Curs 1.

Profesia de medic si microbiologia

Universitatea de Vest Vasile Goldi Arad Facultatea de Medicina, Farmacie si Medicina Dentara Dr.biol. Sergiu Fendrihan

Microbiologia
Microbiologia este tiina care studiaz microorganismele i anume acele fiine vii de dimensiuni microscopice, care n general sunt invizibile sau greu vizibile cu ochiul liber i care formeaz un grup eterogen din punct de vedere taxonomic, fiziologic, morfologic, etc. Ramuri ale microbiologiei : bacteriologia care se ocup cu studiul bacteriilor; micologia - se ocup cu studiul ciupercilor microscopice i macroscopice; protozoologia - se ocup cu studiul protozoarelor; virologia - se ocup cu studiul virusurilor; algologia se ocup cu studiul algelor i n acest caz al algelor microscopice

Bacterii

Virusuri

Micoplasme

Ciuperci
Protozoare

Microbiologia mediului

Microbiologia medicala

Microbiologia moleculara

Microbiologia veterinara Microbiologia industriala Microbiologia

Microbiologia alimenara Biotehnologia Microbiologia agricola

Imunologia

Genetica Microorganismelor patogene

Microbiologia sanitara

Microbiologia medicala

Epidemiologia

Microbiologie farmaceutica

Microbiologia clinica

actiunea bacteriilor a fost intuita inca din antichitate, prinbolile contagioase pe care le determinau si prin epidemiile care omorau mii si milioane de oameni. Hipocrate (400 i.e.n), considerat parintele medicinii, a emis atunci ipoteza transmiterii bolilor contagioase prin miasme morbide (aercontaminat) sau ape poluate. Bazat pe fapte de observatie si o intuitie deosebita, Tucidide, istoric antic grec, a fost primul care a aratat ca persoanele care au trecut printr-o boala infectioasa devin rezistente la aceasta si pot ingriji, fara pericol de contaminare, bolnavii din timpul epidemiei respective

Medicina orientala

Chiar din antichitate s-au instituit primele reguli elementare de igiena individuala si colectiva, de asepsie si antisepsie. La unele popoare: chinezi, indieni, turci etc. era cunoscuta variolarizarea, metoda de vaccinare in variola, cu material patologic uman.

Anton van Leeuwenhoek (n. 24 octombrie 1632, Delft, Olanda, d. 27 august 1723 n localitatea natal) a fost un functionar de primarie olandez, si care desi nu a fost inventatorul microscopului, a fost primul care a facut observatii valabile si astazi si care l-a folosit pentru observarea lumii inconjuratoare.

Leeuwenhoek este considerat in mod traditional unul dintre marii tehnicieni care au contribuit la progresul stiintei, a fost primul care 1-a folosit cu un mare talent observational si descriptiv.
- comunicarile lui catre Societatea Regala Britanica necesitau o traducere din dialectul olandez vorbit de el. Este considerat indeobste fondatorul stiintei microbiologiei, dar a avut contributii semnate si la alte stiinte, cum ar fi embriologia, cristalografia si chimia; -unele din observatiile lui erau atat de precise, incat au putut fi folosite ca baza de interpretare si dupa doua secole.

Edward Jenner (n. 17 mai 1749 - d. 26 ianuarie 1823) a fost un doctor din Berkeley, Gloucestershire, Anglia, cunoscut pentru cercetarea i munca lui introducnd un vaccin pentru variola, o boal care a ucis milioane de oameni de-a lungul secolelor.
La 14 mai 1796, Jenner testeaza vaccinul contra variolei, pe James Phipps, un bieel de opt ani bolnav de variol. nc decnd era student la Medicin, a observat c pacienii care dezvoltau variola taurinelor (o maladie infecioas a vacilor caracterizat prin eruptie cutanat i transmiterea la om) erau protejai mpotriva variolei. Jenner a dat numele de "vaccin" (de la cuvntul vacca din latin, nsemnnd vac) substanei responsabile cu transmiterea variola taurinelor i a dat numele de "vaccinare" procesului utilizat pentru protejarea contra variolei.

Importana descoperirii lui Jenner a fost recunoscut foarte repede i, n mai puin de zece ani, vaccinarea arm-to-arm a nceput s fie utilizat n ntreaga lume pentru protejarea mpotriva variolei.,

Louis Pasteur (n. 27 decembrie 1822, Dole d. 28 septembrie 1895, Marnes-la-Coquette ) a fost un om de tiin francez, pionier n domeniul microbiologiei Apoi, n 1843, a fost admis la cole normale superior la Paris, pe care a absolvit-o n 1847, susinnd dou teze, una de chimie i alta de fizica . ntreprinde cercetri de cristalografie i descoper fenomenul de izomerie. Este numit profesor la noua Facultate de tiine din Lille, unde face o descoperire capital, i anume demonstreaz c levurile din drojdia de bere sunt fiine vii care provoac procesul de fermentatie. Prin lucrrile (1858-1864) sale infirm pentru totdeauna teoria generaiei spontane. ncepnd din 1865, studiaz o maladie care decima viermii de mtase i reuete s identifice fluturii bolnavi i s le distrug oule, nainte ca ntreaga cresctorie s fie infestat.

Robert Koch Robert Koch 11 decembrie 1843 Clausthal, Hanover 27 mai 1910 Baden-Baden, Germania Microbiologie a fost un bacteriolog german. A studiat la Gttingen, avndu-l ca profesor pe Jacob Henle care afirma n 1840 ca rnile sunt infectate de nite organisme parazite. Instituie Imperial Health Office, Universitatea din Berlin Universitatea din Gttingen

Postulatele lui Koch Izolarea microorganismelor care cauzeaz antraxul, tuberculoza i holera
Premii Premiul Nobel pentru Medicin 1905 Robert Koch (n. 11 decembrie 1843, Clausthal, Saxonia Inferioar d. 27 mai 1910, Baden-Baden)

Sir Alexander Fleming

(n. 6 august 1881 - d.11 martie 1955) a fost un bacteriolog scoian, laureat al Premiului Nobel pentru Fiziologie i Medicin pe anul 1945 mpreun cu Ernst Boris Chain i Sir Howard Walter Florey. n anul 1929 a descoperit penicilina produs de mucegaiul Penicillium notatum. Cercetrile au fost reluate n 1939 de un colectiv de la Oxford. n 1940, Fleming, doi biochimiti englezi Ernest Boris Chain i Norman George Heatley - i un medic australian - Howard Walter Florey - au izolat i preparat n stare purificat i concentrat penicilina, una din marile realizri ale omenirii. A avut lucrri privind lizozimul ca element bacteriolitic prezent n esuturi i secreii.

Victor Babe (n. 4 iulie 1854, Viena - d. 19 octombrie 1926, Bucuresti ) a fost un bacteriolog i morfopatolog romn, membru al Academiei Romane din 1893. A fost fiul lui Vinceniu Babe. -n colaborare cu Victor Andr Cornil, este autorul primului tratat de bacteriologie din lume (Bacteriile i rolul lor n anatomia i histologia patologic a bolilor infecioase) i prin care a pus bazele moderne ale acestei tiine. -este fondatorul colii romneti de microbiologie. Activitatea tiinific a lui Victor Babe a fost foarte vast, cu un accent deosebit n problemele de tuberculoza, lepra, vaccinare antirabica i seroterapie anti-difterica. -A demonstrat prezena bacililor tuberculozei n urina persoanelor bolnave i a pus n eviden peste 40 de microorganisme patogene. -descoperirea unei clase de parazii - sporozoari intracelulari nepigmentai - care cauzeaz febra de Texas la pisici i alte mbolnviri la animale vertebrate. La Congresul Internaional de Zoologie din Londra (1900) aceti parazii sunt clasificai n genul Babesia.

Ioan Cantacuzino (n. 25 noiembrie 1863 Bucuresti; d.14 ianuarie 1934, Bucuresti ) a fost un academician, medic, microbiolog, profesor universitar romn, fondator al colii romneti de imunologie si patologie experimental. Ioan Cantacuzino urmeaz att studiile liceale (LiceulLouis le Grand), ct i cele superioare (filosofie, 1882 - 1886, stiinte naturale, 1886 - 1891 i medicina, 1887 - 1894) la Paris. n 1895 obine titlul de Doctor n Medicin cu teza: "Recherches sur le mode de destruction du vibrion cholrique dans l'organisme" (n limba romana, "Cercetri asupra modului de distrugere a vibrionului holeric n organism"). Dup terminarea studiilor, lucreaz n Institutul "Pasteur" din Paris ca asistent al lui Ilia Mencinikov n domeniul mecanismelor imunitare ale organismului. ntors n ar, este numit profesor de Medicina experimentala la Facultatea de |Medicina din Bucuresti (1901) i Director general al Serviciului Sanitar din Romania (1907). Vocaia sa de fondator i organizator a fost demonstrat prin nfiinarea unor instituii ca Insitutul de seruri si vaccinuri (1921), care astzi i poart numele, a Laboratorului de Medicina Experimentala (1901) din cadrul Facultii de Medicin, precum i a unor reviste de specialitate, "Revista tiinelor Medicale" (1905), "Annales de Biologie" (1911) i "Archives roumaines de pathologie exprimentale et de microbiologie".

Stefan S. Nicolau (1896 - 1967) Stefan S. Nicolau a obtinut in 1920 gradul de doctor in medicina la Facultatea de Medicina din Cluj unde a inceput colaboraea sa cu dr, Levaditi. Pasionat, meticulos si precis, Nicolau a efectuat pana in 1939 numeroase studii publicate asupra bolilor virale ca: herpes, rabies, poliomielitia, infecii cu poxvirusuri, febra aftoasa, epiteliomul boala Aujeski si altele. Printre prioritatile mondiale se numara detectia inlcuziunilor in febra galbena ca un criteriu de diagnostic a acestui arbovirus; introducerea conceptului de sincronofilaxie, fiind un precursor al descrierii acestui fenomen,escopererea efectului fotodinamic al coloratiilor si descrierea neuritei septice.

Aceste diagrame arata prevalenta bolilor infectioase in Statele Unite la inceputul secolului XX si in la sfarsitul secolului (dreapta) si prevalenta diferitelor boli infectioase in Pakistan (stanga sus)

Sistemul de clasificare a maladiilor umane

Acest sistem a fost elaborat de ctre Organizatia Mondial a Sntii, cu ajutorul a numeroi specialiti din ntreaga lume. Sistemul de clasificare a maladiilor ajut la o mai bun valorificare a datelor de diagnostic al cazuistiticii existente, la ncadrarea maladiilor i a standardizrii unor date personale i la efectuarea unei mai bune statistici medicale la nivel mondial. Instruciunile de ncadrare a maladiilor, de numerotare a bolilor, i listele de maladii i clasificarea acestora sunt disponibile on line, pe siteul de internet al organizaiei. Astfel maladiile infectioase cuprind A001- pn la B 009

Medicina moderna
Prin vaccinare, antibiotice si dezvoltarea igienei publice medicina moderna a reusit sa faca fata in general la diferitele boli inclusiv infectioase. Provocari ale medicinei moderne a secolului XXI exista si vor constitui obiect de studiu ppentru cercetarea medicala si farmaceutica.

Aparitia de forme de microorganisme resistente la antibiotice sau la diferite medicamente antiparazitice sau antimicotice Exemplu Staphylococcus aureus resistent la meticilina si alte diferite bacterii resistente la diferite medicamente antiinfectioase Aparitia de agenti patogeni care ies din zonele lor endemice ca virusul gripei aviare West Niles Prin inmultirea contactelor economice si transporturi agenti patogeni sunt transportati dintr-o parte a lumii intr-alta Aparitia si acumularea de forme rezistente ale agentilor patogeni in facilitatile sanitare si spitale. Dezvoltarea de noi epidemii si de infectii ca urmare a problemelor de saracie si probleme sociale- ca de pilda a tuberculozei Necesitatea de a gasi noi metode si strategii de lupta pentru prevenirea si combaterea aparitiei bolilor infectioase Necesitatea de a utiliza metode de biologie moleculara si serologice pentru determinarea rapida a agentilor patogeni.

Curs 2.Caracteristicile generale ale regnului Prokaryota. Bacteriologie generala si moleculara

Universitatea de Vest Vasile Goldi Arad Facultatea de Medicin, Farmacie i Stomatologie Dr.biol. Sergiu Fendrihan

Microbiologia

Microbiologia

tiina care se ocup cu studiul microorganismelor

Microbiologia medical:
Morfologia agenilor microbieni infecioi Relaia cu organismul uman Patogenia Rezistena antiinfecioas Diagnosticul etiologic al bolilor infecioase Bazele terapiei antiinfecioase Bazele profilaxiei antiinfecioase

Ramuri
Dupa incadrarea taxonomica a agentilor infectiosi studiati, sunt Virusologia-studiul virusurilor Bacteriologia-bacteriile Micologia patologica-ciupercile filamentoase patogene Parazitologia- organisme microscopice si macroscopice si pluricelulare parazite

Taxonomia lumii vii

Cele trei domenii Bacteria (Eubacteria) Archaea Eukarya Exista 6 regnuri - Plante, Animale, Mycota, Protista, Eubacteria (Monera) si Archaebacteria

Arborele lumii vii

dupa Madigan et al 2000

Nr. 1. 2. 3.

Caracteristici Nr. celule Organite celulare ADN genomic in nucleu nconjurat de mb nuclear Cromozom circular Histone prezente Perete celular

Bacteria Unicelulare Nu Nu Da Nu diferit cu exceptia Chlamydia 70S legturi ester Da formil-metionina Nu Da 1-4 sbu.

Archaea unicelulare nu nu da da diferit fr murein uneori absent 70S legturi eter da metionina nu da mm.8-12 sbu

Eukaryota uni i pluricelulare da da nu da diferit fr murein 80S legturi ester rare metionina da nu 3 12-14-sbu

4. 5. 6.

7. 8. 9. 10 11. 12 13

Ribozomi Lipide de membran Plasmide Iniiator tARN Introni Operoni ARN polimeraze

14
15 15.

Necesit factori transcripie

Structur promoter Sensibilitate la cloramfenicol, strept. Kanamicina Metanogeneza

Nu
10-35 seq. Da Nu

da
TATA box nu da

da
TATA box nu da

16

17
18. 19

Nitrificarea
Denitrificarea Reducerea sulfului la H2S i a Fe 3+ la Fe2* Fixare azot Fotosinteza cu clorofil

Da
Da Da Da Da

nu
da da da nu

nu
nu nu nu da

20 21 22

Taxonomia agentilor patogeni

Virusurile
-sunt entitati la limita dintre viu si neviu -sunt mai multe clasificari ale virusurilor in ordine, familii genuri si specii -o clasificare recunoscuta international este cea a ICVT- Comitetul International de Taxonomie a Virusurilor care recunoaste circa 1500 de specii de virusuri dar circa 30000 de izolate isi astepta cercetarile dedicate si validarea -sunt formate dupa cum se stie dintr-o molecula de acid nucleic mono sau bicatenar ADN sau ARN si din proteine ce formeaza o capsida ce inconjoara acizii nucleici, unele poseda un invelis peste acesta capsida. -sunt parazite intracelulare obligate, sunt ultrafiltrabile (trecand prin cei mai mici pori ale filtrelor care retin bacteriile

Virusuri

Dimensiunile sunt de cica 20 nm diametru pn la cteva sute de nanometrii lungime. s aib o form icosaedric cu nveli (herpes virus) sau fr nveli (adenovirus); form helicoidal cu nveli (virusul gripei) sau fr nveli (VMT) sau forme Forma de cartus (virusul rabiei) de simetrie icosaedrica Forme complexe ca de pild poxvirusurile. Forme de simetrie mixta ca bacteriofagii, avand un cap de simetrie icosaedrica si o coada de simetrie helicoidala continand ARN sau ADN i paraziteaza diferite bacterii sau archaea. Ei sunt folosii ca vectori pentru transformarea genetic a unor celule (pild bacteriofagul T lambda i T7).

virusuri

Structura schematica a unui virus

Virusurile formate numai din nucleocapsid se numesc virusuri neanvelopate. Virusurile care prezint pe lng nucleocapsid i un nveli extern lipoproteic derivat din sistemul membranar al celulei gazd (peplos sau anvelop), se numesc virusuri anvelopate. Nucleocapsida constituit din miez de acid nucleic care este, de fapt, genomul viral, protejat de un nveli proteic numit capsid.

Virusuri

Peplosul 1. Spiculi de natur glicoproteic : -hemaglutinina (HA), cu rol n ataarea virusului de celula gazd -neuraminidaza (N), care faciliteaz ptrunderea virusului n celul. 2. Factori de fuziune cu funcie de iniiere a infeciei 3. Proteina M (matrix) care cptuete faa intern a anvelopei

Genomul viral Este constituit dintr-un singur tip de acid nucleic: fie ADN, fie ARN (niciodat ambii), care conine ntreaga informaie genetic necesar replicrii virusului i care reprezint suportul infeciozitii acestuia. Molecula acidului nucleic poate fi: simplu spiralat (ss) sau dublu spiralat (ds), liniar sau circular, continu sau segmentat.

Virusuri

Viroizii au o structur i mai simpl, fiind alctuii doar dintr-un acid nucleic cu greutate moleculara mic. Unii dintre ei produc boli transmisibile la plante. Virusurile i viroizii alctuiesc mpreun regnul VIRA. Prionii sunt entiti infecioase de dimensiuni foarte mici (5 nm), de natur proteic. Pn n prezent exist relativ puine date referitoare la aceti ageni, dar se presupune c ei ar constitui cauza unor boli degenerative ale SNC, cum sunt bolile Jacob-Creutzfeld, Kuru, etc.

Bacterii
Structura unei celule procariote (bacterie) Sunt formate din membrana celular, citoplasma, genomul bacterian (nu poseda nucleu), peretele celular i capsul (unele), precum i ribozomi i diferite tipuri de incluziuni, iar la suprafaa posed (unele) flageli i pili. Unele formeaz ca forme de rezistenta endospori.

Bacterii

Dimensiunea bacteriilor se exprim n micrometri (1=10-3 mm), fiind cuprins ntre 1-10 . Dimensiunea, forma i aezarea bacteriilor se apreciaz prin microscopie optic, iar detaliile morfologice i structurale prin microscopie electronic. Forma bacteriilor constituie baza clasificrii lor. Form i aezare. n raport cu forma lor deosebim 4 categorii de bacterii: - rotunde (cocii), - alungite (bacili), - ncurbate (spirili, spirochete, vibrioni) i - filamentoase (actinomycete). Genetica.Au un genom format dintr-un cromozom circular si una sau mai multe elemente denumite plasmide

Taxonomia bacteriilor

Bacteriile sunt foarte numeroase, fiind mprite n 29 de ncrengturi (fillumuri) conform lui Euszeby[1], i anume: Acidobacteria, Actinobacteria, Aquificae, Bacteroidetes, Caldiserica, Chlamydiae, Chlorobi, Chloroflexi, Chrysiogenetes, Cyanobacteria, Deferribacteres, Deinococcus-Thermus, Dictyoglomi, Elusimicrobia, Fibrobacteres, Firmicutes, Fusobacteria, Gemmatimonadetes, Lentisphaerae, Nitrospira, Planctomycetes, Proteobacteria, Spirochaetes, Synergistetes, Tenericutes, Thermodesulfobacteria, Thermomicrobia, Thermotogae, Verrucomicrobia. Proteobacteria cuprinde microorganisme procariote Gram-negative care reprezint principalele bacterii de interes medical, industrial i agricol, fiind subdivizate n alfa, beta gama delta i epsilon Proteobacteria. Dei sunt nc multe probleme de lmurit privind poziia taxonomic a unor grupuri acest clasificare actual este utilizat n mod curent. Un loc aparte l ocup ricketsiile, unii specialiti le trateaz separat fa de celelalte bacterii, din acest interesant grup fac parte ageni patogeni periculoi. [1] JP Euszeby, List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature www.bacteriocic.fr.

Ciuperci

microorganisme eucariote care sunt condiderate un regn separat Mycota rspndite n natur; peste 100.000 specii; 150-200 sunt considerate patogene umane Clasificare: cuprind mai multe filumuri functional sunt - dermatofii (patogeni) - levuri (saprofite sau uneori parazite) - mucegaiuri (saprofite, produc infectii oportuniste)

ciuperci

Micoze superficiale la nivelul pielii si a firului de par Micoze cutanate sau subcutanate cu implicarea unghiilor i a straturilor profunde ale pielii Micoze profunde sau sistemice n care sunt implicate organele profunde. Aceast categorie cuprinde fungii oportuniti la organisme imunocompromise

Tip de infece Micoze superficiale

Epidermophyton Microsporum Trichophyton

Micoze profunde
Blastomyces Candida Cryptococcus Histoplasma Aspergillus Coccidioides Paracoccidioides

Paraziti
Protiste Viermi Artropod e

Protiste parazite

Sunt organisme eucariote monocelulare, parazite la om si animale producand parazitoze grave

Imaginea prezint un frotiu de snge a nei persoane infectate cu Trypanomsoma. Protozoarul apare colorat purpuriu, iar elementele figurate hematiile apar roii.

Protiste parazite

Conform Organizatiei Mondiale a Sntii, circa 300-500 millioane de cazuri de malarie sunt in fiecare an inregistrate si circa 1.5-2.7 millioane de persoane decedate mai mult decat SIDA- Cele mai multe cazuri sunt in Africa i America de Sud. Simptomele includ febra, dureri de cap, si frisoane caracteristice. Protozoarul traieste in sngele pacientului si distruge celulele roii.

Plasmodium falciparum in sange

Viermi

Viermii intestinali fac parte din doua increngaturi si anume Plathelmintes si Nemathelmintes Sunt paraziti obligati cu una sau doua gazde in ciclul lor vital Viermii paraziti sunt o diviziune a parazitilor eucarioti pluricelulari si care sunt de fapt endoparaziti care se hranesc cu hrana furnizata de gazd numerosi sunt intestinali la om si animale. Viermii se pot transmite prin vectori ca unele insecte, alimente infestate, apa infestata, sol, etc. si se gasesc in special in tarile in curs de dezvoltare unde nu exista surse de apa curata si un sistem sanitar public bine dezvoltat si finantat

viermi

Ascaris lumbricoides adult (Nematod)

Taenia saginata (Cestode)

Artropode
Sunt nevertebrate cu organizare destul de complexa, cu membre articulate acoperite de un exoschelet de natura chitinoasa. Unele sunt paraziti temporari sau permanenti ai omului fiind exoparaziti Joaca rol de vectori pentru agenti patogeni virali, bacterieni

Artropode parazite
Sarcoptes scabiei produce scabia Pediculus humanus capitis este paduchele de cap Phthirus pubis paduchele pubian capuse Ixodoidea

Bacteriologie generala si moleculara

Taxonomia bacteriilor si identificarea acestora in laborator Identificarea bacteriilor constituie un proces esential pentru determinarea agentilor etiologici si elaborarea unui diagnostic corect Diagnosticul bolilor este analizat si pe baza acestuia se elaboreaza tratamentul Exista un cod international al tuturor bolilor elaborat de OMS si in care bolile de natura infectioasa au coduri asumate printr-un proces standardizat de diagnosticare

Codul maladiilor umane conform OMS

Cuprinde 22 de capitole in care sunt codificate toate bolile umane indiferent de natura lor Cuprinde si indicatii privind determinarea corecta a codului maladiei respective principale si secundare Usureaza mult actul medical de diagnostic si tratament

Codul maladiilor infectioase (capitol 1 A-B) OMS

A00-A09 A15-A19 A20-A28 A30-A49 A50-A64 A65-A69 A70-A74 Boli Intestinale infectioase tuberculoza Unele boli bacteriene zoonotice Alte boli bacteriene Infectii cu transmisie predominant sexuala Alte infectii cu spirochete Alte boli detrerminate de clamidii

Mediu nconjurtor

Ap

Sol

Aer

Alimente naturale sau prroduse alimentare i nealimentare de origine vegetal sau animal

Individ

Transmitere ntre persoane posibil

Animale ferm sau de companie, duntori

Vectori Insecte acarieni

Material biologic contaminat

Transmitere aerosoli, Material biol contaminat Transmitere sexuala Transmitere contact Transmitere obiecte contaminate

Obiecte contaminate

Indivizi, comunitate

Pacieni
Examinare pacient EXPLORRI FUNCIONALE Analize biochimice i de laborator obinuite, ex exemplu examen nr. leucocite hematocite, la snge,hematocrit, etc

Simptoma tologie

Mediu aer , sol,

ap, alimente, etc.

Probe de snge urin, fecale, material biopsie , lichid cefalorahdian, exudat, lavaj faringian, bronic, tampoane, sput , secreii, etc

Diagnostic pacieni, Alert epidemiologic

Tratament, msuri carantin, etc.

Examinare directa la microscop cu sau fara coloratie specifica

Cultivare pe medii de izolare sau selective, aspect colonii, date biochimice

Teste biochimice de identificare, catalaza, oxidaza , utilizare substrat.

Teste biologie molecular

Antibiograma REZULTATE EXAMENE LABORATOR IDENTIFICARE GERMENI PATOGENI

Teste imunologic e ELISA, etc., pt anticorpi

Teste genetice PCR, RTPCR, etc. identificare

Analizele uzuale in laboratoarele clinice si prelevarea probelor

Tipuri de probe prelevate in mediul clinic

-urina -fecale -exudat faringian, tampoane sterile -exudat nazal -secretie vaginala -lavaj bronsic, lavaj faringian -lavaj intestinal si stomacal -sputa -lichid cefalorahidian in urma punctiilor -puroi -probe de tesut biopsie -probe de sange -probe prelevate la nivelul pielii, etc.

Exemplu de caracterizare morfo-biochimica

Diagnostic de laborator
Diagnostic bacteriologic (clasic)
identificarea bacteriilor pe baza caracterelor: - morfo-tinctoriale - culturale - biochimice - antigenice (r. de aglutinare, precipitare, IF) - toxinogenezei - testarea sensibilitii la antibiotice ANTIBIOGRAMA

Continuare
Diagnostic. serologic detectarea i titrarea Ac n serul de cercetat - reacii Antigen-Anticorp (IFimunofluorescence), aglutinare, precipitare, ELISA-enzyme linked immunosorbent assay si altele Diagnostic molecular Amplificarea si secventierea 16S r ARN DGGE, RFLP,etc.

Caracteristici morfo-tinctoriale
Caracteristici morfologice ale coloniilor pe mediile consacrate de cultura Caracteristici morfologice si tinctoriale la microscopul fotonic in frotiuri

Tipuri de bacterii conform coloratiei utilizate

Coloratia Gram

-se coloreaz frotiul cu cristal violet 1min. -se fixeaz cu lugol 2 min. -se decoloreaz cu alcool aceton -se recoloreaz cu fuxin 1 min. A germeni Gram negativi rosu B germeni Gram pozitivi violet

Caracteristici morfotinctoriale Coloratia Ziehl-Neelsen

Este o coloratie speciala care este utilizata pentru bacteriile acido alcolo rezistenti in special din familia Mycobacteriaceae. Mycobacterium tuberculosis I este responsabil de aparitia tuberculozei si poate fi idnetificat prin acest tip de coloratie datorita stratului de ceruri si acid micolic din peretele lor celular si lipide care nu se coloreaza Gram reactivii folositi sunt carbolfucsin, alcoolul si albastrul de metilen iar bacilii se coloreaza rosu stralucitor.

Caracteristici morfologice microscopice

Caracteristici culturale Medii de cultura

Clasificare Dup consisten: - lichide (repartizate n eprubete) - solide (geloza dreapt, nclinat, n plac) - semisolide (n eprubete) Dup coninutul de substane nutritive: 1. Medii naturale: conin substane nutritive n forma lor natural, fr a fi prelucrate n prealabil: mediul cu bil, mediul cu lapte, mediul cu ou, ser de bou coagulat 2. Medii artificiale: A) Medii de baz pentru germeni nepreteniosi 1) bulion simplu 2) geloza simpl bulion + agar-agar (un extract de alge care asigur consistena solid, nu are proprieti nutritive) B) Medii compuse 1) Medii complexe: mediu de baz + substane organice (snge, ser, glucoz), sunt folosite pentru cultivarea germenilor preteniosi (geloza snge)

Medii de cultura continuare

2) Medii de mbogire: conin ageni selectivi, care inhib dezvoltarea unor bacterii si permit cresterea altora 3) Medii speciale - mediul Lwenstein-Jensen pt. cultivarea micobacteriilor - mediul Sabouraud pt. cultivarea levurilor (Candida) - mediul chocolat neisserii, hemofili 4) Medii difereniale si selectiv-difereniale: indicator de culoare, +/substane selective (inhib cresterea unor bacterii) + zaharuri/polialcooli ; sunt folosite pentru izolare si identificare (geloza lactozat, TSI, SIM, Leifson, Chapman, McConkey) 5)Medii de transport Blair, Stuart

Medii uzuale in microbiologia clinica (exemple)

Mediu MacConkey agar Pentru bacili Gram-

Mediu chocolate agar

Pentru germeni ca Neisseria si Haemophilus Pentru germeni hemolitici

Mediu Columbia agar cu 5% sange de berbec Mediu Lowenstein-Jensen

Mycobacterium tuberculosis

Caracterele morfologice a coloniilor bacteriene pe medii solide

Colonies on plate (above) and Streptococcus pneumoniae colony on sheep blood agar medium (below)

Identificare pe medii speciale

Salmonella enterica pe mediul Hektoen enteric agar. Centrul coloniilor transparente este negru aratand prezenta formarii H2S in absenta fermentarii carbohidratilor, Toate serotipurile de Salmonella au acest aspect pe mediul Hektoen enteric agar cu exceptia serotipului typhi care este producator slab de H2S. (Jan Hudzicki, University of Kansas Medical Center, Kansas City, KS)

Caractere culturale
Medii cromogene Rainbow Agars ofera un mediu simplu selectiv si cromogen pentru detectia usoara a tulpinii de E. coli O157, Salmonella, Shigella si Aeromonas cu rezultatele in mai putin de 24 de ore.

Caracterizare biochimica (exemple)

Teste caracteristice de identificare a bacteriilor -oxidaza -catalaza -indol -test hemoliza -capsule test Albastru de metilen eosin cu agar pentru fermentarea lactozei si formarea de acizi.

Testul oxidazei
Se urmrete producerea de enzime oxidative de ctre bacterii Interpretaretest pozitiv - culoare mov nchis test negativ - lipsa modificrii de culoare stnga - bacterii oxidazonegative dreapta - bacterii oxidazopozitive

Testul catalazei
Se urmrete producerea de catalaz de ctre bacterii Interpretare test pozitiv - eliberare de oxigen (efervescen) n prezena apei oxigenate test negativ lipsa efervescenei stnga - bacterii catalazonegative dreapta - bacterii catalazopozitive

Test indol , H2S, mobilitate

Se urmrete producerea de hidrogen sulfurat (H2S) producerea de indol mobilitatea Interpretare nnegrirea mediului = producere de H2S nroirea hrtiei de filtru = producere de indol estomparea traiectului de nsmnare i opacefierea mediului = mobilitate pozitiv

H2S-, I+,
M-

H2S-, I+, M+
Mediul SIM

H2S+, I-, M+

Test hemoliza
Flora normala a tractului respirator superior este amestecata cu specii din genul Streptococcus. (prezenta coloniilor beta-hemolitice indica posibilitatea existentei unei infectii cu Streptoococcus pyogenes.

Test utilizare substrate pentru identificare

Mediu TSI

Se urmrete fermentarea Glucozei, Lactozei, Zaharozei producer ea de gaz producerea de hidrogen sulfurat (H2S) Interpretaren coloana dreapt (jos) - fermentarea G n coloana nclinat (sus) fermentarea L i Z la mijloc producerea de H2S

G+, L-, Z-, H2S-

G+, L+, Z+, H2S-

G+, L-, Z-, H2S+

Test descompunere esculinei

Se urmrete descompunerea esculinei de ctre bacterii (identificarea genului Enterococcus) Interpretare descompunerea esculinei culoarea mediului vireaz n negru Mediu ABE

ABE+

ABE-

Caracterizare biochimica rapida

Utilizarea substratelor, a surselor de carbon este investigata cu ajutorul testului Biolog ce consta in utilizarea unor placi cu 96 de godeuri cuprinzand substatele respective care se incubeaza cu o cultura bacteriana de o anumita concentratie si care este apoi citita la un aparat special si interpretata de programul Omnilogic prin comparare cu bazele de date efectuate si puse la dispozitie de catre manufacturier (Biolog Inc.)

Sistemul Biolog
Permite identificarea a peste 2500 specii de microorganisme si caracterizarea lor fenotipica Desi este destul de, scump,este un instrument preferat de marile companii farmaceutice

Diagnostic serologic ELISA

Se utilizeaza atat pentru bacterii cat si pentru virusuri, putanduse efectua si studii cantitative din prelevate clinice

Diagnostic serologic ELISA

Teste rapide de identificare

Exemplu a unui kit de detecie rapid a principalilor ageni de bioterorism (Tetracore Biothreat Alert test kits)

Diagnostic (caracterizare) molecular (a)

-permite identificarea bacteriilor fara cultivare -permite incadrarea precisa a acestora pe baza caracteristicilor genetice si a compararii secventelor unor gene target cu cele existente pe siteuri specializate de internet -permite lucrul cu microorganisme mai dificil de cultivat Rapid or high-throughput identification of microorganisms Detectia si amaliza genelor de rezistenta Genotiparea Clasificarea Descoperirea de noi microorganisme Speciile, tulpinile secventele specifice de ADN sunt sursele de informatii genotipice.

Diferite metode de analiza moleculara a izolatelor patogene in epidemiologie si estimarea eficacitatii si acuratetei acestora
Metoda Capacitate de genoti pare bun Putere de discriminare Reproductinbilitat e utilizarea Usurinta de interpretare

Analiza plasmidel or PFGE

buna

buna

inalta

buna

mare

mare

mare

moderata

Buna, moderata

RFLP genomic
Ribotyping PCR-RFLP RAPD AFLP Repetitive elements Sequencing

inalt
inalta Bunad Inalta inalta Buna inalta

buna
inalta moderata Inalta Inalta Buna Inalta

buna
inalta Buna Slaba Buna Inalta inalta

inalta
buna Inalta Inalta Moderata Inalta Moderata

Moderat pana la slaba

mare Mare bunainalta inalta Inalta bunainalta

Diferite metode de lucru pentru diagnostic molecular

Amplificarea si secventierea fragmentelor 16S rARN cu PCR Fingerprinting al plasmidelor cu enzime de restrictie Analiza RFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) Ribotipare spa tipare Tiparea secventei multilocus

Schema de indentificare a Bacillus anthracis (Prin amabilitatea firmei Becton Dickinson)

Utilizarea bioinformaticii in identificarea taxonomica a germenilor patogeni

Secvenele obinute se compar cu secvenele existente n bazele de date de pe internet folosind programe speciale de comparare i aliniere a secvenelor Fasta sau Blast i de construcie de arbori filogenetici cum este Clustal X (Thomson i coautorii, 1997).Un nou program de comparare a secvenelor a fost de curnd lansat i care se numeste BAGET (Oberto, 2008) Numeroase baze de date sunt accesibile pe internet -EMBL, Gen Bank, DDBJ si altele. MvirDBeste o baz de date a toxinelor de natur proteic a factorilor de virulen i a genelor ce confer resistena a antibiotice ale microorganismelor patogene cu scopul de a sustine aplicaiile din domeniu aprrii contra armelor biologice i atacurilor bioteroriste (Zhou i coautorii, 2007).

Metode fizice i fizico-chimice de identificare

sunt metode ce utilizeaz principii de fizic cu aplicaii chimice ca de pild spectroscopia. -spectroscopia de mas este utilizat pentru determinarea unor toxine ca de pild toxina botulinic (Barr i coautorii 2005). -metoda spectroscopiei MALDI-TOF determinare a bacteriilor (Dare 2006) identificarea speciilor de Yersinia cu care s-a obinut profilul proteinelor fiecrei tulpini (Ayyadurai i coautorii 2007) i pentru identificarea diferitelor tulpini de Francisella tularemis pentru care sa obinut i o colecie de spectre specifice (Seibold i coautorii 2010). spectroscopia Raman care au fost aplicate in detecia bioriscului i a ameninrilor biologice.(Kalasinski i coautorii 2007).

Microbiota normala si patologica a corpului uman

Comensalism=asociaie n care un microorganism folosete ca mediu de via un alt organism, fr s-l prejudicieze Mutualism=o relaie care se stabilete n beneficiul ambilor parteneri(bacilii lactici+gazda uman) Parazitism=o relaie care se stabilete n mod cert n beneficiul microorganismului i detrimentul gazdei (microorganismele patogene)

Flora normala a corpului uman

Microbiota intestinala

Numarul aproximativ de bacterii determinat pe gram de tesut

Masa de bacterii din colonul de sobolan sectionat observatie la microscopul SEM B=bacterii; T=tesut

Asociatie de bacterii pe pielea umana, aspect la SEM

Microorganisme din cavitatea bucala la om Se observa bacterii, ciuperci, drojdii.

Relatii intre microorganisme

De indiferen=speciile se tolereaz reciproc (nu influieneaz gazda uman) De comensalism= M1 are nevoie de M2 (H.influenzae - S.aureus =satelitism) Simbioza=asocierea a dou specii care se favorizeaz reciproc (Bacilii lacticilevurile) Sinergismul=relaia dintre 2M frecvent duntoare organismului (FuzobacteriumTreponema) Parazitismul=folosirea unei specii de ctre alt specie ca habitat (bacteriofagii) Antagonismul=efectul inhibitor al lui M1 pe M2 Prin diferena de vitalitate Nespecific (eliberare de subst. toxice neselective) Specific (eliberare de subst. netoxice asupra organismului, dar nocive pe alte microorganisme: Antibiotice)

Rolul florei normale

Factor important n aprarea antiinfecioas natural

Ac

recioneaz ncruciat cu cu alte specii Deprim nmulirea florei patogene prin mecanism competitiv pe receptori i substrat nutritiv

Contribuie la nutriia i metabolismul organismului (E.coli) Constituie sursa major a infeciilor oportuniste (S.epidermidis, E.coli)

Antagonims intre microflora normala si cea patogena

Infectii determinate de microflora normala

Bibliografia cursului
Cursul este compilat si editat pe baza urmatoarelor cursuri universitare si lucrari: -Conf Felicia Toma-Bacteriologie medicala -Prof. dr. Buiuc D, prof. dr.Negut M-Microbiologie clinica -Conf. dr.Toma F- Curs de microbiologie -Prof. dr.Lazar V. Microbiologie medicala -Dr. Alvin Fox Medical Microbiology editia 5 -Dr. Toddar K Book of Bacteriology -Dr. biol. Sergiu Fendrihan, Lazureanu C, Prioteasa C Bioterorismul -schemele si fotografiile sunt furnizate prin amabilitate de catre autori

Cursul 3. Morfologia bacteriilor

Universitatea de Vest Vasile Goldi Arad Facultatea de Medicina, Farmacie si Medicina dentara Dr.biol. Sergiu Fendrihan

Aspecte generale
Dimensiuni Bacteriile sunt entiti microscopice ce nu pot fi vzute cu ochiul liber. Dimensiunea bacteriilor se exprim n microni (1=10-3 mm) si variaz in funcie de specie, morfologie sau de vrsta culturii bacteriene . Dimensiunea este cuprins ntre 1-15. Cele mai mici bacterii sunt cele din genul Mycoplasma, cu diametrul de 0,20,3, pe cnd cele mai mari spirochete (genul Borellia) ajung la o lungime de 10-15. Formele filamentoase reprezentate de actinomicete pot ajunge la 500, care se fragmenteaz ns cu usurin. Escherichia coli celule, o "medie" bacterie dimensiuni, sunt de aproximativ 2 micrometri (um) lungime i 0,5 um n diametru, cu un volum de celule de 0.6 - 0.7 m3. Mas umed de cca. 1 pg, presupunnd c celula const n cea mai mare parte din ap. Masa uscat de o singura celula poate fi estimat ca 20% din masa umed, n valoare de la 0,2 pg.

Forma n raport cu forma lor deosebim 4 categorii de bacterii: rotunde (cocii), alungite (bacili), ncurbate (spirili, spirochete, vibrioni) i filamentoase (actinomycetele)

Cocii sunt bacterii rotunde(Staphylococcus), ovalare (Streptococcus), lanceolate (Streptococcus pneumoniae), reniforme Neisseria) cu un diametru de aproximativ 1;

Bacilii sunt bacterii lungi cu form de bastona cu o lungime de 1,5 - 10 si o grosime de 0,5-1. La bacili extremitile sunt diferite, aspectul acestora ajutnd la identificarea lor. Bacilii pot avea capete rotunjite (Enterobacteriaceae), tiate drept (Bacillus), mciucate (Corynebacterium) sau form fusiform (Fusobacterium). Cocobacilii sunt bacterii uor alungite, fiind forme intermediare ntre coci i bacili (Brucella, Bordetella, Haemophilus);
Bacteriile ncurbate : -vibrionii sunt bacterii ncurbate, cu spira incomplet, n form de virgul (Vibrio); -spirilii sunt bacterii spiralate cu 1-2 spire rigide (Spirillum); -spirochetele sunt bacterii spiralate cu corpul flexibil avnd 7-20 de spire care pot ajunge la o lungime apreciabila (15-20 ) si cu o grosime redusa (0,1-0,3 ) - Treponema, Leptospira, Borrelia;

Actinomicetele sunt bacterii asemntoare fungilor care formeaz filamente lungi i ramificate care se pot fragmenta rezultnd forme asemnatoare bacililor (Actinomyces).

Dispunerea bacteriilor Dispunerea bacteriilor poate permite recunoaterea genului sau chiar a speciei, prin examinarea la microscopul optic a frotiurilor colorate efectuate din culturi sau din produsul patologic recoltat de la pacient. Cocii se dispun: n grmezi (ciorchini de struguri) - genul Staphylococcus; n lanuri - genul Streptococcus; n diplo, lanceolai - Streptococcus pneumoniae; n diplo, ca dou boabe de cafea cu concavitile fat in fat - Neisseria gonorrhoeae i Neisseria meningitidis; n tetrade (cte 4) - genul Micrococcus; n cuburi (cte 8), aezati tridimensional - genul Sarcina; izolai. Bacilii se aaz: cel mai frecvent izolai - majoritatea enterobacteriilor; grupai cte doi (diplobacili) sau n lanuri scurte - genul Klebsiella; dispui n lanuri - bacilii din genul Bacillus; dispui n mod caracteristic sub forma unor majuscule sau litere chinezeti - bacilii difterici (Corynebacterium diphteriae); n palisade (bacilii difterimorfi).

Diferite forme de bacterii

Structura bacteriilor

ELEMENTELE DE STRUCTUR ALE CELULEI BACTERIENE Elementele constante (permanente, obligatorii) Peretele celular Membrana citoplasmatic Citoplasma Ribosomii Nucleoidul Elementele inconstante (nepermanente, neobligatorii) Capsula Sporul Flagelii Pilii/fimbriile Plasmidele Incluziunile celulare

pilus sex pilus Common pili or fimbriae Capsules (includes "slime layers" and glycocalyx) Stabilizeaz bacterii mperechere n timpul transferului de ADN de conjugare Ataamentul fa de suprafee; protecia mpotriva acaparat phagotrophic Ataamentul fa de suprafee; protecia mpotriva acaparat fagocitare, ocazional, uciderea sau de digestie; rezerv de nutrieni sau de protecia mpotriva deshidratri protein protein Usually polysaccharide; occasionally polypeptide

Perte celular Gram-positive bacteria Previne liz osmotic a protoplatilor de celule i confer rigiditate si forma pe celulele Peptidoglicanilor previne liza osmotic i confer rigiditatea si forma; membrana exterioar este bariera de permeabilitate, LPS asociate, precum i proteine au functii diferite Barier Permeabilitatea; transportul substanelor dizolvate, producerea de energie; Locul de amplasare a sistemelor enzimatice numeroase
Locuri de translatie(sinteza proteinelor) Foarte diverse; carbohidrati, lipide, proteine sau s anorganice Material genetic celular Extrachromosomal genetic material

Peptidoglycan (murein) complexed with teichoic acids Peptidoglycan (murein) surrounded by phospholipid protein-lipopolysaccharide "outer membrane

Gram-negative bacteria

Membrana plasmatica

Fosfolipid si proteine

Ribosomi Incluzsi Cromosom

RNA and protein Highly variable; carbohydrate, lipid, protein or inorganic DNA

Structura celulei bacteriene

Peretele celular si coloratia Gram

A fost descoperit de Hans Christian Gram un om de tiin danez n 1884. 1. Se fixeaza prin caldura frotiul facut dintr-o cultura bacteriana se aplica o prima coloratie (violet cristal), la o cldur-fix (deces de cldur) frotiu a unei culturi bacteriene. 2.Se aplica un agent de fixare (iod ) 3.Se face o decolorare cu alcool sau aceton, 4.Apoi se face o a doua colorare cu safranin, sau carbol fuchsin .

Peretele celular
Bacteriile acido-alcoolorezistente de interes medical sunt bacilul tuberculos i bacilul leprei a cror perete celular se aseamn cu cel al bacteriilor gram-pozitive. Structurile speciale conin acid micolic i o cear ce confer acestor bacterii caractere tinctoriale deosebite i rezisten crescut la factorii de mediu. Astfel dac, dup o nclzire de scurt durat ce topete cerurile, un colorant poate ptrunde n celula bacterian, decolorarea acesteia sub aciunea acizilor sau alcoolilor nu se mai produce ca la alte bacterii. Acest caracter se numete acido-alcolo-rezisten. Bacteriile acido-acolo-rezistente se coloreaz foarte slab cu coloraia Gram, evidenierea lor fcndu-se la cald prin tehnica Ziehl-Neelsen.

Peretele celular
Bacterii gram-pozitive sunt cele care sunt colorate albastru inchis sau violet prin coloraia Gram. Acest lucru este n contrast cu bacteriilor Gramnegative, care nu pot reine culoarea violet cristal, n schimb preiau ce de a doua coloratie (safranin sau fucsin) i apar colorate in rosu sau roz. Gram-pozitive sunt organislme ce pastreaza culoarea violet cristal, din cauza nivelului ridicat de peptidoglicanilor din peretele celular. Grampozitivele au alta structura, de obicei, membrana exterioar gsita la bacteriile Gram-negative.

Perete celular la Gram pozitive

Perete celular

PERETELE CELULAR AL BACTERIILOR GRAM-POZITIVE Uniform, cu pori mici Grosimea 20-80 nm (pn la 300 nm) Componentul major (40-80%) reprezint PG (structur reticulat tridimensional) Componente minore: 1. Acizii teichoici (polimeri de glicerol sau ribitol fosfat), fixai de N-AGA. Traverseaz PG i creaz sarcin electric negativ la suprafaa bacteriei, asigur transferul de ioni i fixarea unor proteine, funcie antigenic. Pot activa complementul pe cale alternativ i stimula secreia citokinelor de ctre macrofage. 2. Acizii lipoteichoici: se fixeaz de MCP i depesc stratul de PG. Funcii: identic cu acizii teichoici, intervin n adeziunea la celule i au un efect toxic slab. 3. Proteine asociate peretelui celular: proteina A, coagulaza legat (clumping factor) i proteina fixatoare de fibronectin la Staphylococcus aureus, proteina M la Streptococcus pyogenes (rol n adeziune la substrate, protecie de fagocitoz) 4. La unele bacterii G+ (de exemplu: Mycobacterium, Nocardia) peretele conine o cantitate important de lipide sau ceruri, la altele (ex.: streptococi) peretele conine multe glucide.

Peptidoglicanul

Heteropolimer macromolecular reticulat, constituit dintr-un component glicanic i unul peptidic. Partea glicanic (polizaharidic) este constituit din catene liniare paralele n care alterneaz N-acetyl-glucozamina cu acidul N-acetylmuramic. Partea peptidic este reprezentat de uniti tetrapeptidice (izomeri L i D de AA), fixate de acidul muramic, care pot fi legate intre ele direct (formand o structur bidimensional, la bacterii G-) sau prin puni interpeptidice (structur tridimensional, la bacterii G+). Acidul diaminopimelic, izomerii D ai AA i acidul muramic se ntlnesc doar la celulele procariote. Este atacat de 1. Lizozimul, care taie legturile dintre N-AGA i acidul N-AM (catena glicanic) 2. Unele antibiotice (beta-lactamine, glicopeptide, fosfomicina), care perturb procesul de transpeptidare.

Caracteristici ale bacteriilor Gram+

1.Membrana citoplasmica lipidica 2.Strat gros de peptidoglican
. acizi teichoic i lipoiteichoici sunt prezenti, care pentru a aciona ca ageni de chelare, i, de asemenea, pentru anumite tipuri de aderare

3.Capsula din polizaharide (numai unele specii) 4.flagel (numai la unele specii)
. dac este prezenta, acesta conine dou inele de sprijin pentru ca spre deosebire de patru bacterii Gram-negative, deoarece bacterii gram-pozitive au un singur strat membrana Moleculele individuale ale peptidoglicanilor sunt reticulate prin lanuri pentaglicina de catre o enzima DD-transpeptidaza (D-alanyl-Dalanina transpeptidaza). Formeaza spori ca forma de rezistenta. Exemple Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus i Clostridium

PERETELE CELULAR AL BACTERIILOR GRAM-NEGATIVE Grosimea 10-12 nm Neomogen, format din straturi distincte:\ 1.Peptidoglican stratul intern, constituie 1-10% din masa uscat a peretelui celular. Acizii teichoici lipsesc. Nu exista puni interpeptidice (structur bidimensional). 2.Membrana extern (ME) dublu strat lipidic cu proteine nserate (proteine majore 70%, minore 30%). proteine majore - porine, unindu-se n triplete, particip la formarea porilor, altele (nonporine) au funcie de receptor pentru bacteriofagi i pili sau asigur adeziunea la receptorii celulelor-gazde. Proteinele minore sunt enzime implicate in captarea unor substane i transportul specific transmembranar. 3. Lipoproteinele asigur legtura dintre ME i PG 4. Lipopolizaharidul (LPZ) stratul extern al peretelui gram-negativ. Este format din: Lipidul A (endotoxin), glicolipid ancorat n ME. Stimuleaz formarea i secreia citokinelor. Determin efectul toxic al bacteriilor G- manifestat n urma lizei celulare. Polizaharide complexe, fixate pe lipidul A. Particip n procese de penetrare i transport a unor substane, confer specificitate de gen (antigenul R) La exterior, subuniti oligozaharidice liniare sau ramificate. Creaz sarcin negativ la suprafaa bacteriei (mpiedic fagocitoza, accesul moleculelor toxice), confer specificitate de specie sau tip (antigenul O) Spaiul periplasmic este regiunea dintre ME i MCP. Conine PG i proteine-enzime implicate n transport, digestia nutrienilor, protecia contra substanelor toxice (ex.: beta-lactamazele, care distrug antibioticele beta-lactamice). La bacteriile G+ aceste enzime sunt secretate n mediul extern. Evidenierea peretelui celular: microscopia electronic, metode speciale de colorare, plasmoliz (n mediu hipertonic), plasmoptiz (n mediu hipotonic).

Peretele celular la bacteriile Gram negative

Exemple

Proteobacteria bacteriilor Gram-negativ Bacili gram-negative includ o multitudine de specii. Unii dintre ei n primul rnd cauza probleme respiratorii (Hemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa), altele probleme urinare (Escherichia coli, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens), probleme gastro-intestinale (Helicobacter pylori, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi Shigella i alte Enterobacteriaceae, Acinetobacter baumannii Alte grupuri notabile ale bacteriilor Gram-negative includ spirochaetes, Coci gram-negative sunt Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Moraxella catarrhalis.

S layer (stratul de suprafata)

S strat (strat de suprafata) este o parte a invelisului celular -gasit la bacterii, precum i n rndul Archaea. un strat monomolecular compus din proteine identice sau glicoproteine. straturile S au o grosime ntre 5 i 25 nm i posed pori identic cu 2-8 nm n diametru.

Membrana citoplasmatica

Prezint o structur membranar clasic: dublu strat fosfolipidic n care sunt nserate proteine i glicoproteine. Lipsesc sterolii. (6,5-7nm), elastic, lipsit de rezisten mecanic ce mrginete la exterior citoplasma bacteriilor i o separ de peretele celular La bacteriile gram-pozitive MCP formeaz invaginaii, mezosomi (septali, laterali), n care se conin enzime, citocromi i proteine ale sistemului transportor de electroni. Proteinele membranei: PFP (Proteine Fixatoare de Penicilin), enzime ce catalizeaz legturile dintre catenele peptidice din PG reacia de transpeptidare (sunt inactivate de penicilin i antibiotice beta-lactamice) Componente ale sistemului de transport (permeaze) Proteine ale sistemelor de secreie (I VI)- la bacterii gram negative. Reprezint cilindre proteice ce traverseaz nveliurile celulei bacteriene. Asigur transportul proteinelor din interiorul celulei bacteriene spre exterior Proteine receptori Enzime ale lanului respirator

Membrana citoplasmatica

Funciile membranei citoplasmatice

Barier osmotic i de permeabilitate selectiv Asigur transportul activ prin intermediul permeazelor Excreia enzimelor hidrolitice, toxinelor, etc Sediul metabolismului energetic (mezosomi) Intervine n diviziunea celular (mezosomi) Implicare n sinteza peptidoglican i a fosfolipidelor Implicare n chemotaxie prin receptori specifici Asigur transmiterea informaiei din mediul nconjurtor spre interiorul celulei bacteriene

Citoplasma

Necompartimentat Lipsesc organitele celulare Format din ap (80%), conine nucleoidul, ribosomi (apr. 20 000 per celul), incluziuni, plasmide, ioni, enzime, deeuri, etc. Consistena dens (stare de gel) asigur permanena mediului intern pH acid Funcii: sediul tuturor proceselor metabolice Evidenierea: prin orice metod de colorare

Ribozomii

La microscopul optic citoplasma apare omogen, amorf, iar la cel electronic fin granulat datorit unui numr mare de ribozomi. Se apreciaz c o celul bacterian are 20.000 de ribozomi ce conin 80-90% din ARN-ul citoplasmatic. Ribozomii sunt structuri sferice cu diametru de aproximativ 18nm i constanta de sedimentare de 70S. n absena ionilor de Mg2+ se desfac n dou subuniti cu constanta de sedimentare de 50S i 30 S. Din punct de vedere chimic sunt alctuii din 65-70% ARN i 3035% proteine. O parte din ribozomi se asociaz formnd poliribozomi (mai ales n timpul sintezelor proteice), alii sunt liberi, iar o a treia categorie se ataeaz mezozomilor sau membranei citoplasmatice. Ribozomii reprezint sediul sintezelor proteice din celul.

Ribozomii
Aspectul tridimensional al ribozomilor se remarca cele doua subunitati

Nucleoidul (cromozomul bacterian)

Constituit din ADN bicatenar circular, uneori liniar, plasat liber n citoplasm. ADN este repliat n bucle i stabilizat prin ARN i proteine. Fiecare bucl este hiperspiralizat sub aciunea ADNgirazei i topoizomerazei IV (se ntlnesc doar la bacterii). Pe ADN sunt fixate enzime de sintez (ADN, ARN polimeraze) Funcii: dirijaz activitatea celulei (procesele de sintez, creterea, multiplicarea, diferenierea celulei, replicarea proprie, etc) Funcia nucleului bacterian const n depozitarea informaiei genetice necesar autoreplicrii, organizrii structurale i funcionale a celulei bacteriene. Evidenierea: Microscopia electronic Metode speciale de colorare (Feulgen)

Materialul genetic al bacteriilor

Materialul genetic al bacteriilor

Dupa Wright et al.2002 superinfasurarea materialului genetic bacterian

Cromozomul bacterian la microscopul electronic

Capsula
De obicei, este format din polizaharide, dar ar putea fi compus din alte materiale (de exemplu, polipeptida n B. anthracis Deoarece cele mai multe capsule sunt solubile in apa, acestea sunt dificil de pata folosind pete standard, deoarece cele mai multe pete nu ader la capsul.. Pentru examinarea n temeiul microscop, bacterii i trecutul lor sunt ptate mai ntunecate dect capsul, care nu pateaza Cnd vizualizate, celulele bacteriene precum i suprafaa pe care sunt coloreaz sunt ntunecate, n timp ce capsula rmne pal sau incolor i apare ca un inel n jurul celulei.

Capsula
-capsula este considerat un factor de virulenta, deoarece aceasta mbuntete capacitatea de bacterii pentru a provoca o boala (de exemplu, previne fagocitoza). -Capsula este alunecos i fragil, asa ca atunci cand un fagocit ncearc s phagocytose bacterii, se poate aluneca departe. Un anticorp capsul specifice pot fi necesare pentru fagocitoza s apar. -Capsulele conin, de asemenea, de ap care protejeaz mpotriva bacteriilor uscare. -Ei exclud, de asemenea, virui bacteriene i materiale dintre cele mai toxice hidrofobe, cum ar fi detergenii. -ajuta celulele sa adere la suprafee. Detectarea 1. India colorarea cerneal: capsula apare ca un halou n jurul valorii de bacteria clar ca cerneala nu poate ptrunde n capusule. 2. Metode serologice: materiale capsulara este antigenic i poate fi demonstrat prin amestecul cu un ser anticapsular specifice. Cnd a fost examinat la microscop, capsula apare "umflate", datorit unei creteri n refractivity sale. Acest fenomen este numit ca reacie capsul umflarea sau fenomen Quellung. 3. Colorarea capsul special: Aceste tehnici utilizeaz sruri de cupru ca preparate pentru mordansare pentru colorarea a capsulei.

Endosporul
Endosporul la Bacterium megatherium Cu verde este colorat endsoporul in interiorul celulei

Sporii

Unele bacterii se transform n spori, care sunt forme primitive de difereniere celular, cu rezisten crescut la factorii de mediu i care apar endocelular n condiii nefavorabile de via. Sporogeneza se ntlnete numai la 3 genuri de bacterii gram-pozitive, Clostridium i Bacillus care sunt bacili i Sporosarcina care sunt coci. Dintr-o bacterie vegetativ se formeaz un singur spor, care n condiii favorabile de via va da natere unei singure celule bacteriene. Poziia sporului bacterian constituie un caracter taxonomic. Poate fi central, ca la bacilul crbunos (Bacillus anthracis), subterminal, ca la B.cereus, sau terminal, ca bacilul tetanic (Cl.tetani). n coloraiile obinuite sporul apare ca o zon incolor n corpul bacterian. El se evideniaz ns prin coloraii speciale, la cald, care permeabilizeaz nveliurile sporale pentru colorani (coloraia Mller). Pe preparatele native ntre lam i lamel efectuate din culturi, sporii apar ca nite formaiuni rotunde, refringente. Ultrastructura i compoziia chimic a sporilor asigur acestora o mare rezisten la agenii fizici i chimici, ceea ce face ca ei s fie considerai forme de rezistena ale bacteriilor. De importan deosebit pentru medicin este rezistena sporilor la cldur, de care trebuie s se in cont la sterilizare.

Structura sporului variaz de la specie la specie, dar organizarea general se aseamn. De la interior spre exterior, sporul este format din: core sau protoplastul sporal, format din materialul nuclear inconjurat de membrana citoplasmatic. Aici este depozitat AND-ul i o substan care are rol n rezistena sporului la cldur dipicolinatul de Ca, care nu s-a mai evideniat nicieri n natur, cortexul intern sau peretele sporal format din peptidoglican i care este peretele celular primordial, membrana extern sau cortexul sporal, care este stratul cel mai gros al sporului i care conine i el un peptidoglican, cu o structur particular, foarte sensibil la lizozim. Autoliza acestui strat este momentul cheie n transformarea sporului n forma vegetativ, tunica proteic este format din proteine chitinoase cu numeroase legturi disulfitice. Ea este impermeabil, fiind responsabil de rezistena sporilor la unele dezinfectante, exosporiumul este prezent numai la unii spori i conine lipoproteine i zaharide.

Sporulatia

Germinarea endosporului

Germinarea sporului. n condiii de mediu favorabile, sporul germineaz i va da natere unei bacterii vegetative identice cu aceea n care s-a format. Germinarea are loc n 3 etape: Activarea sporului. Se produce cnd acesta ntlnete condiii favorabile de via, dar i un factor care s lezeze nveliul sporal (mecanic sau chimic ca, de exemplu, lizozimul, compui cu grupri sulfhidrilice libere etc.). Iniierea este declanat de un mediu nutritiv bogat. Pentru unii spori triggerul este L-alanina, iar pentru altele adenozina. Acesta duce la activarea unei enzime autolitice care degradeaz cortexul sporal. Are loc absorbia de ap, eliberarea dipicolinatului de calciu i degradarea unor compui sporali. Dezvoltarea sporului. Protoplastul sporal se transform n bacterie vegetativ, care trece printr-o perioad metabolic activ de refacere a constituenilor celulari normali i a echipamentului enzimatic complet.

Flagelul

Cilii sau flagelii bacterieni Sunt extensii filamentoase ale speciilor bacteriene mobile, cu originea n citoplasma bacterian, i servesc ca organe de locomoie. Ei sunt prezeni mai ales la bacili (Enterobacteriaceae) dar i la unii coci (enterococ). Cilii sunt structuri helicoidale, cu dimensiunea n general mai mare dect cea a celulei bacteriene creia i aparin (2-15/2-20 nm) i se evideniaz microscopic prin coloraii speciale. Dispoziia i numrul cililor sunt caracteristice speciei. S-au descris bacterii atriche (fr cili), monotriche - cu un cil polar (Vibro cholerae), lofotriche - cu un smoc de cili situat la unul din polii bacteriei - (Pseudomonas fluorescens), amfitriche - cu cilii situai la ambii poli ai bacteriei (la genul Spirillum) i peritriche - cu cilii dispui pe ntreaga suprafa a bacteriei (Salmonella, E. Coli, Proteus etc.). Structura cililor este tubular, ei fiind formai dintr-o protein contractil, flagelina, sub form

Flagellum
Un flagel bacteriene sunt de 3 Componente de Baza: un filament, un carlig , organism al [lacii bazale. 1) cu filament Este structura rigida, spiralat de ngrijire SE extinde de la suprafata celulei. Acesta Este compus din proteine flagellin aranjate version Lanturi elicoidal astfel Incat sa formeze ONU NUCLEU gol. n Timpul Sinteza o flagellar filamentului, moleculele flagellin venirea n afara de ribozomii sunt transportate principiul nucleul gol al filamentului version cazul n ngrijire pe o acord ngrijire Vrful de cretere o filamentului determinnd-O SA SE lungeasc. Cu excepia unei bacterii Cateva, cum ar fi Bdellovibrio si Vibrio cholerae, filamentul flagellar Nu Este nconjurat de ONU nveli 2) Este carlig un cuplaj flexibil Intre filament Si bazale 3) Organismul bazale CONSTA Dintr-o tij Si o serie de Inele de ngrijire ancora un flagel peretelui celular si membrana citoplasmatice

Spre deosebire de flagella eucariote, flagel bacteriene nu are nici o fibrils interne i nu flex. n schimb, bazale acioneaz ca un motor rotativ molecular, care s permit flagel pentru a roti i polifuncti bacteria prin intermediul lichidului din jur. De fapt, motorul flagellar se rotete foarte rapid. (Motorul de E. coli se rotete 270 rotaii pe secund!) Proteinele Mot inconjoara inele MS i C ale motorului i funcia de a genera un cuplu de rotaie a flagel. Energie pentru rotaie provine din for motrice de protoni (def). Protonii se deplaseaz prin proteinele Mot drive-urile de rotaie.

Cilul se ataeaz de bacterie printr-un corpuscul bazal i un crlig de articulaie aflate n citoplasma bacteriei. Corpusculul bazal se inser prin crligul de articulaie de membrana citoplasmatic i peretele celular. Mobilitatea i direcia micrii cililor pot fi influenate de concentraia unor substane din mediu (chimiotactism pozitiv sau negativ) i de temperatur. Ei sunt sediul antigenelor flagelare (H), importante n identificarea bacteriilor. Cilii bacterieni nu se observ dect pe preparate colorate special. n practica de rutin nu se evideniaz flagelii, ci mobilitatea bacteriilor, fie prin examinarea lor pe un preparat nativ ntre lam i lamel n care se urmresc micrile bacteriilor, fie prin nsmnarea tulpinii pe un mediu semisolid prin neparea n profunzime a mediului. Dac bacteria crete nu numai pe traseul nsmnrii i difuzeaz n mediu, ea este mobil.

Tipuri de flageli
A-monotrichi

B-lophotrichi
C-amphitrichi

D-peritrichi

Flagelii si cilii
Doua exemple de flageli

Pili si fimbriae

Pilii bacterieni Numeroase specii bacteriene gram-negative au pe suprafaa lor lor nite apendici filamentoi, rigizi, mai scuri dect flagelii, n numr mare (100500/celul) i cu dispoziie n general peritrich. Ei se evideniaz numai prin microscopie electronic. sunt polimeri proteici de pilin, dispui helicoidal ntr-o structur tubular. Natura proteic a pililor le confer proprieti antigenice. Din punct de vedere funcional, pilii se mpart n: -sex pili - codificai de formaiunile genetice extracromozomiale (plasmide) i care prezint o importan deosebit n transferul de material genetic ntre bacterii. Sunt prezeni mai ales la bacteriile gramnegative (Enterobacteriaceae, Pseudomonas), -pili comuni sau pili de aderen (fimbrii), n numr mare, codificai cromozomial, i care servesc bacteriilor la fixarea ferm de mediul de cultur sau de celulele pe care se afl. Ei constituie, deci, un factor important de virulen (de exemplu la gonococ). n afar de aderen, pilii comuni mai au i proprieti antifagocitare. Ambele categorii de pili prezint antigene specifice piliare i pot fi receptori pentru bacteriofagi.

Plasmidele

PLASMIDELE Elemente genetice (ADN) extracromozomiale, capabile de replicare autonom. Confer bacteriei caractere suplimentare. Se transmit celulelor-fiice la diviziunea bacteriei. Plasmidele conjugative F se transmit prin conjugare. Episom - plasmida integrat n cromosom Tipuri de plasmide: F factor de fertilitate, conjugative (sinteza pililor F) R rezisten la antibiotice Ent producerea enterotoxinei Hly producerea hemolizinei Col producerea de bacteriocine

Plasmidele
Dimensiuni plasmida variaz de la 1 la peste 1.000 de KBP. Numrul de plasmide identic ntr-o singur celul, poate varia de oriunde de la una la chiar mii n anumite circumstane. Plasmide pot fi considerate parte a mobilome, deoarece acestea sunt adesea asociate cu conjugare un mecanism de transfer de gene orizontale Plasmide pot fi gsite n toate cele trei domenii majore: Archea, bacterii, i Eukarya ADN-ul plasmidic nu codifica genele necesare pentru a incadrati materialului genetic pentru transferul la o nou gazd, Plasmidele ofer un mecanism pentru transfer de gene orizontal la o populatie de microorganisme. Plasmidele pot transporta genele care ofer rezisten la antibiotice apar n mod natural ntr-o ni de mediu competitiv, sau proteine produse pot aciona ca toxine n circumstane similare. Plasmidele utilizate n ingineria genetic sunt numite vectori fiind utilizate in biotechnologii.

Incluziile citoplasmatice

Incluziile citoplasmatice, descrise la unele specii bacteriene, sunt formaiuni structurale inerte, temporare, de diferite dimensiuni, variind n funcie de specia bacterian i condiiile de mediu. Compoziia lor chimic este diferit, ele putnd fi de glicogen sau amidon (la unii bacilii aerobi sporulai), lipide (la genul Bacillus), polimetafosfai (sau incluziile de volutin descrise mai nti la Spirillum volutans i apoi de Babe i Ernst la bacilii difterici).

Incluziile sunt structuri legate de activitatea metabolic a celulei bacteriene i reprezint un material de rezerv care poate fi folosit ca surs de energie.

Incluziile citoplasmice
Poli hidroxi butiratul (PHB si poli hidroxi alcanoatul PHA Unele dintre cele mai raspandite incluziuni intracelulare sunt, n general, clasificate ca fiind substante cu lant scurt (monomeri care conin 3-5 atomi de carbon) sau lanturi de lungime medie (monomeri ce conin 614 atomi de carbon

Bibliografie
Madigan et al. Biology of microorganisms www.wikipedia.com

4.Fiziologia bacteriilor
Universitatea de Vest Vasile Goldi Arad Facultatea de Medicina, Farmacie si Medicina Dentara Dr.biol. Sergiu Fendrihan

Bacteria- compozitie chimica

Apa, reprezint 75 - 85% din greutatea umed a bacteriei. Exist ap liber (mediu de dispersie), fie ap legat fizico-chimic cu diferite structuri. Sporii au putin ap si aceea sub form de ap legat. Substantele minerale reprezint 2-30% din greutatea uscat a bacteriei (P, K, Na, Ca, S, Cl, Fe, oligoelementele, Cu, Mg, Zn) si variaz cu specia, vrsta culturii, compoziia chimic a mediului. Glucidele reprezint 10-25% din greutatea uscat a celulei bacteriene n raport cu specia, vrsta si conditiile de dezvoltare. n structura bacterian se pot gsi glucide simple (mono si dizaharide) cu rol n metabolismul intermediar glucidic precum si glucide complexe (polizaharide) care particip la realizarea structurii peretelui celular si fac parte din capsula unor bacterii Proteinele reprezint ntre 40-80% din greutatea uscat a bacteriei, aproximativ jumtate din proteine functionnd ca enizme restul avnd rol structural Lipidele reprezint 1-10% din greutatea uscat a bacteriilor (excepie micobacteriile unde pot ajunge pn la 20 - 40%). Cantitatea de lipide variaz n raport cu specia, vrsta culturii si compozitia mediului.

Bacteriile- compozitie chimica

Pigmentii bacterieni, sunt prezenti la bacteriile cromogene, pigmentogeneza fiind dependent de specie si de condiiile de cultivare. :- carotenoizi: Staphylococcus, Sarcina; - chinoinici: Mycobacterium; - fenazinici Pseudomonas etc. Roluri:- protectie fat de radiatiile UV (pigmenti carotenoizi);- enzimatic- antibiotic (piocianina produs de P.aeruginosa fat de B.anthracis). Enzimele bacteriene sunt elaborate sub control genetic,

- enzime ectocelulare situate n membrana citoplasmatic, reglnd

permeabilitatea selectiv (permeaze, translocaze);

- enzime extracelulare sau exoenzime, care sunt eliberate n mediu (hidrolaze).

n raport cu reactia catalizat enzimele pot fi: - hidrolaze (fosfataza, proteaza);transferaze (aminotransferaza); - oxido-reductaze (catalaza, oxidaza, peroxidaza);izomeraze etc.

- constitutive, care exist ntotdeauna n celul indiferent de natura mediului; - adaptative (inductibile), sintetizate de ctre bacterie numai ca raspuns al anumiti stimuli din mediu

Factori de crestere Unele bacterii sunt capabile s-si realizeze integral sinteza metabolitilor esentiali utiliznd nutrientii prezenti n mediul lor de viat.

Enzime

o Un catalizator este o substan care reduce energia de activare a unei reacii o catalizatorii biologici sunt numiti enzime o un reactant ntr-o reacie enzimatic catalizat-se numete un substrat o parte a enzimei la care se leag subtrate este site-ul activ Enzimele pot sa creasca viteza unei rectii chimice de la 108 la 1020 de ori fata de viteza pe care a r avea o fara cataliza Majoritatea enzimelor sunt proteine di ca orice proteina are o forma specifica tri-dimensional Cele mai multe enzime conin o protein di componente non proteice care particip n cataliz. Aceste componente sunt grupuri prostetice sau coenzime o grupuri prostetice sunt foarte strns legate pentru activitatea enzimelor Coenzimele sunt derivate din vitamine,

Enzimele

Factori care afecteaz aciune enzimatic -Activitatea enzimelor este puternic afectat de modificarea pH-ului i a temperaturii. Fiecare enzima funcioneaz cel mai bine la un pH anumit (Graficul din stnga) i temperatur (Graficul dreapta), activitatea n scdere la valorile de mai sus i mai jos la acest aspect. -Modificarea pH-ului modifica starea de ionizare a amino acizilor (de exemplu, Asp, Lys), care poate juca un rol crucial n substrat i / sau aciunea catalitic n sine. Fr existenta grupului neionizat-COOH de Glu-35 i ionizat-COO-a Asp-52 -Legaturile de hidrogen sunt uor perturbate de creterea temperaturii. Aceasta, la rndul su, poate perturba forma a enzimei, astfel nct afinitatea sa pentru substrat diminueaz.Poriunea ascendent a curbei de temperatura reflect efectul general de creterea temperaturii asupra vitezei reactiilor chimice. Partea descresctoare a curbei reflect pierderea activitii catalitice deoarece moleculele de enzima sunt denaturate la temperaturi ridicate.

Influenta factorilor de mediu asupra activitatii enzimatice

Enzimele
Fiecare enzima catalizeaza o etapa in lantul de reactii care duce la obtinerea sau la degradarea unui produs iar o intreaga retea de enzime si de lanturi de reactii care se intrepatrund formeaza un sistem de reactii ce constituie intreg metabolismul celular in care multe reactii sunt cuplate si se interconditioneaza intre ele, fiind reglate de mecanisme complicate genetice si de relatie cu mediul inconjurator. Energia obtinuta se stocheaza in substante cu rol de compusi energetici care o elibereaza treptat dupa nevoile metabolice ale celulei

Transition State of Substrate Substrate Activation Energy

Transition State of Substrate Activation Energy

Free energy Substrate

Product

Product

reaction

Compusi ce contin energie ATP

Structura de ATP. ATP-ul este derivat din nucleotid adenozin monofosfat (AMP) sau acid adenylic, n care dou grupuri suplimentare de fosfat sunt ataate prin legaturi pirofosfat (~ P). Aceste dou legaturi sunt bogate de energie, n sensul c prin hidroliz randamentul lor e mai mare, eliberand o cantitate mult mare de energie mai mult dect o legtur covalent corespunztoare. ATP acioneaz ca o coenzima in reactiile energetice de cuplare n care una sau ambele grupuri de fosfat terminal este scoasa din molecula ATP cu energie care este utilizata pentru a transfera o parte din ATP la o alta molecula pentru a activa rolul su n metabolismul celular. De exemplu, Glucoz + ATP -----> glucoz-P + ADP sau aminoacizi + ATP -----> AMP-Amino acid + ppi.

Nicotin Adenine Dinucleotide NADNADH2

(a) nicotinamid adenin dinucleotid este compus din dou molecule de nucleotide: adenozin monofosfat (adenin plus riboz-fosfat) i nicotinamida ribotide (nicotinamid plus riboz-fosfat). NADP are o structur identic cu excepia faptului c acesta conine un grup fosfat suplimentar ataat la unul din reziduuri riboz. (b) oxidat i redus forme ale acestei substante . Nicotinamida este o parte activ a moleculei n cazul n care oxidare reversibile i reducerea are loc. Forma oxidata are un atom de hidrogen mai puin dect forma redus i, n plus, are o sarcin pozitiv pe atomul de azot care i permite s accepte un al doilea electron la reducere. Astfel, modul corect de a simboliza reacia este NAD + + 2H ----> NADH + H +. Cu toate acestea, pentru comoditate, vom folosi n continuare simbolurile NAD i NADH2.

Coenzime A
(a) Structura coenzima A. CoA-SH este un derivat de ADP. Molecula artat aici anexat la ADP este acidul pantotenic, care poart o grupare tiol terminala (-S). (b) oxidarea acidului ceto, acidul piruvic, la acetil ~ SCoA. Aceasta este reacia pe care intr doi atomi de carbon de la piruvat n ciclul TCA.

Nutritia bacteriilor si metabolismul

Nutritia bacteriilor
1.Cum obine organismul carbon pentru sintetizarea masei de celule: -autotrofe necesarul de carbon este obinut din dioxid de carbon (CO2) -heterotrofe necesarul de carbon este obinut din compui organici -mixotrophic necesarul de carbon este obtinut din ambele tipuri de compui organici i prin acumularea de dioxid de carbon 2. Cum se obine energia organismului : -chemotrofic - energia este obinuta din compui chimici din mediu -fototrofic - energia se obine de la soare Bacteriilor patogene sunt heterotrofe

METABOLISMUL BACTERIAN Reprezint totalitatea reactiilor biochimice care caracterizeaz cele dou etape: anabolismul si catabolismul. A. Anabolismul Anabolismul este procesul de constituire a moleculelor complexe organice structurale si functionale ale celulei bacteriene. Aceste reactii de biosintez sunt nsotite de consum de energie si sunt similare la diferite specii bacteriene. A1. Biosinteza polizaharidelor din compusi intermediari rezultati din glicoliz si ciclul Krebs. Polizaharidele au rol plastic si energetic, polimerii (amidon, glicogen) stocnd energia pe termen lung. A2. Biosinteza lipidelor din glicerol (provine dintr-un compus intermediar rezultat n cursul glicolizei) si acizi grasi. Grsimile sintetizate de bacterie sunt utilizate la sinteza fosfolipidelor membranare, a peretelui celular specific bacteriilor Gram negative. A3. Biosinteza aminoacizilor si a proteinelor este diferit n functie de specia bacterian. Unele bacterii au echipament enzimatic ce le permite sinteza tuturor aminoacizilor din intermediari ai catabolismului glucozei (E.coli). Alte bacterii necesit prezenta n mediu a unor aminoacizi preformati. Proteinele bacteriene sintetizate sunt proteine structurale, enzime, toxine). A4. Biosinteza purinelor si pirimidinelor din produsi intermediari rezultati din glicoliz si ciclul Krebs. Purinele si pirimidinele rezultate servesc la sinteza acizilor nucleici.

Metabolismul bacterian

B. Catabolismul Catabolismul bacterian este procesul prin care sunt degradati compusii organici cu structur complex n compusi simpli, cu eliberare de energie. n functie de cile prin care bacteria obtine energia, pe care apoi o conserv si o utilizeaz n procesele de biosintez, bacteriile se mpart n a) bacterii fototrofe (fotobacterii) folosesc energia luminoas, triesc la lumin. Sunt bacterii saprofite; b) bacterii chimiotrofe (scotobacterii, bacterii chimiosintetizante) folosesc energia din procesele de oxido-reducere catalizate enzimatic, triesc la ntuneric. Sunt bacterii saprofite si patogene. Reactiile de oxidoreducere presupun existenta unui donor (surse de energie) si a unui acceptor de electroni. Donorul poate fi o substant anorganic (pentru bacterii chimiolitotrofe) sau organic (pentru bacterii chimioorganotrofe). Bacteriile de interes medical aparti nultimei grupe. B1. Catabolismul hidratilor de carbon Ca surse organice de energie sunt utilizate glucoza, aminoacizii, purinele, pirimidinele, acizii grasi. Dintre toate acestea cel mai frecvent este folosit glucoza eliberarea de energie fcndu-se prin dou ci: respiratia si fermentatia. B2. Catabolismul lipidic si proteic Producerea de energie din glicerol, acizi grasi sau aminoacizi se face tot prin ciclul Krebs.

Relaia dintre catabolism si anabolism ntr-o celul. n timpul catabolismului, energia este schimbata de la o form la alta, i de conformitate cu legile termodinamicii, astfel de transformri de energie nu sunt niciodat complet eficiente, de exemplu, unele tipuri de energie se pierd sub form de cldur. Eficiena unei secvene de reacie catabolica este cantitatea de energie pusa la dispoziia celulei (pentru anabolism) mprit la cantitatea total de energie eliberat n timpul reacii.

EMP=calea Embden Meyerhof Parnas

Glicoliza (de la glucoz, un termen mai mari de glucoz +-liza degradare) este calea metabolic care converteste glucoza C6H12O6, n piruvat CH3COCOO-+ H +.Energie liber eliberat n acest proces este folosit pentru a forma compui de nalt energie ATP (adenozin trifosfat i NADH (nicotinamid adenin dinucleotid redus). Glicolizei este o secven definit de zece reacii care implic zece compui intermediari (una dintre etape implic doi intermediari). Intermediarii ofer puncte de intrare lin procesul de glicoliza. De exemplu, cele mai multe monozaharide, cum ar fi fructoza, glucoza, i galactoz, pot fi convertite la unul din acesti intermediari. Intermediari pot fi, de asemenea, utili n mod direct. De exemplu, intermediarul fosfat dihidroxiacetona (DHAP) este o surs de glicerol, care se combina cu acizi grai pentru a forma grsimi. Ea apare, cu variaii, n aproape toate organismele, atat aerobe si anaerobe.

Calea Emden Meyerhoff Parnas

Calea Embden-MeyerhoffParnas (1 D-glucoz --> 2 piruvat + 2 ATP + 2 NADH) Glc-6-P = Glucoz-6-fosfat Frc-6-P = Fructoz-6-fospfat Frc-1,6-bP = Fructoz-1,6disfosfat DHAP = Dihidroxiacetonfosfat GAP = Gliceraldehid-3-fosfat 1,3-bPG = 1,3-Difosfoglicerat 3-PG = 3-Fosfoglicerat 2-PG = 2-Fosfoglicerat PEP = Fosfoenolpiruvat Pyr = Piruvat

Calea Entner Doudoroff

Calea Entner-Doudoroff descrie o serie de de reacii de catabolizare a glucozei utilizand un set de enzime diferite de cele utilizate n glicoliza sau calea pentozo fosfat. Cele mai multe bacterii utilizeaza pt glicoliza i calea pentoso fosfat. Aceast modalitate a fost descoperita in 1952 de Michael Doudoroff (19111975) i Entner Nathan. Caracteristicile distincte ale calea EntnerDoudoroff sunt c: -Apare numai la procariote. -Folosete enzimele dehidraza 6fosfogluconat i aldolaza 2-ceto-3dezoxiglucozfosfatat pentru degradarea Dglucozei la piruvat. -Are un randament net de 1 ATP pentru fiecare molecula de glucoza prelucrate, precum i o NADH i 1 NADPH. Prin comparaie, glicoliza are un randament net de 2 ATP si NADH 2 pentru fiecare molecula de glucoza un prelucrate deci numai jumatate din eficienta celei dintai.

Calea pentozo fosfat

este un proces care genereaz NADPH i pentoze (5-carbon zaharuri). Exist dou etape distincte n aceasta cale. a.Prima este faza oxidativa, n care este generat NADPH b.iar a doua este sinteza non-oxidativa a unui glucid cu 5-atomi de carbon. Aceasta cale este o alternativ la glicoliza. -Dei nu implic oxidarea glucozei, rolul su principal este anabolic, mai degrab dect catabolic. -Producia de riboz-5-fosfat (R5P), utilizat n sinteza de nucleotide i acizi nucleici. -Producia de eritroza-4-fosfat (E4P), utilizat n sinteza de amino-acizi aromatici.

Cai metabolice principale la procariote

Ciclul Krebs
Ciclul acidului citric - de asemenea, cunoscut sub numele de ciclul acidului tricarboxilic (ciclul TCA), ciclul Krebs, - este o serie de reacii chimice enzimei-catalizat, care este de o importan central n toate celulele vii, n special cele care folosesc oxigen, ca parte a celulare respiraiei. in procariote are loc in citoplasma. Reacia general pentru ciclul acidului citric este: Acetil-CoA + 3 NAD + + Q + PIB + Pi + 2 H2O -> CoA-SH + 3 NADH + 3 H + + + QH2 GTP + 2 de CO2 n cazul n care Q este ubiquinone i Pi este fosfat anorganic n organisme aerobe, ciclul acidului citric este parte a unei cai metabolice implicata n conversie chimic de carbohidrati, grasimi si proteine n dioxid de carbon i ap pentru a genera o forma de energie utilizabil. De aici sunt generati precursori pentru muli compui, inclusiv unii aminoacizi i este, prin urmare, funcionala chiar i n celulele efectuaeaza fermentaie. Are un rol central in mai multe ci de biosintez

Ciclul Krebs

Sinteza aminacizilor
Aminoacizii sunt sintetizati de la -ketoacizi, i mai trziu prin transaminare dintr-un alt aminoacid, de obicei glutamatul. Enzima implicat n aceast reacie este o aminotransferaza. -ketoacid + glutamat aminoacizi + -ketoglutarat Glutamat n sine este format din aminarea ketoglutaratului: -ketoglutarat + NH 4 glutamat -Amoniacul este sursa de azot pentru toti aminoacizii.Lantul de carbon provine din calea glicolitica, calea pentozo fosfat, sau ciclul acidului citric.

Sinteza acizilor grasi si lipidelor

Calea reacie biosintetice este de la simplu la compus

n sintezei acizilor grai, acetil-CoA are un rol esential in formarea acizilor grasi dar numai dup ce acesta este modificata pentru a oferi suport real pentru sinteza de acizi grasi, malonyl-CoA. Malonyl-CoA conine un dicarboxilic acid cu 3 atomi de carbon, malonatul. Formarea de malonyl-CoA este pasul dederminant pentru sinteza de acizi grasi, deoarece malonyl-CoA nu are un rol metabolic, dect servind ca un precursor al acizilor grai. Enzima ce ajuta la sintetizarea acizilor grasi (FAS) efectueaz paii de alungire a lanului acizilor grai. De fapt FAS este un complex multienzimatic. n bacterii i plante, proteine individuale, care se asociaz ntr-un complex , catalizeaza etapele sistemului de sintez. Sistemul conine trei pai iniierea, alungirea i eliberarea acizilor grai.

Biosinteza acizilor grasi

Respiratia si metabolismul

Respiratia celular Este procesul cel mai eficient de utilizare al carbohidratilor n care o serie de molecule sunt oxidate, acceptorul final de electroni fiind o molecul anorganic O2 n respiratia aerob;ionul nitrat, ionul sulfat respiratie anaerob sau substante organice n procesul de respiratie celular este generat ATP, etapele catabolismului glucozei fiind:

glicoliza (calea Embden-Meyerhof-Parnas sau ci alternative: calea pentoz-fosfat, calea EntnerDoudoroff), ciclul Krebs si lantul transportului de electroni.

Respiratia si metabolismul
Lantul de transport de electroni 1) O serie de reactii cuplate de oxidare / reducere cazul n care electronii sunt transmisi de proteine legate de membrana/ enzim l de la unul l altul n cele din urm se ataeaz la un acceptor terminal de electroni (de obicei, oxigen sau NADPH). ATP-ul este format de acest proces. 2) 2)reactii cuplate in serie de oxidare / reducere n care ATP-ul este generat de transferul de energie, electronii trec de la starea de reducere superioara la o stare de reducere inferioara

Anaerobi si aerobi
Sistemul de transport de protoni in bacterii genereaza de a lungul membranei plasmatice o forta motrice contstituind forta de trasnfer de n celul i ioni. (A) ntr-o bacterie aerob, un gradient electrochimic de protoni a lungul membranei plasmatice este produs de un lan respirator i este utilizat apoi att pentru transportul unor substante nutritive n celul i de geenrarea de ATP. (B) aceeasi bacterie n condiii anaerobe poate obine ATP prin glicoliza. O parte din acest ATP este hidrolizat de ATP sintetaza pentru a stabili un gradient electrochimic de protoni care acioneaz in aceleai procese de transport care depind de lanul respirator n (A). La sfritul lanului de transport de electroni implicati in respiratie aeroba, operatorul de transport de electroni pe ultimul loc n membrana transfera 2 electroni la o jumatate de molecula de oxigen (un atom de oxigen), care combinat simultan cu 2 protoni din mediul inconjurator produce ap, ca produs final .

Respiratia aeroba
Nutrieni utilizati n mod obinuit de ctre celule animale i de plante n respiraie - includ glucide, aminoacizi i acizi grai, i un agent de oxidare comun -acceptor de electroni este oxigenul molecular O2). Organismele care folosesc oxigenul ca acceptor de electroni final n respiraie sunt descrise ca aerobe, n timp ce cele care utilizeaza alte tipuri de atomi si substante sunt menionate ca anaerobe. Energia eliberat n respiratie este folosita pentru a sintetiza ATP pentru a stoca aceast energie.Energie stocat n ATP poate fi apoi folosita pentru procesele celulare care necesit energie, inclusiv biosinteza, locomoie sau transportul de molecule in membranele celulare.

Respiratia anaeroba
Respiraia anaerob este o form de respiraie folosind acceptoare de electroni, altele dect oxigen. . Pentru lanul de transport de electroni pentru a funciona, un acceptor de electroni exogen final trebuie s fie prezente pentru a permite electronilor s treac prin sistemul n anaerobe, acceptorul final pot fi sulfat (SO42-), nitrat (NO3-), sau sulf (S) care au potenialul de reducere mai mici dect O2, ceea ce nseamn c este eliberat mai puin energie. Respiraia anaerob este, prin urmare, n mai puin eficienta energetic dect respiraia aerob . Respiraia anaeroba este folosit n principal, de procariote care triesc n medii lipsite de oxigen. Multe organisme anaerobe sunt anaerobe obligate, n sensul c acestea pot respira folosind doar compui anaerob i va muri n prezena oxigenului. Ecuaia general pentru respiraia aerob: C6H12O6 + 6O2 -------------------> 6CO2 + 6H2O + 36 ATP Ecuaia general pentru respiraie anaerob: C6H12O6 + ADP + fosfai -------------------> acid lactic sau etanol + 2 ATP

Fermentatia

Fr oxigen, piruvatul (acid piruvic) nu este metabolizat de respiratia celulara, dar trece printr-un proces de fermentaie. Fermentarea oxideaza NADH la NAD + astfel nct s poat fi reutilizate n glicoliza. n absena oxigenului, fermentarea previne acumularea de NADH n citoplasma i utilizeaza NAD + pentru glicoliza. Se formeaza produsi secundari din fermentatie ce variaz n funcie de organism. La drojdie, produsele secundare reiesite sunt etanol si dioxid de carbon. Acest tip de fermentare este cunoscut sub numele de fermentaie alcoolic sau etanolica. Generarea de ATP n acest proces se face prin la nivel substratului prin fosforilare, care nu are nevoie de oxigen.

Example de fermentatii si produsi secundari rezultati

Respiratia anaeroba si fermentatia diferente

Respiraie anaerob i fermentare sunt dou forme distincte de oxigen metabolismului energetic-independent. In cazul respiraiei anaerobe (i, de asemenea, aerobea) organismele au transport de electroni de la un donator la un acceptor de electroni final prin intermediul unui lan de transport de electroni, care transform energia chimic ntr-un gradient electrochimic.Energia stocat n acest gradient este apoi utilizata intr-o reactie cu ajutorul ATP sintetazei pentru a genera ATP. n fermentaie, ATP este direct sintetizat din compui intermediari fosforilati metabolizati fr implicarea unui lan de transport de electroni. Deoarece nu exist nici un acceptor de electroni extern n fermentaie, celulele au acceptori de electroni proprii pentru a menine echilibrul lor redox.

Transportul compusilor in /din celule

1. difuzie pasiva
Difuziune pasiv este micarea gazelor sau de molecule mici, neschimbate prntr-o membran fosfolipidica bistratificata dintr-o zon de concentraie mai mare ntr-o zon de concentraie mai mic. exemple N2, O2, i de CO2; etanol, H2O, i uree. Toate molecule i atomii poseda energie cinetic Micarea net a acestor particule va fi, prin urmare, in functie de concentratia lor - din zona de concentraie mai mare n zona de concentraie mai mic. Difuzia este alimentata de energia potenial a unui gradient de concentraie i nu necesit cheltuieli de energie metabolice

a. Osmoza
a.

b.

c.

Osmoza este difuzarea de ap ntr-o membran dintr-o zon de concentraie mare de ap (concentraie mai mic solutului) pentru a reduce concentraia de ap (concentraie mai mare solutului). Osmoza este alimentata de energia potenial a unui gradient de concentraie i nu necesit cheltuieli de energie metabolice. ,

Transportul prin membrane

b. Difuzie facilitata Difuzia facilitata este transportul de substane ntr-o membran de proteinele de transport, cum ar fi uniporters i proteine de canal, de-a lungul un gradient de concentraie dintr-o zon de concentrare mai mare la o concentraie mai mic. Difuzia facilitat este alimentata de energia potenial a unui gradient de concentraie i nu necesit cheltuieli de energie metabolice. 1.Uniporter: Uniporterii sunt proteine de transport, care transporta o substan dintr-o parte la alta a membranei ioni F. potasiu (K +) pot intra in bacterii prin uniporteri.

2. Canale de transport
Apa sau anumiti ioni, ce sunt transportati fie in gradient de concentratie sau cu ajutorul unui gradient de potenial electric, dintr-o zon de concentrare mai mare la o concentraie mai mic n timp ce moleculele de apa pot trece direct de membrana prin difuzie pasiv, dup cum sa menionat mai sus, proteinele ce formeaza canale, denumite aquaporine, pot mbunti acest transport

Transport activ
2. Transport activ

transportul activ este un proces prin care celula folosete proteine de transport i de energie metabolic pentru a transporta substante prin membrana mpotriva gradientul de concentraie. transportul activ permite bacteriilor de a concura cu succes cu alte organisme de in conditii de nutrienti limitati, permite agenilor patogeni de a concura cu celulele organismului si bacteriile florei normale pentru aceleai substane nutritive.
Energia este furnizat de fora motrice de protoni, hidroliza ATP, sau compusi energetici, cum ar fi phosphoenolpiruvatul (PEP). Forta motrice de protoni este un gradient de energie care rezult din ioni de hidrogen (protoni) care se deplaseaz prin membrana de la concentraie mai mare la una mai mica ioni de hidrogen. ATP-ul este forma de energie cel mai frecvent se utilizeaz pentru activitatile celulare.

a. Antiporter:
Antiporteri sunt proteine de transport care pot sa transporte o substan prin membranei ntr-o singur direcie n timp ce transporta simultan, o a doua substan n direcia opus. Antiporterii n bacterii utilizeaz, n general, energia potenial a gradienilor electrochimici de protoni (H +), care este, for motrice de protoni pentru a tansporta ioni, glucoz, aminoacizi mpotriva gradientului lor de concentraie. Ionii de sodiu (Na +) i protoni (H +), de exemplu, sunt co-transportate prin membranele bacteriene prin antiporteri.

b. Simporter
Simporterii sunt proteine de transport care transporta simultan dou substane lungul membranei n Simporterii au aceeai direcie si utilizeaz energia potenial a gradienilor electrochimice de protoni (H +), care este, fora motrice de protoni pentru a co-transporta ioni, glucide, i aminoacizi mpotriva gradientui lor de concentraie. Sulfatul (HSO4-) i protoni (H +), precum i fosfatul (HPO4-) i protoni (H +) sunt cotransportate prin membranele bacteriene prin acest sistem.

c. ATP-binding cassette (ABC) system Acest lucru implic n substrat

specific proteinele de legare situate n periplasmul bacterian aflat intre peretele celular bacterian si membrana citoplasmatica. Proteinele periplasmice formeaza punti cu o substan care urmeaz s fie transportata si il transporta la o proteina de transport membranar cu cheltuiala de energie Exemple de transport activ includ transportul anumitor glucide si aminoacizi. Peste 200 de diferite sisteme ABC de transport au fost gasite in bacterii.

d. Translocarea de grup
Aceasta se produce cand o substan este modificata chimic n timpul transportului acesteia prin membrana, astfel c, odat intrat, membrana citoplasmatica devine impermeabila la aceast substan Un exemplu de translocaie de grup la bacterii este sistemul fosfotransferaz. Un grup de energie fosfat de la phosphoenolpiruvate (PEP) este transferat printr-o serie de enzime la glucoz. Enzima final fosforileaza glucoz i o transport a lungul membranei sub form de glucoz 6-fosfat. Alte zaharuri, care sunt transportate de ctre grupul de translocatie sunt manoza i fructoza.

Miscarile bacteriilor
Flagelii si motorul lor molecular este aprovizionat cu energie de catre o cascada de fosforilari responsibila de generara energiei in celule. In actiune, filamentul se poate roti cu circa 200 pana la mai mult de 1,000 rotatii/

Chemotaxia

Chemotaxia este fenomenul n care celulele somatice, bacterii, si alte orgaisme monocelulare sau multicellulare isi directioneaza micrile lor n conformitate cu anumite substane chimice din mediul lor. Acest lucru este important pentru bacterii pentru a gsi nutrienti (de exemplu, glucoz) depalsandu-se spre cea mai mare concentraie de molecule de produse alimentare, sau sa evite toxinele (de exemplu, fenol). Chemotaxia este pozitiva- apare n cazul n care micarea este spre o concentrare mai mare a produsului chimic n cauz. n schimb, chemotaxia negativa apare n cazul n care micarea este n direcia opus.

Traducerea de semnale (sensibilitatea)

Diferente de concentratie (gradiente de concentratie a diferitelor substante) sunt sezizate prin intermediul receptorilor multiplii transmembranari, numiti proteine metil-acceptori chemotactici (MCP-uri), care variaz dupa moleculele pe care le detecteaz. Acesti receptori pot lega atractanti sau repelenti direct sau indirect, printro interaciune cu proteinele din spaiu periplasmatic. Semnalele de la aceti receptori sunt transmise prin grosimea membranei plasmatice n citoplasma, unde proteinele Che sunt activate. Proteinele Che modifica frecvena de rotire a flagelilor, i modifica receptorii.

Semnalizarea si chemotactismul

Cresterea bacteriilor si inmultirea

Binary fission of bacteria, electron microscope x 31.000 magnification by Madigan Martinko et Parker, 1997

Fisiune binara - procesul de reproducere asexuat Replicarea ADN-ului alungire si ceulele formarea un sept Finalizarea septului se face prin formarea de perei distincte separarea celulelor si formarea de celule fiica Toate tipurile de molecule se dubleaza: proteine, ADN, ARN, lipide pentru membrane, materiale peretelui celular, molecule mici. Totul este distribuit uniform.

Faze de crestere
Lag diviziunea celulara nu se produce n faza de laten Bacteriile se pregatesc de a se diviza depinde mult de mediu si de starea inoculului Exponeniala foarte rapida, celulele se divid cu mare repeziciune Faza staionara celulele nu se mai divid, dar ele sunt nc active metabolic nutrientii esentiali din mediu sunt aproape epuizati si se acumuleaza produse toxice metabolice se acumuleaza materiale de rezerva Faza de declin nu mai cresc celulele Moartea asociata cu liza celulara Rata de deces mai mare de reproducere Scderea numrului de celule viabile

Cresterea populatiilor de bacterii Creterea exponenial:

dubleaza numrului de celule ntr-un interval de timp regulat
Cresterea exponentiala growth N = N0 x 2n N = nr de bacterii la sfarsitul interval N0 = nr celule initial n = nr de generatii

Cresterea populatiei de bacterii (inmultirea)

N = N 0 x 2n logN = logN0 + n log2 n = (logN - logN0)/log2 = (logN - logN0)/0.301 = 3.3(logN - logN0) Timpul mediu a unei generati (g) = timpul total de crestere (t)/ n g (timpul unei generatii = t / n = t/3.3(logN/N0) t: timpul cresterii exponentiale

= nr de generatii/ unitatea de timp in cresterea exponentiala (unitate: time-1; ex. ora-1) = n/t cand Nt=2N0 , i.e., t=g n = (logN - logN0)/log2 = (logN - logN0)/0.301 = n/t =log2N0-logN0/(0.301*g) = 1/g (reciproca timpului de generatie g)

Metoda de estimare a unei generaii (g) a populaiilor de cretere exponenial cu generare de ori (a) 6 ore i 2 (b) h din datele reprezentate pe graficele semilogaritmice

Factori de mediu ce afecteaza cresterea populatiilor

Principalii factori de mediu, n controlul creterii microbiene -temperatura, -pH-ul -ap de activitate / ap disponibilitate (presiune osmotic), -concentraia de oxigen, -presiune

Efectul temperaturii
bazat pe temperatura optim de cretere Psychrophiles: sub 20 C Mesophiles: 20 - 45oC Thermophiles: peste 45oC Termofile: 45 - 60oC Extrem termophilie: 60 80oC Hipertermophile: 80 i mai sus

Psichrofile maxim:> 20 C Mezofile Optimum: 20-40 C Minimum: <04 ! Termofile: optim> 45 C. Hyperthermofile: optim> 80C numai n cteva locuri: izvoare fierbinti: 100 C cu abur orificiile de 150-500 C izvoarele hidrotermale adncime mare

pH si activitatea apei
pH-ul optim de cretere, Acidofile: pH 1.0 - 5.5 neutrofilelor: pH 5.5 - 8.0, Alcalofiles: pH 8.5 - 11.5 Activitatea apei (presiunii osmotice) Halofile necesita NaCl (minimum 0,2 m, ~ 1,2%) pentru cretere, bazat pe concentraia NaCl optim ([NaCl] din apa de mare: 3%) uor halofile: 1 6%, halofile moderate: 6 - 15%, halofile extreme: 15 - 30%, Osmofile: triesc n concentratie mare de zahr de pilda Xerofile: triesc n mediu foarte uscat

Necesar de oxigen
O2 este epuizat rapid, n anumite habitate datorit prezenei de abundenta de materiale organice pot sa devina medii anoxice (fa de mediu oxic) Cele mai multe animale necesit concentraii de O2 de cel puin 5 pri per milion (mg / L). Tip de microbi asupra respiraiei a. Obligatorii (strict) aerobi: atmosferic concentraie O2 (21%); respire O2 in timpul metabolismului b. Obligatorii (strict) anaerobe: nu la toate O2, cretere inhibat sau ucise n cazul n care prezint (procariote numai, un ciuperci puine i protozoare) c. Aerobi facultative: aerobi nu necesit O2 pentru cretere economic, dar nu mai bine n prezena sa d. Microaerophiles: aerobi nevoie de numai 2 -10% O2; deteriorate prin concentraia atmosferic O2 e. Anaerobe aerotolerante: nu necesit O2 pentru cretere i, n lipsa acestuia, O2 nu este utilizat.

Degradarea substratului

Substrat + Microorgnism + O2 biomasa + CO2 +

energie + alte produse concentratia biomasei, X (mg/L), cresterea ca functie dependenta de timp datorata conversiei nutrientilor in

maxS Ks + S

biomasa : constanta rata specifica de crestere (time-1). Aceasta reprezinta masa de celule produse/masa de celule per unitatea de timp

: rata specifica de crestere (1/time) max: rata maxima specifica de crestere constant S: concentratia substratului (masa/vol.) Ks: constanta de saturare pe jumatate (mass/vol.) constant @ conc scazuta [substrat], [S]

Relatia bacteriilor cu mediul inconjurator si traducereade semnale

Quorum sensing

Quorum sensing este un sistem de stimul si raspuns corelat cu densitatea populatiei. Multe specii de bacterii utilizeaza QS pentru a coordona expresia genetica conform densitatii populatiilor de bacterii. Bacteria ce utiliyeaza QS produc constant anumite moleucle de semnalizare (denumite autoinducers). Aceste bacterii au receptori pentru detectarea moleculelor autoinducer. Cand inducerul se leaga de receptor, activeaza regiunea de transcriptie a anumitor gene inclusiv pentru sinteza inducerului. E ca si cum bacteria detecteaza prorpiul inducer secretat. Astfel, daca bacterii de acelasi tip exista in vecinatate, difuzia reduce concentratia de incuces din mediu inconjurator astfel ca bacterile produc mai putin inducer.

Quorum sensing

Diagrama fenomenului quorum sensing. (stanga) la numar scazut , concentratia substantei autoinducer (albastru) este scazuta si productia substantei este restransa. (dreapta) la numar mai mare concentratia autoinducer-ului e mare si substantele respective sunt produse de catre bacterii (rosu).

Curs I.5.Genetica bacteriilor

Universitatea de Vest Vasile Goldi Arad Facultatea de Medicina, Farmacie si Stomatologie Dr.biol. Sergiu Fendrihan

Genetica bacteriilor

Organizarea cromozomului si a materialului genetic bacterian Replicarea cromozomului si plasmidelor si diviziunea celulara Adaptarea la conditiile de mediu

Structura materialului genetic

Structura ADN Asa cum se stie molecula de ADN consista in 2 catene complementare de polaritate inversa modelul Watson si Crick, ordinea nucleotidelor acestora determinand secventa genetica a acestei molecule. Nucleotidele sunt formate dintr-o baza purinica (Adenina si Guanina) sau pimimidinica (Timina si Citozina) la care se adauga acidul ortofosforic si deoxiriboza ce formeaza scheletul spiral al moleculei intre cele doua catene fiind asigurate legaturi de hidrogen, doua intre A si T, trei intre C si G.

Compozitia
Base Nucleosides Nucleotides DNA Adenine (A) Guanine (G) Cytosine (C) Thymine (T) RNA Adenine (A) Guanine (G) Cytosine (C) Uracil (U) Deoxyadenosine Deoxyguanosine Deoxycytidine Deoxythymidin Adenosine Guanosine Cytidine Uridine dAMP dGMP dCMP dTMP AMP GMP CMP UMP dAMP dGMP dCDP dTDP ADP GDP CDP UDP dATP dGTP dCTP dTTP ATP GTP CTP UTP

Bazele azotate
pirimidines

purines

Structura moleculara
structura moleculara a dublei catene a and cu legaturile de hidrogen intre cele doua catene A=T CG

I. Organizarea materialului genetic bacterian

Replicon = material genetic care se reproduce independent Cromozomul bacterian Plasmidele elemente genetice extracromosomiale Genomul bacteriofagilor Transpozoni elemente genetice si fragmente de insertie

Materialul genetic bacterian (harta genetica si fizica)

Marimea genomului

Cromozomul bacterian

Cromozomul bacterian este o molecula dublu circulara de ADN cu o lungime de circa 1000 de microni si o greutate moleculara de 1,5-2,0x 109 daltoni continand circa 3000-5000 de gene. Este superinfasurat pentru a intra in celula si avand domenii de superinfssurare specifice ceea ce asigura o economie de spatiu si are efect asupra replicatiei, trsanscriptiei si recombinarii genetice. La cromozom sunt asociate proteine asemanatoare histonelor si un echipament enzimatic specific care asigura infasurarea si desfasurarea cromosomului bacterian si enzime specifice care participa la replicarea si transcriptie. Codifica informatiile absolut necesare pentru supravietuirea in conditii normaleAThe

entire molecule is a linear sequence of bases. Celula de E. coli are circa 4.6 x 106 perechi de baze, iar ADNul este lung de circa 1400 m long, iar celula de E. coli de numai 2-3 m lungime. Cromozomul deafasurat este cu un diametru de circa 430 m, este impartit in circa 50 de domenii cromozomale de catre interatiunea dintre AND proteine, dintre nucleotide si proteine de legare similare histonelor ca HU, IHF si H-NS. O colectie de enzime (ca de pilda DNA giraza) este responsabila de infasurarea DNAiar prin procese repetate, DNA este organizat in mai multe tegiuni de superinfasurare astfel ca un asmenea cromozom are in jur de 1 um intrand inttr-o bacterie.

Organizarea materialului genetic bacterian

Plasmidele sunt molecule circulare de DNA autonome care se replica independent ce sunt asezate in citoplasma conjugative pot fi transfetrate la alte bacterii singular (plasmide R) non-conjugatives le nu pot sa paraseasca bacteria decat numai prin alt plasmid sau bacteriofag conjugat (eg plasmidul ce codifica secretia beta-lactamazei la S. aureus) episomi, care pot fi integrate prin recombinare in cromozomul bacterian pierzand autoreplicarea (plasmid F sau factor de fertilitate).

Plasmidele

Determinantii genetici de pe plasmide codifica informatii despre replicarea lor autonoma -caracterelor fenotipice ce ajuta celula bacteriana sa supravietuieasca in conditii naturale diferite -transferul de gene (ART) -genele de resistenta la antibiotice (factor R), -secretia de toxine, etc. -determinantii genetici ai virulentei Plasmidele ce poarta genele factorilor de virulenta -secretia enterotoxinelor -factorul de colonizare de la Escherichia coli -hemolizina de la Staphylococcus aureus Streptococcus faecalis si E. coli -exfoliantina de la S. aureus -genele de invazivitate de la Shigella

Plasmids
R-plasmidele de rezistenta (R factor) sunt formate din DNA circular avand doua regiuni genetice si anume gene ce codifica pentru rezistenta la antibiotice "R", una sau mai multe transpozitie repetata a materilaleor genetice Genele "FTR" ce determina capqcitatea plasmidelor de a transfera material genetic

RTF

R determinant

Plasmidele

Peste 90% a tulpinilor din spitale au resistenta la antibiotice este de tip plasmidic: -familia Enterobacteriaceae, genurile: Escherichia, Salmonella, Shigella, Proteus, Providencia, Klebsiella, Serratia -genurile Pseudomonas, Acinetobacter, Vibrio, Yersinia, Pasteurella, Campylobacter, Haemophilus, Neisseria, Bacteroides, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Clostridium, and Corynebacterium. Plasmidele prezente in bacterii Gram-negativi sunt mai mari decat cele din bacteriile Gram-pozitive.

Plasmidele

Plasmidele F-sunt plasmide asa zise de sex si contin genele de transfer al factorilor de fertilitate "tra" -pot fi transmite prin conjugare un transfer mediat de gene de al celula donor la cea receptor -depinde de prezenta sau absenta factorului F care este absent la Bacteriile de tip femela F-, iar celulele tip mascul sunt bacterii F + , Bacteriile tip HFR au acest factor integrat in cromozom bacteriiile F 'with F + to plasmid autonomous factor, after it was integrated into chromosome and left breaking a fragment of chromosome DNA

Elementele genetice transpozabile

Barbara Mc Clintock, 1931, 1952, 1983 a aratat ca exista asa numitele jumping genes care pot sa ocupe diferite locuri in structura cromozomului bacterian si Fragmente de insertie (IS) sunt fragmente de ADN mici (din plasmide/cromozom)cu limite structurale clare si care pot sa fie incluse repetat in mai multe siteuri ale genomului Transposonii (Tn) a doua elemente de insertie contin si alte gene nu numai factorii de transpozitie.

ABCDEFG

Transpozaz Gene de rezisten Gene de rezisten

GFEDCBA

IS IS

IS IS

Organizarea genetica la bacterii Un numar de gene ORF pot fi organizate ca operon. Toate secventele genetice dintr-un operon sunt trancrise o data intr-un singur ARN mesager pronind de la acelasi promoter Un exemplu este aratat mai sus operonul tuf-s10, de la Borrelia burgdorferi,care determina boala Lyme si care codifica proteinele ribozomale (rsp1 si un factor de elongare (tuf) Mai jos spre comparatie este prezentat sistemul de organizare al materialului genetic la eucariote.

Operonul

Structura operonului
Genele ce determina aceiasi cale biochimica in bacterii ca de exemplu genele ce codifica proteinele necesare pentru metabolizarea lactozei care vor fi exprimate in acelelasi conditii cand lactoza este prezenta. Pentru economie, genele sunt grupate impreuna sub controlul aceluiasi sistem de reglare formand un operon.

Exemple
Un tip de operon inducbil este operonul lactoz (lac operon), ce contin genele ce codifica enzimele responsabile de metabolismul lactozei. -lac Z, ce codifica enzima beta-galactozidaza (care scindeaza molecula de lactoza in glucoza si galactoza -lac Y=ce codifica o permeaza care ajuta la transportul lactozei in celula -lac A, ce codifica o transacetilaza. -promoterul este locul unde se leaga RNA polimeraza la DNA si pregateste initierea transcriptiei. -operatorul (O). -gena regulatoare este gena lac I ce codifica o proteina denumita represorul lac, cu doua domenii functionale una ce se leaga de ADNul regiunii operatorului si alta care leaga lactoza. Cand represorul se leaga de operator, previne ca RNA polymerase sa actioneze la acet nivel si astfel transcriptia este inhibata.

Reglarea expresiei genetice

1.Atunci cand lactoza este absenta gena lac I este transcrisa, si mRNA este translat producand represorul care se leaga de operator si blocheaza ARN polimeraza 2.Cand lactoza este prezenta represorul se leaga cu lactoza si sufera o schimbare conformationala care impiedica legarea de operator iar ARN polimeraza intra in actiune.

Reglarea genetica
"Wild type"
LacZ+ Makes B-gal enzyme

Mutant
LacZMake NO enzyme Makes NO repressor; Transcription can be constitutive IF PROMOTER IS FUNCTIONAL RNA Pol does NOT bind promoter; No Transcription Operator does NOT bind repressor; Transcription can be constitutive IF PROMOTER IS FUNCTIONAL

LacI+

Makes Repressor

LacI-

p+

RNA Pol binds promoter

p-

o+

Operator binds repressor

o-c

Diviziunea celulara si replicarea ADN

Replicarea
Replicarea are loc pe principiul semiconservatv o catena serveste pentru replicarea celelilate astfel rezulta doua molecula de and cu o catena veche si una nou sinetizata sub actiunea ADN polimerazei iar helicaza ajuta la replicarea catenei antisens

Expresia genetica

Microarrays DNA. Genele ce codifica proteinele se pot distribui pe un chip utilizand pentru moleculele de ADN tehnologia industriei de cipuri de silicon iar apoi o proba de ARN este utilizata pentru hibridizare cu ADN de pe chip si masura expresia genetica a unui mare numar de gene.
Axon Industries. From "Everything's Great When It Sits on a Chip," The Scientist, Volume 13, #11, May 24, 1999

Variabilitatea bacteriilor
Este un domeniu interesant pentru medicina practica si se realizeaza prin -Mutatii -Transfer de material genetic -Transformarea bacteriilor Transductie Conjugare Transpozitie

Mutatia
Sunt schimbari spontane ale genomului sau induse (schimbari ale secventei de nucleotide) cauzate de: X-ray, UV, agenti alchilanti, etc. Ele sunt -Punctiforme afectand numai o nucleotida -Insertie (adaugarea mai multor sute de nucleotide) -Deletia (pierderi de nucleotide) Mutatiile produc resistenta la chemoterapie, modifica profilul antigenic, pierderea unor receptori specifici pentur bacteriofagi, pierderea posibilitatii de producere a unor metaboliti, etc.

Structura si reglarea expresiei genetice

Genomul este totalitatea genelor unei specii continand genele exprimate si neexprimate iar bacteria sunt vitual haploide cu toate acestea au unsistem ce permit expresia genetica diferentiata dar prin alte mecanisme decat cele de la eucariote.

Transferul de material genetic

Transformarea
Reprezinta transferul de de material genetic de la o celula donatoare la o celula receptoare of genetic material from a form de DNA, eliberat prin liza celulei sau prin extractie chimica. Exemple Streptococcus, Haemophilus, Bacillus, Neisseria, Salmonella Are loc si in cadrul acelelasi specii si intre specii diferite. Starea de competenta prin structura peretelui celular ce devine poros si favorizeaza penetrarea si legarea acizilor nucleici straini Are loc in zone care au mai multe specii bacteriene (colon)cu mult material genetic eliberat din celule

Transductia
Transductia este un transfer de gene cromozomale de la o celula la alta mediat de bacteriofagi fagii ce determina liza celulelor preiau una sau mai multe gene dintr-un fragment comozomal si o dara intrati in alta celule pot sa se insereze cu fragment cu tot in materialul genetic cromozomal al gazdei . these phages can enter other cells to inject bacterial al gazdei producand schimbari ale caraceristicilor acestora ca resistenta la antibiotice si modificarea patogenitatii

Transductia

Conjugarea

Este transferul de material genetic de la un donor la un receptor printr-un proces asemanator unui schimb sexual de material genetic Transmis prin plasmidele de conjugare si gene comozomale factor F + La Gram negative, factorul F + poate fi prezent pe : -plasmide transferul este conditionat de existenta genelor tra genes responsabile pentru sinteza pililior de sex si a transferului plasmdelor -pe cromozom-transferul genelor cromozomale. .Aceste celule care sint integrate in cromozom factor F sunt demunie HFR adica gene de recombinare de mare frecventa.

Conjugarea

F+

F+

Hfr

Conjugarea

Transferul prin conjugare

Transferul prin conjugare asl plasmidelor in bacteriile G negative este conditinata de prezenta genelor tra sii de transferul acestora. -sinteza incepe cu pilii de sex care adera la receptorii specifici prezenti pe peretele celular al gazdei -apoi are loc transferul plsmidelor replicate numai un lant de DNA parental va ramane in celula donoare si cel de al doilea in celula receptoare fiin un model pentru catena complementara.

Plasmide conjugative

Dpdv medical importante sunt plasmidele conjugative de rezisten R. Proprieti: -se misca si spre alte specii. Transferul poate avea loc in laborator de pilda sau in macroorganisme. (plasmide de transfer de la nepatogene ca E.coli sau patogen ca Salmonella sau Shigella. -determinantii de rezistenta plasmideleR. Asemenea factori sunt frecventi in spitale si care induc rezistenta la chimioterapie cu antibiotice (ampiciline, cefalosporine, streptomicina, tetraciclina, cloramfenicolul, kanamicina, gentamicina, sulfonamide).

Conjugarea
Conjugarea la Gram pozitive este un proces asemanator procesului sexual la Gram-positive ca Streptococcus, Streptomyces, Clostridium Celulele receptoare produc o peptida cu greutate moleculara scazuta (GM = 1000 daltons) ce determina sinteza substantelor proteice in celule si incepe cu o legatura intre receptor si donor ce permite transferul de material genetic

Transpozitia
Este integrarea a elementelor genetice transpozabile in materialul genetic din aceeasi celula si esrtre de mai multe tipuri. -Transpozitia de clasa I-secvente se misca de la donor la recipienti fara reduplicare -IS elemente de insertie au circa 1000 perechi de baze sunt prezente pe plasmide sau cromozom in copii multiple si sunt flancarte sde secvente palindrom -transpozitia poate fi cauza la deletii prin mutarea determinantilor genetici pe alte plasmide. - evolutia rezistentei la antibiotice sunt un fenomen legat de transpozitie -

Antibioticele

Tipuri de antibiotice (selectie)

Chemical class Beta-lactams (penicillins and cephalosporins Examples Penicillin G, Cephalothin Biological source Penicillium notatum and Cephalosporium species Spectrum (effective against Gram-positive bacteria Mode of action Inhibits steps in cell wall (peptidoglycan) synthesis and murein assembly Inhibits steps in cell wall (peptidoglycan) synthesis and murein assembly Inhibits translation (protein synthesis) Inhibits steps in murein (peptidoglycan) biosynthesis and assembly Inhibits translation (protein synthesis)

Carboxypenems

imipenem

Streptomyces cattleya

Gram-positive and Gram-negative bacteria

Aminoglycosides

Streptomycin

Streptomyces griseus

Gram-positive and Gram-negative bacteria Gram-positive bacteria, esp. Staphylococcus aureus Gram-positive and Gram-negative bacteria

Glycopeptides

Vancomycin

Amycolatopsis orientalisNocardi a orientalis (formerly designated) Streptomyces venezuelae

Chloramphenicol

Chloramphenicol

Growth factor analogs

Sulfanilamide, Gantrisin, Trimethoprim

synthetic

Gram-positive and Gram-negative bacteria

Inhibits folic acid metabolism (anti-folate

Antibiotice

Activitatea antibioticelor poate bactericida (in cazul penicilinei) bacteriostatica intirziind diviziunea si inmultirea bacteriilor (tetracyclines and lvomycthine. antibiotice antimicotics (antifungal) se numeste fungicida sau fungistatic. depinzand de mecanismul de actiune sunt cinci grupuri prinipale: 1) Antibiotice ce blocheaza sinteza peretelui celular antiobiotice lactams (peniciline) activiitartea supra sintezei peptidoglicanului si mai precis asupra transpeptidazei 2) antibiotice ce distrug structura moleculara a membranei celulare polymixine si polienes.

Antibioticele

3) antibiotice ce suprima sineza proteinelor deci translatia la nivel ribozomal tetracicline, cloramfenicol, eritromicina).
4) antibiotice-inhibitori a sinezei acizilor nucleici ca rimfapicina care leaga RNA polimeraza si inhiba sinteza RNA DNA-dependenta, iar chinolonele blocheaza sinteza DNA. 5) sulfanilamidele sintetice suprima sinteza nucleotidelor si disturba metabolismul acizilor aminati ca cisteina si metionina.

Inhibitori ai sintezei peretelui celular

Antibiotice Beta lactamice Contin un inel betalactamic si sunt produse de doua genuri de ciuperci filamentoase, Penicillium si Cephalosporium, asi sunt reprezentate aici de peniciline si cefalosporine

Inhibitori ai membranei celulare

Ele au capacitatea de a dezorganiza striuctura sau a inhiba functiile membranei ca exemplu este polimixina, produ s de Bacillus polymyxa.

Inhibitori ai sintezei proteice

Numeroase antibiotice pot inteveni intr-o etapa de sinteza a proteinelor legate de ribozomi avand afinitate pentru subunitatea de 70S a acestora Cele mai importante sunt tetraciclinele, cloramfenicol, macrolide (ca eritromicina) si aminoglicozide (streptomicina)

Streptomicina

Afectarea acizilor nucleici

Unele antibiotice si chemoterapeutice afecteaza sinteza DNA sau RNA, sau se leaga la acestea astfel ca mesajul lor nu poate fi citit si deci blocheaza desvoltarea celulelor. Majoritatea medicamentelor de acesti tip afecteaza si unele celule. Totusi exista si medicamente selective si are utilitatea medicala si acestea sunt chinolonele si rimfapicinele.
ciprofloxacin

Inhibitori competitivi

Multe antibiotice de sinteza sunt inhibitori competiitivi ai metabolitilor esentiali sau a factorilor de crestere necesari pentru metabolismul bacterian Acestea inhiba cai esentiale metabolice in patogeni.

chemical structures of sulfanilamide and paraaminobenzoic acid (PABA).

Antibioticele , efecte adverse

In practica medicala exista numai 150-200 Efecte adverse 1) reactii toxice mai ales la nivel de ficat (tetraciclins),la nivelul rnichilor si auzului(aminoglicozide) si la nivelul elementelor figurate din sange (levomicetina). 2) disbioza- producerea de schimbari in calitatea si cantitatea microflorei normale Administrare de tetracicline cresterea incidentei unor ciuperci cum este Candida, se de aceea se mai adauga un tratament cu nistatina.

Antibioticele efecte adverse

3) efecte secundare asupra imunitatii

Levomicetina inhiba formarea anticorpilor in limfocitele B, iar tetraciclinele inhiba fagocitoza. Ciclosporina blocheaza imunitatea legata de celulele T Penicillina si cefalosporina induce reactii alergice si uneori socuri anafilactice.

Rezistenta la antibiotice
Este un mecanism prin care bacteriile devin rezitente la unul sau mai multe antibiotice 1) Antibioticul nu penetreaza in bacterie; 2) antibioticul nu suprima tinta din celula (sau o enzima sau structura celulara); 3) antibiotic este degradat sau inactivat chimic de bacterie; La nivel genetic rezistenta bacteriilor este legata de un mecanism de raspandire a acestei rezistente in intreaga populatie de bacterii prin selectie.

Rezistenta la antibiotice

2) in cromozomul bacterian se produc mutatii a unei gene ce este legata reactia la aparitia antibioticelor. Din ingeriorul corpului uman, ele pt sa treaca in mediuj si sa raspandeasca tulpina resistenta. 3) prezenta plasmidelor R conditioneaza acesta transformare din sensibile la rezistente la antibiotice , o bacterie putand avea una sau mai multe asemenea plasmide care se transmit usor de la o celula la alta.

Curs 6. Virusologie generala si Universitatea de Vest Vasile Goldi Arad moleculara.si Facultatea de Medicina, Farmacie
Medicina dentara Dr.biol. Sergiu Fendrihan

Virusologie (inframicrobiologia) tiina care Definiie: Virusologia

studiaz virusurile (inframicrobii) i afeciunile provocate de acetia. Virionul = virus = corpuscul elementar = corpuscul viral, este unitatea viral, morfofuncional, complet, intact, infecioas, cu diametrul cuprins ntre 18-400 nm, capabil s infecteze bacterii, plante, animale, omul Se gsesc extracelular: nainte de a infecta celula gazd dup ce s-au asamblat i au fost eliberai din celula n care sau multiplicat Virusul vegetativ particula viral aflat n celul, deficitar n unele aspecte ale replicrii,lipsit de capsid. Provirusul genom viral integrat n cromozomul celulei gazd, multiplicndu-se sincron cu acesta

Caracteristici generale ale virusurilor pe scurt

Marimea 25 nm (picornavirus) pana la 250-350 nm (smallpox virus). Comparativ, puterea de rezolutie a microrcopului fotonic este de: 300 nm, iar bacteriile au dimensiuni de ordinul a 5005000 nm. Genomul este format din ADN sau ARN putind sa fie dublucatenar sau monocatenar. Structura Virusurile sunt complexe de proteine codificarte dee genele virale si acizi nucleici cateva au si elemente codificate de celulel gazda ca membrane si tARN Reproducerea are loc numai in celule vii. Virusurile pastreaza informatia necesara in acizii nucleici informatiile privind acizii nucleici si a sintezei proteice inclusiv aunor enzime Antibioticele. Virusurile nu sunt afectate de antibiotice dar pot sa fie inhibate de interferon si de diferiti agenti chemoterapeutici (Kayser&Thieme Medical microbiological atlas,2005)

Dimensiunea
-18 30 nm (Parvoviridae, Picornaviridae) -18 30 nm (Parvoviridae, Picornaviridae) -40 80 nm rotavirus, virusul rubeolos, virusul hepatitei B, virusul hepatitei C -90 200 nm virusul herpetic, virusul rujeolos, virusul respirator sinciial, virusul rabic -300 - 450 nm (Poxviridae) virusul Variolic -peste 900 nm lungime, diametru 80 nm (Filoviridae) Metodele de msurare a dimensiunii virionilor sunt: ultrafiltrarea care este o filtrare prin membrane de colodiu cu pori de mrime cunoscut, observarea la ME n comparaie cu particule de referin, de dimensiuni standard (particule de latex), ultracentrifugarea datorit corelaiei ntre rata de sedimentare i dimensiunea virionilor.

Structura generala a virusului

Structura generala
Modele structurale -Virusuri cu simetrie rotationala (cubica sunt icosaedre adica poliedre cu 20 de fete in forma de triunghiuri echilaterale). Numarul de capsomere pe viron variaza de la 32 la 252 si depinde de numarul de capsomere (doua sau sase) ce formeaza o margine a triunghiului echilateral. Capsomerele dintrun virion pot sa difere ca morfologie proprietsti antigenice si biologice. Aceste virusuri pot sa cristalizeze. Simetrie-elicoidala. Simetria elicoidala este prezenta atunci cnd o ax a capsidei este mai lunga dect celelalte.Acidul nucleic si proteinele capsidei sunt strns legate, n care proteina este strns infasurata n jurul genomului. Acest complex ARN-proteine este cunoscut sub numele de nucleocapsida, .

Simetrie complexa. Modele structurale complexe se gsesc la bacteriofagi i virusul variolei.

Bacteriofagi T, de exemplu, au un cap icosahedric care conine ADN-ul i o coad tubulara prin care ADN-ul este injectat n celula gazd.

Materialul genetic viral

Acidul nucleic -virusuri ADN, -dublucatenar liniar circular -monocatenar exceptie Virusuri ARN, - -monocatenar. - -excepia reovirusurilor ARN, genomul poate fi -polaritate pozitiva (+), caz n care poate aciona direct ca ARNm (mesager) -poate fi cu polaritate (-), caz n care trebuie transcris de o enzima asociat virusului, ARN-transcriptaza, ntr-un ARN cu polaritate (+) = imaginea in oglinda. Conine ntreaga informaie genetic necesar replicrii Asigur infectivitatea viral Este capabil de autoreplicare n absena celorlali constitueni virali Mrimea genomului viral se coreleaz cu mrimea capsidei sau anvelopei. Astfelvirusurile mari au un genom de dimensiuni mari care conine cteva sute de gene i codific un numr relativ mare de proteine (poxvirusurile, herpesvirusurile, etc) virusurile mici au un genom de dimensiuni reduse care conine doar 3 sau 4 gene i codific un numr mic de proteine

Capsida

Capsida este un invelis al virusului format din proteine structurale codificate de acesta care acoper acidul nucleic i este mai mult sau mai puin strns asociat cu aceasta. Combinaia a acestor dou componente este numita de cele mai multe ori nucleocapsida, mai ales dac acestea sunt strns asociate ca la myxovirusuri. Capsida este alctuit din subuniti, capsomere, al cror numr variaz, dar este specific i constant pentru fiecare dintre speciile virale. Acestea sunt structuri sferice sau cilindrice compuse din mai multe polipeptide. Capsida protejeaz acidul nucleic de degradare fixarea virusilor de celula gazda, i determin antigenitatea specifica virala.

Aspect al arhitecturii unui virus cu simetrie helicala

Structura elicoidala rigida a virusului mozaicului tutunului. subuniti distincte de proteine cu greutate moleculara de 17400-Da (protomere), constituie un helix, cu o structura repetata de 6,9 nm (49 subunitati pe trei ture). Fiecare la rndul su, conine o serie de subuniti (161/3), care au o grosime de 2,3 nm. ARN-ul (2x1O6 Da) se transform int-un sandwich intern ntre proteine adiacente ale capsidei, formnd o spirala de ARN cu aceasi pasi, 8 nm n diametru, 2130 protomere acopera si protejeaza ARNului virionului. Virusul complet este de 300 nm lungime i 18 nm in diametru, cu o cavitate cilindrica cu un diametru de 4 nm. (De la Mattern CFT: Simetria n arhitectura virusului n Nayak DP (ed): Molecular Biology of Animal Viruses. Marcel Dekker, New York,

1. Capsidele cu simetrie icosaedric au 20 de fee triunghiulare, 30 de muchii si 12 vrfuri, de unde aspectul aparent de sfer. Fiecare din capsomerele situate n cele 12 vrfuri se nvecineaz cu cte 5 capsomere i se numesc pentone. Celelalte capsomere situate pe cele 20 de fee sau pe cele 30 de muchii se nvecineaza cu cte 6 capsomere i se numesc hexone. Mrimea capsidei icosaedrice este dat de numarul hexonelor inserate de-a lungul muchiilor si feelor dintre pentone. Exemplu: virusuri ARN -capsida parvovirusurilor cuprinde 32 capsomere -capsida herpesvirusurilor cuprinde 162 capsomere -capsida adenovirusurilor cuprinde 252 capsomere virusuri ADN -capsida calicivirusurilor cuprinde 32 capsomere caz particular: reovirusurile care prezinta o capsida dubl, formata din 2 structuri icosaedrice.

2. Capsidele cu simetrie helicoidal - capsomerele se aranjeaz n jurul spiralei de acid nucleic, formnd o suprafa cilindric flexibil sau rigid. Majoritatea virusurilor cu simetrie helicoidal poseda o anvelop extern, aspectul extern al virionului fiind de:*sfer (v. gripale,v. paragripale) *cartu sau glon (v. rabic) *filamentoas (v. Marburg). 3. Capsidele cu simetrie binar (icosaedric-helicoidal) sunt prezente la bacteriofagii cu coad contractil (virusurile bacteriilor) la care capul cuprinde nucleocapsida cu simetrie icosaedric iar coada are simetrie helical. 4. Virusuri cu organizare complex. Arhitectura complex este specific virusurilor cu genom mare (poxvirusuri). Virionul conine nucleoidul format din ADN nconjurat de o membran intern omogen i flancat de dou mase ovoide numite corpi laterali. Nucleoidul mpreun cu corpii laterali sunt nconjurai de o membran extern format din tubuli dispui aleator.

Anvelopa (peplos)

Peplosul , ce inconjoara capsida este prezent la cateva familli de virusuri, este totdeauna dependenta de membranele celulare ale gazdei (nucleara,plasmatica, si uneori a reticuluilui endoplasmatic). Virusurile cu anvelopa nu se adsorb la celula cu capsida ci cu anvelopa. Indepartarea acesteia cu solventi organici si detergenti (sensibilitate la eter) duce la afectarea acesteia si imposibilitatea de a se lega. Pe suprafaa acestei membrane se gsesc formaiuni specifice virale, codificate de virus: 1. spiculi (peplomere) de natur glicoproteic. Au funcia de adsorbie i penetrare n celula gazd. Exemple: hemaglutinina (HA) = rol n ataarea virusurilor la celula gazd ; confer virusurilor proprietatea de a liza hematiile diverselor specii animale neuraminidaza (N) = faciliteaz parunderea virusurilor n celul 2. factori de fuziune. Se gasesc sub forma inactiv (FO) iar sub aciunea proteazelor celulei gazd se scindeaz genernd forme active (F1,F2). Au funcia de iniiere a infeciei. 3. proteina M (matrix) cptuete faa intern a anvelopei (frecvent la virusurile ARN cu polaritate negativ).

Alte componente

Enzime diferite. Viruii necesit o serie de enzime diferite pentru funcionarea genomului i realizarea infeciei. n mai multe specii de virus enzimele sunt o component a particulei virale, de exemplu neuraminidaza necesara pentru invazie si eliberarea de myxovirusuri. Alte exemple includ polimerazele acizilor nucleici cum ar fi polimerazele ARN-dependente de ARN antisens n virusi, ADNpolimeraze n virusul variolei si ARN-polimerazei dependente de ADN ("revers transcriptaza"), in hepatita B, virusuri i retrovirusurilor Hemaglutinin. Unii virui (mai presus de toate myxovirusii i izolat paramixovirusuri) sunt capabile de aglutinare a eritrocitelor umane si a diferitelor animale. Acesti virui poart o proteina de suprafata numita hemaglutinina, in envelopa lor care le permite s fac acest lucru. Fenomenul de hemaglutinare poate fi utilizat la studiile cantitative pentru testarea prezentei virusurilor sau prin testul de inhibare a hemglutininei pentru identificarea virusului si a anticorpilor. n termeni biologici, hemaglutinina joac un rol decisiv n adsorbie i in penetrarea virusului n celula gazd.

Taxonomia virusurilor

Comitetul Internaional pentru Taxonomie de virusi (ICTV) recunoatecirca 1.550 specii de virus (20), dar aproximativ 30.000 de tulpini de virus sunt urmrite de virusologi n diferite care au dezvoltat o baz de date de virusi inca din 1991. Unii oameni de stiinta cred ca trebuie infiintat un nou regn nou, denumit Vira, asta nseamn c lumea vie va avea 7 reguri (Archaea, Eubacteria, Protista, Animalia, Mycota, Plantae i Vira). Aceasta este o idee bun, s se gseasc o poziie taxonomic clara pentru virusuri, care sunt att de diferite de toate celelalte organisme vii din lume.

Criteria of viral taxonomy

Van Regenmortel enumer urmtoarele caractere pentru discriminri ntre specii de virus: Corelarea cu secventa genomului spectrul de gazde naturale tropismul pentru celule i esuturi patogenitate i citopatologie modul de transmitere proprietile fizico-chimice ale virionilor proprieti antigenice ale proteinelor virale

Taxonomia virusurilor

Viruii sunt clasificati deci si in functie de natura genomului lor virusuri cu ARN monocatenar de polaritate pozitiva si negativa virusuri ARN dublu-catenar virusuri ADN monocatenar i dublu-catenar; virui ce utilizeaza revers transcriptaza pentru replicare (ARN: ADNul i Retroviridae: Hepadnaviridae).

Denumirea cuprinde deci dup cum urmeaz: (---- viridae familie virus), subfamilia virinae (----) (---- de tip virus).
Denumirea virala respecta normele internationale (n limba englez i n caractere cursive, de exemplu: Un enterovirus uman sau virusul polio, iar in paranteze drepte abrevierea oficiala de exemplu, [HEVA] sau [PV].

Virus forms and taxonomy

Forme i dimensiuni ale virusurilor din familii care includ virusuri ale diferitelor animale, zoonotici, precum i ageni patogeni umani. Dimensiunea virionilor este respectata la scara dar structura lor este reprezentata schematic unele, fiind prezentate in sectiune. Aici nu sunt figurati bacteriofagii

Taxonomia virusurilor
Iata o clasificare a virursurilor conform cu continutul lor in ADN, ARN forma si alte caracteristici ce sunt prezentate sintetic in schema

Caracteristici virusuri (Virusuri ADN)

exist 20 de familii de virusuri care infecteaz oamenii. Exist dou virusuri suplimentare (Hepatita D i hepatita de tip E), care nu au fost nc atribuite unei familii, dar sunt n mod clar distincte de alte familii care infecteaza oamenii. virusuri ADN: ase familii -trei non anvelopate (adenoviruses, parvovirusul i poliomavirus) -trei sunt anvelopate (Hepadnavirus, Herpesvirus i Poxvirus). Toate familiile care nu au invelis au nucleocapsida icosahedrica

Taxonomia virusurilor (Virusuri ARN)

virusuri ARN cu polaritate pozitiva 7 familii: -trei non anvelopate (Astrovirus, calicivirusul i Picornavirus) i -patru anvelopate (Coronovirus, Flavivirus, Retrovirus i Togavirus). Toate familiile care nu au invelis au nucleocapsida icosahedrica. virusuri ARN cu polaritate negativa: sase familii Arenavidae, Bunyaviridae, Filoviridae, Orthomyxoviridae, Paramixoviridae i Rhabdoviridae. Toate cele anvelopate au cu nucleocapsida elicoidala. Virusuri cu ARN dublu catenar o familie-Reoviridae. Virusuri cu genomul segmentat patru familii : Bunyaviridae, Orthomyxoviridae, Arenaviridae i Reoviridae . Ca o regul virusurile cu ADN, n cadrul replicarii are loc in nucleul celular in timp ce virusurile cu ARN se replica n citoplasma. Excepiile sunt cunoscute de la aceast regul: poxvirusurile (virusuri ADN) se replica n citoplasma i orthomyxovirule i virusul hepatitei D (virusuri ARN) se replica interiorul nucleului. trei familii sunt transmise prin artropode: Bunyaviridae, Flaviviridae i Togaviridae.

Diferite tipuri de virusuri

I. virusuri helicale neanvelopate : au capsomere asezate helicoidal in jurul acizilor nucleici Exemplu: virusul mozaicului tutunului. III. Virusuri cu simetrie helicoidala cu anvelopa Exemple: Paramyxovirus

Diferite tipuri de virusi

II. Virusi simetrie poliedrica sau icosaedrice neanvelopate capsidele formeaza forme geometrice cu fete si colturi. Exemple: Reovirus, Adenovirus (in image), si Picornavirus IV. Virusi poliedrici anvelopati : se observa anvelopa care inconjura capsida de morfologie poliedrica exemple Herpesvirus (in imagine) si Togavirus

Virusuri cu morfologie binara reprezinta o combinatie de structuri . Exemplu: bacteriofagii.

Ciclul vital al virusurilor

Replicarea virusurilor parcurge urmatoarele secvene: 1. recunoasterea celulei gazd 2. adsorbia (ataarea ) virusului de celula gazd 3. penetrarea (ptrunderea) virusului n celula gazd 4. decapsidarea virusului 5. sinteza macromolecular a) biosinteza ARNm precoce i a proteinelor precoce = proteine-enzime b) replicarea genomului viral c) biosinteza ARNm tardiv i a proteinelor tardive = proteine structurale 6. eliberarea virionilor progeni din celula gazd

Ciclul vital al virusurilor

Influenta factorilor de mediu asupra virusurilor

Factori fizici Temperatura: actiunea acesteia depinde de tipul de virus, prezena substanelor protectoare 18-25C -sensibile: v.rujeolos, v.gripal etc., moderat sensibile: v.Ebola, v.Marburg, v.EpsteinBarr etc.rezistente: v.coxsackie, v.variolic etc -56-100C in 30 minute inactivarea majoritii virusurilor Temperatura si umiditatea: -fierberea (100C) cteva minute VHA, v.rabic 30 minute VHB -autoclavarea:121C, 1 atm, 30 minute toate virusurile Temperatura scazuta conserv virusurile -4C (refrigerare) cteva sptmni enterovirusuri doi ani v.rabic n fragmente de nevrax -20C (congelare) insuficient pt pstrarea v.gripale, v.respirator siciial 70C (congelare) / pstrare n azot lichid la -190C prezervarea infectivitii pt ani de zile Radiatii ionizante -aciune direct: pe acizi nucleici i proteine virale si indirect: ionizarea mediului nconjurtor producere de compui toxici -radiaii electromagnetice (X, gamma),radiaii corpusculare ( i ),inactiveaz virusurile Ultrasunete vibraii peste 20 kHz/sec folosite pt:eliberarea virusurilor din celule obinerea unor substructuri virale omogenizarea suspensiilor virale etc.

Influenta factorilor de mediu si a metodelor de desinfectie asupra virusurilor

Factori chimici pH sub 5 and peste 9 deterioreaz infectivitatea, stabile la pH extrem acid 3 enterovirusuri, alcalin 9 v.gripal B ageni chimici -oxidani 1%, oxidri n proteinele virale peroxid de hidrogen (H2O2) 3-6%, inactivare virus, agent antiseptizant Ozon dezinfecia apei, f.scump, puin utilizat, permanganat de potasiu 1% -halogeni/compui halogenai -Clorul tratarea apei potabile hipoclorit de calciu / hipoclorit de sodiu 10%, deterioreaz acizii nucleici virali, dezinfectani antivirali universali Cloramina 2-5%, 20%detergeni -detergenti Sintetici afecteaz virusuri cu peplos (dezoxicolat de Na, dodecilsulfat de Na, Tween 80 Cationici aciune virulicid + aciune spumant (sruri de amoniu cuaternar 20%, clorura de benzolcarmin pt. tegumente mucturi de animale 1% inactivare v.rabic) Factori biologici

Lizozim efect virulicid v.gripal n secreiile nazale, lacrimale, salivare suc gastric aciune virulicid prin pH-ul acid enzime proteolitice: tripsin, pepsin Bil inactiveaz virusurile cu pelos

Metode de diagnostic in laborator

Tipuri de diagnostic

1. Diagnosticul indirect: serologie virala Pentru diagnosticul unei infectii curente este important s se analizeze dou prelevate consecutive cel putin la un inteval de 10-15 zile pentru a observa o schimbare semnificativ a concentratiei anticorpilor. - Prezenta IgM cel mai adesea este un semn de infecie recenta; IgG -persist pe termen lung. Atunci cnd o persoan este gasita serologic pozitiva pentru prima dat pentru HIV i VHC, este obligatorie a face verificari printr-o a doua serie de analize (serologie i Western Blot). prelevatele: in principal se preleveaza ser care este apoi trimis la laborator. Alte fluide biologice: lichid cefalorahidian (LCR), lichid amniotic, lichidul pleural, lavaj bronhoalveolar, lichid alveolar (LBA). Probele de snge se preleveaza in n tub uscat i tub cu geloza pentru serologie: sngele este centrifugat i alicote din acest centrifugat este utilizat pentru realizarea testelor serologice prescrise.

1.2. Tehnici utilizate :

Metoda ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) cel mai des folosita Alte reactii serologice mai traditionale , ca reactia de fixare a complementului Teste rapide (dar cu sensibilitate variabila) Teste de confirmare HIV (western blot) si HVC (immunoblot) : diferite proteine ale virusului sunt prezente separat pe membrana ce servesc ca suport de reactie. Aceste teste permit precizarea contra caror proteine virale sunt produsi anticorpii

Metode de detectie

1.3. Principiul Reactiei ELISA

Se formeaza o reactie antigen anticorp serul se presupune a contine anticorpii cautati ce reactioneaza la reactivii antigeni comerciali adsorbiti pe un suport de plastic (placi cu 96 de godeuri)
Detectarea complexului anticorp antigen prin fixarea unui anticorp anti imunoglobulina umana marcata obtinuta comercial - de ctre o enzim (Immunoassay enzime) sau molecula marcata fluorescent imunofluorescenta)

Metode de laborator
Sistem ELISA cu distributie automata si citirea placilor si o placa Elisa 96 de godeuri

Teste serologice rapide

Test serologic HIV-1 si 2 rapid : acest tip de test este util in cazul unui accident de expunere la sangele contaminat daca serul pacientului este pozitiv tratamentul anti retro viral se incepe imediat

Western blot

Benzile de western blot la sfarsitul reactiei : o banda colorata apare daca serul testat contine anticorpii ce recunosc antigenul adsorbit in locul respectiv.

Indicatie: punerea in evidenta a unui contact mai recent la o persoana infectata cu virus mai recent sau chiar mai putin recent . Avantaje: posibilitatea automatizarii Obtinerea de rezultate in maxim 4 ore sau in ziua urmatoare sensibilitate ridicat, specificitate excelenta (ELISA) cel mai sensibil la unii pacieni: copii i immunodeprimati . Interpretarea delicata uneori. Exemplu: pentru toate Herpesviridae (HHV, CMV, EBV S), IgM pot fi prezente sau nu nu la reactivare.

2. Diagnostic direct

2.1. Probe din prelevate Calitatea eantionului determin rezultatul. Exist trei situaii Probele nu au nevoie de mediul de transport pentru a aduce proba la laborator n-un tub steril uscat fecale, urin, LCR lichide de eantionare diferite n-un tub care conine EDTA probe de sange pentru separarea celulelor mononucleare din sngele respectiv (pentru determinarea CMV, EBV, HIV). Probele prelevate cu un tampon steril scufundate n mediul de transport de pilda exudat din gat, vezicule, conjunctive iar livrarea trebuie facuta in decurs de 4 ore la laborator (pentru a pstra antigenitatea, infeciozitatea si calitatea de acizi nucleici) pn la 4C prin incadrarea eprubetei in punga de gheata (pentru a preveni dezvoltarea bacteriilor) Probe de snge total la temperatura camerei - pentru examene de Biologie molecular: se adauga EDTA la tub + + + (fr heparin, care este un inhibitor al PCR)

Dispozitiv Smear (tamponul este dispus pe lama de sticl de ctre laborant): si lasat sa se usuce la temperatura camerei Exemple de probe: lichid cefalorahidian, lavaj bronhoalveolar, scaun, un tampon steril de transport i de mediu lichid

2.2. Metode rapide de diagnostic direct

Aceste metode permit obtinerea unui rezultat in numai cateva ore. Tehnici: Imunoaglutinarea specifica a virusurilor pe o lamela de sticla de un (cu un anticorp contra antigen=proteine virale) dintr-o proba de tesut sau de celule sanguine mononucleate isolate in laborator . Alte metode : aglutinare pe particule latex sensibile Metod: ELISA pentru tipul de antigeni cu detectie automatizata utilizand kituri de enzim de detection si imunodozarea antigenica rapida. Indicaii: Permite identificarea rapida specifica si ajuta la inceperea tratametnului cat mai repede : se foloseste in detectia (HHV), a infeciilor respiratorii (gripa, virusul sinciial respirator, parainfluenza virus, adenovirus) a diareei infantile (rotavirus, Adenovirus) si cercetarea cazurilor subclinice in cazul CMV la pacienii immunodeprimati .

Test de aglutinare pentru Rotavirus in proba de scaun

Probele de scaun , suspendate in solutie tampon sunt puse in prezenta unor particule de latex sensibile la antigenul viral . Aici rezultatul este negativ. In caz contrar, masurile de igiena impuse permit limitarea extensiei epidemiei de gastroenterita printre bebelusii din spital

Metode imunologice

Imunofluorescenta specifica a HHV pe un frotiu vaginal : celulele infectate prezinta o fluorescenta galben verzuie.

Metode imunologice

Antigenemia pp65 a CMV pozitiva : leucocitele marcate prin anticorpi fluorescenti (fluorescenta galbenverzui) contin o fosfoproteina de 65kD a CMV. Pacientul cu grefa renala va beneficia de un tratsment contra CMV, chiar fara semne clinice (tratament preventiv).

Avantajele metodelor immunologice: se obtine rapid un rezultat : 20 minute la 4 ore Limite : lipsa de sensibilitate . Un rezultat negativ nu exclude diagnosticul Imunofluorescenta : citirea la microscop depinde de experienta observatorului

3.3. Metode de diagnostic direct pe cultura

Virusurile sunt parazite obligatorii in celule ele sunt cultivate pe celule eucariote intretinute in laborator sub forma de linii celulare continue sau semicontinue Diferitele etape de diagnostic prin cultura virala sunt: 1.nsmnarea unei linii de celule cu proba patologica. 2. Examinarea direct zilnic: detectarea efectului citopatic (CPE), la microscopul optic inversat. 3. Dac exista ECP: se coloreaza celulele se face frotiu pentru detectarea incluziuni virale i alterarile citoplasmatice i nucleare la microscopul optic. 4. marcarea imunologica specifica a virusului si citirea pe lame microscopice a rezultatului cu microscopie optica sau fluorescenta

Culturi de celule
Prin comparatie, efectul citopatic caracteristic al unei culturi celulare infestata cu enterovirus se observa incluziunile citoplasmatice si nucleul dens impins la periferia celulei

indicatii: Izolarea unui virus intr-o proba biologica Pentru a dovedi infeciozitatea virusului. Caracterizarea fenotipul unei tulpini (rezistena la anti-virale, de exemplu). Beneficii: Buna sensibilitate. Cultura rmne de referin n raport cu care toate metodele noi sunt comparate. Este esenial s se asigure susele initiale, folosite de exemplu n dezvoltarea de vaccinuri (de exemplu, vaccinul antigripal se fabrica in fiecare an). Costul acestei metode este rezonabil Limitri: timp de a obine rezultatul obinuit: 48 de ore la 10 zile. Subiectivitatea citirilor : depinde de experiena de observator .e specializate.

Cultivarea pe oua embrionate de gaina

Virusurile se pot izola si pe oua embrionate de gaina desi acum se renunta la aceasta metoda in favoarea cultivarii pe culturi de celule

2.4.Metode de diagnostic molecular

pentru simplitate, trei metode principale domina de analizele de rutin: -hibridizarea molecular i variantele sale (hibridizare cu amplificarea semnalului i bDNA, hibridizare pentru detectia mutaiilor n genomul viral), -amplificarea unei genei, sau PCR, -secvenierea nucleotidelor. Aplicaiile cantitative devin de asemenea curente

Metode de diagnostic molecular

Hibridizare: detectarea direct a ADN sau ARN pe diferite suporturi (tuburi, plci, membrane) Principiul de hibridizare molecular: 1 - Formarea unui hibrid de acid nucleic viral (ADN sau ARN) / cu sonda specifica pentru genomului viral cutat, pe diverse suporturi : membrana, microplaca, tub 2 Detectare immunoenzimatica a moleculelor hibride prin anticorpii de anti-acid nucleic dublu catenar, sau marcajul sondei i apoi detectarea colorimetrica, fluorescenta sau chimioluminiscenta

Hibridizare cu amplificare de semnal

- Principiul ADNului hibridizat: esantioanele de acid nucleic viral sunt adsorbite pe un suport cu sonde ADN ramificat la care hibridizeaza sonde de relevare. Molecule luminescente sunt asociate sondelor moleculare de relevatie semnalul fluorescent fiind proportional cu numarul de molecule de acid nucleic viral adsorbit Utilizarea simultan a mai multe sonde ramificate complementare la diferite regiuni ale genomului viral int, permite detectarea virusurilor foarte variabil dpdv genetic (HIV, HCV). Numrul mare de molecule luminescente implicate permite o scadere a limitei de detecie, fr risc de contaminare (fara amplificare a acizilor nucleici, n contrast cu tehnica PCR).

Hibridizare pe membrana si pe chipuri

Principiul diferitelor metode: 1) sonde de hibridizare moleculara fixate pe un suport specific pentru a detecta un virus mutant 2) dtectia imuno-enzimatica. Sondele sunt prezente pe benzi iar antigenele sunt fizate pe aceste benzi de imunoblot ex : gnotiparea HVC, mutatii ale HVB). Microcipurile permit detectarea nmutatiilor virusurilor. Un mare numar de sonde asezate ordonat in forma de sir pe suporturi de siliciu sticla etc reprezinta o combinare de tehnic informatice si moleculare. O aplicatie este detectia mutaiilor la HIV asociata cu resistenta la medicatia retrovirala.

Genotiparea HVC prin hibridizare pe membran dup PCR, benzile sunt interpretate cu ajutorul unui model furnizat de productor. n acest caz, pacientul are o VHC genotip 1, subtipul B, mult mai uor rezistente la anti-VHC.

3.4.3. Amplificare genica

Acizii nuleici extrasi dintro proba prin absorbie lor pe particule de siliciu incartcate pozitiv si elutie urmata de amplificare genica sau PCR permite recopierea unei portiuni limitate de genom viral pentru amplificarea genica se detecteaza acizii nucleici amplificati pe gel de agaroza sau hibridizare moleculara post PCR

.4.4. Secventiere nucleotidica

Metoda Sanger este folosita pentru secvenierea de rutin. Aceasta este un PCR, n care vom aduga dideoxynucleotides (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), etichetate cu un fluorocrom la amestecul de reacie, ca de obicei. Polimeraza ADN-ul sintetizeaz folosindu-se, n mod aleatoriu, fie deoxynucleotide sau dideoxynucleotide. Fiecare dat cnd un dideoxynucleotid este ncorporat n lanul de ADN, alungirea lanul se oprete, deoarece aceste molecule nu permit legtura fosfodiester urmtoare. Secvena de reacie, astfel, duce la producerea de fragmente de ADN de toate dimensiunile disponibile (de exemplu, un fragment de ADN de 200 de nucleotide copiate 1 la 200). Aparatul permite detectarea automat a fluorocromilor din aceste fragmente de ADN separate prin electroforeza capilara pe gel de acrilamid vertical sau n capilare umplute cu polimer de siliciu

3.4.5. Cuantificare (estimare cantitativa)

Diferite truse de PCR comercializate se bazeaza pe acest principiu . Un etalon este introdus in prelevatele de analizat, inaintea extractiei acizilor nucleici (etalon intern). Acest etalon este un acid nucleic a carui extremitati sunt identice cu secventa virusului salbatic Acest lucru permite s foloseasc aceeai pereche de primeri. Prin contra, ntre capetele la care hibridizeaz grunduri, secvena de nucleotide difer de cea de-slbatic de tip virus, care se pot distinge dou produse PCR sau prin electroforez (diferite dimensiuni) sau prin hibridizare dup PCR (sonde specifice diferite) ,

 PCR in timp real

Curbe de cantificare a EBV in sangele total prin PCR in timp real : curbele de mai sus ilustreaza amplificarea ADN de la martorii pozitivi la diferite concentratii (curba etalon externa).

Metoda PCR in timp real masoara cantitatea de molecule de ADN produse in timpul debutului fazei exponentiale a reactiei In mod schematic ADN ul produs in timpul PCR este cuantificat prin incorporarea unei molecule fluorescente sau a hibridizarii cu doua sonde specifice moleculare ce emit o fliuorescenta speciala Aparatele sunt echipate pentru lectura continua in timp real a fluorescentei emise

Metode de diagnostic molecular

Indicatiii asupra metodelor de diagnostic molecular : Tehnici calitative : pentru demostrarea prezentei unui virus in particular unui virus in special cand nu este cultivabil (HVC), sau care lichidul biologic nu este adecvat pentru cultura (LCR). Tehnici cantitative : pentru pacientii sub tratament antiviral (HIV, HVC, CMV, HVB). Secventiere : detectarea mutatiilor nucleotidice - asociere cu rezistenta la antivirale (HIV, HVB), - caracteristici ale genotipurilor de virus (HVC, HVB). Interesante pentru ca :sunt sensibile si pot sa fie automatizate Limite : exista riscuri de contaminare pentru tehnica PCR. nu se poate stabili caracterul infectios al virusului detectat. Caracterizarea fenoticipa a tulpinii nu este posibila. Costurile sunt inca destul de mari.

Referinte
Allain Philippon, Paris Universite V, site microbes-edu.org http://basic.shsmu.edu.cn/kejian/microbiologie/www.microbeedu.org/etudiant/etudiants.html Kaiser Color Atlas of medical Microbiology Thieme, 2005

Curs 7. Multiplicarea virusurilor

Universitatea de Vest Vasile Goldi Arad Faculty of Medicine, Pharmacy and Stomatology Dr.biol. Sergiu Fendrihan

Fazele multiplicarii virusurilor

1. recunoasterea celulei gazda 2. adsorbtia (atasmentul) virusului la celula gazda 3. penetrarea (ptrunderea) virusului n celula gazd 4. decapsidarea virusului 5. sinteza macromolecular a) biosinteza ARNm precoce i a proteinelor precoce = proteine-enzime b) replicarea genomului viral c) biosinteza ARNm tardiv i a proteinelor tardive = proteine structurale 6. eliberarea virionilor progeni din celula gazd .

1.Recunoaterea celulei gazd

Pentru a infecta o celul, virusul trebuie, n primul rnd, s recunoasc celula care i permite replicarea. situsuri receptor-specifice (de natur proteic) situate pe suprafaa extern a particulei virale. receptori corespunztori (de natur glicoproteic sau glicolipidic) de pe suprafaa celulelor "int". Astfel, prin aceast interaciune precis de tip "cheie-broasc" se explic faptul c anumite virusuri prezint tropism pentru anumite gazde i pentru anumite esuturi ale gazdei respective.

1.Recunoasterea celulei gazda 2.Ataarea virusului de celula gazd

Ataarea virusurilor este specific i implic legarea situsurilor receptor-specifice de receptorii specifici aflai pe membrana citoplasmatic a celulei gazd. a) Structurile de ataare ale virusului pot fi: -capsomerele capsidei, prezente la virusurile neanvelopate -glicoproteinele, ce reprezint proiecii ale nveliului viral, la virusurile anvelopate. b) Receptorii specifici de pe membrana citoplasmatic a celulei gazd sunt constitueni normali ai acesteia. Multiplele interaciuni dintre proteinele virale de ataare i receptorii celulei gazd, ataeaza ferm virusul de celula gazd. Aceste interaciuni pot reprezenta mecanismul declanator n urma cruia este eliberat nucleocapsida n celula gazd.

3. Penetrarea sau ptrunderea virusului n celula gazd (internalizarea)

Penetrarea se poate realiza prin 3 mecanisme, n funcie de structura virusului: Fuziunea nveliului viral la membrana celular extern, cu eliberarea ulterioar a acidului nucleic viral. internalizare folosit de paramyxovirusuri (v. rujeolic). Aceste virusuri posed o "protein de fuziune" ce mediaz fuziunea ntre lipidele virale i ale membranei celulei gazd. Viropexia (pinocitoza) - internalizarea ntregului virion i fuziunea ulterioar cu o membran intern vacuolar, pentru eliberarea acidului nucleic viral. Viropexia se bazeaz pe existena la nivelul membranei celulelor de mamifere a unei proteine (clathrina) care este implicat i n ptrunderea unor molecule eseniale (substane nutritive, hormoni) n celule. Penetrarea direct - virusurile lipsite de membran lipidic par s treac direct prin membrana citoplasmatic extern.

4. Decapsidarea i migrarea acidului nucleic la locul replicrii.

Decapsidarea const n ndeprtarea sau destructurarea capsidei virale astfel nct genomul viral s devin accesibil mecanismelor de transcripie i translaie. n multe cazuri, penetrarea i decapsidarea se produc sub forma unui proces unic. Astfel, n cursul traversrii membranei citoplasmatice, unele virusuri sufer alterri la nivelul structurii capsidei, aceste alterri facilitnd intrarea acidului nucleic n citoplasm. n cazul virusurilor lipsite de anvelop, se poate produce fuziunea cu lizozomi, astfel nct decapsidarea se realizeaz prin enzimele lizozomale.

5. Sinteza macromolecular. Biosinteza componenilor virali

ARNm (specia de ARN care funcional se fixeaz pe ribozomi pentru a i se traduce mesajul genetic) are o polaritate pozitiva "+". Transcripia cu formarea ARNm pentru sinteza proteinelor precoce difera n funcie de acidul nucleic viral. *Acizii nucleici dublu catenari (dc) au doua catene : una pozitiv (+) i una negativ (-), deci polaritatea va fi notata (+ / -). Pentru formarea de ARNm (+), genomul acestor virusuri, ADN sau ARN, este transcris asimetric, adic va fi transcris o singura caten, cea cu polaritate (+). *Acizii nucleici monocatenari (mc) au catena fie cu polaritate (+), identic cu cea a ARNm, fie cu polaritate (-), complementar cu cea a ARNm.

Transcripia genomului viral n ARN mesager (ARNm) i replicarea genomului viral A. Virusuri ARN

Virusurile ARN pot urma 3 tipuri de transcripie 1.In cazul virusurilor ARN cu polaritate pozitiv, ARN-ul viral este ARNm i poate fi translat n proteine virale. ARN-ul viral "parental", cu polaritate pozitiv, este folosit direct ca ARNm viral, din care vor fi translate direct proteinele virale precoce i tardive. Replicarea genomului parental se produce prin sinteza unei forme intermediare dublu catenare din care, sub aciunea ARN-polimerazei (protein viral precoce), sunt sintetizate multe copii ale genomului parental.

Virusuri ARN cu polaritate negativ

2.In cazul acestor virusuri, iniial sunt produse copii cu polaritate pozitiv ale genomului parental (sub aciunea unei ARN-polimerazei virale). Aceste copii constituie ARNm i ele sunt apoi translate n proteine virale. ARN polimerazele virale transcriu ARN-ul parental, cu polaritate negativ, ntr-o copie complet sub forma unui intermediar dublu catenar. Din acest intermediar dublu catenar se vor sintetiza noi molecule de ARN cu polaritate negativ care vor fi ncorporate n noii virioni.

Multiplicarea retrovirusurilor.

3.ARN-ul viral parental este transcris sub aciunea unei reverstranscriptaze virale (ADN polimeraz-ARN dependent) ntr-un ADN monocatenar care formeaz un hibrid ADN-ARN. Lanul ARN al acestui hibrid este distrus i este nlocuit de o copie ADN, rezultnd astfel o molecul de ADN dublu catenar. Acest ADNdc (numit ADN proviral) este integrat n ADN-ul celulei gazd. Din ADN-ul proviral sunt transcrise moleculele de ARNm care sunt apoi translate n proteine virale. Din ADN-ul proviral sunt transcrise i copii complete de ARN viral care vor fi ncorporate n noii virioni

B. Virusuri ADN
Virusurile ADN trebuie, de asemenea, s produc un transcript ARNm. Acest proces este, de obicei, realizat sub aciunea unei enzime a celulei gazd (ARN-polimeraza ADN-dependent). Moleculele de ARNm viral sunt translate n proteine precoce i tardive. ADN-ul parental dublu catenar este de obicei replicat de o ADN-polimeraz ADNdependent codificat de virus.

Ciclul de multiplicare al HIV

Sinteza proteinelor virale.

Biosinteza proteinelor nestructurale precoce precede replicarea acidului nucleic viral ce inhib sinteza proteinelor celulei gazda i sunt implicate n replicarea acidului nucleic viral. Biosinteza proteinelor structurale tardive ncepe imediat dup replicarea genomului viral. Moleculele de ARNm viral sunt translate pe poliribozomii celulei gazd pentru sinteza proteinelor virale structurale i nestructurale. Enzimele celulei gazd sunt responsabile de citirea mesajului genetic al virusului. Proteinele structurale sunt proteine constitutive ale particulei virale, n timp ce proteinele nestructurale sunt componente cu funcii importante (de obicei, enzimatice), dar care nu fac parte din virion. Dup ce au fost sintetizate, proteinele virale structurale migreaz la nivelul membranei citoplasmatice sau se acumuleaz n citoplasma sau n nucleul celulei gazd. n toate cele 3 situaii, ele sufer transformri biochimice sub aciunea enzimelor celulei gazd.

6. Eliberarea virusului din celula gazd.

se poate realiza prin dou mecanisme : eliberarea prin nmugurire i eliberarea prin liz celular. prin nmugurire, o parte din proteinele virale sunt transportate la nivelul membranei celulare externe a celulei gazd, iar alte proteine structurale virale se cantoneaz la nivelul membranei celulare interne. Proteinele i acidul nucleic se asambleaz i proemin prin membrana celular. Aceast proeminen ("mugure") este apoi desprins i un nou virion este eliberat. prin liz celular presupune asamblarea complet a virionului n citoplasma celulei gazd i eliberarea sa prin liz i moartea celulei respective.

Procesul general de multiplicare a virusurilor

Clase de virusuri dupa tipul de acizi nucleici

Clasa I: virusuri cu ADN dublucatenar (Adenoviruses; Herpesviruses; Poxviruses; Papovaviruses): Pot fi sub-mprite n dou grupe: a. cu reproducere este exclusiv nuclear (adenoviruses de exemplu, Papovaviruses, Herpesviruses). Transcrierea a genomului virusului are loc n etape succesive: Imediata-timpurie a) n funcie de codificarea timpurie a factori de transcriptie virala. Tarzie b) Reproducerea are loc in citoplasma (de exemplu, Poxviruses). Aceste virusuri au dezvoltat toi factorii necesari pentru transcriere / replicare i sunt, prin urmare, n mare msur independente de aparatul celular. Clasa II: virusuri cu ADN monocatenar de sens (+) (Parvoviruses): Replicarea are loc n nucleu, care implic formarea unei catene de sens (-) , care servete ca un ablon pentru sinteza cartenei de sens (+) . Clasa III: virusuri ARN dublu catenar (Reoviruses): Aceste virusuri au genomuri segmentate. Fiecare segment genomului se transcrie separat pentru a produce mRNAs monocistronic. Clasa IV: virusuri cu ARN monocatenar de sens (+) (Picornaviruses; Caliciviruses; Togaviruses; Flaviviruses; Coronaviruses): Pot fi sub-mprite n dou grupe: a) Cu mRNA policistronic de exemplu, Picornaviruses; Hepatitis virus Genomul ARN = mRNA. In urma translatiei rezulta un produs poliproteic, care este ulterior clivat pentru a forma proteine mature. b) Transcriere complexa- de exemplu, Togaviruses. In acest caz sunt necesare una sau mai multe cicluri de translatie pentru a produce ARN-ului genomic.

Clasele de virusuri si multiplicarea lor

Clasele de virusuri si multiplicarea lor

Clasa V: virusuri cu ARN monocatenar de sens (-) (Orthomyxoviruses; Paramyxoviruses; Rhabdoviruses; Filoviruses; Bunyaviruses): Pot sa fie: a) virusuri segmentate de ex Orthomyxoviruses. Primul pas in replicare este transcrierea genomului ARN de sens (-) de catre enzima virala ARN-dependenta de ARN-polimeraza pentru a produce mRNAs monocistronic, care servesc, de asemenea, ca model pentru replicare genomului. b) non-segmentate de exemplu, Rhabdoviruses. Replicarea apare ca mai sus i sunt produse mRNAs monocistronice. Clasa VI: virusuri ARN monocatenarde sens (+) cu intermediar ADN (Retroviruses): Genomul este de sens (+), dar unic printre virusuri n faptul c este diploid, i nu servete drept mRNA, ci ca un ablon pentru revers-transcriptie. Clasa VII: virusuri AND doblucatenar cu intermediar ARN (Hepadnaviruses): Acest grup de virusuri, de asemenea, se bazeaz pe revers transcriere, dar spre deosebire de retrovirusuri, acest lucru se intampla in interiorul particulelor virusului la maturare. La infectarea unei celule noi, primul eveniment s apar este repararea a golurilor genomului, urmat de transcriptie. Pentru a reproduce cu succes genomului su, virusul trebuie s prezinte mRNA la celula care poate fi recunoscut i translat n proteinele codificate de virus. Acest lucru poate fi realizat ntr-un numr de moduri, e.g: -Virusii d/s ADN-ului isi introduc genomul lor n nucleu i utilizeaza mecanismele celulare pentru transcriptie. -Virusii cu ARN de sens (+) au genom care serveste direct ca mRNA (cu exceptia retrovirusurilor!) -Virusii cu ARN de sens (-) trebuie sa aiba enzime codificate de prorpriul genom pentru replicarea ARN de pendenta de ARN, deoarece celulele neinfectate nu au aceste enzime.

Clasele de virusuri si multiplicarea lor

Bacteriofagii

Bacteriofagii sunt virusuri care infecteaza bacteriile si joaca un rol important in microbiologia moderna, microbniologia medicala si ingineria genetica, biotechnologii si cercetarea biotechnologica si medicala Contin ca toti virusii acizi nucleiciADN sau ARN si proteine si au o structura complexa

Ciclul litic al bacteriofagilor

- DNA sau RNA este introdus in celula gazda si informatia lui genetica este exprimata prin preluarea controlului asupra celulei si redirectionand intregul sistem pentru replicarea fagilor - dupa complecta replicare a virusurilor celula bacrteriana lizeaza eliberand noii virusi formati Se poate observa prin liza celulelor in coloniile de culturi pe agar unde se vede formarea unor placi zone clare

Ciclul lizogenic al fagilor

- sunt denumiti fagi temperati - sunt capabili de a intra in cilcul litic sau lizogenic Lizogen este integrarea genomului fagului in genimul gazdei ca un profag linistit care nu se exprima iar celul gazda devine resistenta la alte infectii cu fagi, ulterioare - Profagii pot in mod spontan sa se desprinda si sa intre in cilcul litic Un fag temperat a E. coli este prezentat alaturat - dupa intrare in celula se DNA al fagului 8 se circularizeaza. - se poate alinia cu o regfiune specifica a genomului siteul 8 de atasament si se recombina cu genomul gazda - dupa integrare devine un profag tacut silentios sintetizand un inhibitor a propriei replicari - dupa desprindere poate sa ia cu el unele gene ale gazdei care pot sa fie apoi transportate intr-o alta gazda - daca Hfr doneaza profagul 8 la o celula fara factorul 8, profagul incepe ciclul litic

Cursul 8. Genetica virusurilor

Universitatea Vasile Goldi Arad Facultatea de Medicina, Farmacie si Medicina dentara Dr.biol. Sergiu Fendrihan

Generalitati
Acizii nucleici ce reprezinta genomul viral poate fi monocatenar sau dublu catenar, i ntr-o configuraie liniar, circular sau segmentata. Genomul cu acid nucleic monocatenar poate fi: -sens pozitiv (+) adic de aceeai polaritate (secvena de nucleotide), ca mRNA -sens negativ (-) -sau ambisens - un amestec din cele dou.

Genomul virusului variaz ca mrime de la aproximativ 3200 nucleotide (NT) (de exemplu, hepadnavirusurilor) pentru perechi de baze aproximativ 1,2 milioane de perechi de baze (Mbps, Mimivirus) Multe dintre ADN-ul virusurilor seamn ndeaproape celulele lor gazd eucariote, n ceea ce privete structura genomica: Unele gene ADN-ul virusului sunt complexate cu histone celulare pentru a forma o structura asemanatoare cromatinei din interiorul particulei virale. Capacitatea de codificare prezinta asa numitele rame deschise de citire. Semnale de reglementare - promotori de transcriere, promotorii i terminatori de transcriere

Relatii genetice i secvenele nucleotidice ntre virui pot dezvlui originea nu numai a virusurile individuale, ci de familii ntregi i "superfamiliile" virus posibil: Mycrobiologybites.com 2005

Virururi cu genom monocatenare ARN cu sens positiv (+)

de la cele de Coronavirusuri de aproximativ 30kb cele de bacteriofagi, cum ar fi MS2 Q la aproximativ 3.5kb. A monocatenare sens pozitiv (+) vRNA este direct infecioasa atunci cnd este aplicata la celulele gazd sensibile, n absena oricrei proteine virale Exist o regiune netradus (UTR), la 5 'sfritul genomului care nu codifica orice proteine un UTR mai scurt la 3' de terminare. Aceste regiuni sunt importante funcional n replicarea virusului i sunt astfel conservate n ciuda presiunii pentru a reduce dimensiunea genomului. Ambele capete de polaritate (+) din genomul virusului sunt adesea modificate, capatul terminal 5 este legat covalent de o proteina sau are nucleotide metilate si capatul terminal 3 este poliadenilat. Aceste semnale permit vRNA s fie recunoscut de ctre celulele gazd i s funcioneze ca mRNA.

Virusuri cu genom

Virusurile ARN monocatenare cu polaritate cu sens s aib monocatenar ARN negativa tindnegativ genomi mai mari de codificare a mai multe informaii genetice. segmentarea este o trstur comun, . Virusurile de polaritate negativa nu sunt infecioase sub forma de ARN purificat. Acest lucru se datoreaz faptului c astfel de particule virusul conine toate datele polimerazei specifice virusului. Primul eveniment n cazul n care genomul virusului intr n celul este c genomul sens (-) este copiat de polimeraza, formnd fie catene de sens (+) care sunt utilizate direct ca mRNA, sau o molecula dublu catenara cunoscuta fie ca intermediar replicativ (RI) sau form replicativa (RF), care servete ca model pentru noi etape de sintez mRNA

Virusuri cu genom ambisens

unele virusuri cu ARN nu sunt strict de sens negativ dar sunt ambisens, deoarece au parti de sens (-) si parti de sens (+)

Virusuri cu genom ADN

Genomuri ADN de mici dimensiuni :

Bacteriofagii au fost studiati extensiv ca exemple de genomi virus cu ADN. Dei acestea variaz considerabil n mrime, n termeni generali acestea tind sa fie relativ mici.
Structura genomului bacteriofagului M13 a fost studiat n detaliu i modificat pentru a fi utilizat pe scar larg ca un vector pentru secvenierea ADN. Genomul acestui virus este: circular, din ADN-ul monocatenar de aproximativ 7200 nucleotide lung Spre deosebire de alte structuri de virioni, capsida filamentoasa a M13 poate fi prelungit prin adugarea de subuniti de proteine suplimentare. Dimensiunea genomului a acestui virus poate fi, de asemenea, crescuta prin adugarea de secvene suplimentare n regiunea neeseniala intergenica fr riscul de a deveni incapabil de a fi inserat n capsida

Genomul parvovirusurilor sunt: liniar, nesegmentat format din ADN monocatenar de lungime 5kb pot conine numai dou gene, rep, care codifica proteinele implicate in transcriere i cape, care codifica proteinele structurale. Capetele genomului au secvente palindromice din aproximativ 115nt, care formeaz "agrafe de par". Aceste structuri sunt eseniale pentru iniierea de replicare a genomului, nc o dat subliniind importana secventelor de la capetele genomului

Genomul poliomavirusurilor consta in molecule de ADN circular dublu catenar, de aproximativ 5kbp ca mrime:

Genomuri mari cu ADN

Herpesvirusurile au genomuri foarte mari din pana la 230kbp din ADN liniar, dublu catenar. Diferii membri ai familiei sunt separate la mare distan n ceea ce privete secvena genomic i proteinele, dar toate sunt similare n ceea ce privete structura i organizarea genomului. Unele gene ale virusului herpetic constau din dou seciuni legate covalent alturate, avand o unitate lunga (UL) i o unitate scurta (US) fiecare delimitata de regiuni repetate inversate. Repetarea permite rearanjamente structurale a regiunilor i, prin urmare, unice, aceste gene exista ca un amestec de patru izomeri, din care toate sunt funcional echivalente

Genomul virusurilor herpetice conine, de asemenea, mai multe secvene repetate i n funcie de numrul de acestea, dimensiunea genomului de tulpini ale unui anumit virus poate varia cu pn la 10kbp

Genomul adenovirusurilor

Genomul adenovirusurile constau in ADN liniar, dublu catenar de circa 30-38kbp. Aceste virusuri contin gene 3040. Secvenele terminale de fiecare catena de ADN sunt repetitii inversate de 100-140bp i, prin urmare, catenele denaturate poate forma structuri unice deosebite. Aceste structuri sunt importante n replicarea ADNului

Genomuri virale segmentate si multipartite

Genomurile virale segmentate care sunt mprite n dou sau mai multe molecule de acid nucleic separate fizic, toate sunt apoi ambalate ntr-o particul virala unica. Genomurile pluripartite sunt cele care sunt formate din segmente n cazul n care fiecare segment genomic este ambalat ntr-o particul virala, separat. Aceste particule sunt similare structural i ar putea conine proteine de aceleai compozitie, dar de multe ori difer n mrime, n funcie de lungimea segmentului genomului inclus.

Exist multe exemple de genomi virusului segmentate, inclusiv ageni patogeni multe uman, animal i a plantelor, cum ar fi orthomixovirusuri, reovirusuri si bunyavirusuri. Exist exemple destul de puine de virui pluripartiti, toate insa infecteaza plantele. Acestea includ: virui bipartiti (care au genomului dou segmente / particule de virus) virui tripartiti (genomul trei segmente / particule de virus)

Replicarea , transcriptia, translatia si sinteza proteinelor

1.Materialul genetic viral intr ntr-o celul, este replicat, transcris (mRNA este produs) i tradus (proteinele sunt produse din mRNA) de ctre celula gazd. Prin acest proces, celula gazd utilizeaz instruciunile genetice ale virusului pentru a produce virui.

Replicarea , transcriptia, translatia si sinteza proteinelor

Unii virui contin ARN ca material genetic. Atunci cnd materialul genetic viral intr ntr-o celul, este replicat, transcris (mRNA este produs) i tradus (proteinele sunt produse din mRNA) de ctre celula gazd care trebuie sa sintetizeze o copie ADN-ului a ARN-ului genomic nainte de a fi transcris sau translat

Replicarea , transcriptia, translatia si sinteza proteinelor

La retrovirusuri, materialul genetic, ARN-ul este copiat pentru a produce ADN ul de ctre o enzim numit revers transcriptaza. ADNul nou produs din ablonul ARN-ul este numit cADN. cADN devine ncorporat n ADN-ul gazd. Acesta conine instruciunile pentru a produce proteinele necesare pentru sinteza particulelor virale.

Integrarea genomului viral in genomul celulei

ADN-ul proviral este transportat la nucleu i integrat n ADN-ul celular. HIV nu arata preferine evidente n site-urile de integrare. Enzima virala ce catalizeaza acest proces se numete integraz

HIV are aprox. 9.5 k perechi de baze lungime cu 3 cadre mari de citire deschis (ORF), gag, pol si env, comune tuturor retrovirusurilor. exist, de asemenea, mai multe cadre mai mici de citire.

Variabilitatea genetic

Variabilitatea genetic a virusurilor este un fenomen ce poate surveni n cursul replicrii virale i este mult mai des ntlnit la virusurile ARN dect la cele ADN. De fapt, toate virusurile ARN se pare c ar exista sub form de amestecuri de multiple variante genetice. Aceste amestecuri au un caracter dinamic la nivelul organismului gazd, astfel nct la un moment dat una dintre variantele virale poate fi dominant fa de celelalte, urmnd ca sub aciunea unor factori endogeni (de ex. presiunea exercitat de sistemul imun al gazdei) sau exogeni (de ex. tratamente antivirale, imunomodulatoare, etc.) s se selecteze alte variante genomice virale care s devin dominante numeric n populaia viral infectnd respectiva gazd. Principalele procese ce reflect variabilitatea genetic sunt : mutaia, complementarea i recombinarea.

A. Mutatia

Mutaia const n modificarea stabil a uneia sau mai multor gene avnd drept rezultat absena sintezei unor proteine virale sau sinteza unor proteine virale modificate. Caracterul de stabilitate al acestor modificri presupune transmiterea acestora la descendeni (mutani). Varianta genomic viral iniial, neafectat de mutaie, este desemnat ca variant "slbatic" (virus slbatic). n funcie de mecanismul de producere, deosebim mutaii prin : - substituie - nlocuirea unei baze azotate cu o alta - inserie - intercalarea unei secvene nucleotidice suplimentare - deleie - pierderea uneia sau mai multor secvene nucleotidice - inversie - schimbarea sensului unei secvene nucleotidice n funcie de modul n care survin : - Mutaii spontane - determinate de erori neremediate survenite n replicarea viral. - Mutaii induse - cauzate de ageni mutageni fizici (temperatur, radiaii), chimici (analogi ai bazelor azotate, etc) n funcie de dimensiuni : - Mutaii punctiforme - intereseaz o singur pereche de baze - Mutaii multisitus - intereseaz mai multe secvene

B. Complementarea

Complementarea este procesul prin care dou virusuri cu genom incomplet au capacitatea de a-i completa reciproc produsele genice defective. -Complementarea alelica (intragenica) : cand diferiti mutanti au defecte la aceeasi proteina (gena ce o codifica) si se pot completa -Complementare nealelica (intergenica) complementation: resulta mutanti cu defecte in diferite gene

Complementaritatea de grup la virusul gripei

C. Recombinarea

Recombinarea este procesul prin care dou virusuri au capacitatea de a face schimb de segmente genomice.

Virusuri defective
Virusuri defective sunt virusuri care nu se pot replica autonom, necesitnd prezena unui aa numit virus helper pentru a putea infecta i a se putea replica n organismul infectat. Viroizii care afecteaz celulele vegetale i ei sunt compui dintr-o molecul nenvelit de ARN circular, monocatenar, covalent nchis cu lungimi reduse/ Prionii difer att de virusuri, ct i de viroizi prin faptul c nu conin acizi nucleici

Curs 9. Virusuri oncogene si oncolitice. Chemoterapie antivirala

Western University Vasile Goldi Arad Faculty of Medicine, Pharmacy and Stomatology Dr.biol. Sergiu Fendrihan

Oncovirusuri

O legatura intre cancer si virusuri a fost de mult determinata teoretic si in acelasi timp, au fost raportate si cazuri de regresie a cancerului (cancer cervical, Burkitt lymphoma, Hodgkin lymphoma) dupa imunizarea sau infectia cu un virus neinrudit a fot descris la inceputul secolului al XX lea.

Oncoviruses

Un oncovirus este un virus ce produce cancer.Acest terment provine din perioada de cercetari privind transformarea acuta a retrovirusurilor 195060s, deseori denumite oncornavirusuri ca s arate originea lor RNA . Acum se refera la toate virusurile cu ADN sau cu ARN ce produc cancerul si este sinomim cu virus tumoral " or " virus cancerului ". Majoritatea virusurilor umane si animale, nu produc cancere probabil din cauza coevolutiei lungi intre virus si gazda.

Oncoviruses

La nivel mondial, Agenia Internaional OMS pentru Cercetare n Domeniul Cancerului estimeaza ca n anul 2002 17,8% din cazurile de cancer uman au fost cauzate de infecie, cu 11,9% fiind cauzate de una dintre cele apte virusuri diferite.Importana acestui fapt este c aceste tipuri de cancer ar putea fi cu uurin prevenite prin vaccinare (de exemplu, vaccinuri papilomavirus), diagnosticat cu teste de sange simplu, i tratai cu mai puin toxice compui antiviral)

Oncovirusi
Virusurile tumorale sunt foarte variate e: -virusuri cu un genom ADN-ul, cum ar fi adenovirus, i virui cu un genom ARN, cum ar fi virusul hepatitei C (VHC), poate provoca cancer, -retrovirusuri au ambele ADN i ARN genomi (Human T-limfotropic virus i virusul hepatitei B, care n mod normal reproduce ca un virus ADN-ului dublu mixt i single-irecuperabile, dar are i o component de replicare retrovirale). n multe cazuri, virusuri tumorale nu cauzeaza cancer la gazdele lor matern, dar numai n alte specii. De exemplu, adenoviruses nu cauzeaza cancer la om, dar n schimb sunt responsabili pentru rceli, conjunctivita si alte boli acute.Ei devin tumorigeni doar atunci cnd infecteaza anumite specii de roztoare, cum ar fi hamsterul sirian. Unii virui sunt tumorigeni atunci cnd infecteaza o celul i persist ca episomi circulari sau plasmide,cu replicarea ADN-ului celular separat de la gazd (virusul Epstein-Barr i herpesvirusul asociat sarcomului Kaposi). Alte virusuri sunt cancerigene doar atunci cnd se integreaz n genomul celulei gazd, ca parte a unui accident biologic, cum ar fi polyomaviruses i papilomavirusuri.

Tipuri de oncovirusuri

ADN virui Virusul papiloma uman (HPV), este un virus cu ADN, cauzeaza transformare n celule, prin interferenta cu proteinele supresoare tumorale, Interfera cu aciunea de p53 permite o celul infectat cu virusul s se mute ntr-un stadiu diferit al ciclului celular, care s permit genomul virusului s fie reprodus. -herpesvirusul asociat bolii denumite Sarcom Kaposi (KSHV sau HHV-8) -sarcom Kaposi un tip de cancer de piele. -Virusul Epstein-Barr (VEB sau HHV-4) este asociat cu patru tipuri de cancer -Merkel poliomavirus - un virus polyoma - este asociat cu dezvoltarea de carcinomul cu celule tip Merkel ARN virusuri Nu toate oncoviruses sunt virusuri ADN-ului. Unii virui ARN au fost de asemenea asociati cu cancerul , cum ar fi virusul hepatitei C, precum i T umane-limfotropic virus (HTLV-1).

ADN oncovirusi

Virus Papovaviridae Papillomavirus Herpesviridae Epstein-Barr virus (EBV)

Disease Warts, including genital warts Infectious mononucleosis

Cancer Cervical, penile, vulvar cancer Oropharyngeal, laryngeal carcinoma Burkitts lymphoma Nasopharyngeal carcinoma ??Hodgkins disease

Hepadnavirus Hepatitis B virus (HB Adenoviridae

Hepatitis B

Liver cancer (hepatocellular carcinoma)

Acute respiratory disease; Common cold Multicentric Castlemans Disease

Adenocarcinomas (cancer of glandular epithelial tissues) Kaposis sarcoma

HHV 8 (Kaposis Sarcoma Herpes virus)

Virusuri Oncogenice cu ARN

La retrovirusuri, genomul ARN-ului viral este mai nti transformat n ADN. n timpul acestei proces parti din genomul gazd poate fi ncorporat n genomul viral (transductie). n cazul n care genomul gazdei include o gen proliferativa, gena transduse va conferi un avantaj de crestere celulei infectate. Alternativ, integrarea genomului unui retrovirus in genomul gazd poate fi localizat intr-o regiune puternic promotoare aproape de o gena gazd care codifica reglementarea sintezei proteice. n cazul n care proteina este exprimat la un nivel anormal de ridicat, aceasta poate duce la transformarea celular. Acest lucru este denumita transformare indusa de retrovirusi integrati. A fost artat c HIV induce, de asemenea, anumite forme de cancer la persoanele infectatela care pot fi indus procesul de transformare.

Proces oncogenic declansat de HPV

Virusuri oncolitice

Un virus oncolitic este un virus care infecteaza preferential i lizeaza celulele canceroase; aceste funcii au evidente avantaje pentru terapia cancerului, att prin distrugerea directa a celulelor tumorale, i ca vectori care s permit exprimarea genelor proteice impotriva cancerului care urmeaz s fie livrate n mod specific in siteul tumorii. Cele mai multe virusuri actuale oncolitice sunt proiectate pentru selectivitatea tumorii, dei exist cele cateva ce sunt in mod natural selective , cum ar fi virusul Seneca Valley.

Virusuri oncolitice
E. Antonio Chiocca Viruii pot fi proiectat pentru a infecta selectiv i / sau reproduce in celulele
canceroase. infecii selectiv utilizeaz redirecionarea obligatoriu virale departe de normal i fa de celulele normale. replicarea selectiv poate fi ndreptata spre celulele cu RAS hiperactiv sau defecte de semnalizare interferon, celulele cu defecte n p16/RB tumorale supresoare cale, sau celule, cu defecte, n p53 supresoare de tumori mijloace de utilizarea replicare tumora-selectiv promotorilor de a conduce vehicule expresia genelor virale. Studiile clinice au artat c virusurile oncolytic - care sunt derivate din adenoviruses, cum ar fi virusul herpes simplex i a virusului bolii Newcastle - sunt bine tolerate la om. Principalele obiective de cercetare virale oncolytic sunt pentru a crete selectivitatea tumorii prin modificarea genomului viral, de a combina tratamentul oncolytic virale cu radiatii standard i chimioterapie, i la "braul", virui cu cDNAs sinucidere i / sau cDNAs citokine pentru tratament multimodal. O mai bun nelegere a mecanismelor a oncoliyei virale, precum i rspunsurile sistemului imunitar care virues, precum i mbuntirea capacitii de imaginea aceste virusuri in vivo, ar trebui s fac aceast abordare terapeutica mai sigure i mai eficiente

Virusuri oncolitice

Studii recente folosind tulpini virale modificate genetic, cum ar fi adenovirus5, 6 (ONYX-015 i CV706) i virusul herpes simplex 1 (refs 7,8; G207 i 1716), astfel cum precum i de tip slbatic de virus al bolii Newcastle (PV701) au fost ncurajatoare, artnd aceste virusuri care urmeaz s fie relativ nepericuloase si specifice pentru formatiunile tumorale.

Mecanismul actiunii duale ale terapiei anticaneroase . Sursa: BioVex

Actiunea virusurilor oncolitice

Terapie chimica antivirala

Chemoterapie antivirala
after dr, Richard Hunt

In mod cert un medicament bun trebuie sa arate o toxicitate mai mare fata de virus si mai mica pentru celulele gazdei. Putem masura selectivitatea prin indexul terapeutic al medicamentului respectiv
Index terapeutic (T.I.): doza minima toxica pentru celule doza minima toxica pentru virus

Medicamentele bune au un index de 100-1000 sau mai mare.

Istorie

Primul medicament anti-viral licentiat a fost idoxuridine (1963), un analog de pirimidin care inhiba sinteza ADN-ului viral. El este n continuare folosit local pentru keratita herpetica epiteliala, dar a fost n mare parte nlocuit deoarece alte medicamente sunt mai putin toxice. Este toxic pentru c i lipsete specificitatea, i anume inhiba polimerizarea ADN gazdei si a virusului. Unul dintre cele mai bune medicamente anti-virale pe care le avem dateaz din 1983: Acyclovir (acycloguanosine), care este un analog purinic. Acesta inhib replicarea ADN-ului herpesvirusului. De asemenea, este un analog nucleozidic, dar, spre deosebire de idoxuridine, este foarte specific i nu prezint efecte toxice adverse grave.

Actiuneaunui virus cuprinde mai multe etape, cum ar fi legarea terapiei antivirale Ciclul de via al
la suprafata celulei, replicare, etc sintezei proteinelor si toate aceste etape pot fi tinta de medicamente anti-virale. Printre etapele ciclului de via, care au fost vizate de ageni potenial terapeutic sunt: -fixarea virusului la suprafata celulelor, probabil ca urmare a concurenei cu un receptor virale specific. -penetrarea sau preluarea de ctre vezicule intracelular (endosomi) -decapsidarea (pierderea stratului de proteine, a anvelopei lipidice -Integrarea a ADN-ului viral in ADN-ul cromozomiale a celulei gazd (n cazul n care se ntmpl acest lucru). -Transcrierea a genomului la ARN sau ADN (polimerazele sunt int). -de prelucrare a mRNA (poliadenilare, metilare, plafonarea, despicare) -sinteza proteinelor -modificarea post translationala a proteinelor (glicozilare, fosforilare, acylation grai, proteoliza). Unele dintre acestea sunt eseniale pentru descendeni obtinerea de particule virale funcionale infectioase -asamblarea componentelor n ntregul virus

Punctele de actiune a chimioterapiei antivirale

Legarea receptorilor sau preluarea in veziculele intracelulare

Acolo, au fost pn de curnd, nu medicamente care opresc bun legrii la nivelul receptorilor de orice virus (dar a se vedea sialidase inhibitor de grip de mai jos). Cu toate acestea, posibilitile de utilizare includ o peptida care imita receptorilor, cum ar fi proteine solubile CD4. Acest lucru ar lega HIV gp120 i oprii-l legarea de receptorul de pe suprafata celulelor
AMD-3100 Denumire chimic: 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecane, 1,1 '- (1,4phenylenebis (metilen)) bis-, octahydrochloride n plus fa de abordri peptide pentru a perturba HIV-co-receptor interaciuni, unele inhibitori de molecula mica au fost dezvoltate. De exemplu, AMD3100/JM-3100 pare s se leaga de site-ul de legare al liganzilor co-receptorul cunoscut sub numele de CXCR4 (fusin) i blocheaz interaciunea dintre CXCR4 i bucla V3 de gp120. Maraviroc chimice nume: Maraviroc (de brand-numit Selzentry, Celsentri sau n afara SUA) a fost aprobat pentru utilizare n pacienii infectai cu HIV, n august 2007. Acesta blocheaz interaciunea dintre receptorul CCR5 chemokine i HIV gp120. Deoarece HIV se poate utiliza, de asemenea, un alt co-receptor, CXCR4, un test de tropism HIV se efectueaz pentru a determina daca medicamentul va fi eficiente.

Fuziunea membranelor virale si celulare

Sunt agenice blocheaza fuziunea HIV cu celula gazd prin interactiunea cu gp41 Enfuvirtide alte nume: DP-178, pentafuside, T-20, Fuzeon . Peptidele derivate din gp41 pot inhiba infectia, probabil prin blocarea interaciunii dintre gp41 cu proteinele de membrana a celulelor n timpul fuziunii sau prin oprirea schimbarii conformationale care rezult din asocierea a dou molecule gp41 Acest medicament a fost aprobat n 2003, dar rapoarte recente sugereaza biodisponibilitate sczut i apariia de mutani rezistente. RFI-641 denumire chimica: 4,4 "-bis-{4,6-bis-[3 - (biscarbamoilmetilbenzoic-sulfamoyl)-fenilamino] - (1,3,5) triazin-2ylamino}-bifenil -2,2 acid "-disulfonic RFI-641 (bifenil triazin)? inhib fuziunea anvelopei virusului sincitial respirator (VSR), cu membrana celulelor. Se pare s-i modifice conformaie de fuziune (F), proteine de virus i este activ in vivo pe modele animale mai multe. Este activ mpotriva tulpinilor de VSR A i B.

Decapsidarea si inlaturarea anvelopei virale

Indepartarea invelisului virusului (de exemplu, pierderea membranei lipidice la virui cu invelis sau de proteine din nucleocapsida la virusurile nencapsulate) apare adesea la endosome cu pH scazut sau lizozomii, ca urmare a unei fusogene dependent de pH. Not: Unii virui nu au nevoie de un mediu acid pentru fuziune i fuzioneaza cu membrana plasmatica, acesta este cazul cu virusuri herpetice i HIV i duce la formarea de sincitii celulare.

Decapsidarea si indepartarea anvelopeidenumire chimica: 4 - (6 - (2-cloro-4-metoxi) Arildone i WIN

fenoxi) hexil-3 ,5-heptanedione. Arildone i compui WIN inhiba decapsisdarea la picornavirusi, care nu au o anvelopa din membrana lipidica. Pleconaril denumire chimic: 3 - (3,5-Dimetil-4-(3 - (3-metil-5isoxazolyl) propoxy) fenil) -5 - (trifluoromethyl) -1,2,4-oxadiazol Alte nume: Victorie 63843 , Picovir Aceasta actioneaza ca un compus WIN, n msura n care ncape ntr-o zona hidrofoba n nucleocapsida i ntrerupe replicarea virusului prin oprirea desprinderii de proteine din nucleocapsida de ARN .

Inhibitori ai sintezei ADN

(1) modificarea zaharurilor

Aciclovir / Acycloguanosine Denumirea chimic : A 9 - (2hydroxyethoxymethyl) guanin, acycloguanosine (ACG) Alte denumiri: Aciclovir (ACV), Zovirax. (figura 7). Dup cum sa menionat mai sus, acest medicament este foarte selectiv i unul dintre cele mai bune medicamente anti-virale. Este non-toxic pentru celulele neinfectate (cu excepia unor disfuncii renale), deoarece nu este activat de celulele neinfectate (deoarece medicamentul este un substrat slab pentru kinazei foarte specifice timidin de celule). Mai mult dect att, ADN polimeraza virusului herpes simplex este de 10 ori mai sensibila decatADN- polimeraza celulara. Acest medicament este un inhibitor competitiv - concureaza cu dGTP - dar, de asemenea, acioneaz ntr-un alt mod care este mai important: atunci cnd acesta devine ncorporat n ADN-ului, acioneaz ca un lan terminator. Se administreaz pe cale oral, topic sau intravenoas. HSV-1, HSV-2 i VZV sunt senibile la aciclovir.

Inhibitori ai sintezei ADN

2) modificarea bazelor azotate

Acestea sunt analogi pirimidinici, care sunt ncorporati n ADN de ctre polimeraza ADN-ului viral. Ele formeaz perechi de baze instabile i rezulta proteine mutant. Ele sunt inhibitori competitivi ai polimerazei ADN-ului viral dup fosforilarea intracelular. Bromovinyl deoxyuridine (Brivudin) Denumire chimic: (E) -5 - (2bromovinyl)-2A -deoxyuridine, Alte nume bromovinyldeoxyuridine: BVDU, Zoste, Zonavir, Zerpex. BVDU este utilizat pentru tratarea HSV i VZV. De droguri este iniial phosphoryalted de timidinkinaza viral, prin urmare, sa specificitate. Acesta este utilizat diverse infectii cu HSV i VSV inclusiv keratita HSV i herpes genital. Acesta poate fi administrat pe cale oral sau topic. Iodo-deoxyuridine (Idoxuridine) Denumire chimic: 5-iodo-2A deoxyuridine Alte nume: UDI, IUdR, Herpid, Stoxil, Idoxene, Virudox Acest medicament este similar cu BVDU i acum este utilizat n principal n picaturi pentru ochi sau o crema pentru cheratit HSV.

Analogi de nucleoside

3) Inhibitori ne nucleozidici ai revers transcriptazei

Din cauza problemelor cu AZT si altor analogii nucleozidici n tratamentul infeciei cu HIV, interesul a crescut ntr-o alt abordare a inhibarii enzimei revers transcriptaza. Medicamente alternative ar putea fi utile n terapia combinat, deoarece exist o limit a numrului de mutaii care revers transcriptaza poate suporta, fr a pierde funcia. Inhibitori non-nucleozidici sunt cei mai puternici i selectivi inhibitori de revers transcriptaza pe care le avem actualmente , care sunt active la concentratii nanomolare. Ele au o toxicitate minima n testele cu celule de cultur (au activitate antivirala la o concentraie 10.000 la 100.000 de ori mai mic dect concentraia citotoxica) i s-au dovedit a funciona sinergetic cu analogii nucleozidici, cum ar fi AZT

3) Inhibitori ne nucleozidici ai revers transcriptazei

Nevirapin Denumire chimic: 11-cyclopropyl-5,11-dihidro-4-metil6H-dipyrido [3,2-b: 2A , 3A-f] [1,4] diazepin-6-o Alte denumiri: NVP sau Birg-587, Viramun n monoterapie, acest medicament produce o scdere iniial a numrului de virionilor HIV, dar i seturi de rezisten, n titruri virusul revine la un nivel ridicat. Acest medicament a fost aprobat pentru tratamentul la pacientii cu SIDA. Delavirdin Denumire chimic: 1 - (5-methanesulfonamido-1H-indol2-il-carbonil) -4 - [3 - (1-metiletil-amino) piridinil) monomethane numele piperazin sulfonat Nu au fost rezultate promitoare la pacienii cu CD4 foarte sczut + celule, care au un tratament anterior cu AZT. n combinaie cu AZT i 3TC, DLV poate ntrzia apariia rezistenei la AZT. DLV este utilizat n asociere cu un analog nucleozidic, cum ar fi AZT i inhibitori de proteaz.

Inhibitori ai sintezei ARN

Ribavirina Denumire chimic: 1-i -Dribofuranosyl-1H-1 ,2,4-triazol-3carboxamid Alte nume: Virazole, Virazid, Viramid Acest medicament nu este o pirimidin sau o baza purinica. inhib non-competitiv polimeraza ARN la virusul gripal in vitro, dar are actiune slaba in vivo. Ea poate aciona ca un analog al guanozin i inhib formarea de 5 "pe capatul mRNA. Capatul conine n mod normal, metil guanozin. Cu toate acestea, ribavirina este cunoscuta pentru a inhiba producerea de particule de virus polio infecioase i acest virus nu are un capat de metil guanozina; deci nu trebuie s existe mecanisme alternative de aciune pentru ribavirin. Este probabil ca acest medicament induce mutaii multiple n ARN-ul viral fcndu-l incapabil de o nou rund de infectie a celulelor

Inhibitori ai sintezei proteice

Fomivirsen Denumire chimic: Antisim nume oligonucleotidului Alte: ISIS 2922, Vitravene. Fomivirsin este un oligonucleotid anti-sens compus din 21 de nucleozide care sunt stabilizat fosforilate. Acesta poate fi administrat ca o injecie intra-oculara pentru retinita cu CMV. Hbridizeaza specific cu mARN al pentru CMV si blocheaza traducerea a doua proteine precoce codificate in acesta.

Interferonii (IFN)

Interferonii sunt un grup de substane de natur glicoproteica cu activitate antiviral, antitumorala i imunomodulatoare. Activitatea lor se bazeaz pe inhibitia multiplicarii viral prin blocarea activitatii mARN viral de i / sau produce degradtion sa selectiva. In organismul uman exist 5 tipuri de interferoni: alfa, beta, gamma, tau si omega.Genele pentru sinteza lor sunt situate pe cromozomul 9 (interferoni alfa, beta, i Omega tau) i pe 12 (interferon gamma). Din punct de vedere biochimic, IFN-alfa i beta-sunt monomeri similar structurati i IFN-gamma are o structur homodimerica (compus din doua unitati monomerice identice). IFN-tau si omega-au structuri similare cu IFN-alfa. Sinteza lor in vitro este stimulat de virui i substane polinucleotidice i antigene.Producia de IFN-alfa i beta-are loc n majoritatea celulelor, dar sinteza a IFN-gamma a fost descoperit adoar n unele tip de celule (limfocytes T CD8 +, celulele NK).

Mecanismul de aciune antiviral a IFN (alfa, beta, gamma) este similar i este legat de prezena receptorilor IFN-specifici aflati pe mai multe dintre membranele celulelor.

Actiunea interferonilor

Efectul antiviral este dat prin intermediul sintezei proteice induse de formarea complexului receptor-IFN care migreaz intracitoplasmatic (se internalizeaz). De altfel, majoritatea efectelor IFN, prin intermediul proteinelor I enzimelor a cror sintez o induc, sunt efecte de tip antiproliferativ viral I celular. La acestea se adaug I efectele antineoplazice realizate prin represarea unor oncogene. Aciunea antiviral a enzimelor IFN-induse se produce prin mecanisme variate : - interferarea (blocarea) replicrii virale prin clivarea ARNdc (dublu catenar), - blocarea translaiei I, deci, implicit blocarea sintezei proteinelor virale, - liza celulei gazd cu blocarea posibilitii de infectare a altor celule, - scderea rezervelor de triptofan celular cu inhibarea creterii celulare, - inhibarea revers-transcriptazei (acest efect a fost recent evideniat n cazul IFN-tau care are capacitatea de a inhiba revers-transcriptaza HIV). Aplicaiile IFN n terapia antiviral s-au extins ncepnd cu anii '80. Rezultate bune s-au obinut n infecii cronice cu HTLV, papillomavirusuri, virusuri hepatitice, etc.

Actiunea interferonilor

Curs 10.Imunologie fundamentala si notiuni generale

Universitatea de Vest Vasile Goldis Arad Facultatea de Medicina, Farmacie si Stomatologie Dr.biol. Sergiu Fendrihan

Infectie si imunitate
n orice infecie au loc urmtoarele evenimente:

contaminarea (ntlnirea cu agentul infecios), ptrunderea i multiplicarea n organismul gazd prin eludarea rezistenei antiinfecioase, producerea deteriorarilor morfologice i funcionale, datorate n parte aciunii directe a agentului infecios i cel mai frecvent, reaciilor de aprare ale organismului, finalul infeciei, care poate fi vindecarea cu sau fr sechele, exitusul sau coexistena pe timp ndelungat a celor doi parteneri ai infeciei: agentul infecios i organismul. Infectiile pot sa fie exogene ce presupun patrunderea din exterior a germenilor patogeni si endogene, determinate de catre germenii ce rezida in organism si care pot deveni patogeni

Imunologia

Imunologia

Imunologia studiaza, n primul rnd, functia de aparare a organismului uman si animal, care face parte din categoria functiilor de relatie si este esentiala pentru supravietuire. Sistemul imunitar este esential pentru supravietuirea organismelor multicelulare, datorita agresiunii permanente a agentilor infectiosi (microorganisme si virusuri) Dr. E Mihaiescu

Ramuri ale imunologiei

Imunobiologia

Imunobiologia este cea mai cuprinzatoare dintre ramuri. Ea studiaza fenomenele imunitare ca manifestari ale unei functii biologice esentiale functia de aparare. Studiaza substratul biologic al raspunsului imun (celulele imunitare, originea si mecanismele diferentierii lor, factorii celulari si humorali care asigura diferentierea lor), mecanismele celulare si moleculare ale biosintezei anticorpilor, explica implantarea celulelor tumorale si geneza cancerului clinic n conditiileactiunii efectorilor sistemului imunitar.

Imunogenetica

studiaza determinismul genetic al raspunsului imun: mecanismele genetice care asigura diversitatea anticorpilor si a antigenelor de histocompatibilitate. Imunohematologia s-a nascut odata cu stabilirea diferentelor antigenice ale eritrocitelor umane si cu precizarea grupelor sanguine (K. Landsteiner, 1901) si s-a dezvoltat dupa ce s-a stabilit existenta unor diferente fine ntre diferite tipuri de eritrocite si, n special, dupa descoperirea factorului Rh si a rolului sau n patologia sarcinii.

Imunochimia
Imunochimia este o disciplina de granita ce apartine Imunologiei si Biochimiei, care studiaza functia imunitara sub aspect biochimic. Preocuparea esentiala a constat n studiul chimiei antigenelor si anticorpilor si al mecanismului lor de interactiune n reactia antigen-anticorp. imun cu ajutorul adjuvantilor;

Imunologia medicala
Imunologia medicala umana si veterinara s-a dezvoltat n trei directii: - directia terapeutica studiaza posibilitatea obtinerii serurilor imune. Ele contin anticorpi si se administreaza organismelor care prezinta riscul mbolnavirii prin infectii; - directia diagnosticului studiaza posibilitatea identificarii agentilor etiologici ai diverselor maladii infectioase, cu ajutorul reactantilor imunologici (seruri imune si antigene). - directia profilactica, orientata spre descoperirea si

Imunopatologia si serologia

Imunopatologia studiaza fenomenele imunitare n relatie cu diferite maladii. In multe situatii patologice, raspunsul imun (activarea functiei imunitare) are efecte defavorabile, prejudiciante asupra organismului. Raspunsul imun se instituie drept cauza, dar n special ca mecanism,pentru producerea unor manifestari patologice. Afectiunile generate deactivarea sistemului imunitar (imunopatii) se grupeaza n doua categorii: - starile de hipersensibilitate (alergiile); - maladiile autoimune. Imunopatologia studiaza, de asemenea, imunodeficientele (nascute si dobndite), imunitatea de transplant si imunitatea antitumorala, raspunsul imun n maladiile infectioase virale si bacteriene, precum si n maladiile parazitare. Serologia (Imunoserologia) s-a dezvoltat ca o ramura practica, dedicata studiului tehnicilor de explorare a reactiilor imune in vitro.

Imunitatea si sistemul imunitar

Imunitatea si sistemul imunitar

IMUNITATEnereceptivitatea organismului la orice ageni strini din punct de vedere genetic, inclusiv la microorganisme si toxinele lor. IMUNITATEcapacitatea de aprare specific a organismului fa de agresori externi (virusuri, bacterii, fungi, protozoare, toxine) ct i fa de propriile molecule si unele celule degradate sau modificate. Sarcina fundamental a imunitii distincia dintre moleculele i celulele proprii (self) si cele strine (nonself)

Schema relatiilor dintre microorganisme si sistemul imunitar

Generalitati

n conceptia moderna, functia imunitara se defineste ca o proprietate biologica esentiala a organismului uman si animal, care consta n capacitatea de a diferentia rapid si specific, substantele proprii de cele straine. Sistemul imunitar este tolerant fata de substantele proprii, deoarece a nvatat sa le recunoasca n timpul vietii embrionare, dar este dotat cu proprietatea de a recunoaste si de a diferentia prompt substantele straine, fata de care se activeaza si le ndeparteaza din organism

Generalitati

1) n primul rnd s-a demonstrat ca functia imunitara este esentiala pentru organism, insuficienta sa marind riscul infectiilor cu microorganisme patogene sau potential patogene, iar disfunctia imunitara severa este incompatibila cu viata. 2) S-a demonstrat ca activarea functiei imunitare nu este totdeauna benefica pentru organism, ci uneori, stimularea ei determina leziuni tisulare severe, chiar ireversibile, asociate cu starile de hipersensibilitate sau initiaza evolutia unor stari patologice grave, ca de exemplu, maladiile autoimune. Exemplul clasic este oferit de infectia cu

Privire generala asupra sistemului imun

Celulele sistemului imun: Celulele efectoare ale imunitatii specifice sunt limfocitele B (LB) limfocitele T (LT) Celulele efectoare ale imunitatii nespecifice sunt celulele natural ucigase (NK) celulele mononucleare fagocitare (monocite/macrofage, celulele

Organele limfoide

Organele limfoide: Organele limfoide primare

maduva osoasa hematogena, timusul

Organe limfoide secundare

ganglioni limfatici, splina, tesutul limfoid asociat mucoaselor, sistemul imun al pielii

Tipuri de imunitate
TIPURILE DE IMUNITATE I. Ereditar (natural, de specie). Poate fi absolut (lipsa intei) sau relativ. II.Dobndit (achizitionata, adaptativa) 1.Activ -Natural (postinfecioas) -Artificial (n urma vaccinrii) 2.Pasiv -Natural (transplacentar, prin laptele matern) -Artificial (administrarea Ac / seruri imunesau a limfocitelor)

Tipuri de imunitate
Tsuneyasu Kaisho

Imunitatea dobndit

Este caracterizeaz prin: 1.Dezvoltare lenta si manifestare tardiva (cteva zile, sptmni dupa contactul cu un antigen) 2.Specificitate fa de antigen (capacitatea de a recunoaste si raspunde specific la numeroase substante straine, inclusiv agenti infectiosi) 3.Memorie imunologic (capacitatea de a elabora raspuns mai rapid, mai intens si eficace la intalniri repetate cu un antigen) Imunitatea dobndit poate fi: I.Imunitate antibacterian, antiviral, antimicotic, antitoxic, antitumoral,

Tipuri de imunitate

II.n funcie de mecanismele reaciilor imune -Imunitate umoral, exercitat prin intermediul unor proteine numite anticorpi (Ac, Ig), produse de limfocitele B. Fiind secretate in sange si lichide biologice neutralizeaza si elimina microbii extracelulari si toxinele lor. -Imunitate celular, eficienta in eliminarea parazitilor intracelulari sau a celulelor tumorale. Este exercitat prin intermediul limfocitelor T(citotoxicitate directa, activarea macrofagelor, celulelor NK, secreia citokinelor) III.n dependen de persistena microorganismelor -Imunitate sterilse manifest dup eliminarea agenilor patogeni din organism (ex.:rujeol) -Imunitate nesterilnereceptivitatea se pstreaz doar

Mechanism of action of cellular and humoral immune sytems

Componentele sistemului imun

Nespecific Umoral
complement, interferon, etc.

Specific Umoral
anticorpi

Celular
macrofage, neutrofile

Celular
Celule T; alte celule efectoare

ANTIGENELE

substane strine (non-self) de natur endo-sau exogen capabile s declaneze un rspuns imun (umoral, celular, toleran imunologic, memorie imunologic, paralizie imunologic). Proprietile de baz ale Ag: 1.Imunogenitateacapacitatea Ag de a fi recunoscut ca strin i de a induce rspuns imun specific 2.Antigenitatea (specificitatea)capacitatea Ag de a interaciona specific cu Ac sau cu receptorul pentru Ag complementar al limfocitelor

Antigenele
Antigenele care posed ambele caractere sunt Ag complete. Cerinele fa de Ag complete: -S fie substane strine -S fie formate din gruparea carrier (purttor) i epitopi (determinante antigenice) -S aib o greutate molecular de peste 10 kDa -S aib structur chimic complex (proteine, polizaharide, LPZ, etc) -S aib o conformaie spaial stabil Antigenele incomplete (haptenele) posed antigenitate dar sunt lipsite de imunogenitate.

Tipuri de antigene enzime, hormoni, etc -Ag solubile: proteine plasmatice, toxine,
-Ag figurate(celulare, corpusculare): celule, bacterii, parazii, etc. n funcie de provenien se deosebesc: -Ag heterofileAg comune mai multor specii animale. Ex.: n anumite condiii (spermatozoizii, tiroglobulina, insulina, cristalinul, esutul nervos, etc) -Exoantigene (provenite din compartimentul extracelular -bacterii, fungi, protozoare fagocitate) -Endoantigene (provenite din citoplasma celulelor,reprezint Ag polizaharidice Forssman, prezente n hematiile de cal, cine, oaie, cobai; sistemul Rh al eritrocitelor se ntlnete la om i maimuele Macaccus rhesus, etc -Ag heterologe (xeno-Ag, hetero-Ag)Ag provenite din organismul altei specii -Izo-Ag (alo-Ag)Ag de grup n cadrul unei specii (sistemul ABO i Rh, clasele de Ig) -Idioantigeneantigenele specifice unui individ. Corespund moleculelor CMH -AutoantigeneAg proprii unui organism, devenite imunogene proteine proprii modificate sau proteine virale sintetizate de celulele

Structura antigenic a celulei bacteriene I.Ag structurale (Ag O/Rsomatice, LPZ, termostabile; Ag Hflagelar, proteic, termolabil; Ag Kcapsular, termovariabil; Ag F fimbrial II. Ag solubile (enzime de patogenitate, exotoxine) Antigene virale: proteine/glicoproteinel e de invelis,

Imunogenitatea este o caracteristic a ntregii macromolecule Ag. Antigenitatea (specificitatea) este determinat de anumite secvene ale Ag. Suprafee limitate din macromolecula Ag apte s se combine cu Ac specifici sau cu receptorii de pe limfocitele sensibilizate se numesc determinante antigenice sau epitopi.

Determinantele antigenice. epitopii

Antigenele

La glucide epitopul este format din 4-6 monozaharide. Polizaharidele sunt formate dintr-un epitop repetat sau dintr-un numr redus de epitopi diferii. Polizaharidele sunt antigen T-independente, pot induce sinteza anticorpilor fr intervenia limfocitelor T.

Antigenele

Epitopul proteic este constituit din civa aminoacizi (AA). -Epitopii liniari (secveniali) sunt determinai de structura primar a aminoacizilor (8-30AA) -Epitopii conformaionali sunt determinai de structura secundar sau teriar a moleculei proteice (juxtapoziia n spaiu a AA situai la distan). Se modific la denaturarea proteinei.

Antigenii

Fiecare molecul proteic reprezint un mozaic de epitopi, fie diferii, fie identici. Proteinele sunt antigen T-dependente, deoarece ele induc sinteza anticorpilor doar prin cooperarea dintre limfocitele T i B. Numrul de epitopi de pe o molecul imunogen reprezint valena antigenelor.

Sistemul Imunitar
reprezinta un ansamblu de celule, molecule i tesuturi (organe) distribuite n tot organismul, care participa la instaurarea imunitatii. Functiile Sistemului Imunitar: 1.Aparare contra infectiilor 2.Recunoasterea tesuturilor si proteinelor straine si raspunsul la acestea 3.Protectie contra tumorilor

TESUTURILE SI ORGANELE SITEMULUI IMUNITAR

Organele centrale (primare) ale Sistemului imunitarmduva osoas i timusul la vertebrate (ficatul n perioada embrionar). Apar primele n timpul vieii embrionare. Rolulsursa celulelor-stem, instruirea, maturizarea i selectia celulelor imunocompetente (limfocitele T i B).

Sistemul imunitar

n mduva osoas se afl celulele-stem, precursori ai limfocitelor T i B. Limfocitele Pre-T (precursoare) migreaz ulterior n timus, unde va avea loc instruirea i maturizarea lor, devenind celule imunocompetente, capabile s recunoasc specific un singur Ag (prin achiziionarea unor receptori specifici). Instruirea si maturizarea B-limfocitelor are loc n mduva osoas. Aceste procese sunt independente de orice stimulare antigenic a organismului. Dup prsirea organelor centrale limfocitele nu mai revin aici, ele se stabilesc n organele limfoide secundare, recirculnd prin snge, limf.

Organele periferice (secundare) ale SI

n ele se realizeaz contactul dintre antigen, celulele prezentatoare de antigen( CPA) i celulele imunocompetente, cu inducerea unui raspuns imun. -Ganglionii limfatici (raspuns imun contra Ag transportate cu limfa) -Splina (raspuns imun contra Ag transportate cu sangele) -Formaiunile limfoide ale mucoaselor digestive i respiratorii (amigdale, plci Peyer, apendice), esutul limfoid asociat tegumentului (raspuns imun contra Ag ce penetreaza prin epitelii) Ariile timo-independente (populate de limfocite B) ale organelor limfoide secundare sunt: foliculii cortexului extern din ganglionii limfatici, foliculii din plcile Peyer i foliculii zonei periferice din pulpa alb a splinei.

Sistemul imunitar

CELULELE SISTEMULUI IMUNITAR

1.Limfocitele (celule imunocompetente, recunoasterea Ag) limfocitele T si B Toate limfocitele provin din celule-stem ale maduvei osoase, cu o etapa ulterioara de maturizare si selectie. Limfocitele T si B sunt unicele celule ce poarta receptori specifici de Ag (celule imuno-competente), fiind mediatorii principali ai imunitatii adaptative. Maturizarea limfocitelor B are loc n mduva osoas prin intermediul interaciunii directe cu celulele stromei, iar n stadiile tardive sub aciunea citokinelor secretate de celulele stromale (n special IL-7).LB sunt supuse unei selectii pozitive in favoarea expresiei de receptori intacti si unei selectii negative contra recunoasterii puternice a antigenelor proprii. In organelor limfoide secundare limfocitele B se localizeaza in foliculii cortexului extern din ganglionii limfatici, foliculii din plcile Peyer i foliculii zonei periferice din pulpa alb a splinei

Celulele sistemului imunitar limfocitele B LB mature se caracterizeaz prin prezena

urmtorilor receptori de suprafa: -Receptorul pentru Ag (BCR).Este reprezentat de molecule de imunoglobuline monomeri de Ig M i Ig D. Interacioneaz cu molecule antigenice din soluii sau fixate pe membrane celulare (macromolecule native proteine, glucide, acizi nucleici, etc) -Receptorul pentru fragmentul Fc al IgG -Receptor pentru fraciunea C3b a complementului -Receptori pentru interleukine (IL) -Proteine ale Complexului Major de Histocompatibilitate -CMH -Alte proteine specifice CD79, CD19 asociate BCR

Celulele sistemului imunitar

limfocitele B Organismul

contine 107109 clone diferite de LB, fiecare cu BCR unic. BCR recunoate antigenele dup configuraia lor. BL stimulate de Ag se multiplic i se difereniaz n celule efectoare -plasmocite

Celulele sistemului imunitar

Limfocitele T
Limfocitele T citotoxice (CTL sau CD8 +) distrug celulele infectate.
Aceste celule functioneaza ca celulele ucigase (killer" n limba englez) sau citotoxic, deoarece acestea sunt capabile sa distruga celulele int care exprima antigene specifice pe care le recunosc Celulele T helper (Th) sunt intermediari n rspunsul imun pentru a activa i a prolifera n mai multe tipuri de celule care actioneaza alte mai direct cu privire la rspunsul.T helper reglementeaza sau "ajut" la realizarea de alte funcii de catre limfocite. Ei desfoar CD4 ca marker de suprafa. Celulele T de reglare (Treg) ajuta la prevenirea activrii limfocitelor autoimune care distrug celulele din corpul lor. Anterior cunoscut sub numele de "T supresoare", ele sunt foarte importante pentru meninerea homeostaziei. Rolul principal este de a suprima activitatea celulelor imune, sau raspunsul imun autoimune sau n cele din urm. Ele sunt deosebite cu uurin de alte: celule T au pe suprafa markeri CD4 si CD25.

 Celulele

NKT sunt un tip de limfocite T cu markeri celulari (CD3 i markeri ai celulelor NK.
Acestea sunt o legtur ntre imunitatea innascuta si cea adaptativa. Spre deosebire de celulele T conventionale, ale cror TCR recunosc o peptida prezentata ntr-o molecul a complexului major de histocompatibilitate (CMH), NKT sunt capabili s recunoasc un glicolipid prezentat ntr-o molecula numita CD1d, nrudit structural cu CMH clasa I. odat activate, NKT sunt capabile s lizeze obiectivul i sa secrete citokine.

celule

T i i reprezint o populaie de celule T cu receptori TCR speciali.

Cele mai multe T au un TCR compus din dou glicoproteine , avand lanuri i . Cu toate acestea, celulele au lanturi i TCR sau lanturi si . Aceste celule sunt mai puin abundente dect i (reprezentnd 5% din total LT), dar se gsesc n cantiti mai mari n mucoasa intestinal, inclusiv pentru populaia de limfocite numit e limfocite intraepiteliale. TCR lor nu pare limitat la recunoaterea unei peptide, dar ar putea s

Celulele sistemului imunitar

Limfocitele T

Precursorii limfocitelor T migreaz n timus, unde sub influena celulelor stromale i a corpusculilor Hassal se difereniaz n limfocite T mature. Migraia TL din cortex spre medulara timic este nsoit de achiziia unor proteine de suprafa specifice (receptori: TCR, CD3, CD4, CD8, etc). La o etapa precoce de selectie doar limfocitele cu TCR functional vor supravietui. Dezvoltarea ulterioara a TL este caracterizat printr-o selecie pozitiv (supravieuiesc TL care recunosc moleculele Complexului Major de Histocompatibilitate (CMH) propriu). Aceste molecule sunt prezente pe suprafata celulelor dendritice si a macrofagelor din timus.

Celulele sistemului imunitar

Limfocitele T recunoasccu afinitate inalta peptide proprii asociate cu CMH suport o selecie negativ (moarte programat prin apoptoz). Selecia const n eliminarea clonelor de limfocite potenial autoreactive (potenial reactive fa de moleculele proprii). Timusul selecioneaz utilul, ignor inutilul i distruge nocivul. (Von Boehmer ). La etapa finala limfocitele T care sunt capabile sa recunoasca peptide in asociatie cu moleculele CMH I pierd receptorul CD4 (devenind celule TCD8), iar cele ce recunosc complexe peptid-CMH II pierd receptorul CD8 (devenind celule TCD4)

Limfocitele T

Receptorii limfocitelor T: -TCR, receptorul pentru Antigene -format din 2 catene polipeptidice i (90%) sau i . TCR poate recunoate doar peptide antigenice asociate cu molecule ale CMH, localizate pe suprafaa unei Celule Prezentatoare de Antigen -CPA. Nu interacioneaz cu Ag solubile. -CD3(Cluster Differentiation 3)asociat TCR, ajut la transmiterea n celul a semnalului de recunoatere a Ag si de activare a limfocitului -CD2prezent la toate TL, fixeaz hematii, poate fi depistat prin testul de formare a

-Unii markeri (receptori) de suprafa definesc 2 varieti principale de LT: limfocitele T CD4+i TCD8+ -CD4exprimat pe 60% din TL.Recunosc antigenele peptidice legate cu moleculele CMH clasa II (exprimate pe celulele dendritice, macrofage i LB). Limfocitele TCD4 (T4) au funcia de coordonator central al rspunsului imun i la activare se difereniaz n subpopulaia de Thelper (Th). Th acioneaz prin producerea citokinelor. n funcie de profilul de citokine elaborate se disting 2 grupe de Th: Th1 i Th2.

Celulele sistemului imunitar

Limfocitele T Diferenierea n Th1 este favorizat de IL-12 produs de macrofage. Citokinele secretate de Th1 (IL-2, TNF i IFN-) stimuleaz rspunsul imun celular i hipersensibilitatea tardiv (activarea macrofagelor pentru distrugerea mi/o intracelulare, proliferarea i diferenierea limfocitelor T citotoxice (Tc), activeaz procesul inflamator).De asemenea stimuleaz producerea

Celulele sistemului imunitar

-CD8exprimat pe 40% Limfocitele

T. Recunosc antigenele peptidice asociate cu moleculele CMH de clasa I (exprimate pe toate celulele nucleate). Pot produce citokine, dar n special manifest activitate citotoxica. La activare se difereniaz n limfocite Tcitotoxice (Tc) i Tsupresoare (Ts). Tcitotoxice distrug celulele infectate cu virus, cu bacterii intracelulare sau celulele canceroase, intervin n respingerea grefelor. T supresoare suprim rspunsul imun fiind responsabile de tolerana imunologic. T-cu memorie asigur memoria imunologic

Celulele sistemului imunitar

Limfocitele B i T naive sunt celulele care inca nu s-au ntlnit cu un Ag. Dup interaciunea cu Ag urmeaza activarea lor, proliferarea i diferenierea n celule efectoare (LB n plasmocite, LT n Th, Tc), care vor elimina microbii sau neutraliza toxinele lor prin diferite mecanisme LB reprezint 10-15% din populaia limfocitar, cu o durat de via scurt, de 3-5 zile, iar LT constituie 70% cu o durat de via lung (luni, ani). Raportul limfocitelor CD4/CD8 este de 1,5

Celulele sitemului imunitar

Alte celule limfocitare (nule, neimuno-competente) 15% -Celule NK, capabile s distrug spontan celule canceroase i celule infectate cu virus -Celule K, posed pe membrana lor receptori pentru fragmentul Fc al Imunoglobulinelor. Distrug celulele-int acoperite cu Ac (Ig) fenomen de citotoxicitate Ac-dependent.

Celulele sistemului imunitar

Celulele sistemului imunitar

CELULELE PREZENTATOARE DE ANTIGEN (CPA) BL recunosc direct prin intermediul BCR epitopi antigenici conformaionali solubili sau fixai pe membrane celulare. TL pot recunoate numai epitopi proteici liniari asociai cu molecule ale CMH expui pe suprafaa unor celule specializate CPA (restricie CMH) CPAprofesioniste include celulele dendritice foliculare i tisulare, monocitele/macrofagele i limfocitele B Funciile CPA 1. Captarea, fragmentarea (processing-ul) Ag proteice, selectia i expunerea pe suprafaa sa a peptidelor antigenice (epitopi liniari)asociate cu moleculele CMH. 2. Transportarea acestor complexe spre tesutul limfoid periferic, unde complexul CMH-peptid va fi prezentat LT naiv cu TCR specific, declanand activarea lui. CPA care exprima peptide asociate cu CMH Ivor interactiona cu limfocite TCD8, iar CPA care exprima peptide in asocoatie cu CMH IIcu TCD4 3. Producerea semnalelor secundare de activare a LT (secreia unor

Celulele sistemului imunitar

COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE

Moleculele CMH reprezint un ansamblu unic de glicoproteine exprimate pe suprafaa celulelor organismului, care sunt veritabili markeri/ antigene de identitate ai fiecrui individ. Rolul moleculelor CMH: -Particip la prezentarea antigenelor peptidice limfocitelor T -Responsabilitate n respingerea grefelor

CMH este transmis genetic. Genele CMH sunt situate pe cromozomul 6 la om, locus numit HLA (Human Leukocyte Antigen). Moleculele CMH sunt formate din -2 catene polipeptidice, constituite din domenii extracelulare, -un fragment transmembranar -i o regiune intracitoplasmatic.

COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE

Structura tridimensional a moleculei duce la formarea unei caviti, la fundul creia se afl receptorii care vor interaciona cu peptide antigenice proprii sau strine.Ali receptori ai CMH interacioneaz cu moleculele CD4 sau CD8 de pe TL.

COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE

COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE Se disting molecule (antigene) CMH de clasa I i de clasa II. Moleculele CMH de clasa I sunt exprimate pe toate celulele nucleate ale organismului. CMH I recunoaste si interacioneaz cu receptorul CD8 de pe limfocitele T. CMH I particip la prezentarea peptidelor antigenice scurte (9 AA) obinute n cursul degradrii intracitoplasmatice (de ctre proteosom) a antigenelor endogene (molecule proprii sau proteine virale sintetizate de celula prezentatoare).

COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE Complexul peptid/CMH Ide pe suprafaa Celulelor Prezentatoare de Antigen -CPA (macrofage, celule dendritice) poate fi recunoscut de complexul TCR/CD8 complementar de pe limfocite T CD8 naive (rezult activarea limfocitelor, diferenierea lor n limfocite Tc iniierea rspunsului imun celular)

COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE -Complexul peptid/CMH Ide pe suprafaa celulelor infectate sau a celulelor tumorale poate fi recunoscut de complexul TCR/CD8 complementar de pe limfocitele efectoare Tc (rezult distrugerea celulelor ce conin antigenul endogen)

COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE

Moleculele CMH de clasa II sunt exprimate pe celulele specializate n prezentarea Ag limfocitelor CD4: limfocite B, celule dendritice, monocite, macrofage. Ele pot prezenta peptide din 12-30AA derivate din degradarea n fagolizosomea Agexogene (bacterii, protozoare, fungi, virioni liberi). Complexul peptid/CMH IIde pe celulele prezentatoare de Ag interacioneaz cu complexul TCR/CD4de pe limfocitele CD4 naive sau efectoare (Th1, Th2). Astfel moleculele CMH II sunt implicate n ambele tipuri de imunitate: umoral i celular.

COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE

COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE

Prezentarea Ag limfocitelor T. Ag este prezentat receptorului TCR sub form de peptide asociate moleculelor CMH de clasa I sau II de pe CPA. Limfocitele T CD8 recunosc n special Ag endogene, provenite din proteine citoplasmatice (molecule proprii modificate sau proteine virale) degradate de ctre proteasome. Aceste peptide din 9 Aa sunt prezentate n asociaie cu moleculele CMH de clasa I de pe macrofage, celule dendritice, dar i de pe

COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE

Prezentarea Ag limfocitelor B poate fi realizata prin intermediul celulelor dendritice foliculare din splin i ganglioni limfatici. Aceste celule nefagocitare fixeaz prin intermediul receptorilor membranari Antigenele polizaharidice sau proteice prezentndu-le ulterior limfocitelor B.

COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE

Referinte
Prelegeri Universitatea de Medicina si Farmacie Nicolae Testemiteanu E Mihaiescu Imunologie si imunochimie Ed UB, 2002

Curs 11.Sistemul imunitar, anticorpii, tesuturi si organe limfoide

Western University Vasile Goldi Arad Faculty of Medicine, Pharmacy and Stomatology Dr.biol. Sergiu Fendrihan

Anticorpii

IMUNOGLOBULINELE (ANTICORPII) Ig prezint glicoproteine din fracia globulinelor. Se disting Ig membranare (BCR) i Ig solubile (secretate)Ac ca atare. Ac sunt molecule glicoproteice produse de plasmocitele derivate din limfocitele B activate de Ag. Ac circul n snge i ptrund n esuturi. Sunt eficieni contra bacteriilor, toxinelor microbiene i virusurilor n poziie extracelular. Ac au proprietatea de a recunoate i a se combina cu Ag complementar, att in vivo, ct i in vitro.

Anticorpi

Structura si proprietatile Ig Unitatea structurala a Ig (monomerul) este constituit din 2 lanuri glicoproteice (catene) identice uoare L (Light) i 2 catene grele H (Heavy), legate ntre ele prin puni disulfidice. Exist 2 tipuri de catene L i , identice ntr-o molecul de Ig. Se disting 5 clase de lanuri H: , , , , ,ce corespund celor 5 clase (izotipuri) de Ig: IgG, IgA, IgM, IgD, IgE. n componena lanurilor se disting regiuni variabile (aminoterminale) i regiuni constante (carboxilterminale

Anticorpii

Regiunile variabile ale catenelor L i H formeaz o cavitate tridimensional -centrul activ (paratopul)al moleculei de Ig, care va reaciona specific cu determinanta antigenic (epitopul)Ag corespunztor,constituit din 5-7 AA sau 3-4 reziduuri glucidice. Regiunea variabil constituie fragmentul Fab(antigen binding) al moleculei de Ig. Regiunea constant corespunde fragmentului Fc(constant, cristalizabil). Este purttor de receptori i responsabil de activitatea biologic a Ig: -Transportul transplacentar al unor Ig (Ig G) -Fixareape diferite celule (mastocite, bazofile, fagocite, limfocite, etc.) -Capacitatea de a fixa complementul -Capacitatea de fixare a proteinei A a stafilococilor -Definete clasele i subclasele de Ig (specificitatea antigenic a catenei H)

Anticorpii

Anticorpii Monomerul de
Igeste constituit din 2 fragmente Fabi unul Fc. ntre ele se afl zona balama, responsabil de flexibilitatea moleculei de Ig. Numrul paratopilordetermi n valenaIg. Ac cu 2 sau mai muli paratopise numesc Ac complei, cei cu un singur paratopAc incomplei.

Anticorpii

Ig G, Ig Di Ig E sunt monomeri, Ig A din ser monomeri, din secretele mucoaselor dimeri, Ig M sunt pentameri. Proprietile claselor de Ig Ig G(4 subclase IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)reprezint 75% din ansamblul Ig serice. Constanta de sedimentare-7S, greutatea molecular-150kDa. Sunt unicele Ig capabile s traverseze bariera placentar.Fc alIgG arecentre de fixare a complementului (activarea C pe cale clasic), a macrofagelor i neutrofilelor (rol n opsonizare), a proteinei A a stafilococilor. Perioada de semi-via 21 zile. Manifest activitate opsonizant, antibacterian, antitoxic, antiviral.

Ig G(4 subclase IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)reprezint 75% din ansamblul Ig serice. Constanta de sedimentare-7S, greutatea molecular-150kDa. Sunt unicele Ig capabile s traverseze bariera placentar.Fc alIgG arecentre de fixare a complementului (activarea C pe cale clasic), a macrofagelor i neutrofilelor (rol n opsonizare), a proteinei A a stafilococilor. Perioada de semi-via 21 zile. Manifest activitate opsonizant, antibacterian, antitoxic, antiviral.

IgM5-6% din totalul Ig. Pentamer. Constanta de sedimentare-19S, greutatea molecular-900kDa. Se distrug sub aciunea mercaptoetanoluluisau cisteinei. Semi-viaa 5 zile. Fixeaz si activeaz complementul pe cale clasic. Nu traverseaz placenta, prezena IgM la nou-nscut denot infecie intrauterin.Sunt primele care apar dup un stimul antigenic primar i indic un proces infecios acut. Monomeri de IgMconstituie BCR pe B-limfocite

IgA15% din totalul Ig. CS -7S, GM 160 kDa. Bogate n glucide. Se disting 2 subclase: IgA1 (93%) i IgA2 (7%). Semiviaa6 zile, nu traverseaz placenta, nu activeaz complementul pe cale clasic. -IgA serice(monomeri) 6% din totalul Igserice. Agregate de IgApot activa complementul pe cale alternativ. -IgA secretoare (sIgA)saliv, lacrimi, colostrum, lapte, secreii gastro-intestinale, nazale, bronhice. Dimer. Asigur protecia mucoaselor, blocnd ataarea bacteriilor i virusurilor de receptorii mucoaselor

Anticorpii

Ig D0,2% din totalul Ig. CS 6,5S, GM 170 kDa. Semiviaa 3 zile. Rolul receptor pentru Ag (BCR) pe LB; posibil particip laeliminarea limfocitelor B care produc autoAc (Ac autoreactivi). Ig E0,002 -0,01%, CS 7,9S, GM 185 kDa. Semiviaa 2-3 zile. Nu traverseaz placenta, nu fixeaz complementul. Termolabile (inactivate la 56C n 30 min). Se pot fixa pe suprafaa mastocitelor i bazofilelor, determinnd degranularea lor cu eliberarea unor amine vazo-active (oc anafilactic, dereglri alergice). Eficiente n afeciuni parazitare (opsonizarea helminilor i artropodelor) .

Anticorpii

Anticorpii sunt efectorii principali ai imunitii umorale, iar limfocitele Tc i macrofagele activateale imunitii celulare. Imunitatea umoral este eficace contra bacteriilor non-invazive (extracelulare), virusurilorliberei contra toxinelor. Imunitatea celular intervine n special contra paraziilor intracelulari (bacterii, virusuri) i celulelor proprii modificate (tumorale)

Tesuturi si organe limfoide

Figura reprezinta limfocitele circulante

Tesut limfatic difuz si nodular

Tesutul limfatic nodular este totdeauna gasit inconjurat de tesut limfatic difuz si este mai bine organizat . Tipic exemlu de tesut limfatic nodular este centrul germinal care este o adunare foarte bine struicuturata de limfocite B care se gaseste in ulnele organe limfatice. Centrele germinale nu apar niciodata in afara organelor limfaice care reprezinta un bun mediu penru ele. Tesutul limfatic din afara organelor limfatice este difuz. Nodulul limfatic este un organ anatomic specific animlelor superioare si consta din tesut limfatic difuz si in multe cazuri tesut limfatic nodularin forma de centre germinale, de asemenea.)

Splina
Splina este parte din sistemul circulator limfatic si este un organ limfatic Serveste ca depozit pt sange Distrugerea eritrocitelor batrane, etc. In imagine Benzile roz sunt septe si trabecule (T) ce subdivid splina in interior organul are si o capsula ce formeaza iun to c trabeculele (C). PALS inseamna i nacest caz peri-arteriolar-lymphocytesheath, ce este o asociere de vase de sange si limfocite

Ganglionul limfatic

Este cel mai organizat organ limfatic in forma de boaba d fasole cu o depresie pe una din parti, denumnita hil pe unde intra si ies vasle sanguine in timp ce vaslee limfatice intra pe la periferia organului si ies prin zona hilului. Ele sunt prezente pe traseul vaselor limfatice mai mari

Structura unui ganglion limfatic

Timusul

Timusul este organul limfatic primar la mamifere, i prezena precum i funcionalitatea sa este necesara pentru immunocompetenta pe deplin stabilita. ntr-un mutant de soareci, nud, timusul este absent congenital, iar aceste animale trebuie s fie adpostite ntr-un mediu steril, deoarece acestea au un sistem imunitar functional. Timusului are trei tipuri principale de celule: imocites, de exemplu, limfocitele timusului, cateva macrofage, precum i de celule specializate epitelioreticulare, celule stelate care ofer un cadru de sprijin (stroma) pentru a parenchimul timic. Stroma timusului nu este de natur fibrilara. Este n ntregime celulara. Celulele epitelio-reticulare sunt n form ramificata,

Alte structuri limfatice

Cteva dintre ceea ce ar putea fi numit "organe limfoide diverse" sunt mprtiate n diferite locuri din organism. n timp ce mase de tesut limfatic neorganizat difuze pot fi gsite n aproape orice CT sau orice alt organ epitelial, n aceste "diverse" organe are organizarea regulata a esutul limfoid nodular, care arat de multe ori centre de germinale.

Amigdalele

Imaginea reprezinta sectiune a amigdalelor palatine. Amigdalele sunt gsite n asociere cu cavitatea bucal, i poate fi uor de identificat prin suprafaa lor de acoperire a epiteliului scuamos stratificat.

O cantitate semnificativ de tesut limfatic este asociat cu mucoasa umane. Asociat mucoasei tesutului limfoid (MALT) este risipit de-a lungul garniturilor mucoaselor, de msurare aproximativ 400 m2. Acesta este componenta cea mai extins a tesutului limfoid umane. Aceste suprafee proteja organismul de o cantitate enorm i varietate de antigene.Amigdalele, patch-uri Peyer n intestinul subtire, apendice vermiform i sunt exemple de asociat mucoasei tesutului limfoid (MALT). Interaciunea complex dintre antigeni, celule, citokine i rezultatele ntr-un rspuns imun foarte eficient Nomenclatura ncorporeaz Locul de amplasare; prin urmare, -tesutului limfoid asociat mucoaselor (MALT) - tesutului limfoid intestinal (Galt), -tesutului limfoid asociate mucoaselor bronice / traheale- (Balt), tesutului limfoid asociat mucoasei nazale (NALT), tesutului limfoid asociate mucoasei vulvo-vaginale (VALT). Suplimentare asociat mucoasei tesutului limfoid (MALT), exist n cadrul organelor accesorii ale tractului digestiv, n special glandele parotide

Tesuturi limfoide

Course 12.Types of immune response, types of inflammation

Western University Vasile Goldi Arad Faculty of Medicine, Pharmacy and Stomatology Dr.biol. Sergiu Fendrihan

Types de reponse immune

Le reponse immune
1.

Phase cognitif . Les lymphocytes T sont capable de reconnaitre les antigenes etrangeres avec le CMH. Phase de proliferation et diferentiation des lymphocytes.

2.

3. Phase efectrice les lymphocytes sont actives pour elimination des antigenes.

I. Le reponse immune humorale

Soarta antigenelor depinde de calea de ptrundere in organism

Dans le sang dans la rate ou le reponse immun va etre .... Par le tegument par voie lymphatique chez le premier ganglion lymphatique Par passage par les muqueuses - MALT

Raspunsul imun umoral

Interrelaiile dintre limfocitele B i T

Antigene

Macrofage

Limfocit Helper T

Limfocit T c

Limfocite B
Limfocite B avec memoire

Distrug celulele infectate

Limfocit T c cu memorie

Plasmocite

Anticorpi

Complexe Ag-Ac

Rspunsul imun specific, adaptativ dobandit

1.Faza cognitiva

In organele limfoide, antigenele sunt prelevate prin fagocitoza de macrofage. -antigenele vor fi digerate de catre enzimele lizozomale si apoi et epitopii secventiali vor fi eliberati(peptide scurte). -epitopii secventiali sunt fixati pe suprafata macrofagelor care le prezinta celulelor LTh asociate cu CMH de clasa II.

Antigenele complete : Imunogenitate + antigenitate Haptenele (antigene incomplete): nu au imunogenitate

Antigenitate +++ Ele sunt imunogene numai in asociere cu o molecula caraus (carrier). Efectorii iminitari rezultati vor reactiona cu haptena neasociata cu carausul
Limfocitul

T recunoaste carausul

Limfocitul

B recunoaste haptena

Interactiunea dintre LTh si LB

Prelevarea antigenului

CPA CD4 CMH II TCR Citokina Limfocitul T helper Limfocitul B

2. Faza de activare (proliferare)

n contact cu un LTh (a crui receptor este complementar antigenului i poart la suprafa antigenul CD4), se produce un semnal care va stimula: secreia de IL-1 de ctre macrofag. IL-1 va aciona asupra LTh care va secreta IL-2, IL-2 va induce creterea celulelor ce au receptori pentru aceast IL, printre care chiar LTh (activare autocrin). LB este stimulat la rndul su de epitopul structural, neprelucrat, nativ (in timp ce LTh este stimulat de epitopul secvenial, prelucrat i prezentat de macrofage, al unui antigen)

Epitopul structural este un prim semnal pentru LB, dar insuficient pentru a produce un rspuns n anticorpi. Aici intervine LTh care a fost stimulat de epitopul secvenial al aceluiai antigen. LTh va secreta dup activare un factor de cretere i un factor de difereniere pentru limfocitele B,

3. Faza efectoare

LB se vor transforma n limfoblati, plasmoblati i n final plasmocite secretoare de anticorpi care impreun cu complementul, fagocitele vor elimina agenii infecioi extracelulari. n decursul rspunsului imun o parte din LTh i LB se vor diferenia n LT, respectiv LB de memorie, care vor iniia o stimulare ulterioar cu acelai Ag un rspuns secundar mai rapid i eficient. n afar de Ag TD mai exist i Ag TI. Acestea sunt n general antigene cu epitopi repetitivi (care se repet n mod regulat de-a lungul moleculei ca, de exemplu, polizaharidul pneumococic). Ele stimuleaz direct LB, fr participarea LT. Aceste antigene induc un rspuns n anticorpi discret i fr memorie imunologic.

Activarea unui limfocit B de catre un antigen independent de celulele T

Determinantii antigenici repetitivi si identici interactioneaza cu mai multi receptori de suprafata a celulelor B si induc productia de Ig M

Opsonizarea

Bacteriile sunt pregatite pentru fagocitoza prin opsonizare cu opsoninele nespecifice (C3b, PCR, fibronectina) sau specifice (AC). Bacteriile cu capsula (pneumococii), nu sunt accesibili pentru fagocitoza. Prin opsonizarea lor cu IgG anticapsulare, se vor fixa cu fragmentul Fc prin fagocit si cu segmentul Fab cu bacteria si astfel fagocitoza devine posibila Bacteriile extracelulare vor fi eliminate prin fagocitoza.

4.Liza bacteriilor.
Prin

asamblarea IgG sau IgM cu antigenii de suprafata, complementul este activat prin modul clasic ceea ce va determina bacterioliza.

AC sunt implicati in rezistenta contra microorganismelor intracelulare ca si cytotoxicitatea mediata pe cale celulara anticorpodependenta: de alti germeni intracelulari (fungi, bacterii) exprimate la suprafata celulelor infectate si cu fragmentul Fc este legata de receptorii pentru Fc de la suprafata celulelor LK (killer). Limfocitele K vor distruge celula infectata prin perforarea membranei celulare.

IgG se fixeaza prin Fab de antigenele virales sau

II. Raspunsul imun celular

Este eficace contra microorganismelor cu habitat intracelular : virusi, bacterii, protozoare sau cu habitat intracelular facultativ ca bacilul tuberculozei, bacilul leprei care sunt protejati contra actiunii anticorpilor .

Raspunsul imun celular

Imunitatea mediat celular cuprinde n esen dou procese: 1. distrugerea de ctre LTc CD8+ (ajutate de LTh) a celulelor care conin un microorganism n faz replicativ (de obicei un virus) 2. activarea prin IFN i altor citokine a macrofagelor pentru a le face capabile s distrug microorganismul care se dezvolt chiar n interiorul lor (bacilul tuberculos, bacilul leprei, toxoplasma, legionella etc.)

RaspunsulLTc CD8+ (ajutate de LTh) imun celular 1. n prima situaie:

rspunsul celular este declanat de LTh activat de macrofag. Astfel, un virus este fagocitat de macrofag, care prezint limfocitului Th epitopul secvenial n asociaie cu CMH de clasa II. Pe de alt parte, virusul ptrunde i n alte celule dect macrofage. Antigenele virale modific imunogenicitatea acestor celule, care devin astfel non-self. Celulele nucleate ale organismului au la suprafaa lor CMH de clasa I n asociaie cu care Ag de suprafa aprut datorit infeciei virale va fi vzut de LTc. Acestea se vor nmuli sub actiunea IL-2 secretate de ctre LTh stimulat de macrofage. Rezultatul va fi c LTc activate vor secreta citotoxine letale pentru celula infectat de virus.

Ca i n cazul LTh i LB, o parte din LTc se vor diferenia n limfocite Tc de memorie, capabile s iniieze un rspuns celular mai prompt la un al doilea contact cu acelai antigen

2. n infeciile cu germeni cu habitat facultativ intracelular (TBC, lepr etc.),

un rol important l au macrofagele i LTh. Acestea secret limfokine care activeaz macrofagele i recruteaz i alte celule participante. mpreun vor iniia un rspuns inflamator, denumit de tip ntrziat - deoarece, el apare dup cel puin 24-48 de ore, sau chiar mai trziu (spre deosebire de rspunsul inflamator iniiat de anticorpi, care apare n timpul cel mai scurt minute sau ore).

O parte din microorganismele care i desfoar ciclul de via i supravieuiesc n macrofage mor, iar produsele lor de degradare prelucrate vor ajunge la suprafaa acestor celule. Macrofagul va prezenta LTh aceste Ag n asociaie cu antigenul CMH de clasa II. LTh va declana secreia de gIFN care va transforma macrofagul ntr-un macrofag activat sau furios.

Factorii de activare a macrofagelor (mai ales IFN) vor activa mecanisme microbicide puternice care vor reusi de regul distrugerea microorganismului aflat n celul, dar nu ntotdeauna.

Activarea unui macrofag de catre un factor de activare a macrofagilor MAF limfokinele sunt produse de catre celulele T care au fost stimulate de catre un antigen raftled membrana plasmatica indica activarea macrofagelor

Rspunsul primar i secundar

1. rspunsul imunologic primar - organismul vine n contact pentru prima oar cu un antigen timodependent LT i LB de memorie 2. Rspuns imunologic secundar rentlnirea cu acelai antigen - receptorii pentru antigen se gsesc n concentraie mai mare dect la prima ntlnire probabilitatea ntlnirii partenerilor de reacie potrivii crete, reacia imunogenetic decurgnd mai rapid. .

Rspunsul primar
perioad de laten, a crei durat depinde de natura antigenului i care dureaz n general 2 sptmni,

o faz de cretere, n cursul creia apar anticorpii, titrul lor crescnd n progresie geometric, - IgM o faza n platou, n care AC se menin la un nivel costant pentru cteva sptmni o faz de descretere, n care AC sunt metabolizai i dispar

Rspunsul secundar
1. cinetica rspunsului: faza de laten n rspunsul secundar este mai scurt (3-5 zile), faza de platou prelungit (luni) i descreterea mai lent (luni, ani, uneori pe toat viaa). 2. nivelul de anticorpi: titrul maxim de anticorpi este n general de 10 ori mai mari dect n rspunsul primar. 3. clasa de anticorpi: AC din rspunsul primar sunt IgM, iar cei din rspunsul secundar IgG. 4. afinitatea anticorpilor: n rspunsul secundar, afinitatea anticorpilor fa de antigen este mai mare dect n rspunsul primar. Amplitudinea i rapiditatea rspunsului secundar sau a unor rapeluri ulterioare - memoria imunologic.

Reglarea rspunsului imun

Multiplicarea la nesfrit a efectorilor imuni este supus unor mecanisme riguroase de reglare . 1. Durata de via relativ scurt a celulelor efectoare (plasmocitele, de pild, au o durat de viaa de cteva zile). 2. Scderea progresiv a cantitii de Ag pn la dispariia sa. Scopul nsi al aprrii antiinfecioase este eliminarea agenilor infectioi din organism. ndeprtarea lor nseamn implicit dispariia stimulrii antigenice .

Reglarea raspunsului imun

3. Legarea AC de Ag previne recunoaterea n continuare a acestora de ctre LB. n consecin, proliferarea lor i diferenierea spre plasmocite va fi oprit.
4. LTs, care au un rol limitativ asupra rspunsului imunitar, prolifereaz pe msur ce se nmulesc LTh. Acest mecanism de feedback permite autoreglarea activitii a celor dou subpopulaii de limfocite

Concluzii
n prima etap,
asupra miroorganismului vor aciona factorii aprrii nespecifice prin barierele externe ce se opun atarii i ptrunderii. o dat ajuns n esuturile sterile, microorganismul va fi supus aciunii factorilor interni ai rezistenei naturale (complementul, interferonii, citokinele, substane bacteriolitice, fagocitoza prin PMN i macrofage, celulele NK etc.). n anumite situaii, microorganismul va fi distrus prin activitatea bacteriolitic a complementului i prin fagocitoz. Dac distrugerea i eliminarea microorganismului este incomplet, se vor distruge PMN i vor interveni macrofagele care prelucreaz ag i iniiaz faza urmtoare.

Etapa 2-a: stimularea sistemului SCIC care va produce efectorii imuni (AC i L sensibilizate) fa de microorganismul respectiv. Etapa<3-a: aciunea concertat, sinergic a celor dou componente ale aprrii antiinfecioase: nscut i dobndit. Astfel, AC vor activa, n combinaie cu Ag, complementul pe cale clasic, mult mai eficient dect pe cale alternativ i vor neutraliza toxinele bacteriene i unele enzime citolitice (leucocidine, hemolizine). La aceasta se adaug citotoxicitatea mediat prin anticorpi a celulelor K i NK. Pe de alt parte, limfokinele secretate de LT dTh activeaz macrofagele prin amplificarea randamentului distrugerii prin fagocitoz a paraziiilor cu habitat intracelular.

Rezultatul aciunii efectorilor imuni :

efect benefic asupra organismului rspuns neadecvat, imunopatologic

sistemul imun nu mai are capacitatea de a discrimina selful de non-self, ceea ce constituie baza bolilor autoimune.
n imunodeficiene, rspunsul este deficitar, lipsa unor efectori imuni producnd infecii repetate i greu de controlat depete n intensitate rspunsul normal determinnd fenomenele de hipersensibilitate.

Inflamation

Inflammation is an immune system response to protect the body from infection. Inflammation occurs when white blood cells migrate out of blood vessels into the infected area, where they act as phagocytes (destroyers of foreign matter). The white cells can also wall off the infected area, preventing its spread to other parts of the body. A secondary aspect of inflammation involves the movement of protein containing fluids to the affected area. The dilation of upstream and constriction of downstream blood vessels to the infected area results in a loss of blood plasma at the site, which leads to swelling. Pain results from the compression of nerve endings that the swelling causes. Inflammation progresses through four stages: Redness Heat Swelling Pain Inflammation can also bring on general flu-like symptoms such as fever, chills, fatigue, loss of energy and headaches. In some cases the inflammation response can be triggered even when there is no foreign invader. Such is the case with auto immune diseases such as rheumatoid arthritis and shoulder tendonitis. In these cases the bodys protective system actually causes damage to itself. Inflammation as a response to injury is non-specific in that it occurs in an identical manner regardless of the situation that prompts it. Inflammation is a necessary and integral part of the immune system. However, excess or chronic inflammation can be damaging to our health. Recent research indicates that inflammation may be a major contributor to atherosclerosis, Alhzeimers disease and some cancers. In fact, excessive inflammation is a by-product of many diseases.

Inflamatia

Basically, inflammation can be divided into acute or chronic. Acute inflammation is of short duration, ranging from a couple minutes to a few days, and is the initial response of the body to a foreign substance or harmful stimuli. The stimulation results in increased movement of plasma and white blood cells into injured tissues. Chronic inflammation is the result of inflammation being prolonged for a period of time, it may last for weeks, months or even years. It results in a change of the type of cells at the site of the inflammation. Two other, less common types of inflammation are sub-acute inflammation and granulomatous chronic inflammation. Sub-acute inflammation has clinical features of both acute and chronic inflammation it is an intermediary stage between the two. Granulomatous chronic inflammation is a special type of chronic inflammation that is associated with tuberculosis and some lesser known diseases.

Inflamation

Inflammation that has a slow onset and persists for weeks or more is classified as being chronic. The symptoms are not as severe as with acute inflammation, but the condition is insidious and persistent. Chronic inflammation may follow on from acute inflammation or exist by itself. An acute inflammation will become chronic if the immune system is unable to rid the body of the offending foreign agent or if the agent is constantly able to re-enter the body. In the case of persistent infections, such as tuberculosis, and auto immune diseases chronic fatigue will arise without the person first going through the acute inflammation stage. The main cells involved in chronic infection are macrophages and lymphocytes. Because both these cells have a single nuclei, they are known as mononuclear cells. With the aid of chemical mediators such as lymphokines, macrophages do an excellent job of engulfing and neutralizing or killing foreign antigens. Lymphocytes are the predominant cell in chronic inflammation. There are two types, labeled T and B. T-lymphocytes are produced in the thymus gland. They ensure cell based immunity from infection. B-lymphocytes originate in the bone marrow and ensure humoral (bodily fluid) immunity. The activation of B-lymphocytes produces plasma cells, which manufacture and secrete antibodies to fight specific types of antigens. Macrophages and lymphocytes are interdependent in that the activation of one stimulates the actions of the other. Certain chronic infections cells known as eosinophils accumulate. Within their cytoplasm are bright red granules. These granules contain a substance called major basic protein which has the ability to destroy certain antigens. In cases of chronic inflammation involving foreign particulate matter, such as splinters, macrophages cells can fuse together to form multinucleated giant cells. Tuberculosis may also cause macrophage cells to unite in this manner. A key feature of chronic inflammation is collagen production. If too much collagen is formed, this can lead to the condition known as fibrosis. Connective tissue cells known as fibroblasts enter the area of tissue injury and then go to work to produce collagen which is necessary to replace the tissue lost during long term inflammation. The dilated blood vessels which are characteristic of acute inflammation are not evident in cases of chronic inflammation. The two major complications associated with chronic infection are fibrosis leading to scarring and persistence. The overabundance of collagen production over time can lead to scarring that can cause permanent distortion of the tissue, interfering with its function. Chronic inflammation can be continually stimulated by substances with low antigenic properties or by auto-immunity.

Markerii pentru Inflamatii

C-Reactive Protein (CRP): A test that measures the concentration of a protein that is only present in cases of acute inflammation in serum as an indicator of acute inflammation. CRP is produced in the liver. The test is performed by drawing blood from a vein, usually from the inside of the elbow. After the puncture site is cleaned, a blood pressure cuff is placed around the upper arm, causing the veins below the band to swell with blood. A needle is then inserted into the vein and the blood collected. Antiserum is then used to detect CRP levels. While this is a fairly accurate test, a low CRP level does not mean that there is no acute inflammation. CRP may also be elevated in cases of heart attack and many consider elevated CRP levels to be a positive risk factor for coronary artery disease.

CRP is not in itself a contributor to coronary artery disease. It is simply a red flag to the inflammation which is now believed to contribute to atherosclerosis. Fibrinogen: Fibrinogen is a protein that makes the blood sticky. During the blood clotting process, the blood-vessel walls or the clotting factors in the blood release a chemical into the bloodstream. This causes fibrinogen, an inert protein found in blood plasma, to be converted into fibrin. The fibrin molecule is unique in its ability to link together, forming long threads that wrap around the platelet plug. The threads act much like a spider-web, catching more platelets, red blood cells, and other substances to form a clot. Fibrinogen levels also become elevated with tissue inflammation or tissue destruction. Thus, the fibrinogen test is a reliable measure of the amount of inflammation occurring in the body. High fibrinogen levels may also be an indicator of an increased risk of heart or circulatory disease. The changing levels of fibrinogen can also be used to monitor the course of an ongoing inflammation decreased levels indicate an improvement, while increases are indicative of a worsening condition. The fibrinogen test involves taking a blood sample. Normal reference ranges for an adult are 200-400 mg/dL. Risks for the test are minimal, involving slight bleeding from the extraction site. However, people with active bleeding, acute infection or illness should not take this test. Unlike CRP, Fibrinogen is believed to be a direct contributor to atherosclerosis. However, there are currently no medical treatments available to lower fibrinogen levels. Interleukin-6: Interleukin-6 (IL-6) is a cytokine (a chemical which enables communication between cells) which is secreted by T Cells and macrophages as part of the immune inflammation response to trauma. The body makes CRP from IL-6. Elevated levels of IL-6, then, are a reliable indicator of the amount of inflammation occurring in the body. A blood test is used to ascertain the IL-6 level in the body. Adipose tissues make large amounts of IL-6. Increased blood sugar levels also lead to more manufacture of IL-6. Overweight and high blood sugar levels are well known predictors of heart disease. Many in the medical community believe that the inflammation resulting from enhanced IL-6 production is a major contributor to this and other cardiovascular problems. High IL-6 levels have also been found in people with Alzheimers disease. (Alzheimers is increasingly being seen as an inflammatory brain disorder).

Inflamatiile

Cause of Inflammation Inflammation is instigated when pro-inflammatory hormones (cytokines, prostaglandins) signal the white blood cells to isolate and clear out antigens, damaged tissue and infected areas of the body. The inflammatory process then moves into high gear, neutralizing and eliminating the intruder and then beginning the healing process. If such inflammation is acute and ebbs and flows according to specific needs, then the immune system is working efficiently. However, sometimes the inflammatory response does not switch off when the danger has passed. This leads to chronic inflammation. Stress, smoking, high blood sugar levels, bacteria, viruses and parasites are all contributory factors towards chronic inflammation. Some people have a hereditary disposition towards chronic inflammation. Such environmental factors as diet, exposure to toxins, germs, pollutants and inhalants also pre-dispose a person to develop an overactive inflammatory system. Diet has often been overlooked as cause of inflammation. To reduce the likelihood of ones diet being a contributory factor to an out of control inflammatory system, eat plenty of fish and vegetables. Avoid over indulgence in sugary foods, simple carbs and fatty acids. Junk foods should be eliminated from the diet. Foods containing arachidonic acid, such as eggs, organ meats, beef and dairy products promote inflammation. Overcooked foods and those that are cooked at high temperatures should be avoided. This is because foods cooked in such a manner create advanced glycation end products (AGES), which the body treats as an antigen. This promotes the inflammatory response. Over-eating, regardless of the foods involved, can also bring on an inflammatory response. Five or six evenly spaced small meals throughout the day are ideal for those concerned about preventing chronic inflammatory problems. Being overweight can also promote the inflammatory response. Fat cells secrete inflammatory factors such as cytokines and histamines, which bring on an inflammatory response. As one ages the inflammatory system becomes less efficient. Age is also related to increases in systemic markers of inflammation. Insomnia is another condition that can bring on the inflammatory response. When we sleep the immune system is given time to calm down and cytokine secretion slows down. For people with such conditions as rheumatoid arthritis, pain associated with the condition can prevent sleep, which, in turn, causes further pain and discomfort.

Inflamatiile

references

http://www.inflammationremedy.com

Curs I.13. Patogenitatea microorganismelor si infectiei

Universitatea de Vest Vasile Goldi Arad Facultatea de Medicina, Farmacie si Medicina dentara Dr.biol. Sergiu Fendrihan

Patogenitatea microorganismelor

Infectiasuma proceselor biologice produse dupa penetrarea microorganismelor patogene sau potentia patogene in organism . Proces infectios este interactiunea dintre microorganism si organisms in diferite conditii de mediu. Manifestarile pot fi inaparente asimptomatice (eliminarea rapida a microorganismelor si un aspect sanatos) sau simptomatica. Maladie infectioasa manifestarea unui proces infectios caracterizat prin diferite simptome ca resultat al efectului microorganismelor a eliberarii de metaboliti (toxine, enzime,si altele) sau prin reactia imuna a gazdei la prezenta patogenilor.

Patogeneza microbiana

Caracteristicele bolilor infectioase 1.sunt produse de agenti patogeni 2.Contagiozitate (capacitatea de a fi transmise de la sursa la persoana receptiva) 3.Specificitate (un agent produce o infectie ca Clostridium tetani este agentul patogen al tetanusului) 4.o evolutie clinica cu stadii diferite 5.Imunitate la reinfectie Aparitia maladiei depinde de multi factori de abiliatatea patogenului de a produce maladia si de gradul de resistenta al gazdei la infectie.

ROLUL MICROORGANISMULUI N PROCESUL INFECIOS.

Relaiile dintre microorganisme si gazda: 1.Comensalism (flora bucal, intestinal, etc) 2.Parazitism (prezena mi/o este nociv pentru ma/o) Orice microorganism parazit capabil s provoace o infecie (n condiii adecvate) este considerat p a t o g e n. Exist 2 tipuri de mi/o patogene: 1.Obligat (cert) patogene, care infecteaz persoane imunocompetente cu doze mici 2.Potenial patogene(oportuniste), care pot cauza infecie numai cu doze mari sau la persoane imunocompromise (deseori fac parte din flora normal a organismului) Mi/o patogene pot fi gzduite uneori fr a provoca maladia, astfel de persoane sunt numite purttori sntoi de germeni

Patogeneza microbiana

Microorganismele patogene sunt caracterizate de: Patogenitateaeste abilitatea patogenului de a initia infectia si e o caracteristica de specie determinata genetic (cromozom, plasmide bacteriofagi). In cadrul aceleiasi specii pot sa coexiste tulpini ciu patogenitate variabila de la totala absenta la patogenitate inalta. Virulenta arata gradul de patogenitate al unei tulpini (patogenitate cantitativa). Este evaluata prin inoulari de diferite cantitati de inoculum in animale de laborator.

Patogeneza microbiana

Unitati de virulenta: -MLD-(minimal lethal dosis) este numarul minim de patogeni ce este necesar pentru a ucide 80% din animalele de laborator infectate -DL5050% letalitate -DCL 100% letalitate -DI50/DIproduce boala la 50%/sau 80% din animalele totale infectate Modificarea virulentei : -Amplificarea prin transfer genetic recombinare si conditii de crestere optime -Reducerea (atenuare prin mentinerea patogenilor in conditii necorespunzatoare (temperatura,factori chimic si asa mai departe), mutatii

Patogeneza microbiana

Patogenul trebuie sa fie capabil sa: 1. sa fie transmis intre gazde 2. sa penetreze in organismul gazda 3. sa fie capabil sa se raspandeasca in organism 4. sa se multiplice si sa persiste in organism evitand distrugerea lor de catre sistemul imun al gazdei 5. sa produca deteriorari in organism Si abilitatea de a produce factori de patogenitate

Patogeneza microbiana

Factori structurali (somatici) 1. Adezine - fimbrii, glycocalix, proteine de adeziune a peretelui celular ce asigura adeziunea patogenilor la receptorii de suprafata a celulelor tinta sau la proteinele matricei extracelulare (colagen, fibronectina, laminina, elastina, si altele) 2. Proteine ale sistemelor de secretie (tip I-IV) 3. Capsula antifgocitoza, anti-complement 4. Antigen O - antifagocitoza 5. Peptidoglican (adesiune, agresiune tisulara) 6. Acizi teichoici/lipoteichoici (adeziune, toxicitate) 7. Protein A a stafilococilor (antifagocitoza, actiune prin fixarea Fc a IgG) 8. Proteina M a streptococilor (adeziune, antifagocitoza)

Patogeneza microbiana

II. Enzime de patogenitate (responsabile de persistenta, diseminarea si producerea leziunilor) -Plasmocoagulaze (formatrea trombului septic efect antifagocitar , propagare in organism) -Fibrinolizine (eliberarea bacteriilor din trombocites) -Hialuronidaze(diseminare, leziuni tisulare) -Colagenaze (identic) -Neuraminidaze (lichefierea mucusului) -Proteazes (ex.: distrugerea Ig A secretorii) -Dezaminazes -Decarboxilazes -Fosfataze, etc

Patogeneza microbiana

III.Toxine bacteriene (responsabile de leziuni) -Exotoxine (proteice, secretate n mediul extracelular) -Endotoxine (LPZ, legate de celula bacterian) Caracteristici ale exotoxinelor: -Proteine produse de bacterii G+/G-Pot fi secretate n mediul extern, eliberate n spaiul periplasmic sau fixate pe suprafaa celulei -Termolabile (excepie enterotoxina stafilococic i TS (toxina termostabil) a E. coli) -Hidrosolubile i acioneaz la distan -Efectul se instaleaz dup o perioad de incubaie -Manifest tropism (specificitate de aciune)

Patogeneza microbiana

Toxicitate nalt (DLM de ordinul ng/kg) -Exotoxinele sunt imunogene (induc sinteza anticorpilor-antitoxine) -Antitoxinele neutralizeaz activitatea exotoxinei (faza de fixare pe receptorii celulari) -Exotoxinele tratate cu formol 0,4% i meninute la 39-40C timp de 3-4 sptmni se transform n anatoxine. Ele sunt lipsite de toxicitate dar pstreaz imunogenitatea (utilizate n calitate de vaccin).

Patogeneza microbiana

Suportul genetic al exotoxinelor: cromozom (dizenteric), plasmide (toxina antraxului, toxina tetanic), profagi (toxina difteric, botulinic). Tipurile de exotoxine: I.Toxine citolitice Deregleaz membranele celulare prin aciune enzimatic (fosfolipaza /lecitinaza, sfingomielinaza) sau prin formarea porilor (streptolizina O, toxina/hemolizinaS.aureus, leucocidina

Patogeneza microbaiana

II.Toxine citotoxice, de tip AB (acioneaz n interiorul celulei). Ex.: toxina difteric, botulinic, tetanic, holeric, etc Au structur bipartit: fracia polipeptidic B (cell binding) este responsabil de legarea de receptorii specifici din membrana celulei-int, fracia polipeptidic A (active) ptrunde n celul (prin endocitoz sau translocare) i determin activitatea toxic.

Fiecare citotoxin acioneaz strict specific: toxina difteric inhib sinteza proteinelor, -toxina botulinic i tetanic sunt neurotoxine, inhib eliberarea neurotransmitorilor -toxina holeric i pertusic activeaz adenilat-ciclaza membranar, etc

Obinerea exotoxinelor bacteriene

-Cultivarea tulpinii toxigene n mediu lichid -Filtrarea culturii pentru separarea toxinei -Purificarea toxinei -Concentrarea toxinei -Determinarea activitii toxinei (se msoar in uniti de floculare Lf

Caracteristica endotoxinei bacteriene

-Reprezint complexe LPZ din peretele celular G-(cel mai toxic component este lipidul A). -Este eliberat n urma lizei bacteriilor (sub influena sistemului imun al gazdei sau a unor AB). -Termostabil -Ne-imunogen -Nu poate fi transformat n anatoxin -DLM de ordinul mg/kg -Efectul se manifest imediat -Determin efecte generale, indiferent de provenien

Mecanismul de aciune al endotoxinei

LPZ induce secreia unor substane biologic active (citokine pro-inflamatoare: IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-a) de ctre macrofage i alte celule. Iniial LPZ se leag de o protein seric (LPSbinding protein), ulterior acest complex interacioneaz cu un receptor de pe membrana macrofagului, CD 14. Exist i molecule solubile de CD 14, astfel endotoxina poate s acioneze asupra altor celule, de ex.: celulele epiteliale. Un alt receptor macrofagic poate interaciona cu LPZ receptorul toll-like (TLR4

n doze mari citokinele pot provoca ocul endotoxinic (septic), comun pentru toate bacteriile G-: - Febr (eliberarea pirogenilor IL-1, TNF de ctre celulele care au captat endotoxina) - Leucopenie, urmat de leucocitoz - Tulburri de coagulare (activarea factorului XII formarea fibrinei i obstrucia capilarelor sanguine coagulare intravenoas diseminat) - Hemoragii (consumarea factorilor de coagulare) n diverse organe (rinichi, suprarenale, plmni, creier) - Vazodilatare, urmat de colaps vascular (sechestrarea periferic a sngelui, hipovolemie, acidoz metabolic, scderea brusc a presiunii sanguine)

IV. Moduline i invazine

Injectate la suprafaa sau direct n interiorul celulei-int - Induce penetrarea (internalizarea) i propagarea bacterian Se ntlnesc la Yersinia, Shigella, Salmonella, Escherichia

Patogeneza bolilor infectioase

Ptrunderea i rspndirea mi/o n ma/o Sursa de infecie: omul bolnav, reconvalescent, purttor sntos (infecii antroponoze) sau animalele (infecii zooantroponoze) Mecanismele de transmitere 1. Prin contact (direct, indirect) 2. Fecal-oral (alimentar, hidric, etc) 3. Aerogen (aer-praf, aer-picturi) 4. Transmisiv (prin intermediul vectorilor) 5. Vertical (transplacentar)

Infectia
n orice infecie au loc urmtoarele evenimente:
contaminarea (ntlnirea cu agentul infecios), ptrunderea i multiplicarea n organismul gazd prin eludarea rezistenei antiinfecioase, producerea deficientelor morfologice i funcionale, datorate n parte aciunii directe a agentului infecios i cel mai frecvent, reaciilor de aprare ale organismului, deznodmntul infeciei, care poate fi vindecarea cu sau fr sechele, exitusul sau coexistena pe timp ndelungat a celor doi parteneri ai infeciei: agentul infecios i organismul.

Infectii exogene

sunt cele care rezult n urma contactului cu agentul infecios din mediul nconjurtor. Agenii infecioi pot contamina organismul n cele mai variate mprejurri:

pe cale alimentar, respiratorie, contact sexual, manevre medicale, promiscuitatea cu animalele, mucturile de insecte etc.

Modul de contaminare sugereaz aproape ntotdeauna i posibilitile de prevenire nespecifice ale infeciei. n infeciile exogene produse de germenii nalt patogeni, timpul care trece de la contaminare pn la apariia simptomatologiei clinice este n general bine definit (perioada de incubaie).

Infectii endogene

rezult n urma contaminrii cu germeni de pe suprafaa mucoaselor i a pielii. Aceste microorgansime produc infecii dac traverseaz barierele anatomice i ptrund n esuturi (E.coliITU). Pe de alt parte, ageni infecioi din flora normal a organismului, care nu produc infecii la individul sntos, le vor produce la indivizi cu deficiene imune (supui unui tratament imunosupresor, cu deficiene imune genetice, cu deficiene imune dobndite). n ambele situaii contaminarea are loc cu mult nainte de producerea infeciei propriu-zise.

2. Penetrarea

n zone anatomice care sunt n relaie direct cu exteriorul (tubul digestiv, cile respiratorii, cile urinare, cile genitale, conjunctiva etc.) - fr traversarea barierelor epiteliale.

microrgansime: V. cholerae (holera), B. pertussis (tusea convulsiv), C.diphteriae, E.coli (infeciile urinare) etc., unele microorganisme pot trece direct prin pielea intact cum sunt leptospirele i unii viermi, ca, de exemplu, filariile, iar altele pot traversa epiteliul mucoasei respiratorii, digestive, a tractului genitourinar i conjunctiva, prin leziuni traumatice, muctura unor animale (virusul rabic, Pasteurella multocida), nepturile unor insecte (Plasmodium falciarum) sau prin diverse acte medicale efectuate fr respectarea normelor de asepsie (HIV, virusul .hepatitei Betc.).

n esuturile profunde - cu trecerea microorganismelor prin barierele anatomice reprezentate de piele i mucoase.

direct n snge sau n esuturile profunde

3. Multiplicarea

Numrul de microorgansime care ptrund n organism (mrimea inoculului) este n mod obinuit prea mic pentru a produce simptome. Agenii infecioi trebuie s nving mecanismele de aprare antiinfecioas ale gazdei i s se nmuleasc la un nivel corespunztor pentru ca prezena lor n organism s se fac simit. n general, microorganismele se multiplic mai ncet in vivo dect in vitro, tocmai din cauza reaciilor de aprare pe care le declaneaz. Intervalul - de la ptrunderea agentului infecios pn la apariia simptomatologiei clinice se numete perioad de incubaie. Un aspect foarte important, determinant n evoluia infeciei, este sediul multiplicrii microorgansimelor: extra- sau intracelular. Microorgansimele cu habitat extraclelular sunt supuse aciunii complementului, lizozimului, anticorpilor, fagocitozei etc., pe cnd cele cu habitat intracelular sunt protejate de aceti factori, nmulirea lor fiind protejat. Eliminarea lor din organism se face prin distrugerea celulelor n care se afl, ceea ce atrage dup sine producerea unor leziuni tisulare.

4. Infectia

Un proces infecios poate fi localizat atunci cnd germenii se multiplic ntro zon relativ limitat a organismului (abces sau furuncul). Infecia se poate propaga de la poarta de intrare prin continguitate din aproape n aproape i prin diseminare la distan pe cale sanguin sau/i limfatic. n cel din urm caz rezult infecia sistemic sau generalizat. Dintr-un proces infecios localizat, germenii pot fi vehiculai de snge sau limf la diferite organe iniiind o localizare secundar. Un aspect particular al diseminrii microbilor n organism este transportul mediat celular i translocarea. Transportul mediat celular este modalitatea pe care o folosesc microorganismele care rezist digestiei intracelulare a fagocitelor (de exemplu, chlamydiile, gonococii etc.). Ele se vor nmuli n aceste celule i vor fi vehiculate la distan. Translocarea este proprietatea unor germeni de a traversa un epiteliu pentru a ajunge n circulaie (de exemplu, bacilul tific este translocat de ctre celulele epiteliale ale mucoasei digestive i ajunge n circulaie). Prezena bacteriilor n snge se numete bacteriemie iar multiplicarea lor n snge septicemie. Toxemia este prezena n snge a unei toxine secretate sau eliberate de microb fie n afara organismului (toxina botulinic prezent n conserve), fie n organism (endotoxina bacteriilor gram-negative cnd se produce o liz masiv a acestora n snge).

II. Etapele de evolutie a infectiei

perioada de incubaie: intervalul de timp care trece de la ptrunderea microbului n organism pn la apariia primelor simptome.
boli cu perioad de incubaie scurt de 1-7 zile (toxinfecii alimentare, meningite, difterie, gonoree etc.), cu incubaie medie de 8-21 de zile ( febra tifoid, tetanos etc.) i cu incubaie lung de zeci de zile (hepatita B, 60-180 de zile) i foarte lung de ani de zile (tuberculoz, SIDA, lepr etc.).Bolile infecioase ciclice (cu evoluie regulat), ca de pild rujeola, rubeola, varicela, variola etc., au o perioad fix de incubaie. debutul bolii reprezint apariia primelor simptome i poate fi brusc sau insidios. perioada de stare. n aceast perioad se manifest semnele clinice i paraclinice caracteristice bolii. perioada de convalescen n care se refac leziuni i se restabilesc funciile perturbate. Aceast perioada este important deoarece acum pot apare recderi, complicaii sau cronicizarea infeciei. n cazul unei evoluii favorabile se produce vindecarea cu sau fr sechele. n cazuri nefavorabile, boala evolueaz spre exitus sau spre cronicizare.

III. Efectele infectiilor

1. Alterri organice i funcionale datorate agenilor infecioi Alterri mecanice. Obstruciile mecanice se datoreaz reaciei inflamatorii a gazdei ca rspuns la prezena microorganismului. Orice organ tubular poate fi obstruat n anumite infecii, uneori cu urmri nefaste.

obstrucia cilor respiratorii - n difterie. ptrunderea germenilor dintr-o infecie a urechii medii la meninge poate duce la dilatarea ventriculilor cerebrali prin obstruarea circulaiei LCR. n infeciile parazitare. Dac agenii infecioi au dimensiuni mari i sunt n numr suficient, ei pot obstruciona unele ci anatomice vitale. ( Ascaris lumbricoides, poate obstrua un canalicul biliar, iar dac se gsete n numr mare produce un ghem care obstrueaz tubul digestiv)

1. Alterri organice i funcionale datorate agenilor infecioi

Distrugere celular

Bacteriile distrug celulele prin toxinele pe care le secret. Acestea acioneaz fie n apropierea porii de intrare (Shigella), fie la distan de locul unde sunt produse (Corynebacterium diphteriae). La aciunea toxinelor se mai adaug cea a enzimelor hemolitice i leucolitice.
Virusurile cu efect citopatogen produc liza celulelor n care se nmulesc.

Alterri farmacodinamice ale metabolismului.

Toxina tetanic modific metabolismul celulelor motoare ducnd la paralizii spastice, iar cea botulinic interfereaz eliberarea de acetilcolin la nivelul sinapselor colinergice rezultatul fiind paralizia flasc. n ambele cazuri moartea se produce prin paralizia muchilor respiratori. Toxina holeric crete nivelul de AMP-ciclic n celulele epiteliului intestinal, ceea ce are ca rezultat eliminarea unor cantiti mari de ap n intestin cu producerea consecutiv a diareei. Moartea survine prin deshidratare.

2. Alterri datorate reaciilor de aprare antiinfecioas

Puroiul: un amestec de leucocite vii i distruse, bacterii i un exudat. El rezult n urma migrrii rapide a leucocitelor PMN n focarul infecios, stimulate de substane chemotactice produse chiar de bacterii dar i de esuturi sau PMN. Dup distrugerea lor, leucocitele elibereaz n jur hidrolaze puternice din granulaiile lizozomale. Aceste enzime lezeaz esuturile nvecinate, extinznd zona afectat. Abcesul. Cnd puroiul se constituie ntr-o colecie, vorbim de un abces. De exemplu, furunculul se produce prin obstrucia unei glande sebacee, ceea ce ofer stafilococului auriu, prezent n mod normal pe piele, oportunitatea de a se nmuli eficient i de a produce infecia.

Localizarea unui abces este esenial pentru prognostic. Astfel, furunculele cutanate sunt dureroase, dar prognosticul nu este grav n general, pe cnd localizarea unui abces la nivel cerebral este fatal. Pacienii cu deficiene genetice ale funciilor leucocitare sufer de infecii purulente recurente, chiar i n condiiile unui tratament corect cu antibiotice.

2. Alterri datorate reaciilor de aprare antiinfecioas

Reacia de faz acut. Prezena bacteriilor n esuturi elicit o reacie generalizat cunoscut sub denumirea de rspuns de faz acut i care este un mecanism al rezistenei antiinfeciose naturale. Dac intensitatea acestei reacii depsete nivelul fiziologic, ea determin tulburri foarte grave. Bacteriile induc secreia IL-1 care acioneaz asupra centrului termoreglrii, rezultatul fiind febra. IL-1 stimuleaz, de asemenea, sinteza unor substane numite prostaglandine care i ele acioneaz asupra centrului termoreglrii i sunt responsabile de starea general de disconfort pe care o resimim n timpul unei infecii. Endotoxinele bacteriilor gram-negative pot induce i ele rspunsul de faz acut. n doze mici, endotoxinele produc febr i mobilizeaz unele mecanisme de aprare antiinfecioas. n cantiti mari, ele induc ocul endotoxic i coagularea intravascular diseminat.

2. Alterri datorate reaciilor de aprare antiinfecioas

Rspunsul umoral (formarea de anticorpi specifici). n circulaie i n esuturi anticorpii se combin cu agenii infecioi sau cu unele produse ale acestora (toxine, enzime etc.). Aceste complexe antigen-anticorp vor induce, n mod normal, un rspuns inflamator prin intermediul sistemului complement n scopul eliminrii agenilor nfectioi sau a neutralizrii produilor lor toxici.

nu are ntotdeauna un efect protector. La persoane cu predispoziie alergic este posibil sensibilizarea organismului fa de anumite antigenele bacteriene ceea ce duce la instalarea unor stri de hipersensibilitate mediate umoral (de tip I, II sau III). Astfel, de pild, sunt foarte bine cunoscute mecanismele umorale prin care se produc complicaiile alergice poststreptococice cum sunt cardita reumatismal (HS de tip II) i glomerulonefrita acut (HS de tip III).

Rspunsul celular mediat de limfocitele T citotoxice, K, NK i macrofage poate depi n intensitate limitele fiziologice fiind asociat cu inflamaia cronic. Acest aspect se ntlnete mai frecvent n infeciile cu germeni cu habitat predominent intracelular (tuberculoz, lepr) i virusuri.

Inflammatia faze de dezvoltare

IV. Manifestarile clinice ale infectiei

Manifestrile clinice ale infeciei sunt multiple, fiind influenate de o serie de variabile:

factorii genetici ai gazdei i ai agenilor infecioi, doza infectant, calea de ptrundere, factorii de patogenitate ai microbilor, rezistena antiinfecioas a gazdei, considerente anatomice, factorii de mediu i de ali factori pn n prezent necunoscui.

Unele infecii au, n general, acelai tablou clinic la majoritatea indivizilor (holer, cium, dizenterie, rabie etc.). Alteori, evoluia este diferit n funcie de rezistena individului i patogenitatea agentului infecios. Astfel, la unii indivizi infecia poate fi urmat de starea de boal, deci evolueaz cu manifestri clinice, iar la cei la care organismul este capabil s-i mobilizeze rapid i eficient mijloacele de aprare, meninnd multiplicarea agenilor infecioi la un prag sczut, de o infecie inaparent, care va determina doar modificri imunologice, decelabile prin teste de laborator. ntre aceste dou extreme exist diferite nuane care pot fi reprezentate sub forma unui iceberg. (infecia cu virus poliomielitic

Concept of iceberg
Boal acut

Infectie subclinica

Infectie asimptomatic a

IV. Manifestari clinice ale infectiei

After their evolution, the infections are: infectii acute: dureaza in timp limitat si evoluaza spre insanatosire (rubeola, varicella, orellion si altele). Infectii cronice (hepatita B), sau infectii cu patogeni cu evolutie cronica (tuberculoza, sifilis, lepra si altele). Infectii latente : cu patogeni ce stau in organism perioade mari de timp sau multiplicare are loc in mai multe faze si cu recidive (infectia cu herpes). Infectii incete: ce progreseaza foarte incet si sistematic ca viroza panencefalica subacuta .

Rolul agentului cauzal in infectie

Criteriile de apreciere a rolului etiologic al agentului cauzal n survenirea infeciilor specifice (postulatele lui Koch). 1.Bacteria trebuie s fie prezent la toate persoanele bolnave 2.Bacteria trebuie s fie izolat de la bolnav i meninut n cultur pur 3.Cultura pur inoculat la un voluntar sau la un animal experimental trebuie s reproduc simptomele bolii 4.Aceeai bacterie trebuie s fie reizolat de la voluntarulsau animalul infectat Actualmente se insist pe genomul bacterian (prezena genelor de patogenitate)

Rolul gazdei in infectie

Rolul gazdei n procesul infecios. Rezistena nespecific a organismului. Pentru meninerea coerenei celulelor i esuturilor i pstrarea integritii sale ma/o pune n joc 2 categorii de procese aprute succesiv n cursul evoluiei: -Rezistena nespecific, nnscut dezvoltat filogenetic, asigurat de factori constituionali. Rspuns maxim imediat, nespecific, antigen-independent -Imunitatea (rezistena specific)s-a dezvoltat ontogenetic, antigen-dependent i antigen-specific, rspuns maxim peste cteva zile de la agresie, se caracterizeaz prin memorie imunologic.

Rezistenta

Rezistena nespecific
Rezistena nespecific este asigurat de factori tisulari (de barier), factori celulari i umorali. Factori tisulari (de barier) -Tegumentul(barier mecanic -integritatea, descuamarea stratului cornos; barier biologic -flora normal, chimic -pH acid al tegumentului) -Mucoasele(barier mecanic -integritatea, micarea cililor, scurgerea secretelor; chimic secreiile digestive, pH acid al urinei; biologic -flora normal; barier enzimaticenzimele din secreiile mucoaselor, ex.: lizozimul, lactoferina) Dac barierele au fost depite, atunci organismul dispune de ali factori de rezisten nespecific: factori celulari i umorali.

Factori celulari de rezisten nespecific -Reacia inflamatoare. mpiedic multiplicarea i rspndirea microbilor i asigur distrugerea lor. -Fagocitoza (component al reaciei inflamatoare). Asigur captarea i distrugerea substanelor strine, inclusiv a mi/o, celulelor infectate, celulelor tumorale. Celulele fagocitare (fagocitele) 1 -Leucocitele PMN 2 Macrofagele (monociten snge, macrofage fixecel. Kupffer, macrofage alveolare, osteoclaste, microglia, macrofage din splin i ganglioni limfatici

Pentru a interveni, fagocitele trebuie s recunoasc bacteriile ca particule strine. Exist molecule solubile i membranare care pot recunoate componente bacteriene: 1.Solubile-lectinele care se pot lega de manoza din peretele celular bacterian; proteine plasmatice ce leag LPS bacterian 2.Membranarepe macrofage exist receptori de manoz, receptorul CD 14 pentru LPZ, receptori Toll-like (TLR). TLR pot recunoate diferite molecule bacteriene: LPZ, peptidoglicanul, lipoproteine, acizi lipoteichoici, flagelina. Ali receptori: receptori pentru Fc al IgG, pentru complement (CR1, CR3, CR4), pentru interferon, limfokine, lectine, fibronectin, .a.

FAZELE FAGOCITOZEI I. Chemotaxisul (atractani proteine bacteriene, fragmente de perete celular, capsule, endotoxina, chemokine, etc) III. Adeziunea mi/o la fagocit(fagocitul recunoate molecule strine de pe suprafaa bacteriilor monomeri de PG, acizi teichoici, LPZ, acid micolic, ADN bacterian, ARNd.c.viral, manoza,glicani din fungi, etc) Inhibitori capsula, antigenul O, proteina M, proteina A, plasmo-coagulaza, etc. Bacteriile patogene care nu pot fi fagocitate se numesc extracelulare.

Stimulatoricationi de Ca2+, proteina C reactiv, opsonine (fracii de complement (C3b), fibronectina, unii anticorpi). Datorit receptorilor opsoninele acoper suprafaa bacteriilor (opsonizare). Fagocitele de asemenea posed receptori pentru opsonine i astfel faciliteaz adeziunea i ingestia mi/o. IV. Ingestia (nglobarea) i formarea

IV. Distrugerea (digestia) intracitoplasmatic Fagosoma fuzioneaz cu lizosoma, n interiorul fagolizosomei formate mi/o va fi omort sub aciunea enzimelor, anionilor superoxizi, H2O2, pH acid, apoi digerat de enzimele hidrolitice. Produsele degradate pot fi eliminate din celul (PMN, macrofagele) sau dup o selecie i pregtire prealabil (processing) unele peptide vor fi expuse pe membrana macrofagelor n asociaie cu molecule ale CMH. Ele vor contribui la stimularea imunitii prin interaciunea cu receptorul pentru Ag de pe limfocitele T. Aceasta este fagocitoza complet.

Fagocitoza incompletagentul persist i se multiplic n fagocit (micobacterii, gonococi). Cauze:inhibiia formrii fagolizosomei, eliminarea bacteriei din fagosom nainte de fuziunea cu lizosoma, etc). Acetia sunt patogeni facultativ intracelulari

Aprecierea strii funcionale a fagocitelor 1.Procentul fagocitelor active (N -30-60%) ponderea fagocitelor care au nglobat cel puin un mi/o 2.Numrul fagocitar (N -4 -24) nr de mi/o nglobate n mediu de un fagocit Alte celule cu activitate nespecific: celulele K i NK Factori umorali de rezisten nespecific Reactivi de faz acutorganismul supus unei agresiuni reacioneaz prin sinteza i secreia crescut a unor proteine plasmatice: inhibitori de proteaze, proteine ale sistemului complement i ale coagulrii, proteina C reactiv, protrombina, fibrinogenul, etc. Acestea mresc rezistena gazdei, limiteaz leziunile tisulare si favorizeaz vindecarea

Complementul

Complementulreprezint un sistem complex de proteine termolabile solubile i membranare. Se ntlnesc n plasma sangvin, limf i exsudate. Nu se detecteaz n saliv, lacrimi, urin, transsudate. Exist peste 30 de fracii ale C. C1-C9 sunt solubile, celelalte au rol de receptori membranari. Fraciile C1-C9 circul n ser sub form inactiv, care n procesul activrii capt proprieti enzimatice. Activitatea biologic a complementului: -Opsonizarea bacteriilor -Aciune citolitic -Activitate anafilactic stimuleaz chimiotaxisul i activeaz neutrofilele, degranularea mastocitelor i bazofilelor -Activarea limfocitelor B

Curs I.14. Diagnosticul imunologic al bolilor infectioase

Universitatea de Vest Vasile Goldi Arad Facultatea de Medicina, Farmacie si Medicina dentara Dr.biol. Sergiu Fendrihan

Tipuri de diagnostic

Diagnosticul de laborator al unei infecii presupune: 1. Diagnosticul bacteriologic ce const n esen din examenul direct al produsului patologic pe preparate colorate, izolarea germenilor pe medii de cultur i identificarea lor pe baza caracterelor culturale, biochimice, antigenice etc. Examenul microscopic al produselor este foarte important deoarece prezena celulelor inflamatoare (leucocite) confirm diagnosticul de infecie. Interpetarea rezultatelor obinute att prin examinarea direct ct i prin cultur trebuie s in cont de zona anatomic din care s-a recoltat produsul, de flora normal prezent, deoarece n multe infecii, mai ales n cele produse de germeni condiionat patogeni, implicaia etiologic a acestora este dificil. Astfel, de exemplu, izolarea salmonelelor din materiile fecale are ntotdeauna o semnificaie patologic, pe cnd a bacilului coli care face parte din materiile fecale, doar n anumite situaii. Examenul direct i izolarea germenilor n vederea diagnosticului se face nainte de administrarea de antibiotice.

2. Diagnosticul serologic pune n eviden anticorpii fa de un anumit microb. Se efectueaz atunci cnd agentul etiologic bnuit nu se cultiv sau se cultiv greu (de exemplu, n sifilis, hepatit, SIDA etc.) i determin un rspuns umoral interpretabil. Att n diagnosticul bacteriologic ct mai ales n cel serologic se utilizeaz o serie de tehnici imunologice, cum sunt reaciile de aglutinare, precipitare, de fixare a complementului, imunofluorescena, imunodifuzia, Elisa, radioimunodozare, Western-Blot). Cu ajutorul lor se pun n eviden: anticorpi fa de agentul etiologic (sifilis, SIDA, febra tifoid, infecii cu Streptococcus pyogenes, Mycoplasma pneumoniae, Rickettsia prowazeki, Legionella pneumophyla etc.), antigene prezente n organism produse de agenii infecioi cauzali (antigenul HBs, Hbe n hepatita viral B, Chlamydia trachomatis n secreiile genitale etc.). Datele obinute de laboratorul de bacteriologie i imunologie trebuie coroborate ntotdeauna cu cele obinute de medicul clinician care cunoate istoricul bolii, contextul n care s-a produs, elemente care ne ajut n alegerea cii optime de diagnostic i tratament. 3. Diagnostic molecular

Diagnosticul serologic

pune n eviden anticorpii fa de un anumit microb. Se efectueaz atunci cnd agentul etiologic bnuit nu se cultiv sau se cultiv greu (de exemplu, n sifilis, hepatit, SIDA etc.) i determin un rspuns umoral interpretabil. Att n diagnosticul bacteriologic ct mai ales n cel serologic se utilizeaz o serie de tehnici imunologice, cum sunt reaciile de aglutinare, precipitare, de fixare a complementului, imunofluorescena, imunodifuzia, Elisa, radioimunodozare, WesternBlot). Cu ajutorul lor se pun n eviden: anticorpi fa de agentul etiologic (sifilis, SIDA, febra tifoid, infecii cu Streptococcus pyogenes, Mycoplasma pneumoniae, Rickettsia prowazeki, Legionella pneumophyla etc.), antigene prezente n organism produse de agenii infecioi cauzali (antigenul HBs, Hbe n hepatita viral B, Chlamydia trachomatis n secreiile genitale etc.). Datele obinute de laboratorul de bacteriologie i imunologie trebuie coroborate ntotdeauna cu cele obinute de medicul clinician care cunoate istoricul bolii, contextul n care s-a produs, elemente care ne ajut n alegerea cii optime de diagnostic i tratament.

Reactiile imunologice

Studiul i aprecierea imunitii poate fi efectuat prin intermediul diferitor teste realizate in vitro sau in vivo (reacii imunologice). Pentru aprecierea rspunsului imun umoral se studiaz interaciunea dintre Ag i Ac, iar pentru aprecierea imunitii celulare se determin numrul total de limfocite, subclasele limfocitelor T, se evalueaz citokinele, etc

Reactiile serologice

REACIILEANTIGEN-ANTICORP in vitro (REACIILE SEROLOGICE) ReaciaAg-Ac estedeterminat de interaciuneaspecificdintre epitopiiAntigenului iparatopiiAnticorpilor. n acest proces intervin patrutipuride legturi: legturi de hidrogen, legturi electrostatice, foreleVan der Waals i legturi hidrofobe. Legtura Ag-Ac aretrei caracteristici: esteexotermic, specificireversibil.

Reactii serologice

Afinitatea unuiAc pentru un Ag specific caracterizeaz intensitateaforelor de legtur a complexului Ag-Ac. Ea depinde de complementaritatea steric dintre paratop i epitop.

Examen serologic

Aviditatea unuiAc pentru un Ag specific reprezint rapiditatea apariiei manifestrii reacieiAg-Ac (precipitare, aglutinare, etc.). Ea depinde de constanta de asociere, de valenaAc, de numrul de epitopi, de temperatur, de pH, de fora ionic a mediului. Un paratop se poate combina cu un singur epitop, numitspecific. Astfel,dac este cunoscut unul din elementele reaciei-Ag sauAc, poate fi identificat cellalt

Reaciile Ac-Ac (reaciile serologice

Reaciile Ac-Ac (reaciile serologice) au dou direcii de aplicare practic: I.Seroidentificare: Detectarea i dozarea Ag (element necunoscut tulpini microbiene izolate din diferite prelevate) cu ajutorul Ac specifici cunoscui. Pot fi utilizate dou surse de Ac: Ac monoclonali, absolut omogeni, dar care recunosc doar un singur epitop iAc policlonali, ce se conin n seruri imune (antiseruri), care permit legturi de aviditate nalt cu Ag. Serurile imune se obin prin injectarea la un animal de laborator a antigenelor cunoscute. Dup o perioad detimp, serul animalului va conine anticorpi contra acestor antigene. Dar natura exact a Ac din acest ser nu poate fi cunoscut cu exactitate (Ac policlonali). Specificitatea serului trebuie s fie permanent controlat i Ac nedorii trebuie s fie eliminai prin adsorbie.

II. Serodiagnostic:Detectarea i titrarea Ac din serul bolnavilor(component necunoscut) fa de un Ag specific cunoscut (coninut n diagnosticuri). Unele reaciiAg-Ac se manifest direct i pot fi observate de experimentator: de exempluprecipitareasau aglutinarea complexelorAg-Ac, liza unor celule purttoare de Ag pe membrana lor (hemoliz, bacterioliz, etc).

Alte reacii Ag-Ac nu se vizualizeazspontan in vitro. n acest caz se va recurge la nite artificii experimentale, cum ar fi utilizarea Ac marcai: Ac marcai cu un fluorocrom:imunofluorescena. Ac marcai cu un izotop radioactiv: analiza radio-imun. Ac marcai cu o enzim:analiza imunoenzimatic

INTERACIUNEA ANTIGEN-ANTICORP

I.Faza specific: are loc interaciunea dintre Ag i Ac specific corespunztor. Este un fenomen rapid, invizibil, comun pentrutoatereaciileAgAc.Decurge la temperatura de 37 C, n prezena unui electrolit (sol. fiziologic). II.Faza nespecific,vizibil a uniunii Ag-Ac, se manifest prin precipitare, aglutinare, liz, etcfenomene determinate de anumite condiii (valena Ac, dimensiunile Ag, etc).

REACIA DE AGLUTINARE

Din latinagglutinatio -ncleiere Reacia Ag-Ac se poate manifesta prin aglutinareatunci cnd determinantele antigenice sunt purtate de particule figurate(Ag insolubile, corpusculare), iar Acspecifici sunt complei(cel puin bivaleni). Aglutinarea este determinat de formarea unei reele ntre Ag i Ac, ce permite apropierea unui numr suficient de particule figurate pentru a constitui aglutinate vizibile cu ochiul liber. Ac IgM cu 10 epitopi poteniali aglutineaz mai activ dect Ac IgG.

Clasificarea reaciilor de aglutinare

1.Aglutinare activ sau direct, n care particula figurat (Ag corpuscular) este el nsui purttor de determinante antigenice specifice (hematii, leucocite, trombocite, spermatozoizi, bacterii) 2.Aglutinare pasiv sau indirect, n care particula servete doar de suport pentru un determinant antigenic solubil fixat artificial pesuprafaa sa. Frecvent sunt utilizate ca suport hematii formolate, particule de latex sau microcristale de colesterol.

Reactii de aglutinare activa (directa)

Aspect calitativ Reactiapoatefi efectuatapelamade sticlasau in tuburi. Reactiapelama Se amesteca o picatura de sersi o picaturade suspensiebacteriana (Ag). Lecturase facelamicroscop sau cu ochiul liber. In cazde reactiepozitiva apar conglomerate, iar lichidulse clarifica; in cazde reactienegativa,

Reactia in tuburi

In eprubeta se amestec a serul si Ag figurate(hematii, bacterii). Reactiapozitivase manifesta prinformareaunui sediment cu aspect de umbrelainversatalafundultuburilor (peste 20-24 ore)i clarificarea lichidului.Aprecierea intensitaii reaciei se efectueaza dupa sistema de 4 plusuri (++++). Celuleleneaglutinate se sedimenteazalafundultuburilorsubformade buton sau inel(reactienegativa). Lecturase facecu ochiul liber saufolosindoglindaconcavaa

Reactia de aglutinare

Aspect cantitativ Metoda dilutiilor succesive Initial se efectueaza dilutii succesive ale serului (1/50, 1/100, 1/200, etc) in care se introduc ulterior cantitatiegale de Ag. Termostat 2 ore, apoi la t camerei 18-20 ore. Aprecierea: cea mai mare dilutie a serului in care se manifesta aglutinare de cel putin 3 + (+++)se numeste titrul anticorpilor aglutinanti (titrul serului aglutinant). Aglutinarea directa este utilizata pentru determinarea grupelor sangvine sau in diagnosticul unor maladii infectioase (sero identificarea Ag sau depistarea i

Reactia de aglutinare pasiva (indirecta)

Aglutinarea pasiva consta in fixarea unui Ag solubil (sau alunui Ac) pe un suport corpuscular inert, care nu intervine in reactiaAg-Ac. In calitate de suport inert pot servi hematiile, particule de latex, cristale de colesterol. Suspensia de particule sensibilizate cu Ag sau Ac este pusa incontact cu serul imun (respectivcuAg),ca si in cazul aglutinarii directe. Avantajele reactiilor indirecte: facilitatea lecturii si sensibilitatea inalta.

Reactiade hemaglutinareindirecta (pasiva) RHAI / RHAP

Unele antigenede origine polizaharidica se fixeaza practic spontan, dupa o scurta incubatie, pe suprafata hematiilor. Antigenele proteice se fixeaza doar dupa o pregatire prealabila a hematiilor (de ex.: tratarea cu tanina, formol). RHAI se efectueaz in godeurile unei placi din polistiren. Reactia pozitiva se manifesta prin aglutinarea eritrocitelor sensibilizate (umbrela inversata de culoare bruna la fundul godeurilor

n reacia de latex-aglutinare Ac sau Ag sunt fixai pe particule de latex. Reacia se efectueaz pe lama de sticl. Reacia de latex-aglutinare este utilizatain identificarea factorului reumatoid la bolnavisuspectide poliartritareumatoida, in bacteriologie pentruidentificarea rapid a mi/o sau Ag lor n prelevate, sau identificarea tulpinilor izolate, de asemenea pentru serodiagnosticul unor infecii.

Reacia de Co-aglutinare.

La baza acestei reacii se afl proprietatea unei bacterii Staphylococcus aureus(tulpina Cowan) -ce are n componena peretelui celular proteina A-s fixeze Ig G prin intermediul fragmentului Fc. Astfel se formeaz diagnosticuri cu Ac, cu ajutorul carora pot fi identificare Ag respective necunoscute. Reacia se efectueaz pe lam.

amestecat cu Ac corespunzator. Ea poate fi observata sau in mediu lichid, sau solid, fiind sau calitativa, sau cantitativa. Acestea sunt reactii specifice dar putin sensibile, ce necesita cantitati importante de anticorpi. Precipitarea complexelor moleculare rezultate din uniunea Ag-Ac este determinata de formarea unei retele tridimensionale de Ag reunite prin Ac.

Condiiile de formare a reelei de precipitare:

Ac sa fie cel putin bivalent (Ac completi) Ag sa fie multivalent (haptenele nu pot fi precipitate) Precipitarea maxima corespunde cu zona de echivalen, unde Ac si Ag sunt in raport optimal de concentraie, ce permite precipitarea tuturor moleculelor de Ac cu Ag corespunzator.n exces de Ag sau de Ac precipitatul nu se formeaz. Utilizare:n medicina legala (determinarea apartenenei de specie a diferitor proteine: snge, sperm, etc),nigiena alimentar(depistarea falsificriialimentelor), n diagnosticul maladiilor infectioase

PRECIPITAREA IN MEDIU LICHID

Reactia de precipitare inelara Intr-un tub cu diametrul de cinci millimetri se introduce serul imun; pipeta se inclina si pe peretii ei se lasa sa se prelinga incet solutia de Ag, ca sa nu se amestece cu serul. Daca Acdin ser corespund cu Ag, in zona de separare a celor doua lichide se formeaza un inel alb, ceea ce semnifica precipitarea complexului Ag-Ac. Avantajul metodeirapiditatea si simplicitatea. Utilizarea practica: identificarea petelor de sange, depistarea falsificarilor produselor alimentare, depistarea antigenului polizaharidic al agentului antraxului in omogenat de organe (reactia Ascoli

Reacia de floculare (tehnica Ramon)

Se efectueaz diluia succesiv a serului imun (Ac) la care se adauga cantiti egale de Ag. Se ntroduc probele n termostat i periodic se examineaz pentru depistarea tubului n care apare precipitatul iniial (zona de echivalen). Utilizare:pentru determinarea cantitii de toxin, antitoxin sau

Imunodifuzie dubl (tehnicile Ouchterlony i Elek)

Se acoper cu geloz o plac de sticl sau se toarn geloza n cutia Petri. n tehnica Ouchterlony Ag i Ac difuzeaz din godeurile situate la o distan de 15 mm unul de altul. n tehnica Elek cele 2 reactive difuzeaz din benzile de hrtie plasate pe suprafaa gelozei. Moleculele difuzeaz n gel n funcie de greutatea lor i formeaz linii de precipitare pentru fiecare sistem Ag-Ac ce corespund n zona lor de echivalen. Dac dou Ag sunt identice, liniile lor se unesc, dac sunt diferite se intersecteaz. Utilizareadeterminarea toxinelor (toxigeneza), antitoxinelor, Ag proteice

Contraimunoelectroforeza (CIEF) Este util la examinarea amestecurilor antigenice complexe. Lectura este posibila peste 90 minute. Geloza este turnat pe o plac de sticl, Ag i Ac sunt dispui n rezervoare circulare de 2 mm diametru, la o distan de 10 mm. n timpul electroforezeiAg, ncrcat negativ, migreaz spre polul pozitiv, ntlnind Ac care migreaz spre catod. La interaciunea Ag i Ac omologi are loc formarea liniei de precipitare. CIEF servete la examinarea componentelor Ag din lichide biologice: LCR, urin, lichid pleural, ascit, etc

Reactii de citoliza imuna (cu participarea complementlui)

Activarea fraciilor complementului (C) duce la liza particulei purttoare de Ag (hematii, bacterii, diverse celule...) Activarea complementului -Calea clasic -Calea alternativ -Calea lectinic

Activarea C pe cale clasica

Activarea C pe cale clasic Activatorul l constituie complexe Ag-Ac (IgG, IgM) Consecutivitatea activrii C: AgAcfixeaz fracia C1qrs, care capt ulterior activitate esterazic (n prezena obligatorie a Ca++

Activarea C pe cale clasica

C1 activeaz C4, cu formarea complexului AgAcC1C4b. Este apoi activat C2 (AgAcC1C4bC2a), complexul C4bC2 adevenind convertaz ce acioneaz asupra

Activarea C pe cale clasica

Urmeaz clivarea C3 n C3a (anafilotoxin) i C3b, care se unete de complex (AgAcC1C4bC2a C3b), formnd C5convertaza, care cliveaz C5 n C5a i C5b

Activarea C pe cale clasica

C5b se leag de membrana celuleiint. Urmeaz fixarea simultan a C,6,7. La final se fixeaz C8, apoi C9,formnd complexul de atac membranar. Fixarea lor produce leziuni ireversibile liza celulei

Calea alternativ de activare a C

Activatori:endotoxine , celule infectate cu virus, levuri, parazii, venin de cobr, agregate de IgA sau IgE. C1,4 i 2 nu intervin i reacia ncepe cu C3. Properdina, factorul B i ionii de Mg++ sunt obligatorii n procesul de activare pe cale alternativ.

Calea lectinica de activare a C

Calea lectinic de activare a C este determinat de legarea unor lectine pe unele grupri de manoz, carbohidrat prezent n componena multor mi/o i absent la ma/o. Lectina este echivalent fraciei C1q. Alte 2 molecule se asociaz, formnd o enzim similar C1, ceea ce duce la formarea complexului C4bC2a (C3-convertaza)

Componentele reaciilor de liz:

-Ag (celule bacteriene, hematii, etc) -Ac (lizine -IgG i IgM) -Complementser proaspt de cobai sau ser de cobai liofilizat Reacia de bacterioliz (RBL) -Ag suspensie de bacterii vii (vibrioni, leptospire...) -Ac serul imun sau serul bolnavului -Complement

RBL in vitro

-Se efectueaz diluia succesiv a serului -Se adaug suspensie microbian vie -Se adaug complement (martor: Ag+ser fiziologic+C) -Incubare 2 h la 37C -Rensmnare pe cutii cu geloz cte 0,1 ml din fiecare diluie (24h 37C) -Lecturase compar nr coloniilor crescute din martor i probele studiate -Titrulcea mai mare diluie a serului n care au fost lizate cel puin 50% din celule

RBL in vivo

-Amestecul dintre Ag i Ac se inoculeaz intraperitoneal la animale de laborator (ex.: oareci albi) -Peste fiecare 10 min, timp de o or, se extrage lichidul peritoneal, se pregtete un preparat nativ i se examineaz pe fond negru sau cu contrast de faz. -Rezultat pozitiv numrul bacteriilor scade treptat pn la dispariie. Utilizarea RBLdiagnosticul holerei (RVL), leptospirozelor (RALL

Reacia de hemoliz (RHL)

-Aghematii de berbec, suspensie de 3% -Acser imun de iepure anti-hematii de berbec (serul hemolitic) -Complement Principiul reaciei: complexele Ag-Ac formate fixeaz C i-l activeaz pe cale clasic, provocnd hemoliza. Intensitatea hemolizei se apreciaz vizual (++++) sau prin msurarea densitii optice a hemoglobinei eliberate. Utilizarea practic a RHL: pentru dozarea C, precum i n montarea reaciei de fixare a

REACIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI (RFC)

Este o reacie complex, constituit din 2 sisteme Ag-Ac i cu participarea C. n RFC particip Ig capabile s fixeze C IgM i IgG. RFC se utilizeaz n diagnosticul virozelor, infeciilor bacteriene, etc Toate componentele RFC sunt utilizate n acelai volum fiind titrate n prealabil pentru aprecierea dozelor de lucru. Reacia este nsoit de martori ai tuturor componenilor

Reacia se efectueaz n 2 etape utiliznd 2 . sisteme

I etapSistemul de baz este constituit din Ag1(diagnosticuri sau Ag necunoscute), Ac1 (serul bolnavului sau serul imun) i complementn doza de lucru. Amestecul este incubat 1h la 37C sau meninut 16-18 ore la 4C. Dac Ac se combin cu Ag omolog va avea loc i fixarea C (efect frecvent invizibil). II etapla sistemul de baz se adaug sistemul indicator (hemolitic),constituit din hematii de berbec (Ag2)combinate cu Ac specifici serulhemolitic(Ac2).Peste 1h incubare la 37C reacia este terminat. Evaluarea rezultatelordac complementul a fost fixat de primul sistem AgAc hemoliza nu se observ (rezultat pozitiv).Dac Ag1 nu corespunde cu Ac1, complementul rmne disponibil pentru fixare pe sistemul indicator Ag2-Ac2, provocnd hemoliza (rezultat negativ)

Fixarea complementului

Tehnici serologice cu utilizarea Ac marcai

n unele cazuri este imposibil de a detecta o reacie Ag-Ac: unii Ac nu precipiteaz, alii nici nu precipiteaz, nici nu aglutineaz, exist complexe Ag-Ac care nu fixeaz C. n aceste cazuri pot fi utilizai Ac marcai pentru a vizualiza Ag respectiv. Conjugarea Ac cu marcani nu afecteaz proprietile lor imunologice. Aceste reacii se monteaz pe suport solid (lam, plci din plastic) Marcanii utilizai uzual: -Fluorocromi (rodamina, fluoresceina), care emit respectiv o lumin rou-oranj sau verde-galben la tratarea lor cu raze UV (Reacia de Imuno-Fluorescen) -Enzime(fosfataza alcalin, peroxidaza), capabile s modifice culoarea unui substrat (Reacia Imuno-enzimatic) -Radio-izotopi (125J sau 3H), care emit respectiv raze gamma i beta (Analiza Radio-Imun)

Reacia de imunofluorescen (RIF, reacia COONS)

Metoda direct (numai n scop de seroidentificare). Din materialul ce conine Ag(material nativ, cultur pur, biopsie tisular) se prepar un frotiu, peste care se aplic serul imun specific cu Ac marcai cu fluorocrom.Peste 20 min de incubare ntr-o camer umed preparatul este studiat la microscopul luminiscent. n caz de reacie pozitiv se observ luminiscen local. Inconvenient necesitatea de a avea seruri imune marcate specifice pentru fiecare Ag.

Reacia de imunofluorescen (RIF, reacia COONS

Resultat pozitiv si negativ pe virusul rabiei

Principiile imunofluorescentei

Metoda indirect

Poate fi utilizat pentru seroidentificare i sero-diagnostic. Pe frotiul ce conine Ag se aplic Ac corespunztori nemarcai. Peste 20 min se spal minuios preparatul, apoi se adaug anti-Ig fluorescent, care se va combina cu Ac din complex. Acest reactiv poate fi utilizat n numeroase reacii. Anti-Ig se obine prin imunizarea iepurilor (sau altor animale) cu Igumane

Tehnica bazata pe fixarea C

Markerul fluorescent este un ser anticomplement care se va lega de complementul fixat pe complexul Ag-Ac. RIF se utilizeaz pentru identificarea rapid a Ag din bio substrate sau pentru sero diagnostic

Reacia Imuno-Enzimatic (RIE, ELISA -Enzyme Linked Immunosorbent Assays).

Utilizat doar n sero-identificarea Ag. n godeurile din placa de polistiren n care sunt fixai Ac cunoscui se toarn soluia de Ag necunoscut. Se incubeaz 1h. Dup o splare minuioas a godeurilor se adaug Ac marcai cu enzime, care se fixeaz pe epitopii liberi ai Ag polivalent. Dup incubare de 30 min-1h se spal iari godeurile. Prezena complexului Ac-Ag-Ac-marcat se depisteaz cu ajutorul substratului cromogen (substan iniial incolor, dar care se coloreaz sub aciunea enzimei, ex. apa oxigenata si orthofenilendiamina).

RIE indirecta

- RIE indirect. Utilizat n serodiagnostic. Ag cunoscut este fixat la fundul godeurilor. Ac (serul testat) se ntroduce n godeu, dup 1h se spal totul i se adaug ligandul marcat cu enzim (anti-Ig sau proteina A cuplate cu enzim). Acest ligand se fixeaz pe Ac testai. Se adaug apoi substratul cromogen. Cantitatea de Ac se msoar dup densitatea optic a lichidului din godeuri.

ELISA test

ELISA test

Tehnica imunoblot (western blot)

- permite identificarea Ag sau ai Ac dintr-un amestec. I etap electroforeza n gel a probei de Ag II etap transferul electric al Ag pe membrana de nitroceluloz III etap pe membran sunt aplicai succesiv Ac dirijai contra Ag, apoi conjugatul marcat cu enzim, care permite depistarea Ac fixai. Dup o splare se adaug substratul cromogen. Fiecare complex Ag-Ac formeaz zone colorate distincte. Utilizare: depistarea Ac anti-HIV, caracterizarea Ac monoclonali...

Tehnica imunoblot

Imunoelectroforeza Proteinele sunt separate electroforetic

n gel poliacrilamida. Sub aciunea cmpului electric are loc difuzia proteinelor conform greutii moleculare, aranjndu-se n zone liniare subiri diferite: mai aproape de start se aranjeaz proteinele cu mas molecular mare (120-150 kDa), la final se aranjeaz proteinele cu mas molecular mic (5-10kDa). Apoi lamela de gel este transferat pe o foaie de nitroceluloz amplasat ntre electrozii unei surse de curent continuu. Sub aciunea cmpului electric are loc trecerea proteinelor din gel pe nitroceluloz, unde se fixeaz foarte bine pe hrtie. Proteinele fixate sunt marcate cu o enzim (e.g. alkaline phosphatase sau peroxidase) incolor. Procedura ulterioar de montare a reaciei este similar tehnicii ELISA.

Analiza radioimun (ARI)

Principiul este identic cu cel al RIE Ag se fixeaz la fundul godeurilor din placa de plastic. Se adaug Ac testai care se vor combina cu Ag omolog. Dup splarea godeurilor, se adaug un ligand radiomarcat(anti-Ig). Dup eliminarea excesului de izotopi prin splare, se msoar radioactivitatea: ea este proporional cu concentraia Ac dozai.

Reacia de neutralizare (RN):

Formarea complexelor Ag-Ac duce la neutralizarea efectului biologic al Ag (neutralizarea toxinelor, enzimelor, virusurilor). Reacia de imobilizare. Unii anticorpi antibacterieni pot provoca imobilizarea bacteriilor mobile (vibrioni, spirochete)