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Chapitre 4 : L’exocytose. Régulation calcique de la neurotransmission.

I. Introduction : un peu d’historique. La neurotransmission s’effectue au niveau de synapse (= zone de communication entre 2 neurones ou entre un neurone et un muscle par exemple). Phénomène électriques et chimiques. Concept de transmetteurs : L’expérience qui a permis de mettre en évidence la transmission chimique = expérience d’Otto Loewi.

Utilise 2 cœurs différents baignant dans cuve de liquide physiologique. 1 cœur innervé par son nerf vague 1 cœur isolé de son nerf vague Ces 2 cœurs sont raccordés à l’aide d’une pompe. Le 2ème cœur est perfusé par le liquide physiologique provenant du 1er cœur. Théoriquement : On pense que le messager est libéré dans le liquide physiologique 1 et est transmis dans le liquide physiologique 2 puis dans le cœur 2 grâce aux pompes. Observations : Stimulation du nerf vague  ralentissement de fréquence cardiaque. On observe également un ralentissement de la fréquence cardiaque du 2ème cœur.  Présence d’un messager diffusible libéré au niveau d’une synapse. La libération d’un NT d’une stimulation présynaptique peut être suive qu’au travers de son effet post-synaptique. A retenir également : il existe des synapses électriques. II. La synapse : évidences pour une libération quantique : l’exocytose. Les NT sont stockés dans des vésicules synaptiques et sont libérés par exocytose. Càd par fusion de petits compartiments membranaires (vésicules ou granules) avec la membrane plasmique.

Quelles sont les évidences ? * Evidence fonctionnelle : libération quantale. = libération par quanta (1 quanta = 1 vésicule). Enregistrement de potentiel de plaque motrice (PPM) = variation de potentiel enregistré au niveau de la terminaison post-synaptique au niveau d’une jonction neuromusculaire. Cet enregistrement = reflet de la libération du NT. Au niveau de la plaque motrice : Acétylcholine avec un récepteur nicotinique. On stimule le motoneurone électriquement, on enregistre une grande variation de potentiel = un PPM sur lequel vient se greffer un PA. C’est le reflet de l’Ach qui a été libérée suite à la stimulation. Lorsque l’Ach se fixe sur son récepteur  le canal s’ouvre (car récepteur canal)  dépolarisation. + il y a d’Ach, + l’amplitude de PPM est important. L’amplitude de PPM est proportionnelle à la quantité d’Ach libéré. Après stimulation des fibres motrices. Enregistrement de variations de potentiel de grande amplitude (ppm suivi de PA).  Schéma 1. En condition de repos, on enregistre ce qu’il se passe au niveau post-synaptique. Si on plante l’électrode dans la plaque motrice, on enregistre de petites variations de potentiel que l’on a appelé : potentiel de plaque motrice miniature (PPMminiature). On observe donc des variations de potentiel même sans stimulation  dû à de l’Ach qui est libéré de manière spontanée. Si j’éloigne l’électrode d’enregistrement  on enregistre plu rien. Les PPM sont trop petits pour atteindre le seuil et ne déclenche pas de PA  les variations de potentiel se dissipent et ne peuvent pas être enregistrées. La plupart des PPMminiature (PPMM) ont presque tous la même amplitude  phénomène unitaire. Ces phénomènes obéissent à la loi du tout ou rien. Chacun des PPMM ont la même amplitude car une vésicule a presque toujours la même taille. Reflète le signal engendré par la libération de NT. Libération d’1 quanta d’Ach. Un PPM a une amplitude qui est égale à un multiple stricte de l’amplitude PPMm.

PPM = n * PPMM n = nombre de vésicules. Quelle est la quantité d’Ach dans une vésicule ? Comment faire pour mesurer la quantité de molécules de NT/vésicule ? On utilise la microiontophorèse. Une électrode dans laquelle on met une concentration connue d’Ach (ou d’un autre NT). Cette µélectrode est ouverte, on l’approche de la terminaison post synaptique où il y a les récepteurs nicotiniques. On a évalué que : 1 quantum d’ACh = 1 paquet d’environ 10 000 molécules. Environ 500 mmole.L-1 d’ACh dans une vésicule. Ex : Applique Ach 100mM  schéma 2. On fait passer un courant électrique dans l’électrode et l’Ach est libérée et va se fixer sur ses récepteurs. Quel est l’amplitude du PPMM lorsque l’Ach est libérée spontanément ? On compare le résultat obtenu avec une courbe expérimental réalisée par microiontophorèse. Conclusion, on a évalué que : 1 quantum d’ACh = 1 paquet d’environ 10 000 molécules. Environ 500 mmole.L-1 d’ACh dans une vésicule. Les études au microscope électronique ont fourni à la notion de quanta un support morphologique : preuves de la libération vésiculaire. 1ère preuve : Dans une terminaison post-synaptique, il y a toujours des vésicules de même taille environ. La synapse est remplie de vésicules synaptiques. A la jonction neuromusculaire, les vésicules synaptiques s’alignent au niveau de zones actives pré-synaptiques, prêtes à fusionner.

2ème évidence : On voit les vésicules (ou granules) fusionner sur la membrane plasmique. (On observe des figures en oméga).

3ème évidence : Techniques de cryofracture. On plonge un échantillon dans un milieu très froid (très brutalement) et on casse l’échantillon. Souvent l’échantillon se casse entre les 2 feuillets (endroit le + fragile).  Permet de voir les feuillets de la membrane.

E = ectoplasmique P = protoplaste On observe des trous à l’endroit où il y avait des protéines. Et on observe des protéines de profusion = qui dépassent. On observe également un alignement de particules lorsque la synapse n’est pas stimulée. Après stimulation électrique  toujours alignement de particules + il y a des trous dans la membrane appelés puits (ou pores de fusion). Ces puits correspondent aux pores formés lors de la fusion des vésicules.  schéma 3.

III.Exocytose constitutive vs exocytose constitutive.

On distingue 2 types d’exocytose :

• constitutive = due à des vésicules se formant depuis le réseau transgolgien. Elles sont adressées vers la membrane plasmique. Ce qui caractérise cette voie c’est qu’elle s’effectue généralement à vitesse constante. Comme c’est un processus permanant, on n’observe pas de stock de ces vésicules. A pour fonction principalement : le renouvellement des constituants membranaires et le renouvellement de la matrice extracellulaire. La vitesse d’exocytose n’est pas régulée. Ce processus est régulé uniquement pas la vitesse de synthèse protéique. Mécanisme universel. • Régulée = des vésicules bourgeonnent du réseau transgolgien. On trouve des stocks de vésicule. Les stocks se trouvent dans la zone active pour une synapse. Ces stocks vont attendre un signal (ex : fixation d’une hormone sur un récepteur membranaire). Régulation de l’exocytose et donc de la vitesse de libération par des messagers intracellulaires. Mécanismes non universel, il est commun à différents types de cellules : - Neurones  NT - Endocrines  hormones peptidiques - Exocrines  libération d’enzymes digestives - Mastocytes  histamine

Au cours de l’exocytose, les vésicules bourgeonnent depuis le réseau transgolgien, notamment grâce à la présence de protéines coatamères (coat 1, coat 2 et clathrine), on obtient des vésicules immatures = vésicules de grande taille où le matériel interne est peu condensé. Au fur et à mesure de la migration vers la membrane, il y a un phénomène de maturation avec condensation du matériel transporté. Il y a également une maturation biochimique. Ce sont ces vésicules matures qui vont pouvoir fusionner aves la membrane plasmique et pas les autres.

Polarisation des mécanismes de l’exocytose : Les mécanismes d’exocytose peuvent être polarisés. B. On induit l’exocytose  elle se produit partout dans la cellule. C. L’exocytose n’est déclenchée que du côté de l’agent stimulant. Exocytose polarisée même sur une cellule non polarisée. Il peut aussi y avoir une polarisation morphologique. Ex : cellules épithéliales. Qu’est ce qui fait que les vésicules sont orientées vers le pôle apical ou vers le pôle basolatéral ?

Des séquences protéiques, dans les membranes des vésicules, permettent d’envoyer certaines vésicules spécifiquement vers le pôle apical ou vers le pôle basolatéral. Ex : Signaux : présence d’une tyrosine et / ou présence de leucines détermine l’orientation vers le pôle basolatéral. Au niveau apical, les vésicules ciblées vers le pôle apical contiennent des protéines à ancrage GPI (Glycosyl Phosphatidyl Inositol). Le groupement GPI permet à la protéine de s’ancrer à la membrane. Les vésicules contenant ces groupements GPI sont orientées vers la membrane apicale.

Vers la membrane basolatérale : signaux dans la terminaison cytoplasmique. 1) signal contenant 1 tyrosine et 2) 2 leucines adjacentes. Ces acides aminés sont reconnus par des protéines coatamères qui les assemblent dans des vésicules de transport au niveau du réseau trans Golgi. Trafic membranaire dans la synapse :

Corps cellulaire + synapse (coupé pour meilleure visualisation). Des vésicules se forment et vont être orientées vers la membrane plasmique. A partir du réseau transgolgien, on peut avoir des mécanismes d’exocytose constitutive et des mécanismes d’exocytose régulée (pour les neuropeptides et non les NT). Les vésicules qui permettent la libération de NT proviennent des endosomes. Ces endosomes permettent le bourgeonnement de vésicules synaptiques. Dans un 1 er temps, les vésicules sont vides. Puis elles sont remplies et vont pouvoir alors fusionner par exocytose. Maturation = remplissage par des NT. Lors de l’exocytose : on incorpore un bout de mb supplémentaire, en permanence, un phénomène d’endocytose compense. Car sinon la surface de la membrane plasmique ne ferait qu’augmenter de taille. On obtient une vésicule d’endocytose qui : - peut être orientée vers les endosomes - ou peut être directement réutilisé en étant rempli de NT  permet réutilisation rapide de vésicules. IV. Couplage stimulation-neurotransmission (stimulation-sécrétion) : Rôle du calcium Le calcium est le second messager essentiel à la neurotransmission. 1er messager = hormone 2nd messager = Ca2+, IP3… Pour qu’une molécule soit considérée comme un messager, il faut : • En présence du 1er messager, la concentration du 2nd messager doit augmenter de manière importante. • La molécule doit agir spécifiquement sur des cibles et induit une réponse physiologique. Que faut-il à une molécule pour être un (bon !) second messager ? • Elle doit agir sur un récepteur/senseur/effecteur.

 Site de fixation couplé à un élément de réponse.  Réponse physiologique (contraction, sécrétion…) • Sa concentration doit changer de manière significative en réponse à un autre signal.  Système pour création et destruction du message.  Niveau du second messager doit changer en réponse à un stimulus naturel et ceci avant et pendant que la cellule répond. Calmoduline  senseur à Ca2+. Protéine kinase A  senseur à AMPc.

V. Le calcium comme second messager. Le calcium peut rentrer par des canaux ioniques et est capable de déclencher l’exocytose. Mais l’exocytose est dépendant du cytosquelette et le calcium intervient sur de nombreuses protéines du cytosquelette. Le calcium agit à différents niveaux.

Exocytose et 2nd messagers : Le calcium stimule la sécrétion régulée. On peut changer la concentration en calcium à l’extérieur de la cellule. Comment peut-on aller contrôler la concentration en calcium à l’intérieur de la cellule ? On peut utiliser un détergent doux qui va faire des petits trous dans la membrane = perméabilisation de cellule. Le calcium peut alors entrer. On peut alors contrôler les concentrations internes et externes de calcium. Permet de maintenir la concentration en calcium dans les cellules à une valeur connue.  Principe de perméabilisation. On peut contrôler la taille des molécules que l’on veut faire entrer selon la grosseur des trous dans la membrane. A une concentration physiologique de repos  très d’adrénaline est libérée. Si entrée de + de calcium  entrée de bcp d’adrénaline. La sécrétion hormonale est associée à des variations de calcium.

Sécrétion d’insuline par les ilots de Langerhans. Quand la concentration en glc plasmique est élevée, la concentration d’insuline est élevée. La sécrétion d’insuline suit parfaitement les oscillations de calcium. Un stimulus (glucose) est capable d’induire l’augmentation de calcium (cytosol) qui est capable de stimuler la sécrétion (insuline) ou la neurotransmission. Qu’est ce qui fait que ces cellules ont une sécrétion calcium dépendante ? Ce sont des cellules excitables càd qu’elles présentent des PA. Ces PA sont associés à une entrée de calcium. Les canaux qui participent à la dépolarisation sont des canaux calciques voltages dépendants. L’entrée de calcium permet de stimuler la sécrétion hormonale. Si l’on bloque ces canaux calciques, on bloque les PA de manière réversible et on bloque la sécrétion. Le calcium et la transmission synaptique : Ce qui caractérise le bouton synaptique : il y a des canaux calciques voltages dépendants. Si on mesure les PA, ils sont bcp + longs que ceux de l’axone. 1ère phase due à un canal sodique et 2ème phase due à un canal calcique. Lorsqu’on stimule la terminaison présynaptique (arrivée d’un PA), le PA sodique permet l’ouverture de canaux calciques voltages dépendants. A ce moment là, le calcium entre dans le bouton et stimule l’exocytose. Délai entre entrée de calcium et exocytose = 0,1 msec. Il y a donc très peu d’étapes biochimiques entre ces 2 phénomènes.

Structure générale des canaux calciques voltage-dépendants : Ne sera pas à l’exam ! Un canal calcique est caractérise par sa SU port α1. C’est elle qui donne les principales propriétés du canal. Il y a 3 grandes familles de canaux calciques voltages dépendants : • Les canaux calciques de type L permettent la sécrétion hormonale. (entrée de clacium longue). • Les canaux de types P, Q, N et R (= canaux présynaptiques) permettent la libération des NT. Ils participent à la neurotransmission. • Les canaux de types T ont des fonctions de canaux PaceMaker. (entrée de calcium transitoire). La zone active synaptique : site de libération présynaptique :

Les vésicules se rapprochent de la zone active. Au niveau présynaptique : structure ou les vésicules sont condensées au même endroit = zone active et au même endroit on a les canaux calciques voltages dépendants. Lorsque le PA arrive et que le Ca passe par ces canaux  les 1ères cibles du calcium sont les protéines vésiculaires. L’ensemble canaux calcique/vésicules synaptiques forment un microdomaine. Pdt un PA, la concentration en calcium passe de 10-7 mol/L à 10-4 mol/L. Donc localement la concentration en calcium va augmenter d’un facteur 1 000 au moins. Caractéristique du senseur calcique = (il se trouve sur la membrane vésiculaire) il a une faible affinité pour le calcium. Donc s’il la vésicule est un petit peu + loin du canal  le senseur calcique n’est pas activé. Cette faible affinité a pour avantage que les vésicules stimulées sont celles qui st très prés du canal. Ciblage entre un canal donné et une vésicule donnée. Une vésicule à proximité d’un canal calcique peut être libérée par un seul PA. Par contre, une bouffée de PA sera nécessaire pour libérer les vésicules les plus éloignées ou les vésicules les plus grosses (neuropeptide).

VI.Le cycle synaptique et l’exocytose.

Les vésicules synaptiques ont 3 origines : - Golgi - Endosomes - Membrane plasmique Le cycle synaptique démarre d’un compartiment intracellulaire. 1ère étape : Bourgeonnement (du golgi ou des endosomes). Ce bourgeonnement créé des vésicules vides. 2. Stockage = Remplissage des vésicules synaptiques avec le NT. 3. Transit vers la membrane = étape de recrutement des vésicules. 4. Les vésicules arrivent près de la membrane plasmique, il y a interaction physique/moléculaire entre membrane vésiculaire et membrane plasmique = arrimage (=amarrage, accostage ou docking). 5. Interaction physique se resserre. Les interactions moléculaire : augmentation de la force d’interaction entre les protéines = étape d’amorçage. Etape de maturation des vésicules. Cette étape nécessite des phosphorylations, donc ATP indispensable. 6. Quand le stimulus ultime intervient (augmentation de Ca2+), les 2 compartiments membranaires fusionnent = étape de fusion membranaire / exocytose. Libération des NT. 7. La cellule va être capable de recycler des fractions de membrane plasmique = endocytose. Ces vésicules sont alors vides. Elles ont plusieurs destinés possibles en fonction de l’état des protéines se trouvant à la surface des vésicules. - Si les protéines de surfaces de la vésicule sont en bon état. Ces vésicules peuvent être reremplis de NT et reservir dans un cycle court. - Lorsque les protéines à la surface ont été dégradées, les vésicules peuvent être envoyées vers les endosomes. Les endosomes vont servir à faire le tri entre des fractions membranaires qui vont être envoyées vers les lysozomes et les fractions membranaires qui pourront à nouveau faire le bourgeonnement  cycle synpatique. Cycle lent dure environ 1min. L’étape d’exocytose ne prend que 0,1 msec  étape centrale mais la + courte.

Au niveau d’un bouton présynaptique, il y a plusieurs populations de vésicules : - transit - prête à fusionner avec la membrane - sont prêtes à fusionner avec les membranes Lorsqu’un stimulus intervient une entrée de Ca2+, passage des différentes vésicules d’une étape à une autre. VII. Les mécanismes moléculaires de l’exocytose. 1. Les protéines et leur localisation. Ces protéines se trouvent dans : Mb vésiculaire, mb plasmique et cytoplasme. • Vésicules : protéines associées de manière stable = protéines qui ont des compartiments transmembranaires. Dans membrane vésiculaire (vésicule = 50nm de diamètre). Syntaxin : rôle fondamental dans exocytose. Stockage des NT : nécessite 2 protéines = un transporteur de NT et une pompe à protons. La pompe à protons génère un gradient de protons qui est utilisé pour stocker des NT. • Vésicules : protéines associées transitoirement. Synapsin, CaMKII = CaM Kinase de type II et Myosine V. Ces 3 protéines permettent l’interaction avec les filaments d’actine. Ce sont des protéines qui interagissent de manière définitive avec les vésicules. Au niveau d’axones et de dendrites, on peut observer le déplacement de vésicules le long de filaments du cytosquelette. Possible grâce à des moteurs moléculaires. Protéine qui participe à la formation d’un manteau sur les vésicules : Clathrine Protéines adaptatrice : Adaptrines De plus, tjrs dans membrane vésiculaire : synaptobrevin et synaptotagmine Au niveau de la membrane plasmique : syntaxine, SNAP-25 et canaux calciques Protéines cytosoliques : NSF et αSNAP et Munc18.

NSF et αSNAP : ce sont ces protéines qui ont été découvertes en 1er. NeM : N-éthyl maléimide = cette molécule bloque l’exocytose. Ils ont cherché la protéine sensible au NeM. 1er candidat = NSF (Nem sensitive fusion protein). 2ème candidat = protéines SNAP (protéine d’attachement du NSF soluble) Ils ont isolés ces protéines membranaires et les ont appelés SNAPreceptor = SNARE. Les SNARE sont des récpeteur à SNAP. Mais SNAP25 n’est pas une SNAP (elle porte juste ce nom à cause de son action = synaptosomalassociated protein). 2. Le cytosquelette. Lorsqu’on observe des coupes microscopiques de boutons présynaptiques, on observe des vésicules. Certaines sont recouvertes d’un manteau et d’autres non. Les endosomes bourgeonnent. La formation du manteau protéique permet le bourgeonnement. 1. Bourgeonnement  manteau protéique de Clathrine. Puis Scission (séparation vésicule de l’endosome) : une protéine forme un étranglement = Dynamine. Clathrine = les protéines de clathrine ont une forme de triskel et s’associent ensemble  formation de pentagone régulier. Entraine une courbure de la membrane et la membrane se trouve piégée au centre de cette structure. La vésicule se trouve au centre de cette association de Clathrine. La clathrine interagit avec des protéines adaptatrices = les Adaptines qui interagissent elles même avec des protéines transmembranaires = récepteurs. La dynamine est une GTPase. Permet séparation de la vésicule de l’endosome. Il y a ensuite perte du manteau (grâce à des enzymes) car il ne sert qu’au bourgeonnement. On trouve donc des vésicules lisses qui vont pouvoir être endocytées. 2. Etape de recrutement. (diapo46) Essentiellement filaments d’actine et cytosquelette en sont responsables. Des toxines du cytosquelette modifient/altèrent l’exocytose. En stabilisant le cytosquelette  inhibe libération de NT. Agents dépolymérisants  stimulent la libération de NT.

L’augmentation du Ca2+ est capable de modifier le cytosquelette  entraine une dépolymérisation des filaments d’actine. 2 modèles de fonctionnement impliquent ce rôle de barrière (diapo 48) :

Les vésicules sont attachées au cytosquelette (= filaments d’actine) par l’intermédiaire de la synapsine (p°). Lorsque la synapsine est non phosphorylée, elle est située au niveau de la vésicule et permet l’interaction vésicules/actine. Lorsque la synapsine est phosphorylée, elle se détache (ou libère) des vésicules. Lorsque du calcium entre dans la terminaison présynaptique, il active des kinases sensibles au calcium = CaMkinase II. (Calcium-calmoduline dependent Kinase). Donc phosphorylation de la synapsine et libération de la synapsine de vésicules. Mais un certain nombre d’étude montrent le contraire :s. Généralement, ces effets aberrants sont observés à haute concentration de toxine. L’actine ne serait donc pas qu’un réseau passif.

Rôle de la myosine Va :

Elle permet aux vésicules de se déplacer le long de microfilaments d’actine. Interaction actine/myosine. La myosine se déplace le long du filament d’actine pour arriver au niveau de la membrane plasmique et pouvoir fusionner avec cette membrane.

En réalité les 2 modèles coexistent : - modèle de rail : progression le long d’un filament d’actine. - barrière : emprisonne les vésicules qui forment un réseau.

Arrimage : 2 étapes d’arrimage : - permet faible interaction avec la membrane plasmique  Exocyste. - interaction plus forte avec la membrane plasmique  SNARE 2 complexes moléculaires : - exocyste : en bleu - SNARE : formé de protéine SNARE

Lorsque le complexe exocyste se former, à ce stade, l’arrimage est réversible. Les vésicules peuvent se détacher de la membrane plasmique. Une fois que le complexe SNARE est formé, cela devient relativement irréversible. Arrimage : Formation de l’exocyste : rapprochement de la vésicule, grâce au rapprochement des SU.

Le complexe SNARE nécessite un rapprochement suffisant des 2 compartiments membranaires (fait par exocyste). Ces complexes SNARE participent à tout le trafic intracellulaire. Toutes les interactions membranaires nécessitent des protéines SNARE. La spécificité du trafic intracellulaire est assurée par le sous type de SNARE utilisé. Mécanisme universel dans la cellule, à l’échelle de l’évolution. Ubiquitaire car présent dans toutes nos cellules. Pr se former, un complexe SNARE nécessite 3 protéines SNAREs : - 1 SNARE dans le compartiment donneur (vésicule) = v-SNARE = synaptobrévine. - 2 SNAREs dans le compartiment accepteur (cible) = membrane plasmique. Ces 2 protéines sont des t-SNAREs = syntaxine + SNAP 25.

Lorsque ce complexe est formé, il peut y avoir fusion entre les différents compartiments. La formation de ce complexe permet la spécificité des vésicules vers la membrane plasmique. Le complexe interagit avec des molécules cytosolubles. Les protéines SNARE s’associent avec des protéines cytosolubles NSF et SNAPα.*

Amorçage : Le complexe SNARE devient de + en + resserré  augmentation de la force d’interaction entre t-SNARE et v-SNARE. Comment s’effectue l’interaction t-SNARE/v-SNARE ? Les 4 hélices alpha s’enroulent les unes autour des autres et l’enroulement commence des extrémités. Les super-hélices se resserre de + en + comme une fermeture éclaire et donc la vésicule se rapproche de la membrane. Un effet mécanique tire donc sur la vésicule = effet de traction. Des mécanismes de phosphorylation des protéines SNAREs permettent le super-enroulement des hélices. Le calcium est capable d’activer les protéines kinases qui phosphorylent les protéines SNAREs. La vésicule se rapproche de la membrane plasmique.

Interaction physique moléculaire entre canaux calciques et p° SNAREs. Il existe de vrais microdomaines calciques. La synaptotagmine est activée  augmente encore + l’interaction protéique entre les protéines SNARE. Lorsque le calcium est fixé à la synaptotagmine, elle a alors une affinité forte avec les phospholipides membranaires et donc avec la membrane plasmqiue. La vésicule se rapproche donc de la membrane plasmique. Les molécules d’eau entre les 2 membranes (vésicule et plasmiques) sont expulsés. Les 2 feuillets membranaires et cytoplasmiques fusionnent et le NT est expulsé. La fusion : mécanisme protéique ou lipidique ? On ne sait pas. On suppose que c’est un mécanisme de type protéique.