat concentraiile superficiale s se ajusteze la noile valori ce479

rute de schimbrile de potenial). n plus, Ep depinde de valoarea ks/v i, prin urmare, ks poate fi calculat din variaiile Ep cu v. B) Din pcate, creterea Ep cu creterea v poate fi, de asemenea, cauzat de rezistena necompensat a soluiei (Ru). Efectul Ru poate fi minimizat printr-un design experimental atent, prin compensare electronic cu feedback pozitiv i prin manipularea ulterioar a datelor. Cele dou efecte pot fi distinse prin varierea concentraiei de analit (scderea potenialului datorit rezistenei necompensate a soluiei i astfel, valoarea Ep rezultat crete cu creterea curentului, n timp ce valoarea ks este independent de concentraia de analit). C) Atunci cnd peak-urile sunt semi-reversibile, adic raportul ipa/ipc este diferit (mai mare sau mai mic) de 1, este posibil s se determine mai multe informaii, n special despre procesul cinetic care urmeaz dup cel electrochimic. n figura 13, prima curb prezint cazul n care constantele de vitez ale proceselor, att de oxidare, ct i de reducere sunt nc rapide, cu toate acestea, cnd constantele de vitez sunt reduse, potenialele de peak se deplaseaz spre valori mai pozitive/negative. Din nou, acest lucru poate fi neles n termeni de echilibru la suprafa care nu este stabilit att de rapid. n aceste cazuri, separarea potenialelor de peak nu mai este fix, dar variaz n funcie de viteza de scanare. n mod similar cu cazul de reversibilitate, curentul de peak variaz n funcie de rdcina ptrat a ratei de scanare. Prin analizarea variaiei potenialului de peak, n funcie de viteza de scanare este posibil s se obin o estimare pentru constantele vitezelor de transfer de electroni. 2) Reaciile chimice ale Ox i Red Valorile de echilibrul pentru Ox i Red pot fi meninute n timpul unui experiment de voltametrie ciclic, dac ambele specii Ox i Red sunt stabile n timpul experimentului. De exemplu, n cazul n care reducerea de la Red la Ox este urmat de conversia lui Red la P, atunci mai mult Red trebuie generat pentru a compensa pierderea de Red. Prin urmare, viteza de reducere crete i potenialul de peak (Epc) se deplaseaz spre o valoare mai pozitiv. n plus, raportul ipa/ipc este mai mic dect unitatea (din moment ce doar o parte din moleculele care au fost reduse prin baleiajul direct sunt disponibile pentru reoxidation prin baleiajul invers). Valoarea curentului poate fi, de asemenea, afectat de reacii chimice care urmeaz dup transferul de electroni. Efectul unei reacii chimice depinde de valoarea raportului k/v (unde k este constanta de vitez a reaciei chimice). Dac aceast valoare este mare, 480

atunci reacia chimic are un efect semnificativ, n timp ce un efect mai redus apare n cazul n care acest raport este mai mic. Prin urmare, este posibil s se elimine efectul reaciei chimice (deci s se restabileasc reversibilitatea), prin cresterea v. Valoarea lui k poate fi calculat fie prin studii de simulare, fie prin investigarea efectului vitezei de baleiaj asupra raportului ipa/ipc. Dei voltametria ciclic este foarte utilizat pe scar larg pentru caracterizarea speciilor redox (de exemplu: poteniale redox i stabilitatea diferitelor stri de oxidare) i de investigare calitativ a reaciilor chimice care nsoesc transferul de electroni, exist o serie de dezavantaje inerente n cadrul acestui procedeu: a. Efectele transferului eterogen de electroni lent i reaciile chimice nu pot fi separate. Dac ambele efecte sunt prezente, atunci constantele de vitez pentru aceste procese nu pot fi calculate folosind metode de simulare. b. Exist un curent rezidual de ncrcare n timpul experimentului, exprimat prin vCdl (unde: Cdl este capacitatea la interfaa electrodului de lucru). Acest fapt restrnge limita de detecie la aproximativ 10-5 M. n plus, raportul dintre curentul de peak faradaic i curentul de ncrcare scade cu creterea v (n timp ip este proporional cu v1/2), plasnd o limit superioar a lui v dect poate fi utilizat. n ciuda acestor limitri, voltametria ciclic este foarte potrivit pentru o gam larg de aplicaii. ntr-adevr, n unele domenii de cercetare, voltametria ciclic este una din tehnicile standard utilizate pentru caracterizare. Procese redox ireversibile (control de transfer de sarcin) n cazul transferului de electroni ne-reversibil, exist diferene considerabile n ceea ce privete parametrii voltamogramei. Cnd peak-urile sunt ne-reversibile este imposibil s se determine parametrul E01/2. Acesta poate fi ns determinat, cu toate acestea el necesit adesea existena de cantiti egale de analit, n ambele stri de oxidare. Cnd un peak este ne-reversibil, voltameteria ciclic nu poate determina dac peak-ul este la potenialul su termodinamic sau s-a deplasat la un potenial mai extrem, datorit unui suprapotenial. Cuplul redox ar putea fi ireversibil din cauza unui proces chimic care urmeaz, un exemplu comun pentru metale tranziionale este o schimbare n geometria sferei de coordonare. Dac este acesta cazul, atunci viteze mari de scanare pot arta peak-uri reversibile. De asemenea, este posibil ca peak-ul s fie ireversibil din cauza unui proces fizic, cel mai frec481

vent, o form de precipitare. Unele speculaii pot fi fcute n ceea ce privete peak-urile ireversibile, cu toate acestea, ele sunt n general n afara domeniului de aplicare al voltametriei ciclice. Condiii experimentale Metoda utilizeaz o combinaie de trei electrozi: electrodul de lucru, un electrod de referin i un contraelectrod (figura 14). De obicei, electrolitul este adugat la soluia de testat pentru a asigura o conductivitate suficient. Combinaia dintre solvent, electrolit i electrodul de lucru specific determin intervalul de potenial baleiat.

Figura 14. Celula electrochimic pentru experimentul de voltametrie liniar sau ciclic.

n timpul voltametriei ciclice, electrozii sunt statici i aezai n soluii negitate. Aceast metod cu soluie staionar are ca i consecin apariia caracteristicilor de peak controlate de difuzie. Aceast metod permite, de asemenea, ca o parte din analit s rmn, dup reducere sau oxidare, acolo unde poate afia n continuare activitate redox. Agitarea soluiei ntre trasarea voltamogramelor este important pentru ca s furnizeze suprafaei electrodului analit proaspt n fiecare nou experiment. Solubilitatea unui analit se poate schimba drastic dac se schimb sarcina total a acestuia. Deoarece voltametria ciclic modific, de obicei, sarcina analitului, este uzual pentru analitul redus sau oxidat s precipite pe electrod. Aceast stratificare a analitului poate izola suprafaa electrodului, evideniind propria activitate redox n scanrile ulterioare sau, cel puin, poate modifica 482

suprafaa electrodului. Din acestea sau alte motive, adesea este necesar curarea electrozilor ntre scanri. Materialele uzuale pentru electrozii de lucru sunt: crbunele sticlos, platina i aurul. Aceti electrozi sunt, n general, ncastrai ntr-un material izolator inert, avnd doar un disc expus la unul dintre capete. Un electrod de lucru obinuit are o raz de un ordin de mrime de civa mm. Pentru interpretarea rezultatelor de voltametrie ciclic este important ca electrodul s posede o arie a suprafaei controlat cu o form definit. Pentru a executa experimente de voltametrie ciclic la viteze de scanare mari este insuficient un electrod de lucru obinuit. Vitezele mari de scanare creeaz peak-uri avnd intensiti mari de curent, care au ca rezultat creterea rezistenei, ceea ce duce la denaturarea formei voltamogramei. Pentru a minimiza curentul i rezistena, pot fi folosii ultramicroelectrozi. Contraelectrodul cunoscut, de asemenea, sub numele de electrod auxiliar, poate fi orice material care conduce cu uurin i nu va reaciona cu volumul soluiei. Reaciile care apar la suprafaa contraelectrodului sunt lipsite de importan, atta timp ct este asigurat o conducie bun a curentului. Pentru a menine curentul observat la contraelectrod, se vor oxida sau reduce adesea electrolitul sau solventul. Electrozii de referin uzuali sunt cei de calomel sau de Ag/AgCl saturai cu KCl, uneori separai de soluia testat prin capilare Luggin care s mpiedice infestarea electrolitului cu KCl. Remarci Voltametrie ciclic nu este o tehnic hidrodinamic. ntr-o tehnic hidrodinamic, fluxul spre suprafaa electrodului este realizat prin agitare, pompare a soluiei sau rotaia electrodului, cum este n cazul electrozilor disc-rotitor i disc-inel-rotitor. Aceste tehnici intesc condiiile de stare de echilibru, care apar oricum indiferent dac baleiajul se face dinspre valori pozitive sau negative, ceea ce le limiteaz la voltametria cu baleiaj liniar de potenial. Exemplu Se realizeaz o soluie de hexacianoferat de potasiu 0.5 mM K3Fe(CN)6 prin dizolvarea cantitii corespunztoare de sare n 100 ml de KCl 1 M. Utiliznd voltametria ciclic s sa investigheze comportamentul cuplului redox Fe(CN)63-/4- i s se determine parametrii electrochimici: Eo, Ep, ipa/ipc, precum i D. Celula electrochimic conine 10 ml soluie de analit i este echipat cu 3 electrozi: electrod de lucru din grafit, contraelectrodul de platin i electrodul de referin Ag/AgCl/KClsat. 483

Procesele de electrod sunt: reducere: oxidare: [FeII(CN)6]3- + e- [FeIII(CN)6]4[FeII(CN)6]4- [FeIII(CN)6]3- + e(13) (14)

Aparatura folosit este un poteniostat Autolab PGStat 10 (EcoChimie, Olanda) pilotat de computer (figura 15).

Figura 15. Poteniostat Autolab PGStat 10.

La rularea softului GPES se deschid 3 ferestre (figura 16). n fereastra Edit Procedure se fixeaz parametrii experimentului: potenialul de start, potenialul de ntoarcere, numrul de cicluri i viteza de baleiaj. Eventual, se fixeaz i parametrii pretratamentului (depinde de sistemul studiat). n fereastra Manual Control se bifeaz toat gama de cureni pentru ca rRESezentarea grafic on-line s se autoscaleze. n fereastra Data presentation va aprea voltamograma on-line, dup ce s-a dat comanda Start.

Figura 16. Softul GPES pentru pilotarea poteniostatului.

484

Pentru sistemul studiat, se obin voltamogramele din figura 17, la diferite viteze de baleiaj. Din panta rRESezentrii log I vs log v (figura 18) se stabilete puterea lui v i astfel se verific posibilitatea de a utiliza ecuaia Randles-Sencik pentru calculul coeficientului de difuzie.
0.00075

20 mV/s 50 mV/s 70 mV/s 100 mV/s 200 mV/s

0.00050

anodic catodic 1E-3

0.00025

-0.00025

-0.00050

-0.00075

log I
1E-4

I/A

0.00000

0.0

0.2

0.4

0.6

10

E/ V vs. Ag/AgCl, KClsat

log v

Figura 17. Voltamograma ciclic pe CV/NP (0.0188:1)-Nafion n 5 mM K3[Fe(CN)6] + 1 M KCl. Condiii experimentale: electrolit, tampon fosfat 0.1 M, pH = 6.8; 2 cicluri; potenial de start, -0.1 V/ Ag/AgCl, KClsat.

Figura 18. Dependena log I vs. Log v pentru electrodul CV/NP (0.0188:1)-Nafion n 5 mM K3[Fe(CN)6] + 1 M KCl. Condiii experimentale: electrolit, tampon fosfat 0.1 M, pH = 6.8; 2 cicluri; potenial de start, -0.1 V/ Ag/AgCl, KClsat.

Tabelul 1. Parametrii electrochimici ai sistemului studiat n figura 17.

v (mV/s) 50 100 Epa (V) 0.303 0.303 Epc (V) 0.253 0.253 Ipa (A) 1.023e-4 2.254e-4 Ipc (A) -1.255e-4 -2.753e-4 Eo (V) 0.278 0.278 Ep (V) 0.050 0.050 ipa/ipc 0.815 0.818

Din datele prezentate n tabelul 1, se observ ca mrimile Ep i ipa/ipc au valori care plaseaz sistemul studiat n cazul sistemelor monoelectronice, reversibile (conform Anexei 1). Cronoamperometrie Cronoamperometria este o tehnic electrochimic n care potenialul electrodului de lucru este variat dup un semnal tip treapt, curentul faradic rezultat la electrod este monitorizat ca funcie de timp. Ca i toate tehnicile cu puls de potenial, cronoamperometria genereaz un curent mare, care scade exponenial cu timpul, ca orice circuit RC. Curentul obinut (figura 19) are dou componente: un curent datorat ncrcrii stratului dublu (figura 20) i altul datorat transferului de electroni. 485

Figura 19. Cronoamperograma

Figura 20. Profilul curentului stratului dublu electric

Considernd o situaie n care un electrod solid este cufundat ntr-o soluie care conine forma oxidat (Ox) a unui cuplu redox la concentraie iniial cunoscut (C0), de ex.: 1 mM. Iniial, electrodul este fixat la un potenial (Ei) mult mai pozitiv decat ale E0 a cuplului Red/Ox, asigurndu-ne c doar Ox este prezent n soluie. Soluia conine, de asemenea, un exces de electrolit inert, i se lucreaz n acele condiii experimentale care s asigure c fluxul spre electrod s fie strict controlat de difuzie. La un moment t0, potenialul este modificat dup un semnal de tip treapt pn la o valoare semnificativ mai negativ dect E0 pentru cuplu redox (Es), iar forma Ox din vecintatea electrodului este imediat transformat (dup o cinetic reversibil) la forma Red. Ca urmare a transformrii, concentraia de Ox din vecintatea electrodului este redus la zero fa de concentraia iniial, n faza de volum de 1 mM. Aceasta duce la formarea unui gradient de concentraie pentru Ox, prin care Ox din cea mai mare parte a soluiei trebuie s difuze la suprafaa electrodului, unde este imediat redus la Red. Cu ct electrodul rmne mai mult la acest potenial de reducere, cu att stratul de difuzie srcit n Ox, se extinde. Un gradient similar, dar n sens opus exist pentru Red, care dup formarea sa este liber s difuzeze departe de suprafaa electrodului, n faza de volum, pe msur ce trece timpul. Aceast situaie este prezentat n Figura 21. Aa cum s-a discutat anterior, curentul faradaic n condiii controlate de difuzie este direct legat cu gradientul de concentraie, Ci/x, evaluate la x = 0. Astfel, cum panta profilului de concentrare pentru Ox scade cu timpul n urma excitrii sub form de treapt de potenial, acelai lucru se va observa i n cazul curentului. 486

Figura 21. Semnalul de excitare in cronoamperometrie si evolutia profilului de concentratie la suprafata electodului.

n exemplul de mai sus, concentraia de Ox la suprafa a atins imediat valoarea zero pentru o treapt de potenial mult mai negativ dect E0 a cuplului redox. n general, pentru un sistem reversibil (de reducere), raportul [Red] la [Ox] la suprafaa electodului este dat de ecuaia lui Nernst la orice potenial, cu raportul 100:1 ajungnd la o valoare de 118 mV mai negativ dect E0. Informaii suplimentare cu privire la formarea de gradienilor de concentrare, pot fi gsite la (http://www.chem.uoa.gr/applets/AppletDiffus/Appl_Diffus2.html). Pe lng cel mai frecvent experiment de cronoamperometrie, adic cel cu o singur treapt de potenial, n care numai curentul rezultat este nregistrat, exist i cele cu treapt dubl de potenial, n care potenialul revine la o valoare final (Ef) dup ce este meninut o perioad de timp , la potenialul Es. Ecuaia cea mai util n cronoamperometria este ecuaia Cottrell, care descrie curentul observat (electrodul planar) n orice moment, n urma unui trepte de potenial ntr-o reacie redox reversibil (sau la suprapotenial mare) n funcie de t-1/2. i = n F A Co Do1/2 -1/2 t-1/2 [A]
2

(15)

unde n = numrul de electroni implicai n reactie; F = constanta Faraday (96,485 C/echivalent), A = aria electrodului (cm ), C0 = concentraia speciei electroactiv (mol/cm ), si D0 = constanta de difuzie pentru specia electroactiv (cm /s). Curentul datorat ncrcrii stratului dublu, contribuie la curentul total observat dup aplicarea unei treapte de potenial. Prin natura lui acest curent capacitiv, ic, scade ca funcie de 1/t si are valori semnificative numai n perioada iniial (de cteva ms) imediat dup aplicarea semnalului treapt. Acesta poate fi uor nregistrat prin efectuarea experimentului ntr-o celul care conine doar electrolit. De obicei, aceast influen poate fi evitat numai lund n considerare datele i-t n ultimele 90% din timp. 487
2 3

Cronoamperometria cu pas dublu de potenial este ilustrat n figura 22. n partea stng a figurii este artat felul cum se aplic treapta de potenial de la Ei la Es, unde este meninut un timp , pentru ca apoi s revin la Ef = Ei. n general, curentul din perioada de ntoarcere este nregistrat tot pentru un inte rval de timp .

Figura 22. Semnalul de excitare i rspunsul n cronoamperometria cu treapt dubl .

Cum era de ateptat din ecuaia Cottrell, curentul observat pentru prima treapt scade cu t-1/2. n acest exemplu, transferul de electroni este reversibil att chimic, ct i electrochimic. Curentul aprut la treapta de ntoarcere este conceptual mai dificil de explicat dect cel de la prima treapt. Pentru cei interesai detaliile se afl n Bard i Faulkner. Un sistem simplu, reversibil poate fi identificat prin compararea valorile curentului direct i invers msurat n acelai interval de timp, dup fiecare treapt de potenial. De exemplu, valorile curentului msurat la un moment egal cu /2, dup fiecare treapt (notat ir i if n figura 22) pentru un astfel de sistem ar duce la o valoare egal cu 0.293 pentru raportul dintre [-ir (2)/if ().Prezena unei reacii chimice dup etapa de transfer de electroni va duce la un raport diferit de aceast valoare teoretic. Cronoamperometria se preteaz bine la msurarea exact a ariei electrodului (A) prin utilizarea unui cuplu redox bine-definit (cu n, Co si Do cunoscute]. Cu o suprafa de electrod cunoscut, sunt uor de realizat msurtori, fie de n, fie de D0 pentru o specie electroactiv. Metoda dublei trepte de potenial este deseori aplicat n msuratori de constante de vitez pentru reacii chimice (inclusiv produi de adsorbie) care apar n urma primei trepte de potenial.

6.Bibliografie
1. 2. Bard A. J. , Faulkner L. R., Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications, John Wiley and Sons Publishers, New York, 2001. Brett C. M. A., Brett Oliveira A. M., Electrochemistry: Principles, Methods and Applications, Oxford University Press, USA, 1993.

488

3.

Bartlett P.N. (Editor) Bioelectrochemistry: Fundamentals, Experimental Techniques and Applications, John Wiley & Sons, Ltd, 2008.(ISBN 978-0470843642) 4. Compton R. G., Banks C. E, Understanding voltammetry, World Scientific, Singapore, 2007. 371 + XII p., ISBN 981-270-625-9 5. V. Mireski, . Komorsky-Lovri, M. Lovri: Square-Wave Voltammetry. Theory and Application. In: Monographs in Electrochemistry (F. Scholz, edt) Springer-Verlag, Berlin., 2007, ISBN 978-3-540-73739-1, 6. Nicholson R. S., Shain I., Anal. Chem., 1964, 36, 706. 7. Nicholson R. S., Shain I., Anal. Chem., 1965, 37, 178. 8. Nicholson R. S., Shain I., Anal. Chem., 1965, 37, 190. 9. Nicholson R .S., Anal. Chem., 1965, 37, 667. 10. Nicholson R. S., Anal. Chem., 1965, 37, 1351 (https://twiki.ogt.co.uk/twiki/pub/People/ElectrochemistryPapers/TheoryandApplicationofC yclicVoltammetryforMeasurementofElectrodeReactionKinetics.pdf)

Anexa 1.
Criterii de identificare pentru voltametria ciclic cu specia redox n soluie
ip = (2.687 *105) n3/2 AD1/2 v1/2C* [A]; se calculeaz D

Sisteme reversibile

28.5 [mV] RT E p - E1/2 = - 1.109 = n nF RT 28.5 [mV] E p/2 = E1/2 + 1.09 = E1 / 2 + n nF

Ep (= Epc - Epa) = 59/n ipa/ipc = 1

Sisteme cvasi-reversibile

nF i p = nFAC* D1/2 (E) v1/2 Ox RT RT Ep/2 - Ep = ( , ) nF

ko = nF D1 D Ox Red RT 1/2 v

1/2

D /2 ox k , se calculeaz ks s D v 1 / 2 = Re d 1/2 nF Dox RT

Sisteme ireversibile, ip = (2.99 *105) n(na)1/2 A D1/2 v1/2 C* [A], se calculeaza D na = numr de 1/2 o 1/2 RT 0.78 + ln D Ox + ln n a F + lnv1/2 , se calculeaza k electroni transferai n E p = E o' ko n a F RT etapa determinat de vitez 47.7 [mV], se calculeaza na

n a [Pentru identificarea notaiilor i detalii vezi: Nicholson, Anal. Chem. 1965, 37(11), 1351]

E p - E p/2 =

489

Electrochimia unei substane cu potenial biologic activ. Studiu de caz

Conf. dr. ing. Graziella Liana Turdean Cuprins
1. Exemplu de utilizare a voltametriei ciclice pe electrod de platin pentru estimarea coeficientului de difuzie, prin experimente realizate n K3[Fe(CN)6] la diferite viteze de baleiaj. .....................490 2.Calculul parametrilor electrochimici pentru o substan redox (pe baz de fier) n soluie .........493 2.1. Influena vitezei de baleiaj asupra comportrii heminei in soluie (G//Fe(III)P) pe electrod de grafit.................................................................................................................494 2.2. Influena pHului asupra comportrii sistemului G//Fe(III)P pe electrod de grafit ......495 3. Calculul parametrilor electrochimici pentru o substan redox (pe baz de fier) imobilizat n polimeri ........................................................................................................497 3.1. Influena vitezei de baleiaj asupra comportrii heminei adsorbit (G/SWCNTFe(III) P-Nafion) pe electrod de grafit .....................................................498 3.2. Calculul constantei eterogene de transfer de electroni pentru sistemul G/SWCNTFe(III)P-Nafion ........................................................................................499 3.3. Studiul integritii filmului de Fe(III)P pentru sistemul G/SWCNTFe(III)P-Nafion prin calculul ariei suprafeei active ..............................................................................501 3.4. Influena pH-ului asupra comportrii sistemului adsorbit (G/SWCNT Fe(III)P-Nafion) pe electrod de grafit ...........................................................................502 3.5. Estimarea stabilitii sistemului G/SWCNTFe(III)P-Nafion la funcionare continu .....504 4. Concluzii .............................................................................................................................505 5. Bibliografie ..........................................................................................................................506 6. Anex ..................................................................................................................................507

1. Exemplu de utilizare a voltametriei ciclice pe electrod de platin pentru estimarea coeficientului de difuzie, prin experimente realizate n K3[Fe(CN)6] la diferite viteze de baleiaj.
a. Se traseaz voltamogramele ciclice la diferite viteze de baleiaj pe electrodul de platin n soluia de 5 mM K3[Fe(CN)6] care conine 0.1 M KCl ca i fond electrolitic pentru mbuntirea conduciei (Figura 1A). Comportamentul redox al acestei substane considerat standard este descris de ecuaia 1: Fe(CN)6 + e
-3

Fe(CN)6

-4

(1)

i se manifest prin apariia unei perechi de picuri bine conturate (poziionate la Ea = 0.354 V, Ec = 0.245 V, Ipa = 0,155 mA si Ipc = 0.157 mA) avnd parametrii electrochimici (E = 0.109 V, Eo = 0.300 V si Ipa/Ipc = 0.987, pentru o vitez de baleiaj de 50 mV/s. 490

(A)
800 600 400 200 0 -2 0 0 -4 0 0 -6 0 0 -0 .2

(B)
5 m V /s 1 0 m V /s 2 5 m V /s 5 0 m V /s 7 5 m V /s 1 0 0 m V /s 2 5 0 m V /s 5 0 0 m V /s 7 5 0 m V /s 9 0 0 m V /s
anodic catodic

I / A

I/A
1E-4

10

100

1000
-1

v / (mV *s )
0 .0 0 .2 0 .4 0 .6

/ V vs. ESC

(C)
Figura 1. (A) Voltamograma ciclica a 5 mM K3[Fe(CN)6]+ 0.1 M KCl pe electrod de platina. (B) Dependenta log I vs. log v pentru voltamogramele din fig 1A. (C) Influenta vitezei de baleiaj asupra curentului de peak I pentru voltamogramele din fig 1A. Condiii experimentale: potenial iniial, 0.2 V vs. ESC.
500

/ A
anodic

400 300 200 100

I / A I

0 -1 0 0 -2 0 0 -3 0 0 -4 0 0 0 ,0 0 ,2 0 ,4 0 ,6 0 ,8
1/2

catodic

1 ,0

1 /2

/ (V /s )

b. Intensitatea curentului de peak (Ip) depinde de viteza de baleiaj (v) n conformitate cu ecuaia Randles-Sevcic (ecuatia 2) pentru un sistem reversibil sub control difuziv [Bard A. J., 1980]: Ip = 2.69*105 n3/2 A D01/2 v1/2 Co* (2) unde: Ip = curentul de peak (A), n = numrul de electroni, A = aria electrodului (cm2), D0 = coeficientul de difuzie (cm2/s), v = viteza de baleiaj (V/s) ; C0* = concentraia soluiei n faz de volum (mol/cm3). Astfel, cu ajutorul curenilor de peak anodic i catodic (Ipa, Ipc), se traseaz dependenta log I vs. log v (figura 1B). Ecuaiile regresiei liniare sunt prezentate n tabelul 1. Panta acestor regresii ne d indicii despre tipul de transfer de sarcin difuziv (specia n soluie, panta n jur de 0.5, dependena I vs. v1/2, conform ecuaiei Randles Sevcik) sau transfer de sarcin eterogen (specia adsorbit, panta n jur de 1). Analiza datelor prezentate n tabelul 1 indic c specia redox studiat, K3[Fe(CN)6], se afl n soluie, iar intensitatea curentului, I, respec491

t dependena Randles-Sevcik fa de v1/2.

Tabelul 1. Regresii liniare pentru dependenele log I v.s log v i respectiv, I vs. v.
anodic log Ia = (-4.518 0.011) + (0.415 0.007) log v Ia /A= (2,132 e-5 4.220e-6) + (5.817e-4 2.008e-5)v1/2 /V/s log Ic = (-4.552 0.013) + (0.438 0.009) log v Ic /A= (-1,648e-5 3.90e-6) (6.131e-4 1.858e-5) v1/2 /V/s R = 0.9994, n=6 R = 0.9976, n = 6 R =0.9992, n=6 R = 0.9982 n = 6

catodic

c. Avnd stabilit dependen log I vs. log v se poate trasa dependena I vs. v1/2 (figura 1C) i estima panta regresiei liniare, pentru a putea utiliza ecuaia Randles Sevcik la calculul coeficientului de difuzie, D. Valorile parametrilor regresiei liniare I vs. v1/2 sunt prezentate n tabelul 1. Atentie, pentru a putea utiliza corect rezultatele, n rRESezentarea I vs. v1/2, valorile curentului trebuie s fie n amperi (A) i ale vitezei de baleiaj (v) n (V/s). d. Se nlocuiesc n ecuaia Randles Sevcik (ecuaia 2) parametrii cunoscui. Astfel: n = numrul de electroni este 1 n conformitate cu reacia 1; A = aria electrodului (cm2) este (d2)/4, unde d= diametrul electrodului, adic d = 0.7 cm, C0* = concentraia soluiei de K3[Fe(CN)6] n faz de volum (mol/cm3), adic 5 mM = 5 10-6 mol/cm3. Astfel, ecuaia 2 devine: Ip = 2.69*105 (1)3/2 [ (0.7)2]/4 D01/2 5 10-6 v1/2 analoaga unei ecuaii liniare y = a x, unde a este panta. Prin urmare panta regresiei liniare este: a = 2.69*105 (1)3/2 [ (0.7)2]/4 D01/2 5 10-6 = 0.00517 102 D01/2 de unde: D0 = a2/(0.00517 102)2 Adic: Do,a = (5.817 10-4)2/(0.00517 102)2 = 1.265 10-6 cm2/s si Do,c = (6.131 10-4)2/(0.00517 102)2 = 1.41 10-6 cm2/s, iar Dmediu = 1.33 10-6 cm2/s. Datele obinute sunt n concordan cu cele din literatur care variaz ntre: D = 6.5 10-6 cm2/s obinut cu o soluie 20 mM K3[Fe(CN)6] [Hrapovic S., 2003] si D = 5.9 10-5 cm2/s obinut cu o soluie 5 mM K3[Fe(CN)6] [Ye J.-S., 2004]. 492

2.Calculul parametrilor electrochimici pentru o substan redox (pe baz de fier) n soluie
Hemina (denumirea IUPAC: cloro[3, 7, 12, 17 tetrametil - 8, 13 divinilporfirin - 2, 18 dipropanoato (2)]fier(III), denumirea comercial: Panhematina) este o porfirin cu coninut de fier (figura 2). Mai exact, este protoporfirina IX care conine un ion de fier feric (Heme b) i un ligand clorur. Este folosit n gestionarea atacurilor de porfirie10, n special n porfiria intermitent acut11. Se distinge de hematin12 care are o grupare hidroxid n loc de clorur. Cu toate acestea, termenii sunt uneori echivaleni. Hematina este considerat "factorul X" necesar pentru creterea Haemophilus Figura 2. Structura heminei. influenzae13. Voltamogramele ciclice ale Fe(III)P n soluie obinute la diferite viteze de baleiaj pe electrod de grafit arat o pereche de peak-uri bine definite plasate la un potenial formal standard (o)14 care se plaseaz ntre 0.350 to - 0.500 V vs. Ag/AgCl, KClsat, n funcie de pHul soluiei. Peak-urile au fost atribuite unui comportament reversibil monoelectronic al cuplului redox Fe(III)/Fe(II) coordinat n inelul porfirinic (Figura 3A), n conformitate cu reacia 3: Fe(III)P + e- Fe(II)P Din
10

(3) conine parametrii electrochimici ai

tabelul

2,

care

Porfiria este o boal ereditar cauzat de o tulburare a sintezei hemului (fraciunea neproteic a hemoglobinei) i caracterizat prin acumularea n esuturi a unor substane intermediare ale acestei sinteze, porfirinele. Porfiriile sunt boli foarte rare. 11 Porfiria intermitent acut se manifest de cele mai multe ori la vrsta adult prin dureri abdominale acute, uneori prin crampe, printr-o slbiciune muscular i prin tulburri psihice. Urinele devin roii atunci cnd sunt lsate s atepte. Numeroase medicamente, ca barbituricele, contraceptivele orale, sulfamidele si fenitoina, se afl la originea acestor crize. 12 Hematin, hematine, (s.f.) pigment care provine din snge i conine fier. din fr. hmatine [Dicionarul explicativ al limbii romne, Academia Romn, Institutul de Lingvistic Iorgu Iordan, Editura Univers Enciclopedic, 1998]. 13 Haemophilus influenzae sunt cocobacili Gram negativi, mici (1 - 1,5/0,3 m), cu bacili scuri, drepi, cu capete rotunjite, pleomorfic. Este non-motil, nu formeaz spori, facultativ anaerobe. 14 Potenialul formal standard se calculeaz ca media aritmetic a potenialelor de peak anodic i catodic.

493

voltamogramelor din figura 4A se observ c la viteze de baleiaj care depesc 300 mV*s-1, separarea peak-urilor (Ep) devine superioar valorii de 59/n mV, indicnd transformarea procesului reversibil, ntr-unul cvasi-reversibil.

2.1. Influena vitezei de baleiaj asupra comportrii heminei in soluie (G//Fe(III)P) pe electrod de grafit
Trasarea dependenei log I vs. log v (figura 3B) a permis estimarea pantelor, care avnd valori n jur de 1 (tabelul 3), indiferent de pHul soluiei, indic faptul c specia studiat se adsoarbe pe electrod n timpul trasrii voltamogramelor. Ca urmare dependena liniar I-v (figura 3C) confirm un transfer de electroni heterogen, descris de o ecuaie n care v este la puterea 1, caracteristic speciilor adsorbite. Ca urmare, nu este posibil calculul coeficientului de difuzie D al speciei studiate din ecuaia Randles-Sevcik (aa cum s-a descris n capitolul 1, pentru specia considerat standard, K3[Fe(CN)6]. (A)
300 200 100
v v v v v v v = = = = = = = 10 m V*s -1 20 m V*s -1 100 m V*s -1 300 m V*s -1 500 m V*s -1 1000 m V*s -1 1500 m V*s
-1

(B)
anodic catodic 100

I/A

log I

10

-100 -200 -300 -750

E / m V vs. Ag/AgC l, KC lsat

-500

-250

10

100

1000

log v

(C )
Figura 3. (A) Voltamogramele ciclice ale 0.5 mM Fe(III)P pe electrod de grafit (sistem G//Fe(III)P). (B) Dependenta log I vs. log v pentru voltamogramele din fig 3A. (C) Influenta vitezei de baleiaj asupra curentului de peak I pentru voltamogramele din fig 3A. Condiii experimentale: electrolit, TRIS 0.05 M, pH 8; potenial initial, -0.85 V vs. Ag/AgCl, KClsat; soluie dezaerat.
200

/ A I /A I
cat an

100

-1 0 0

-2 0 0

-3 0 0 0 500 1000 1500

v / m V *s

-1

494

Tabelul 2. Valorile parametrilor electrochimici pentru sistemul G//Fe(III)P investigat prin voltametrie ciclica pe electrod de grafit. Condiii experimentale: vezi figura 3.
v mV/s 10 20 50 70 100 200 300 500 700 1000 1500 Epa mV vs ER -420.0 -420.0 -420.0 -420.0 -415.1 -405.3 -405.5 -400.6 -391.7 -370.2 -361.0 Epc mV vs ER -420.0 -440.0 -439.9 -439.9 -444.8 -454.6 -454.4 -464.3 -478.7 -484.7 -506.4 Ipa A 0,88 2,51 8,54 12,34 18,11 35,88 54,17 86,10 117,10 157,70 229,20 Ipc A -5,86 -7,08 -13,29 -16,94 -23,76 -44,53 -67,86 -108,90 -146,70 -200,50 -286,30 E =Epa-Epc mV vs ER 0 20.0 19.9 19.9 29.7 49.3 48.9 63.7 87.0 114.5 145.4 Eo 420 430 429.95 429.95 429.95 429.95 429.95 432.45 435.2 427.45 433.7 Ipa/Ipc 0.15 0.35 0.64 0.73 0.76 0.81 0.80 0.79 0.80 0.79 0.80

Tabelul 3. Panta dependentei log Ip log v pentru sistemul G//Fe(III)P. Condiii experimentale: vezi figura 3.
pH 6.48 8 8.82 Panta proces anodic 0.53091 0.0217 0.9925/11 1.0784 0.03639 0,99492/11 0.8765 0.0245 0.9965/11 proces catodic 0.91835 0.0096 0.9995/11 0.82581 0.0318 0,99337/11 1.09837 0.0454 0.9924/11

2.2. Influena pHului asupra G//Fe(III)P pe electrod de grafit

Reacia general de electrod: ox + n e- + p H+ red

comportrii

sistemului

(4)

este caracterizat de potenialul Nernst descris de ecuaia:

a ox a p + RT H ln E=E + nF a red a RT sau E = E 0' + ln ox a red nF

0

(5) (6)

495

RT p ln a H + sau E 0' = E 0 0.059 pH , la 25 C (7) nF n Comportamentul electrochimic al heminei (Fe(III)P) n soluie este influenat de pHul soluiei. Experimentele au fost efectuate n domeniul de pH 6.5 - 10.5 n tampon 0.5 mM TRIS-HCl + 0.1 M KBr [Li M-Xl., 1997]. n domeniul de pH studiat se observ o deplasare a voltamogramelor spre valori de potenial mai negative odat cu creterea pHului soluiei (figura 4A). Parametrii electrochimici ai voltamogramelor sunt sintetizai n tabelul 4. Pantele dependenei potenialului formal standard n funcie de pH (figura 4B), indiferent de viteza de baleiaj, este n jur de de -47 mV*pH-1 (tabelul 5). Aceast valoare este apropiat de valoarea teoretic de 56 mV*pH-1 (conform ecuaiei 7) la 25 C, indicnd c 1 H+ este cuplat la transferul de electroni ai heminei n timpul reaciei de electrod [Yang J., 1999]. Peste pH >8, panta dependenei o vs. pH reflect formarea complexului bis(hidroxo) al heminei:

unde: E 0' = E 0 + p

(H2O)(OH)Fe(III)P (OH)2Fe(III)P +

H+

(8)

Astfel, dependena de pH se poate explica prin schimbrile la ligandul fierului sau prin rolul OH- n stabilizarea formei oxidate a heminei [Trevin S., 1996a; Trevin S., 199b], conform reaciei 9: (OH)2Fe(III)P + H+ (A)
10

+ e- (H2O)(OH)Fe(II)P (B)
-300 v = 500 mV s -350 v = 300 mV s v = 50 mV s
-1 -1 -1

(9)

I/mA

-500
0

-20

o'

-10

/ mV
pH 7.16 pH 7.64 pH 8.0 pH 8.31 pH 8.82 pH 9.26 pH 9.7
-800 -600 -400 -200

-400

-450

-550

E / mV vs. Ag/AgCl, KClsat

10

pH

Figura 4. (A) Influena pHului asupra voltamogramelor sistemului G//Fe(III)P si (B) dependena Eo vs. pH. Condiii experimentale: electrolit, TRIS 0.05 M; viteza de baleiaj, 50 mV/s; potenial de start, -0.85 V vs. Ag/AgCl, KClsat; soluie dezaerat.

496

Tabelul 4. Parametrii electrochimici ai voltamogramelor ciclice ale sistemului G//Fe(III)P la diferite viteze de baleiaj. Condiii experimentale: vezi figura 4.
pH 9,7 9,26 8,82 8,31 8,08 7,64 7,157 6,48 v = 500 mV/s Ec Ea
(mV vs. ER)

Eo -497,45 -475,95 -463,95 -438,95 -432,45 -415,95 -389 -349,95

v = 300 mV/s Ea Ec
(mV vs. ER) (mV vs. ER)

Eo
(mV)

v = 50 mV/s Ea Ec
(mV vs. ER) (mV vs. ER)

Eo
(mV)

(mV vs. (mV) ER)

-455.2 -435.8 -430.2 -401.7 -400.6 -386.3 -353 -302.3

-539.7 -516.1 -497.7 -476.2 -464.3 -445.6 -425 -397.6

-465.6 -450.2 -436.6 -405.5 -385.2 -360.8 -292.3

-539.3 -505.7 -485.3 -454.4 -439.3 -411.1 -387.6

-502,45 -477,95 -460,95 --429,95 -412,25 -385,95 -339,95

-510 -460 -448 -424 -420 -390 -368 -324

-529.9 -479.9 -453.9 -421.9 -439.9 -419.9 -395.9 -367.9

-519.95 -469.95 -450.95 -422.95 -429.95 -404.95 -381.95 -345.95

Tabelul 5. Regresia dependenei Eo- pH. Condiii experimentale: vezi figura 4.

v / (mV/s) 50 300 500 Eo vs pH Eo = -28.45 (48.88 3.79) pH Eo = -38.55 (47.94 2.21) pH Eo = -70.82 (44.26 1.82) pH R/n 0.9824/8 0.99475/7 0.99493/8

3. Calculul parametrilor electrochimici pentru o substan redox (pe baz de fier) imobilizat n polimeri
n figura 5A sunt prezentate voltamogramele obinute cu electrodul G/SWCNTFe(III)P-Nafion nregistrate n tampon fosfat (pH 7). Aa cum era de ateptat prezena heminei pe suprafaa electrodului se manifest prin apariia unei perechi de peak-uri bine definite, atribuite unui proces monoelectronic cvasireversibil de transfer de electroni (EFWHM = 197mV). Ca i n cazul heminei n soluie acest proces implic cuplul redox Fe(III)/Fe(II) coordinat n inelul porfirinic (ecuaia 3) [Murray R.W., 1983]. Faptul c EFWHM are o valoare mai mare dect cea teoretic (90.5/n mV) corespunztoare cuplurilor redox adsorbite pe suprafa [Laviron E., 1979; Wang B., 2000], indic o anumit neuniformitate a cuplurilor redox adsorbite sau existena unor interaciuni repulsive ntre centrii activi redox [Honeychourch M. J., 1998]. Potenialul formal (Eo) are o valoare de 0.535V vs. Ag/AgCl, KClsat, (tabelul 6) pentru v = 50 mV/s. Aceast valoare este cu 0.153 V deplasat spre valori mai negative), fa de cazul n care hemina este n soluie (vezi tabelul 4). Aceast diferen reflect influena specific a matricei de imobilizare asupra comportamentului redox al heminei. 497

3.1. Influena vitezei de baleiaj asupra comportrii heminei adsorbit (G/SWCNTFe(III) P-Nafion) pe electrod de grafit
Curentul de peak pentru sistemele redox adsorbite depinde de viteza de baleiaj conform ecuaiei: Ip =

n 2 F2 A 0* v 4RT

(10)

unde: Ip = curentul de peak (A), n = numrul de electroni, F = constanta lui Faraday (C/mol), R = constant universal a gazelor (J/mol K), T = temperatura (K), v = viteza de baleiaj (V/s), A = aria geometrica a electrodului (cm2), 0*= gradul de acoperire sau concentraia superficial activ (mol/cm3). Pe un domeniu larg de viteze de baleiaj (5 2000 mV s1), intensitatea de curent att a peak-ului anodic, ct i celui catodic variaz liniar cu viteza de baleiaj indicnd prezena unui cuplu redox adsorbit (figura 5B) [Murray R. W., 1983]. Aceast concluzie este susinut i de panta dependenelor log I log v, care este n jur de valoarea 1 (tabelul 7) [Bard A. J., 1980] i o slab cretere a diferenei potenialelor de peak15 (Ep) cu creterea vitezei de baleiaj a potenialului. (A)
50

(B)
300 200 100 0 -100
-25
20 mV s 50 mV s 70 mV s
-1 -1 -1 -1 -1 -1

25

I / A

Ipa/ A Ipc / A
200 mV s 400 mV s 500 mV s

-200 -300 -400 0 500 1000 1500

-1

-50

-750

-500

-250

250

2000

2500

E / mV vs. Ag/AgCl, KClsat

v / mV*s

Figura 5. (A) Voltamogramele ciclice ale sistemului G/SWCNTFe(III)P-Nafion si (B) Dependenta Ip de viteza de baleiaj. Condiii experimentale: potenial de start, 0 V vs. Ag/AgCl, KClsat; electrolit suport, tampon fosfat 0.1M (pH 7); soluie dezaerat. Diferena potenialelor de peak (Ep = Epa - Epc) se calculeaz ca diferena dintre potenialele de peak anodic (Epa ) si catodic (Epc).
15

498

Tabelul 6. Parametrii electrochimici a sistemului G/SWCNTFe(III)P-Nafion. Condiii experimentale: vezi figura 5.

v
mV/s

Ea -540 -520 -516 -518 -512 -510 -498 -490,1 -475,1 -456 -449,2 -429,9

Ipa 1,285 2,415 7,068 11,57 15,8 22,04 61,49 93,46 120,6 164,2 219 272,8

Ec -554 -544 -552 -552 -558 -560 -580 -596 -608,2 -620 -641,2 -660

Ipc -1,252 -2,713 -8,264 -13,71 -18,85 -26,33 -74,45 -112,4 -160,1 -195 -258,2 -320,5

E a - Ec -4 -24 -36 -34 -46 -50 -82 -105,9 -133,1 -164 -192 -230,1

Eo -542 -532 -534 -535 -535 -535 -539 -543,05 -541,65 -538 -545,2 -544,95

Ipa/Ipc 1.02 0.89 0.85 0.84 0.84 0.84 o.83 0.83 0.75 0.84 0.85 0.85

(mV/vs. ER) (A)

(mV/vs. ER) (A)

(mV/vs. ER) (mV/vs. ER)

5 10 30 50 70 100 300 500 700 1000 1500 2000

Tabelul 7. Regresie liniar pentru dependena log I v.s log v a sistemului G/SWCNTFe(III)P-Nafion (conform figurii 5B). anodic catodic log Ia = -0.486 + 0.901 log v log Ic = -0.467 + 0.923 log v R = 0.99923, n = 12 R = 0.99815, n = 12

3.2. Calculul constantei eterogene de transfer de electroni pentru sistemul G/SWCNTFe(III)P-Nafion

Pentru calculul constantei eterogene de transfer de electroni se utilizeaz tratamentul Laviron pentru speciile adsorbite, cnd Ep < 200/n mV i = 0.5 [Laviron E., 1979].

499

Tabelul 8. Dependena 1/m Ep conform datelor din Laviron E., 1979.

Ep 18,8 27 34,8 48,8 61,2 72,2 82,4 91,8 100,6 130 142,4 153,8 164 173,4 182 190 197,6 204,6 1/m 0,5 0,75 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 6 7 8 9 10 11 12 13 14
16 14 12 10 8

1/m

6 4 2 0 0 50 100 150 200

Ep

Figura 6. Dependenta 1/m dEp conform datelor din Laviron E., 1979.

Se utilizeaz datele Ep pentru diferite viteze de baleiaj (din tabelul 6) pentru interpolarea din figura 6 i estimarea valorii 1/m a cror valori sunt trecute n tabelul 9.
Tabelul 9. Estimarea constantei eterogene de transfer de electroni
v (V/s) 0,005 0,01 0,03 0,05 0,07 0,1 0,3 0,5 0,7 1 1,5 2 Valoare medie m-1 Ep G/SWCNT Fe(III)P-Nafion -4 -24 0,6587 -36 1,0463 -34 0,9759 -46 1,4 -50 1,55 -82 2,982 -105,9 4,36 -133,1 6,256 -164 9,0058 -192 12,281 -230,1 4.3672 0.302 n=5 ks / s-1 Ep/mV m-1 G/SWCNT(UC) Fe(III)P-Nafion -50 1,55 -35 1,013 -45 1,3651 -55 1,7527 -55 1,7527 -55 1,7527 -80 2,8 -104,7 4,28 -124.9 5,659 -144.5 7,186 -180.4 10,816 -209 4,875 0,542 n=5 ks / s-1 Ep/mV m-1 G/SWCNT(KOH) Fe(III)P-Nafion -20 0,536 -25 0,69 -20 0,536 -35 1,013 -30 0,85 -40 1,185 -40 1,185 -54.9 1,75 -74.2 2,599 -89.5 3,376 -122.6 5,4952 -135 6,4065 10,973 0,817 n= 6 ks / s-1

0,59159 1,11731 1,99652 1,94841 2,51408 3.92034 4.46883 4.36025 4.32701 4.75957

0,1257 0,38468 0,85638 1,11166 1,55633 2,22332 4,17516 4,55236 4,82024 5,42279 5,40424

0,36351 0,56476 2,18105 1,9234 3,20914 3,28845 9,86536 11,13376 10,49547 11,5427 10,63697 12,1652

Diferena Ep < 200/n mV indic un transfer de electroni rapid. Constanta de vitez a transferului de electroni ks poate fi estimat din ecuaia: ks = m n F V / (RT) unde: m = parametru care depinde de Ep (conform figurii 6). 500 (11)

Viteza de transfer de electroni rapid este rezultatul puternicilor interaciuni dintre Fe(III)P i micromediul format din SWCNT si Nafion [Dai Z., 2004].

3.3. Studiul integritii filmului de Fe(III)P pentru sistemul G/SWCNTFe(III)P-Nafion prin calculul ariei suprafeei active
n scopul de a face o evaluare a variaiei permeabilitii sau a integritii matricei de nglobare a heminei, s-au trasat voltamograme ciclice ale electrodului G/SWCNTFe(III)P-Nafion n soluii 5mM K3[Fe(CN)6] coninnd 1M KCl [Long D.D, 2001]. Aa cum se observ din figura 7A, peakurile voltametrice ale cuplului [Fe(CN)6]3/[Fe(CN)6]4 (conform ecuaiei 1) nu se suprapun cu cele ale cuplul Fe(III)P/Fe(II)P din hemin (conform reaciei 3), iar curentul de peak anodic i catodic ascult aceeai ecuaie 2. (A)
40
200

(B)
300

20
100

I / A

-20

I /A
5 mV s
-1 -1 -1 -1

-100

10 mV s
-40

30 mV s 70 mV s

-200

-60 -400

-300

-200

-100

100

200

-300 0.0

0.5 v
1/2

1.0 / (V*s )
-1 1/2

1.5

E / mV vs. Ag/AgCl, KClsat

Figura 7. (A) Voltamogramele ciclice ale 5 mM K3[Fe(CN)6] + 0.1 M KCl pe electrodul G/SWCNTFe(III)P-Nafion si (B) Dependena Ip de viteza de baleiaj. Condiii experimentale: potenial de start, -0.400 V vs. Ag/AgCl, KClsat; soluie dezaerat.

n tabelul 10 sunt sintetizai parametrii electrochimici ai voltamogramelor obinute pe sistemul G/SWCNTFe(III)P-Nafion, n scopul trasrii dependenei log I - log v i apoi I - v1/2 (figura 7B).

501

Tabelul 10. Parametrii electrochimici ai voltamogramele ciclice ale 5 mM K3[Fe(CN)6] + 0.1 M KCl pe electrodul G/SWCNTFe(III)P-Nafion i ecuaia regresiei I - v1/2 pentru calculul ariei suprafeei active. Condiii experimentale: vezi figura 6.
v (V/s) 0,005 0,010 0,030 0,050 0,070 0,100 0,300 0,500 0,700 1,000 1,500 2,000 v1/2 (V/s)1/2 0,07071 0,1 0,17321 0,22361 0,26458 0,31623 0,54772 0,70711 0,83666 1 1,22474 1,41421 Ipa (A) 9,727E-6 1,332E-5 2,402E-5 2,798E-5 3,869E-5 4,781E-5 8,975E-5 1,217E-4 1,661E-4 2,072E-4 2,405E-4 Ipc (A) -9,043E-6 -1,318E-5 -2,279E-5 -2,926E-5 -3,809E-5 -4,542E-5 -8,924E-5 -1,074E-4 --1,571E-4 -1,899E-4 -2,19E-4 Proces Ecuatia de liniarizare R n A (cm2) Amediu anodic catodic I = -5.8972 10-6 + I = 3.26707 10-6 1,74056 10-4 v1/2 1,5828 10-4 v1/2 0.9995 0.9995 11 11 0.01684 0,01532 0,0161 cm2

Utiliznd ecuaia Randles Sevcik (ecuaia 2) caracteristica speciei K3[Fe(CN)6] aflat n soluie i presupunnd c coeficientul de difuzie al K3[Fe(CN)6] este identic cu cel raportat n literatur (adic D = 5.9105 cm2/s [Ye J.-S.., 2004] se obine Ip = 2.69*105 (1)3/2 A (5.9105 )1/2 5 10-6 v1/2 = 0.010331 A v1/2 care se compar cu ecuaia liniar I = panta v1/2 (sau y = ax), de unde A = panta / 0.010331 (cm2) Valorile obinute pentru ramura anodic i catodic sunt prezentate n tabelul 10, iar valoarea medie este 0,0161 cm2, care este cam de 5 ori mai mic dect aria geometrica a electrodului calculat cu relaia A = (d2)/4 = 0.07065 cm2 (unde: d = 0.3 cm).

3.4. Influena pH-ului asupra comportrii sistemului adsorbit (G/SWCNTFe(III)P-Nafion) pe electrod de grafit
Influena pH-ului a fost studiat pe aceleai tipuri de electrod, doar c nanotuburile de carbon SWCNT au suferit un tratament suplimentar naintea imobilizrii. Este vorba de o ultracentrifugare pentru G/SWCNT(UC) i un tratament cu KOH concentrat n cazul SWCNT(KOH). Voltamogramele ciclice sunt prezentate n figura 8A, iar dependena Eo- pH n figura 8B.

502

10

-0,50

' / V vs. Ag/AgCl, KClsat

-0,55

I / A

-0,60

-5 pH 6.04 -10 pH 7.3 pH 8.57

-0,65

G/SWCNT(UC)-Fe(III)P-Nafion

-15

G/SWCNT(KOH)-Fe(III)P-Nafion

-800

-600

-400

-200

-0,70

6,0

6,5

7,0

E / mV vs Ag/AgCl, KClsat

pH

7,5

8,0

8,5

9,0

Figura 8. (A) Influena pHului asupra voltamogramelor sistemului G/SWCNT(UC) Fe(III)P-Nafion si (B) dependena Eo vs. pH. Condiii experimentale: electrolit, TRIS 0.05 M; viteza de baleiaj, 50 mV/s; potenial de start, -0.85 V vs. Ag/AgCl, KClsat; soluie dezaerat.

Tabelul 11. Parametrii electrochimici ai voltamogramele ciclice pe electrodul G/SWCNT(UC)Fe(III)P-Nafion i G/SWCNT(KOH)Fe(III)P-Nafion n funcie de pH. Condiii experimentale: vezi figura 8.
pH 6.03 6.22 6.55 6.88 7 7.44 7.7 8.12 8.45 G/SWCNT(UC)Fe(III)P-Nafion Ea Ec Eo (mV vs. ER) (mV vs. ER) (mV) -510 -560 0.535 -510 -560 0.535 -510 -560 0.535 -500 -540 0.52 -585 -620 0.602 -570 -615 0.5925 -570 -615 0.5925 -595 -630 0.6125 -600 -655 0.6275 G/SWCNT(KOH)Fe(III)P-Nafion pH Ea Ec Eo (mV vs. ER) (mV vs. ER) (mV) 6.04 -545 -570 0.5572 6.3 -520 -540 0.53 6.6 -540 -560 0.55 6.9 -500 -540 0.52 7.3 -600 -620 0.61 7.68 -590 -615 0.6025 8.04 -600 -640 0.62 8.57 -650 -690 0.67

Utiliznd parametrii electrochimici din tabelul 11 i acelai formalism matematic ca i cel descris pentru speciile n soluie de ctre ecuaiile 4 - 7, se obine pentru dependena Eo - pH (tabelul 12) o pant apropiat de valoarea teoretic (59 mV/pH), ceea ce confirm faptul c comportamentul heminei, chiar i imobilizat, este dependent de pH soluiei adiacente, conform ecuaiei 9.

503

Tabelul 12. Regresia dependentei Eo- pH. Condiii experimentale: vezi figura 8.
Electrod G/SWCNT(UC)Fe(III)P-Nafion G/SWCNT(KOH)Fe(III)P-Nafion Eo - pH E' = -0.157 - 0.0562 pH E' = -0.165 - 0.0577 pH R/n 0.945/ 6 0.990 /5

3.5. Estimarea stabilitii sistemului G/SWCNTFe(III)P-Nafion la funcionare continu

Stabilitatea pe termen scurt a electrozilor modificai poate fi evaluat n condiii poteniodinamice, prin ciclarea continu a electrodului ntre 0 i 0.95 V/ER (v = 50 mVs1), ntr-un electrolit inert rRESezentat de o soluie de tampon fosfat (pH 7) (figura 9A). Presupunnd ca evoluia n timp a gradului de acoperire al electrodului sau concentraia superficial activ, , respect o cinetic de ordinul zero, constanta vitezei de activare/dezactivare se calculeaz ca fiind panta dependenei - timp (figura 9B). Gradului de acoperire al electrodului sau concentraia superficial activ, , se calculeaz ca raportul dintre aria de sub peak i aria geometrica, conform relaiei 12 [Yacynych A.M., 1978]:

A F S *v

(mol/cm2)

(12)

unde: A = aria de sub peak obinut prin integrarea peak-ului din voltamograme (A*V); F = constanta lui Faraday (C/mol); S = aria geometrica a electrodului (cm2), v = viteza de balaiej (V/s). (A)
15 10 5 0 -5 -1 0 -1 5 -2 0 -8 0 0 -6 0 0 -4 0 0 -2 0 0 0 c ic lu l 5 c ic lu l 5 0
-2

(B)
c ic lu l 1 0 0

80

/ mol*cm

60

N T -S D S

I / A

= 7 .4 3 3 * 1 0
40

-9

+ 4 .5 9 1 * 1 0

-1 4

R = 0 .7 3 5 , n = 1 6

| * 10

-10

cat

20

E / m V v s A g /A g C l, K C l s a t

1000

2000

3000

4000

tim e / s

Figura 9. (A) Voltamograme ciclice succesive pe electrodul G/SWCNT-Fe(III)P-Nafion si (B) dependenta - timp pentru estimarea constantei de stabilitate. Condiii experimentale: viteza de baleiaj, 50mV s1; potenialul de start 0 V vs. Ag/AgCl, KClsat; electrolitul suport, 0.1M tampon fosfat (pH 7); soluie dezaerat.

504

Utiliznd datele obinute din voltamogramele ciclice din figura 9A, pentru doi electrozi similari, sintetizate n tabelul 13, regresia liniar a dependenei c- timp conduce la obinerea constantei vitezei de activare de ka = 4,591 10-14 s (figura 9B), valoare care este n concordan cu datele din literatur [Ciszewski A. et al., 2000].
Tabelul 13. Parametrii electrochimic ale sistemului G/SWCNT-Fe(III)P-Nafion supus ciclrii succesive.
Numarul de cicluri 1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 90 100 Timpul de scanare (s) 38 190 380 570 760 950 1140 1330 1520 1710 1900 2280 2660 3040 3420 3800 Eld 1 Apc (C) 3,008E-6 2,879E-6 2,836E-6 2,861E-6 2,8519E-6 2,8768E-6 2,8894E-6 2,8634E-6 2,8719E-6 2,874E-6 2,872E-6 2,8826E-6 2,8757E-6 2,8749E-6 2,8777E-6 2,9044E-6 pa (mol/cm2) 8,82406E-9 8,44563E-9 8,31949E-9 8,39283E-9 8,36613E-9 8,43918E-9 8,47614E-9 8,39987E-9 8,4248E-9 8,43096E-9 8,4251E-9 8,45619E-9 8,43595E-9 8,43361E-9 8,44182E-9 8,52014E-9 Eld 2 Apc (C) 2,1248E-6 2,2292E-6 2,192E-6 2,1898E-6 2,1898E-6 2,2088E-6 2,2424E-6 2,2438E-6 2,2553E-6 2,233E-6 2,3074E-6 2,2823E-6 2,2388E-6 2,2877E-6 2,2783E-6 2,287E-6 pc (mol/cm2) 6,23316E-9 6,53942E-9 6,4303E-9 6,42384E-9 6,42384E-9 6,47958E-9 6,57815E-9 6,58225E-9 6,61599E-9 6,55057E-9 6,76883E-9 6,6952E-9 6,56759E-9 6,71104E-9 6,68346E-9 6,70898E-9 pc, mediu (mol/cm2) 7,52861E-9 7,49253E-9 7,37489E-9 7,40834E-9 7,39499E-9 7,45938E-9 7,52714E-9 7,49106E-9 7,5204E-9 7,49077E-9 7,59696E-9 7,57569E-9 7,50177E-9 7,57232E-9 7,56264E-9 7,61456E-9

4. Concluzii
a. S-au studiat prin voltametrie ciclic att n soluie, ct i imobilizat pe electrod de grafit, doi compui care conin Fe(III): K3[Fe(CN)6] (compus cu comportament standard) i hemina (Fe(III)P, compus cu proprieti biologice). b. Studiul compusului standard n soluie pe electrod de platin a permis determinarea coeficientului de difuzie, D, utiliznd ecuaia Randles Sevcik (ecuaia 2) specific transferului de electroni difuziv. c. Studiul sistemului G//Fe(III)P la diferite viteze de baleiaj a stabilit c compusul studiat (Fe(III)P) se adsoarbe pe suprafaa electrodului (panta logI-log v aproximativ 1). d. Studiul efectului pH-ului asupra sistemului G//Fe(III)P a permis stabilirea c n procesul de transfer de electroni intervin i protonii (ecuaia 9, panta Eo-pH n jur de 59 mV/pH). 505

e. Studiul influenei vitezei de baleiaj asupra sistemului G/SWCNT-Fe(III)P-Nafion confirm c specia studiat este adsorbit pe electrod i transferul de sarcin se face dup un proces eterogen. Calculul constantei eterogene de transfer de electroni pentru sistemul G/SWCNTFe(III)P-Nafion se face utiliznd modelul Laviron pentru Ep < 200/n mV i = 0.5. f. Studiul integritii filmului de Fe(III)P pe electrodul de G/SWCNT Fe(III)P-Nafion s-a realizat prin ciclarea la diferite viteze de baleiaj n soluie de K3[Fe(CN)6], ceea ce a permis calculul ariei suprafeei active utiliznd ecuaia Randles-Sevcik (ecuaia 2). g. Studiul influenei pH asupra Fe(III)P imobilizat (G/SWCNT-Fe(III)P-Nafion) arat un comportament care nu este diferit fa de a celui n soluie (n G//Fe(III)P). h. Estimarea stabilitii pe termen scurt a sistemului G/SWCNT Fe(III)P-Nafion la funcionarea continu se face utiliznd i rRESezentarea grafic - timp (modelul cineticii omogene de ordinul zero), a crei pant rRESezint constanta de activare/dezactivare. i. Estimarea cantitativ a eficienei electrocatalitice a Fe(III)P asupra eletcrocatalizei NO2- sau H2O2 pe sistemele G//Fe(III)P i G/SWCNTFe(III)P-Nafion se face prin calculul unui indicator al efectului electrocatalitic descris de relaia 16.

5. Bibliografie
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. Bard A.J., Faulkner L.R., Electrochemical Methods, Wiley-VCH, New York, 1980, p. 522. Ciszewski A., Milczarek G., Anal. Chem., 2000, 72 (14), 3202-3209. Dai Z., Liu S., Ju H., Chen H., Biosensors Bioelectronics 2004, 19, 861-867. Honeychourch M. J., Rechnitz G.A., Electroanalysis 1998, 10, 285-293. Hrapovic S., Luong J. H. T., Anal Chem., 2003, 75(14), 3308-3315. Laviron E., J. Electroanal. Chem. 1979, 101, 19-28. Li M-X., Li N-Q., Gu Z-N., Zhou X-H., Sun Y-L., Wu Y-Q., Anal. Chim. Acta, 1997, 356, 225-229. Long D.D, Marx K.A. Zhou T., J. Electroanal. Chem., 2001, 501, 107-113. Murray RW (1983) Chemically modified electrodes, in Electroanalytical chemistry, Bard A. J. (ed), vol. 13, Marcel Dekker, New York, p. 191. Trevin S., Bedioui F., Devynck J., J. Electroanal. Chem., 1996a, 408, 261-265. Trevin S., Bedioui F., Devynck J., Talanta, 1996b, 43, 303-311. Wang B., Zhang J., Cheng G., Dong S., Anal. Chim. Acta, 2000, 407, 111-118. Yacynych, A. M.; Kuwana, T. Anal. Chem. 1978, 50, 640-645. Yang J., Hu N., Rusling J. F., J. Electroanal. Chem., 1999, 463, 53-62. Ye J.-S., Wen Y., Zhang W.D., Cui H.-F., Gan L.M., Xu G.Q., Sheu F.-S., J. Electroanal. Chem., 2004, 562, 241-246.

506

6. Anex
Reactivi Clorura de protoporfirina IX fier(III) (Fe(III)P), 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propandiol(tris-(hidroximetil)amino metan) (TRIS) i bromura de potasiu s-au achiziionat de la Fluka Buchs, Switzerland. Nanotuburile de carbon cu un singur perete (SWCNT), dodecil sulfatul de sodiu (SDS) i Nafionul s-au procurat de la Sigma (SUA), iar apa oxigenat (soluie 30% w/v) de la J. T. Baker i nitritul de sodium de la Merck. Soluia de electrolit este tamponul fosfat (PB) care conine 0.1M KBr (pH 7.5) i a fost preparat din 0.05 M NaH2PO4, 0.05 M Na2HPO4 i 0.1 M KBr (Fluka Buchs, Switzerland) i pHul ajustat cu HCl. Soluia 0.5 mM Fe(III)P s-a preparat prin dizolvarea srii n tampon 0.05 M TRIS-HCl + 0.1 M KBr (pH 8). Soluiile de tampon 0.1 M KBr, 0.05 M TRIS i 0.05 M PB au fost preparate cu ap distilat i pstrate la frigider pentru a mpiedica creteri bacteriene. Ajustrile de pH s-au fcut cu soluii de HCl i NaOH (Carlo Erba, Italy). Toi reactivii au fost de puritate analytical i s-au utilizat fr alte purificri. Aparate Msurtorile de voltametrie ciclic s-au fcut cu o combin electrochimic PGStat 10 (Autolab EcoChemie, Olanda). Celula electrochimic cu un compartiment a fost echipat cu un electrod de lucru din grafit (2.5 mm diameter) (Ringsdorff-Werke, Gmbh, Bonn-Bad Godesberg, Germany), un electrod de referin AgAgCl, KClsat (Radiometer, Frana) i un contraelectrod de platin. Toate experimentele au fost efectuate la temperatura camerei, n soluii dezaerate prin barbotare de argon.

Modul de citire a parametrilor de peak este prezentat n figura 10. Figura 10. Modul de citire a paramterilor de peak: potentialul de peak (Ep) si intensitatea curentului de peak(Ip).

507

Prepararea electrodului modificat G/SWCNTFe(III)P-Nafion Electrodul de grafit (G) a fost curat cu hrtie abraziv de diferite dimensiuni (Carbimet 240, 400, 600 i 1000, de la Buehler Ltd, Lake Bluff, Il, USA), apoi supus unui tratament cu ultrasunete n ap distilat i apoi splat cu ap distilat. O cantitate de 0.01 g nanotuburi de carbon (SWCNT) se disperseaz n 50 ml de soluie de 1% (wt) dodecil sulfat de sodiu (SDS) Dup omogenizare i ultrasonare, suspensia de SWCNT obinut se ultracentrifugheaz al 120.000 G timp de 4 ore. Se prepar o soluie din 500 l de SWCNT i o soluie 5 mM Fe(III)P. Un volum de 2 l din aceast soluie se depune pe suprafaa electrodului i se ateapt evaporarea solventului. Operaia este repetat de 3 ori. n final electrodul se acoper cu 2 l de Nafion 5%.

508

XIV. SISTEME DE ANALIZ A SUPRAFEEI SPECIFICE I A DIMENSIUNII PARTICULELOR Sisteme de analiz a suprafeei specifice i a dimensiunii particulelor
Lect. dr. ing. Rka Barabs Cuprins
1. Introducere; considerente teoretice ...................................................................................... 509 1.1. Suprafaa specific i porozitatea ................................................................................. 509 1.2. Determinarea suprafeei specifice prin metoda difraciei laser ..................................... 513 2. Operarea cu Analizorul de Suprafee, seria Qsurf .............................................................. 513 2.1. Etape n derularea unei analize ................................................................................... 513 3. Bibliografie .......................................................................................................................... 517

1. Introducere; considerente teoretice

1.1. Suprafaa specific i porozitatea
Suprafaa specific i porozitatea sunt dou proprieti fizice importante care determin calitatea i utilitatea multor materiale. Datorit acestui lucru, este important ca ele s fie determinate i controlate ntr-o manier strict. Cunotinele legate de porozitate i suprafa specific reprezint elemente importante n nelegerea modului de formare a structurii i a posibilelor aplicaii ale unor materiale. Analizarea suprafeei specifice ajut la determinarea modului n care materialele se dizolv sau reacioneaz ntre ele. Diferenele n zona de suprafa si porozitatea particulelor ntr-un material pot influena foarte mult performana i caracteristicile acestuia. Suprafaa specific depinde de natura adsorbantului, de metoda de obinere, de modul de tratare fizico-chimic i termic (ceea ce influeneaz natura suprafeei), de porozitatea adsorbantului, precum si de mrimea, distribuia i volumul porilor. Cu ct numrul porilor, raportat la unitatea 509

de mas (sau de volum) de adsorbant este mai mare, cu att suprafaa specific este mai mare. Unitatea de msur pentru suprafaa specific este m2/g. Suprafaa specific are o importan deosebit la procesele de adsorbie, cataliz eterogen i la reaciile de suprafa. Cea mai folosit tehnic pentru estimarea suprafeei specifice este metoda BET. Mai jos sunt descrise doar cteva dintre aplicaiile cele mai utilizate ale analizelor de suprafa i a msurtorilor de porozitate: Produse farmaceutice Analizarea suprafeei specifice si porozitatea joac roluri importante n capacitatea de a purifica, procesa, amesteca i comprima un medicament. Rata de dizolvare (care reglementeaz rapiditatea cu care medicamentul devine disponibil pentru organism) depinde de suprafaa i de porozitatea materialului. Produse ceramice Analizarea suprafeei specifice i informaiile legate de porozitate sunt necesare pentru obinerea unui produs final cu aspect, textur i densitate dorit. Crbuni activi Suprafaa specific i porozitatea trebuie s fie optimizate, n intervale nguste pentru a realiza n mod corespunztor recuperarea vaporilor de benzin n automobile, recuperarea solvenilor n operaiunile de vopsire sau controlul polurii n managementul apelor reziduale. Negru de fum Productorii de cauciucuri au descoperit c suprafaa de carbon afecteaz durata de via, traciunea si performana cauciucurilor. Utilizarea prevzut a cauciucului, sau tipul de vehicul pe care va fi plasat acesta, determin dac suprafaa de carbon necesar trebuie s fie sczut sau ridicat. Vopsele i straturi de acoperire Suprafaa pigmentului sau a materialului de umplere influeneaz luciul, textura, culoarea, saturaia culorii, luminozitatea si proprietile de adeziune ale filmului. Porozitatea poate controla proprietile aplicrii, cum ar fi fluiditatea, timpul de uscare i grosimea filmului. Propelani Suprafaa specific a propelantului utilizat n fabricarea de muniii afecteaz n mod direct rata de ardere. O rat ridicat poate fi periculoas, iar o rat sczut de ardere poate provoca defeciuni si lips de acuratee. Implanturi medicale Suprafaa specific i porozitatea materialelor utilizate n implanturile medicale influeneaz aderena materialului pe os sau pe esuturile naturale. 510

Electronice Fabricarea condensatorilor compaci utiliznd un numr minim de materii prime costisitoare necesit dezvoltarea unui material cu suprafaa controlat, avnd o reea de pori atent proiectat. Aerospace Porozitatea scuturilor termice i materialele izolante afecteaz att greutatea ct i funcionarea. Nanotuburi Analizele de microporozitate sunt utilizate pentru a anticipa capacitatea unui material de a stoca hidrogen. Celule de combustibil Electrozii celulelor de combustibil necesit porozitate controlat pentru a produce densitate de putere optim [1,2,3]. Metoda BET se folosete foarte mult n studiul materialelor pentru determinarea suprafeei solidelor prin intermediul adsorbiei fizice ale moleculelor de gaz. Brunauer, Emmet si Teller au descris 5 izoterme de baz care sunt grafice ale volumelor de gaz adsorbit n raport cu presiunea. Tratarea matematic a izotermelor de adsorbie este dificil i n general se pleac de la modele simplificate ale solidului i ale adsorbiei. S-a ajuns totui ca, din izotermele de tipul II i IV, s se poat calcula suprafaa specific a solidului. n unele cazuri, pentru materiale microporoase i la chemisorbie pot fi folosite i izotermele de tipul I. Din izotermele de tipul III i V nu se poate determina suprafaa total. Brunauer, Emmett i Teller pleac de la urmtoarele ipoteze: adsorbia este localizat pe anumite centre active; fiecare centru activ poate adsorbi numai o molecul; energia de adsorbie a particulelor este identic pentru toate particulele adsorbite i nu depinde de prezena sau absena altor particule pe centrii vecini. La aceste ipoteze, se mai adaug i presupunerea c o molecul din primul strat adsorbit poate constitui un centru de adsorbie pentru o molecul din al doilea strat, iar acesta din urm pentru al treilea strat etc. Brunauer, Emmett i Teller presupun c exist un echilibru dinamic ntre moleculele adsorbite i cele din faza gazoas. Ei mai presupun c la primul strat de adsorbie energia de adsorbie este E1,iar la celelalte straturi este mai mic i egal cu cldura latent de condensare a adsorbatului. Izoterma de tip 1 este caracteristic solidelor pe care sunt formate doar monostraturi adsorbite. Moleculele adsorbatului pot fi considerate ca fiind depozitate pe suprafaa ntr-un strat de grosime monomolecular. Pe masur ce presiunea crete, volumul de gaz adsorbit crete rapid pn cnd se formeaz un monostrat; creterile ulterioare de presiune nu au ca rezultat adsorbia unei 511

cantiti mai mari de gaz (chiar dac aceast cretere se face pn la presiunea vaporilor saturai Po). Principiul de analiz: proba de analizat se scufund n azot lichid, azotul din amestecul de gaz care trece prin celul se lichefiaz i se depune ntr-un strat de grosime molecular pe suprafaa i pereii porilor probei [4]. La baza acestui model st teoria lui Langmuir, i anume teoria adsorbiei n strat monomolecular, care poate fi extrapolat pentru adsorbia n mai multe straturi, avnd n vedere urmtoare ipoteze: i) moleculele de gaz se adsorb fizic pe solid n straturi infinite; ii) nu exist interaciune ntre straturile adsorbite; iii) teoria lui Langmuir poate fi aplicat pentru fiecare strat. Ecuaia BET poate fi exprimat [5,6,7]:

1 c 1 P 1 ( )+ = V [( P0 / P ) 1 ] Vm c P0 Vm c

(1)

unde P i P0 este presiunea speciei adsorbite la echilibru i la saturaie la temperatura de adsorbie, V este cantitatea de gaz adsorbit (n uniti de volum) i Vmc este cantitatea de gaz adsorbit n strat monomolecular, c este constanta BET, exprimat:

c = exp(

E1 E L ) RT

(2)

unde, E1 este energia de adsorbie pentru primul strat i EL pentru stratul doi (sau straturi mai mari) i este egal cu energia de lichefiere. n concluzie, msurarea suprafeei specifice prin metoda BET const n msurarea volumului de azot adsorbit la temperatura azotului lichid. Ecuaia Brunauer, Emmet i Teller (B.E.T.) pentru determinarea suprafeei este, n forma cea mai simpl, urmtoarea: St=K(1-P/Po)xVa (3) Unde: St suprafaa total a probei supuse analizei K - o constant pentru nitrogen K= 4,03 P/Po = 0,294 pentru amestec de gaz de 30% (vol.) N2 i 70% (vol.) He Va = Volum de gaz (N2) adsorbit Fiecare cm3 de N2 adsorbit (apoi desorbit) de ctre prob este echivalent cu o suprafa total (St) de 2,84 m2 . Suprafaa specific se calculeaz mprind St la masa probei din celula n grame [8]. 512

1.2. Determinarea suprafeei specifice prin metoda difraciei laser

Difracia laser permite i ea determinarea relaiei ntre distribuia granulometric i suprafaa specific. Suprafaa specific crete odat cu scderea mrimii particulelor. Diferena ntre suprafaa specific determinat prin metoda BET i difracia laser depinde de porozitatea i rugozitatea suprafeei particulelor. n cazul materialelor cu particule poroase, suprafaa specific determinat prin metoda BET va fi mai mare dect cea determinat prin metoda difraciei laser [9]. Avantajul metodei BET este c ne permite att determinarea suprafeei specifice, ct i determinarea distribuiei porilor.

2. Operarea cu Analizorul de Suprafee, seria Qsurf

Echipamentele analitice tip Qsurf au fost dezvoltate cu scopul de a permite utilizatorilor analize rapide, rRESoductibile i de calitate conform cerinelor care se impun pentru laboratoarele de control. Analizoarele Qsurf se caracterizeaz printr-o precizie ridicat n ceea ce privete calibrarea semnalului de conductivitate termic, satisfcnd astfel cerinele cele mai severe n ceea ce privete precizia i acurateea.

2.1. Etape n derularea unei analize

Pentru a msura volumul de gaz adsorbit de ctre o prob, analizoarele din seria 9600 utilizeaz metoda fluxului continuu dezvoltat de ctre Nelsen & Eggertsen. Un amestec de 30% N2 i He, este trecut printr-un detector de conductivitate termic, TCD (de referin) i apoi printr-o celul de sticl coninnd proba (vezi figura 1.) La prsirea celulei de probe, amestecul de gaze trece printr-un al doilea detector de conductivitate termic. Aceast pereche de detectori conine o punte Wheatstone. Aceast punte este conectat la un panou de control cu microprocesor. Sistemul este calibrat mai nti prin injectarea a 1,00 m1 de nitrogen n flux chiar n faa detectorului de prob. Volumul injectat de N2 trece printr-un tub ctre detectorul de probe la un debit de flux constant. Puntea i pierde echilibrul n timpul n care accept acest volum de gaz de calibrare pentru a trece prin detectorul de probe. Semnalul rezultant este integrat ntr-un integrator digital si rezultatul este stocat ntr-un fiier din memorie. 513

Figura 1.Diagrama bloc al sistemului de analizare Qsurf [8]

Odat ce instrumentul a fost astfel calibrat, se formeaz automat o baie de N2 lichid care inund proba. N2 din amestecul care curge prin prob, care este scufundat n nitrogen lichid, devine ca un lichid i este adsorbit de ctre prob. n timpul n care nitrogenul este adsorbit, amestecul de gaz care iese din celula de prob conine cu mult mai puin nitrogen dect la intrare. Adsorbia continu pn cnd proba nu mai poate adsorbi nitrogen din flux. Cnd amestecul de gaz, cu un coninut redus de nitrogen dup adsorbie, ajunge la detectorul de prob, puntea devine instabil i rmne aa pn cnd tot gazul cu deficit de nitrogen a trecut de detectorul de probe. Semnalul rezultat de la punte este integrat, dar valoarea nu este utilizat n determinarea suprafeei. Ciclul de adsorbie este utilizat doar pentru a ncrca proba cu ntreaga cantitate de nitrogen pe care o poate adsorbi din amestecul de gaz. La finalul semnalului de adsorbie, se face revenirea la linia de baz i baia de nitrogen lichid este cobort automat. Pe msur ce proba revine la temperatura camerei, tot nitrogenul care a fost adsorbit este acum desorbit si este returnat fluxului de amestec de gaze. Acest semnal de nitrogen mbogit este transmis la detectorul de probe i semnalul rezultant integrat, iar rezultatul stocat ntr-un fiier n memorie. Analiza este complet i este calculat echivalentul suprafeei totale, St, a nitrogenului adsorbit i apoi desorbit de ctre prob. n scopul realizrii acestui calcul se presupune c n celul exist 1,00 g prob. La nceputul analizei este stabilit o mas brut n lipsa egal cu masa de tara + 1,00g. 514

Operaiunea se face astfel nct la sfritul analizei s se calculeze suprafaa total S t i s poat fi afiat ca S t=m 2/celula. Rezultatul este afiat, iar cnd operatorul confirm apsnd ENTER, confirmarea este salvat n fiierul numit anterior n memorie. Fiierul arat c adevrata mas brut nu a fost nc introdus. Pentru a calcula suprafaa specific (SSA= St/masa probei), se msoar masa brut actual a probei. Fiierul este refcut n memorie i este introdus masa brut. Suprafaa specific, SSA, este automat calculat i afiat, de aceast dat n m2/g. Mrimea optim a probei Domeniul dinamic al instrumentului permite msurtori ale suprafeelor totale (St) n domeniul 0,50 pn la 50 metri ptrai n celul. Pentru a determina mrimea optim a celulei, se urmrete procedura de mai jos: 1. n cazul n care se cunoate domeniul suprafeei a. Dac este cunoscut suprafaa aproximativ a probei ce urmeaz a fi analizat, se alege o mas a probei care va furniza o prob cu adevrat rRESezentativ. Metodele prin care se poate face aceast determinare depind foarte mult de materialul respectiv. Aceste metode sunt de obicei bine stabilite din fabricaie sau n laboratorul care se ocup cu analiza suprafeelor. b. Se ncarc celula de prob cu cantitatea minim de prob ce va fi reprezentativ i care are o suprafa total (St) aflat n domeniul analizorului. Mai jos sunt prezentate dou exemple pentru a estima mrimea probei. Exemplu: suprafaa ntre 50 i 500 m2/g Dac suprafaa ateptat este aprox. de 300 m2 /g, atunci se alege o greutate de 0,075 grame n celul, care va nsemna aprox. 15 m2 in celul. Aceast valoare se afl la mijlocul domeniului analizorului. Exemplu: suprafaa ntre 5 i 50 m2/g Dac suprafaa estimat este aprox. de 20 m2/g, se alege o greutate de aprox. 0,50 g care va fi aprox. 10 m2 in celul. Din nou, aceast valoare se afl la mijlocul domeniului analizorului. B.E.T cu mai multe puncte (o metod mai precis): Utilizeaz 3 amestecuri diferite de gaze pentru determinarea de puncte 515

multiple, (Not: opional este disponibil un cap de distribuie cu puncte multiple). Moleculele pot fi considerate c exist sub form de monostrat cu un strat mai jos pe pereii interiori ai porilor probelor, precum i pe suprafaa exterioar. Porii nu se umplu cu molecule de N2 lichid; doar pereii probelor sunt acoperii. Dac sunt plasate pe o suprafa plan, aceste molecule vor acoperi o suprafa de 2,84m2. Suprafaa total, St = 2,84 m2 n celul {m 2/celul} Suprafaa specific a materialului SSA este = St masa i pentru o prob de 1g este 2,84m2/g [10]. Exemple de msurtori i domenii de aplicaie ale metodei Suprafaa specific i volumul mediu al porilor pentru hidroxiapatit (HAP) i HAP dopat cu diferite cantiti de silice i cadmiu [11].
Material ncHAP >90 m ncHAP >45 m ncHAP >90 m + Cd (10-3 M) cHAP >90 m ncHAP-SiO2 5% >45 m ncHAP-SiO2 10% >63 m ncHAP-SiO2 10% <45 m ncHAP-SiO2 15% >45 m Suprafa specific medie m2/g 31.2 - 54.4 (3x) 73.7 (2x) 71.5 (2x) 2.5 (3x) 89.8 (3x) 120.9 (2x) 124.4 (2x) 87.8 (2x) Volumul mediu al porilor mL/g 0.15 - 0.16 (3x) 0.24 (2x) 0.23 (1x) 0.006 (1x) 0.28 (1x) 0.41 (2x) 0.46 (1x) 0.25 (1x)

Metoda BET de determinare a suprafeei specifice prezint un interes deosebit i pentru domeniul nanotehnologiei, cum ar fi determinarea suprafeei specifice la: - fibre polimerice [12] - nanoaerosoli [13] - nanotuburi de carbon [14] - suprafaa specific ale bentonitelor

numrul de repetri a msurtorilor pentru proba respectiv

516

Figura. 2. Reprezentarea schematic a adsorbiei azotului pe diferite specii de smectite [15]

3. Bibliografie
1. 2. 3. 4. 5. Bratu, E. A., Operaii i utilaje n industria chimic, Ed. Tehnic, Bucureti, 1970 http://www.infim.ro/~biomat/physisorption.html Q. Jiang, a, b, , and Y. Zhaoa, Microporous and Mesoporous Materials, Volume 76, Issues 1-3, 215-219 G. Fagerlund, Determination of specific surface by the BET method, Materials and Structures, 6, 3, 239-245, 1973, DOI: 10.1007/BF02479039 D. Dollimore, P. Spooner, A. Turner, The bet method of analysis of gas adsorption data and its relevance to the calculation of surface areas, Surface Technology, 4, 2, 1976, 121-160, doi:10.1016/0376-4583(76)90024-8 S. Brunauer, P.H. Emmett and E. Teller, J. Am. Chem. Soc. 60 (1938), p. 309 J.U. Keller and R. Staudt, Gas Adsorption Equilibria. Experimental Methods and Adsorptive Isotherms, Springer, Heidelberg, 2004. www.porotec.de http://www.malvern.com/LabEng/technology/laser_diffraction/gas_adsorption _bet.htm http://www.thermo.com.cn/Article.aspx?ID=189 Bogya Erzsebet-Sara: Studii cinetice i de echilibru ale unor procese de reinere pe materiale apatitice, tez de doctorat, 2010, Cluj-Napoca, UBB S. J. Eichhorn and W. W. Sampson, Journal of the Royal Society, 2010 vol. 7 no. 45, p. 641-649 S. Bau, O. Witschger, F. Gensdarmes, O. Rastoix, D. Thomas, Powder Technology, Volume 200, Issue 3, 28 June 2010, p. 190-201 Q. Jiang, Y. Zhao, Microporous and Mesoporous Materials, Volume 76, Issues 1-3, 1 December 2004, p. 215-219 S. Kaufhold, R. Dohrmann, M. Klinkenberg, S. Siegesmund, K. Ufer, Journal of Colloid and Interface Science, Volume 349, Issue 1, 1 September 2010, p. 275-282

6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15.

517

Casa Crii de tiin

Director: Mircea Trifu Fondator: dr. T.A. Codreanu Tehnoredactare computerizat: Andra Ioana Ghira, Czgely Erika Tiparul executat la Casa Crii de tiin 400129 Cluj-Napoca; B-dul Eroilor nr. 6-8 Tel./fax: 0264-431920 www.casacartii.ro; e-mail: editura@casacartii.ro

518