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Trafic intracellulaire et compartiment cellulaire I - Introduction

Toutes les protéines sont fabriquées dans le cytoplasme. Elles auront plusieurs destinations possibles : le noyau (facteur de transcription), la mitochondrie, les peroxysomes, les plastes chez les végétaux. Ici nous parlerons uniquement des protéines destinées au réticulum endoplasmique granuleux donc destinées à être sécrétées. Ensuite elles passent dans le Golgi qui est un carrefour pour les protéines. Après le Golgi, elles peuvent soit emprunter la voie des : – Lysosome – Membrane plasmique – Vésicules de sécrétions
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– Excision du peptide signal qui lui permet d'être engagé dans le réticulum endoplasmique. – Formation de ponts disulfures entre 2 résidus cystéine (donc ne touche pas toute les protéines) qui leurs permettent d'obtenir une conformation spécifique. – Glycosylation (soit N-glycosylation ou O-glycosylation), extrêmement complexe car dure pendant tout le voyage de la protéine mais sera spécifique d'un compartiment à un autre. – Phosphorylations qui à lieu dans le Golgi moyen – Sulfatation et protéolyse qui coupe les protéines en petites parties – Centre de tri qui cible les protéines vers les 3 voies citées précédemment Certaines cellules contiennent une deuxième voie de sécrétion : la voie de sécrétion régulée

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II - Les différents organelles impliqués dans la sécrétion des protéines
1 - Les réticulum

Le réticulum endoplasmique granulaire : il est tapissé de ribosomes. Le réticulum endoplasmique lisse : il n'est pas impliqué dans la transformation des protéines mais dans la production de stéroïdes et d'autres constituants.

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a - Adressage au réticulum

Les protéines sécrétées vont être soumise à une translocation co-traductionnelle : la formation de la protéine se fait en même temps qu'elle rentre dans le réticulum endoplasmique. Les protéines intracellulaire et non sécrétées vont être soumise à une translocation post-traductionnelle : les protéines sont entièrement traduite avant d'être adressées à leurs compartiments. Approches expérimentales pour déterminer l'adressage des protéines : Pulse chase + autoradiographie : détermination du lieu de synthèse et du trajet de molécules marquées radioactivement Fractionnement cellulaire + chromatographie, électrophorèse : précise aussi la nature des composés et les modifications subies. Immunocytochimie : détection in situ Génie génétique (protéines de fusion ou chimères) : suivi des déplacements en temps réel

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Hypothèse du "signal" d'adressage au RE : G.Blobel et Dobbenstein (1975). Existence d'un translocon : preuve apportée par l'électrophysiologie (1983). Il existe un signal qui permet au protéine de s'adresser aux ribosomes.

Le protéine SRP lie le peptide signal et permet l’arrêt de la traduction. Il emmène l'ensemble vers la membrane du RE. La protéine SRP s'associe au récepteur de la SRP (hétérodimère) qui entraîne une déformation. Cette déformation permet : – la dissociation de la SRP au complexe qui retourne ensuite dans le cytosol. – au peptide signal de s'engouffrer dans le translocon. En traversant la membrane du réticulum, la traduction va reprendre. Le peptide signal est hydrophobe, c'est pour ça qu'il passe la membrane facilement. La signal peptidase va cliver le peptide signal. L'appareil de translocation est composé d'un récepteur de la particule SRP

b - Biosynthèse des protéines membranaires
La protéines va avoir 2 domaines hydrophobes : le peptide signal et le domaine trans-membranaire. Lorsque la séquence trans-membranaire, rentre dans le RE, la traduction s’arrête. Parfois le peptide signal ne sera pas clivé et contribuera à la partie hydrophobe transmembranaire de la protéine.

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– Protéines membranaires de type 1 : la partie N-terminale se trouve dans la lumière du réticulum. – Protéines membranaire de type 2 : la partie C-terminale se trouve dans la lumière du réticulum. Les types 1 et 2 sont déterminé selon la charge des 15 premiers acides aminés de part et d'autre la protéine. Si du coté C-terminal, on a + 2 en charge globale et du coté N-terminal, on a 0, on fait la différence C - N < 0 alors la protéine sera de type 2, si C - N > 0 alors la protéine et de type 1

c - Modifications des protéines
La peptide disulfide isomérase : elle a une activité de correction (certain pont disulfure se font de manière erronés) et elle établie les bons ponts disulfures. Cela permet à la protéine d'adopter la bonne conformation (folding) 2 types de glycosylation : – N-glycosylation : le sucre se lit sur une asparagine mais il faut quand même une séquence consensus (Asn-X) – O-glycosylation : le sucre se lie soit à une sérine ou une thréonine

d - Les signaux de localisation dans le RE
Transport rétrograde du Golgi vers le RE : – Présence de signaux de tri "récupération" par le RE (lorsque les protéines ont été trop loin et qu'elles n'ont rien à faire en dehors du réticulum) – En fait, la récupération sélective des protéines résidentes dans le réticulum leurs permettent de subir des modifications post-traductionnelles – Elles reviennent à l'aide des vésicules sélectives – « Prison ouverte » Protéines résidentes de membrane du RE : – Signal KKXX (lysine-lysin-AA-AA) à l’extrémité C-terminale des protéines de la membrane du RE

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– Signal qui se lie directement à COP1 → emballage dans des vésicules à COP1 → transport rétrograde vers le RE Protéines résidentes solubles : – Signal KDEL (lysine-Asp-Glu-Leu) à l'extrémité C-terminale des protéines solubles du RE – Signal qui ne se lie pas directement à COP1 : présence de protéines réceptrices spécialisées comme le récepteur à KDEL Récepteur à KDEL : – Protéine transmembranire à plusieurs passages – Les récepteur à KDEL Recyclage du récepteur à KDEL : • VTC/Golgi – Forte affinité pour la séquence KDEL → – Capture des protéines résidentes du RE qui se sont échappées et qui sont à faible concentration – Milieu légèrement acide → liaison Dans le RE – Faible affinité pour la séquence KDEL → – Libération du cargo malgré la forte concentration en protéines résidentes du RE portant le signal KDEL – Milieu à pH neutre → libération – Se lie à toute séquence KDEL → vésicule à COP1 → transport rétrograde vers le RE

Trajet rétrograde des protéines résidentes dans le RE :

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Maintient des protéines résidentes du RE dans le RE : – KDEL / KDEL récepteur – Protéine résidente sans son KDEL → sécrétion de la protéine, mais sécrétion lente ⇒ – KDEL / KDEL récepteur ne servirait que pour faire revenir les protéines qui se sont échappées ⇒

– Autre mécanisme : agrégation des protéines entre-elles → trop gros pour une vésicule 2- L'appareil de Golgi Premier organite décrit par les microscopistes à la fin du 19ème. Accumulation de petit saccules directement en liaison avec le RE

– La face cis : est la plus proche physiquement du RE – La partie médian – La face trans : la partie la plus éloignée du RE → le réseau trans-golgien, véritable car refour de la cellule

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a- Rôle du complexe golgien
• Synthèse de glycoprotéines et de protéoglycanes

– Modifications des chaînes N-liées vers des chaînes exportables par ajout de nouveaux oses – O-glycosylation sur des protéines – Greffage de sucres sur certains lipides → glycolipides • Clivages protéolytiques

– Certaines protéines destinées à la sécrétion devront subir plusieurs clivages, ceux-ci, amorcés dans le TGN se poursuivent dans les grains de sécrétion • Centre de tri

– Les saccules du Golgi font l'objet d'échanges antérogrades et rétrogrades par des vésicules à manteau COP1

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b - Le réseau trans-golgien (TGN) est un centre de tri

Les mannose 6 phosphate : signal de ciblage vers la voie lysosomale
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III – Le trafic vésiculaire
Le transport vésiculaire doit permettre : – le maintient de la symétrie de la membrane (la composition de la membrane du Golgi n'est pas la même que la membrane plasmique) Il doit y avoir un ciblage des vésicules, elle doivent se rendre au bon endroit. – le transport des molécules solubles qui ne peuvent passer les membranes seules.

• • •

1ère étape : bourgeonnement à partir du compartiment donneur. 2ème étape : formation de la vésicule qui doit être ciblée vers des compartiments spécifiques (se fait à l'aide des protéines SNARE) 3ème étape : fusion avec la membrane réceptrice

Équilibre entre les compartiments : – entrées = sorties – pour les membranes et pour les cargos (ce qui est transporté) → – un aller et un retour – sélectivité (des cargos transportés et des destinations)

Problème : si il y a un échange permanent entre les compartiments, il y aura un mélange des molécules et à terme, les compartiments finirons par être identique. La solution : marqueurs moléculaires exprimés à la surface cytosolique des membranes Méthodes d'approches : – Systèmes sans cellules – Protéines de fusion avec la GFP – Génétique

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1. Les types de vésicules

Éléments d'approche :

2. Assemblage du manteau (les GTPases) 3. Guidage du transport (les SNARE) 4. Amarrage (protéines Rab 5. Fusion

1 – Les types de vésicules Le recouvrement de la face cytosolique des vésicules va permettre la bourgeonnement, ensuite ce manteau disparaît et il y aura fusion de la membrane. Les 2 rôle du manteau :

– Concentration de protéines membranaires dans un patch qui formera la vésicule → permet la sélection des molécules à transporter – Moule la vésicule qui aura ainsi toujours a peu près la même taille

Les 3 types de manteau des vésicules recouvertes : – clathrine – COP1 – COP2

On peut les distinguer en microscopie électronique

Utilisation des différents manteaux dans le trafic vésiculaire : – Clathrine : à partir et à partir de la membrane plasmique (au moins 3 types de vésicules à clathrine) – COP1 et COP2 : à partir dur RE et du Golgi – beaucoup d'autres 2 - Assemblage du manteau (les GTPases)

a – Exemple de la clathrine (cas le plus étudié)
– Une sous-unité de clathrine = 3 grosses chaînes + 3 petites chaînes – Une sous-unité = un triskélion
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– Assemblage des triskelions en un panier d'hexagones et de pentagones – Les triskelions peuvent s'assembler spontanément en panier même sans membrane. Le manteau de clathrine ;

• • •

Un manteau = 36 triskélion (sans la vésicule) 12 pentagones + 6 hexagones Formation de 2 coquilles :

– externe – interne : domaine N-terminaux des chaînes lourdes ou se fixent les adaptines • Sur une vésicule : 12 pentagones + beaucoup plus d'hexagones

L'adaptine : – Protéine de manteau à clathrine – Complexe multiprotéique – Lie la clathrine à la membrane – Piège les protéines transmembranaires dont les récepteurs qui capturent les cargos solubles – Au moins 4 types d'adaptine pour les différents récepteurs de cargo

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Assemblage et désassemblage d'un manteau de clathrine : – Les adaptines se lient à la clathrine et au complexe cargo/cargo-r – Dynamine = GTPase

Pincement de la membrane : – Dynamine + autres protéines – Fusion des feuillets non cytosoliques (grâce à la dynamine)

Perte du manteau : • • La vésicule quitte la membrane Le manteau de clathrine est perdu immédiatement

– intervention de chaperonnes de la famille des hsp70 (ATPase) – auxilline active l'ATPase
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• La vésicule doit attendre d'être constituée pour que le manteau se retire Spécificité du manteau : • • Mécanismes généraux identiques Mais chaque membrane à ses spécificités

– membrane plasmique (riche en cholestérol) : nécessite de beaucoup d’énergie – autres membranes : existence de bourgeonnements Toutes les vésicules ne sont pas sphériques : – Membranes contenant des protéines fluorescentes – Long tubules qui émanent des endosomes et réseau trans-golgien (TGN) – Ces tubules peuvent servir de transporteurs (grand rapport surface / volume) – « une vésicule peut être tubulaire ! » L'activation de ce système marche comme le système Kinase ou Phosphatase mais avec des protéines spécifiques.

b – Contrôle de l'assemblage du manteau : GTP binding proteins (rappel)

Le système fonctionne comme la signalisation par phosphorylation mais avec la GTP binding protein (donc le schéma de droite)

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➢ GTP binding proteins • 2 états – Actif avec liaison de GTP – Inactif avec liaison de GDP • 2 types – Monomèrique (= GTPases monomèriques) les mieux connues – Trimèrique (= GTPases trimèriques = protéines G) ➢ Passage d'un état a l'autre par • •

GEFs (Guanine-nucleotide-Exchange Factors) GDP → GTP GAPs (GTPase-Activating Proteins) GTP → GDP

c - Protéines autres que la clathrine
Cop1 : 7 sous-unités protéiques (analogies avec l'adaptine) - bourgeonnement à partir du Golgi Cop2 : 4 sous-unités protéiques - Bourgeonnement à partir du RE

GTPases de recrutement du manteau : la séquence - Une vésicules à COP2 est sur le point de bourgeonnement -.......
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GTPases de recrutement du manteau : les acteurs : – Membrane du RE – Sar 1 GDP (= GTPases de recrutement du manteau) forte concentration, cytosolique, inactive – GEF (Guanine-nucleotide-Exchange Factor) GTPases de recrutement du manteau : la séquence : Une vésicule à COPII est sur le point de bourgeonner (du RE). Une GEF spécifique (protéine de membrane du RE appelée Sec 12) se lie a la Sar 1 du cytosol et remplace le GDP de la Sar 1 par du GTP. La Sar 1 GTP libère une queue d'acide gras lui permettant de se fixer dans la membrane du RE puis recrute des sous-unités de COPII. La membrane bourgeonne en incluant des protéines membranaires sélectionnées

Désassemblage du manteau : – GTPases de recrutement du manteau – Hydrolyse du GTP en GDP – La queue est exclue de la membrane – → désassemblage du manteau – C'est le temps qui finit par déclencher l'hydrolyse

3. Guidage du transport (les SNARE)

Abréviations - SNAREs : SNAP receptors - SNAPs : Soluble NSF Attachement Proteins - NSF : N-ethyl
– Reconnaissance vésicule de transport ↔ membrane cible – Toutes les vésicules de transport ont des marqueurs de surface spécifiques de leur origine et de leur cargo – Les membranes cibles ont des récepteurs complémentaires

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Reconnaissance vésicule de transport ↔ membrane cible : 1. SNAREs – Spécificité – Catalyseur de la fusion 2. Rabs (GTPases cible) – Amarrage initial – Fixation de la vésicule – En collaboration avec d'autres protéines SNAREs • • • Au moins 20 espèces différentes Protéines trans-membranaires Marchent par 2 : – v-SNAREs (vesicle) → clef •

– t-SNAREs (target = cible) → serrure

Domaine hélicoïdale qui s'enroule l'un dans l'autre → complexe trans-SNARE qui contribue

Rôle des SNAREs dans le guidage des vésicules de transports

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Complexe trans-SNARE : • Toujours 4 hélice alpha – 3 formées par t-SNARE – 1 formée par v-SNARE • Ici 3 protéines – v-SNARE 1 hélice (synaptobrévine) – t-SNARE 1 hélice (syntaxine) – t-SNARE 2 hélices (Snap 25 : protéine périphérique) Désassemblage du complexe trans-SNARE – Âpres fusion le complexe SNARE est stable dans la membrane – Doit être désassemble ⇒NSF (Nethylmaleimide-sensitive-fusion-protein) NSF : – Cycle entre les membranes et le cytosol – Catalyse le désassemblage – ATPase – Ressemble a une chaperonne cytosolique qui solubilise et aide a replier correctement les protéines dénaturées – Déroule les hélices des SNAREs – en collaboration avec des protéines adaptatrices

– NSF + des protéines adaptatrices → hydrolyse ATP + séparation des SNAREs – La dissociation regule quand et ou les membranes vont fusionner

Dissociation d'une paire v-SNARE t-SNARE par NSF une fois le cycle de fusion terminé

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4. Ammargage (protéines Rab) Rôle important des protéines Rab dans la spécificité du transport vésiculaire Protéines Rab : – GTPases monomériques – Plus de 30 membres → la plus grande sous-famille de GTPases monomériques – Distribution caractéristique sur les membranes cellulaires – Chaque organite a au moins une protéine Rab sur sa face cytosolique – Facilitent et régulent : ➢ Le taux d'amarrage des vésicules ➢ et l'appariement des v- t- SNAREs • • Comme les GTPases de recrutement du manteau elles cyclent entre la membrane et le cytosol Comme les GTPases de recrutement du manteau, 2 états : – Inactif avec liaison de GDP dans le cytosol – Actif avec liaison de GTP associe à une membrane Les protéines Rab sont différentes selon les compartiments sub-cellulaires

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Les effecteurs de Rab : – Reconnaissance de Rab (Lie, GTP) par un Rab effecteur – Gros complexe protéique – Très variable d'une protéine Rab a une autre – Parfois longues protéines filamenteuses qui limitent le mouvement des vésicules entre des citernes golgiennes adjacentes – Se lient a Rab et empêchent l'hydrolyse prématurée du GTP – D'autres sont des moteurs qui dirigent les vésicules vers leur destination Protéines Rab (suite) – Agissent sur les protéines de contrôle des SNAREs – Accélèrent le processus de reconnaissance des SNAREs entre elles – Achèvent le verrouillage de la vésicule a sa cible par appariement des SNAREs qui sera prête pour la fusion – Âpres la fusion, la protéine Rab hydrolyse son GTP lie et retourne dans le cytosol 5. Fusion – Distinguer amarrage de fusion – Fusion ne fait pas toujours suite a amarrage : ex : exocytose régulée – Amarrage : les protéines des membranes interagissent et adhèrent – Fusion : les couches lipidiques peuvent se joindre ⇒ nécessite d'extrusion d'eau ⇒protéines de fusion pour résoudre le problème énergétique (» dynamine au cours du bourgeonnement des vésicules a clathrine) • Modèle de concentration des protéines SNAREs au cours de la fusion de membrane – Des liposomes (in vitro) v-SNAREs + des liposomes t-SNAREs → fusion lente ⇒ – Intervention (dans la cellule) d'autres protéines : ➢ pour initier la fusion ➢ ou pour retirer des protéines inhibitrices

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Importance des phénomènes de fusion de membrane : – Transport vésiculaire – Fécondation (fusion oolemme spermatozoïde) – Fusion des myoblastes – Maintien de l’identité des cellules – Maintien de l’identité des compartiments intracellulaires – Mode d’entrée des virus a enveloppe dans les cellules DISCRIMINATION ENTRE VOIE CONSTITUTIVE ET VOIE RÉGULÉE ? C'est à dire : quelles sont les mécanismes qui vont faire que les protéines vont emprunter la voie constitutive ou régulée

Les différentes étapes : a. Agrégation b. Concentration c. Maturation d. Exocytose

A. Agrégation des molécules Grâce à des signaux inconnus mais probablement communs à toute une classe de protéines. Les candidats potentiels sont les chromogranines (présente dans uniquement dans les cellules à sécrétion régulée) Toutes les chromogranines, ont un point isoélectrique très acides. Si on prend un tube, on met des chromogranines avec le pH du Golgi et la concentration adéquat en calcium, elles vont s'agréger spontanément. Certaines familles de chromogranines possèdent des ponts disulfures qui permettent le ciblage des protéines vers les voies de sécrétions régulée, cela dit, toutes les protéines de la voie régulée ne possèdent pas de pont S-S

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B. Concentration • • Au départ simple bourgeonnement du TGN appelé : vésicules sécrétoires immature Puis concentration : – Par retour de membrane vers les endosomes – Acidification du contenu de la lumière – Toutefois concentration modérée par rapport à celle qui survient à la sortie du RE

C. Maturation • • • Se fait souvent par protéolyse pendant la formation de la vésicule Activation des précurseurs inactifs en molécules actives par protéolyse (hormones polypeptidiques et neurohormones) Ou ? Débute dans le TGN continue dans le granule immature et dans l’espace extra cellulaire
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– Amidation (ajout d’un groupement amide en C-terminal par la PAM (peptidyl alpha amidating monooxygenase). La glycine est un donneur d’amidation X-X-Gly →X-XNH2 – Ajout d’un groupement pyroglu par la pyroglutamyltransferase (Gln →pGlu). Exemple de la TRH → pGlu-His-Pro-NH2 – Ajout d’un groupement acetyl en N-terminal (acetyltransferase). Alpha MSH acetylee active en périphérie mais pas dans le cerveau – Une protéolyse spécifique a la voie régulée Toutes ces modifications vont moduler l’activite des proteines formees D. Exocytose

Conclusion – Le trafic intracellulaire est nécessaire a la bonne localisation des protéines et permet de moduler leur activité biologique – Les modifications post-traductionnelles régulent l’activité des protéines – Elles sont spécifiques d’un compartiment donné – Le trafic intra-cellulaire s’effectue dans les deux sens pour maintenir l’architecture de la cellule
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