1.

Objetivo da Prtica

Identificar a presena das metilxantinas cafena e teobromina em diferentes amostras utilizando-se a Cromatografia Lquida de Alta Eficincia e construir uma curva de calibrao a partir de padres das substncias em questo, aplicando o mtodo quantitativo de padronizao externa para determinar o teor de cafena nas dadas amostras.

2.

Descrio das substncias analisadas: Tempo de mdio 3,2 min 2,2 min Reteno Peso molecular 194,19 g/mol 180,16 g/mol

Substncia Cafena Teobromina

Tabela 1:

Estrutura Molecular da Cafena

Estrutura Molecular da Teobromina

3.

Materiais Utilizados

3.1. Materiais e Reagentes 3 Bckers de 100 mL; Funil; Papel filtro; Suporte universal; 3 Bales volumtricos de 100,00 mL; 1 Balo volumtrico de 50,00 mL; Esptula; gua Milli-Q; Seringa e agulha; 3 Filtros 0,45 m hidroflicos; 3 Eppendorfs; Padres de Cafena e Teobromina Concentraes: 1 mg/L; 2 mg/L; 5 mg/L; 10 mg/L; 20 mg/L; 50 mg/L. Amostras de Caf Solvel; Caf Descafeinado e chocolate em p. Metanol 100% Grau HPLC

3.2. Equipamentos Utilizados Placa de aquecimento; Balana analtica; HPLC: Marca: Dionex Modelo: Ultimate 3000

4.

Metodologia

As etapas de preparo da fase mvel, da soluo estoque TC 100 e dos padres, foram feitas pelos monitores.

4.1. Preparo das Amostras: Adicionou-se em trs bckers de 100 mL separadamente, 0,20g de caf solvel, 0,20g de caf descafeinado e 0,50g de chocolate em p pesados em balana analtica. Em seguida, adicionou-se 100 mL de gua Milli-Q em cada e ferveu-se durante cinco minutos. Aps o trmino deste tempo, esperou-se para que as solues retornassem temperatura ambiente e ento transferiu-se quantitativamente cada uma para um balo volumtrico de 100,00 mL e a cada balo, adicionou-se 1,00 mL de duas solues de Carrez e as trs amostras foram agitadas e avolumadas a 100 mL. Antes de ser injetada, a soluo de caf solvel foi diluda 5 vezes e todas as solues foram filtradas em filtro de 0,45 m desprezando os 5 mL iniciais.

4.2. Anlise Cromatogrfica

4.2.1. Ajuste do HPLC: Primeiramente realizou-se a purga do sistema, para a retirada de bolhas de ar, e depois foram aplicadas as condies experimentais (comprimento de onda, fluxo da fase mvel, temperatura da coluna e etc) e por ltimo injetou-se metanol 100% grau HPLC para remoo de impurezas provenientes de corridas anteriores.

4.2.2. Medies: Os padres foram injetados segundo a ordem crescente de concentrao, primeiro TC1 e por ltimo TC50, evitando alterao nas concentraes. Os tempos de reteno e as reas obtidas para cada analito foram anotadas, e foi construda uma curva de calibrao com esses valores. Posteriormente, as amostras, j filtradas, foram injetadas e seus respectivos tempos de reteno e reas foram anotados.

5.

Resultados Resultados obtidos das corridas dos padres. Teobromina Concentrao rea (mg/L) TR (minuto) (mAU.min) 1,0 2,070 1,5479 2,0 2,067 2,8380 5,0 2,067 7,5721 10,0 2,067 16,0806 20,0 2,067 29,0422 50,0 2,067 68,7105 Cafena TR (minuto) 3,087 3,087 3,083 3,083 3,083 3,083 rea (mAU.min) 1,0916 1,9840 5,3017 10,7732 20,9446 51,3236

Padres TC 1 TC 2 TC 5 TC 10 TC 20 TC 50

Tabela 2: Resultado obtido dos padres

Resultados obtidos das corridas das amostras. Teobromina rea TR (minuto) (mAU.min) 2,063 12,8324 Cafena TR (minuto) 3,083 3,083 3,083 rea (mAU.min) 5,0975 1,2815 0,3538

Amostra Caf Solvel Caf Descafeinado Chocolate em p

Tabela 3: Resultados obtidos das amostras

Tempo de reteno mdio da cafena = 3,083 minutos Tempo de reteno mdio da teobromina = 2,067 minutos

6.

Tarefas

a) Descrever as amostras analisadas e listar os equipamentos utilizados (marca e modelo) e as condies de anlise. Aps a filtrao e a diluio, as amostras eram bem translucidas e com uma colorao amarelada. A amostra de caf solvel, j diluda 5x, se apresentou a mais incolor As amostras analisadas, aps a diluio e a filtrao, apresentaram aparncia translcida, a amostra de caf descafenada apresentou uma colorao leve, e o chocolate em p apresentou uma colorao amarela mais intensa, em relao as demais. Segue abaixo as especificaes do aparelho de HPLC usado e das condies de anlise: HPLC Marca: Dionex Modelo: Ultimate3000 Presso das bombas: ~1800 psi Fluxo: 1mL/min

Loop de amostra: 20L Detector: UV-VIS; = 272 nm Fase mvel: 40% MeOH - 60% H2O Fase Estacionria: Coluna C18, marca "Vertical", dimenses: 4,6 x 150 mm, dimetro das partcula de slica eram de 5 m. Lavagem da coluna: 100% MeOH

b) A partir dos valores das reas dos padres, construir a curva de calibrao (rea x concentrao) de cada um dos alcalides purnicos. Calcular os coeficientes angular, linear e R2.

Concentrao (mg/L) x rea

80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 y = 1.3668x + 0.9188 R = 0.9987

rea

Teobromina y = 1.0254x + 0.1968 R = 0.9999 30 40 50 60 Cafena

Concentrao (mg/L)

Teobromina Equao da reta : y = 1,3668x + 0,9188 (R = 0,9987) Coeficiente angular = 1,3668 Coeficiente linear = 0,9188 Cafena Equao da reta : y = 1,0254x + 0,1968 (R = 0,9999) Coeficiente angular = 1,0254 Coeficiente linear = 0,1968

c) Calcular o teor das metilxantinas (% p/p) nas amostras analisadas Teobromina y = 1,3668x + 0,9188 Caf Solvel Abaixo do limite de deteco Caf descafeinado Abaixo do limite de deteco Chocolate em p

Massa pesada = 0,5003 g 500,3 mg

Volume de soluo 100,00 mL rea =12,8324 mAU.min y = 1,3668x + 0,9188 (12,8324 0,9188)/1,3668 = X x = 8,72 mg/L 8,72 mg -----1000mL 8,72*100/1000 0,872 mg Y mg -------- 100mL % (p/p) de teobromina no chocolate em p = 0,872 *100 / 500,3 0,174% Cafena y = 1,0254x + 0,1968 Caf Solvel

rea = 5,0975 mAU.min Massa pesada = 0,2007 g 200,7 mg Volume de soluo 100,00 mL Diluio da soluo preparada : 5x y = 1,0254x + 0,1968 ( 5,0975 0,1968)/1,0254 = X x = 4,779 mg/L Diluio de 5x Soluo concentrada = 4,779 * 5 23,895 mg/L 23,895mg -----1000mL 23,895*100/1000 2,39 mg Y mg -------- 100mL % (p/p) de cafena no caf solvel = 2,39 *100 / 200,7 1,19% Caf descafeinado

rea = 1,2815 mAU.min Massa pesada = 0,2030 g 203,0 mg Volume de soluo 100,00 mL y = 1,0254x + 0,1968 ( 1,2815 0,1968)/1,0254 = X x = 1,058 mg/L 1,058 mg -----1000mL 1,058*100/1000 0,1058 mg Y mg -------- 100mL % (p/p) de cafena no caf descafeinado = 0,1058 *100 / 203,0 0,0521%

Chocolate em p

rea = 0,3538mAU.min Massa pesada = 0,5003 g 500,3 mg Volume de soluo 100,00 mL

y = 1,0254x + 0,1968 ( 0,3538 0,1968)/1,0254 = X x = 0,153 mg/L 0,153 mg -----1000mL 0,153*100/1000 0,0153 mg Y mg -------- 100mL % (p/p) de cafena no chocolate em p= 0,0153 *100 / 500,3 0,00306%

d) Responder: Por que a teobromina tem tempo de reteno menor do que a cafena?

Analisando as estruturas moleculares da cafena e da teobromina, percebe-se que a nica diferena entre elas a presena de um grupamento metila a mais na estrutura da cafena. Tal fato proporciona um maior peso molecular e uma maior apolaridade para a substncia. Como a coluna de fase reversa (natureza apolar), a cafena apresenta maior interao com ela do que a teobromina, por isso seu tempo de reteno maior.

Existe teobromina e cafena em todas as amostras? Justifique.

Como foi visto na tabela 2, todas as amostras continham cafena, mas nem todas continham teobromina. A presena ou no das metilxantinas nas amostras, foi explicada ao comparar os tempos de reteno obtidos para os padres com os das amostras: Tempo de reteno mdio da cafena = 3,083 minutos Tempo de reteno mdio da teobromina = 2,067 minutos A amostra de caf solvel foi a que apresentou maior teor de cafena, o pico respectivo a ela saiu no tempo de reteno 3,083 minutos. Mas no foi detectada teobromina na amostra, nenhum pico foi registrado no tempo de reteno esperado, nem mesmo com uma certa proximidade. O fato citado acima se repetiu para a amostra de caf descafeinado, no qual s foi possvel a deteco da cafena (em menores quantidades). J na amostra de chocolate em p houve a deteco das duas substncias, a cafena, em menores quantidades que as demais, no tempo de reteno 3,083 minutos e a teobromina no tempo de reteno 2,063 minutos. Compare os valores obtidos experimentalmente com os valores esperados ou declarados no rtulo pelo fabricante. Teor de cafena de acordo com a literatura: Caf solvel: 150 a 200 mg/g Chocolate em p: 5,44 mg/g Teores de cafena obtidos na prtica: Caf Solvel: % (p/p) de cafena = 1,19% 1,19mg ------0,1 g x = 11,9 mg/g

X mg -------- 1g Chocolate em p : % (p/p) de cafena = 0,00306% 0,00306 mg -----0,1 g x = 0,0306mg/g X mg -------------1 g Amostra Caf Solvel Chocolate em p Teor de cafena terico 150 - 200 mg/g 5,44 mg/g Teor de cafena prtico 11,9mg/g 0,0306mg/g

Tabela 3: Comparao da dosagem de cafena.

Os resultados obtidos foram muito diferentes dos tericos. Uma certa diferena de valores pode ser explicada por perda de analito no preparo da amostra ou erros de operador, mas essa enorme discrepncia no foi possvel explicar.

7.

Concluso

Pode-se constatar atravs do resultado desta prtica, que o HPLC um equipamento de alta preciso, devido ao bom alinhamento dos pontos na curva de calibrao dos padres injetados e que, atravs dele foi possvel realizar a separarao das substncias desejadas e tambm sua quatificao, chegando a coerentes resultados.

8.

Referncias Bibliogrficas

Apostila, Anlise Insturmental: Cromatografia Lquida de Alta Eficincia. Centro Federal de Educao Tecnolgica de Qumica-RJ Disponvel em: < http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S010040422008000500048&scri pt=sci_arttext> acessado em 06/07/2012.