Universitatea de Stat de Medicin i Farmacie Nicolae Testemianu Catedra Biologie molecular i Genetic uman

Curs

Genetica uman

Chiinu, 2012

Cuprinsul
CURS 1 ...................................................................................................................................................................... 3 GENETICA UMAN TIIN FUNDAMENTAL I MEDICAL ......................................................... 3 CURS 2 ...................................................................................................................................................................... 7 APARATUL GENETIC AL CELULEI UMANE .............................................................................................. 7 CARACTERISTICA GENOMULUI UMAN .................................................................................................. 12 CURS 3 .................................................................................................................................................................... 17 VARIABILITATEA I FORMELE EI............................................................................................................. 17 (A) VARIABILITATEA NEEREDITAR ...................................................................................................... 18 (B) VARIABILITATEA EREDITAR SAU GENOTIPIC .......................................................................... 19 CURS 4 .................................................................................................................................................................... 21 CROMOZOMII UMANI .................................................................................................................................. 21 (B) CLASIFICAREA CROMOZOMILOR UMANI ........................................................................................ 26 STUDIUL CROMOZOMILOR UMANI.......................................................................................................... 28 NOMENCLATURA CROMOZOMILOR UMANI ......................................................................................... 32 CURS 5 .................................................................................................................................................................... 36 ANOMALII CROMOZOMICE ........................................................................................................................ 36 ANOMALIILE CROMOZOMICE DE STRUCTUR ................................................................................. 36 ANOMALIILE CROMOZOMICE NUMERICE ............................................................................................. 40 CURS 5 .................................................................................................................................................................... 47 TRANSMITEREA MATERIALULUI GENETIC DE LA CELUL LA CELUL ....................................... 47 ERORILE MITOZEI ......................................................................................................................................... 50 CURS 6 .................................................................................................................................................................... 55 TRANSMITEREA INFORMAIEI GENETICE DE LA PRINI LA COPII ............................................ 55 GAMETOGENEZA .......................................................................................................................................... 55 DINAMICA CROMOZOMILOR N MEIOZ ............................................................................................... 57 ERORILE MEIOZEI I CONSECINELE LOR............................................................................................. 60 CURS 7 .................................................................................................................................................................... 62 GENELE UMANE ............................................................................................................................................ 62 CURS 8 .................................................................................................................................................................... 75 TEHNICI DE ANALIZ A GENELOR ......................................................................................................... 75 CURS 9 .................................................................................................................................................................... 81 CARACTERE EREDITARE ............................................................................................................................ 81 CARACTERISTICA GENELOR ALELE I NEALELE ................................................................................ 81 CARACTERE MONOGENICE MENDELIENE ............................................................................................ 82 DETERMINISMUL UNOR CARACTERE EREDITARE NORMALE ......................................................... 83 CARACTERE MONOGENICE NON-MENDELIENE ................................................................................... 84 CARACTERE EREDITARE NORMALE POLIGENICE ............................................................................ 86 CURS 10 .................................................................................................................................................................. 88 STUDIUL CARACTERELOR EREDITARE ................................................................................................. 88 PARTICULARITILE CARACTERELOR EREDITARE .......................................................................... 88 METODE DE STUDIU UTILIZATE N GENETICA UMAN ..................................................................... 90 CURS 11 .................................................................................................................................................................. 94 INTRODUCERE N PATOLOGIA GENETIC UMAN ............................................................................. 94 ASPECTE COMUNE N PATOGENEZA BOLILOR GENETICE ................................................................ 96 BOLI CROMOZOMIALE ................................................................................................................................ 98 BOLI MONOGENICE .................................................................................................................................... 101 TESTAREA GENETIC ................................................................................................................................ 112

CURS 1
GENETICA UMAN TIIN FUNDAMENTAL I MEDICAL Genetica este o tiin biologic fundamental, cu ritm rapid de dezvoltare, ce studiaz proprietile universale ale vieii ereditatea, variabilitatea i substratul lor material moleculele de ADN. n conceptul actual, organismul viu este un sistem deschis, ce se autoregleaz i se autoreproduce. Activitatea vital este susinut de schimbul permanent de energie, substane i informaie. Particularitile organizrii i funcionrii sistemelor biologice, cile de transformare a substanelor i energiei sunt controlate de informaia ce se conine n gene. Descifrarea informaiei genetice se realizeaz n procesul de biosintez a diverse proteine, care reprezint suportul tuturor proceselor vitale ale organismului. Ereditatea este proprietatea organismului de a pstra i a transmite caracterele morfologice, fiziologice, biochimice i de comportament generaiilor urmtoare. Ereditatea este asigurat de proprietatea moleculelor de ADN de a se replica cu mare exactitate i a determina transmiterea de-a lungul miilor i milioanelor de generaii a informaiei i, deci, a caracterelor. Astfel, n realitate, nu caracterele se pstreaz i se transmit, ci informaia genetic despre ele, codificat n ADN. Ereditatea face posibil conservarea speciilor n spaiu i timp. Variabilitatea este proprietatea organismului de a prezenta caractere deosebite de cele ale prinilor, asigurnd diferene individuale, intrafamiliale i intrapopulaionale. Sursele principale ale variabilitii sunt diferite modificri ale materialului ereditar (mutaiile) care apar n rezultatul erorilor de replicaie sau aciunii diferitor factori mutageni fizici, chimici sau biologici. O alt surs de variabilitate, este capacitatea moleculelor de ADN de a se recombina i, ca rezultat, apar combinaii noi de gene i, respectiv, de caractere. Totodat, diveri factori ai mediului (intern i extern) pot modula activitatea genelor, asigurnd rspunsul organismului n condiii concrete. Apariia la descendeni a caracterelor noi este important din punct de vedere evolutiv, asigurnd adaptarea indivizilor la condiiile noi ale vieii. Transmiterea caracterelor evaluante la descendeni determin dezvoltarea speciei n timp. Substratul ereditii i variabilitii la majoritatea organismelor vii este molecula de ADN (ca excepie, la unii virui materialul genetic este reprezentat de molecule de ARN). Structura moleculelor de ADN, proprietile, structura i funcia genelor, mecanismele moleculare ale reglrii activitii genice reprezint obiectul de studiu al geneticii contemporane. Permanent sunt elaborate metode noi de cercetare, identificate gene noi, stabilite legiti noi ce permit de a ptrunde mai profund n tainele vieii. Genetica ofer o nelegere tiinific a proceselor biologice ce stau la baza activitii vitale normale a organismului, ct i a dereglrilor n diverse stri patologice. Toate tiinele despre om integreaz realizrile geneticii, fapt confirmat prin ompartimentele geneticii care s-au transformat n discipline independente: Genetica general, clasic; Genetica dezvoltrii; Genetica senescenei; Imunogenetica; Genetica ecologic; Neurogenetica; Farmacogenetica; Genetica comportrii; Genetica medical; Genetica clinic. 3

Genetica uman contemporan reprezint o tiin bazat pe genetica clasic i genetica molecular ce se focuseaz pe: legitile pstrrii, transmiterii i realizrii informaiei ereditare; mecanismul apariiei, manifestrii i transmiterii modificrilor materialului genetic; structura i funciile genelor normale i patologice. Genetica uman contemporan utilizeaz att metodele clasice ale geneticii ct i cele moleculare: metoda genealogic studiul agregrii familiale ale caracterelor ereditare, stabilirea tipului de transmitere i calcularea riscului de recuren la generaiile urmtoare, reprezentnd o etap important n consultul i sfatul genetic; metoda gemenologic studiul ponderii factorilor genetici i ecologici n manifestarea caracterelor normale sau patologice; metode citogenetice - analiza cromozomilor i depistarea anomaliilor cromozomiale de numr i de structur; metode molecular genetice analiza variaiilor nucleotidice la nivelul moleculei de ADN, studiul genelor normale i genelor mutante, identificarea polimorfismelor normale i mutaiilor patologice; metoda populaional statistic analiza genofondului populaiei, stabilirea frecvenei unor gene patologie, evaluarea factorilor ce deregleaz echilibrul populaional; modelarea matematic i biologic; genetica celulelor somatice studiul corelaiei dintre modificrile materialului genetic cu modificrile fenotipice la nivel celular; Medicii de diferite specialiti n activitatea lor ntlnesc boli genetice, de aceea utilizeaz diverse metode n investigarea acestora. Depistarea modificrilor n structura genelor prin studiul ADN reprezint o cale n diagnosticul corect al bolilor genetice. Ingineria genic permite elaborarea i producerea diferitor preparate medicamentoase: hormoni, factori de cretere, interferon, etc. Una dintre problemele actuale ale medicinei se refer la posibilitatea clonrii embrionilor pentru transplantul esuturilor i organelor. Se elaboreaz metode ale terapiei genice, prin care gena patologic este nlocuit cu cea normal. Din aceste considerente, genetica uman este o tiin aplicativ, cu un rol deosebit n medicin. Profilaxia bolilor genetice se bazeaz pe realizrile geneticii umane: diagnosticul prenatal prin screeningul mutaiilor patologice; terapia genic ce permite introducerea genelor umane in genomul celulelor somatice ale purttorilor de mutaii cu revenirea la un genotip normal; obinerea produilor genetici artificiali, transferul lor n alt celul sau organism, studiul funciei; sinteza noilor proteine cu proprieti terapeutice. *** Piatra de temelie pentru progresul Geneticii umane este pus n anul 1956, an n care a fost stabilit cromosologia uman i an n care a avut loc I-ul Congres n Genetica Uman la Copenhaga. Principalele evenimente discutate la acest congres au fost: numrul de cromozomi la specia uman (46,XX; 46,XY); analiza grupelor de nlnuire; studiul proteinelor prin electroforeza n gel; stabilirea defectului molecular n siclemie. Din 1956 pn n 1991 (Congresul VIII, Washington) au aprut metode moleculare n studiul cromozomilor umani; s-a reuit s se studieze variaiile ADN-ului. 4

Spre 1961 deja s-au evaluat implicaiile clinice ale anomaliilor cromozomiale: rolul cromozomilor X i Y n sexualizare, patogenia sdr. Turner, Klinefelter; a fost descoperit TDF testis determining factor; a fost naintat ipoteza Mary Lyon privind activitatea cromozomilor X la cele dou sexe; s-a stabilit corelaia dintre cromozomul Philadelphia i LMC (leucemia mieloid cronic) care este prima pies n teoria cancerului cu implicarea cromozomilor. n 1966 a fost descifrat n totalitate codul genetic i se descriu erorile nnscute de metabolism; se pun bazele diagnosticului prenatal prin amniocentez. n 1971 se pun la punct erorile nnscute de metabolism prin studiul pe culturi celulare. n 1980 se practic deja clonarea genelor umane. Iar din anul 1981 (Congresul de la Ierusalim) se discut metodele de genetic molecular implicate n studiul localizrii genelor la nivel de cromozomi, prin studiul familial a patologiilor cu transmitere mendelian. n 1985 a aprut tehnica PCR. n 1986 la congresul de la Berlin s-a discutat despre studiul RFLPs n boala Hungtington; s-a evideniat importana studiului molecular n aa patologii ca Granulomatoza cronic, distrofia Duchenne, retinoblastom, leucemia mieloid cronic i limfomul Burkitt. n 1991 s-au clonat i studiat genele implicate n patologia Duchenne, fibroza chistic, neurofibromatoz, polipoza de colon, retinita pigmentar, cardiomiopatia hipertrofic, sdr. Marfan, hipertermia malign; au aprut diverse concepte legate de impriting-ul genelor i disomia uniparental. n 1994 a fost publicat Catalogul Fenotipurilor Autosomal Dominante, Autosomal Recesive i X-lincate; acest catalog este denumit Catalogul genelor umane i a defectelor genice. n 1996 a avut loc al XIX-lea Congres n Genetica Uman la Rio-de-Janeiro unde s-au discutat marcherii ADN-ului; YAC-urile; rolul acidului folic n defectele aprute la nou-nscui i introducerea acestuia ca supliment obligatoriu n perioada prenatal; diagnosticul preimplantativ al celulelor utilizate n fertilizarea in vitro i metodele de selecie a produilor de concepie non-mutani. Din 1996 pn n 2001 s-au descoperit mai mult de 1000 de gene implicate n patologia uman (cu una sau mai multe mutaii); s-a studiat expresia genic, diagnosticul maladiilor genetice, s-au fcut studii de omologie pe drojdii i drosofil. n 2001 a demarat Proiectul Genomul Uman. n perioada 2001 - 2003 se schimb paradigmele Geneticii: de la structural la studiul funcional al genelor; de la aranjarea genelor la nivel de cromozomi la secvenierea ADN-ului; de la diagnosticul unei afeciuni genetice la determinarea predispoziiei genetice n bolile comune; de la etiologie la patogenie, la mecanismul producerii bolilor genetice; de la studiul unei gene ce cauzeaz boala la studiul familiilor de gene; de la genom la proteinom; de la Genetica Medical la Medicina Genetic; Genetica Medical se axeaz pe studiul patologiilor mendeliene i a aberaiilor cromozomiale, pe cnd Medicina Genetic se focuseaz pe implicarea geneticii n orice parte a medicinii clinice, factorii genetici fiind implicai n toate bolile existente, iar predispoziia genetic exist pentru maladiile comune ale adultului i copilului; Genetica Molecular prevaleaz n toate aspectele Geneticii Umane i Medicale.

Complexitatea studiilor din Proiectul Genomul uman, chiar n zilele noastre nc nu sunt definitive, deoarece, dei marea majoritate a genelor sunt cunoscute, nc nu se tie cu certitudine, cum se comport marea majoritate a acestor gene solo, darmi-te n concert cu celelalte gene din genotipul uman. Genetica Nou se bazeaz pe studiul secvenelor specifice de ADN cu funcie necunoscut i corelaiile genotip fenotip. Aa dar, progresnd n ultimii 40 de ani de la fenotip la ADN, n urmtorii 30 de ani ne vom ntoarce de la ADN la fenotip determinnd funcia anumitor secvene de ADN. O alt problem ce ine de viitor este studiul corelaiei: secvene ADN funcie variaie a secvenelor ADN funcie. Se ateapt o nelegere a implicaiei factorilor genetici n afeciunile multifactoriale (ex: HTA, boli psihice). Se ateapt o viziune nou asupra maladiilor genetice ale celulelor somatice a patra mare categorie de maladii genetice (cancerul), celelalte trei categorii fiind bolile monogenice, boli multifactoriale; anomaliile cromozomiale. Conexiunea ntre oncogenez i teratogenez (oncogene i teratogene) deja a fost fcut pe exemplul tumorii Wilms i sindromul cefalosindactiliei Greig. Terapia genic va deveni popular nu doar pentru maladiile ereditare, dar i pentru cele ale celulelor somatice. *** Trim n veacul celor dou revoluii tiinifice: n biologie !!! n informatic !!! Geneticienii sunt privilegiai s lucreze ntr-un important cmp tiinific un cmp al provocrilor intelectuale. Genetica uman este un cmp care deine fascinaii particulare, pentru c implic aspectele fundamentale ale speciei noastre, sunt fascinaii pe care matematica, de exemplu, nu le poate mprti. Genetica Uman, combin fascinaiile intelectuale i antropoceutice, oportunitatea de a contribui la bunstarea umanitii, de a fi n serviciul familiei i individului aparte prin Genetica Medical. Dar acest privilegiu aduce cu sine i responsabiliti !!! Proiectul Genomul Uman are semnificai etice, legale i sociale. Abilitatea de analiz a genomului individului este acompaniat de riscul de a folosi greit informaia i de aceia trebuie de limitat la maxim acest risc. Exist necesitatea pstrrii confideniale a anumitor studii pe indivizi, trebuie protejat informaia pentru a nu se ajunge la un complex hazardat genetic comercial.

CURS 2
APARATUL GENETIC AL CELULEI UMANE Aparatul genetic al celulelor umane este format din structuri celulare ce conin ADN (nucleul i mitocondriile) i care care intervin n realizarea funciilor ADN-ului (ribozomii i centrul celular). Nucleul conine ~ 98% din ADN celular, iar numrul de molecule de ADN nuclear este corelat cu numrul de cromozomi, care constituie o caracteristic de specie: - n celulele somatice ale omului se conin 46 molecule lungi de ADN n cei 46 de cromozomi (set diploid = 2n cromozomi); - n celulele sexuale 23 molecule de ADN n 23 cromozomi (set haploid = n cromozomi). ADN-ul cromozomial este extrem de heterogen, 25 % din secvenele polinucleotidice corespund genelor structurale codificatoare de proteine. Totalitatea informaiei genetice (genele) din cei 46 cromozomi ai celulelor somatice formeaz genotipul, fiind n proporie de 50 % / 50% de origine matern i patern. Mitocondriile conin ~ 2% din ADN celular. Spre deosebire de nucleu, mitocondriile conin cteva copii mici de ADN circular. Informaia genetic din mitocondrii constituie plasmotipul. Transmiterea informaiei ereditare a mitocondriilor se face pe linie matern. Ribozomii reprezint o component a aparatului de translaie a informaiei genetice, controlnd biosinteza proteinelor expresia informaiei genetice codificate n ADN. Centrul celular asigur formarea aparatului de diviziune responsabil de repartizarea materialului genetic n procesul de transmitere a informaiei genetice de la o generaie de celule la alte celule n timpul mitozei, de la prini la copii n timpul meiozei.

ORGANIZAREA I FUNCIONAREA MATERILAULUI GENETIC

(date generale) (A) ADN-ul deine informaia genetic despre: structura organismului particularitile lui funcionale particularitile de dezvoltare, reproducere, rspunsului la aciunea factorilor de mediu, interaciunea dintre diferite elemente ale aceluiai organism sau cu alte organisme. ADN reprezint macromolecule formate din dou catene polidezoxinucleotidice complimentare, antiparalel sub form de dublu helix. Informaia genetic n ADN este nscris sub forma unei secvene prin succesiunea a patru tipuri de baze azotate: A, G, C, T Bazele azotate se combin cte trei formnd codoni - "cuvintele" codului genetic, fiecare triplet codific un anumit aminoacid, de exemplu: AAA Lys CAG Gln TGC Cys GGA Gly etc. Astfel, succesiunea tripletelor dintr-un segment codant de ADN determin succesiunea aminoacizilor dintr-un polipeptid. Secvena codant - ...AAACAGTGCGGA... Fragment polipeptidic - ...Lys Gln Cys Gly... Sucesiunea aminoacizilor din polipeptid determin particularitile spaiale i funcionale ale proteinei. Proteinele determin (direct sau participnd n diferite lanuri metabolice) toate structurile celulare, activitle celulare, asigur interaciunea cu alte celule, particip n aprarea celulei sau rspunsul la aciunea diferitor factori ecologici, etc. (B) ADN-ul transmite informaia genetic din generaie in generaie (de la celul la alte celule sau de la o generaie de organisme la alte generaii de la prini la copii). La baza motenirii i transmiterei I.G. st proprietatea unic a moleculei de ADN de replicare: 1 molecul de ADN
replicare

2 molecule de ADN

n timpul replicrii sau sub aciunea diferitor factori ai mediului n molecula de ADN pot aprea modificri n secvena nucleotidic mutaii. Mutaiile pot avea catacter adaptiv sau pot fi patologice. Pentru a se evita acumularea de mutaii patologice moleculele de ADN au alt proprietate unic reparaia cu refacerea structurii iniiale a ADN-ului prin nlturarea nucleotidelor eronate sau modificate i inlocuirea lor cu nucleotide normale. (C) ADN-ul realizeaz informaia genetic n timpul sintezei moleculelor de ARN i proteinelor. ADN-ul poate fi transcris sub form de secvene nucleotidice de ARN: ARNm, ARNr, ARNt i microARN care particip la translaia I.G. i sinteza lanurilor polipeptidice - viitoare proteine structurale, enzime, receptori, reglatori, etc.. 8

ADN

transcript ie

ARNm ARNt ARNr microARN

translatie

polipeptid protein funcional

(D) Procesele moleculare de baz din celule umane sunt: replicarea ADN suportul transmiterii I.G.; reparaia ADN suportul stabilitii I.G; transcripia ADN i translaia ARNm suportul realizrii I.G.. Toate aceste procese: (1) sunt programate se realizeaz numai ntr-o anumit perioad ontogenetic a celulei, dependent de tipul celulei, depind de semnale exogene i endogene; (2) se realizeaz matricial moleculele iniiale reprezint modele pentru sinteza produilor specifici: ambele catene ale moleculei de ADN sunt matrie pentru sinteza noilor catene de ADN n timpul replicrii; una din catenele moleculei de ADN este matri n timpul reparaiei celeilalte catene de ADN; una din catenele ADN-ului genic este matri pentru sinteza moleculelor de ARN (ARNm, ARNt, ARNr) n timpul transcripiei ADN-ului; molecula de ARNm este matri pentru sinteza polipeptidului n procesul translaiei codului genetic; (3) se desfoar dup principiul complementaritii bazelor azotate; n timpul replicrii catenele noi de ADN sunt complementare celor vechi, matrielor; n timpul reparaiei fragmentele reparate de ADN sunt complementare catenei integre; n timpul transcripiei moleculele de ARN sintetizate sunt complementare catenei anticodogene a secvenei moleculei de ADN; n timpul translaiei anticodonii moleculelor de ARNt adaptorii aminoacizilor sunt complementare codonilor din ARNm. (4) necesit factori proteici, uniti de polimerizare i energie pentru a se desfura: a. pentru a se desfura replicarea: ADN-polimerazele - enzime ce sintetizeaz catene noi de ADN pe baza catenelor vechi; dNTP nucleotide, monomeri pentru formarea noilor catene de ADN + donatori de energie n realizarea legturilor covalente dintre nucleotide; b. pentru a se desfura reparaia: Endonucleaze enzime specifice ce nltur fragmentul nucleotidic defect; ADN-polimerazele - enzime ce sintetizeaz fragmente noi de ADN pentru inlocuirea golului; dNTP nucleotide, monomeri pentru formarea noilor catene de ADN + donatori de energie n realizarea legturilor covalente dintre nucleotide; c. pentru a se desfura transcripia: ARN-polimerazele enzime care sintetizeaz catene de ARN pe baza unei catene a moleculei de ADN; NTP - nucleotide, monomeri pentru formarea moleculelor de ARN + donatori de energie n realizarea legturilor covalente dintre nucleotide; d. pentru a se desfura translaia: ribozomii sediul translaiei i sintezei polipeptidului; ARNt - translatorii codului genetic i transportori de aminoacizi spre ribozomi; 9

(5)

(6)

(7)

(8)

aminoacizi monomeri pentru formarea polipeptidului; ATP, GTP surse de energie. necesit secvene nucleotidice reglatoare pentru interaciunea cu reglatorii procesului dat; Pentru iniierea replicrii secvena ORI; Pentru transcriie: o Promotor secven reglatoare a iniierei transcripiei; o Terminator secven reglatoare a terminrii transcripiei; o Enhancer secven intensificatoare a transcripiei; o Silencer secven atenuatoare a transcripiei. Pentru translaie o Codon de iniiere - AUG; o Codon STOP - UAA, UAG sau UGA; necesit factori proteici i energie pentru despiralizarea ADN-ului sau ARN-ului ca s fie acsesate matriele i citite secvenele nucleotidice: Helicazele enzime ce denatureaz acizii nucleici, scindez legturile de H dintre bazele complementare ale ADN sau ARNm particip la toate procesele de baz analizate; Topoizomerazele relaxeaz i despiralizeaz dublul helix de ADN, ajutnd Helicazele n timpul replicarii. se desfoar n mai multe etape cu cooperarea numeroilor factori proteici i n consecin defectul sau absena unei proteine din setul necesar pot compromite calitativ sau cantitativ replicarea, reparaia, transcripia sau translaia: i Blocarea replicrii ADN-ului va conduce la blocarea proliferrii celulei (diviziunii celulei) care n consecin pot duce la: o deficiene in dezvoltarea i creterea organismului; o deficiene n regenerarea i reinnoirea esurutilor; o mbtrnire precoce i moarte. ii Blocarea reparaiei ADN-ului va avea ca consecin: o acumularea mutaiilor patologice; o sensibilitatea sporit a organismului la aciunea radiaiei ultraviolete, radiaiei ionizante, substanelor chimice din mediu; o apariia i dezvoltarea rapida a tumorilor (cancerului); o mbtrnirea precoce i moartea. iii Blocarea transcripiei sau translaiei, fiind etape ale realizrii I.G. vor avea ca consecin blocarea sintezei proteinei i diferite defecte la nivel celular sau organismic dependent de: o tipul proteinei, o funciile ei n celul; o tipul de celul, esut n care se sintetizeaz i / sau activeaz; o perioada ontogenetic n care este activ, o etc. prezint principii generale comune la diferite organisme i anumite particularitai, unele aspecte sunt aceleai i la procariote i la eucariote, inclusiv i la om.

NIVELE DE ORGANIZARE A MATERIALULUI GENETIC

Din punct de vedere funcional se disting trei nivele de organizare a materialului genetic: genic, cromozomial, genomic, care au urmtoarele caracteristici comune: 1. autoreproducerea, care asigur transmiterea informaiei genetice la urmai prin replicarea ADNului i diviziunea celular suportul ereditii;

10

2. autoconservarea, ce asigur stabilitatea organizrii, pstrrii i repartizrii uniforme a materialului genetic n succesiunea generaiilor prin replicare i reparaia ADN-ului important n pstrarea caracterelor de specie; 3. mutabilitatea, care asigur proprietatea materialului genetic de a se schimba i de a transmite modificrile descendenilor - sursa principal a variabilitii. Gena - unitatea elementar structuralfuncional a ereditii i variabilitii: reprezint o secven specific polinucleotidic din molecula de ADN; conine informaia despre formarea caracterului elementar proteina: succesiunea de nucleotide din ADN determin succesiunea de aminoacizi n protein; asigur continuitatea material a informaiei genetice de-a lungul generaiilor, adic motenirea de ctre descendeni a caracterelor parentale; modificrile ce se produc n structura genei pot determina modificri n sinteza proteinei i ale caracterului. Existena genelor a permis descoperirea de ctre G. Mendel a legitilor de motenire a caracterelor.

Cromozomul reprezint substratul morfologic al ereditii i variabilitii: - este reprezentat de o molecul de ADN linear compactizat cu ajutorul proteinelor histone i nonhistone, vizibil n timpul diviziunii celulare; - conine multe gene, de la cteva sute (crs. Y) pn la cteva mii (crs. 1); - asigur aranjarea ordonat a informaiei genetice n spaiu, n grupuri de nlnuire, fiecare gen are un locus fix pe molecula de ADN; - determin transmiterea genelor n bloc, datorit proprietilor de replicare a cromozomilor i compactizrii lor rapide; - controleaz recombinarea materialului genetic crossing-overul. Genomul este nivelul superior de organizare a materialului genetic care asigur unitatea genetic a sistemelor unui organism prin realizarea informaiei genetice n caractere fenotipice i integrarea diferitor procese moleculare, biochimice, morfologice i fiziologice. Genomul reprezint: - totalitatea moleculelor de ADN ce se conin n celul; - genomul celulelor sexuale umane - 23 molecule ADN nuclear (set haploid) i cteva moleculele de ADN mitocondrial; - genomul celulelor somatice - 46 molecule ADN nuclear (set diploid) i cteva copii de ADN mitocondrial; - genomul conine setul de secvene codante, reglatoare i modulatoare care asigur dezvoltarea tuturor caracterelor specifice individului; - sistemul de gene care se conine n 46 molecule de ADN ale celulelor somatice se numete genotip i include circa 25-35 mii perechi de gene; - genele din ADN mitocondrial formeaz plasmotipul; - setul diploid al moleculelor de ADN nuclear, organizate sub form de cromozomi (complexe ADNproteine) formeaz cariotipul.

11

CARACTERISTICA GENOMULUI UMAN

Genomul este sistemul genetic complet al celulei organismului uman, care determin dezvoltarea individual, activitatea vital i transmiterea caracterelor structurale i funcionale descendenilor. Sistemul genetic uman complet include genomul nuclear i mitocondrial, adic 46 molecule ADN nuclear i cteva molecule circulare mitocondriale.

Genomul nuclear al celulei somatice umane reprezint 95-98% din cantitatea de ADN celular i este fragmentat n 24 molecule de ADN distincte: 22 molecule de ADN ce formeaz cromozomii autozomi; o molecul de ADN ce formeaz cromozomul X; o molecul de ADN ce formeaz cromozomul Y. n nucleu sunt aproximativ: 7 picograme de ADN cu o lungime de pn la 7 mld. p.n. (7x109), circa 30.000 perechi de gene codificatoare de proteine care: constituie doar 25% din ADN-ul celular; sunt dispersate neomogen pe toi cromozomii; 90% regiuni eucromatice ce asigur transcripia i se caracterizeaz prin alternarea: secvenelor unice i repetitive, codificatoare i necodificatoare; 10% - regiuni heterocromatice ce constau din secvene nalt repetitive necodificatoare; Partea necodificatoare a genomului se caracterizeaz printr-un polimorfism nalt, care nu se manifest n fenotip, constituie baza molecular a individualitii ADN-lui uman amprent genetic. Genomul nuclear reprezint o comunitate simbiotic de secvene nucleotidice, care const din elemente obligatorii i facultative. Elementele obligatorii determin formarea i transmiterea caracterelor specio-specifice i individuale, structurale i funcionale ntr-un ir de generaii; controleaz particularitile dezvoltrii ontogenetice ale fiecrui individ. Elementele obligatorii ale genomului uman sunt: genele structurale caracteristice speciei, numrul i localizarea crora sunt constante n genom; 12

 genele ARNr i ARNt produii crora asigur expresia genelor structurale, sinteza proteinelor celulare baza tuturor structurilor i funciilor celulelor organismului uman; secvenele inversate i palindromii care reprezint situsuri de recunoatere - reglatoare ale expresiei, replicrii i recombinrii materialului genetic; secvenele centromerice i telomerice care asigur integritatea materialului genetic cromozomial, transmiterea exact a IG n timpul mitozei, meiozei. Elementele facultative ale genomului sunt reprezentate de pseudogene, elemente mobile (transpozoni), secvene de ADN viral, retrotranscripi (ADNc), care reprezint un substrat n evoluia genomului.
CLASIFICAREA SECVENELOR GENOMULUI UMAN NUCLEAR ADN nerepetitiv 60% Tipuri de secvene Numrul de copii per genom Localizare - gene structurale - pseudogene - spaiatori ai genelor - secvene unice - familii multigenice cu un numr mic de copii dispersate neomogen pe toi cromozomii - codific proteine - separ secvenele codificatoare - regleaz expresia genelor ADN moderat repetitiv 30% - gene de clasa I i III; - SINEs - LINEs sute i mii de copii de secvene scurte de 300-1000pb - sunt dispersate n genom - formeaz secvene repetate n tandem - codific ARNr, ARNt, ARNsn - reprezint transpozoni - secvene ORI - controleaz mperecherea corect a cromozomilor n timpul meiozei ADN nalt repetitiv 10% ADN satelit (100-200pb)n; ADN minisatelit (14-65pb)n; ADN microsatelit (1-4pb)n. Milioane de copii de secvene de 2200pb - -sateliii n regiunile de heterocromatin costitutiv; - minisateliii au localizare specific pentru fiecare cromozom - sateliii au rol structural; - minisateliii reprezint markeri specifici ai cromozomilor; - microsateliii sunt hipervariabili marcheri genetici individuali permit dactiloscopia genomic

Funcii

Genomul mitocondrial este reprezentat de 2-10 copii circulare de ADN, localizate n matricea mitocondrial. Fiecare molecul de ADN const din 16.569 perechi nucleotide. Ambele catene ale moleculei de ADN conin gene structurale care sunt lipsite de introni i se separ unele de altele prin gene ARNt. n fiecare molecul de ADN sunt localizate 13 gene ce codific proteine enzime ale aparatului de respiraie mitocondrial, 2 gene pentru ARNr i 22 gene pentru ARNt. Genomul mitocondrial se caracterizeaz prin: numr variabil a copiilor per celul, care depinde de numrul mitocondriilor i / sau intensitatea metabolismului celular; localizarea compact a genelor; lipsa secvenelor necodante; transcrierea informaiei de pe ambele catene ale moleculei de ADN; mutabilitatea nalt a secvenelor nucleotidice; mutaiile genelor mitocondriale sunt cauzele unor boli genetice legate de metabolismul energetic (de ex., miopatii, encefalopatii, etc.); transmitere pe linie matern. 13

DINAMICA MATERIALULUI GENETIC NUCLEAR Materialul genetic nuclear este reprezentat de cromatin sau cromozomi, care din punct de vedere al organizrii moleculare reprezint complexe nucleoproteice (ADN, proteine histone, proteine nehistone, ARN). Cantitatea, forma i activitatea materialului genetic se modific n funcie de: - perioada ciclului celular; - perioada ontogenetic; - tipul celulei; - aciunea factorilor de mediu. n diferite perioade ale ciclului celular materialul genetic se poate prezenta sub form de: - cromatin sau cromozomi, graie diferitor nivele de compactizare; - cromozomi mono- sau bicromatidieni, nainte sau dup replicare; - secvene genetic active sau inactive transcripional.
Compactizarea ADN-ului nuclear

Dinamica materialului genetic pe parcursul ciclului celular Perioadele ciclului celular G1 Grad de condensare Procese genetice Nr de cromozomi 46 Nr de mol de ADN 46 Eu- i heterocromatin Transcripie, translaie, reparaie Eu- i heterocromatin Replicaie, transcripie, translaie, reparaie Eu- i heterocromatin Transcripie, translaie, reparaie Heterocromatin Cromozomi metafazici Heterocromatin Heterocromatin Transcripie

46

4692

G2 Profaz Metafaz Anafaz Telofaz

46 46 46 92 46+46

92 92 92 92 46+46

(A) COMPACTIZAREA MATERIALULUI GENETIC Materialul genetic poate fi reprezentat de cromatin n nucleul interfazic i de cromozomi n timpul diviziunii. Cromatina constituie forma extins i despiralizat a cromozomilor. Din punct de vedere al interaciunii cu coloranii bazici, cromatina se clasific n dou categorii: eucromatin i heterocromatin.

14

Eucromatina reprezint regiunea slab condensat a cromatinei care conine gene structurale i este poriunea funcional activ a ADN-ului de pe care are loc transcripia. Astfel regiunile de eucromatin sunt responsabile de expresia specific a informaiei genetice, reglarea proceselor vitale eseniale prin expresia genelor house keeping. Ponderea eucromatinei poate varia de la celul la celul datorit expresiei difereniate a genelor specifice de esut, specifice unei anumite perioade ontogenetice sau aciunei factorilor de mediu . Heterocromatina reprezint segmente de cromatin condensate, inactive genetic, care nu se supun transcripiei. Se disting dou tipuri de heterocromatin: constitutiv i facultativ. Heterocromatina constitutiv conine ADN repetitiv (ADN satelit), deci nu conine secvene codificatoare i nu poate fi transcris. Astfel de secvene sunt implicate n idividualizarea cromozomilor (secvenele telomerice), reglarea mitozei sau meiozei (centromerii), separarea secvenelor codificatoare i aranjarea lor funcional n nucleu. Localizarea segmentelor de heterocromatin constitutiv n cromozomii omologi este identic i, de regul, nu variaz de la celul la celul. - Heterocromatina facultativ conine secvene codificatoare Reprezentarea aceluiai fragment de cromozom n diferite celule (A, B, neactive, funcia lor fiind C). E eucromatina, Hc heterocromatina constitutiv, Hf dependent de momentul heterocromatina facultativ ontogenetic, tipul de esut sau de sex. Heterocromatina facultativ n anumite condiii se poate decondensa i transforma n eucromatin. Heterocromatina facultativ autozomal regleaz indirect expresia genelor dependente de esut sau a genelor ce activeaz n diferite perioade de vrst. Heterocromatina facultativ sexual cromatina sexual X - reprezint un cromozom X heterocromatinizat n nucleele celulelor somatice cu doi cromozomi X; inactivarea cromozomului X se realizeaz arbitrar, indiferent de originea lui matern sau patern; astfel, n unele celule (46,XX) un cromozom X este activ (eucromatinizat) iar cellalt - inactiv (heterocomatinizat). (B) CANTITATEA MATERIALULUI GENETIC Cantitatea materialului genetic n celulele somatice depinde de perioada ciclului celular. O celul tnr n perioada G1 a interfazei, pn la replicarea ADN-ului, conine 46 de cromozomi monocromatidieni (46 molecule ADN). Pe parcursul perioadei S are loc replicarea semiconservativ i asincron a ADN-ului, cromozomii devenind bicromatidieni (92 molecule de ADN). Cele dou cromatide ale unui cromozom rmn unite prin centromer pn n anafaza mitozei, cnd are loc distribuia materialului genetic la celulele fiice. n aa mod celulele nouDinamica cromozomilor pe parcursul ciclului celular formate conin aceeai cantitate de material genetic ca i celula iniial (transmiterea ereditar a materialului genetic de la celul la celul). 15

(C) ACTIVITATEA MATERIALULUI GENETIC Activitatea materialului genetic se exprim prin capacitatea ADN-ului de a fi transcris. Transcripia i rata transcripiei este dependent att de perioada ciclului celular, ct i de tipul celulei, aciunea diferitor factori genetici sau negenetici. Pentru ca o secven de ADN s fie transcris sunt necesare urmtoarele evenimente: - solicitarea produsului proteic respectiv n celul; - activarea unor factori de transcripie specifici; - eucromatizarea secvenei respective de cromozom. Deoarece pe parcursul diviziunii celulare ADN-ul este puternic condensat, eucromatizarea i respectiv transcripia este posibil doar n interfaz. Sub aciunea unor inductori ai transcripiei are loc despiralizarea selectiv a unui segment cromozomic, iniierea transcripiei i sinteza unei molecule de ARN. Tipul i cantitatea proteinei sintetizate este dictat de necesitatea celulei sau organismului. Produii proteici ai genelor pot fi clasificai n cteva grupe: - proteine house keeping indispensabile activitii tuturor celulelor, - proteine specifice pentru un anumit esut, - proteine necesare unei anumite perioade a ontogenezei celulei sau organismului; - proteine necesare organismelor de sex feminin sau masculin; - proteine necesare n anumite condiii de mediu. Astfel, concomitent ntr-o celul se expreseaz circa 10% din setul de gene motenite.
Fiecare celul? a organismului con?ine setul complet de gene (30000 perechi gene pentru 46 mol. ADN nuclear)

Expresia genic? numai 10% din toate genele

Expresie continu? Gene ARNr Gene ARNt Gene house keeping

Expresie dependent? de anumite condi?ii: - Gene specifice de ?esut; - Gene specifice de perioada ontogenetic?; - Gene specifice de perioada ciclului celular; - Gene specifice de factorii de mediu.

Non-expresie: pseudogene

16

CURS 3
VARIABILITATEA I FORMELE EI Variabilitatea este proprietatea organismelor de a obine caractere sau nsuiri noi, diferite de cele ale prinilor. Variabilitatea este un fenomen biologic complex i universal n lumea vie: - este determinat de factori ecologici i ereditari; - se manifest prin modificri genetice, biochimice, fiziologice i morfologice. Variabilitatea are o importan deosebit n viaa organismului, populaiei i speciei, asigurnd: - polimorfismul genetic i fenotipic individual; - supravieuirea organismelor n diversele condiii ale mediului; - susceptibilitatea diferit a indivizilor la anumii factori ai mediului; - manifestarea unor stri patologice; - selecia natural; - baza material a evoluiei speciei umane. Factorii ecologici care determin apariia variaiilor pot fi clasificai n factori externi (fizici, chimici i biologici) i factori interni (produi intermediari ai metabolismului, diferite stri fiziologice).

CLASIFICAREA VARIABILITII
Transmiterea sau netransmiterea ereditar este criteriul fundamental n clasificarea variabilitii. Valoarea biologic a variaiilor este judecat n raport cu faptul dac acestea sunt corelate cu modificri la nivelul materialului genetic. Din acest punct de vedere, variabilitatea este de dou tipuri: - variabilitate neereditar, numit i variabilitate fenotipic sau modificaiune; - variabilitatea ereditar sau variabilitatea genotipic.

17

(A) VARIABILITATEA NEEREDITAR Variaiile neereditare sau modificaiunile reprezint reaciile organismului, determinate genetic, de a rspunde la aciunea factorilo mediului ambiant prin schimbri morfologice, fiziologice i biochimice, pe termeni mai scuri sau mai ndelungai. Modificaiunile se caracterizeaz prin: variaii fenotipice neereditare; poart un caracter adaptiv i favorizeaz individul n lupta pentru existen; reprezint stri reversibile de durat diferit, determinat de tipul factorului ecologic, intensitatea i durata de aciune a acestuia i particularitile caracterului modificat; determin capacitatea organismelor de a reaciona diferit cnd sunt puse n condiii similare de via, fiind o caracteristic ereditar (norma de reacie).

i. ii. iii. iv.

Exemple de modificaiuni la om pot fi: rspunsul la aciunea razelor ultraviolete (creterea cantitii de melanin n epiderm bronzarea); rspunsul la eforturi fizice repetate (creterea masei musculare); rspunsul la hipoxie (mrirea concentraiei hemoglobinei n snge); rspuns la aciunea ndelungat a temperaturilor sczute (creterea stratului celulo-adipos subcutanat tipul arctic). Modificaiunile se produc n anumite limite, ce sunt controlate genetic i sunt dependente de doza i durata de aciune a factorului modificator. Pentru fiecare organism aceste limite sunt individuale i se ncadreaz n noiunea de norm de reacie. Norma de reacie pune n eviden raportul dintre potenialul genetic cu care individul se nate i posibilitile de manifestare fenotipic a acestuia n diferite condiii mezologice (mediul ecologic, mediul familial, mediul social). ***** Caracterele indivizilor i ale populaiei umane se manifest fenotipic n limitele normei de reacie, a potenialului genetic nscris n structuri ereditare (genomul nuclear i mitocondrial), iar prin educaie prin dirijarea factorilor sociali i ecologici, se pot dezvolta caracterele i trsturile ce se nscriu n norma de reacie. (1) Sunt indivizi cu potenial genetic favorabil, cu norm larg de reacie (talent muzical, inteligen, capaciti fizice): a. n mediu social-educaional nefavorabil nu se manifest posibilitile n toat plenitudinea lor; b. prin educaie se dezvolt posibilitile pe msura metodelor de educaie i a efortului de perfecionare. (2) Sunt indivizi cu norm de reacie manifestat n limite relative: a. Fr educaie se manifest mediocru; b. Prin educaie se manifest la valoarea lor. (3) Sunt indivizi cu deficiene psiho-somatice determinate genetic, cu norm de reacie manifestat n limite restrnse (oligofreni etc.) educai n instituii speciale. ***** Unii factori ai mediului pot avea aciune distructiv asupra organismului, producnd modificaiuni ce depesc limita normei de reacie. Drept exemple sunt anomaliile de dezvoltare teratogene. Factorii teratogeni de diferit natur (fizici, chimici, biologici) perturbeaz dezvoltarea normal a embrionilor la diferite perioade ale ontogenezei, producnd anomalii morfologice, fiziologice sau biochimice, prezente la natere. Acestea ar putea fi confundate cu defecte ereditare i n acest caz poart denumirea de fenocopii (de ex., surditatea rubeolic, microcefalie alcoolic etc.). 18

(B) VARIABILITATEA EREDITAR SAU GENOTIPIC Variaiile ereditare sunt produse prin modificri ale materialului genetic modificri n structura i /sau cantitatea materialului genetic. Variaiile ereditare se caracterizeaz prin urmtoarele particulariti: sunt determinate de modificri specifice ale materialului genetic; apar spontan sau prin aciunea factorilor fizici, chimici i biologici asupra materialului genetic; se transmit de-a lungul generaiilor, sunt ereditare; reprezint sursa principal a evoluiei lumii vii; stau la baza polimorfismului populaiei.

i. ii. iii. iv. v.

Sursele biologice ale variabilitii ereditare sunt mutaiile i recombinarea materialului ereditar dou ci prin care apar caractere i / sau combinaii noi de caractere, ce au o anumit valoare i semnificaie biologic. 1. VARIABILITATEA COMBINATIV Recombinarea materialului genetic este asigurat n general de procesele legate de nmulirea sexuat. n dependen de cantitatea de material implicat n recombinare deosebim: - recombinare genomic recombinarea materialului ereditar n procesul fecundaiei; - recombinarea intercromozomic combinarea independent a cromozomilor neomologi n anafaza I a meiozei; - recombinarea intracromozomic recombinarea genelor ntre cromozomii omologi n procesul crossing-overului. Importana biologic a recombinrilor materialului genetic: a. combinarea ntmpltoare a genelor de origine parental diferit i naterea unor indivizi cu caractere comune ale ambilor prini unici din punct de vedere genetic i bioogic; b. selecia natural prin eliminarea indivizilor cu combinaii defavorabile de gene, mutaii letale i semiletale i supravieuirea indivizilor cu caractere normale, adaptive; c. evoluia speciei datorit seleciei genelor evaluante. 2. VARIABILITATEA MUTAIONAL Mutaia este fenomenul biologic de apariie a modificrilor materialului genetic, prin care apar caractere i nsuiri noi, ci metabolice sau structuri noi i, ca rezultat, a unui fenotip nou. Mutaia apare relativ rar i rmne destul de stabil de-a lungul generaiilor. Procesul prin care apare mutaia se numete mutagenez. Factorii fizici, chimici i biologici care produc mutaii se numesc ageni mutageni. Prin mutaie pot s apar gene noi (gene mutante), cu informaie ereditar diferit de cea iniial (gen de tip slbatic). Mutaia include modificri n structura acizilor nucleici i a genelor, schimbarea cantitii materialului genetic (anomalii de numr ale cromozomilor); poate interesa materialul genetic nuclear (genotipul) ct i materialul genetic citoplasmatic (plasmotipul). n funcie de cantitatea materialului genetic modificat, sediului proceselor de mutagenez, gen, cromozom, genom se pot descrie trei tipuri de mutaii: i. mutaii genice ce se produc la nivelul moleculei de ADN, pot implica ntreaga gen, mai multe nucleotide sau unul singur; 19

ii.

iii.

mutaii cromozomice (aberaii cromozomiale) sunt modificri structurale ale cromozomilor ce constau n pierderea, ctigul sau rearangarea unor segmente din cromozom; mutaii genomice sunt modificri ale setului diploid (46) de cromozomi, afectnd fie 1-2 perechi cromozomi (aneuploidie), fie toi cromozomii, prin adugarea a 1-2-3 seturi haploide (poliploidie).

O alt clasificare a mutaiilor se bazeaz pe tipul de celul afectat: germinal sau somatic: - mutaiile germinale produc gamei anormali, care dup fecundare transmit mutaia la generaia urmtoare, rezultnd un individ n care toate celulele vor fi mutante; - mutaiile somatice vor forma o clon celular anormal i, secundar, prin modificrile morfofuncionale ale organelor, sunt implicate n geneza cancerului i accelerarea senescenei organismului. Mutaiile genice pot fi spontane sau induse. Primul tip este determinat de factori necunoscui, imposibil de definit sau obiectivat de un observator; al doilea tip de mutaii sunt produse prin aciunea unor factori cunoscui: fizici (radiaii ionizante), chimici (analogi ai bazelor azotate, ageni alchilani) sau biologici (virusuri). Mutaiile spontane ar putea fi determinate de radioactivitatea natural (reprezentat de razele cosmice, radioactivitatea terestr permanent i iradierea intern) i reprezent circa 1,5% din totalul mutaiilor nregistrate la om. Modificrile materialului genetic se pot rsfrnge asupra proprietilor vitale ale organismului mutant i pot fi: - mutaii evaluante, pozitive, care asigur apariia unor caractere noi care-l fac pe individ mai rezistent la factorii de mediu; - mutaii defavorabile, negative, letale sau subletale ce determin apariia unor anomalii incompatibile cu viaa sau stri patologice; - mutaii neutre care nu afecteaz vitalitatea producnd polimorfisme genice i fenotipice.

POLIMORFISMUL ADN
Analiza genomurilor umane, alese la ntmplare, indic identitatea lor n proporie 99,9%, iar 0,1% prezint variante diferite ale unei secvene de ADN. Aceste variaii pot fi att n interiorul genelor, ct i n regiunile intergenice, ultimele fiind mai frecvente deoarece nu sunt eliminate de selecia natural. Polimorfismul ADN se refer la variaiile nucleotidice din diferite regiuni ale ADN-ului. Exist mai multe tipuri de polimorfisme ADN: - variaii a unui singur nucleotid SNP (single nucleotid polymorphism); - variaii microsatelitice di-, tri-, tetra- i pentanucleotidice STR (short tandem reapeats); - variaii minisatelitice cu secvene de 10-15 p.n. repetate n tandem - VNTR (variable number tandem reapeats). Secvenele polimorfe n genomul uman sunt ntlnite cu o frecven de un situs polimorf la 300-500 nucleotide. Polimorfisme ADN nu se manifest n fenotip i constituie baza molecular a individualitii ADN-lui uman amprent genetic , iar situsurile polimorfe marcheri n studiile populaionale sau n identificarea persoanelor dactiloscopia genomic.

20

CURS 4
CROMOZOMII UMANI Termenul de cromozom a fost propus n 1888 de Waldeyer cu referin la corpusculi colorai ce pot fi vizualizai pe parcursul diviziunii celulare. n interfaz cromozomii sunt decondensai i se prezint sub form de filamente, fibre sau bucle de cromatin bine organizate n nucleul celulei, aspectul cruia depinde de tipul celulei sau perioada ontogenetic. Segmentele de cromatin active transcripional se prezint sub form de eucromatin, iar cele ce nu se transcriu sub form de heterocromatin. Cromozomii metafazici reprezint nivelul maximal de condensare a materialului genetic nuclear, iar studiul cromozomilor n metafaz permite identificarea precis a fiecrui cromozom, evaluarea morfologiei cromozomilor.

CARACTERISTICI GENERALE ALE CROMOZOMILOR

1. Cromozomii reprezint nivelul supramolecular de organizare a materialului genetic i substratul morfologic al ereditii. Molecula de ADN este principalul component al cromozomului, care-i specific funciile de pstrare, transmitere i realizare a materialului genetic ce-l conine sub form de secvene polinucleotidice specifice gene. 2. Un cromozom conine de la cteva sute la cteva mii de gene: reprezint un grup de nlnuire a genelor: - sigur ordonarea genelor n spaiu i n timp - fiecare gen are o poziie fix pe cromozom locus; - activarea sau inactivarea genei este realizat strict dup necesitile celulei sau organismului; - asigur transmiterea nlnuit a genelor i caracterelor determinate de genele unui cromozom. 3. Cromozomii se autoreproduc n perioada S a interfazei prin replicare semiconservativ a moleculelor de ADN care i constituie. Replicarea diferitor segmente cromozomiale i diferitor cromozomi se realizeaz asincron, dar la sfritul perioadei S toi cromozomii devin bicromatidieni. 4. Cromozomii reprezint structuri dinamice ce i modific aspectul, forma, activitatea n dependen de perioadele ciclului celular. 5. Cromozomii au structur neomogen de-a lungul lor datorit alternrii diferitor segmente de ADN: - secvene codificatoare i necodificatoare, - secvene unice i repetitive, - regiuni ce corespund eucromatinei i heterocromatinei; - regiuni ce se deosebesc dup gradul de pliere a fibrei de cromatin (dimensiunile buclelor); - regiuni cu un coninut diferit de perechi A T i G C; - regiuni cu o cantitate diferit de proteine asociate. Toate aceste explic polimorfismului cromozomial, colorarea difereniat a cromozomilor i originea benzilor (Vezi Tehnici de analiz a cromozomilor). Fiecare individ, fiecare celul conine un set diploid de cromozomi. Fiecare cromozom n setul diploid are omologul su. Cele 23 de perechi de cromozomi ale celulei umane somatice constituie cariotipul, care att cantitativ, ct i calitativ se implic n formarea fenotipului celulei i organismului uman.

21

Modificrile numrului sau structurii cromozomilor produc anomalii de dezvoltare multiple sindroame cromozomice plurimalformative (ex. 47, XX(XY),+21 sindrom Down; 46,XX(XY),5p- - sindrom cri-du-chat) sau determin transformarea clonelor celulare aneuploide. Genetica dispune de variate tehnici de cariotipare pentru depistarea anomaliilor de numr sau de structur a cromozomilor cu scop: de diagnostic al sindroamelor cromozomice, de prevenire a naterii copiilor cu anomalii cromozomiale prin diagnostic prenatal i studiul anomaliilor cromozomiale n tumori.

ORGANIZAREA MOLECULAR A CROMOZOMILOR

Cromozomul este constituit din 1 sau 2 molecule de ADN (n dependen de perioada ciclului celular), asociat cu proteine histone, nehistone i ARN, formnd o nucleoproteid cu diferite nivele de compactizare: 1. molecula de ADN cu diametru de 2 nm interacioneaz cu proteinele histone determinnd formarea primului nivel de compactizare nucleosomic; octamere histonice (2H2A, 2H2B, 2H3 i 2H4) sunt nfurate de segmente de ADN cu o lungime de 160p.n., transformnd molecula de ADN n filament nucleoproteic polinucleosomic cu diametru de 11nm i asigurnd un grad de compactizare de circa 6 ori; 2. n prezena H1 filamentul de cromatin de 11 nm se supraspiralizeaz i se formeaz al doilea nivel de compactizare - solenoidul, ce se prezint sub form de fibr nucleoproteic de 30 nm, asigurnd un grad de compactizare de circa 40 ori; 3. solenoidul se fixeaz de axul proteic longitudinal al cromozomului (scaffold), format din proteine ale matricei nucleare; solenoidul interacioneaz specific cu scaffoldul prin intermediul SAR regiuni situs specifice de ancorare la SAP proteine situs specifice ale axului cromozomial i astfel apare al treilea nivel de compactizare buclele, care permit un grad de compactizare a materialului genetic interfazic de 600 1000 de ori; 4. al patrulea nivel cromozomul metafazic se formeaz prin rsucirea buclelor n jurul axului cromozomial dup pierderea contactului scaffold / anvelop nuclear; fiecare spir se formeaz din aproximativ 30 de rozete (bucle), buclele sunt orientate spre exteriorul cromozomului; stabilirea nivelului maximal de condensare de 10 000 ori are loc n metafaz.

22

23

MORFOLOGIA CROMOZOMILOR METAFAZICI

Cromozomii sunt cel mai uor de analizat n metafaz sau prometafaz deoarece: se afl n acelai plan placa ecuatorial; sunt compactizai i pot fi uor individualizai; sunt bicromatidieni, iar cromatidele surori sunt unite prin centromer, ce permite diferenierea cromozomilor dup form.

Structura cromozomilor metafazici

(A) ELEMENTELE MORFOLOGICE ALE CROMOZOMILOR sunt: - cromatidele; - centromerii; - telomerii; - constriciile secundare; - sateliii; - situsurile fragile. Cromatida este reprezentat de o molecul de ADN liniar asociat cu proteine histone i non-histone maximal compactizat. Cromozomul metafazic are dou cromatide surori, identice genetic, rezultate prin replicarea ADN cromozomial n perioada S a ciclului celular. Cromatidele surori rmn unite prin centromer de la perioada S pn n anafaz. Centromerul (c) reprezint secvena de ADN specific asociat cu proteine histone specifice ce unete cromatidele surori. ADN centromeric este reprezentat de secvene nalt repetitive. Poziia centromerului este fix i specific fiecrui cromozom, fiecrei perechi de cromozomi omologi. Centromerul mparte cromatidele n dou brae: bra proximal p i bra distal q. Centromerii au urmtoarele funcii: - controleaz formarea kinetocorilor pentru fixarea cromozomilor la fusul de diviziune; - asigur clivarea longitudinal i disjuncia cromatidelor surori cu formarea a doi cromozomi monocromatidieni din fiecare cromozom bicromatidian; - asigur distribuia egal i identic a materialului genetic n timpul mitozei, transmiterea exact a materialului genetic de la celula mam la celulele fiice. 24

Telomerii (t) sunt secvene specifice de ADN asociate cu proteine speciale de la capetele cromozomilor (a) secvene scurte (TTAGGG) repetate n tandem de mii de ori i (b) secvene de ADN specifice fiecrui cromozom. Telomerii: - protejeaz capetele cromozomilor de nucleaze; - mpiedic fuziunea cromozomilor; - asigur replicarea complet a ADN-ului nuclear i previn scurtarea progresiv a telomerilor datorit activitii telomerazei; - controleaz senescena celulelor i organismului pluricelular; - contribuie la fixarea cromatinei de anvelopa nucleului interfazic, controlnd arhitectura nucleului interfazic; - particip la conjugarea cromozomilor omologi n meioz. Constriciile secundare (h) reprezint regiuni de ADN repetitiv despiralizate, slab colorate, prezente pe braele distale ale unor cromozomi (1, 9, 16, mai rar pe crs. 4,6,10 i Y) i pe braele proximale ale cromozomilor acrocentrici 13, 14, 15, 21 i 22, ce conin organizatori nuclelolari. Lungimea constriciilor secundare poate varia individual. Sateliii (s) reprezint mici segmnente de heterocromatin constitutiv separate prin constricia secundar la capetele braelor proximale ale cromozomilor acrocentrici 13, 14, 15, 21 i 22; numrul i dimensiunile sateliilor pot varia de la o persoan la alta. Situsurile fragile reprezint nite regiuni cromozomiale decondensate, cu rezisten sczut la aciunea mutagen ce se pot rupe uor determinnd rearanjamente cromozomiale. Situsurile fragile sunt considerate ca marcheri genetici normali dac afecteaz regiunile de heterocromatin constitutiv; se pot asocia cu unele stri patologice dac afecteaz regiuni crs codante (ex. FRAXA i retardul mental familial); pot avea un rol n progresia tumoral (inactivarea unor gene supresoare de tumori).

25

(B) CLASIFICAREA CROMOZOMILOR UMANI n celulele somatice umane exist cte un set diploid de cromozomi (2n=46), adic 23 de perechi: - 22 perechi sunt identice la femeie i brbat autosomi; - 1 pereche este diferit la cele dou sexe (XX la femeie, XY la brbat) gonosomi. Cromozomii identici ca morfologie (form i mrime) i coninut genic, dar diferii ca origine (unul de origine matern, cellalt de origine patern) se numesc cromozomi omologi. n celulele sexuale mature (gamei) exist cte un set haploid de cromozomi (n=23): n ovule 23,X (22 autosomi+ crs. X), iar n spermatozoizi 23,X (22 autosomi+ crs. X) sau 23,Y (22 autosomi+ crs.Y). Pentru identificarea cromozomilor se folosesc criterii morfologice, indicii autoradiografiei i marcajul n benzi. Criteriile morfologice se refer la dimensiunile i configuraia cromozomului. Se deosebesc criterii cantitative (lungimea cromozomului, indicele centromeric) i calitative (prezena constriciilor secundare i a sateliilor) de clasificare a cromozomilor. Lungimea cromozomului lungimea absolut a cromozomului (n microni) sau lungimea relativ este calculat dup formula:
Lungimea cromozomului studiat X 100. Suma lungimilor cromozomilor setului haploid

Dup lungime cromozomii se clasific n: mari, mijlocii, mici. Poziia centromerului. Pentru a caracteriza poziia centromerului n cromozom se utilizeaz indicele centromeric, care se calculeaz dup formula: p Ic X 100, p q unde p lungimea braului proximal, q lungimea braului distal. n baza acestui criteriu cromozomii se clasific n: Ic = 46 49%

metacentrici:

p submetacentrici:

Ic = 31 45% Ic = 17 30%

p acrocentrici:

26

Pe baza criteriilor morfologice cantitative (lungimea i poziia centromerului) i calitative (satelii i constricii secundare) cromozomii se grupeaz n perechi de omologi i se clasific n 7 grupe, notate de la A la G: grupa A - perechile 1-3, sunt cei mai mari cromozomi metacentrici, cromozomul 1 poate prezenta constricie secundar pe braul distal (1qh), cromozomul 2 este uor submetacentric; grupa B - perechile 4-5 de cromozomi sunt mari, submetacentrici; grupa C - perechile 6-12 de cromozomi i cromozomul X sunt mijlocii, submetacentrici; sunt 16 cromozomi la femeie i 15 la brbat; cromozomul 9 prezint constricie secundar pe braul distal (9qh); grupa D - perechile 13-15 de cromozomi sunt mijlocii, acrocentrici; prezint constricii secundare pe braele proximale i satelii; grupa E perechile 16-18 de cromozomi; cromozomul 16 este metacentric mijlociu i poate prezenta constricie secundar pe braul distal (16qh); cromozomii 17-18 sunt submetacentrici mici; grupa F - perechile 19-20 de cromozomi sunt mici, metacentrici; grupa G - perechile 21-22 i Y de cromozomi sunt mici, acrocentrici; cromozomii 21 i 22 prezint constricii secundare pe braele proximale i satelii; cromozomul Y nu prezint satelii; cromozomii grupei G ajut la determinarea sexului: la femei sunt 4 acrocentrici mici (2 crs 21 + 2 crs 22) / la brbai sunt 5 acrocentrici mici (2 crs 21+ 2 crs 22 + Y).

Cariotipul uman 46,XY

Cariotipul uman 46,XX

27

STUDIUL CROMOZOMILOR UMANI

Analiza cariotipului urmrete evaluarea numrului, formei, structurii, prezena unor repere morfologice i evideniaz polimorfisme individuale. Actualmente exist diverse metode ce sunt utilizate n evaluarea cariotipului, depistarea anomaliilor cromozomice de numr sau de structur, evidenierea unor markeri cromozomiali n norm sau patologie. Mai mult ca att, unele tehnici bazate pe tehnologiile ADN recombinat, permit identificarea unor modificri la nivel de secven de ADN cromozomial.

n dependen de scopul propus, cromozomii pot fi analizai att n interfaz, ct i n timpul diviziunii. Aceasta permite identificarea att a unor schimbri minore n structura molecular a ADN (microdeleii, microduplicaii), ct i modificri majore n structura i numrul cromozomilor (aberaii cromozomiale, aneuploidii). STUDIUL CROMOZOMILOR METAFAZICI Etapa optim de studiu a cariotipului este metafaza, deoarece cromozomii sunt maximal condensai i sunt dispui ntr-un singur plan, ceea ce permite identificarea lor precis. Pentru studiul cariotipului trebuie ndeplinite urmtoarele condiii: - s se obin celule n diviziune, - s se blocheze diviziunea n metafaz i - s se realizeze un preparat cromozomic care s fie examinat la microscop. (1) Celule n diviziune pot fi analizate direct n cazul esuturilor cu proliferare activ (mduv osoas, gonada masculin, tumori) sau dup realizarea unei culturi celulare din snge periferic*, limfocite T, mduv osoas roie, fibroblati (piele, fascii, embrioni), celule amniotice, celule din vilozitile coriale, tumori solide.
* Tehnica recoltrii sngelui periferic i punerea acestuia n cultur (constituie cea mai simpl tehnic de obinere a cromozomilor umani): se prelev snge periferic prin puncie venoas (n condiii de asepsie); se recolteaz pe heparin, pentru a se mpiedica coagularea sngelui; n condiii de asepsie, sngele este introdus ntr-un flacon ce conine un mediu de cultur specific, mbogit cu ser fetal bovin sau ser uman AB; pentru stimularea diviziunilor se utilizeaz fitohemaglutinina; se incubeaz la 37C, timp de 72 ore.

28

(2) Blocarea diviziunilor n metafaz se face cu substane care inhib formarea fusului de diviziune (citostatice) colchicin sau colcemida. (3) Realizarea preparatelor (lamelor) pentru studiul la microscop impune urmtoarele etape: hipotonizarea celulelor pentru dilatarea celulelor i dispersarea cromozomilor (centrifugare, eliminarea supernatantului i resuspendare n soluie hipotonic de KCl); fixarea celulelor pentru a ntrerupe activitatea vital a celulei, pstrnd morfologia cromozomilor (alcool + acid acetic); colorarea cu soluie Giemsa sau un alt colorant specific pentru cromozomi; examinarea la microscopul optic, ce permite analiza cromozomilor pentru evidenierea eventualelor anomalii de numr (omogene sau n mozaic) sau anomalii de structur; fotografierea plcilor metafazice din frotiu i decuparea cromozomilor; identificarea cromozomilor i efectuarea cariogramei (idiogramei).

Realizarea cariogramei din preparate citologice

Cromozomi metafazici umani colorai cu colorantul Giemsa (colorare uniform)

29

MARCAJUL N BENZI AL CROMOZOMILOR

Exist un grup de tehnici speciale, prin care se evideniaz n lungul cromatidelor alternana de zone colorate i necolorate, numite benzi. Acestea au o distribuie precis, determinat de structura intern a cromozomului.

Cariotipul uman normal obinut prin colorare difereniat G a cromozomilor unei celule somatice (46,XX)

Schema cariotipului uman (46,XY) pe baza colorrii n benzi G a cromozomilor metafazici

Metodele de marcaj n benzi au aprut relativ recent, n anii '70, i au determinat o revoluie n citogenetic, deoarece au o mare valoare practic: marcajul n benzi reflect structura discontinu a cromozomilor, respectiv alternana de eucromatin i heterocromatin, de secvene de ADN bogate n AT sau GC, de segmente de cromatin cu concentraie diferit de proteine histone i proteine nehistone; modelul benzilor este identic n toate celulele unui organism i la toi indivizii aceleiai specii, de aceea efectuarea marcajului n benzi permite identificarea precis a unei specii; marcajul n benzi permite identificarea precis a perechilor de cromozomi omologi, deoarece acetea sunt la fel din punct de vedere genetic i au acelai model de benzi; marcajul n benzi permite identificarea precis a fiecrui cromozom, deoarece cromozomii, aparinnd unor perechi diferite, au alte gene i deci alt model al benzilor; metodele de marcaj n benzi permit un diagnostic citogenetic foarte precis n multe anomalii de structur (deleii, inversii) care nu se evideniaz sau se evideniaz foarte greu n coloraia obinuit.

n consecin, utiliznd diverse tehnici de colorare a cromozomilor se obin benzi colorate (pozitive) i necolorate (negative) stabile i caracteristice fiecrui cromozom. Diferite tehnici (G,Q,R,T,C) determin o dispoziie specific a benzilor.

30

Caracteristica diferitor tehnici de bandare a cromozomilor Tehnica de analiz a Colorantul Originea benzilor Rolul practic cromozomilor utilizat Benzi pozitive Identificarea anomaliilor de heterocromatin; Giemsa numr i de structur a Metoda G Benzi negative cromozomilor eucromatin. Benzi pozitive Identificarea anomaliilor de Quinacrina heterocromatin; Metoda Q numr i de structur a (fluorescent) Benzi negative cromozomilor eucromatin. Benzi pozitive Giemsa sau Identificarea anomaliilor de eucromatin; Metoda R colorani numr i de structur a Benzi negative (revers) fluoresceni cromozomilor heterocromatin. Giemsa sau Benzi pozitive Analiza polimorfismului Metoda C colorani heterocromatina cromozomial (centromeric) fluoresceni pericentromeric Giemsa sau Benzi pozitive Analiza polimorfismului Metoda T colorani heterocromatina telomeric cromozomial (telomeric) fluoresceni

Dispunerea benzilor cromozomiale obinute prin diferite tehnici de colorare (cromozomul X)

TEHNICI DE CITOGENETIC MOLECULAR

Pe baza metodelor de analiz molecular a acizilor nucleici au fost elaborate o serie de tehnici noi de analiz a cromozomilor interfazici, ce se caracterizeaz printr-o specificitate i precizie nalt metode de hibridizare in situ (FISH, CGH, SKY). Metoda FISH (fluorescent in situ hybridization) este bazat pe urmtoarele principii: se utilizeaz sonde moleculare marcate fluorescent, care sunt complementare unor secvene nucleotidice specifice ale unui cromozom sau fragment de cromozom; n preparatul microscopic in situ, supus unui tratament alcalin, ADN-ul cromozomial denatureaz prin ruperea legturilor de hidrogen dintre cele dou catene ale moleculei de ADN; la adugarea sondei n preparat are loc legarea ei complementar la secvena specific a cromozomului - hibridizarea; ulterior, preparatul este prelucrat cu o substan ce se leag selectiv de biotin sau de digoxigenin: pentru biotin este specific streptovidina, iar pentru digoxigenin sunt

i. ii.

iii. iv.

31

v.

anticorpii antidigoxigeninici; la aceste substane se pot aduga unul sau mai muli colorani fluoresceni; cromozomii colorai se vizualizeaz la microscop pe fondul cromozomilor necolorai.

Tehnica FISH se utilizeaz pentru evidenierea: - cromozomilor supranumerari; - anomaliilor cromozomice de structur; - rearanjamentelor intercromozomiale complicate; - microdeleiilor i microduplicaiilor cromozomice; - localizrii genelor. Aceast tehnic este precis, rapid i econom de aceea este tot mai larg utilizat n diagnosticul anomaliilor congenitale, sindroamelor monogenice, diagnosticul prenatal. CGH (comparative genome hybridization). Aceast tehnic este utilizat n citogenetica oncologic pentru determinarea regiunilor cromozomiale deletate sau amplificate ntr-un anumit tip de cancer. Regiunile deletate, de regul, conin gene supresoare de tumori, iar cele amplificate oncogene. Astfel, metoda este utilizat pentru cartarea i clonarea genelor implicate n cancerogenez. Metoda CGH const n urmtoarele: se extrage ADN-ul dintr-o tumor i dintr-un esut normal; ADN-ul din tumor i din esutul normal se marcheaz cu diferii fluorocromi; ADN-ul marcat (i din tumor, i din esutul normal) este hibridizat cu preparatul cromozomic obinut din tumor; se determin regiunile cu deleii sau cu amplificri dup intensitatea marcherilor. Analiza rezultatelor este efectuat utiliznd programe speciale computerizate. SKY (spectral karyotyping) analiza spectroscopic a cromozomilor. Aceast tehnic se bazeaz pe utilizarea unui set de sonde fluorescente cu colorani diferii. Fiecare sond specific un anumit segment cromozomic. Fiecare pereche cromozomial are parametri spectrali unici. Utilizndu-se interferometrul, analogic aparatelor utilizate n msurarea spectrului obiectelor astronomice, este posibil depistarea unor variaii minore n componena spectral a cromozomului, invizibile ochiului. Computerul analizeaz datele interferometrului i graie unei programe speciale indic pentru fiecare pereche de cromozomi culori anumite. Avantajul acestei metode const ntr-o individualizare mult mai precis a cromozomilor, datorit culorii lor specifice; depistarea unor translocaii ce sunt greu de depistat prin alte metode citogenetice. Se utilizeaz in oncocitogenetic pentru depistarea aberaiilor cromozomice ce se produc la nivel de tumoare, chiar i a unor rearanjamente ce implic fragmente cromozomice foarte scurte.

NOMENCLATURA CROMOZOMILOR UMANI

Exist un sistem internaional de standardizare, care permite formularea cariotipului normal sau anormal cu ajutorul unor simboluri i semne, ce redau numrul de cromozomi i eventualele anomalii de structur - deficit, surplus sau rearanjamente ale materialului cromozomic. n cazul cariotipului normal se scrie numrul total de cromozomi urmat de o virgul, dup care se scrie structura gonosomilor: o cariotip feminin normal - 46,XX o cariotip masculin normal - 46,XY. Cariotipurile anormale pot caracteriza anomaliile cromozomiale numerice sau anomaliile structurale: o anomalii ale autosomilor numrul total de cromozomi, virgula, gonosomii, iar dup o alt virgul, precedat de + (cromozom suplimentar) sau - (lipsa unui cromozom) se scrie 32

numrul cromozomului implicat (de ex..: 47, XX, +21 (trisomia 21); 47,XY,+13 (trisomia 13); 45,XX,-8 (monosomia 8); etc.; o anomalii ale gonosomilor se scrie numrul total de cromozomi, urmat dup virgul de gonosomii respectivi (de ex.: 45,X (monosomia X); 47,XXY (disomia X); 47,XXX (trisomia X)). n rezultatul colorrii difereniate pe fiecare cromozom se pot observa o serie de repere, elemente importante pentru identificarea unui cromozom: - benzi net conturate, - centromerul, - telomerele. Dea lungul braelor cromozomilor sunt delimitate regiuni. Fiecare regiune are mai multe benzi, iar benzile pot avea subbenzi. Cromozomii metafazici prezint 400 - 500 benzi, n timp ce cromozomii aflai n profaza timpurie prezint 1800-2000 benzi (metode de nalt rezoluie).

Aspectul crs prometafazici vs crs metafazici

Nomenclatura benzilor: regiunile i benzile se numeroteaz de la centromer spre telomere pentru fiecare din brae; ex: 7q12 - cromozomul (7), braul distal (q), regiunea (1), banda (2). Pentru desemnarea anomaliilor cromozomiale structurale se indic natura rearanjamentului i punctele de ruptur, identificate prin banda i regiunea n care se produc. Exemple: 46,XX,del(1)(q21q31) - cariotip feminin cu deleiea unui fragment a braului distal al cromozomului 1 de la regiunea 2, banda 2 pn la regiunea 3, banda 1. 46,XY,r(2)(p21q31) - cromozomul 2 inelar; punctele de ruptur sunt pe braul proximal n regiunea 2 banda 1 i pe braul distal n regiunea 3 banda 1. 46,XX,inv(2)(p21q31) - inversie pericentric a segmentului cuprins ntre regiunea 2 banda 1, braul proximal i regiunea 3 banda 1, braul distal ale cromozomului 2. 46,X,i(Xq) - isocromozom de brae distale al cromozomului X; 46,X,del(X)(q12.1-q24.3) deleia unui segment din crs X, de pe braul distal, de la regiunea 1 banda 2 subbanda 1 pn la regiunea 2 banda 4 subbanda 3.

33

Simboluri A-G 1-22 X, Y / p q pter qter cen del der dup dic fra i ins inv mat pat r t upd :: + -

Simboluri folosite n descrierea cariotipului (standarde internaionale) Semnificaia simbolului Grupele de cromozomi Numerele cromozomilor autosomi Gonosomii (cromozomii sexuali) Mozaicizm cromozomial Bra proximal, scurt Bra distal, lung Captul braului proximal Captul braului distal centromer Deleie, pierderea unui fragment cromozomic Cromozom derivat printr-un rearanjament cromozomial Duplicaie, dublarea unui fragment cromozomic Cromozom dicentric, cu doi centromeri Situs fragil Izocromozom, cu brae identice p sau q Inseria unui fragment cromozomic Inversia unui fragment cromozomic Origine matern Origine patern Cromozom inelar (ring) Translocaia unui fragment cromozomic pe alt cromozom neomolog Disomie uniparental Rupere cu reunire naintea numrului unui cromozom adugarea cromozomului ntreg, dup numrul unui cromozom adugarea unei pri de cromozom naintea numrului unui cromozom pierderea cromozomului ntreg, dup numrul unui cromozom pierderea unei pri de cromozom

VARIAII ALE CARIOTIPULUI LA PERSOANE CU FENOTIP NORMAL Exist uneori o serie de abateri de la regulile generale stabilite, care determin unele variante (variaii) particulare rare, dar care nu reprezint anomalii cromozomice. Variaii numerice: - la femeie - dup vrsta de 60 ani, pn la 7% din celulele organismului pot pierde unul din cromozomii X, devenind 45,X; - la brbat - dup vrsta de 70 ani, pn la 2% din celule pot pierde cromozomul Y i devin 45,X. Variaii structurale n heterocromatin: - lungimea i forma cromozomilor omologi poate varia; variaiile n lungime intereseaz n special braele scurte ale cromozomilor D, G. - sateliii se gsesc obinuit n cromozomii acrocentrici, cu excepia cromozomului Y, dar pot fi observai i pe ali cromozomi; pot prezenta o mare variabilitate n form i mrime. - constriciile secundare care reprezint zone decondensate, situate n regiunile proximale ale braelor lungi ale cromozomilor 1, 9, 16 i Y; uneori pot prezenta o mrire exagerat a constriciilor secundare (46, XX, 1qh+; 46,XY, 1qh++...). 34

Polimorfismele de bandare (benzile Q, G i C) sunt reprezentate de diferene n ceea ce privete mrimea i aspectul unor zone cromozomice; cel mai frecvent, polimorfismele implic regiunile centromerice, braele scurte i sateliii cromozomilor D i G, zona de constricie secundar de pe braul lung al cromozomului Y. Semnificaia polimorfismului: polimorfismul se transmite dominant dup modelul mendelian, nu modific expresia fenotipic deoarece pare limitat numai la regiunile heterocromatiniene, inactive genetic (produce modificri cantitative ale ADN repetitiv). Polimorfismul cromozomic este utilizat: - ca marcher pentru evidenierea transmiterii unor caractere de la prini la copii (de ex.: cercetarea paternitii); - pentru determinarea originii parentale a nedisjunciei n aneuploidii (de ex.: originea cromozomilor suplimentari n trisomii); - pentru identificarea cromozomilor care conin gene marcher pentru unele patologii monogenice; - stabilirea unor grupe de nlnuire (linkage) genic; - evaluarea frecvenei unor polimorfisme n unele forme de leucemii i la copiii cu anomalii congenitale.

35

CURS 5
ANOMALII CROMOZOMICE Anomaliile cromozomice reprezint modificri ale numrului cromozomilor caracteristic speciei (46 n celulele somatice umane) sau modificri structurale ale acestora. n literatur sunt ntlnite noiunile de mutaii genomice (ce explic anomaliile cromozomice de numr) i mutaii sau aberaii cromozomice (ce se refer la anomaliile de structur). Anomalii cromozomice numerice afecteaz ntregul cromozom i cele structurale implic rearanjamente ale structurii cromozomilor.

Clasificarea anomaliilor cromozomice

Factori posibili ce produc anomalii cromozomice ar putea fi: factori care deregleaz mitoza sau pot produce rupturi ale ADN-ului sau altereaz replicarea: - factori chimici: citostatice, antimetabolii, radicali liberi, agenii alchilani; - factori fizici: radiaiile ionizante; - factori biologici: virusuri; vrsta matern avansat, care sporete riscul erorilor n segregarea cromozomilor n meioz i a aneuploidiilor la descendeni; unul din prini este purttor de anomalie congenital echilibrat (translocaie, inversie); rearanjrile intercromozomice prin crossing-over inegal sau erori de recombinare.

ANOMALIILE CROMOZOMICE DE STRUCTUR

Anomaliile cromozomice structurale pot fi clasificate n funcie de efectul fenotipic i de mecanismul de producere. Pe baza efectului fenotipic, anomaliile cromozomice structurale se mpart n: echilibrate (inversiile i translocaiile), care nu modific fenotipul purttorului i neechilibrate (deleiile, duplicaiile, etc.), care produc fenotipuri anormale. n raport cu mecanismul de producere, anomaliile cromozomice structurale pot fi grupate n: anomalii produse printr-o singur ruptur cromozomic (deleia terminal), anomalii produse prin dou rupturi cromozomice n acelai cromozom (deleiile interstiiale, inversiile, cromozomii inelari), anomalii produse prin rupturi n cromozomi diferii (cromozomii dicentrici, translocaiile reciproce i cele robertsoniene; inseriile). 36

ANOMALII CROMOZOMICE ECHILIBRATE Inversia reprezint o anomalie de structur, caracterizat prin modificarea ordinii genelor de pe un fragment cromozomic. Mecanismul de producere const n ruperea unui cromozom n dou puncte i rotirea cu 180 a fragmentului intermediar. Inversiile pot fi de dou tipuri: pericentrice: produse prin ruptura unui cromozom n dou puncte situate pe brae diferite, urmat de rotaia cu 180o a fragmentului intermediar i reunirea fragmentelor; n urma acestei rotaii se poate produce modificarea configuraiei cromozomului; paracentrice: produse prin ruptura unui cromozom n dou puncte situate pe acelai bra, urmat de rotaia cu 1800 a fragmentului intermediar i reunirea fragmentelor; n urma acestei rotaii nu se modific configuraia cromozomului, ci numai ordinea benzilor.

Translocaiile sunt anomalii de structur caracterizate prin trecerea unuia sau mai multor fragmente cromozomice de pe un cromozom pe altul, fr a determina modificri fenotipice. Translocaiile pot fi de trei tipuri: - reciproce - produse prin ruperea a doi cromozomi n cte un punct, urmat de schimbul fragmentelor rupte i realipirea cromozomilor;

cu inserii - produse prin ruperea a doi cromozomi neomologi, unul ntr-un punct i cellalt n dou puncte de pe acelai bra, urmat de inserarea n punctul de ruptur al primului cromozom al fragmentului intermediar din al doilea cromozom;

robertsoniene - produse prin ruperea a doi cromozomi acrocentrici la nivelul centromerului urmat de fuziunea braelor lungi (fuziune centric) i pierderea braelor scurte (conin doar gene pentru 37

ARN ribosomal i, astfel, pierderea lor nu determin modificri fenotipice); acest tip de anomalii conduce la scderea numrului de cromozomi de la 46 la 45.

Anomaliile cromozomice echilibrate nu modific fenotipul individului, deoarece reprezint rearanjri cromozomice, care nu determin modificri cantitative ale materialului genetic. Dar, purttorul unei translocaii echilibrate, dei normal fenotipic, poate produce gamei anormali datorit erorilor de conjugare i erorilor de segregare (nedisjuncii) ale cromozomilor implicai n translocaie.

Consecinele translocaiei robertsoniene t(13q21q) asupra gametogenezei

38

ANOMALII CROMOZOMICE NEECHILIBRATE Deleiile sunt anomalii structurale caracterizate prin pierderea unor fragmente cromozomice. Anomaliile pot fi de dou tipuri: - terminale - produse prin ruperea unui cromozom ntr-un punct, urmat de pierderea fragmentului terminal; - interstiiale - produse prin ruperea unui cromozom n dou puncte situate pe acelai bra, urmat de pierderea fragmentului intermediar. Deleiile se pot produce i prin alte mecanisme: crossing-over inegal ntre cromozomi omologi aliniai eronat, segregarea cromozomilor anormali n cursul meiozei parentale n cazul n care unul din prini prezint o anomalie echilibrat. Deleia are ca efect apariia unei diferene de lungime ntre cromozomii omologi. Duplicaiile sunt anomalii structurale caracterizate prin prezena n dublu exemplar a unui fragment cromozomic. Anomalia se poate produce prin crossing-over inegal i segregare anormal a cromozomilor cu translocaie. Cromozomii inelari apar prin ruperea unui cromozom n dou puncte situate pe brae diferite, urmat de pierderea segmentelor terminale (acentrice) i reunirea capetelor segmentului centric ntr-o structur inelar. Izocromozomii sunt cromozomi anormali formai fie numai din brae scurte, fie numai din brae lungi. Mecanismul de apariie a anomaliei const n clivarea transversal a centromerului. Anomalia are ca efect apariia unui cromozom care prezint concomitent deleia unuia din brae i duplicaia celuilalt bra.

Cromozomii dicentrici sunt cromozomi anormali caracterizai prin prezena n acelai cromozom a doi centromeri. Mecanismul de producere const n ruperea a doi cromozomi n cte un punct, urmat de pierderea fragmentelor terminale i unirea celor dou segmente cromozomice, care prezint centromere, ntr-un singur cromozom. Anomaliile cromozomice neechilibrate determin un dezechilibru cantitativ al materialului genetic (n plus sau n minus) ce se manifest fenotipic asemntor anomaliilor numerice (trisomii pariale sau monosomii pariale). Trisomiile i monosomiile pariale ale unui cromozom determin multiple caractere anormale n "tip i contratip" asemntoare cu monosomiile i trisomiile totale ale aceluiai cromozom: trisomia 18 (sdr. Edwards) i monosomia parial determinat de 18q-; trisomia 13 (sdr. Patau) i monosomia parial determinat de r(13).

39

ANOMALIILE CROMOZOMICE NUMERICE

Anomaliile numerice sunt clasificate n: poliploidii (prezena n plus a unor seturi haploide de cromozomi) i aneuploidii (prezena n plus sau absena unui cromozom ntreg). Poliploidiile, n dependen de numtul de seturi haploide prezente n nucleul celulei somatice, pot fi: triploidii (3n) - 69,XXX sau 69,XXY sau 69,XYY; tetraploidii (4n )- 92,XXXX sau 92,XXYY; etc. Triploidia (3n) poate rezulta prin fecundarea de ctre un gamet normal (n = haploid) a unui gamet anormal (2n=diploid); gametul diploid este rezultatul neseparrii citelor de ordinul II n meioza parental (de obicei, n cursul ovogenezei, neexpulzarea primului globul polar - diginie; uneori n cursul spermatogenezei - diandrie); prin erori n cursul fecundrii: fecundarea unui ovul (n) de ctre 2 spermatozoizi (2n) dispermie. Tetraploidia (4n) poate fi rezultatul unei erori de clivaj n cursul primei diviziuni mitotice a zigotului i dublarea numrului de cromozomi imediat dup fecundare (endomitoz) sau prin fecundarea a 2 gamei diploizi (2n+2n=4n). Poliploidiile intereseaz o mare cantitate de material genetic i la om sunt, de regul, neviabile (manifestndu-se prin avort n trimestrul I de sarcin sau nou-nscui mori). Aneuploidile se caracterizeaz prin prezena n plus fa de numrul diploid normal sau absena a 1-2-3 cromozomi. Majoritatea aneuploidiilor sunt consecina unor erori de segregare cromozomic sau cromatidian n cursul diviziunii celulare, numite nedisjuncii. n cazul nedisjunciilor numrul de cromozomi din celulele fiice nu este egal. Aceste anomalii se pot produce n meioza I, meioza II sau n mitoz. Rareori, gameii nulisomici, iar apoi embrionii monosomici, pot rezulta datorit pierderii cromozomilor printr-o ntrziere anafazic la nivelul plcii ecuatoriale. Aneuploidiile omogene sunt rezultatul fecundrii unui gamet normal de ctre un gamet aneuploid produs prin erori de distribuie a materialului genetic n cursul meiozei parentale. Aneuploidiile n mozaic sunt rezultatul erorilor de distribuie a materialului genetic n cursul mitozei (de obicei, diviziunile de segmentare ale primelor stadii embrionare). CLASIFICAREA ANEUPLOIDIILOR: a) dup surplus sau lips de cromozomi: - monosomie (2n-1) - absena unui cromozom; - trisomie (2n+1) - prezena unui cromozom supranumerar; b) dup tipul cromozomului implicat: - aneuploidii autozomale - aneuploidii gonozomale c) dup numrul de celule afectate: - anomalii omogene (prezena anomaliei n toate celulele organismului); - anomalii n mozaic (prezena unor linii celulare anormale i normale n acelai organism); d) dup asocierea sau lipsa acesteia cu anomaliile de structur: - anomalii libere fr anomalii cromozomice structurale; - anomalii prin translocaie prezena n plus a unor cromozomi ataai la alii fr modificarea numrului diploid normal, sau falsa absen a unui cromozom ca urmare a 40

fuzionrii cu un altul. Uneori termenul se folosete referitor la orice modificare cantitativ a materialului genetic, inclusiv la anomaliile congenitale structurale: anomalii complete prezena n plus sau lipsa unui cromozom n ntregime; anomalii pariale prezena n plus sau lipsa unui segment cromozomic.

Efectele i gravitatea anomaliilor cromozomice cantitative depind de: - tipul de anomalie i mrimea dezechilibrului genetic - cu ct defectul cantitativ este mai mare, cu att consecinele sunt mai grave; deficitul are consecine mai grave dect excesul; - coninutul genic i activitatea cromozomului implicat de ex., trisomia 1 nu este viabil, trisomia 21 - da. - tipul i numrul de celule afectate - afectarea celulelor somatice duce la modificarea fenotipului individului; afectarea celulelor sexuale duce la apariia tulburrilor de reproducere. Monosomiile sunt mai grave dect trisomiile. Singura monosomie viabil la specia uman este monosomia X; monosomiile autozomale, Y i 98% din zigoii cu monosomie X se elimin ca produi de avort, n trimestrul I de sarcin. Trisomiile cromozomilor mari, activi genetic, sunt neviabile, producnd avort n trimestrul I de sarcin sau nou-nscui mori. Viabile pot fi trisomiile 8, 13, 18, 21, fiind responsabile de multiple anomalii de dezvoltare (sindroame): - sindromul trisomiei 8 - 47, XX (XY), +8; - sindromul Patau - 47, XX (XY), +13; - sindromul Edwards - 47, XX (XY), +18; - sindromul Down - 47, XX (XY), +21. Anomaliile cromozomice viabile (sindroamele cromozomice) prezint modificri fenotipice comune (tulburri de cretere pre- i postnatal; ntrziere n dezvoltarea psiho-motorie i debilitate mintal; multiple anomalii viscerale, disgenezii gonadice) i modificri specifice ale cromozomului sau cromozomilor implicai. INDICAIILE ANALIZEI CROMOZOMILOR UMANI Analiza cariotipului prin diverse tehnici de colorare a cromozomilor metafazici sau prometafazici, utiliznd tehnici de citogenetic molecular (FISH) este indicat n urmtoarele situaii: (1) Copiii cu anomalii congenitale multiple (minore/majore) asociate cu: - tulburri de cretere prenatal, - ntrziere n dezvoltarea psiho-motorie postnatal, - anamneza familial tulburri de reproducere. (2) Debiliti mintale (indiferent de grad) de cauze nedeterminate i/sau tulburri de comportament asociate cu: - dismorfie facial, - anamnez familial pozitiv ( teste pentru X fragil). (3) Dac n situaiile (1),(2) se identific o anomalie de structur neechilibrat (monosomie sau trisomie parial) se va studia cariotipul - prinilor (anomalie cromozomial echilibrat); - rudelor gr.I (4) Stri intersexuale, pentru stabilirea sexului genetic (XX sau XY) sau anomaliilor cromozomilor sexuali. (5) Tulburri de dezvoltare pubertar semne de disgenezie gonadic: - spermogram anormal (azo- sau oligospermie) 41

- amenoree primar sau amenoree secundar precoce. (6) Cupluri cu tulburri de reproducere ( 2 avorturi spontane i/sau nou-nscui mori/vii plurimalformai; 5% din cazuri se identific anomalii cromozomiale echilibrat la unul dintre partenerii). (7) Hemopatiile maligne, mai rar n tumorile solide, pentru diagnostic pozitiv i diferenial, prognostic sau urmrirea evoluiei tratamentului. (8) Sindroame cu instabilitate cromozomic (sindromul Bloom, anemia Fanconi, sindromul Nijmegen, sindromul ICF .a). (9) Depistarea efectului mutagen al expunerii profesionale sau accidentale la radiaii ionizante i unele substane chimice (clastogene). (10) n DIAGNOSTICUL PRENATAL, studiul cromozomilor n celulele fetale este indicat la femeile gravide: - peste 35 de ani; - unul din prini are o anomalie cromozomic echilibrat; - copil cu o anomalie cromozomic de novo (dei cariotipul prinilor este normal este posibil un mozaicism gonadic prenatal); - semne ecografice de alarm sau testele de screening biochimic (triplu test) pentru sindromul Down sunt pozitive; - pentru stabilirea sexului genetic, n cazul mamelor purttoare de mutaii recesive gonosomale XNXa (n care se nbolnvesc numai din biei) i nu exist o metod de diagnostic prenatal specific.

42

CURS PARTICULARITILE CROMOZOMILOR X i Y Gonosomii provin dintr-o pereche de autosomi, care n procesul evoluiei s-au difereniat genetic i morfologic, formnd cei doi cromozomi X i Y. Acest proces s-a realizat prin specializarea progresiv a cromozomului Y, care a pstrat genele determinismului sexual i a pierdut aproape toate genele somatice, devenind mult mai mic ca cromozomul X, care a conservat forma original pstrnd att genele de sexualizare, ct i cele somatice. Diferenierea celor doi gonosomi a fost necesar pentru: - a mpiedica schimbul de gene ntre cromozomul X i Y n meioz i permite conservarea pur a determinanilor sexuali specifici fiecrui cromozom; - a asigura ulterior obinerea unor zigoi cu sexe genetic distincte XX sau XY. Cromozomii de sex (gonozomi, heterozomi) se deosebesc att dup structur (dimensiuni, poziia centromerului, cantitatea de heterocromatin), ct i dup coninutul de gene. Cromozomul X - este un cromozom submetacentric mediu (Grupa C). Este prezent n celulele somatice la indivizii de ambele sexe: n dublu exemplar la femeile cu cariotip 46,XX i ntrun singur exemplar la brbaii cu cariotip 46,XY; este prezent ntr-un singur exemplar n ovule circa 1606 gene: gene structurale pentru caractere somatice (de ex., grupa sanguin Xg, factorii VIII i IX de coagulare, enzima glucozo-6-fosfat dehidrogenaza, vederea cromatic etc.); gene reglatoare feminizante; gene structurale feminizante; gene structurale masculinizante. Cromozomul Y este un cromozom acrocentric mic (Grupa G), 2/3 din braul q este inactiv genetic, fiind heterocromatinizat. Este prezent ntr-un singur exemplar n celulele somatice ale indivizilor de sex masculin cu cariotip 46,XY i n 50% din spermatozoizi. Cromozomul Y conine circa 397 gene: gene reglatoare masculinizante (SRY = Tdf); gene care asigur fertilitatea (AZF1, AZF2); gene structurale somatice (factorul de control al creterii dinilor, receptor interleukin); pseudogene (actin, Xg). Deoarece genomul feminin conine doi cromozomi X, iar cel masculin un singur cromozom X, produii genelor localizate pe cromozomii X ar trebui s fie ntr-o cantitate dubl la femeie fa de brbat. Acest lucru ns nu se ntmpl datorit inactivrii unui cromozom X la femeile normale i a cromozomilor X suplimentari la indivizii ce se abat de la normal, fapt ce determin s rmn n stare funcional un singur cromozom X la ambele sexe, fenomen denumit compensaie de doz a genelor X-linkate. Ipoteza existenei unui asemenea mecanism a fost formulat n 1961 de Mary Lyon i cuprinde trei postulate: n celulele somatice este activ un singur cromozom X, restul fiind inactivai i nedisponibili pentru transcripie. Procesul de inactivare este un proces de heterocromatinizare: cromozomul X inactivat este puternic condensat i vizibil n interfaz sub forma corpusculului Barr; replicarea lui se produce la sfritul perioadei S. Inactivarea se produce la nceputul vieii intrauterine, nainte de implantarea blastocistului (la ziua a 16-18, la etapa de ~3000-4000 celule). Pn la acest moment ambii cromozomi X sunt activi (se sintetizeaz ARNm, enzime); embrionii 46,XX i 46,XY sunt biochimic i funcional 43

i.

ii.

iii.

diferii; inactivarea unui din cromozomii X, odat aprut, rmne definitiv la toi descendenii celulei. Inactivarea cromozomului X-matern sau X-patern are un caracter ntmpltor i independent n fiecare celul. Deci fiecare femeie normal este un mozaic de celule somatice, unele avnd activ X-ul matern, altele X-ul patern.

Consecinele genetice ale inactivrii cromozomului X 1. Compensarea dozajului genic X-lincat. Dac un X este inactivat: - cantitatea total a produilor genelor X va fi aceeai la ambele sexe; - procesul de inactivare a crs X nu este ntotdeauna complet i perfect; - n aneuploidiile X o femeile 45,X0 i brbaii XXY manifest fenotipuri anormale; o s-a observat c fenotipul unui individ este cu att mai anormal, cu ct sunt prezeni mai muli cromozomi X. 2. Variabilitatea expresiei la femeile heterozigote. Femeile heterozigote pentru gene X-linkate au o variabilitate considerabil n expresia fenotipic, deoarece inactivarea cromozomului X este ntmpltoare i ca urmare proporia celulelor n care o alel oarecare este inactiv va fi variabil (de la 0%- 100%). Dac alela mutant este funcional ntr-o majoritate a celulelor organismului, heterozigoii feminini pot manifesta tulburarea (heterozigotul care se manifest sau Layonizare defavorabil ). Exemple de boli: deficitul de G-6-PD, daltonismul, hemofilia, distrofia muscular Duchenne. 3. Mozaicismul. Femeile prezint un mozaicism pentru genele X-lincate i au deci dou populaii de celule, una cu X- matern activ, alta cu X- patern activ. La om fenomenul de mozaicism a fost evideniat n cazul femeilor heterozigote pentru: form rar de albinism X-linkat, la care la fundul ochiului s-au depistat pete de celule pigmentate i nepigmentate. gena ce codific G-6-PD, aceasta prezint 2 alele care produc dou forme distincte ale enzimei. La femeile heterozigote s-au izolat celule de piele n cultur i s-a demonstrat c descendenii unei celule produc un singur tip de enzim. MECANISME MOLECULARE IMPLICATE N LYONIZARE Au fost semnalate gene care rmn funcional-active pe cromozomul X inactivat. O explicaie a acestui fenomen ar fi faptul c o parte din ele au gene omoloage pe cromozomul Y, de aceea nu necesit compensarea dozei. Genele din regiunea pseudoautozomal (PAR), cu o extindere de 2Mb, cuprins ntre Xp22- pter sunt: gena STS, care codific steroid-sulfataza; gena MIC-2, din vecintatea regiunii pseudoautozomale; genele DXS, U23E, UBEI din regiunea proximal a braului scurt; gena RPS4X care codific proteinele ribozomale S4 din regiunea proximal a braului lung.
I regiunea pseudoautosomal (PA) cu gene comune i pe crs X i pe crs Y:

- Xpter; - Ypter; II regiunea cu gene specifice numai crs X; III regiunea crs Y cu gene masculinizante;
IV regiunea crs Y (2/3Yq) cu secvene necodificatoare heterocromatin constitutiv.

44

Cercetrile de biologie molecular au identificat pe cromozomul X un segment - (q13), implicat n inactivare, denumit centru de inactivare a cromozomului X (XIC). La acest nivel se gsete gena XIST, care este o gen atipic - a pierdut potenialul de codificare proteic. Ea codific o molecul de ARN de circa 17 Kb care rmne asociat cu cromozomul inactivat genetic. Prin experiene de transgenez s-a constatat c gena XIST integrat ntr-un autosom este capabil s declaneze procesul de inactivare cromozomial i formarea heterocromatinei. Prin metoda FISH s-a constatat c molecula de ARN- XIST se localizeaz pe autosomul n care s-a integrat gena i antreneaz inactivarea in cis a genelor autozomale. De asemenea s-a constatat ca autosomul n care este integrat gena XIST este hipoacetilat la nivelul histonei H4 i are loc formarea unui tip nou de histone- macroH2A1. Alte cercetri relev c mecanismul de inactivare depinde de stabilitatea moleculei de ARN-XIST pe cromozomul X inactivat. Forma stabil i instabil de ARN se transcrie de pe promotori diferii ale aceleai gene. Reglarea expresiei genei XIST poate fi explicat pe baza fenomenului de amprentare genomic. Amprentarea genomic (sau imprinting-ul parental) reprezint represarea permanent, dependent de originea parental, a activitii transcripionale a uneia din cele doua copii ale unei gene din perechea de alele; sunt modificri suferite de gene n cursul gametogenezei i/sau embriogenezei precoce i reprezint un mecanism de reglare a expresiei fenotipice a unor gene.

TESTUL CROMATINEI X Cromatina X reprezint un cromocentru vizibil, n mod normal, n nucleii interfazici ai celulelor aparinnd sexului feminin; ea rezult prin heterocromatinizarea unuia dintre cei doi cromozomi X. Originea i semnificaia cromatinei X a fost explicat de Mary Lyon (1961). Studiul celulelor interfazice din orice esut provenit de la organismul feminin normal permite identificarea cromatinei sexuale X. Tehnicile uzuale folosesc frotiul din celulele mucoasei bucale (testul Barr) i frotiul din snge periferic. Evaluarea acestor teste presupune stabilirea numrului cromozomilor X n corelaie cu numrul de corpusculi de heterocromatin X. Corpusculul Barr reprezint un cromozom X heterocromatinizat, puternic condensat i intens colorat bazofil. Este situat cel mai frecvent periferic, lipit de faa intern a membranei nucleare (intranuclear) i are o form oval, plan convex, discoidal sau triunghiular. Mrimea medie este de 1 micron ( 0,3). Cnd corpusculul Barr este situat central trebuie difereniat de cromocentri nespecifici sau de nucleol, care se prezint ca o formaiune rotund, cu dimensiuni mai mari, ce se coloreaz n brun-crmiziu cu verde de metilpironin.

Morfologia corpusculului Barr n celulele mucoasei bucale. A. Microfotografia nucleilor interfazici. B. Schema unei celule. CB corpuscul Barr. NC nucleol.

n mod normal corpusculul Barr este prezent ntr-un singur exemplar la femeie i lipsete la brbat, deoarece brbatul are un singur cromozom X, iar acesta nu se inactiveaz, n timp ce femeia are doi cromozomi X, din care unul se inactiveaz. n frotiurile mucoasei bucale frecvena teoretic a corpusculului Barr este de 100%, iar practic aproximativ de 30-40%. Aceast frecven real se datoreaz: - excluderii corpusculilor situai central; 45

calitilor improprii ale unor nuclei din celulele superficiale sau profunde; defectelor de colorare; existenei reale a celulelor cromatin-negative: cromozomul X inactiv nu se condenseaz din cauza unor condiii metabolice generale sau celulare; alte cauze: vrsta, ciclu ovarian, boli, tratamente.

n cazuri patologice - anomalii de numr ale cromozomilor X (disgenezii gonadice) - poate fi prezent la brbat (47,XXY), absent la femeie (45,X) sau prezent n mai multe exemplare la ambele sexe (polisomii X). Mrimea corpusculului Barr depinde de mrimea cromozomului X inactivat (mai mare de 1 micron: isoXq, duplicaie pe cromozomul X; mai mic de 1 micron: deleie pe cromozomul X, crs X inelar). Cnd pe aceeai lam se ntlnesc celule cu un numr diferit de corpusculi Barr, se ia n consideraie numrul maxim gsit deoarece unii ar putea s nu apar.

TESTUL CROMATINEI Y Cromatina Y reprezint aspectul interfazic al celor 2/3 distale ale braului q al cromozomului Y. Se evideniaz prin colorare cu quinacrin prezentndu-se un corpuscul intens fluorescent (corpuscul F), vizibil n nucleul interfazic. Mrimea lui este de 0,25 microni i este situat liber sau lipit de membrana nuclear. Frecvena este diferit n diferite esuturi ale organismului masculin: 70-80% n fibroblati; 45% n spermatozoizi; Corpusculul F este prezent exclusiv la brbat ntr-un singur exemplar; poate fi prezent n dou exemplare la persoanele cu cariotip 47,XYY. VALOAREA PRACTIC A TESTULUI CROMATINEI SEXUALE Testul cromatinei X este un test rapid, foarte util n multe situaii, care poate fi efectuat n condiii de dotare minim, cu mijloace modeste: a) prenatal: n celulele extrase prin puncie amniotic - permite stabilirea sexului genetic al ftului n anomaliile gonosomale recesive (de exemplu hemofilie sau miopatie Duchenne) n cazul n care femeia este purttoare a genei anormale (risc 50%). b) la natere: n cazul ambiguitii sexuale la nou nscuii cu testicul nepalpabil - pentru precizarea sexului genetic i punerea n concordan cu sexul civil; sexul civil are importan mai ales n edificarea ulterioar a sexului psiho-comportamental. c) mai trziu: n diferite anomalii de sexualizare pentru precizarea sexului genetic; diagnosticul disgeneziilor gonadice orhitice sau ovariene prin anomalii de numr i structur a cromozomilor sexuali. d) n medicina legal i criminalistic pentru precizarea provenienei feminine sau masculine a unor fragmente de esuturi, pete de snge, fire de pr. DAR, testul cromatinei sexuale este un test subiectiv, nu poate depista toate mozaicurile i nici anomaliile autozomilor; n multe situaii, pentru precizare necesit efectuarea cariotipului.

46

CURS 5
TRANSMITEREA MATERIALULUI GENETIC DE LA CELUL LA CELUL Una dintre proprietile fundamentale ale organismelor vii este autoreproducerea, asigurat de proprietatea unic a moleculelor de ADN de a se replica. n timpul replicrii materialul genetic se dubleaz, iar n timpul diviziunii celulare are loc distribuia lui descendenilor. Astfel, diviziunea celular este ansamblul de evenimente genetice, biochimice i morfologice, ce asigur, prin intermediul cromozomilor, transmiterea informaiei genetice la generaiile urmtoare de celule sau organisme. Transmiterea informaiei genetice de la celul la celul se realizeaz n dou etape majore: - dublarea ADN cromozomial; - repartizarea egal i identic a cromozomilor celulelor fiice. Acurateea dublrii materialului genetic i distribuiei cromozomilor n timpul diviziunii celulare sunt asigurate de succesiunea evenimentelor ciclului celular (ciclului mitotic) programate genetic. Fiecare ciclu celular cuprinde dou perioade dinamic i calitativ distincte: interfaza i mitoza.

Perioadele ciclului celular

Nr de cromozo mi 46 46 46 46

Nr de mol. ADN 46 92 92 92

Dublarea materialului genetic Replicare -

Compactizarea materialului genetic

Segregarea materialului genetic -

INTERFAZA

G1 S G2 Profaza

slab condensat slab condensat slab condensat puternic condensat

MITOZA

Metafaza

46

92

maximal condensat

Disjuncia cromatidelor surori Citochineza

Anafaza

92

92

puternic condensat puternic / slab condensat

Telofaza

46 + 46

46 + 46

Interfaza reprezint perioada dintre diviziuni pe parcursul creia materialul genetic este decondensat i se prezint sub form de cromatin; informaia genetic este realizat prin expresia unor anumite seturi de gene i sinteza diferitor proteine care asigur vitalitatea celulei, creterea, specializarea celular i integrarea ei ntr-un esut. Pe parcursul interfazei celula primete semnale mitogene (pentru celulele esuturilor proliferative inducerea mitozei este programat). Recepionnd semnalele mitogene, celula deruleaz procesele de pregtire ctre mitoz: - replicarea ADN cromozomial cu dublarea materialului genetic, cromozomii devenind bicromatidieni; 47

controlul calitii materialului genetic i nlturarea defectelor din moleculele de ADN prin activarea diferitor sisteme reparative; dublarea centriolilor, care vor asigura formarea fusului de diviziune n timpul mitozei. DUBLAREA MATERIALULUI GENETIC

Replicarea este procesul molecular prin care se realizeaz dublarea exact a moleculelor de ADN (a secvenei nucleotidice), i n consecin dublarea exact a materialului genetic. Dintr-o molecul de ADN se formeaz dou molecule identice att ntre ele, ct i cu molecula parental. Acest proces are loc datorit particularitilor unice de organizare a moleculelor de ADN: ADN este format din dou catene polinucleotidice complementare i antiparalele. Principalele caracteristici ale replicrii sunt: - sinteza replicativ a ADN-ului este semiconservativ, deoarece fiecare din cele dou catene este folosit ca matri pentru sinteza unei catene noi de ADN, noile molecule conin o caten matri i alta nou; - replicarea ADN-ului nuclear are loc numai o singur dat pe parcursul ciclului mitotic, n perioada sintetic a interfazei; - procesul este asincron - unele secvene de ADN se replic mai precoce (eucromatina), iar alte secvene mai tardiv (heterocromatina). n rezultatul sintezei replicative a ADN-ului materialul genetic se dubleaz i cromozomii devin bicromatidieni. Dac pn la replicare n celul sunt 46 de cromozomi monocromatidieni (46 de molecule de ADN) dup replicare cei 46 de cromozomi devin bicromatidieni (92 de molecule de ADN). Moleculele de ADN obinute prin replicare rmn unite prin centromer pn n anafaz (dou molecule de ADN identice ntre ele reprezint cromatidele surori ale unui cromozom) .
Replicarea semiconservativ a ADN-ului

DISTRIBUIA MATERIALULUI GENETIC PRIN MITOZ ECVAIONAL Mitoza reprezint mecanismul de distribuie a materialului genetic replicat la doi poli ai celulei, asigurat de fusul acromatic i de separarea masei citoplasmatice, cu formarea a dou celule identice genetic ntre ele i cu celula mam. Mitoza reprezint o diviziune ecvaional determinat de urmtoarele evenimente: condensarea materialuilui genetic cromatina se transform n cromozomi facilitnd distribuia egal i identic a materialului genetic; toi cromozomii sunt bicromatidieni; cromatidele surori sun identice, rezultate prin replicarea ADN-ului cromozomial, cromatidele sunt unite prin centromer de la sfritul perioadei S pn n Anafaz; n regiunea centromerului fiecrui cromozom se maturizeaz cte o pereche de kinetocori, ce asigur interaciunea cromozomilor cu firele fusului acromatic; organizarea aparatului de diviziune centriolii n perioada S se dubleaz, n Profaz migreaz, formnd doi poli ai celulei de la care se asambleaz firele fusului de diviziune;

48

microtubului fusului de diviziune se unesc cu cromozomii de ambele pri ale centromerului prin intermediul kinetocorilor; cromozomii maximal condensai, se aranjeaz ntr-un singur plan ecuatorial placa metafazic, datorit aparatului de diviziune; segregarea materialului genetic, replicat i condensat, se realizeaz prin: - dublarea i clivarea longitudinal a centromerilor; - disjuncia cromatidelor surori (din fiecare cromozom bicromatidian se formeaz doi cromozomi monocromatidieni); - migrarea simultan i sincron a cromatidelor surori spre polii opui ai celulei. procesul de repartizare a materialului genetic se finalizeaz prin formarea a doi nuclei identici urmat de citochinez.

Dinamica cromozomilor n diferite faze ale ciclului mitotic

Astfel, materialul genetic (cei 46 de cromozomi ai celulei somatice replicai), prin mitoz se transmite de la o celul la dou celule fiice. Celulele rezultate motenesc cte 46 de cromozomi material genetic identic, set de gene identic. Mitoza, n aa mod, reprezint mecanismul ce asigur proprietatea celulelor de a transmite n succesiunea generaiilor material genetic identic. Rolul biologic al mitozei: asigur transmiterea egal i identic a materialului genetic n succesiunea generaiilor de celule; reprezint mecanismul universal de nmulire a celulelor somatice la organismele pluricelulare; 49

asigur creterea organismelor pluricelulare la etapele prenatale i postnatal; reprezint mecanismul prin care se rennoiesc esuturile; intervine n procesul de regenerare a esuturilor. CARACTERISTICA PERIOADELOR CICLULUI MITOTIC
Perioadele ciclului celular Procese genetice de baz Transcripia Translaia Reparaia Replicarea Reparaia Transcripia Translaia Reparaia Transcripia Translaia Forma de prezentare a materialului genetic Cromozomi monocromatidieni, decondensai sub form de eucromatin i heterocromatin Cromozomii devin bicromatidieni, decondensai sub form de eucromatin i heterocromatin Cromozomi bicromatidieni, decondensai sub form de eucromatin i heterocromatin Cromozomii bicromatidieni se condenseaz

Evenimente celulare principale Creterea celular; Specializarea celular; Controlul competenei intrrii celulei n perioada S. Dublarea ADNului nuclear; Dublarea centriolilor. Controlul competenei intrrii celulei n mitoz; Acumularea factorilor proteici mitotici. Disocierea membranei nucleare; Condensarea cromatinei i transformarea ei n cromozomi; Formarea aparatului de diviziune; Maturizarea kinetocorilor; Interaciunea cromozomilor cu fusul de diviziune. Cromozomii sunt dispui ntr-un singur plan ecuatorial; Controlul interaciunii cromozomilor cu fusul de diviziune. Clivarea longitudinal a centromerului Disjuncia cromatidelor surori Migrarea simultan i sincron a cromatidelor spre polii celulei Decondensarea cromozomilor cu transformarea lor n cromatin Reorganizarea membranei nucleare, cu formarea a dou nuclee Citochineza cu formarea a dou celule fiice

INTERFAZA

G1

G2

Profaza

MITOZA

Metafaza

Cromozomi bicromatidieni maximal condensai

Anafaza

Telofaza

Din fiecare cromozom bicromatidian, prin separarea cromatidelor surori, se formeaz doi cromozomi monocromatidieni. Cromozomi monocromatidieni, ce se decondenseaz transformndu-se n cromatin.

ERORILE MITOZEI Erorile mitozei reprezint anomalii de distribuie a materialului genetic n timpul diviziunii celulare. nsi distribuia materialului ereditar are loc n anafaz prin clivarea longitudinal a centromerului, segregarea cromatidelor i migrarea lor simultan spre polii celulei, iar prin separarea citoplasmei cele dou celule-fiice motenesc un numr identic de cromozomi. Din diverse motive (defecte genetice, defecte metabolice, aciunea factorilor de mediu) aceste procese celulare pot fi dereglate; se pot produce: - asamblare anormal a fusului acromatic i interaciune defectuoas cu kinetocorii; - depolimerizare asincron a microtubulilor, care determin migrarea neconcomitent a cromozomilor spre polii celulei; - defecte n structura centromerului ce mpiedic separarea cromatidelor-surori; 50

modificarea viscozitii citoplasmei care poate mpiedica procesul normal de deplasare a cromozomilor spre polii celulelor, etc. Principalele erori ce conduc la o distribuie anormal a materialului genetic sunt: - clivarea transversal a centromerului cu producerea izocromozomilor; - nedisjuncia cromatidian i - ntrzierea anafazic cu producerea celulelor aneuploide (trisomii, monosomii). -

CLIVAREA TRANSVERSAL A CENTROMERULUI n anafaz, cromozomul bicromatidian se separ n doi cromozomi monocromatidieni prin clivarea centromerului. Clivarea centromerului, n norm, se realizeaz n plan longitudinal, rezultnd doi cromozomi identici dup mrime, form i informaie genetic, avnd un bra proximal (p) i altul distal (q). Dar, mai rar, clivarea centromerului se poate realiza n plan transversal, rezultnd doi cromozomi monocromatidieni diferii ca mrime, form i coninut genetic izocromozomi (iso) ce conin dou brae de acelai fel: - iso p (ip) cromozom format din dou brae p fiind absent braul q; - iso q (iq) cromozom format din dou brae q fiind absent braul p. n rezultatul clivrii transversale a centromerului i segregrii cromozomilor, cele dou celule fiice vor moteni materialul genetic dublat al unui bra i absena altui bra al cromozomului implicat n anomalie. Ex.: 46, XX CTCcrsX 46,X,i(Xp) / 46,X,i(Xq) CTCcrsY 46, XY 46,X,i(Yp)/ 46,X,i(Yq) CTCcrs 21 46, XX (XY) 46,XX (XY), i(21p) / 46,XX (XY), i(21q) etc. 51

NEDISJUNCIA CROMATIDIAN Cromatidele surori ale unui cromozom, rezultate prin replicarea premitotic a ADN-ului cromozomial, se separ una de alta dup clivarea centromerului. Acest proces reprezint momentul cheie n distribuia materialului genetic n timpul diviziunii. n caz de neseparare nondisjuncie cromatidele surori ale unui cromozom vor migra la acelai pol, determinnd o repartizare inegal a materialului genetic. Ca rezultat una dintre celulele fiice va moteni un cromozom n plus (2n+1 47 cromozomi trisomie), iar n cealalt celul va lipsi cromozomul respectiv (2n-1 45 cromozomi monosomie). Ex.: 46, XX NDcrsX 45,X / 47,XXX ; NDcrsY 46, XY 45,X / 47,XYY; NDcrs13 46, XX 45,XX,-13 / 47,XX,+13; NDcrs18 46, XY 45,XY, -18 / 47,XY,+18; NDcrs 21 46, XY 45,XY,-21 / 47,XY,+21; NDcrs8 46, XX 45,XX,-8 / 47,XX,+8; etc. NTRZIEREA ANAFAZIC Dup separarea cromatidelor-surori, prin depolimerizarea fusului de diviziune, are loc migrarea simultan a cromozomilor monocromatidieni spre poli opui. La fiecare pol ajung cte 46 cromozomi, care vor fi separai n dou nuclee, iar prin citochinez vor rezulta dou celule cu coninut genetic identic. Ca rezultat al defectelor de dezasambalre a microtubulilor sau a modificrii viscozitii citoplasmatice migrarea cromozomilor poate fi asincron. n rezultat, unii cromozomi vor nimeri n nucleul celulei-fiice, iar alii, cei ntrziai, vor forma micronuclei citoplasmatici, care vor degrada. n consecin, celulele fiice motenesc seturi diferite de cromozomi: una dintre celule poate obine un set normal, iar cealalt celul va fi monosomic. Ex.: 46, XX IAcrsX 45,X / 46,XX; 46, XY IAcrsY 45,X / 46,XY; 46, XX IAcrs13 45,XX,-13 / 46,XX; 46, XY IAcrs18 45,XY, -18 / 46,XY; etc. CONSECINELE ERORILOR DIN MITOZ Erorile de distribuie a materialului genetic n mitoz determin apariia celulelor cu seturi diferite de cromozomi n acelai organism - mozaicuri celulare cromozomice ce pot genera dou sau mai multe linii sau clone celulare, care difer prin numrul de cromozomi. n rezultatul clivrii transversale a centromerului se poate produce mozaicul de tipul: 46,isop / 46,isoq - cnd eroarea afecteaz diviziunea zigotului, sau 46 / 46,isop / 46,isoq - cnd eroarea apare n cursul diviziunii blastomerilor.

n rezultatul nedisjunciei cromatidiene, eroare determinat de nesepararea cromatidelor surori ale unui cromozom n cursul anafazei, apar mozaicuri de tipul: - 45 / 47 cnd eroarea afecteaz diviziunea zigotului; sau - 45 / 46 / 47 cnd eroarea apare n cursul diviziunii blastomerilor. n rezultatul ntrzierii anafazice - eroare caracterizat prin migrarea cu vitez redus sau blocarea migrrii unei cromatide dup ce disjuncia cromatidian s-a produs normal, determin apariia unui mozaic cromozomic de tipul 45/46. 52

Evoluia clonelor celulare anormale depinde de viabilitatea celulelor care prezint anomalia cromozomic: a. anomaliile grave determin moartea celulelor anormale (clonele anormale se autoelimin); b. anomaliile mai puin grave permit multiplicarea celulei anormale cu apariia unei clone anormale. Trisomiile sunt mai puin grave ca monosomiile, anomaliile gonosomilor sunt mai puin grave ca anomaliile autosomilor; cromozomii mai mici au mai puine gene i anomaliile lor sunt mai puin grave ca anomaliile cromozomilor mari.
Anomalii cromozomiale Erori mitotice cauze ale anomaliilor cromozomiale Nedisjuncia cromatidian Trisomii (47,+?) Anomalii cromosomice viabile 47,XXX 47,XXY 47,XYY 47,XX(XY),+21 47,XX(XY),+13 47,XX(XY),+18 47,XX(XY),+8 45,X 46,X,i (Xp) 46,X,i (Yp) Clivarea transversal a centromerului i (?q) Anomalii cromosomice letale Restul trisomiilor autozomale

Monosomii (45,-?) i (?p)

Nedisjuncia cromatidian; ntrzierea anafazic

Toate monosomiile autozomale Restul anomaliilor crs 46,XX(XY),i (?p) Restul anomaliilor crs 46,XX(XY),i (?q)

46,X,i (Xq) 46,X,i (Yg) 46,XX(XY),i (Dq) 46,XX(XY),i (Gq)

Consecinele fenotipice ale clonelor anormale depind de momentul ontogenetic al apariiei lor. Dac se produc n timpul embriogenezei - este perturbat formarea normal a esuturilor i organelor producnd anomalii congenitale (fenotip anormal la natere); n caz dac apar postnatal se produce perturbarea structurii sau funciei anumit esut sau organ i apare o degenerare neoplazic (cancer).
SALVAREA ANEUPLOIDIILOR Organismul are tendina de a corecta dezechilibrul genetic, ncercnd s elimine cromozomul supranumerar n cazul trisomiilor sau s ctige un cromozom n plus n cazul monosomiilor. Corecia unei trisomii n disomie se poate realiza prin urmtoareale mecanisme: - nedisjuncie mitotic; - ntrziere anafazic; - pulverizarea cromosomului supranumerar. Corecia monosomiei n disomie poate fi realizat prin: - nondisjuncie mitotic; - endoreplicare selectiv a cromosomului monosomic; - clivare transversal a centromerului ce rezult iso q. n cazul acrosomilor. Consecina unui mecanism de salvare a unei aneuploidii este disomia uniparental. Trisomiile ce sunt corectate prin pierderea unuia din cei trei cromosomi, 1/3 cazuri - rezult o disomie uniparent (DUP). Monosomiile sunt corectate prin duplicarea cromosomului monosomic, rezultnd ntotdeauna DUP.

53

n cazul n care corecia se produce doar n anumite celule, rezult mozaicuri cromosomice: - corecia unei trisomii prin pierderea cromosomului suplimentar determin producerea unui mozaic 47/46; - corecia unei monosomii prin duplicarea cromosomului fr omolog determin producerea unui mozaic 46/45. Mozaicurile cromosomice pot fi mprite n trei categorii: I. mozaicuri generalizate, prezente n toate esuturile organismului; II. mozaicuri limitate la anumite esuturi embrionare; III. mozaicuri limitate la placent.

Consecinele mozaicurilor limitate la placent sunt: disfuncie metabolic placentar ce afecteaz dezvoltarea embrionar; ntrziere n dezvoltare i avorturi; mortalitate perinatal.

54

CURS 6
TRANSMITEREA INFORMAIEI GENETICE DE LA PRINI LA COPII Perpetuarea speciei i pstrarea caracterelor distinctive sunt determinare pe proprietatea fundamental a organismelor vii de a se autoreproduce. Pe parcursul evoluiei lumii vii a aprut necesitatea nmulirii sexuate care asigur diversitatea intraspecific fenomen important pentru supravieuire: asigur recombinarea materialului genetic, determin apariia indivizilor cu combinaii noi de caractere cu o susceptibilitate diferit la agresiunile din mediul ambiant i, n consecin, reprezint un mecanism important n selecia natural. La organismele cu reproducere sexuat legtura material dintre generaii, transmiterea i conservarea informaiei genetice de la o generaie la alta este asigurat de dou procese genetice distincte: - gametogeneza - producerea celulelor sexuale mature cu set haploid de cromozomi (n=23), - fecundarea gameilor i formarea zigotului cu set diploid de cromozomi (2n=46) cu o configuraie genetic nou, unic i constant.

GAMETOGENEZA Gametogeneza este ansamblul proceselor genetice, biochimice i morfologice, care determin formarea i maturaia gameilor n gonade (testicule sau ovare). Ovogeneza este mecanismul de difereniere a ovulelor haploide din celule sexuale primare diploide (ovogonii); se desfoar n ovare; unele procese se realizeaz n perioada embrio-fetal, iar alte numai dup pubertate pn la menopauz; populaia de ovocite nu se rennoiete, iar nsi procesul este discontinuu, cu dou faze de ateptare (dictiotenul profazei I i metafaza II ale meiozei). Spermatogeneza reprezint procesul de difereniere a spermatozoizilor haploizi din celule sexuale primare diploide (spermatogonii); are loc n testicule; se desfoar n mai multe etape, cu rennoirea permanent a populaiilor de celule sexuale dup pubertate. Gametogeneza se desfoar n cteva etape: perioada de nmulire mitotic a celulelor sexuale primare cu formarea unei populaii mari de gametogonii (2n=2c); perioada de cretere cu formarea gametociilor de ordinul I (2n=46 crs) prin replicarea ADNului cromozomial, sinteza componentelor necesare pentru meioz i acumularea factorilor ce asigur formarea i dezvoltarea zigotului; perioada de maturaie cu formarea gameilor haploizi, realizat prin meioz proces decisiv n gametogenez: - pe parcursul ovogenezei dintr-o ovogonie se maturizeaz doar un ovul capabil de fecundaie i doi/ trei globuli polari; - pe parcursul spermatogenezei dintr-o spermatogonie se maturizeaz patru spermatide; !!! perioada de formare, caracteristic doar spermatogenezei, ce asigur modificrile morfologice ale celulei sexuale masculine, transformnd spermatidele n spermatozoizi capabili pentru fecundaie (mobilitate i capacitaie).

55

Ovogeneza Locul desfurrii n ovare (gonade feminine)

Spermatogeneza

n testicule (gonade masculine) Perioadele caracteristice I. De nmulire a ovogoniilor I. De nmulire a spermatogoniilor II. De cretere a ovocitelor de ordinul I II. De cretere a spermatocitelor de ordinul I III. De maturaie a ovulelor (dintr-un ovocit I se III. De maturaie a spermatidelor (dintr-un formeaz un ovul i trei globuli polari) spermatocit I se formeaz patru spermatide) IV. De formare a spermatozoizilor Reglarea procesului Control neuro-endocrin dependent de factorii de Autocontrol neuro-endocrin mediu Tipul de gamei Ovule - celule mari rotunde, ce conin vitelius, setul Spermatozoizi celule mici mobile, formate din de organite celulare caracteristic i nucleul haploid cap, gt i flagel, nucleul este haploid ( 23,X sau (23,X) 23,Y) Perioada desfurrii Perioada de nmulire i cretere se desfoar doar Prenatal, odat cu formarea gonadelor se formeaz o prenatal; populaie de spermatogonii; Ovarul nou-nscutei conine ovocite de ordinul I Dup pubertate toate cele patru perioade ale stopate n dictioten (profaza I a meiozei); spermatogenezei se desfoar continuu, producnd Perioada de maturaie ncepe dup pubertate, cte un numr enorm de spermatozoizi. un ovocit (mai rar dou) se maturizeaz lunar, pn Spermatozoizii permanent se rennoiesc; perioada la stadiul metafazei II; de rennoire este de circa 64 de zile.. Meioza se finalizeaz dup fecundarea ovulului de ctre spermatozoid. !!! Ovocitele nu se rennoiesc. Riscul mutaiilor generative Crete odat cu vrsta femeii; risc pentru anomalii Independent de vrsta brbatului, risc pentru mutaii cromozomiale. genice.

56

FECUNDAREA Contopirea gameilor haploizi de origine parental diferit poart denumirea de fecundare, iar celula rezultat ce conine materialul genetic al ambilor gamei - zigot. Gameii formai n timpul ovogenezei i spermatogenezei sunt foarte variai, pentru c rezult n urma unor procese de recombinare intra- i intercromozomial. Participarea ovulelor i spermatozoizilor la fecundaie este aleatorie, asigurnd formarea diferitor variante genetice de zigoi, ceea ce reprezint recombinarea genomic. Fuziunea celor doi gamei haploizi reface setul diploid de cromozomi, caracteristic speciei. Mitozele succesive ale zigotului duc la creterea i dezvoltarea organismului pluricelular. ncepnd cu zigotul, toate celulele somatice vor avea cromozomii n perechi. Cromozomii pereche sau omologii sunt asemntori ca morfologie i structur genic, dar diferii ca origine. n concluzie, organismul uman matur posed dou linii celulare: (i) celule somatice ce alctuiesc diferite esuturi i organe: - au set diploid de cromozomi (2n=46crs); - provin de la celula zigot prin mitoze repetate; - 51% din materialul genetic este de origine matern i 49% de origine patern (deoarece ADNmt este de origine matern); - se nmulesc prin mitoz pentru a asigura creterea organismului, rennoire i regenerarea esuturilor; (ii) celule sexuale care asigur transmiterea materialului genetic de la prini la descendeni la formarea zigotului; - au set haploid de cromozomi (n=23crs); - provin din gametogonii (celule diploide), care reprezint celule somatice specializate pentru gametogenez; - se maturizeaz n gonade prin meioz; - determin stabilitatea numrului de cromozomi la specia dat. DINAMICA CROMOZOMILOR N MEIOZ Meioza (meiosis micorare) este un mecanism complex ce implic desfurarea succesiv a dou diviziuni, care se termin cu njumtirea setului de cromozomi. Din fiecare celul cu 46 cromozomi (set diploid) se formeaz 4 gamei cu cte 23 cromozomi (set haploid). Gameii sunt extrem de variai pentru c, rezultai din meioz, sunt produi ai recombinrii intra- i intercromozomice.

Particularitile segregrii cromozomilor n meioza ovogenezei i spermatogenezei

57

Meioza este precedat de o interfaz premeiotic n care are lor replicarea ADN-ului. ntre cele dou diviziuni exist o perioad scurt interkineza n care ADN-ul nu se replic. Prima diviziune a meiozei diviziunea reducional asigur njumtirea numrului de cromozomi n celulele: transform gametocitele de ordin I cu 46 cromozomi bicromatidieni n gametocite de ordin II cu 23 cromozomi bicromatidieni. Reducerea numrului de cromozomi este determinat de: - conjugarea cromozomilor omologi cu formarea a 23 de bivaleni (tetrade) n profaza I; - aranjarea bivalenilor n plan ecuatorial n metafaza I; - disjuncia cromozomilor omologi i migrarea spre polii celulei a cromozomilor bicromatidieni, cte un cromozom din fiecare pereche n anafaza I; - citokineza asigur separarea masei citoplasmatice cu formarea a dou celule cu numr haploid de cromozomi dar bicromatidieni (cu cantitate dubl de ADN 1n=2c) gametocite de ordinul II.

Dinamica cromozomilor n meioz

58

Paralel cu procesele ce asigur segregarea cromozomilor pe parcursul diviziunii meiotice reducionale are loc recombinarea materialului genetic:

Conjugarea omologilor i recombinarea intracromozomial crossing-overul

recombinarea intracromozomial crossing-overul, care reprezint schimbul reciproc de fragmente (gene) ntre cromozomii omologi materni i paterni i se desfoar datorit conjugrii lor (Profaza I); recombinarea intercromozomial, care reprezint asortarea independent a cromozomilor neomologi materni i paterni la polii celulei n timpul Anafazei I, datorit aranjrii aleatorii a bivalenilor la ecuator i migrrii spre polii celulei.

Perioadele ciclului celular

Nr. de cromozomi

Nr. de cromatide

Dublarea mat. genetic

Recombin area

Segregarea mat. genetic

Interfapa premeiotic PI MEIOZA I reducional MI AI TI Inerchineza P II MEIOZA II ecvaional M II A II T II

46 (gametocit I) 46 46 46 23 + 23 (gametocii II) 23 23 23 46 23+23 23 23 23 46 23+23 (gamei) 46 46 46 46 23+23

92 92 92 92 46 + 46 46 46 46 46 23+23

+ -

+ + -

+ Citokineza + Citokineza

A doua diviziune a meiozei diviziunea ecvaional asigur repartizarea egal i identic a materialului genetic n celulele-gamei. Formarea gameilor haploizi (1n=1c) din gametociii de ordinul II (1n=2c) este asigurat de: - maturizarea a doi kinetokori pentru fiecare centromer; - aranjarea la ecuator a cromozomilor ntr-un singur plan; - clivarea longitudinal a centromerului i disjuncia cromatidelor surori; - migrarea simultan i sincron a cromatidelor (cromozomilor monocromatidieni) spre polii celulei; - separarea masei citoplasmatice cu formarea a cte doi gamei haploizi din fiecare gametocit I, n total 4 din fiecare celul ce a intrat n meioz. 59

ROLUL BIOLOGIC AL MEIOZEI i. Meioza are un rol esenial pentru reproducerea organismelor i conservarea nsuirilor prinilor, asigurnd legtura material ntre prini i copii; ii. Meioza are i rolul de a produce i a menine variabilitatea genetic n populaiile umane prin fenomenele de recombinare intra- i intercromozomic, ce se realizeaz n profaza meiozei I schimbul reciproc de fragmente egale ntre cromozomii omologi (procesul crossing-over) i n anafaza meiozei I asortarea independent a cromozomilor neomologi; iii. Meioza demonstreaz corelaia dintre dinamica cromozomilor i legile ereditii ale lui Mendel (legea segregrii caracterelor, legea motenirii independente a caracterelor). ERORILE MEIOZEI I CONSECINELE LOR n cursul meiozei se pot produce diferite anomalii de distribuie a materialului genetic: crossing-over inegal cu formarea gameilor purttori de deleii sau duplicaii cromozomice; nedisjuncie cromozomial sau cromatidian cu formarea gameilor nulisomici i disomici; ntrziere anafazic cu formarea gameilor nulisomici; nesepararea gametocitelor cu formarea gameilor diploizi.; clivarea transversal a centromerului cu formarea isocromozomilor.

CROSSING-OVERUL INEGAL se poate produce ca rezultat al unei conjugri anormale a cromozomilor omologi i, n consecin, schimbului inegal de fragmente ntre comatidele nesurori ale bivalentului. Aceast eroare va fi cauza apariiei unor cromozomi cu deleie i cu duplicaie, iar gameii respectivi purttori de aberaii cromozomiale [de ex.: 23,X(Y),1p- i (23,X(Y),1p+] vor da natere la zigoi cu monosomii i trisomii pariale [de ex.: 46,XX(XY), 1p- i 46, XX(XY), 1p+]. NEDISJUNCIA CROMOZOMIC poate avea loc n anafaza I, cnd ambii cromozomi omologi nimeresc la acelai pol al celulei i ca urmare n acelai gametocit sau n meioza II cnd din diverse motive nu are loc clivarea centromerului i cele dou cromatide nu se separ, migrnd mpreun la un pol se poate produce nedisjuncia cromatidian. n ambele cazuri se formeaz gamei cu aneuploidii cromozomice disomii i nulisomii, care dup fecundare vor da natere unor zigoi anormali: trisomici i monosomici. NTRZIEREA ANAFAZIC a unui cromozom sau a unei cromatide se poate produce ca urmare a separrii anafazice asincrone a cromozomilor n meioza I sau a cromatidelor n meioza II, urmat de ntrzierea unui cromozom la polul celulei i pierderea acestuia n momentul citochinezei (cromozomul ntrziat rmne n afara nucleului n citoplasm i degradeaz). Ca rezultat al ntrzierii anafazice se formeaz gamei nulisomici, ct i gamei normali. NESEPARAREA GAMETOCITELOR reprezint fenomenul cnd dup segregarea cromozomilor n meioz nu se separ masa citoplasmatic i ca rezultat se produc gamei diploizi (2n), care dup fecundare cu gameii normali vor forma zigoi triploizi (3n). CLIVAREA TRANSVERSAL A CENTROMERULUI, cauzat de defecte ale ADN-ului centromeric sau de asamblarea anormal a proteinelor centromerice, se poate produce n Anafaza II. Ca rezultat se vor forma gamei cu isocromozomi p i izocromozomi q. La fecundarea gameilor 23,ip sau 23,iq vor rezulta zigoi 46,ip (cu materialul genetic al braului p a cromozomului respectiv dublat i lipsa materialului genetic al braului q a cromozomului respectiv sau zigoi 46,iq (cu materialul genetic al braului q a cromozomului respectiv dublat i lipsa materialului genetic al 60

braului p a cromozomului respectiv), iar dup fecundare se vor forma zigoi cu monosomie parial i trisomie parial. Astfel toate erorile de distribuie a materialului genetic n cursul meiozei duc la formarea gameilor aneuploizi, iar dup fecundare formeaz zigoi aneuploizi (monosomici, trisomici), care n consecin sunt cauza tulburrilor de reproducere: sterilitate, avorturi spontane, nou nscui mori sau malformaii, copii cu tulburri de cretere pre i postnatal, ntrziere n dezvoltarea psihomotorie. ERORI LA FECUNDARE Fecundarea dubl este posibil cnd ovarul elibereaz n momentul ovulaiei dou ovule i prin fecundare, ele vor forma doi zigoi, care pot evolua independent; sau se pot uni, formnd o singur structur embrionar denumit himer; n ultimul caz, dac zigoii vor avea acelai sex genetic, se realizeaz o sexualizare normal i numai unele studii a caracterelor vor evidenia o populaie celular dubl; dac zigoii care s-au unit au sexe genetice diferite, se realizeaz o constituie XX/XY cu tulburri de sexualizare hermafroditism adevrat. Dispermia este posibil cnd un ovul este fecundat de doi spermatozoizi, rezultnd zigoi triploizi (69,XXX sau 69,XXY sau 69,XYY). Diginia sau diandria reprezint fenomenul cnd unul din gamei este diploid i cellalt este haploid, rezultnd zigoi triploizi; zigoii triploizi evolueaz cu dereglri severe n dezvoltarea embrionar.
Consecine Fecundarea dubl Gemeni dizigoi Himer Dispermie Triploidie Constituia genetic 46,XX i 46,XX 46,XX i 46,XY 46,XX/46,XX 46,XX/ 46,XY 69,XXX sau 69,XXY sau 69,XYY 69,XXX sau 69,XXY 69,XXY sau 69,XYY Evoluie Evoluie normal

Evoluie normal Hermafroditism adevrat Dereglri severe n embrionar

dezvoltarea

Diginie

Triploidie

Diandrie

Triploidie

Dereglri severe n dezvoltarea embrionar, placent mic de form anormal, avort precoce Mol hidatiform parial, placent mare, polichistic, embrion malformat.

61

CURS 7
GENELE UMANE n conceptul clasic gena este un segment cromozomial ce controleaz expresia fenotipic a unui caracter, iar n conceptul contemporan gena reprezint un segment polinucleotidic al moleculei de ADN ce codific sinteza unei molecule specifice polipeptid sau ARN. Astfel substratul molecular al informaiei genetice este molecula de ADN, iar substratul molecular al caracterului morfologic, biochimic sau fiziologic este proteina. Genele umane se clasific n dou categorii majore: gene structurale care codific polipeptide i gene codificatoare de molecule de ARNr i ARNt.

62

ORGANIZAREA GENERAL A GENELOR STRUCTURALE Gena structural reprezint o combinaie de secvene nucleotidice reglatoare i codificatoare: secvene reglatoare proximale promotorul, enhanceri i silenseri, care sunt responsabili de controlul iniierii transcripiei, ratei i vitezei transcripiei; secvene reglatoare distale terminatorul i situsul de poliadenilare, care intervin n controlul terminrii procesului de transcripie i maturizrii ARN-transcriptului primar; secvena codificatoare ce este format din exoni separai de introni. Genele sunt localizate n lungul moleculei de ADN cu o poziie fix (locus) i sunt separate una de alta prin secvene necodificatoare spaceri. Ele nu au granie morfologice, au numai granie funcionale, ce se stabilesc n procesul transcripiei. n genomul uman se descriu circa 30000 perechi gene structurale ce constituie circa 25% din genom (la 50% din ele funcia este cunoscut). Dimensiunile genelor umane sunt diferite i au o lungime medie de 3000p.n., de ex: - gena globinei 1, 5 kb; - gena insulinei - 1, 7 kb; - gena catalazei - 34 kb; - gena distrofinei - 2,5 mb;
Clasificarea genelor umane dup dimensiuni Dimensiunile Exemple genei, kb -globina 0,8 -globina 1,5 Insulina 1,7 Factorul IX de coagulare 34,0 Catalaza 34,0 Fenilalaninhidrixilaza 90 Factorul VIII de coagulare 186,0 Tireoglobulina ~300,0 Distrofina ~2000,0 Dimensiunile ARNm, kb 0,5 0,6 0,4 2,8 1,6 2,4 9 8,7 16,0 Numrul intronilor 2 2 2 7 12 12 26 36 60

Categoria Gene mici Gene medii Gene mari Gene gigante Gene supergigante

Lungimea, kb pn la 10 10-25 25-50 51-100 101-500 peste 500

Repartizarea genelor umane dup lungime % de la numrul total 23,3 35,6 20,2 13,0 6,7 1,2

PARTICULARITILE GENELOR STRUCTURALE UMANE: A. au o organizare complex: pot prezenta mai mult de un promotor sau situsuri de iniiere al transcripiei; pot prezenta mai muli codoni de iniiere i codoni STOP; prezint secvene complexe de reglare a transcripiei; asigur diferite variante de splicing alternativ; B. se caracterizeaz prin prezena unor mecanisme de reglare combinat a activitii genelor (complex i precis n spaiu i n timp): n dependen de tipul celulei; n dependen de perioada ontogenetic a celulei i a organismului; 63

n dependen de factorii de mediu interni sau externi.

Gena distrofinei i izoformele distrofinei Lungimea Localizarea ARNm, kb promotorului Captul 5' 14 netranscris 14 Intronul 1 14 Intronul 1 4,5-4,8 5,5 2,2 7,5 Intronul 44 Intronul 63 Intronul 56

Tipuri Dimensiuni complete Muscular Cerebral Cerebral 1-Dp71 Forme scurte 2-Dp116 3-Dp40 Dp140 Dp260

Expresie Inim, muchi scheletici Scoara Hipocamp Celulele Purkinje Oriunde, n afar de muchi Nervii periferici Oriunde, n afar de muchi Neuroni embrionali Retin

PROPRIETILE GENELOR UMANE

1. Genele, fiind reprezentate de secvene de ADN, se replic, autoreproducndu-se i prin mitoze

repetate sau prin meioz se transmit la alte generaii de celule sau de organisme, asigurnd continuitatea materialului genetic n irul generaiilor i transmitea genealogic a caracterelor ereditatea;
2. Gena este specific - codific o molecul polipeptidic, determin expresia unui caracter; 3. Gena are o aciune dozat asupra fenotipului prin posibilitatea sintezei unei anumite cantiti de

produs genic (ARNm i molecule polipeptidice);

4. Gena este stabil datorit particularitilor de organizare a moleculei de ADN i transmiterii din

generaie n generaie a informaiei genetice neschimbate, determinnd formarea caracterelor asemntoare la prini i copii; dar exist n genomul uman gene nestabile, programate genetic, ce se reorganizeaz de novo n timpul diferenierii celulare (de ex.: genele pentru lanurile grele i uoare ale Ig, genele ce codific pentru receptorii olfactivi, pentru enzimele aparatului de detoxifiere a xenobioticilor);
5. Unele gene sunt dependente de factorii de mediu (interni genetici i negenetici, externi) i

determin expresivitatea variabil a unui caracter la diferite persoane n diverse condiii de mediu: factorii de mediu pot modula (mri, micora sau bloca) expresia genei; factorii de mediu pot modifica expresia genei (expresie patologic, non-expresie);
6. Genele pot avea aciune pleiotrop; pleiotropia sau aciunea multipl a genei este proprietatea

genei de a contribui la formarea mai multor caractere; poate fi primar - determinat de aciunea multipl a produsului genei sau poate fi secundar determinat de consecinele secundare ale aciunii proteinei la nivelul diferitor celule, esuturi i organe;
7. Genele pot exista n mai multe forme moleculare (diferite secvene nucleotidice), determinnd o

surs de variabilitate genetic. Prin modificarea secvenei nucleotidice ale unei gene (mutaii) apar variante noi ale genei alele; alelele multiple controleaz diferite stri sau forme alternative ale unui caracter; caracterul controlat de o serie de alele multiple se numete caracter polimorf (25% din genele umane au variante alelice multiple).

64

FUNCIILE GENELOR UMANE Genele dein i pstreaz informaia genetic codificat despre sinteza anumitor proteine specifice i formarea anumitor caractere fenotipice (biochimice, morfologice, fiziologice, psihice i comportamentale). Genele transmit informaia genetic datorit replicrii ADN-ului i reprezint legtura material dintre generaii, asigurnd transmiterea genealogic a caracterelor de specie i de familie. Genele realizeaz informaia genetic prin transcrierea ADN-ului pe molecule informaionale de ARN i translaia codului genetic n timpul sintezei proteinelor substratul material al diferitor caractere la nivel de celul, esut i organism. Expresia genelor reprezint realizarea informaiei codificate de gene prin formarea caracterelor - fenotipului. (I) La nivel molecular, aceasta constituie procesul prin care informaia din ADN este transformat n molecule polipeptidice, ARNt, ARNr. Expresia genelor ce codific polipeptide reprezint un proces complicat, ce decurge n cteva etape:

transcripia copierea informaiei genetice din ADN i sinteza moleculelor precursoare ale ARNm; processingul maturizarea moleculelor ARNm: CAParea, poliadenilarea, splicingul; transferul ARNm n citoplasm; translaia procesul prin care secvena nucleotidelor din ARN este tradus ntr-o secven de aminoacizi ai lanului polipeptidic. maturizarea moleculei proteice prin conformaie +/- modificri structurale.

(II) La nivel celular expresia genei reprezint rezultatul integrrii proteinei sintetizate ntr-o structur celular, ntr-un lan metabolic sau ntr-o reea de semnalizare celular. Fenotipul celular morfologia i funcia este controlat de genomul celulei, dar realizat de setul specific de proteine sintetizate proteinomul. (III) La nivel organismic expresia genelor se manifest prin caractere morfologice i nsuiri complexe, datorit cooperrii tuturor componentelor moleculare i supramoleculare n morfogeneza i fiziogeneza organismului uman. Astfel, n concept actual, expresia genic este studiat la diferite nivele: i. molecular polipeptidul sintetizat, care constituie efectul primar al expresiei genice; ii. celular molecula proteic i funcia ei n celul efectul secundar; iii. organismic manifestarea fenotipic a genei efectul teriar.

CLASIFICAREA GENELOR UMANE Exist diferite criterii de clasificare a genelor, care includ diferite puncte de vedere asupra legturii dintre structur, localizare i funciea genelor: 65

1. dup tipul produsului genic: - gene codificatoare de proteine gene structurale; - gene codificatore de ARNr i ARNt. 2. dup numrul de copii n genom: - unice - cu o singur copie; - cu mai multe copii (repetate n tandem sau dispersate). 3. n dependen de numrul de celule n care se expresea genele: - genele house keeping active n toate celulele; - gene specifice de esut. 4. n dependen de perioada de expresie fenotipic: - gene active n toate perioadele vieii; - gene active numai n perioada embrionar; - gene active n perioada pubertii; - gene active la adult. 5. dup gradul de activitate: - gene normomorfe - cu activitat normal; - gene hipomorfe - cu activitat redus: - gene hipermorfe - cu activitat n exces; - gene amorfe - cu activitate blocat. Activitatea genic se stabilete dup cantitatea de molecule de ARN transcris, cantitatea de protein sintetizat, activitatea produsului genic proteinei. 6. dup funcia produilor genici sintetizai sunt gene ce codific: gene codificatoare de enzime - 31,2%; gene codificatoare de modulatori ai proteinelor sintetizate - 13, 6 % gene codificatoare de receptori; gene codificatoare de factori de transcripie; gene codificatoare de proteine ale matricei intracelulare i matricei extracelulare; gene codificatoare de transportori membranari i proteine canal; gene codificatoare de molecule de semnalizare celular; gene codificatoare de hormoni; gene codificatoare de imunoglobuline, etc.

50%

7. n dependen de aciunea modulatoare a factorilor de mediu asupra expresiei genei: - gene stabile; - gene plastice.

LOCALIZAREA GENELOR Conform teoriei cromozomiale ale ereditii propus de Th. H. Morgan (1911): genele sunt localizate pe cromozom, fiecare gen ocup un anumit locus; genele unui cromozom sunt dispuse liniar i formeaz grupuri de nlnuire; numrul grupurilor de nlnuire este egal cu numrul haploid de cromozomi; ntre cromozomii omologi poate avea loc schimb de gene alele (crossing-overul); frecvena crossing-overului este direct proporional cu distana dintre gene i este invers proporional puterii de nlnuire; 66

distana dintre gene se msoar n % de recombinare i 1% de crossing-over =1cM (centiMorganid). n loci identici ai cromozomilor omologi sunt dispuse gene cu aceiai funcie - gene alele, iar genele cu loci diferii n acelai cromozom sau cromozomi diferii se numesc gene nealele. Dac individul este purttor de alele identice este numit homozigot, dar dac genele alele sunt diferite heterozigot. Fiecare persoan poart circa 30 000 perechi de gene, dup unele perechi este homozigot, iar dup altele heterozigot, Repartizarea genelor pe cromozomi este neomogen: sunt cromozomi bogai n gene i cromozomi sraci n gene; sunt fragmente de cromozomi cu o densitate mare de gene i cu densitate redus.

Unele gene au o singur copie, altele gene au mai multe copii i formeaz familii repetitive (n tandem sau pe diveri cromozomi) sau nerepetitive de gene. Genele de pe un cromozom, ce sunt localizate foarte aproape una de alta formeaz haplotipuri, care deseori au elemente reglatoare comune. Genele localizate pe autosomi determin caractere autozomale ce se transmit de la prini indiferent de sex, iar genele localizate pe gonosomi determin caractere sex-lincate ce se transmit dependent de sex: - genele i caracterele X-lincate se transmit de la mam i fiicelor i fiilor, iar de la tat numai fiicelor; - genele i caracterele Y-lincate (holandrice) se transmit exclusiv din tat n fiu. HRILE GENETICE Genomul celulei include dou sisteme de gene cu mod de organizare i motenire diferite: genomul nuclear i genomul mitocondrial. n nucleul celulelor umane se conin circa 30000 perechi de gene, care sunt repartizate de-a lungul a 46 molecule de ADN, care corespund celor 46 cromozomi din setul diploid. Fiecare cromozom conine n medie 1-2000 de gene. Genele sunt dispuse liniar n cromozom, una dup alta, fiind separate prin secvene necodificatoare (ADN-satelit, spaceri). Genele unui cromozom se transmit de la o generaie la alta, n bloc, fenomen numit nlnuire genic sau linkage. Fiecare cromozom reprezint un grup de nlnuire. Genomul mitocondrial este organizat sub form ADN inelar, conine 37 gene aranjate compact i se transmite pe linie matern. Astfel, la om sunt 25 de grupuri de nlnuire: 22 grupuri ale autosomilor; un grup al cromozomului X; un grup al cromozomului Y; un grup genele ADN-ului mitocondrial.

67

Cromozom Nr. gene Lungimea, Mb

1 3511 250

2 2368 243

3 1926 198

4 1444 191

5 1633 181

6 2057 171

7 1882 159

8 1315 146

Cromozom Nr. gene Lungimea, Mb

9 1534 141

10 1391 136

11 2168 135

12 1714 134

13 720 115

14 1532 107

15 1249 103

16 1326 90

Cromozom Nr. gene Lungimea, Mb

17 1773 81

18 557 78

19 2066 59

20 857 63

21 450 48

22 855 51

X 1672 155

Y 429 59

Fenomenul de linkage se manifest numai n cazul genelor plasate pe acelai cromozom, n timp ce pentru genele plasate pe cromozomi diferii transmiterea ereditar a genelor se face independent, mendelian. Studiul mecanismului de transmitere ereditar a artat c nu ntotdeauna genele ce fac parte din acelai grup linkage se transmit nlnuit. Excepiile sunt explicate prin posibilitatea recombinrii ntre cromozomii omologi crossing-over, care are loc n meioz. n timpul crossing-overului are loc schimbul reciproc de gene alele ntre cromozomii pereche - cromozomii omologi. Frecvena crossing-overului este diferit pentru diveri loci, variaz de la 0% la 50% i este

Mecanismul recombinrii ntre cromozomii omologi crossing-overul

corelat cu distana dintre gene. La valori de peste 50% nu se mai consider o recombinare, ci o segregare independent. Pe baza observaiei c ntre genele foarte apropiate probabilitatea apariiei chiasmelor i respectiv a fenomenului de crossing-over este mic, iar ntre genele mai ndeprtate crete spre limita superioar de 50%, determinarea frecvenei recombinrilor genice n procente constituie modalitatea de stabilire a localizrii genelor pe cromozom i, respectiv, a alctuirii hrilor genetice. 68

Hrile genetice se alctuiesc innd cont de fenomenul de linkage, crossing-over, plasarea liniar a genelor pe cromozomi, etc. Aceste hri constituie o reprezentare grafic a cromozomilor i a genelor care alctuiesc diferite grupe de linkage, gene situate pe cromozomi la distane relative, exprimate n procente de recombinare (1% de crossing-over = 1 cMorganid (1cM)).

Motenirea nlnuit complet i incomplet. Formarea zigoilor nerecombinai (NR) i a celor recombinai (R) produi ai crossing-overului

n prezent, datorit tehnicilor de genetic molecular, s-au elaborat hrile fizice ale cromozomilor cu distribuia exact a genelor pe cromozom, iar mrimea genelor i distana dintre ele se prezint n perechi de nucleotide (pn). Stabilirea unor relaii (grupe) de nlnuire ntre gene i, deci, caractere este foarte important n genetica medical. Se urmrete transmiterea unor caractere patologice n comun cu un caracter normal. Caracterul normal servete ca marcher (indicator) a unei patologii i este important n special pentru bolile ce apar pe parcursul vieii. Exemple de grupe de nlnuire: - Rh i eliptocitoz (eritrocite cu form oval); AB0 i xeroderma pigmentosum (XP); grupa sanguin Duffy i cataracta congenital; grupa sanguin Lutheran, statusul secretor i miopatia; grupele MNSs i dentinogenesis imperfecta-1 (DI-1); grupa sangvin Xg i hemofilia A (HEMA), hemofilia B (HEMB), daltonismul (Dalt); etc.

69

MUTAIILE GENICE Mutaiile genice pot interesa genele de structur sau secvenele implicate n reglare: n primul caz se modific structura (calitatea polipeptidului sintetizat dup informaia genei), n al doilea caz se schimb ritmul (cantitatea) sau tipul de protein sintetizat. Ca rezultat al mutaiilor genice, se produc forme alternative ale genei, numite alele.

Clasificarea mutaiilor genice

Mutaiile genice se pot produce prin: - alterri ale secvenei nucleotidice - prin substituie, inversie, deleie, inserie de nucleotide; - recombinri intragenice i crossing-over inegal; - reversie; - duplicaii i hiperduplicaii. Substituia unui singur nucleotid prin alt nucleotid este cea mai frecvent posibilitate de modificare genic. Substituiile sunt definite mutaii punctiforme i se clasific n: transversii - tip de nlocuire (substituie) a bazelor azotate n care o baz azotat purinic este nlocuit de o baz pirimidinic sau invers. tranziii - tip de nlocuire (substituie) a bazelor azotate din ADN, n care o baz purinic este nlocuit de o alt baz purinic sau o baz pirimidinic este nlocuit de alt baz pirimidinic.

70

Substituia duce la modificarea unui singur codon (sens sau nonsens). Schimbarea unui codon sens va determina unul din urmtoarele efecte: - schimbarea aminoacidului ca rezultat al modificrii codonului mutaii misens; - oprirea sintezei proteinei, n cazul n care codonul format prin substituie este un codon STOP (UAA, UAG i UGA) mutaii nonsens; - pstrarea structurii iniiale (normale) a proteinei deoarece codonul rezultat prin substituie este sinonim cu cel modificat samesens mutaii.

. Substituia poate implica uneori i un codon non-sens sau stop: UAA sau UAG pot deveni CAA sau CAG, codoni care semnific glutamina. n acest caz sinteza polipeptidului continu pn la un nou codon stop. Un exemplu de elongaie a catenei l constituie o alt Hb anormal Hb CS (Hb Constant Spring) a crei caten alfa are 172 aminoacizi n loc de 141; secvena adiional de 31 aminoacizi ncepe ntr-adevr cu Glutamina. Substituia poate interesa doi sau chiar mai muli aminoacizi distinci, separai, din catena unui lan polipeptidic . De ex: Hb C-Harlem = 2 alfa 2 beta 6 GluVal; 73 AspAsn. Inversia va duce la modificarea unui codon i lectura sa n sens invers. Consecinele inversiei sunt aceleai ca i ale substituiei. Prin deleie se nelege lipsa a una sau a mai multe perechi de nucleotide din molecula de ADN. Natura anomaliei produse va depinde de numrul de perechi de nucleotide implicat n deleie. Dac lipsete o singur pereche de nucleotide se produce o decalare a fazei (cadrului) de lectur a codului genetic (mutaii frame shift); lectura este incorect i se sintetizeaz o protein n care toi aminoacizii, situai dincolo de locul deleiei, vor fi modificai (ex: Hb Wayne). Dac numrul de nucleotide deletate este multiplu de trei, atunci n catena polipeptidic determinat de gena mutant vor lipsi unul sau mai muli aminoacizi (n Hb Gun-Hill sunt abseni cinci aminoacizi din catena beta: 91-95) Uneori se poate realiza deleia complet a unei gene. n alfatalasemii nu se produc catenele alfa ale hemoglobinei pentru c gena corespunztoare lipsete din genom, n locul lor se sintetizeaz alte tipuri de lanuri: de ex: Hb H=4 beta sau Hb Bart=4 gama. Inseria sau adiia nseamn introducerea unui nucleotid n secvena unei gene; din punctul de inserie lectura codonilor se va face decalat, realizndu-se o protein cu secven anormal.

71

Crossing-overul inegal se poate produce dac nu are loc o mperechere perfect a omologilor. n rezultatul CO inegal se produce o rearanjare a secvenelor ADN i deci o modificate a structurii polipeptidelor codificate de aceste secvene (ex. Hb Lepore).

Reversia (mutaia supresiv) este o mutaie care intereseaz o alt mutant, determinnd revenirea la fenotipul normal (slbatic). Reversia adevrat transform codonul mutant n normal, iar reversia numit supresiv produce o a doua mutaie, diferit ca poziie ca prima dar care corijeaz efectul ei. Ex. Hb. Harlem prezint prima mutaie n catena beta 6 Glu-Val ca i Hb S dar efectul ei de transformare a hematiilor n secer este anulat de o a doua mutaie: beta 73 AspAsn. Situaia se repet i n cazul Hb Memphis/S: alfa 23 GluGln; beta 6 GluVal. Consecinele mutaiilor genice. Efectul primar al mutaiilor genice l reprezint modificarea secvenei aminoacizilor n moleculele polipeptidice, sintetizate pe baza informaiei acestor gene (ele sunt produsul primar al genei respective). Efectul biologic al acestei modificri depinde de tipul aminoacidului substituit i de locul su particular n molecula polipeptidic. Dac mutaiile vor modifica structura sau ritmul de sintez a unei enzime, atunci se produce o alterare (bloc complet sau parial) a unei ci metabolice. Efectul primar este urmat de o mulime de efecte secundare care vor determina un fenotip modificat.

72

Mutaiile pot afecta partea reglatoare sau partea codificatoare a genei. Modificarea secvenei nucleotidice a promotorului poate duce la schimbri cantitative n sinteza ARN i proteinei: - blocarea transcripiei lipsa produsului proteic modificri fenotipice prin deficien (de ex., fenilcetonuria, intolerana la zaharoz); - activarea continu a transcripiei sinteza unei cantiti mari de produs proteic modificri fenotipice prin exces (de ex., sinteza n cantiti mari a HbF i HbA2 duce la hemoliz i anemie). Modificarea secvenei nucleotidice a regiunii codificatoare, n special a exonilor, poate duce la schimbarea mesajului genetic i secvena de aminoacizi din protein, producnd schimbri calitative n sinteza produsului final: - sinteza unei proteine cu o activitate sczut (mutaie hipomorf); - sinteza unei proteine cu o activitate exagerat (mutaie hipermorf); - sinteza unei proteine inactive (mutaie amorf). Dup valoarea adaptiv i consecinele mutaiilor genice asupra structurii i funciei organismelor ele se pot mpri n mai multe grupe: - mutaii neutre care produc polimorfismul biologic intraspecific, variantele normale (de ex., grupele sanguine, serice sau tisulare); - mutaii deviante (defavorabile) care antreneaz un handicap mai mult sau mai puin sever i creeaz fie o stare de boal, fie o predispoziie la boal; unele dintre ele sunt mutaii letale sau subletale, afectnd decisiv viabilitatea i reproducerea individului; - mutaii evoluante cu valoare adaptiv mai mare ca normalul; ele produc indivizi mai bine adaptai, mai rezisteni la mediu. MUTAII DINAMICE n 1991 s-a descoperit o nou clas de alterri ale ADN, diferite de mutaiile clasice, mutaiile dinamice. Ele sunt reprezentate de creteri ale numrului unor repetri trinucleotidice situate n proximitatea sau chiar n interiorul genelor structurale. Mutaiile dinamice sunt caracterizate de instabilitate, exprimat prin creterea numrului de copii ale unitilor trinucleotidice, cu ocazia diviziunilor pe care le realizeaz celula purttoare.

Mutai e comple t Exist variaii ale numrului de repetri trinucleotidice: - polimorfisme ADN benigne; - premutaia secvena de ADN devine instabil, dar nu determin un fenotip patologic; - mutaia complet - prin expansiunea repetrilor trinucleotidice determinnd fenotip patologic. 73

Purttorii premutaiilor sunt fenotipic normali. Expansiunea repetrilor are loc n gametogenez. Astfel unii din gameii purttorilor sntoi vor conine mutaia complet, care la descendeni va produce un fenotip patologic. n gametogeneza ultimilor, din cauza instabilitii acestor repetri, vor aprea expansiuni adiionale, care la urmtoarea generaie va produce un fenotip patologic mai grav (=fenomenul de anticipaie). Frecvena (rata) mutaiilor Frecvena medie cu care se produce un eveniment mutaional particular, per celul (sau individ) i per generaie se numete rat de mutaie. Rata mutaiilor spontane variaz pentru diferii loci, ntre anumite limite: 1:25000 (sau 4x10-5) 1:1000000 (sau 1x10-6) per gamet i generaie. Exist variaii regionale. 1-2% din persoane au un efect determinat de mutaia unei gene; fiecare individ este heterozigot (purttor) de circa 610 gene recesive; fiecare individ este heterozigot (purttor) de circa 3-5 gene letale tot recesive (care dac vor fi n stare homozigot la descendeni vor produce moartea lor)

74

povar genetic

CURS 8
TEHNICI DE ANALIZ A GENELOR Tehnologia ADN recombinant a creat premisele dezvoltrii unor metode de diagnostic molecular dotate cu capacitate de rezoluie, grad de precizie i nivel informativ net mai superioare celor ale metodelor convenionale. Superioritatea absolut a abordrii moleculare rezult ns din faptul c spre deosebire de toate celelalte metode de diagnostic, limitate la determinarea exclusiv a trsturilor fenotipice, - analiza ADN, destinat nemijlocit studiului genotipului este singura n msur s obiectiveze alterrile primare (mutaiile) care se fac direct responsabile pentru starea de boal. Tehnicile ADN recombinant permit identificarea genelor normale i/sau a variantelor lor mutante, stabilirea purttorilor de gene mutante, diagnosticul prenatal sau presimptomatic al patologiilor genetice, iar n viitorul apropiat apare posibilitatea dezvoltrii terapiei genice. Studiul molecular al genelor poate fi realizat pe mai multe ci n dependen de scopul propus: - secvenierea ADN pentru determinarea structurii primare a genei; - tehnica Southern-blot pentru identificarea RFLPs; - tehnica Northen-blot pentru determinarea expresiei genelor (analiza ARNm); - tehnica Western-blot pentru determinarea produsului proteic al genei; - tehnica PCR pentru identificarea genei normale sau mutante, prin amplificarea specific a secvenelor de ADN, etc. n laboratoarele de biologie molecular se utilizeaz diverse variante ale metodelor menionate. Toate aceste metode se bazeaz pe diferite principii de manipulare a acizilor nucleici: - clivarea specific a ADN-ului genomic pentru obinerea fragmentelor de cercetat; - identificarea fragmentelor de ADN sau ARN de cercetat prin hibridare cu sonde specifice complementare secvenei int; - identificarea genelor normale sau mutante prin procesul de amplificare specific a ADN (PCR) reacie specificat de alegerea primerilor complementari genei / secvenei de interes; - vizualizarea fragmentelor de interes dup rezultatele electroforezei i marcarea specific al ADN sau ARN de cercetat, sau utilizndu-se programe computerizate de citire i interpretare a rezultatelor; - interpretarea rezultatelor este un proces complex, legat de fiecare tehnic i procedur n parte n concordan cu particularitile metodei utilizate.

Pentru separarea fragmentelor de acizi nucleici se utilizeaz electroforeza n gel de agaroz sau de poliacrilamid. Purtnd sarcin negativ, moleculele acizilor nucleici migreaz n cmpul electric, iar viteza de migrare depinde de greutatea molecular a fragmentelor cercetate - fragmentele mai scurte migreaz mai rapid, n timp ce fragmentele lungi migreaz mai lent. Pentru determinarea dimensiunilor fragmentelor de acizi nucleici, concomitent cu fragmentele de interes sunt supuse electroforezei n trecuri vecine i fragmente-marker ai lungimii. Moleculele acizilor nucleici pot fi vizualizate n gel prin colorare cu ageni chimici, marcare radioactiv sau fluorescent. n cazul marcrii radioactive fragmentele se identific cu ajutorul autoradiografiei care const n suprapunerea gelului cu un film fotosensibil.

75

SECVENIEREA ADN Secvenierea const n determinarea succesiunii nucleotidelor (bazelor azotate) dintr-un anumit segment al moleculei de ADN. Analiza secvenei bazelor azotate din structura ADN poate fi realizat prin dou ci: 1) calea chimic (Maxam-Gilbert), n care se folosesc reaciile chimice de clivare a ADN-ului n baze individuale, dar fiind o metod complicat i laborioas, n ultimii ani nu se mai utilizeaz; 2) calea enzimatic (Sanger) n care ADN-ul este sintetizat in vitro pe baza matriei ADN studiat, n aa fel nct reacia se termin specific n poziia care corespunde unei baze anumite. Pentru a determina o secven de nucleotide pe una din cile menionate, ADN-ul este supus seriei de patru reacii separate, fiecare reacie fiind specific pentru una din baze. Prin electroforez produii de reacie vor migra n patru curse paralele, pe acelai gel. Urmrind band cu band, poate fi identificat ordinea nucleotidelor n ADN.

Tehnica Sanger (dideoxi) utilizeaz sinteza enzimatic a unei catene, complementar cu o matri clonat. n cadrul acestei proceduri sinteza este stopat prin ncorporarea unui dideoxinucleozid trifosfat - un analog al dezoxiribonucleotidelor. Dideoxinucleozidtrifosfaii conin n poziia 3' grupa H, dar nu grupa OH care mpiedic polimerizarea nucleotidelor. Folosind patru analogi dedeoxi diferii n timpul sintezei catenei noi de ADN, se poate de identificat fiecare nucleotid normal din catena matri. Electroforeza fragmentelor obinute permite stabilirea ordinii nucleotidelor n molecula de ADN. n ultimii ani se utilizeaz o metod automat de secveniere, bazat pe metoda dideoxi. n scopuri de diagnostic a purttorilor de gene normale sau mutante se compar rezultatele secvenierii cu datele structurii primare normale a genei din bibliotecile de ADN. Spre regret, nu se cunoate nc secvena tuturor genelor umane, de aceea n diagnostic se utilizeaz metode indirecte: nlnuirea cu marcheri genetici apropiai (repetiii hipervariabile de ADN mini- i microsatelitic), determinarea situsurilor de restricie caracteristice genei date, hibridarea cu sonde alel-specifice etc. TEHNICA SOUTHERN-BLOT Tehnica Southern-blot se bazeaz pe analiza specific a unor fragmente de ADN genic/genomic obinute prin secionarea ADN-ului genomic cu una sau mai multe enzime de restricie. innd cont c enzimele de restricie nu acioneaz la ntmplare asupra ADN-ului, dar cliveaz ADN-ul bicatenar numai n anumite situsuri de restricie, la utilizarea unei enzime de restricie se obin fragmente de ADN bicatenar cu o lungime diferit (numrul i lungimea fragmentelor de restricie depind de harta de restricie pentru enzima utilizat). 76

Lund n calcul polimorfismil ADN / polimorfismul genic determinat de mutaii punctiforme, ne putem da seama c hrile de restricie la diferite persoane se pot deosebi. Diferenele dintre hrile de restricie obinute de la doi indivizi este numit Polimorfismul Lungimii Fragmentelor de Restricie (RFLP Restriction Fragment Lenght Polimorphism). Acest polimorfism poate fi folosit ca marcher genetic n evaluarea genotipului. Pentru analiza RFPLs a unor gene e necesar s se cunoasc localizarea specific a situsurilor de restricie. Aceast informaie e utila pentru compararea genelor normale cu genele mutante, pentru identificarea precoce a purttorilor de gene mutante patologice. Tehnica Southern-blot se bazeaz pe principiul RFLPs i vine cu o soluie destul de important pentru identificarea fragmentului de interes din amestecul de mii de fragmente diferite obinute prin digestia specific a ADN-ului genomic. Identificarea secvenei int se face pe baza hibridrii ADN-int cu o sond complimentar, radioactiv dup transferul fragmentelor de ADN de cercetat pe un suport solid - tehnica Southern-blot (de la numele inventatorului Edward Southern). Tehnica Southern-blot const din urmtoarele etape: extragerea din celule a ADN-ului genomic cu greutate molecular mare; digestia enzimatic a ADN-ului cu diferite ER, fiecare producnd fragmente de lungime diferit; separarea fragmentelor de restricie prin electroforez n gel de agaroz; denaturarea fragmentelor bicatenare cu o soluie alcalin; transferul capilar al fragmentelor de ADN pe membrane filtre de nailon sau nitroceluloz; hibridarea cu sondele monocatenare radioactive; autoradiografia pentru vizualizarea hibrizilor ADN int - ADN sond i interpretarea rezultatelor.

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7)

77

Extragerea ADN din celule nucleate

Restric?ia ADN genomic cu ER

Electroforeza FR

Denaturarea ADN ?i transferul FR pe membrane

Hibridare cu sonda

Autoradiografia

Vizualizarea ?i interpretarea rezultatelor

Etapele tehnicii Southern-blot

Datorit tehnicii Southern-blot se poate determina prezena sau lipsa unor situsuri de restricie caracteristice genei analizate care se asociaz cu anumite mutaii: - detectarea mutaiilor punctiforme ce implic situsurile de restricie (dispar sau apar noi situsuri de restricie), care se evideniaz prin modificarea numrului i lungimii fragmentelor de restricie; - detectarea mutaiilor prin deleii, duplicaii sau inserii ale unor fragmente polinucleotidice mai mari de 50-100p.b., care se evideniaz prin modificarea lungimii fragmentelor de restricie; - acestea permit diagnosticul prenatal sau presimptomatic al mutaiilor patologice i depistarea purttorilor heterozigoi de gene mutante. Metoda Southern blot are i limite: (1) nu permite detectarea mutaiilor punctiforme sau microdeleiilor la nivelul secvenelor de ADN dintre situsurile de restricie; (2) este laborioas, complex i scump. TEHNICA NORTHERN-BLOT Metoda Northern-blot const n transferul moleculelor denaturate de ARN pe filtre de nailon sau nitroceluloz, urmat de hibridarea cu sonde marcate. Aceast metod este similar tehnicii Southernblot cu deosebirea c ARNm extras i purificat nu este supus scindrii cu enzime, iar electroforeza decurge n condiii de denaturare. Tehnica Northern-blot permite identificarea transcripilor genelor analizate, cantitii de ARNm, stabilirea lungimii lor.

TEHNICA WESTERN-BLOT Aceast metod const n identificarea unei proteine specifice din amestecul de proteine celulare. Pentru aceasta, proteinele sunt separate prin electroforez n condiii de denaturare. Proteinele separate dup greutatea molecular sunt transferate pe filtre de nailon sau nitroceluloz i supuse tratrii cu anticorpi specifici marcai radioactiv sau fluorescent. Prin aceast metod se poate identifica prezena/lipsa proteinei, dimensiunile ei, rata de expresie a genei. 78

TEHNICA PCR N ANALIZA GENELOR Tehnica PCR poate fi utilizat pentru multiplicarea selectiv a unei secvene de ADN genic. Ca rezultat, se obin populaii omogene de fragmente care pot fi utilizate n studiile de genetic molecular sau n diagnostic.

Extragerea ADN

Pregtirea componentelor pentru PCR

Amplificarea ADN-int

Electroforeza produilor PCR

Vizualizarea produilor PCR Etapele analizei PCR

Autoradiografia i interpretarea rezultatelor

Pentru a realiza amplificarea unei secvene este necesar cunoaterea structurii genei normale sau mutante i sinteza primerilor specifici complementari capetelor fragmentului de interes. Primerii reprezint secvene oligonucleotidice monocatenare de 20-30 baze care sunt obinute prin sintez artificial. PCR se bazeaz pe hibridarea ADN int - primer i replicarea semiconservativ a ADN. Avantajele tehnicii PCR sunt urmtoarele: necesitatea cantitilor mici de ADN, rapiditatea ei (n cteva ore se obin milioane copii de ADN), iar specificitatea primerilor permite amplificarea selectiv a ADN i, de menionat c, produsele de amplificare pot fi utilizate n calitate de sonde pentru hibridri n alte tehnici. Aplicaiile practice ale tehnicii PCR: - detectarea mutaiilor cunoscute la bolnavi i purttori, n diagnosticul prenatal i presimptomatic al bolilor ereditare; - determinarea genelor de predispoziie la bolile comune (coronaropatii, boala hipertonic, tulburri psihice etc.); - diagnosticul precoce i evaluarea pronosticului bolilor canceroase; - determinarea prenatal a sexului; - identificarea agenilor patogeni (virui, bacterii); - dactiloscopia genomic n identificarea persoanelor, analiza filiaiei (paternitate, maternitate); - tipizarea HLA.

79

Utilizarea tehnicii PCR pentru identificarea mutaiilor punctiforme cu primeri specifici pentru gena normal

Utilizarea tehnicii PCR pentru identificarea deleiilor

Hibridarea in situ Hibridarea in situ reprezint o tehnic molecular, n care o sond specific marcat poate identifica direct pe preparatele celulare: (1) o gen pe un anumit cromozom sau fragment de cromozom; (2) un ARNm ntr-o celul particular sau esut; (3) numrul moleculelor de ARNm n dependen de perioada ontogenetic sau tip tisular; (4) ADN viral; (5) deleiile cromozomiale submicroscopice; (6) genele responsabile de producerea cancerului, localizarea i nivelul lor de expresie. n ultimii ani se utilizeaz metoda FISH (Fluorescence In Situ Hibridization) care utilizeaz sonde fluorescent marcate. Metoda FISH este simpl, poate fi aplicat pe preparate celulare arhivate, este rapid, nu modific morfologia celulelor.

Tehnica FISH

80

CURS 9
CARACTERE EREDITARE RELAIA GENOTIP - FENOTIP Definirea biologic a unui individ este determinat de ansamblul unor caractere morfologice, fiziologice, biochimice, psihice i comportamentale fenotipul, controlate de aciunea, n diferite proporii, a factorilor ereditari i a celor de mediu. Sistemul de gene din setul diploid de cromozomi al unui individ, care determin formarea unui anumit fenotip se numete genotip. Caracterele, la formarea crora genotipul particip ntr-o proporie mai mare de 50% poart denumirea de caractere ereditare. Caracterele ereditare pot avea determinism monogenic sau poligenic (multifactorial). CARACTERISTICA GENELOR ALELE I NEALELE Genele alele sunt localizare n loci identici pe cromozomi omologi i controleaz acelai caracter sau forme alternative ale aceluiai caracter. Genele alele se pot prezenta n mai multe forme moleculare diferite polialelism, dar n genotip, la o persoan, sunt prezente numai dou alele o pereche (excepie - pe cromozomii X i Y la brbai este prezent doar o alel pentru fiecare gen). Fiecare individ poart circa 30 mii perechi de gene alele, dup unele este homozigot - purttor de gene alele identice, dup altele este heterozigot purttor de gene alele diferite i hemizigot dup genele nlnuite cu cromozomul X la brbai. n cazul heterozigoiei se manifest alela cu o activitate mai mare (gena dominant) fa de a doua (gena recesiv). Astfel sunt alele: - cu activitate moderat normomorfe; - cu activitate mrit hipermorfe; - cu activitate mic hipomorfe; - neactive amorfe; - cu funcie nou neomorfe. Manifestarea fenotipic a unei alele depinde i de alte gene nealele i de factorii de mediu. n timpul transmiterii: n meioz, genele alele se separ n gamei diferii segreg, iar la fecundare se combin ntmpltor formnd diferite genotipuri, determinnd segregarea caracterelor ce reprezint baza legilor ereditii mendeliene. Alelele unui individ una este de origine matern i alta de origine patern. Individul homozigot produce gamei identici dup alela dat, iar individul heterozigot produce gamei diferii 50% vor conine o alel i 50% vor conine cealalt alel. Gene nealele sunt localizate n loci diferii ai cromozomilor i, de regul, controleaz caractere diferite sau coopereaz pentru formarea unui caracter complex. Se manifest fenotipic independent una fa de alta sau interacioneaz determinate de: o efectul poziiei genelor dintr-un haplotip; o epistazie; o aciunea complimentar; o poligenia aditiv. Genele nealele se transmit: - n bloc nlnuit, dac se afl pe acelai cromozom i formeaz grup de nlnuire, haplotipuri; - independent, dac se afl pe cromozomi diferii. 81

Combinarea independent a genelor nealele din cromozomi neomologi

Transmiterea nlnuit a genelor localizate ntr-un cromozom

CARACTERE MONOGENICE MENDELIENE Caracterele monogenice sunt caracterele controlate de o singur pereche de gene alele (conform dogmei genetice: o pereche de gene un caracter). Exemple de caractere monogeneice normale pot fi: - grupele de antigene eritrocitare (AB0, Rh, MN, Xg, etc.); - grupele serice (haptoglobine, transferine, etc.); - grupele enzimatice; - antigenii tisulari (HLA). Caracterele monogenice reprezint produsul interaciunii a dou alele, ntre care pot exista relaii de dominan / recesivitate sau codominan; se transmit mendelian i respect legile monohibridrii.

Exprimarea fenotipic n populaie a caracterelor monogenice este de regul bimodal (de ex., 75% din populaie are Rh+, iar 25% - Rh-). Unele caractere monogenice prezint mai multe forme alternative polimorfisme determinate de existena alelelor multiple i/sau interaciunea cu ali factori ereditari sau neereditari (de ex., mai multe variante de grupe sangvine dup sistemul AB0 I [0], II [A1 sau A2], III [B], IV [A1B sau A2B]). Caracterele monogenice pot fi att normale (de ex., grupele sangune, grupele serice, antigenii tisulari, etc.), ct i patologice (de ex., polidactilia, albinismul, fenilcetonuria, hemofilia, daltonismul, unele forme ale displaziei smalului dentar, etc.).

82

DETERMINISMUL UNOR CARACTERE EREDITARE NORMALE

Localizare pe cromozom 1 ? 19 Relaiile dintre alele Dominan / recesivitate Dominan / recesivitate Dominan / recesivitate Dominan / recesivitate Grupe sangvine AB0 0, A1, A2, B 9 Codominan Grupe sangvine MN Haptoglobine Grupe sangvine Xg M, N 4 Codominan Codominan Dominan / recesivitate

Caracterul Factorul Rhesus Gusttor Secretor

Alele D, d G, g Se, se

Genotipuri DD, Dd dd GG, Gg gg SeSe, Sese sese 00 A1A1, A1A2, A10 A2A2, A20 BB, B0 A1B A2B MM MN NN Hp1Hp1 Hp1Hp2 Hp2Hp2 Xg(a+)Xg(a+), Xg(a+)Xg(a-), Xg(a+)Y Xg(a-)Xg(a-), Xg(a-)Y

Fenotipuri Rh+ RhGusttor Negusttor Secretor Nesecretor 0 (I) A1 (II) A2 (II) B (III) A1B (IV) A2B (IV) M MN N Hp1-1 Hp1-2 Hp2-2 Xg+ Xg-

Hp1, Hp2 Xg(a+), Xg(a-)

16

Unele gene au aciune unic (o gen un caracter), altele au aciune multipl, pleiotrop (o

gen controleaz formarea mai multor caractere). n dependen de capacitatea de manifestare fenotipic caracterele pot fi: dominante, intermediare i recesive. Gena ce se manifest att la homozigoi ct i la heterozigoi se numete alel dominant (A), iar cea care se manifest doar n stare homozigot alel recesiv (a). Fiecare individ este heterozigot pentru unii loci i este homozigot pentru alii. ntre genele alele pot exista mai multe tipuri de relaii interaciuni alelice: - dominare complet la heterozigoi se manifest alela dominant (de ex., indivizii DD sau Dd prezint Rh+, iar dd prezint Rh-); - dominare incomplet la heterozigoi se formeaz un caracter intermediar (de ex., HbAHbA hemoglobin normal 100% eritrocite normale; HbAHbS anemie form uoar, 50% eritrocite normale i 50% eritrocite n form de secer; HbSHbS anemie form letal, 100% eritrocite n form de secer); - codominare la heterozigoi se manifest ambele alele (de ex., grupa sangvin IV A1B sau A2B). Manifestarea fenotipic a caracterelor monogenice poate fi influenat i de gene nealele din acelai grup de nlnuire sau din grupuri diferite interaciuni nealelice:

83

epistazia fenomenul cnd o gen (epistatic) influeneaz activitatea unei alte gene nealele (hipostatic). De ex., gena h n stare homozigot blocheaz expresia genelor sistemului AB0 fenotipul Bombay: o persoanele cu genotip HHBO sau HhBO prezint antigeni B pe eritrocite, iar o persoanele cu genotip hhBO nu prezint antigeni B pe eritrocite. - aciunea complementar a genelor pentru formarea unui caracter coopereaz diferite gene prin aciunea concomitent a produilor lor (de ex., hemoglobina A este rezultatul expresiei genelor globinei de pe cromozomul 16 i -globinei de pe cromozomul 11); - efectul poziiei - activitatea unei gene este influenat de alte gene sau secvene nvecinate; modificarea secvenelor nvecinate pot duce la inhibarea sau activarea defectiv a genei. Genotipul se afl sub influena diferitor factori genetici sau negenetici, interni sau externi ce pot influena capacitatea de manifestare fenotipic a genei: - penetrana reprezint frecvena cu care o gen se manifest fenotipic la indivizii heterozigoi; penetrana poate fi complet (toi heterozigoii prezint caracterul dominant) sau incomplet (doar o parte dintre heterozigoi prezint caracterul dominant); - expresivitatea reprezint gradul sau severitatea de manifestare fenotipic a unei gene (de ex., forme complete sau incomplete ale unui sindrom, forme uoare sau forme grave ale unei patologii). CARACTERE MONOGENICE NON-MENDELIENE Majoritatea caracterelor monogenice normale sau anormale se transmit dup regulile lui Mendel avnd o manifestare distinct n dependen de genotipul persoanei, prezentnd i unele excepii determinate de interaciuni cu alte gene sau cu factorii de mediu penetrana incomplet sau expresivitatea variabil. Dar exist caractere ce prezint abateri de la regulile mendeliene care sunt determinate de fenomene genetice neobinuite: - instsbilitatea genelor; - amrentarea genomic; - disomia uniparental; - mozaicizmul, - ereditatea mitocondrial. Penetrana reprezint frecvena cu care o gen se manifest fenotipic la indivizii heterozigoi. Penetrana poate fi complet (toi heterozigoii prezint caracterul dominant) sau incomplet (doar o parte dintre heterozigoi prezint caracterul dominant). Cauzele non-penetranei unei gene pot fi interaciunile genelor nealele de tipul epistaziei, efectului poziiei sau pot fi factorii de mediu.

Un exemplu de non-penetran a genei B, fenotip Bombay, n cazul epistaziei recesive ntre genele H i ABO.

Expresivitatea reprezint gradul sau severitatea de manifestare fenotipic a unei gene la diferii indivizi cu acelai genotip. Cauzele expresivitii variabile pot fi interaciunile genice sau factorii de mediu i se manifest prin forme complete sau incomplete ale unei patologii, forme uoare sau forme grave ale unei patologii, etc..

84

Expresivitatea variabil a genei polidactiliei la indivizii heterozigoi: I-1 are ase degete la piciorul drept, II-4 are cte ase degete i la mni i la picioare, II-5 numai la picioare, III-4 la piciorul stng, III-5 la mna i piciorul stng, III-6 la ambele mni i III-8 are ase degete numai la mna dreapt.

Instabilitatea genelor n irul generaiilor este determinat de mutaii dinamice. Ele sunt reprezentate de creterea numrului de copii ale unor repetri trinucleotidice situate n proximitatea sau chiar n interiorul genelor structurale, cu ocazia diviziunilor pe care le realizeaz celula purttoare. Exist variaii ale numrului de repetri trinucleotidice: - polimorfisme ADN benigne; - premutaia secvena de ADN devine instabil, dar nu determin un fenotip patologic; - mutaia complet - prin expansiunea repetrilor determinnd fenotip patologic. Purttorii premutaiilor sunt fenotipic normali. Expansiunea repetrilor are loc n gametogenez. Astfel unii din gameii purttorilor sntoi vor conine mutaia complet, care la descendeni va produce un fenotip patologic. n gametogeneza ultimilor, din cauza instabilitii acestor repetri, vor aprea expansiuni adiionale, care la urmtoarea generaie va produce un fenotip patologic mai grav (=fenomenul de anticipaie).

Mutaie complet

Amprentarea genomic este un proces genetic implicat n reglarea activitii genelor, n special prenatal, controlnd dozajul genetic prin inactivarea selectiv a genelor de origine matern sau patern. 85

Mecanismele amprentrii gnelor nu sunt pe deplin elucidate. Unul din acestea ar putea fi determinat de metilarea ADN proces asociat cu inactivarea genei. De exemplu, gena Igf-2 ce controleaz sinteza unuia dintre factorii de cretere poate fi implicat n procesul de cretere (talia). Mutaia acestei gene este implicat n apariia nanismului, n cazul dac este motenit pe linie patern. Astfel indivizii heterozigoi (Na) pot avea fenotip normal dac gena mutant (a) este de origine matern sau sunt cu hipostatur (pitici) dac gena (a) are origine patern. Duplicaia genei normale (N NNa) poate cauza supracreterea dac este motenit pe linie patern sau prezint fenotip normal dac motenete pe linie matern. Disomia uniparental este fenomenul, cnd zigotul conine doi cromozomi omologi motenii de la acelai printe. Ea apare ca rezultat al nedisjunciilor cromozomilor n meioza matern sau patern, urmat de eliminarea postzigotic a cromozomului supranumerar de cealalt origine. O alt cauz a apariiei disomiei uniparenatale ar putea fi translocaia robertsonian. Astfel, persoanele cu disomie uniparental motenesc de la un singur printe alelele pentru anumite caractere, nlnuite cu cromozomul disomic. Dar, n dezvoltare exist o contribuie difereniat a informaiei din cromozomii materni i paterni (dozaj genetic). Totodat prezena ambelor genomuri parentale este esenial pentru dezvoltarea feilor viabili. Necesitatea existenei materialului genetic a ambilor prini a fost demonstrat prin consecinele disomiei uniparentale. Sindromul Prader Willi i sindromul Angelman sunt determinate de amprenarea genei Snrpn cu localizare n cromozomul 15q11-13. n cazul sindromului Prader Willi s-a identificat disomia uniparental matern a cromozomului 15, care se manifest fenotipic prin retard mintal moderat, obezitate i hipostatur. Sindromul Angelman rezult prin disomie uniparental patern, manifestndu-se fenotipic prin retard mintal sever i ataxie. n disomia uniparental matern a cromozomului 7 au fost depistat retard de cretere.

CARACTERE EREDITARE NORMALE POLIGENICE Caracterele poligenice sunt controlate de mai multe gene nealele, care acioneaz independent unele de altele (nu exist relaii de dominan / recesivitate sau epistazie), care, de regul, au efecte cantitative mici aditive. Caracterul poligenic prezint o distribuie continu n populaie (distribuie normal gaussian) i nu exist clase fenotipice distincte, specifice transmiterii monogenice. Fiecare individ din populaie difer, uneori aproape imperceptibil, de toi ceilali. Expresia caracterelor poligenice este influenat de mediu, de aceea pot fi numite caractere multifactoriale. Exemple de caractere poligenice normale pot fi menionate: distribuia pigmentaiei pielii, talia, masa corpului, inteligena, Modelul de motenire a pigmentaiei tegumentelor la om dermatoglifele, etc. pe exemplul a trei perechi de gene

86

Culoarea pielii depinde de mai muli factori: grosimea i transparena epidermei; starea circulaiei la nivelul vaselor subepidermice; cantitatea de pigment melanic i distribuia acestuia (cel mai important). Cantitatea de melanin din piele este determinat de 2-6 perechi de gene. Modelul de motenire a pigmentaiei tegumentelor este reprezentat n figurile alturate. Fiecare alel dominant (A, B, C) determin sinteza unei anumite cantiti de melanin, iar alele recesive (a, b, c) sunt inactive. Cantitatea de melanin, i ca rezultat intensitatea pigmentaiei, depinde de sumarea dozelor genelor dominante, fenomen numit poligenie aditiv (cumulativ).
Distribuia normal (Gaussian) n populaie pigmentaia pilelii

VALOAREA CUNOATERII CARACTERELOR EREDITARE NORMALE Din punct de vedere teoretic, cunoaterea ereditii caracterelor normale la om permite: demonstrarea valabilitii legilor lui Mendel; studiul funciei genice; evidenierea unor fenomene genetice cunoscute la alte specii (himerele, dubla fecundare, recombinarea genetic, nedisjuncia meiotic); investigarea localizrii genelor pe cromozomi i stabilirea "hrilor genetice" (utilizarea caracterelor normale ca marcheri i analiza fenomenelor de nlnuire genic ntre genele normale care le determin i alte gene, normale sau anormale); elucidarea unor aspecte de genetic a populaiilor. Din punct de vedere practic, cunoaterea ereditii caracterelor normale la om permite: elaborarea testelor de identificare a persoanei (fiecare individ are o combinaie specific, unic, de caractere ereditare normale - ex. dermatoglife unice, combinaie HLA specific, etc.); stabilirea compatibilitatii ntre donator i recipient (grupe sanguine - pentru transfuzii; grupe tisulare, sanguine - pentru transplanturi); expertiza filiaiei i paternitii, diagnosticul gemenilor monozigoi (concordan 100% pentru caracterele monogenice, 95% pentru dermatoglife) i dizigoi; elaborarea testelor de diagnostic n diferite boli: diagnosticul unor afeciuni prin studiul nlnuirii genelor anormale cu anumite gene normale (ex. elipsocitoza - locus nlnuit cu locusul Rh); relaii ntre sistemul HLA i predispoziia sau rezistena fa de anumite boli; prezena unor modificri ale dermatoglifelor n unele anomalii cromozomice (de ex. sindromul Down - pliu palmar transvers unic, triradius axial t' sau t", exces de bucle cubitale).

87

CURS 10
STUDIUL CARACTERELOR EREDITARE Caracterele ereditare normale sau anormale (bolile genetice) se caracterizeaz prin determinism monogenic, poligenic sau multifactorial. De regul, determinismul genetic al caracterelor se stabilete odat cu formarea genotipului individului la fecundare. Astfel, caracterele ereditare au un ir de particulariti prin care se deosebesc de cele neereditare: - sunt produse prenatal; - au manifestare congenital; - se transmit genealogic; - sunt familiale; - sunt concordante la gemenii monozigoi; - se asociaz cu marcheri genetici; - au o distribuie populaional specific. De fapt aceste particulariti luate fiecare n parte, nu au o valoare absolut deoarece unele dintre ele se pot ntlni i la caracterele i bolile neereditare dar, atunci cnd ele se asociaz mai multe deodat la un caracter, semnific, de obicei, natura ereditar. PARTICULARITILE CARACTERELOR EREDITARE 1. Determinismul genetic Fiecare caracter ereditar este determinat de interaciunea genotip factorii de mediu. Gena sau genele motenite determin un caracter fenotipic prin: - sinteza unor proteine specifice (caracter elementar); - realizarea funciei specifice a proteinei la nivel de celul i/sau esut; - manifestarea unui anumit caracter (normal sau patologic) la nivel de organism caracter fenotipic. 2. Determinismul prenatal Constituia genetic a fiecrui individ se stabilete n momentul formrii zigotului, iar fenotipul se formeaz prin expresia difereniat a genelor motenite (caractere de specie, caractere normale individuale, anomalii). Caracterele ereditare sunt determinate pn la natere, dei se pot manifesta la diferite etape ale ontogenezei. Dar, n perioada prenatal, organogeneza poate fi influenat i de factorii mediului, producnd anomalii de dezvoltare neereditare (de ex., fenocopiile). 3. Manifestarea congenital Manifestarea congenital reprezint prezena caracterului sau a bolii nc de la natere. Majoritatea caracterelor i bolilor ereditare sunt prezente la natere, dar exist i excepii, cnd ele se manifest mai trziu la o anumit vrst, mai precoce sau mai tardiv (de ex., hipodonia, miopatia, coreea Huntington etc.). Dar, exist i afeciuni neereditare cu manifestare congenital (de ex., fetopatia rubeolic, fetopatia alcoolic, boala constriciilor amniotice). 4. Transmiterea genealogic Transmiterea genealogic reprezint motenirea unui caracter de la prini i transmiterea lui la descendeni. Este cunoscut c caracterele i bolile ereditare se transmit din generaie n generaie. Dar exist i unele care nu se transmit: - datorit decesului precoce a persoanelor afectate (bolnavii cu hemoglobinopatii severe); - datorit sterilitii persoanelor afectate (de ex., sindromul Morris - testicul feminizant); - apariia unor mutaii noi care ar putea s se transmit generaiilor urmtoare; - boli recesive rare. Exist i boli neereditare care se pot transmite de la o generaie la alta (de ex., transmiterea mam - ft a sifilisului, SIDA etc.). Analiza transmiterii genealogice este un lucru esenial n stabilirea naturii ereditare a unui caracter sau a unei boli deoarece transmiterea ereditar se face dup nite reguli stricte, matematice (ex: legile lui 88

Mendel), n timp ce transmiterea neereditar are un caracter aleator, n funcie de condiiile momentane de mediu. 5. Distribuia familial Distribuia familial reprezint frecvena crescut a anomaliei / caracterului la membrii nrudii ai aceleiai familii, comparativ cu frecvena din populaia general (concentrare familial a caracterului). Majoritatea bolilor ereditare prezint o net distribuie familial, dei exist i boli ereditare cu apariie sporadic (de ex., anomaliile cromozomice care apar sporadic deoarece de obicei determin anomalii de reproducere). Exist i boli neereditare care pot prezenta distribuie familial atunci cnd membrii familiei sufer influena unor condiii similare de mediu (de ex., gua endemic, tuberculoza, intoxicaiile, unele infecii etc.). 6. Concordana caracterului la gemenii monozigoi Caracterele monogenice, pur ereditare sunt totdeauna identice la gemenii monozigoi (100 % concordan), iar cele neereditare sau multifactoriale pot fi discordante. Cnd concordana unui caracter este regula, iar discordana excepie, se vorbete despre caractere determinate parial ereditar (caractere multifactoriale). In cazul caracterelor ecologice, concordana este egal cu discordana la gemenii monozigoi. 7. Frecvena diferit n populaii diferite Anumite caractere ereditare prezint frecvene diferite n populaii genetic diferite. Aceasta se explic prin concentrarea anumitor gene ntr-o anumit regiune. De exemplu: - deficiena n G6PD (glucozo-6-fosfat-dehidrogenaza) sau unele hemoglobinopatii (de ex., sicklemia) sunt mai frecvente n zonele cu malarie, deoarece heterozigoii pentru aceste afeciuni sunt rezisteni la plasmodiul malariei; - n izolatele umane (geografice, etnice sau religioase), prin cstorii consangvine se creeaz un fond crescut de alele comune (de ex., n majoritatea populaiilor din Europa frecvena albinismului este 1:20000, iar ntr-un izolat din regiunea Bihorului, Romnia este de 1:100). 8. Prezena anomaliilor cromozomice Toate afeciunile care se nsoesc de anomalii cromozomice de numr sau de structur (vizibile la analiza cariotipului) sunt anomalii genetice (ereditare). Dar nu toate bolile ereditare se nsoesc de anomalii cromozomice (de ex., bolile ereditare produse prin mutaii genice sau poligenice se nsoesc de un cariotip normal). Cariotipul normal nu exclude deci existena unui caracter ereditar anormal la subiectul cercetat. 9. Asocierea cu marcheri genetici Unele caractere fenotipice anormale se pot asocia cu marcheri genetici specifici uor detectabili, de obicei caracteristici pentru o familie, la care se refer: - o anumit secven ADN, reprezentnd o gen normal, localizat n vecintatea genei patologice; - un microsatelit aflat n vecintatea sau interiorul unei gene patologice; - un situs de restricie. Asocierea se poate explica prin urmtoarele fenomene: - transmiterea nlnuit a genelor ce formeaz haplotip (de ex., asocierea Rh - eliptocitoz); - o gen favorizeaz apariia unei anumite tulburri (ex. asocierea HLA-B27 - spondilit anchilozant). Numai asocierea criteriilor prezentate permite stabilirea naturii ereditare a unui caracter. Criteriile luate separat, nu au valoare practic.

89

METODE DE STUDIU UTILIZATE N GENETICA UMAN n genetica uman, pentru a stabili natura ereditar a unui caracter se utilizeaz mai multe metode ce au ca int urmtoarele: - analiza materialului genetic cu depistarea direct sau indirect a mutaiilor, analiza marcherilor genetici (metode molecular-genetice, metode citogenetice); - analiza produsului genic primar (proteina), depistarea defectelor de metabolism (metode biochimice); - studiul transmiterii ereditare a caracterelor normale i patologice n familie (metoda genealogic); - stabilirea ponderii factorilor genetici i factorilor de mediu n geneza unui caracter normal sau patologic (metoda gemenilor); - stabilirea structurii genetice a populaiei (metoda populaional-statistic). METODE MOLECULAR GENETICE Metodele molecular-genetice sunt bazate pe tehnologia ADN recombinant i include mai multe tehnici de studiu a secvenei nucleotidelor n ADN i expresiei genice la nivel de ARN. Acestea au ca scop depistarea genelor normale sau mutante responsabile de un anumit caracter, modificrile genice asociate cu un anumit fenotip, unele particulariti de organizare a ADN-ului asociate cu anumite anomalii marcheri genetici (minisatelii, situsuri de restricie, metilarea ADN-lui etc.), analiza expresiei genelor (expresia specific de esut, ntr-o anumit perioad a ontogenezei, rata expresiei). n dependen de scopul studiului se pot folosi mai multe metode bazate pe: - secvenierea ADN; - tehnica PCR; - tehnica Southern-blot; - tehnica Northern-blot, etc. Analiza acizilor nucleici este util n: - depistarea purttorilor de mutaii genice; - diagnosticul prenatal sau postnatal a unor boli genice; - depistarea genelor de predispoziie la boal; - analiza filiaiei (maternitate / paternitate); - stabilirea identitii biologice (criminologie); - depistarea ADN-ului (ARN-ului) strin n diagnosticul infeciilor. n figura din stnga se prezint: A. o familie cu dou generaii, unde ambii prini sunt sntoi i au 5 copii dintre care doi prezint semnele clinice ale fenilcetonuriei (afeciune autozomal rcesiv); B. rezultatele electroforezei produilor PCR a tuturor membrilor familiei respective; I-1, I-2, II-3, II-5 sunt heterozigoi (Na), II-2 i II-4 sunt homozigoi dup alela recesiv patologic (aa), iar II-1 este homozigot dominant dup alela normal (NN).

90

METODE CITOGENETICE Metodele citogenetice includ diverse tehnici de analiz microscopic a materialului geneic la nivel de celul: - analiza cromozomilor metafazici i prometafazici (cariotiparea); - teste de citogenetic molecular pe cromozomi interfazci (FISH, mFISH, SKY); - testul Barr pentru analiza cromatinei sexuale X; - testul F pentru analiza cromatinei sexuale Y. Cariotiparea reprezint analiza setului de cromozomi din celulele somatice n diviziune pentru aprecierea numrului, formei i mrimii cromozomilor, utiliznd diferite tehnici de colorare / vizualizare. Astfel, analiza plcilor metafazice sau prometafazice permite depistarea diferitor anomalii cromozomice de numr sau de structur implicate n sindroame plurimalformative, neoplazii, stri intersexuale. Analiza cromozomilor interfazici, bazat pe hibridizarea in situ permite stabilirea unor anomalii cromozomice submicroscopice (microdeleii sau microduplicaii) sau stabilirea poziiei unor gene n cromozomi. Testul cromatinei sexuale permite diagnosticul sindroamelor cromozomiale cu implicarea heterozomilor X sau Y i stabilirea sexului genetic. Cromatina sexual X (corpusculul Barr) poate fi uor vizualizat pe preparate citologice n interfaz (numrul corpusculilor Barr + un cromozom X = numrul cromozomilor X n celula analizat). METODE BIOCHIMICE Spectrul de metode biochimice presupune analiza produsului primar al expresiei genice proteina, precum i a metaboliilor controlai de aceast protein. Sunt utilizate metode calitative i cantitative specifice unui anumit tip de metabolii. Aceste tehnici sunt indicate n: - diagnosticul unor boli monogenice enzimopatii; - diagnosticul unor boli multifactoriale; - stabilirea unei predispoziii la boal. De exemplu, prin analiza electroforetic a proteinelor serice se poate stabili polimorfismul individual i, indirect, constituia genetic a individului (genotip homozigot sau heterozigot). METODA GENEALOGIC Una dintre particularitile caracterelor ereditare este concentrarea lor familial i transmiterea de la o generaie la alta. Metoda genealogic presupune analiza familial, identificarea persoanelor cu un anumit caracter i urmrirea acestuia pe parcursul mai multor generaii. Aceasta este important pentru stabilirea tipului de transmitere a caracterului i calcularea probabilitii de reapariie a caracterului ereditar la descendenii unui cuplu. Studiul genealogic se realizeaz n mai multe etape: - anamneza familial; - analiza clinic i paraclinic a membrilor familiei; - ntocmirea arborelui genealogic; - analiza tipului de transmitere a caracterului; - stabilirea genotipurilor persoanelor din familia studiat i calcularea probabilitii de manifestare a unui fenotip normal sau patologic; - sfat genetic. Anamneza familial este primul pas n obinerea informaiilor despre prezena unui anumit caracter ntr-o familie. De regul, informaia este obinut de la proband (cazul princeps persoana ce se adreseaz dup sfat genetic). Datele despre structura familiei sunt nregistrate n fie speciale de consult genetic i sunt completate pe baza informaiilor obinute din analiza familial. 91

Analiza familial include chestionarea rudelor probandului (cel puin 2-3 generaii), analiza clinic i paraclinic a probandului i a rudelor afectate i sntoase, analiza fielor medicale personale, efectuarea testelor genetice (n dependen de caz cariotip, cromatin sexual, analiza ADN, studiul nlnuirii cu marcheri genetici). Toate aceste informaii pe de o parte completeaz istoricul familiei, pe de alt parte concretizeaz tipul anomaliei sau afeciunii (diagnostic clinic precis). Fiele de consult genetic includ urmtoarele date: (a) dac probandul este copil evoluia sarcinii, boli acute sau cronice ale mamei i medicamente administrate n timpul sarcinii, expunerea la ageni teratogeni sau mutageni; vrsta prinilor; prezena consangvinitii; naterea la termen sau prematur, durata travaliului, natere natural sau prin manevre obstetricale; date despre nou-nscut greutatea i talia la natere, scor Apgar; evoluia postnatal. (b) dac probandul este adult evoluia pubertii, funcia reproductiv (normal sau perturbat: sterilitate, avorturi spontane, nou-nscui mori sau nou-nscui vii malformai); locul de munc, expunere la noxe. Analiza familial este util pentru diferenierea unei anomalii congenitale neereditare de o boal ereditar propriu-zis. ntocmirea arborelui genealogic. Arborele genealogic este reprezentarea grafic, cu ajutorul unor semne convenionale, a rezultatelor anchetei familiale i servete la stabilirea tipului de transmitere n cazul n care acesta este ereditar. Stabilirea tipului de transmitere a caracterului n cazul cnd acesta este ereditar, se efectueaz n conformitate cu criteriile de recunoatere (prezena caracterului n fiecare generaie sau discontinuitate n transmitere; raportul prezenei caracterului la cele dou sexe). Transmiterea poate fi monogenic sau poligenic, autozomal, sau lincat cu cromozomii sexuali, determinat de alele dominante sau recesive. n dependen de tipul de transmitere, se stabilete genotipul persoanelor sntoase i afectate, se calculeaz riscul de recuren (probabilitatea apariiei anomaliei analizate la descendeni). Rezultatele analizei genealogice a familiei stau la baza unui consult genetic adecvat pentru: - informarea obiectiv a familiei; - planificarea familiei; - opiuni pentru diagnosticul prenatal n scop de prevenire a naterii copiilor cu anomalii; - prevenirea manifestrii unor complicaii n cazul bolilor genetice cu manifestare la adult. METODA GEMENILOR Prin analiza comparativ a unui caracter la gemenii monozigoi i gemenii dizigoi se poate urmri o concordan sau discordan care poate fi asociat cu ponderea factorilor genetici i de mediu n manifestarea unui fenotip. Gemenii monozigoi (GMZ) provin din acelai zigot i ca urmare sunt genetic identici. De regul GMZ, avnd genotip identic, au caractere ereditare asemntoare (concordan) i difer doar dup caracterele influenate de mediu (discordan). Gemenii dizigoi (GDZ) sunt gemeni provenii din fecundarea a dou ovule diferite de ctre doi spermatozoizi, ei difer genetic ca oricare membru al unei fratrii fa de ceilali. Pentru stabilirea cotei factorilor genetici i celor de mediu n formarea unui caracter, se calculeaz coeficientul de ereditate (H): Concordan aGMZ Concordan aGDZ H x100% 100% Concordan aGDZ Concordana GMZ sau GDZ reprezint procentul de asemnare dup un anumit caracter la mai multe perechi de gemeni (valori statistice veridice). Cu ct raportul este mai apropiat valoric de 100%, participarea factorilor genetici n determinismul caracterului este mai mare. Coeficientul are valoarea 100% pentru caracterele pur ereditare (concordana la gemenii monozigoi este de 100%). La valorile H cuprinse ntre 100-70% factorul ereditar are rol major, preponderent; ntre 70-40% caracterul este format sub influena mediului dar cu predispoziie genetic; mai puin de 40% - caracterul este ecologic. 92

n prezent metoda gemenilor se utilizeaz pentru stabilirea rolului factorilor genetici i de mediu n longevitate, manifestarea talentului, sensibilitatea la medicamente, etc. Caracterul analizat Sexul ABO Dermatoglife Reumatism Diabet zaharat Concordana la GMZ (%) 100 100 95 60 30 Concordana la GDZ (%) 58 65 60 34 16 H (%) 100 100 88 40 17 Tipul caracterului Genetic Genetic Genetic Cu predispoziie genetic Ecologic

METODA POPULAIONAL-STATISTIC Populaia uman reprezint totalitatea indivizilor ce locuiesc pe un anumit teritoriu, ntre care are loc schimb permanent de informaie ereditar. Structura genetic a unei populaii se poate deosebi de alta datorit existenei unui genofond particular determinat de suma genotipurilor indivizilor din aceast populaie. S-a stabilit c genofondul unei populaii este relativ constant de-a lungul mai multor generaii. Stabilitatea genetic este valabil pentru populaia ideal care se caracterizeaz prin urmtoarele particulariti: - este numeroas (peste 1,5 mii indivizi); - este panmictic (cstorii la ntmplare); - lipsa fluxului interpopulaional de gene (lipsa migraiilor); - rata mutaiilor rmne constant; - lipsa seleciei n favoarea sau defavoarea unui genotip; - lipsa undelor populaionale. Echilibrul genetic al unei populaii ideale este caracterizat de legea Hardy-Weinberg, valabil pentru caracterele monogenice: 1. ntr-o populaie ideal frecvena alelelor rmne constant de-a lungul generaiilor: p+q=1, unde p frecvena alelei dominante (A) q frecvena alelei recesive (a) 2. ntr-o populaie ideal frecvena genotipurilor rmne constant de-a lungul generaiilor: p2+2pq+q2=1, unde 2 p frecvena homozigoilor dominani (AA) 2pq frecvena heterozigoilor (Aa) q2 frecvena homozigoilor recesivi (aa). Factorii care ar putea modifica genofondul populaiei sunt: izolatele, cstoriile consanguine sau asortative, migraiile, mutageneza, selecia, deriva genic etc. Valoarea practic a metodei populaional statistice const n cunoaterea genofondului populaiei, estimarea frecvenei unor alelele mutante, calcularea numrului aproximativ al persoanelor afectate i purttoare de mutaii patologice etc. Datele statistice pot fi utile n planificarea activitii instituiilor medicale, iniierea unor programe de profilaxie a patologiilor genetice.

93

CURS 11 INTRODUCERE N PATOLOGIA GENETIC UMAN Bolile genetice reprezint stri patologice determinate sau condiionate de modificri specifice ale materialului genetic (mutaii). Bolile genetice sunt numeroase i variate att dup cauza apariiei, momentul manifestrii, ct i tabloul clinic. ETIOLOGIA BOLILOR GENETICE Cauzele producerii bolilor genetice pot fi clasificate n trei grupe: anomalii cromozomice de numr sau de structur, ce determin un deficit sau surplus al materialului genetic i ca consecin, n dependen de dezechilibrul genic sindroame plurimalformative viabile sau letale; mutaii genice cu efect patologic major, ce determin anomalii calitative sau cantitative n sinteza unei proteine (enzim, receptor, canal, etc.) i producerea unei boli monogenice sau unui sindrom monogenic; mutaii poligenice cu efect patologic minor, dar aditiv, ce reprezint predispoziia la boal, iar aciunea unor factori de mediu determin apariia unor boli multifactoriale. Mutaiile reprezint modificri anormale ale materialului genetic la diverese nivele: - substituii nucleotidice n secvenele codificatoare sau necodificatoare ale moleculei de ADN; - deleii sau adiii nucleotidice; - deleii sau duplicaii a unor fragmente cromozomiale; - monosomii sau trisomii cromozomiale. Mutaiile pot afecta att materialul genetic nuclear, ct i ADN-ul mitocondrial; pot afecta materialul genetic al celulelor generative i se pot transmite genealogic, sau pot afecta materialul genetic al celulelor somatice realizndu-se o clon celular mutant cu consecine patologice doar asupra fenotipului purttorului, fr transmitere genealogic. Mutaiile pot fi ereditare (motenite), manifeste sau nu la alte generaii, sau pot fi de novo spontane sau produse sub aciunea unor factori de mediu mutageni (radiaii, virusuri, noxe profesionale, diverse substane chimice toxice). CLASIFICAREA BOLILOR GENETICE Bolile genetice sunt determinate sau condiionate de mutaii la nivelul moleculelor de ADN (modificri calitative sau cantitative ale materialului genetic). n dependen de cota de participare a factorilor genetici bolile genetice se clasific n: - boli cromozomiale determinate de anomalii de numr sau structur a cromozomilor; - boli monogenice sau monofactoriale, determinate de mutaii dominante sau recesive, manifestarea crora nu depinde de anumite condiii de mediu; - boli poligenice sau multifactoriale care sunt condiionate de mutaii mai multe gene cu efect minor sau aditiv i determinate de aciunea patologic a factorilor de mediu. n dependen de perioada ontogenetic de manifestare, bolile genetice pot fi clasificate n: anomalii sau malformaii congenitale; boli i sindroame congenitale; boli i sindroame ale adultului. Bolile genetice sunt rezultatul modificrii materialului ereditar, dar pot fi: 94

ereditare, cu transmitere genealogic mendelian sau nonmendelian; neereditare, produse prin mutaii spontane, dar care se pot transmite la generaiile urmtoare; anomalii de reproducere, ca rezultat al mutaiilor letale sau mutaiilor sterile; boli genetice ale celulelor somatice, ca rezultat a apariiei postnatale a unei clone celulare mutante.

Specialitii din domeniul geneticii medicale insist asupra clasificrii etio-patogenetice a bolilor genetice: boli cromozomiale sau sindroame cromozomiale plurimalformative; boli monogenice sau moleculare; boli poligenice sau multifactoriale, boli cu predispoziie genetic; boli mitocondriale; boli genetice ale celulelor somatice (boala canceroas); boli de incompatibilitate materno-fetal. n prezent sunt cunoscute peste 1000 sindroame cromozomiale. Dup datele Dr. Mc.Kusick au fost descrise i nregistrate peste 9000 de boli i sindroame monogenice. Luate fiecare n parte, au o frecven populaional mic, dar n ansamblu reprezint o categorie de patologie uman important, n special lund n consideraie impactul lor medico-social: - 50% din toate avorturile spontane cunoscute n primul trimestru de sarcin prezint o anomalie cromozomial; 2-3% dintre nou-nscui au o anomalie congenital major; 0,6% din toi nou-nscuii au o anomalie cromozomial; 50% din toi copii cu retard mintal sever, cecitate sau surditate prezint o cauz genetic; 30% din toi copii spitalizai prezint o maladie genetic; 40-50% din mortalitatea infantil au cauz genetic; 1% din toate cazurile de malignitate sunt direct determinate de factorii genetici; 10% din cazurile comune de cancer (CR de sn, CR de colon sau CR ovarian) au o component important genetic; 5% din populaia cu vrste < 25 ani va manifesta o maladie genetic; 10% din aduli prezint fie o maladie pur genetic, fie o maladie cu predispoziie genetic.

95

ASPECTE COMUNE N PATOGENEZA BOLILOR GENETICE Specificitatea mecanismului patogenic al bolii este determinat de caracterul lezrii materialului genetic, dar se formeaz la nivelul ntregului organism determinnd particularitile individuale de desfurare a procesului patologic. n bolile cromozomiale dereglrile fenotipice coreleaz cu gradul de dezechilibru cromozomic, cu ct mai mult material genetic este implicat n mutaie, cu att mai precoce apar defectele de dezvoltare n ontogenez i mai grave sunt consecinele. Bolile cromozomiale se caracterizeaz prin anomalii multiple de dezvoltare (dismorfii cranio-faciale, anomalii scheletice, anomalii cardiovasculare, anomalii ale sistemului nervos, anomalii ale aparatului urinar etc.). Mecanismele patogenetice n bolile monogenice sunt diverse i depind de caracterul modificrilor biochimice determinate de mutaie: Gen mutant (ADN) ARNm mutant Protein anormal Funcie celular dereglat Simptoame Patogeneza multor boli ereditare i neereditare poate fi influenat de ali factori interni: starea sistemului imun i endocrin, vrsta i sexul pacientului, particularitile metabolismului. Tabloul clinic al bolilor genetice este foarte polimorf. Polimorfismul clinic este definit prin varietatea manifestrilor clinice i de laborator a unei boli, determinat de: - heterogenitatea genetic; - penetrana incomplet a unor gene dominante; - expresivitatea variabil a genelor patologice, pleiotropie, interaciunea factorilor genetici cu factorii de mediu. Cauzele genetice ale polimorfismului clinic sunt determinate de unicitatea biologic a fiecrui individ. Un rol important n expresivitatea bolii genetice l au factorii de mediu ce pot interaciona cu cei ereditari la orice etap de dezvoltare prenatal i postnatal. Bolile cu predispoziie genetic se caracterizeaz printr-un polimorfism mai accentuat, manifestndu-se prin continuitatea distribuirii de la formele uoare, pn la formele grave. EREDITATEA I CONSECINELE BOLII 1. Unele mutaii (genice sau cromozomiale) sunt letale, fiind responsabile de moartea prenatal, perinatal i infantil. Se cunosc peste 150 gene ce provoac moartea prenatal, printre nounscuii mori 1:5 are un defect genetic. Factorii externi cu aciune distructiv (hipoxia, trauma la natere, intoxicarea, hipotrofia, infeciile) produc mai frecvent moartea copiilor cu genotip anormal, dect la cei cu genotip normal. Cele mai frecvente cauze ale mortalitii infantile sunt bolile cromozomice, fibroza chistic, fenilcetonuria, sindromul adreno-genital, hipotireoza.

96

2. Mutaiile patologice, ca factori etiologici, pot fi cauza bolilor cronice. Evoluia cronic i progresiv n bolile genetice este o caracteristic, cu excepia celor letale. 3. Mutaiile genice se manifest nu numai cu semne specifice, dar i cu diminuarea rezistenei nespecifice a organismului la bolile asociate, determinnd cronizarea ultimelor. 4. Constituia genetic a pacientului: - poate modifica eficacitatea msurilor terapeutice, - poate determina reacie patologic a unor indivizi la anumite medicamente, - determin un polimorfism n viteza de eliminare sau oxidare a unor preparate medicamentoase, sau a metaboliilor care pot modifica farmacocinetica unor medicamente. 5. Unele mutaii sau asocierea lor duc la scderea capacitii organismului de a rezista la aciunea distrugtoare a factorilor de mediu, astfel i nsntoirea bolnavului va fi problematic. Aciunea genelor asupra cronizrii proceselor patologie poate fi explicat prin modificarea direcionrii unor procese biochimice, modificarea statusului hormonal, deficiene ale rspunsului imun. PARTICULARITILE BOLILOR GENETICE Fiecare caracter ereditar este determinat de interaciunea genotip factorii de mediu. Gena sau genele mutante determin un fenotip patologic prin: - sinteza anormal a unor proteine specifice (efectul patologic primar al mutaiei); - dereglarea structurii sau funciei specifice la nivel de celul i/sau esut (efectul patologic secundar al mutaiei); - manifestarea unui anumit caracter patologic sau sindrom la nivel de organism simptoamele bolii (efectul patologic teriar al mutaiei). Bolile i sindroamele genetice se caracterizeaz prin determinism monogenic, poligenic, multifactorial sau apar n rezultatul anomaliilor cromozomiale. De regul, determinismul genetic al bolii se stabilete odat cu formarea genotipului individului la fecundare. Astfel, afeciunile ereditare au un ir de particulariti prin care se deosebesc de cele neereditare: - sunt produse prenatal i se pot manifesta congenital sau n orice perioad de via; - se transmit genealogic i au o agregare familial; dar pot aprea spontan prin mutaii de novo; - se asociaz cu marcheri genetici (anomalii cromozomice sau secvene nucleotidice specifice); - sunt concordante la gemenii monozigoi i au o distribuie populaional specific; - au evoluie cronic, progresiv i recidivant determinate de aciunea permanent a genei mutante, cu manifestare variabil de la pacient la pacient, chiar i n cadrul aceleai familii; - se manifest cu modificri patologice a mai multor organe i sisteme, datorit efectului pleiotrop al genei mutante; - sunt rezistente la metodele de tratament tradiionale. METODELE STABILIRII NATURII GENETICE A UNEI BOLI Pentru a stabili implicarea factorilor genetici n bolile umane i ponderea lor n producerea unei patologii se urmrete: - studiul transmiterii genealogice a bolii sau anomaliei i determinarea tipului de motenire, calcularea riscului de manifestare sau de recuren; evidenierea unor anomalii cromozomice sau mutaii genice ce ar putea fi responsabile de fenotipul patologic; 97

determinarea defectului biochimic primar la nivel de sintez proteic sau efectele acestuia asupra unui proces biochimic controlat de gena/proteina modificat. identificarea unor marcheri genetici specifici asociate cu fenotipul patologic; calcularea indicelui de ereditate n cadrul patologiei multifactoriale; studiul distribuiei populaionale a bolilor genetice i calcularea frecvenei genelor patologice, purttorilor heterozigoi de gene mutante. BOLI CROMOZOMIALE

Bolile cromozomiale sunt rezultatul unor modificri specifice ale numrului cromozomilor caracteristic speciei (46 n celulele somatice umane) sau modificri structurale ale acestora. Efectele i gravitatea anomaliilor cromozomice depind de tipul de anomalie i mrimea dezechilibrului genetic - cu ct defectul cantitativ este mai mare, cu att consecinele sunt mai grave. Sindroamele cromozomice prezint modificri fenotipice comune (tulburri de cretere pre- i postnatal; ntrziere n dezvoltarea psiho-motorie i debilitate mintal; multiple anomalii viscerale, disgenezii gonadice) i modificri specifice ale cromozomului sau cromozomilor implicai. SINDROMUL DOWN (TRISOMIA 21) Sindromul Down este un sindrom plurimalformativ congenital cu incidena medie de 1:700 nou-nscui, dar dependent de vrsta matern: - la 20 ani 1:1500; - la 30 ani 1: 900; - la 35 ani 1: 400; - la 40 ani 1:100; - la 45 ani 1:30. Cauza sindromului Down este trisomia 21: 95% - trisomia 21 omogen liber, avnd ca origine nondisjuncia meiotic; 5% - trisomia 21 mozaic sau translocaional. Cariotipuri asociate n sindromul Down: 47, XX (XY), +21; 47, XX(XY), +21/ 46,XX(XY); 46, XX(XY), rob (21;13); 46, XX(XY), rob (21;14); 46, XX(XY), rob (21;15); 46, XX(XY), rob (21;21); 46 ,XX(XY), rob (21;22); 46, XX(XY), i(21q). Manifestrile clinice majore sunt determinate de anomalii multiple de dezvoltare: - hipotonie generalizat; - dismorfism cranio-facial; - malformaii cardiace; - retard mintal i fizic; - imunitate sczut; - risc crescut pentru leucemii. Evoluie: - n cazul de malformaii severe decesul n perioada de sugar; 98

n celelalte cazuri evoluia i gradul de retardare mental i somatic depinde de menegementul medical i social, dar longevitatea este redus.

Riscul de recuren depinde de forma trisomiei i variaz ntre 1 i 100%; Diagnosticul este bazat pe studiul cromozomilor (cariotip, FISH). SINDROMUL PATAU (TRISOMIA 13) Sindromul Patau este un sindrom plurimalformativ congenital cu incidena medie de 1:5000 7000 nou-nscui i dependent de vrsta matern. Cauza: 75% - trisomia 13 omogen liber, avnd ca origine nondisjuncia meiotic; 20% - trisomia 13 prin translocaii reobertsoniene; 5% - trisomia 13 forma mozaic. Cariotipuri asociate n sindromul Patau: 47, XX (XY), +13; 47, XX(XY), +13/ 46,XX(XY); 46, XX(XY), rob (13;13); 46, XX(XY), rob (13;14); 46, XX(XY), rob (13;15); 46, XX(XY), rob (13;21); 46 ,XX(XY), rob (13;22); 46, XX(XY), i(13)q. Manifestrile clinice majore sunt determinate de anomalii multiple de dezvoltare: - dismorfism cranio-facial: microcefalie, holoprosencefalie, microftalmie, despictur labiopalatin, defecte ale scalpului; - polidactilie; - criptorhidie; - malformaii cardiace; - retard mintal i fizic; - imunitate sczut. Evoluia sdr Patau este determinat de prezena malformaiilor viscerale: 50% din cazuri se termin cu deces n prima lun de via; 70% - deces naintea vrstei de 6 luni de via, 70% - deces nainte de 6 luni; 10% - supravieuiesc vrstei de 1 an. Riscul de recuren depinde de forma trisomiei i variaz ntre 1 i 100%. Diagnosticul este bazat pe studiul cromozomilor (cariotip, FISH). SINDROMUL EDWARDS (TRISOMIA 18) Sindromul Edwards este un sindrom plurimalformativ congenital cu incidena medie de 1:3000 nou-nscui i dependent de vrsta matern. Cauza sdr Edwards este: n 89% din cazuri - trisomia 18 omogen liber, avnd ca origine nondisjuncia meiotic; 1% - duplicaii ale cromozomului 18; 10% trisomia 8 forma mozaic. Cariotipuri asociate n sindromul Edwards: 47, XX (XY), +18; 47, XX(XY), +13/ 46,XX(XY); 46,XX(XY), 18p+; 46,XX(XY), 18q+. Manifestrile clinice majore sunt deteminate de asocierea anomaliilor multiple de dezvoltare: - dismorfism cranio-facial; - stern scurtat, - criptorhidie; - malformaii cardiace i renale; - retard mintal i fizic; - imunitate sczut.

99

Evoluie: 30% din cazuri deces n prima lun de via; 10% - supravieuiesc vrstei de 1 an cu retard sever mental i somatic. Riscul de recuren 1%. Diagnosticul este bazat pe studiul cromozomilor (cariotip, FISH).

SINDROMUL TRISOMIEI 8 Sindromul trisomiei 8 este un sindrom plurimalformativ congenital cu incidena medie de 1:5000 nou-nscui i dependent de vrsta matern, mai frecvent sun afectai indivizii de sex masculin. Cauza trisomia 8: 90% din cazuri sunt rezultatul unei nedisjuncii postzigotice, determinnd forme mozaice ale trisomiei 8; 10% - sunt trisomii pariale determinate de rearanjamente strucrurale ale cromozomului 8 (duplicaii). Cariotipuri asociate n sindromul Patau: 47, XX (XY), +8; 47, XX(XY), +8/ 46,XX; 46, XX(XY), 8p+; 46, XX(XY), 8q+. Manifestrile clinice majore sunt deteminate de asocierea anomaliilor multiple de dezvoltare: - dismorfism cranio-facial: frunte proieminent, strabism, epicant, hipertelorism, palatin arcuit, despictur palatin, buze ngroate, urechi mari malformate; - contracturi articulare, camptodactilia, aplazia rotulei, pliu palmar transvers unic; - anomalii ale anusului; - malformaii cardiace i renale; - retard mintal i fizic; - imunitate sczut. Evoluie: Trisomia 8 total este letal, iar n formele pariale sau mozaice pacienii au longevitate sczut. Riscul de recuren 1 %. Diagnosticul este bazat pe studiul cromozomilor (cariotip, FISH). SINDROMUL TURNER Sindromul Turner este un sindrom plurimalformativ congenital cu incidena medie de 1:2000 1 : 5000 nou-nscuii de sex feminin. Cauza : 50% - 69% - monosomia X total i omogen, 30-40% forme mozaice i restul cazurilor, mult mai rare, sunt rezultatul unor monosomii X pariale (deleii, izocromozomi, cromozom X inelar). Cariotipuri asociate n sindromul Turner: 45,X; 45,X / 46,XX; 46, X, Xq-; 46, X, i(X q); 46, X, del(Xp); 46, X, r(X); Manifestrile clinice majore sunt determinate de anomalii multiple de dezvoltare: o la nou-nscut piele abundent n exces la nivelul gtului, pterigium coli, limfedem periferic localizat mai ales pe faa dorsal a piciorului; o malformaii cardiace (DSA); o hipostatur disproporionat; o impubertizm, amenoree primar. Evoluie: statura final a adultelor este ntre 125-145 cm; intelegena i sperana de via sunt, n general, normale; tratamentul de substituie cu hormaoni estrogeni de la adolescen induce dezvoltarea caracterelor sexuale secundare i previne osteoporoza, dar nu influieneaz statura i infertilitatea. Riscul de recuren 1 %. Diagnosticul este bazat pe studiul cromozomilor (cariotip, FISH); testul Barr, de regul, este negativ.

100

SINDROMUL KLINEFELTER Sindromul Klinefelter este un sindrom cu infertilitate masculin, cu incidena medie de 1:1000 nou-nscuii de sex masculin; 1 : 10 din brbaii infertili; 1 : 100 din bieii din instituiile pentru retard mintal. Cauza: 85% - disomie X total i omogene (47,XXY), 15% - forme mozaice sau polisomii X totale sau pariale. Cariotipuri asociate n sindromul Klinefelter: 47, XXY 47, XXY / 46,XY 48, XXXY 48, XXYY 49,XXXXY etc. Manifestri clinice majore: o Talie nalt; o Constituie de tip feminin; o Ginecomastie; o Pilozitate sczut de tip feminin; o Testicule mici (sub 2 cm la adult), incapabile de a secreta testosteron; o Oligo- sau azoospermie; o Sterilitate primar; o Retard mintal moderat. Evoluie: Tratamentul de substituie cu testosteron induce dezvoltarea caracterelor sexuale secundare i previne osteoporoza. De regul, indivizii cu sindrom Klinefelter sunt infertili, dar n cazurile cu mozaicizm ar putea fi fertili. Riscul de recuren 1 %. Diagnosticul este bazat pe studiul cromozomilor (cariotip, FISH); testul Barr este pozitiv. Alte sindroame cromozomice Manifestri clinice majore 5pSindrom plurimalformativ congenital: microcefalie, deficien mintal, hipertelorizm, epicant, fante palpebtale de tip antimongolian, ipt specific datorat malformaiilor laringelui, malformaii viscerale i scheletice. 4pSindrom plurimalformativ congenital: microcefalie, hipotrofie staturo-ponderal, dismorfie facial caracteristic, malformaii cardiace grave, retard mintal sever. del (15)(q11-q13), Hipotonie neonatal, dismorfie craniofacial crs patern caracteristic, obezitate, hipogonadism, retard mintal moderat, tulburri de comportament. del (15)(q11-q13), Microcefalie, retard mintal sever, tulburri de mers i crs matern echilibru, absena vorbirii, tulburri de comportament Del (7) (q11.23) Dismorfie facial caracteristic, stenoz aortic, laxitate articular, hipostatur, retard mintal, dereglri psihice Del 22(q11.2) sau Despictur palatin, malformaii cardiace, dismorfie Del 10(p13) facial caracteristic, hipoplazia paratiroidei i timusului. Cauza

Sindromul Cri-du-chat

Wolf-Hirschhorn

Prader - Willi

Angelman Williams

Velo-cardio-facial DiGeorge

BOLI MONOGENICE Bolile i sindroamele monogenice sunt strile patologice determinate de mutaii dominante sau recesive ntr-o singur gen cu efect major, ce determin o sintez anormal a lanului polipeptidic codificat i, prin efect pleiotrop, anomalii de structur sau funcie celular. Acestea la rndul lor vor 101

determina manifestarea fenotipic cu o simptomatologie specific genei date i diverse simptome secundare. Patologia monogenic mai este numit monofactorial datorit independenei manifestrii genelor mutante de factorii de mediu. Dar, factorii de mediu pot modula expresia genic i determina o expresivitate variabil a bolii la diferii pacieni. O caracteristic a bolilor monogenice este transmiterea lor genealogic mendelian cu posibilitatea calculrii riscului de recuren. Dup tipul transmiterii bolile monogenice se clasific n 5 categorii: - dominante-autozomale - dominante X-lincate; - recesive-autozomale; - recesive X-lincate; - mitocondriale. n general bolile monogenice sunt rare i pot aprea att prin mutaii motenite ct i mutaii de novo. n ansamblu bolile monogenice sunt numeroase (peste 9000 entiti nozologice) i au implicaii deosebite pe plan medical i social. Majoritatea din ele nu sunt posibil de tratat iar prevenirea lor necesit teste genetice specifice pentru diagnosticul prenatal. Distribuia bolilor monogenice n dependen de tipul de transmitere conform catalogului lui Mc. Kusick a. 1966 a. 1975 a. 1986 a. 1994 a. 1998 837 531 119 1487 1218 947 171 2336 2201 1420 286 3907 4458 1730 412 19 59 6678 8005 495 27 60 8587 19769 1172 59 64 21064

Boli Autozomal dominante Autozomal recesive X-lincate Y-lincate Mitocondriale Total

a. 2012

Afeciuni cu transmitere autozomal dominant Principalele afeciuni cu transmitere autozomal dominant sunt: hipercolesterolemia familial; sindromul Marfan; coreea Huntington; boala polichistic renal; neoplazia multipl endocrin; miotonia congenital Thomsen; neurofibromatoza Recklinghausen; retinoblastomul; sindroamele Wiliams, Noonaan i velocardiofacial; afeciunile de colagen (osteogeneza imperfecta i sindromul Ehlers-Danlos). HIPERCOLESTEROLEMIA FAMILIAL Este cea mai frecvent afeciune cu transmitere autozomal-dominant; are o inciden de 1 : 500; etiologia: apare ca urmare a unui defect al receptorului lipoproteinelor cu densitate joas (LDL), determinat de mutaia genei situate n locusul 19p13; vrsta de debut dup 30-40 ani; 102

se caracterizeaz prin urmtoarele particulariti clinice: - xantelasme la nivelul feei, palpebral, xantoame pe tendoanele extensorilor) tendonul lui Achile); - cardiopatie ischemic precoce (crize anginoase, infarct de miocard); - deces prematur prin cardiopatie ischemic (50% din brbai decedeaz fr tratament pn la vrsta de 60 ani); - valori mari ale colesterolemiei 300-600mg/dl; LDL peste 200mg/dl; - anamnez familial pozitiv (ali cardiaci n familie); - diagnostic prenatal prin analiza ADN. SINDROMUL MARFAN Sindrom autozomal-dominant ce afecteaz esutul conjunctiv cu expresivitate variabil, dependent de factorii de mediu; are o inciden de 1 : 10000 1 : 15000; etiologia: apare ca urmare a unei mutaii n gena fibrilinei care este situat n locusul 15q21; debuteaz n primii ani de via prin: - creterea rapid a membrelor cu aspect de arahnodactilie; - subluxaia de cristalin, cataract, strabism, - articulaii laxe cu scolioz i cifoz; - pectus excavatum sau carinatum; - afeciuni cardiace (anevrism de aort); sperana medie de via 40-50 ani; diagnosticul presiptomatic se bazeaz pe analiza ADN.

COREEA HUNTINGTON Afeciune neurovegetativ cu transmitere atozomal-dominant ce se manifest la indivizii de peste 30-40 ani; are o inciden de 1 : 18000; etiologia: apare ca urmare a unei mutaii dinamice n gena ce codific proteina huntingtina, situat n locusul 4p16.3; mutaia produce atrofia de nucleu caudat, putamen i globus palidus; manifestri clinice majore: - tulburri neurologice motorii progresive (coree, distonie); - n timp apar tulburri de personalitate i demen; decesul se produce la 15-20 ani de la debutul clinic; agregare familial, afecteaz mai frecvent brbaii; diagnosticul presiptomatic se bazeaz pe analiza ADN. ADPKD Boala Polichistic Renal de tip Autozomal Dominant este o afeciune multisistemic, caracterizat prin scderea rezistenei esutului conjunctiv i astfel apar modificri structurale ale organelor supuse stres-ului presional: tubii nefronali, conducte biliare, perete vascular, ducte pancreatice, aparat valvular cardiac; are o inciden de 1 : 1000; etiologia: apare ca urmare a unui defect n gena PKD1 situat n locusul 16p13.3 (85%) sau PKD2 din locusul 4q21-22 (15%); manifestri clinice majore: - dezvoltarea progresiv i difuz de chiti renali multipli, bilaterali, n toate segmentele tubilor uriniferi; - asocierea variabil cu alte anomalii extrarenale (cardiovasculare, digestive) - n special chiti hepatici; - manifestat de obicei la adult i evolund frecvent spre IRC; 103

6-10% din pacienii cu IRCT, admii n dializ, au ADPKD; vrsta medie la care se atinge IRCT este 55 ani, dar exist variaii individuale; diagnosticul presimptomatic se bazeaz pe analiza ADN. MIOTONIA CONGENITAL THOMSEN Afeciune muscular nondistrofic cu transmitere autozomal-dominat i manifestare congenital; frecvena 1:20000-50000 nou-nscui; etiologia: apare ca urmare a unui defect n gena ce codific canalul de clor tip 1 din muchii scheletici (localizare 7q35); manifestri clinice majore: - afectarea muscular n special la nivelul centurilor scapular i pelvian; - slbiciune muscular, astenie fizic marcat; diagnosticul este susinut prin electromiogram; diagnosticul prenatal bazat pe teste ADN. NEUROFIBROMATOZA RECKLINGHAUSEN Este o afeciune cu transmitere autozomal-dominant cu expresivitate variabil; are o inciden de 1 : 3000; etiologia: apare ca urmare a unui defect n proteina neurofibromina o GTP-az ce regleaz expresia proteinelor RAS, acionnd ca o protein supresoare de tumori; gena NF1 este situat n locusul 17q11.2; debutul clinic n copilrie i pubertate, boala evolueaz n timp; manifestrile clinice majore: - prezena de pete cafe au lait cutanate ce apar nc din copilrie; - neurofibromatoz cutanat i subcutanat; - modificri ale irisului noduli Lisch; - tumori benigne pe traiectul unor nervi; - anomalii de cretere i dezvoltare, retard mental, HTA secundar (frecvent de natur renal displazie de arter renal); copii cu neurofibromatoz au un risc crescut pentru leucemia mielomonoclonal tipul juvenil i pentru mielodisplazie; testul prenatal sau presimptomatic este bazat pe analiza ADN. RETINOBLASTOMUL Este cea mai frecvent tumor intraocular cu transmitere autozomal-dominant, exprimat n copilrie; are o inciden de 1 : 18000 1 : 30000; etiologia: apare ca urmare a unui defect n gena RB1, localizat n 13q14.3, produsul creia intervine n reglarea ciclului celular i a transcripiei; manifestri clinice majore: - tumoare embrionar cu origine n celulele retinei; - la aduli se asociaz cu alte neoplazii sarcomul osteogenic, sarcoamele de pri moi sau melanoamele; - diagnostic prenatal se bazeaz pe testele ADN. OSTEOGENEZA IMPERFECT (TIP I IV) Este o afeciune cu transmitere autozomal-dominant cu expresivitate variabil ce determin o predispoziie la deformaii scheletice i fracturi osoase n urma unor traumatisme minime; are o inciden de 1 : 10000; etiologia: apare ca urmare a unui defect n gena ce codific pentru sinteza colagenului tip I (locus: 17q21.31-q22) sau n alte gene ce codific lanurile procolagenului; manifestri clinice majore: 104

Tip I (Boala Lobstein) forma uoar; - fragilitate osoas; - sclere albastre; - surditate presenil; Tip II (Boala Vrolik) forma sever, letal n perioada neonatal; - fracturi osoase; - deformaii scheletice; - sclere de culoare nchis; Tip III fracturi prezente la natere; - deformaii osoase progresive; - hipostatur; - sclere albastre; - tulburri ale dentiiei; - surditate; Tip IV deformaii osoase uoare sau moderate; - susceptibilitate la fracturi; - surditate; - sclere de culoare normal; - anomalii ale dentiiei; diagnosticul prenatal prin teste ADN. SINDROMUL EHLERS-DANLOS Reprezint un grup de boli genetice ale esutului conjunctiv cu transmitere autozomal-dominant; are o inciden de 1 : 5000 1 : 50000; etiologia: apare ca urmare a unui defect n gena ce codific colagenul tip V (2q31); manifestri clinice majore: - manifestri cutanate aspectul hiperextensibil (cutix laxa); textur moale, catifelat; apariia unor escare atrofice i a echimozelor; - manifestri articulare hipermobilitate articular; - cifoscolioz; - anomalii oculare keratoconus; sclere albastre; subluxaie de cristalin; dezlipirea retinei; - complicaii ruptura prematur a membranelor i hemoragiile pre- sau postpartum; - ruperea vaselor ce reprezint o cauz frecvent de deces; diagnostic prenatal pe baza testelor ADN. AFECIUNI CU TRANSMITERE AUTOZOMAL-RECESIV Principalele afeciuni genetice cu transmitere autozomal-recesiv sunt: fenilcatonuria; fibroza chistic; boala Wilson; surditatea nonsindromic recesiv; hemoglobinopatiile; atrofia muscular spinal acut infantil; atrofia muscular progresiv a copilului; trombastenia Glanzmann. FENILCETONURIA Reprezint o hiperfenilalaninemie sever cu transmitere autozomal-recesiv; are o inciden de 1 : 10000 nou-nscui;

105

etiologia: apare ca urmare a unui defect n gena pentru fenilalaninhidroxilaz (PAH), cu localizare 12q24.1; manifestri clinice majore: - tulburri neorologice; - retard somatic i mintal; - demen n formele netratate; - miros particular al urinei; - dermatit cronic descuamativ; boala se manifest n copilrie i depinde de dietoterapie (excluderea fenilalaninei din produsele alimentare); diagnosticul prenatal sau neonatal prin dozarea fenilalaninei plasmatice sau analiza ADN.

FIBROZA CHISTIC (MUCOVISCIDOZA) - Reprezint o alterare a funciei exocrine cu producerea de secreii glandulare vscoase ce conduc la afectare pulmonar cronic i insuficien pancreatic; patologia are o transmitere autozomalrecisiv; - are o inciden de 1 : 2500; - etiologia: apare ca urmare a unui defect n gena CF (locus 7q31.2) ce codific pentru un canal de clor la nivelul polului apical al celulelor apicale; - manifestri clinice majore: - la nivel-pulmonar infecii recurente cu evoluie spre insuficien pulmonar; - la nivelul pancreasului obstrucia canalelor pancreatice, deficiena enzimelor pancreatice i ca rezultat afectarea digestiei; - creterea concentraiei de sodiu i clor n secreiile sudorale; - tulburri gastrointestinale ileus meconeal (la 10-25% dintre nounscuii cu FC); - absena congenital bilateral a vaselor deferente la biei (95% de cazuri); - supravieuirea medie este de 25 30 de ani; - diagnosticul prenatal prin teste de ADN. BOALA WILSON reprezint o degenerescen hepato-lenticular cu tansmitere autozomal recesiv. Are o inciden 1 : 100000; etiologia: apare ca urmare a unui defect n gena localizat pe crs. 13q14.3, ce determin tulburri n transportul cuprului cu scdere a capacitii de ncorporare a cuprului n ceruloplasmin i scderea secreiei biliare; cuprul se acumuleaz n ficat producnd leziuni la acest nivel; se depune n creer, rinichi.; manifestri clinice majore: - debuteaz la persoanele tinere cu afectare hepatic i tulburi neurologice; - afeciunea hepatic are o evoluie ciclic cu caracterul unei hepatopatii cronice (icter, astenie, inapeten) cu citoliz; - poate asocia anemie hemolitic; - manifestrile neurologice tremor fin al extremitilor, coree, dizartrie, imposibilitate de a coordona micrile; - manifestri psihice cu alterarea personalitii (schizofrenie), scderea performanelor colare la copii; - semn specific prezena inelului Kayser-Fleischer. supravieuirea depinde d gradul de afectare a ficatului; ciroza hepatic cauz frecvent de deces; diagnosticul prenatal prin teste de ADN. HEMOGLOBINOPATIILE Reprezint un grup heterogen de patologii, cu transmitere autozomal - recesiv, determinate de diverse variante ale Hb, care induc tulburri prin afectarea structurii i funciei hematiilor; 106

etiologia: apar ca urmare a unor mutaii n dou familii de gene: - familia alfa-globinelor localizat pe crs. 16p, format din 4 gene funcionale ( 2, 2, 1, 1); - familia beta globinelor pe crs. 11p, cuprinde 5 gene funcionale - se disting diferite forme de hemoglobinopatii - hemoglobinoza S, hemoglobina C, talasemiile. Hemoglobinoza S apare ca urmare a nlocuirii acidului glutamic din poziia 6 a lanului cu valina. Boala se poate manifesta la homozigoi i heterozigoi prin anemie drepanocitar. Clinic copiii aa sunt icterici, cu ntrziere de cretere, dureri osoase, peste 50% au splenomegalie. Pacienii prezint eritrocitele n form de secer, viscozitate sanguin, staz i risc de tromboze vasculare. Diagnosticul pe baza datelor clinice, hematologice, electroforezei Hb, diagnosticul prenatal analiza ADN. Hemoglobina C apare prin nlocuirea acidului glutamic (6, lan ) cu lizina, se caracterizeaz printr-o solubilitate sczut, clinic anemie hemolitic grav, splenomegalie i icter cutaneo-mucos, hematologic-eritrocite n int. Talasemiile detrminate de afectarea sintezei lanului sau a Hb, ce reprezint modificri cantitative. n dependen de defectul molecular se manifest de la forme uoare pn la forme grave, letale de anemie. Beta talasemia major Cooley - se manifest precoce, n primul an de via cu retard de cretere, paloare a tegumentelor, hepatosplenomegalie compensatorie, hiperplazia medular, n special la nivelul oaselor feei i craniului - aspect caracteristic de craniu n perie, la nivelul oaselor lungi - subiere a corticalei cu risc crescut de fractur, pacienii fac uor infecii intercurente. Diagnosticul clinic, hematologic, anamneza familial (prini heterozigoi cu semne uoare de anemie), diagnostic prenatal teste ADN. ATROFIA MUSCULAR SPINAL ACUT INFANTIL Afeciune grav, ce se manifest precoce prin hipotonie muscular, retracia spaiului intercostal n timpul inspiraiei, tuse ineficiente, areflectivitate, cu transmitere autozomal-recesiv; etiologia: apare ca urmare a unui defect n gena localizat pe crs. 5q13.2; moartea survine n primii doi ani de via; diagnosticul pe baza biopsiei musculare i electromiogramei; diagnosticul prenatal pe baza testelor ADN. AFECIUNI CU TRANSMITERE RECESIV X LINCAT DISTROFIA MUSCULAR DUCHENNE (DMD) afeciune cu debut n prima copilrie, de obicei sub vrsta de 5 ani, cu afectarea muchilor centurilor, se asociaz cu retard mental. Criteriile de diagnostic sunt dozarea creatinkinazei (crescut), electrocardiograma i biopsia muscular. DISTROFIA MUSCULAR BECKER (DMB) afeciune cu debut n a doua copilrie, fiind asemntoare simptomatic cu DMD, dar cu o supravieuire mai mare i fr retard mental. DMD i DMB se transmit XR, gena afectat fiind localizat pe braul p (Xp21). Proteina codificat de aceast gen se numete distrofina: face parte din clasa spectrinei (din citoscheletul celular). Studiile electroforetice in vitro pe biopsiile musculare de la pacienii cu DMB au artat o diminuare a conductanei clorului sarcolemal. Repausul n conductana clorului pentru fibra muscular sintetic contribuie la repolarizarea potenialelor de aciune n esutul dat, iar reproducerea lor conduce la instabilitate electric. Astfel, genele canalelor de clor din fibra muscular par a fi cele mai indicate n explicarea acestor modificri. Fiind o maladie XR, se manifest n special la biei, mama fiind purttoare de gen patogen. n astfel de cazuri diagnosticul prenatal se poate face prin detectarea genei mutante n vilozitile coriale, folosind RFLP intra- i extragenic.

107

HEMOFILIILE A I B Hemofiliile A i B sunt afeciuni XR; genele mutante responsabile sunt localizate pe braul lung (Xq28), avnd ca urmare deficitul factorilor VIII i respectiv IX, componente ale cii intrinseci a coagulrii. Boala afecteaz 1 din 5000 de biei. Hemofilia A este de 10 ori mai frecvent ca hemofilia B. Aspectul clinic al hemofiliei A depinde de gradul de activitate a factorului VIII i se exprim n 4 forme: Forma Concentraia Manifestri clinice factorului VIII Sever Sngerare spontan i dup circumcizie. Hemartroze 1% repetate. Deformri articulare. Moderat 1-5% Hemartroze ocazionale. Deformri articulare rare. Uoar 5-20% Sngerare rar: dup intervenii chirurgicale, stomatologice, dup traumatisme. Ascuns Se includ i purttoarele genei patologice. 25% Diagnosticul prenatal al hemofiliilor se bazeaz pe stabilirea sexului, analiza ADN n vilozitile coriale i dozarea factorului VIII sau IX n sngele fetal. PROFILAXIA BOLILOR EREDITARE Profilaxia primar const n evitarea concepiei sau naterii copilului cu anomalie grav, incurabil prin diverse msuri ce intesc: micorarea procesului mutaional; limitarea concepiei n cazurile cu risc 100% sau ntreruperea sarcinii dup diagnosticul prenatal; diagnosticul preimplantiv cu selecia produilor de concepie mutani n cazurile de fertilizare in vitro; terapie genic germinal sau somatic cu revenirea la genotip normal. Profilaxia secundar cuprinde o serie de inrervenii pentru prevenirea / atenuarea maniferstrii complicaiilor la indivizii cu mutaii patologice: msuri terapeutice perinatale i n timpul sarcinii; diagnosticul preclinic cu aplicarea terapiei de prevenire a complicaiilor; excluderea factorilor ce pot provoca apariia bolilor cu predispoziie genetic; terapie de substituie / dietoterapie / transplant de esut .... pentru fiecare caz n particular. Profilaxia eficient poate fi relizat n cadrul unui centru specializat de consult genetic. Diagnosticul prenatal cu scop de prevenire a bolilor genetice sau AC grave are ca scop depistarea anomaliilor congenitale sau a bolilor genetice la embrion sau ft. Se realizeaz n cazurile de sarcini cu risc teratogen sau genetic (anamnez familial sugestiv) i poate fi ca metod de screening populaional. Diagnosticul prenatal necesit respectarea principiului de siguran i precizie i se poate realiza numai n cadrul unui centru specializat de consult genetic.

Strategii de terapie a bolilor genetice Pentru atenuarea consecinelor patologice a unor mutaii se aplic diverse strateii de tratament simptomatic, corecie a tulburrilor metabolice, ce acioneaz asupra proteinei deficitare, transplante 108

de organe, terapii celulare. Terapia genic are ca scop corecia cauzei bolii mutaiei genice. Terapia genic reprezint modificarea genetic a celulelor afectate prin substituia genei mutante amorfe cu o gen normal sau inhibarea unei gene patologice sau ARNm mutant. Terapia genic poate fi realizat la nivelul celulelor somatice sau celulelor germinale (interzis). Boli candidate pentru terapia genic sunt: - Deficiena ADA SIDC (deficiena de adenozindezaminaz implicat n sindromul imunodificienei combinate); - Hemofilia B; - Fibroza chistic; - FH (hipercolesterolemia familial); - Cancerul.

SFATUL GENETIC Sfatul genetic este actul medical specializat i complex prin care se determin probabilitatea (riscul) ca o boal ereditar sau parial ereditar s se manifeste sau s reapar ntr-o familie. Sfatul genetic este atribuia medicului genetician i se acord la solicitarea persoanelor interesate, deoarece prin calcularea riscului i stabilirea conduitei ulterioare, sfatul genetic are rol important n profilaxia bolilor genetice. Dup calcularea riscului de recuren i comunicarea acestuia, trebuie avut n vedere posibilitatea efecturii diagnosticului prenatal, precum i ntreruperea sarcinii cnd se consider c riscul este prea mare. Necesitatea actual a sfatului genetic este determinat de 2 condiii: 1. Diferitele substane poluante din mediul urban, precum i iradierea accidental, profesional sau diagnostic n timpul sarcinii pot duce la apariia de mutaii i deci a bolilor genetice. Datorit creterii frecvenei bolilor genetice, cresc i morbiditatea, mortinatalitatea i mortalitatea infantil prin boli genetice. 2. Datorit interveniei medicinii moderne persoanele cu boli genetice pot supravieui pn la vrsta de adult i deci pot transmite boala genetic la descendeni. Ideal, sfatul genetic ar trebui solicitat n urmtoarele situaii: * Premarital: 1. Unul sau ambii parteneri au anomalii congenitale sau boli genetice; 2. Parteneri sntoi, dar unul sau ambii au rude apropiate cu boli genetice (frai, prini, bunici, unchi-mtu, verior); 3. Parteneri sntoi, dar doresc o cstorie consangvin; 4. Persoane expuse accidental, profesional sau terapeutic la ageni teratogeni sau mutageni; 5. Cupluri care se cstoresc trziu sau planific s aib copii la mai mult de 35 ani; * Postmarital (cele mai frecvente solicitri): 1. Naterea unui copil malformat sau cu o boal genetic; 2. Cupluri cu copii nscui mori sau avorturi spontane repetate; 3. Femei care necesit: a. doze mari de medicamente care pot afecta dezvoltarea ftului; b. femei care au avut boli infecioase virale (rubeol); c. radiografii pe micul bazin, vaccinri. Sfatul genetic se acord n centre specializate de genetic medical, de ctre o echip complex de specialiti (genetician, obstetrician, pediatru, chirurg pediatru, endocrinolog etc). Centrul trebuie s fie dotat cu un laborator bine utilat pentru a efectua investigaiile necesare unui diagnostic corect i complet. Metodologia sfatului genetic Stabilirea diagnosticului precis clinic i paraclinic (date biochimice, radiografii, echografie, ECG, EEG etc) ; Stabilirea autenticitii filiaiei i a caracterului genetic al bolii prin: 109

Ancheta familial, care va ncerca att depistarea bolnavilor, ct i a purttorilor de gen anormal pe baza analizei arborelui genealogic; Explorri genetice (msurtori antropometrice, cromatin sexual, cariotip, Southern blot, PCR etc). Cunoaterea datelor din literatura de specialitate, mai ales frecvena de apariie a bolii n populaia respectiv. Calcularea riscului de recuren presupune folosirea unor noiuni de calcul al probabilitilor. Tipuri de risc: a. Total 100% n: Boli monogenice: Boli cromozomice: - bolnav + bolnav n anomalii recesive; - translocatii reciproce echilibrate ntre cromozomi omologi

b. Foarte mare 50-75% n: Boli monogenice: - bolnav + sntos heterozigot n anomalii recesive (50%);; - bolnav + bolnav n boli dominante autozomale cu penetran complet (75%); - bolnav + sntos n boli dominante autozomale cu penetran complet (50%); c. Mare - 25% - n boli monogenice: - heterozigot + heterozigot n anomalii recesive; d. Moderat 10 - 25% n: Boli monogenice: Boli poligenice: Boli cromozomice: - boli dominante cu penetran redus; - n situaia cnd exist mai multe persoane afectate n familie; - translocaii ntre cromozomi diferii;

e. Mic, mai puin de 5% n: Boli poligenice: - n situaia cnd exist o singur persoan afectat n familie; - malformaii; Risc 0% nu exist. Riscul minim este de 3,2% . Acordarea sfatului genetic Sfatul genetic trebuie s precizeze: a. Natura i consecinele bolii; b. Riscul de recuren; c. Mijloacele de modificare a consecinelor; d. Mijloacele de prevenire a recurenei (diagnostic prenatal, sfat). Rspunsul celui care d sfat genetic trebuie s fie explicit, obiectiv, personalizat n funcie de pacient, modulat dup contextul psihologic creat de gravitatea handicapului, vrsta de procreere, vrsta sarcinii, prezena altor copii normali sau anormali, echilibrul psihologic al cuplului. Medicul trebuie s informeze, nu s decid. Latura psihologic a sfatului genetic este deosebit de important. Dup acordarea sfatului genetic pot fi stabilite msuri de ngrijire ulterioar: a. Trimitere la specialiti corespunztori, agenii de sntate, grupuri de susinere; b. Continuarea evalurii clinice dac este indicat; c. Continuarea susinerii prin sfat genetic dac este indicat. In boli monogenice calcularea riscului de recuren se face pe baza legilor ereditii (gene mutante cu efecte majore ce se transmit dominant sau recesiv, autozomal sau gonosomal). In boli poligenice se calculeaz "riscul empiric", stabilit pe baza studiilor populaionale. 110

In boli cromozomice n aprecierea riscului de recuren trebuie inut cont de mecanismul de producere (nedisjuncie, translocaie ntre cromozomi omologi sau neomologi etc). (Vezi Cap.Anomalii cromozomice). APARITIA UNOR COPII BOLNAVI DIN PARINTI SNTOI Apariia unor copii bolnavi din prini sntoi determin adesea o adevrat dram familial fiind o situaie frecvent ce implic sfat genetic n practica obinuit a geneticii medicale. Cauzele acestui eveniment nedorit pot fi foarte diverse i explic riscul diferit de recuren n diferite familii. 1. Boli recesive autozomale sau gonosomale cu prini sntoi, dar purttori (risc 25 % sau 50 %). Se ntlnete ntmpltor, dar mai frecvent n legturile consanguine. 2. Boli dominante cu penetran incomplet (dominan neregulat) n care unul din prini este heterozigot nemanifest (risc variabil 20 - 30 %). 3. Boli recesive cu heterogenitate genetic (gene diferite determin acelai aspect fenotipic). Ex: surditatea congenital (surdomutitatea), retinit pigmentar etc. Riscul este de 50 % iar transmiterea mimeaz o transmitere dominant neregulat. 4. Anomalii poligenice n care prinii sunt sntoi, dar copilul motenete un numr de gene de risc ce depete pragul. Riscul variabil este de 4 - 10 % . 5. Mutaie nou. Riscul este variabil de la neglijabil pn la foarte mare n funcie de existena aciunii factorului mutagen. 6. Factorii de mediu teratogeni (medicamente, substane chimice, infecii) pot determina anomalii (malformaii) neereditare dar cu manifestare congenital. Riscul poate fi neglijabil n cazul n care se elimin agenii teratogeni. ROLUL CONSANGVINITII N TRANSMITEREA RECESIVA Consangvinitatea (cstorie ntre rude de snge) crete riscul ntlnirii a doi prini sntoi dar purttori ai unei gene recesive anormale i duce la apariia unor copii bolnavi de boli recesive. Acest lucru se explic deoarece ntr-o familie n care exist o persoan cu o anomalie recesiv, frecvena heterozigoilor pentru aceast gen anormal este mult mai mare dect n populaia general datorit fondului genetic comun al persoanelor nrudite. In bolile recesive este important a se calcula: COEFICIENTUL DE NRUDIRE: reprezint probabilitatea a doi indivizi de a prezenta o anumita gena motenita de la un strmo comun: coeficientul de nrudire se noteaz cu r; el se calculeaz folosind urmtoarea formul:

r = coeficient de nrudire; n1 = numrul de generaii situate ntre unul dintre cei doi indivizi i strmoul comun; n2 = numrul de generaii situate ntre al doilea individ i strmoul comun. exemple de coeficieni de nrudire: - rude de gr. I - prini/copii; frate (sor)/frate (sor) - au r = 1/2 - rude de gr. II - bunici, mtui, unchi - au r = 1/4 - rude de gr. III - veri primari - au r = 1/8. COEFICIENTUL DE CONSANGVINITATE: Coeficientul de consangvinitate se calculeaz pentru indivizii rezultai n urma cstoriei a dou persoane nrudite. 111

Coeficientul de consangvinitate al unui individ este probabilitatea acestuia de a prezenta pentru un locus dat din genomul su dou gene alele identice motenite de la un strmo comun. Coeficientul de consangvinitate se noteaz cu F Coeficientul de consangvinitate se poate calcula prin dou formule: n cazul n care membrii cuplului consanguin prezint un singur cuplu de strmoi comuni: , F = coeficient de consangvinitate; r = coeficient de nrudire. n cazul n care membrii cuplului consanguin prezint mai multe cupluri de strmoi comuni:

, F = coeficient de consangvinitate; n = numrul de indivizi prezeni ntr-o bucl care ncepe la nivelul unui strmo comun, merge pe linie descendent pn la copilul rezultat n urma unei cstorii consanguine, trecnd pe la unul dintre membrii acestui cuplu consanguin i se ntoarce pe linie ascendent pn la acelai strmo comun, trecnd pe la al doilea membru al cuplului consanguin. NOT: n se calculeaz pentru toi strmoii comuni De obicei cu ct o boal recesiv este mai rar cu att consangvinitatea la prini este mai frecvent.

TESTAREA GENETIC Testarea genetic este o metod de studiu ce identific genotipurile asociate cu o anumit afeciune sau predispoziie la boal sau care pot duce la apariia unor boli la descendeni. Scopul testrii genetice const n identificarea urmtoarelor categorii: - Persoane afectate (ct mai precoce pentru o ct mai prompt intervenie terapeutic); - Purttori sntoi heterozigoi (pentru afeciuni recesive); - Purttori sntoi de gen mutant dominant (pentru afeciuni dominante cu debut tardiv); - Persoane cu predispoziie genetic pentru boli cu determinism multifactotial. n dependen de caz, scopul final al acestei identificri este alegerea unei opiuni reproductive optime sau acolo unde este posibil un tratament precoce. Testarea genetic este parte component a screeningului neonatal, populaional sau familial. Screening-ul neonatal Reprezint programul de depistare presimptomatic i de prevenire a unor boli genetice. Are drept scop depistarea nou-nscuilor cu anumite boli genetice nemanifestate la natere, boli a cror evoluie poate fi controlat i eventual oprit prin terapie adecvat i iniiat precoce. Constituie o strategie eficient de sntate public, aplicabil pentru unele afeciuni tratabile precum fenilcetonuria, hipotiroidismul congenital i galactozemia. 112

Pentru alte tipuri de afeciuni, programele de screening variaz de la o ar la alta, n funcie de prevalena afeciunilor ce pot beneficia de ameliorri terapeutice prin depistare precoce: mucoviscidoza (frecvent n Europa), anemia falciform (frecvent la afro - americani), maladia Ta Sacks (frecvent la evreii ashkenazi); thalasemia (frecvent la populaia circum - mediteranian); depistate neonatal, acestor afeciuni li se poate influiena evoluia, depistarea lor putnd constitui factor de decizie pentru sarcinile ulterioare. Exist deja protocoale specifice pentru o serie de afeciuni: Screening-ul pentru fenilcetonurie, aplicabil nou-nscuilor, se realizeaz prin testarea nivelului fenilalaninei n ser n primele 4-5 zile dup natere, sensibilitatea testului fiind de 98%, iar specificitatea practic de 100%. Screening-ul neonatal n hipotiroidia congenital se bazeaz pe: detectarea imunologic a hormonilor tiroideni sanguini care prezint valori sczute; testele moleculare de screening neonatal i de depistare a heterozigoilor sunt cel mai frecvent aplicate. Efectuarea screening-ului neonatal la anemia falciform n zonele afectate cu predilecie se realizaeaz pe baza tabloului hematologic i prin diagnostic ADN.

DIAGNOSTICUL PRENATAL Este necesar n cazul sarcinilor cu risc crescut, identificate prin screening sau n urma consilierii genetice a cuplurilor parentale cu risc. Un diagnostic prenatal complet va impune consultri interdisciplinare (obstetrician, pediatru, genetician, neonatolog etc.).

Dei diagnosticul prenatal constituie o surs de disconfort pentru mam i chiar o surs de risc vital pentru ft, acesta rmne un instrument predictiv extrem de eficient n epidemiologia bolilor genetice, permind n unele situaii evitarea naterii unui copil malformat. Existnd riscurile citate mai sus, efectuarea diagnosticului prenatal impune ndeplinirea unor criterii clar definite: - severitatea malformaiei: nendoielnic n cazul prezumpiei de sindromDown (sau alte anomalii trisomice), defecte de tub neural deschis sau boli metabolice neurodegenerative, decizia rmne discutabil n alte situaii (defecte ale membrelor, despictur labio- maxilo palatin), n care intelectul i durata de via pot rmne neafectate; zona geografic poate fi decisiv pentru unele afeciuni, impactul malformaiei fiind diferit receptat n funcie de particularitile socio-culturale zonale; 113

existena unui tratament satisfctor: astfel, fenilcetonuria poate rmne fr consecine neuropsihice n rile n care exist posibilitatea deteciei prenatale prin analiza molecular i a unei diete specifice corespunztoare, n timp ce galactozemia afecteaz sever ficatul n majoritatea cazurilor; - acceptarea prealabil de principiu a ntreruperii sarcinii de ctre cuplu i comunitate ca sanciune terapeutic n cazul confirmrii unei malformaii grave; - existena unui test diagnostic prenatal cu dezabilitate satisfctoare; stabilirea existenei unui risc genetic semnificativ la consilierea genetic prealabil sarcinii. Metoda utilizat poate varia n funcie de vrsta sarcinii i tipul afeciunii implicate (boala cromozomic, monogenic sau alt tip de anomalie congenital). Pot fi necesare att metode invazive care comport risc abortiv (caz n care acordul ambilor prini este obligatoriu). Indicaiile pentru diagnostic prenatal: - vrsta matern gestaional peste 35 de ani (risc de nondisjuncie cromozomic meiotic-gamei anormali); - istoric familial pozitiv (defecte de tub neural, boli cromozomice, boli monogenice depistabile prin diagnostic enzimatic/ ADN, anomalii morfologice congenitale); - sarcini anterioare cu anomalii cromozomice; - teste screening pozitive sugestive; - un printe cu anomalie cromozomic echilibrat cunoscut; - expunere la ageni teratogeni cunoscui n cursul sarcinii (n special n trimestrul I); - boli cronice materne cu posibil impact asupra ftului (prin deficienele funcionale organice sau prin medicaia folosit). Diagnosticul prenatal cuprinde att metode noninvazive, ct i metode invazive, acestea din urm avnd ns risc abortiv. METODE NONINVAZIVE Echografia are ca scop identificarea unor anomalii fetale structurale: defecte de tub neural, malformaii congenital de cord, anomalii scheletice, renale etc. Detecia celulelor fetale n circulaia matern, metod la limita dintre cercetare i practica medical, se bazeaz pe apariia n sngele matern a anticorpilor fa de celulele trofoblastice sau sanguine (trombocite, leucocite) nc din primul trimestru de sarcin. Metologia poate fi util att n determinarea sexului produsului de concepie (important n transmiterea bolilor legate de cromozomul X), dar i n boli monogenice cu transmitere autozomal precum i n anomalii cromozomice de tip aneuploidie. Poate fi utilizat ca test screening n grupuri int speciale cu risc crescut . Detecia ADN-ului fetal n plasma matern acest ADN, provenind din apoptoza celulelor fetale, ar fi n cantitate mai mare dect cel izolat din celulele fetale i n consecin, mai uor de detectat.

METODE INVAZIVE SUB CONTROL IMAGISTIC Fetoscopia - efectuat n sptmnile 17-20 de sarcin permite vizualizarea endoscopic a ftului, recoltarea de snge ombilical din cordon, biopsia tegumentar (n suspiciunea de epidermoliz buloas, ichtioza, hiperketatoz, n afara acestor faciliti diagnostice, metoda permite i proceduri terapeutice precum transfuzia sanguin n vena ombilical n caz de necesitate. Prezint ns risc semnificativ (510%) de avort spontan, natere prematur, pierdere de lichid amniotic, infectare de lichid amniotic. Cordonocenteza prin PUBS (percutaneous umbilical blood sampling) const n puncionarea transabdominal echoghidat a cordonului ombilical nc din sptmna 17 de gestaie. Se practic n urmtoarele situaii: - boli cromozomice ce necesit o analiz cromozomic rapid (prin amniocinteza sunt necesare culturi celulare, ceea ce ntrzie diagnosticul); 114

boli monogenice caracterizate prin sinteza de proteine anormale specifice: hemoglobinopatii (tip thalasemie), hemofilie; - suspiciune de infecie fetal (n caz de infecie matern viral rubeol, virus citomegalic sau bacterian); - incompatibilitate de grup sanguin (n cazul confirmrii fiind posibil transfuzia sau exsanguinotransfuzia n utero); - deficite imunologice. Riscul de avort spontan i natere prematur este mai redus n cazulfetoscopiei, dei rmne semnificativ (aproximativ 2% deoarece se practic cu ac subire, motiv pentru care aceast metod tinde s nlocuiasc fetoscopia. Amniocenteza - const n aspirarea transabdominal de lichid amniotic sub ghidaj echografic. Permite efectuarea de cariotip (rezultat tardiv ns, deoarece implic culturi celulare), analiza ADN, determinri biochimice. Celulele amniotice prelevate permit studierea cromozomilor (cariotipului) pentru identificarea rearanjamentelor structurale, a mozaicurilor i a aneuploidiilor, cu interpretare viciabil ns prin contaminarea cu celule materne sau, n cazul sarcinilor gemelare, prin confuzie cu celulele celuilalt ft, datorit puncionrii din greeal a sacului amniotic al acestuia. Alte surse de eroare in de tehnic sau de prezena mozaicurilor cromozomice, linia anormal innd, n acest din urm caz, nu de celulele fetale ci de cele extraembrionare. n plus, prelevarea de celule amniotice face posibil studiul ADN, necesar n unele boli genice, cum ar fi: fibroza chistic de pancreas, hemofilia, distrofia muscular Duchenne, sindromul X fragil, rinichiul polichistic etc. Din lichidul amniotic se pot face analize biochimice n vederea identificrii de proteine anormale caracteristice unor enzimopatii (fenilcetonuria, tirozinemia galactozemia, polizaharidozele etc.). Riscurile fetale ale amniocentezei sunt reprezentate de: - avort 1% (n caz de manevre repetate poate atinge 10%); - chorioamniotit; - pierderi de lichid amniotic. Riscurile materne nu sunt neglijabile: - hemoragii vaginale; - izoimunizare Rh. Puncia vilozitilor choriale (CVS) placenta primitiv (corionul) derivnd din blastocist ca i embrionul, puncia vilozitilor choriale efectuat n sptmnile 9-11 de sarcin, (niciodat mai devreme) sub control ecografic, transabdominal sau transcervical, permite, prin studierea biopunctatului obinut, diagnosticul n caz de: boli cromozomice prin metoda FISH (pe celule interfazice, identificndu-se eventuale mozaicuri cromozomice, precum i aneuploidii ce intereseaz cromozomii 13, 18, 21, X, Y) sau prin PCR pentru identificarea unor marcheri specifici cromozomici. boli moleculare prin analiza ADN-ului ce permite fie detecia direct a mutaiei (distrofia amiotrofic, mucoviscidoza, sindromul X fragil, sicklemia), fie detecia indirect (prin analiza de nlnuire n hemofilie), fie combinarea ambelor metode (neurofibromatoza, coreea Huntingron, distrofia muscular Duchenne, cancerul mamar familial, hemocromatoza). Avantajele metodei: - diagnostic precoce (trimestrul I de sarcin); 115

decelarea (n 1-3% din cazuri) de mozaicuri cromozomice adevrate (dar celulele fetale pot fi contaminate cu celulele materne ceea ce preteaz la confuzii; n plus, pot exista alte facte derutante); se impune monitorizarea sarcinii i efectuarea cariotipului din celulele fetale obinute prin amniocentez i cordono-centez. Riscurile constau n: - avort (risc superior amniocentezei); - anomalii ale membrelor (de aceea metoda este interzis nainte de sptmna a 9-a de gestaie); - pierderi de lichid amniotic, - sngerri vaginale. Placentocenteza transabdominal - este un echivalent al punciei vilozitilor coriale, util n trimestrele II i III de sarcin n caz de oligohidraminos, cnd celelalte metode (amniocenteza, cordiocenteza, PUBS) sunt practic contraindicate. Puncia vilozitilor choriale avnd indicaii asemntoare amniocentezei (dar un termen diferit), s-ar impune o contrapunere amniocentez versus CVS. PROBLEME ETICE N TESTAREA GENETIC Testarea genetic este una din cele mai importante aplicaii ale cunotinelor obinute din Proiectul Genomului Uman i reprezint analiza ADN-ului, cromozomilor, proteinelor i a unor metabolii umani pentru detectarea bolilor transmise ereditar, mutaiilor, identificarea purttorilor, stabilirea diagnosticului sau prognosticului prenatal i clinic, monitorizarea i screeningul prenatal i al nou-nscuilor. Principiile eticii identificate de Comitetul de Apreciere a Riscului Genetic din USA. (CommiTTee on Assessing Genetic Risks) se refer la dreptul la autonomie, intimitate, confidenialitate i echitate. Pe baza acestor principii, Comitetul a emis urmtoarele recomandri: - Screeningul nou-nscuilor nu poate fi avizat fr dovada necesitii lui pentru detecia i tratamentul efectiv al bolilor specifice. - Testarea copiilor se face numai n cazul bolilor pentru care exist i este necesar tratament curativ sau preventiv. - Confidenialitatea poate fi elucidat, prin dezvluirea diagnosticului la rude, numai cnd ne ateptm la lipsa unei dezvluiri voluntare i numai n situaiile cnd exist o nalt probabilitate de afectare ireversibil sau/i fatal a rudelor n lipsa acestei dezvluiri - Falsa paternitate poate fi relevat exclusiv mamei (nu i partenerului acesteia). - Informaia genetic, privitoare la statusul de purttor al solicitantului / consultantului nu poate fi dezvluit partenerului fr consimmntul consultantului. - Legislaia ar trebui astfel adoptat nct riscurile genetice s nu fie luate n considerare la luarea deciziei de asigurare medical sau privind costul acesteia. - Legislaia ar trebui astfel adoptat nct informaia genetic s nu poat fi accesat de ctre angajatorul prospectiv sau existent, dect n cazul n care poate influena exercitarea atribuiilor profesionale.

116