PERANCANGAN PRIMER UNTUK DETEKSI Fusarium spp.

IIN PREMITASARI

DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2012

Judul Nama NIM

: Perancangan Primer untuk Deteksi Fusarium spp. : Iin Premitasari : G34062196

Menyetujui:

Pembimbing 1,

Pembimbing 2,

Dr. Utut Widyastuti, M.Si. NIP 19640517 198903 2 001

Dwi Sugipriatini, S.Si, M.Si. NIP 19741029 200312 2 001

Mengetahui: Ketua Departemen Biologi

Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si. NIP 19641002 198903 002

Tanggal lulus:

ABSTRAK
IIN PREMITASARI. Perancangan Primer untuk Deteksi Fusarium spp. Dibimbing oleh UTUT WIDYASTUTI dan DWI SUGIPRIATINI. Fusarium adalah salah satu genus cendawan yang paling heterogenus dan klasifikasi berdasarkan morfologi dari spesies-spesies dalam genus ini sangat sulit. Selama ini, untuk mendeteksi dan identifikasi Fusarium spp. dilakukan berdasarkan ciri morfologi koloni dan morfologi mikroskopis seperti bentuk dan ukuran makrokonidia serta ada/tidak ada mikrokonidia dan klamidospora. Identifikasi spesies kompleks Fusarium spp. berdasarkan morfologi, sering menimbulkan kesalahan karena mempunyai ciri morfologi yang sama. Pendekatan molekuler telah dikembangkan untuk mendukung studi sistematika cendawan, termasuk pendeteksian spesifik melalui primer Polymerase Chain Reaction (PCR). Perbedaan ukuran fragmen DNA hasil amplifikasi dengan PCR dapat digunakan sebagai alat untuk membedakan cendawan pada tingkat genus hingga spesies. Penelitian ini bertujuan untuk merancang primer pada daerah 18-28s rRNA dan menguji primer tersebut dengan PCR untuk mendeteksi Fusarium spp.. Analisis primer forward dan reverse menggunakan urutan nukleotida daerah 18-28s rRNA Fusarium spp. diperoleh dari gene bank National Center of Biology Information (NCBI). Urutan-urutan nukleotida yang terkumpul kemudian disejajarkan dan dibuat rancangan primernya menggunakan Primer3. Hasil analisis primer diberi nama Fus1, Fus2, Fus3, dan Fus4. Isolat-isolat uji yang digunakan pada penelitian ini adalah F. graminearum, F. acuminatum, F. culmorum, F. oxysporum, F. proliferatum, F. semitectum, F. solani, F. verticillioides, dan F. equiseti. Pengujian primer dilakukan dengan mengamplifikasi DNA Fusarium spp. menggunakan PCR. Primer Fus1 dan Fus3 mengamplifikasi daerah Internal Trancribe Spacer (ITS) 1 dan 2 menghasilkan amplikon berukuran 650 pb, primer Fus2 mengamplifikasi daerah ITS 1 menghasilkan amplikon berukuran 200 pb, dan primer Fus4 yang mengamplifikasi daerah ITS 2 menghasilkan amplikon berukuran 420 pb. Primer Fus2 mampu mengamplifikasi seluruh isolat uji, sedangkan primer Fus1, Fus3, dan Fus4 berhasil mengamplifikasi enam isolat.

ABSTRACT IIN PREMITASARI. Primer Design for Fusarium spp. Detection. Supervised by UTUT WIDYASTUTI and DWI SUGIPRIATINI. Fusarium is one of the most heterogeneous fungal genera and classification of species within this genus is very difficult. So far, the detection of Fusarium spp. is based on morphological colony and microscopic morphological characteristic such as shape and size of macroconidia and the presence or absence of microconidia and clamydospores. Similarity in one of characteristic of Fusarium spp. species complex can lead to misidentify. Molecular approaches have been developed to support fungal systematic studies, including specific diagnostic by primer of Polymerase Chain Reaction (PCR). DNA fragment size as a result from PCR amplification can used to distinguish fungi from genus until species. This research has a purpose to design PCR primer on 18-28s rRNA region and use it to detect Fusarium spp.. Analysis of forward and reverse primer based on 18-28s rRNA sequences were taken from NCBI. The primer were designed at Primer3. Primer testing were done by PCR amplification. Primer analysis result were named Fus1, Fus2, Fus3, and Fus4. Nine isolates were use in this study are F. graminearum, F. acuminatum, F. culmorum, F. oxysporum, F. proliferatum, F. semitectum, F. solani, F. verticillioides, and F. equiseti. Primer Fus1 and Fus3 amplificate ITS 1 and ITS 2 produce 650 bp amplicon, primer Fus2 amplificate ITS 1 produce 200 bp amplicon, and primer Fus4 amplificate ITS 2 produce 420 bp amplicon. Primer Fus2 was able to amplificate all of the samples, whereas primer Fus1, Fus3, and Fus4 were able to amplificate only six samples.

PERANCANGAN PRIMER UNTUK DETEKSI Fusarium spp.

IIN PREMITASARI

Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2012

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT yang Maha Esa atas karuniaNya, sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Penelitian dalam karya ilmiah ini dilakukan sejak 2010 sampai dengan 2011 bertempat di Laboratorium Genetika Cendawan dan Biorin Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi Institut Pertanian Bogor. Terimakasih penulis haturkan pada program kerjasama IPB Karantina atas nama Ibu Dr. Utut Widyastuti, M. Si atas bantuan dana penelitian yang telah diberikan serta bimbingan dan pengarahan selama penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Terimakasih juga penulis haturkan kepada Ibu Dwi Sugipriatini, S.Si, M.Si. atas bimbingan dan pengarahan selama penyusunan karya ilmiah ini. Terimakasih juga penulis haturkan kepada Ibu Dr. Sri Listiyowati, M. Si selaku dosen penguji wakil komisi pendidikan yang telah bersedia menguji dan memberikan masukan pada penulisan karya ilmiah ini, serta kepada Pak Muzuni, Ibu Hanum, Pak Ulung, Ibu Dini, mbak Pepi dan semua teman-teman di Laboratorium Genetika Cendawan dan Biorin Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB, atas semua bantuan teknis dan saran yang telah diberikan. Penulis juga berterimakasih kepada mamah, Aa, teteh, kakang, semua kerabat dan teman-teman Biologi yang telah memberi nasihat, doa, dukungan dan semangat hingga saat ini. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Januari 2012

Iin Premitasari

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Cianjur, Jawa Barat pada 8 Maret 1988 dari ayah Bubun Bunyamin dan ibu Ai Maesaroh. Penulis adalah putri bungsu dari tiga bersaudara. Pada tahun 2006, penulis lulus dari SMUN 3 Bogor dan diterima di Institut Pertanian Bogor melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru dan pada tahun 2007, masuk Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Penulis aktif sebagai anggota Divisi Informasi dan Komunikasi Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO) IPB pada tahun 2007/2008. Penulis juga berpartisipasi dalam kepanitiaan berbagai acara yang diselenggarakan oleh HIMABIO dan Badan Eksekutif Mahasiswa Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam seperti Biologi Cinta Lingkungan, Revolusi Sains, Lomba Cepat Tepat Biologi, dan Pesta Sains. Penulis melakukan Praktik Lapang di Bina Usaha Flora, Cipanas pada tahun 2009.

DAFTAR ISI
Halaman DAFTAR TABEL..........................................................................................................................viii DAFTAR GAMBAR .....................................................................................................................viii DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................................................viii PENDAHULUAN............................................................................................................................. 1 Latar Belakang.............................................................................................................................. 1 Tujuan ...........................................................................................................................................1 BAHAN DAN METODE .................................................................................................................1 Waktu dan Tempat........................................................................................................................1 Alat dan Bahan ............................................................................................................................. 1 Metode ..........................................................................................................................................2 Perancangan Primer..................................................................................................................2 Pengujian Primer ......................................................................................................................2 Penyiapan Kultur Cendawan ....................................................................................................2 Ekstraksi DNA Genomik dan PCR. .........................................................................................2 Elektroforesis. .......................................................................................................................... 3 Pengurutan Nukleotida Hasil PCR. .......................................................................................... 3 HASIL...............................................................................................................................................3 Perancangan Primer ......................................................................................................................3 Pengujian Primer dengan Amplifikasi PCR..................................................................................4 PEMBAHASAN ............................................................................................................................... 6 SIMPULAN DAN SARAN ..............................................................................................................8 Simpulan .......................................................................................................................................8 Saran .............................................................................................................................................8 DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................................................8 LAMPIRAN....................................................................................................................................10

DAFTAR TABEL
1 2 3 4 Halaman Hasil rancangan primer Fusarium spp........3 Hasil analisis bioinformatika menggunakan megaBLAST dari NCBI...5 Perbedaan urutan nukleotida beberapa spesies Fusarium berdasarkan hasil pengurutan nukleotida................................................................................................................................8 Primer forward spesifik.......8

DAFTAR GAMBAR
1 2 3 Halaman Skema posisi keempat primer pada urutan nukleotida rRNA Fusarium spp...4 Amplifikasi PCR pada rDNA F. graminearum menggunakan berbagai pasangan primer: (1) Fus1, (2) Fus2, (3) Fus4, dan (4) Fus34 Perbadingan hasil amplifikasi PCR menggunakan empat macam primer yang berbeda pada rRNA: (1) 1Kb ladder, (2) F. graminearum, (3) F. acuminatum, (4) F. semitectum, (5) F. proliferatum, (6) F. culmorum, (7) F. oxysporum, (8) F. solani, (9) F. verticillioides, (10) F. equiseti.5

DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3 4
Halaman Urutan nukleotida Input Primer Fusarium spp. berdasarkan 18-28s rRNA.........11 Cara membuat larutan buffer TAE 1x...........12 Cara membuat larutan CTAB 2%.............................................................................................13 Hasil analisis bioinformatika menggunakan megaBLAST dari NCBI.14

PENDAHULUAN
Latar Belakang Fusarium adalah salah satu genus cendawan yang paling heterogenus dan klasifikasi berdasarkan morfologi dari spesies-spesies dalam genus ini sangat sulit. Saat ini, diferensiasi Fusarium didasarkan pada karakteristik fisiologis dan morfologi, seperti bentuk dan ukuran makrokonidia, keberadaan mikrokonidia dan klamidospora, dan morfologi koloni. Perbedaan khas dalam karakteristik tunggal dapat merujuk ke salah satu spesies. (Llorens et al. 2005). Perbedaan susunan nukleotida DNA dari gen telah digunakan untuk mendukung identifikasi morfologi dari spesies Fusarium. Contohnya, berdasarkan karakter morfologi, isolat-isolat dari lahan dan isolat-isolat dari kultur stok, 30 isolat teridentifikasi sebagai F. verticillioides, 20 isolat sebagai F. sacchari, tujuh isolat sebagai F. subglutinans, 12 isolat sebagai F. proliferatum dan sembilan isolat sebagai F. fujikuroi. Sedangkan berdasarkan urutan nukleotida Translation Elongation Factor 1, 23 isolat diidentifikasi sebagai F. verticillioides, enam isolat sebagai F. andiyazi, 29 isolat sebagai F. sacchari, 11 isolat sebagai F. fujikuroi dan sembilan sebagai F. proliferatum (Hsuan et al. 2011). Metode pemeriksaan berdasarkan Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan salah satu teknik alternatif untuk mendeteksi dan mengawasi keberadaan cendawan mikotoksigenik (Suanthie et al. 2009). Perbedaan profil fragmen DNA hasil amplifikasi dengan PCR dapat digunakan sebagai alat untuk membedakan mikroba pada tingkat genus, spesies bahkan genotipe spesifik dari patogen (Edel 1998). Penggabungan metode PCR dan perancangan primer untuk mengamplifikasi berbagai daerah yang terdapat pada DNA ribosom (rDNA) sangat mendukung upaya pengembangan perangkat deteksi cendawan patogen tanaman (Darmono et al. 2006). Urutan nukleotida DNA yang menyandi rRNA telah luas digunakan untuk studi hubungan taksonomi dan variasi genetik pada cendawan. Kelompok gen rRNA ditemukan dalam nukleus dan mitokondria, dan terdiri atas daerah yang sangat konservatif dan daerah variabel yang meliputi gen-gen untuk pembentukan rRNA berukuran kecil (18s rRNA), 5.8s dan

berukuran besar (28s rRNA) yang mengapit daerah Internal Transcribe Spacer (ITS) (White et al. 1990). Daerah ITS biasanya mengalami perubahan atau mutasi sehingga dapat berbeda atau bervariasi di antara spesies (Darmono et al. 2006). Semua urutan nukleotida rDNA yang digunakan pada penelitian ini, berasal dari nukleus dan mitokondria Fusarium spp., data diambil dari gene bank National Center of Biology Information (NCBI). Hasil penelitian ini diharapkan dapat dimanfaatkan salah satunya untuk mencegah penyebaran berbagai penyakit dari negara luar yang disebabkan oleh Fusarium spp. ke Indonesia. Fusarium Head Blight (FHB) yang disebabkan oleh beberapa spesies Fusarium adalah salah satu penyakit utama yang disebabkan oleh cendawan pada sereal di dunia. Di Manitoba (Kanada), FHB mengakibatkan kerugian ekonomi senilai US $300juta pada 19931998 pada komoditas serealia (Windels 2000) dan Fusarium oxysporum f.sp. elaeidis menyebabkan layu pembuluh pada kelapa sawit (Surachmat 1996). Hal ini sangat penting, mengingat kelapa sawit merupakan komoditas unggulan. Selain itu, F. graminearum dapat menyebabkan penyakit scabies pada gandum (Patola 2008) dan F. oxysporum menyebabkan layu fusarium pada tomat (Winarsih 2007). Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk merancang primer pada daerah 18-28s rRNA dan menguji primer tersebut dengan PCR untuk mendeteksi Fusarium spp.

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Februari-Juli 2011, bertempat di laboratorium BIORIN Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), Institut Pertanian Bogor. Alat dan Bahan Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah laptop yang terhubung ke internet, laminar, shaker, mortar, water bath, mesin sentrifugasi merk Jouan, mesin vacuum, mesin spektrofotometri, hot plate, freezer, mesin PCR, mesin elektroforesis, UV translumintor, dan peralatan

laboratorium laninnya. Bahan yang digunakan adalah isolat Fusarium spp. yang telah diidentifikasi secara morfologi, yaitu F. graminearum BIO956 dan F. proliferatum BIO967 yang diisolasi dari biji kakao, F. verticillioides BIO957 yang diisolasi dari beras, F. semitectum BIO969 yang diisolasi dari biji kacang tanah, dan F. equiseti BIO955 koleksi SEAMEO BIOTROP. Selain itu, digunakan pula isolat F. culmorum IPBCC 88.084 yang diisolasi dari tanah ladang gandum, F. solani IPBCC 88.114 yang diisolasi dari Solanum tuberosum, F. oxysporum IPBCC 07.540 yang diisolasi dari serasah penanaman daun meranti, dan F. acuminatum IPBCC 88.017 koleksi IPB Culture Collection (IPBCC) yang tidak diketahui substratnya. Media Potato Dextrose Agar (PDA), media Potato Dextrose Broth (PDB), Nitrogen cair, Cetyl Trimethyl-Ammonium Bromide 2% (CTAB), -mercapto ethanol, Chlorofoam Isoamil (24:1) (CI), Phenol Chlorofoam Isoamil (25:24:1) (PCI), 2 M NaOAC pH 5,2, ethanol 100%, ethanol 70%, ddH2O, RNAse, enzim taq polymerase, empat pasang primer (Fus1 sampai Fus4), dNTPs, taq buffer, DNA template, gel agarosa 1% (b/v), TAE 1x, 1 Kb Ladder, loading dye 6X, dan Ethidium Bromida (EtBr) (5 mg/ml). Metode Perancangan Primer. Analisis primer forward dan reverse menggunakan urutan nukleotida daerah 18-28s rRNA Fusarium spp. yang diperoleh dari NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Urutan nukleotida DNA Fusarium spp. yang digunakan sebagai acuan rancangan primer pada penelitian ini terdiri atas lima daerah konservasi, yaitu 18s rRNA, ITS1, 5.8s rRNA, ITS2, dan 28s rRNA. Masing-masing urutan nukleotida lengkap dari setiap daerah konservasi, disejajarkan untuk mendapatkan urutan nukleotida yang paling seragam sebagai acuan rancangan primer. Setelah itu, primer dirancang berdasarkan daerah konservasinya menggunakan Primer3 yang terdapat di http://frodo.wi.mit.edu/. Hasil rancangan primer yang dipilih adalah primer yang memiliki persentase GC sebesar 50-55%, angka dimer dan hairpin yang kecil, dan suhu leleh (melting) sekitar 60-62 oC. Primer hasil rancangan yang diperoleh selanjutnya disintesis DNA melalui jasa 1st Base, Singapura.

Pengujian Primer. Langkah pertama dalam tahap pengujian primer adalah meremajakan dan menumbuhkan isolat-isolat Fusarium spp. ke media PDB untuk ekstraksi DNA. Hasil ekstraksi ini diamplifikasi dengan PCR menggunakan primer yang telah dirancang sebelumnya. Kemudian, hasil amplifikasi PCR tersebut diurutkan nukleotidanya dan dibandingkan dengan urutan nukleotida dalam gene bank menggunakan megaBLAST yang dilakukan di http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Penyiapan Kultur Cendawan. Sebanyak sembilan isolat spesies Fusarium spp. diremajakan pada media agar miring PDA, kemudian ditumbuhkan ke media agar cawan PDA, dan PDB di atas shaker dengan kecepatan 80 rpm pada suhu ruang, masing-masing tahap peremajaan isolat dilakukan selama 7-10 hari. Miselium disaring dan langsung digunakan untuk ekstraksi DNA. Ekstraksi DNA Genomik dan PCR. Ekstraksi DNA genomik dari cendawan dilakukan dengan metode Bluhm et al. (2002) yang telah dimodifikasi. Sembilan isolat Fusarium spp. diisolasi dari media PDB, diambil secukupnya, disaring menggunakan kertas saring steril, dikeringkan menggunakan vakum, kemudian digerus menggunakan N2 cair dalam mortar. Hasil penggerusan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf yang telah diisi dengan 600 L CTAB 2% (Lampiran 1) dan 1,2 L -mercapto ethanol yang sudah diinkubasi pada suhu 65 oC dalam waterbath. Tabung ependorf yang berisi hasil gerusan ini dibolak-balik dan diinkubasi dalam waterbath pada suhu 65 oC. Setelah 30 menit, diangkat dan disimpan dalam es. Setelah kurang lebih lima menit, ditambahkan 600 L CI (24:1), dibolakbalik, disentrifus pada suhu 4 oC dengan kecepatan 10.000 rpm. Setelah 10 menit, sebanyak 600 L supernatan diambil, ditambahkan 600 L PCI (25:24:1), dibolak-balik, dan disentrifus pada suhu 4 oC dengan kecepatan 10.000 rpm. Setelah lima menit, supernatan diambil secukupnya, ditambah 2 M NaOAC pH 5,2 sebanyak 0,1 x volume supernatan yang diambil, ditambah ethanol 100% sebanyak 2 x volume supernatan yag diambil, dan disimpan dalam freezer. Setelah 30 menit, disentrifugasi pada suhu 4 oC dengan kecepatan 10.000 rpm. Setelah 5 menit, supernatan dibuang, dikeringkan dalam vakum, ditambahkan 50 L ddH2O, ditambahkan RNAse (1 mg/mL)

sebanyak 0,2 x volume, disimpan dalam oven bersuhu 37 oC selama 10 menit, dan diinaktifkan pada suhu 70 oC selama 10 menit. Amplifikasi potongan daerah 1828s rRNA terhadap isolat sampel dilakukan dengan mesin PCR menggunakan primer hasil rancangan penelitian ini. Sebanyak 1 L DNA sampel konsentrasi 100 ng/L dimasukkan ke dalam 9 L mix PCR yang terdiri atas 0,1 L enzim taq polymerase 5 U/L; 0,25 L primer forward 10 pmol (Fus1 sampai Fus4); 0,25 L primer reverse 10 pmol (Fus1 sampai Fus4); 1 L dNTPs 2 mM; 1 L 10x taq buffer; dan 6,4 L ddH2O. Volume campuran reaksi sebanyak 10 L dimasukkan dalam mesin PCR dengan program denaturasi awal 94 oC selama 75 detik, denaturasi 95 oC selama 35 detik, penempelan 56 oC selama 30 detik, dan ekstensi 72 oC selama 1 menit yang dijalankan sebanyak 35 siklus. Setelah itu, dilanjutkan dengan pasca ekstensi 72 oC selama 5 menit dan pendinginan 15 oC selama 10 menit (Jurado et al. 2006). Elektroforesis. Produk PCR selanjutnya dielektroforesis dalam gel agarosa 1% (b/v) dengan marker 1 Kb ladder dalam larutan bufer TAE 1X (Lampiran 2). Sebanyak 5 L DNA hasil PCR dicampur dengan 2 L loading dye 6X kemudian dimasukkan dalam sumur yang terdapat pada gel. Elektroforesis dijalankan pada tegangan 100 volt selama 29 menit. Kemudian hasil elektroforesis direndam dalam larutan ethidium bromida (1 mg/L) selama 5 menit lalu dibilas dengan akuades.

Selanjutnya gel diletakkan di atas UV transluminator dan difoto untuk dokumentasi. Pengurutan nukleotida Hasil PCR. Amplifikasi PCR disiapkan dengan volume campurannya 70 L untuk masingmasing kombinasi menggunakan pasangan primer Fus1 dan Fus2 pada program yang sama. Sebagian hasil PCR ini, sebanyak 5 L digunakan untuk cek elektroforesis. Sisanya dikirim ke perusahaan analisa DNA (1st Base, Singapura).

HASIL
Perancangan Primer Hasil pensejajaran semua urutan nukleotida lengkap Fusarium spp. daerah ITS1, 5.8s rRNA, dan ITS2 serta sebagian urutan nukleotida 18s rRNA dan 28s rRNA memperlihatkan keseragaman tinggi dengan urutan nukleotida Giberella zeae (fase seksual F. graminearum) AB250414.1 dan AY188924.1. Urutan nukleotida hasil pensejajaran ini kemudian disebut dengan urutan nukleotida input primer Fusarium sp. (Lampiran 1). Hasil analisis Program Primer3 diperoleh tiga macam daerah amplifikasi, yaitu 18-28s rRNA (Fus1 dan Fus 3), 18-5.8s rRNA (Fus 2), dan 5.8-28s rRNA (Fus 4) (Tabel 1, Gambar 1).

Tabel 1 Hasil rancangan primer Fusarium spp.

Primer Fus1F Fus1R Fus2F Fus2R Fus3F Fus3R Fus4F Fus4R Gen rRNA 18-28s rRNA Urutan nukleotida primer 5.....3 5 AACCAGCGGAGGGATCATTA 3 5 CACCGCATCAAAGTCATCCT 3 5 ACCAGCGGAGGGATCATTAC 3 5 CGATGCCAGAACCAAGAGAT 3 5 CGGAGGGATCATTACCGAGT 3 5 CACCGCATCAAAGTCATCCT 3 5 AACGGATCTCTTGGTTCTGG 3 5 CCGCATCAAAGTCATCCTC 3 Ukuran amplikon yang diharapkan 653 pb

18-5.8s rRNA

203 pb

18-28s rRNA 5.8-28s rRNA

647 pb 421 pb

Gambar 1 Skema posisi keempat primer pada urutan nukleotida rRNA cendawan

Pengujian Primer dengan Amplifikasi PCR Urutan nukleotida input primer Fusarium sp. digunakan sebagai dasar rancangan primer forward dan reverse pada Program Primer3 di http://frodo.wi.mit.edu/primer3/. Hasil rancangan primer memperlihatkan perbedaan ukuran produk PCR. Primer Fus1 dan Fus3 mampu mengamplifikasi daerah 18s rRNA hingga 28s rRNA berukuran 650 pb amplikon, Fus2 mampu mengamplifikasi daerah 18s rRNA hingga 5.8s rRNA berukuran 200 pb amplikon, dan Fus4 mampu mengamplifikasi daerah 5.8s rRNA hingga 28s rRNA berukuran 420 pb amplikon (Gambar 2). M ) 650 pb 1 ) 2

Pengujian primer dilakukan pada sembilan isolat Fusarium yaitu : F. equiseti, F. graminearum, F. proliferatum, F. verticillioides, F. semitectum, F. culmorum, F. oxysporum, F. solani, dan F. acuminatum. Primer Fus2 mampu mendeteksi sembilan isolat uji, sedangkan primer Fus1, Fus3, dan Fus4 mampu mendeteksi enam dari sembilan isolat uji, sehingga tiga isolat uji, yaitu F. solani, F. verticillioides, dan F. equiseti hanya dapat dideteksi oleh primer Fus2 (Gambar 3). Hasil pengurutan nukleotida rDNA Fusarium spp. menggunakan primer Fus1 dan Fus2 dianalisis menggunakan megaBlast di NCBI (Tabel 2).

420 pb 200 pb

Gambar 2 Amplifikasi PCR pada rRNA F. graminearum menggunakan berbagai pasangan primer: (M) Marker 1 Kb ladder, (1) Fus1, (2) Fus2, (3) Fus4, dan (4) Fus3.

Fus1
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 650 pb

Fus2
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

200 pb

Fus3
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 650 pb

Fus4
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 420 pb

Gambar 3 Perbadingan hasil amplifikasi PCR menggunakan empat macam primer yang berbeda pada rRNA: (M) Marker 1 Kb ladder, (1) F. graminearum, (2) F. acuminatum, (3) F. semitectum, (4) F. proliferatum, (5) F. culmorum, (6) F. oxysporum, (7) F. solani, (8) F. verticillioides, (9) F. equiseti Tabel 2 Hasil analisis bioinformatika menggunakan megaBLAST dari NCBI
Fragmen rRNA sampel F. graminearum Homologi F. graminearum spesies kompleks, yang terdiri dari: F. vorossi NRRL 45800 F. aethiopicum NRRL 46738 F. culmorum NRRL 25475 F. lunulosporum NRRL 13393 F. brasilicum NRRL 31238 F. cortadariae NRRL 31185 F. acaciae-mearnsii NRRL 34207 F. boothii NRRL 29105 F. mesoamericanum NRRL 29148 F. austroamericanum NRRL 28585 F. asiaticum NRRL 29720 F. meridionale NRRL 28723 F. acuminatum NRRL 54217 Fusarium sp. NRRL 34036 F. graminearum spesies kompleks yang terdiri dari: F. aethiopicum NRRL 46738 F. vorossi NRRL 45800 Fusarium sp. NRRL 45833 F. oxysporum f. sp. melonis F. proliferatum NRRL 6413 Fusarium incartatum-equiseti spesies kompleks yang terdiri dari: F. equiseti NRRL 36478 F. lacertatum NRRL 20423 F. solani isolat 10 Gibberella moniliformis strain PUF014 Fusarium sp. 3 TMS-2011 voucher MS2-4 No. Akses Skor Query coverage E value Max ident

F. acuminatum

FJ240315.1, FJ240310.1, DQ459870.1, DQ459868.1, DQ459860.1, DQ459859.1, DQ459854.1, DQ459848.1, DQ459844.1, DQ459839.1, DQ459836.1, DQ459842.1 HM068325.1 (unpublished), GQ505451.1

1181 1181 1181 1181 1181 1181 1181 1181 1181 1181 1181 1181 1205 1208

100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100%

0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99%

F. culmorum

F. oxysporum F. proliferatum F. semitectum

FJ240310.1, FJ240315.1, FJ240316.1 AY188919.1 GQ167230.1

1190 1190 1190 1188 1149

100% 100% 100% 100% 98%

0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

99% 99% 99% 99% 98%

F. solani F. verticillioides F. equiseti

GQ505743.1, GQ505682.1, FJ460589.1 HQ165917.1 HQ630965.1

1175 1175 364 322 368

100% 100% 100% 100% 100%

0.0 0.0 9e-98 4e-85 7e-99

99% 99% 99% 100% 99%

PEMBAHASAN
Perancangan primer pada daerah 18s28s rDNA digunakan untuk mendeteksi Fusarium spp.. Sehubungan hal itu, primer yang dipilih harus mempunyai nukleotida yang sama antara spesies Fusarium. Persamaan urutan nukleotida pada Fusarium diperoleh dari pensejajaran Fusarium spp. dari NCBI kemudian diedit dan selanjutnya dianalisis pada program Bioedit dan Primer3. Hasil pensejajaran urutan nukleotida Fusarium sp. 18s-28s rRNA memperlihatkan bahwa daerah 5.8s rRNA lebih seragam bila dibandingkan dengan daerah konservasi lainnya. Menurut Hershkovitz dan Lewis (1996), daerah 5.8s rRNA bersifat sangat konservatif, sedangkan ITS1 berevolusi sangat cepat dan ITS2 berevolusi dari cepat hingga sangat cepat. Daerah 18s rRNA dan 28s rRNA digunakan sebagai bahan dalam merancang primer universal untuk mendeteksi Fusarium sp. pada berbagai bahan pangan. Urutan nukleotida input primer Fusarium spp. digunakan sebagai dasar rancangan primer forward dan reverse pada Program Primer3 di http://frodo.wi.mit.edu/primer3/. Hasil rancangan primer memperlihatkan perbedaan ukuran produk PCR. Suhu optimal annealing keempat pasang primer terletak antara 54-57 oC, namun pada penelitian ini suhu annealing yang digunakan adalah 56 oC karena hasil amplifikasi terlihat paling jelas, tidak terbentuk dimer di bagian bawah gel agarosa. Perbedaan antara primer Fus2 dengan primer lain terletak pada urutan nukleotida reverse yang tidak komplemen di daerah 28s rRNA seperti reverse pada Fus1, Fus3, dan Fus4 (Gambar 1). Primer-primer dengan target daerah 18s rRNA dan 5.8s rRNA mampu menempel dengan baik, sehingga seluruh sampel dapat teramplifikasi. Sedangkan primer dengan target daerah 28s rRNA tidak menempel pada daerah 28s rRNA, karena perbedaan susunan nukleotida antara primer dan urutan nukleotida target. Hal tersebut merupakan salah satu penyebab tidak muncul pita hasil PCR pada F. solani, F. verticillioides, dan F. equiseti yang menggunakan primer Fus1, Fus3, dan Fus4. Primer forward Fus1, Fus2, Fus3, dan Fus4 menempel dengan sangat baik pada daerah 18s rRNA karena daerah

ini bersifat lebih konservatif daripada daerah 28s rRNA. Urutan nukleotida hasil PCR F. acuminatum, F. oxysporum, dan F. Proliferatum yang menggunakan primer Fus1 identik dengan spesies yang sama. Urutan nukleotida F. graminearum dan F. culmorum homolog satu sama lain dan homolog dengan anggota F. graminearum spesies kompleks (ODonnell et al. 2008), yaitu F. vorossi (FJ240315.1), F. aethiopicum (FJ240310.1), F. lunulosporum (DQ459868.1), F. brasilicum (DQ459860.1), F. cortaridae (DQ459859.1), F. acacia-mearnsii (DQ459854.1), F. boothii (DQ459848.1), F. mesoamericanum (DQ459844.1), F. austroamericanum (DQ459839.1), F. asiaticum (DQ459836.1), dan F. meridionale (DQ459842.1). Selain itu, urutan nukleotida F. graminearum juga identik dengan G. zeae (DQ459831.1) yang merupakan fase seksual dari F. graminearum. Urutan nukleotida F. verticillioides homolog dengan fase seksualnya, yaitu G. moniliformis. Hasil pensejajaran urutan nukleotida F. graminearum dengan G. zeae dan F. verticillioides dengan G. moniliformis, menunjukkan tidak ada perbedaan susunan nukleotida yang menandakan mikroorganisme tersebut berada pada fase seksual atau aseksual (Tabel 2). Isolat-isolat Fusarium spp. yang digunakan dalam penelitian ini merupakan hasil identifikasi berdasarkan morfologi. Namun, hasil pensejajaran urutan nukleotida F. semitectum dengan urutan nukleotida yang terdapat di genbank menunjukkan perbedaan dengan hasil identifikasi berdasarkan morfologi. Urutan nukleotida yang homolog dengan F. semitectum adalah F. equiseti (GQ505743.1), F. lacertatum (GQ505682.1), dan F. incartatum (AY633745.1). Ketiga spesies tersebut merupakan anggota Fusarium incartatum-equiseti spesies kompleks (ODonnell et al. 2009). Fusarium solani, F. verticillioides, dan F. equiseti diidentifikasi menggunakan urutan nukleotida berdasarkan primer Fus2, sehingga amplikon yang dihasilkan jauh lebih sedikit bila dibandingkan dengan hasil urutan nukleotida Fusarium lainnya yang digunakan pada penelitian ini. Hal ini memberikan dampak pada skor dan E-value hasil pensejajaran dengan MegaBlast. Ketika urutan nukleotida yang berukuran 400-650 pb diblast menghasilkan E-value bernilai 0. Sedangkan ketika urutan nukleotida yang

berukuran 200 pb diblast menghasilkan Evalue tidak sama dengan 0. Ukuran amplikon mempengaruhi nilai E-value, ketika ukuran amplikon kecil menghasilkan nilai E-value besar, tetapi saat ukuran amplikon besar menghasilkan nilai E-value kecil. Semakin besar skor dan semakin kecil E-value, semakin baik dan identik hasil pensejajarannya (Tisdall 2001). Nilai Evalue besar menunjukkan tingkat kesalahan yang terjadi ketika proses pensejajaran antara urutan nukleotida input dengan urutan nukleotida yang terdapat dalam basis data NCBI. Hal ini disebabkan oleh ukurannya lebih kecil dari urutan nukleotida yang terdapat di NCBI. Urutan nukleotida F. solani tidak hanya identik dengan F. solani (fase aseksual Nectria haematococca), tetapi juga dengan urutan nukleotida mikroorganisme lain seperti F. oxysporum. Begitu juga dengan urutan nukleotida F. verticillioides, tidak hanya identik dengan G. moniliformis, tapi juga identik dengan Fusarium spp. lainnya. Sedangkan urutan nukleotida F. equiseti, tidak homolog dengan F. equiseti, melainkan dengan Fusarium sp., G. intermedia dan G. moniliformis. Berdasarkan hasil rancangan, primer Fus1, Fus2, Fus3, dan Fus4 merupakan primer universal untuk genus Fusarium karena mampu mendeteksi lebih dari satu spesies Fusarium. Primer-primer tersebut mampu membedakan Fusarium dari genus lain. Hal tersebut dapat dibuktikan dari hasil blast (Tabel 2). Sedangkan berdasarkan hasil pengurutan nukleotida menggunakan primer Fus1, dapat dirancang primer spesies spesifik yang mampu membedakan antara spesies Fusarium. Berbeda dengan primer universal, untuk merancang primer spesifik dibutuhkan susunan nukleotida yang khas pada spesies tertentu agar amplifikasi primer spesifik tersebut hanya akan mendeteksi spesies target. Oleh karena itu, urutan nukleotida F. graminearum, F. acuminatum, F. culmorum, F. oxysporum, F. proliferatum, dan F. semitectum hasil PCR sebelumnya disejajarkan menggunakan program Bioedit

sehingga terlihat perbedaan urutan nukleotida antar spesies. Data urutan nukleotida DNA yang berbeda dijadikan dasar untuk merancang primer forward dan reverse yang baru. Perancangan primer dilakukan dengan memilih urutan nukleotida (21-28 nukleotida) yang berbeda kemudian dianalisis dalam Program Oligocalc di http://www.basic.northwestern.edu/biotools/ oligocalc.html. Hasil pensejajaran urutan-urutan nukleotida Fusarium spp. memperlihatkan adanya kesamaan antara urutan nukleotida F. graminearum dengan urutan nukleotida F. culmorum (Tabel 3). Hal ini disebabkan F. culmorum hasil pengurutan nukleotida penelitian ini termasuk dalam anggota F. graminearum spesies kompleks. Hasil analisis primer forward menggunakan Oligocalc, tidak ditemukan struktur palindrom dan bentuk seperti jepit rambut. Primer-primer dirancang dari urutan nukleotida ITS1 (Tabel 4). Sedangkan Primer reverse dapat diambil dari primer reverse Fus2 atau primer reverse universal untuk fungi. Sampai saat ini terdapat tiga macam urutan nukleotida yang telah dianalisis keefektifannya sebagai dasar untuk mendeteksi Fusarium secara molekuler, yaitu Internal Transcribe Spacer (ITS), Intergenic Spacer (IGS), dan Translation Elongation Factor 1- (TEF 1). Primer Fus2 adalah primer universal untuk genus Fusarium yang dirancang berdasarkan ITS1 dapat mendeteksi Fusarium spp. (Premitasari 2012). Primerprimer yang dirancang berdasarkan IGS merupakan primer universal dan spesies spesifik, dapat mendeteksi kontaminasi Fusarium mikotoksigenik pada serealia (Jurado et al. 2006). Primer EF-1/EF-2 adalah primer spesies spesifik yang dirancang berdasarkan TEF 1- dapat mendeteksi spesies Fusarium dalam spesies kompleks Gibberella fujikuroi (Hsuan et al. 2011). Penggunaan primer-primer tersebut dapat disesuaikan dengan tujuan pendeteksian.

Tabel 3 Perbedaan urutan nukleotida beberapa spesies Fusarium berdasarkan hasil pengurutan nukleotida No. Spesies Urutan nukleotida 1. F. graminearum GAA CAT ACC T-T ATG TTG CCT CGG CGG ATC AGC CC 2. F. acuminatum GAA CAT ACC TTA ATG TTG CCT CGG CGG ATC AGC CC 3. F. culmorum GAA CAT ACC T-T ATG TTG CCT CGG CGG ATC AGC CC 3. F. oxysporum GAA CAT ACC ACT TG TTG CCT CGG CGG ATC AGC CC 4. F. proliferatum GAA CAT ACC AAT TG TTG CCT CGG CGG ATC AGC CC 5. F. semitectum GAA CAT ACC TAT ACG TTG CCT CGG CGG ATC AGC CC

Tabel 4 Kandidat primer forward spesies spesifik berdasarkan daerah ITS

No. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Spesies F. graminearum F. graminearum F. graminearum F. graminearum F. acuminatum F. acuminatum F. acuminatum F. oxysporum F. oxysporum F. oxysporum F. proliferatum F. proliferatum F. proliferatum F. semitectum F. semitectum F. semitectum Urutan nukleotida CCT TAT GTT GCC TCG GCG GAT GAA CAT ACC TTA TGT TGC CTC GGC GG AAC ATA CCT TAT GTT GCC TCG GCG TTA TGT TGC CTC GGC GGA TCA GCC C CCT TAA TGT TGC CTC GGC GGA T CCT TAA TGT TGC CTC GGC GGA TCA G TTA ATG TTG CCT CGG CGG ATC AGC CC CCA CTT GTT GCC TCG GCG GAT CCA CTT GTT GCC TCG GCG GAT CAG ACT TGT TGC CTC GGC GGA TCA GCC C CCA ATT GTT GCC TCG GCG GAT CCA ATT GTT GCC TCG GCG GAT CAG AAT TGT TGC CTC GGC GGA TCA GCC C CCT ATA CGT TGC CTC GGC GGA T CCT ATA CGT TGC CTC GGC GGA TCA G TAT ACG TTG CCT CGG CGG ATC AGC CC Tm (oC) 56,3 61,1 57,4 62,6 56,7 61 62,7 58,3 62,5 64,2 56,3 60,8 62,6 58,6 62,6 64,3 Ta (oC) 51,3 56,1 52,4 57,6 51,7 56 57,7 53,3 57,5 59,2 51,3 55,8 57,6 53,6 57,6 59,3 GC (%) 57 54 50 60 55 56 58 62 63 64 57 58 60 59 60 60

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan Terdapat empat macam primer yang berhasil dirancang, yaitu Fus1 dan Fus3 yang dapat mengamplifikasi daerah ITS 1 dan ITS 2 berukuran 650 pb amplikon, Fus2 yang dapat mengamplifikasi daerah ITS1 berukuran 200 pb amplikon, dan Fus4 yang dapat mengamplifikasi daerah ITS2 berukuran 420 pb amplikon. Primer Fus2 mampu mengamplifikasi seluruh isolat uji, sedangkan primer Fus1, Fus3, dan Fus4 berhasil mengamplifikasi enam isolat. Saran Perlu dilakukan pengujian spesifitas primer terhadap spesies Fusarium lainnya dan spesies kontaminan.

DAFTAR PUSTAKA
Bluhm BH, Flaherty JE, Cousin MA, dan Woloshuk CP, 2002. Multiplex polymerase chain reaction assay for the differential detection of trichothecene and fumonisinproducing species of Fusarium in cornmeal. J Food Protect 65: 19551961. Darmono TW, Jamil I, Dwi AS. 2006. Pengembangan penanda molekuler untuk deteksi Phytophtora palmivora pada tanaman kakao. Menara Perkebunan 74(2): 87-96. Edel V. 1998. Polymerase chain reaction in mycology: an overview. In: Bridge PD et al. (editor). Applications of PCR in Mycology. United Kingdom: CAB Intenational. Hlm 1-20. Jurado M, Vazquez C, Marin S, Sanchis V, Gonzalez-Jaen MT. 2006. PCRbased strategy to detect contamination with mycotoxigenic

Fusarium species in maize. Syst Appl Microbiol 29: 681-689. Hershkovitz, M.A. and Lewis, L.A. 1996. Deep-level diagnostic value of the rDNA-ITS region. Mol Biol Evol 13:127695 Hsuan HM, Salleh B, Zakaria L. 2011. Molecular identification of Fusarium species in Gibberella fujikuroi species complex from rice, sugarcane and maize from Peninsular Malaysia. Int J Mol Sci 12: 6722-6732. Llorens A. et al. 2005. Characterization of Fusarium spp. isolates by PCRRFLP analysis of the intergenic spacer region of the rRNA gene (rDNA). Int J Food Microbiol 106: 297-306. McDowell D. 1999. PCR: Factors affecting reliability and validity. Di dalam: Saunders GC, Parkers HC, editor. Analytical molecular Biology: quality and validation. Teddington: Laboratory of the Government Chemist. hlm 58-80. ODonnell K. et al. 2008. Multilocus genotyping and molecular phylogenetics resolve a novel head blight pathogen within the Fusarium graminearum species complex from Ethiopia. Fungal Genet Biol 45: 15141522. ODonnell K. et al. 2009. Novel multilocus sequence typing scheme reveals high genetic diversity of human pathogenic members of the Fusarium incarnatum-F. equiseti and F. chlamydosporum species complexes within the United States. J Clin Microbiol 47(2): 38513861. Patola E. 2008. Lingkungan tumbuh, organisme pengganggu tanaman gandum, serta pengendaliannya. Jurnal Inovasi Pertanian 7(1): 1925. Suanthie Y, Maribeth AC, Charles PW. 2009. Multiplex real-time PCR for detection and quantification of mycotoxigenic Aspergillus, Penicillium and Fusarium. J Stored Prod Res 45: 139-145. Surachmat M. 1996. Deskripsi Beberapa Penyakit Penting pada Tanaman Kelapa Sawit di Persemaian. Jakarta: Badan Karantina Pertanian

Tisdall

J. 2001. Beginning Perl for Bioinformatics. California: OReilly & Associates, Inc. White TJ, Bruns T, Lee S, dan Taylor J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols a guide to methods and applications. San Diego: Academic Press: 315-322. Winarsih S. 2007. Pengaruh bahan organik pada pertumbuhan Gliocladium virens dan daya antagonisnya terhadap Fusarium oxysporum secara in-vitro. Jurnal Ilmu-Ilmu Pertanian Indonesia Edisi khusus 3: 386-390. Windels CE. 2000. Economic and social impacts of Fusarium Head Blight : changing farms and rural communities in the Northern great plains. Phytopathology 90: 1721. Yuwono T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Yogyakarta: ANDI.

10

LAMPIRAN

11

Lampiran 1 Urutan nukleotida Input Primer Fusarium spp. berdasarkan 18-28s rRNA 2805 pb
1 71 141 211 281 351 421 491 561 631 701 771 841 911 981 1051 1121 1191 1261 1331 1401 1471 1541 1611 1681 1751 1821 1891 1961 2031 2101 2171 2241 2311 2381 2451 2521 2591 2661 2731 2801 CATGCATGTC TTGATAGTAC GGAAGGGATG CGAATCGCAT ATTGGCCAAA GGCTACTACA AAATACTGAT CAATTGGAGG GTGGTTAAAA GCCGGGCCTT GAAAAAATTA TGGTTCTATT ATTGTCAGAG CATTAATCAG GCCGACTAGG CTCCAGGGGG CCTGCGGCTT GAGCTCTTTC ATTGCGATAA GAGGGACTAT GGCCGCACGC AAACTCCGTC GTCATCAGCT CTCAGTGAGG TCGGTCATTT AGTTTACAAC AAGGGACGGC ATCAAAAAAC AATGTGAATT GGCATGCCTG TTACACATCG CAGGTAGGAA AGTAACGGCG GAGGATGACT TGGTTGGATG GAGGTATATG GAAAAGCACT TGGGCTTGGT GGGGGATAAA GGGACTGAGG CCAAG TAAGTATAAG CTTACTACTT TATTTATTAG GGCCTTGCGC CATGGTTGCA TCCAAGGAAG ACAGGGCTCT GCAAGTCTGG AGCTCGTAGT TCCCTCTGTG GAGTGCTCCA TTGTTGGTTT GTGAAATTCT GAACGAAAGT GATCGGACGG AGTATGGTCG AATTTGACTC TTGATTTTGT CGAACGAGAC CGGCTCAAGC GCGCTACACT GTGCTGGGGA TGCGTTGATT CGTCCGGACT AGAGGAAGTA TCCCAAACCC CCGCCGCAGG TTTCAACAAC GCAGAATTCA TTCGAGCGTC TTACTGGTAA TACCCGCTGA AGTGAAGCGG TTGATGCGGT CCAAATCTCT TCTTCTAAAG TTGAAAAGAG TAATCATCTG GGCTTCGGGA TTCGCGCTTC 2805 CAATTATACA GGATAACCGT ATTAAAAACC CGGCGATGGT ACGGGTAACG GCAGCAGGCG TTTGGGTCTT TGCCAGCAGC TGAACCTTGG GAACCCCATG GGCAGGCCTA CTAGGACCGC TGGATTTATT TAGGGGATCG TGTTATTTTT CAAGGCTGAA AACACGGGGA GGGTGGTGGT CTTAACCTGC CGATGGAAGT GACGGAGCCA TAGAGCATTG ACGTCCCTGC GGCCCAGAGT AAAGTCGTAA CTGTGAACAT AACCCTAAAC GGATCTCTTG GTGAATCATC ATTTCCCCAA TCGTCGCGGC ACTTAAGCAT CAACAGCTCA GCCTTCCGAG GTAAGTCTCC CTAAATACCG AGTTAAAAAG GGGTTCTCCC ATGTGGCTCC TGCAAGGATG GCGAAACTGC GGTAATTCTA AATGCCCTCC TCATTCAAAT GAGGGTTAGG CGCAAATTAC GTAATTGGAA CGCGGTAATT GCCTGGCTGG CCCTTCACTG TGCTCGAATA CGTAATGATT GAAGACTAAC AAGACGATCA TGACCCGTTC ACTTAAAGAA AACTCACCAG GCATGGCCGT TAAATAGCCC TTGAGGCAAT GCGAGTACTT CAATTATTGC CCTTTGTACA GGTGGGCAAC CAAGGTCTCC ACCTTATGTT TCTGTTTTTA GTTCTGGCAT GAATCTTTGA ATTGATTGGC CACGCCGTTA ATCAATAAGC AATTTGAAAT TTCCCTGGAA TTCGACGAGT GCCAGAGACC TACGTGAAAT CAGTGCACTT CCTCGGGGAG CTGGCGTAAT GAATGGCTCA GAGCTAATAC GGGGCTCACT TTCTTCCCTA GCTCGACCCC CCAATCCCGA TGAGTACAAT CCAGCTCCAA CCGGTCCGCC GGCGTGGCGG CATTAGCATG AATAGGGACA TACTGCGAAA GATACCGTCG GGCACCTTAC ATTGACGGAA GTCCAGACAC TCTTAGTTGG GTATTGCTTT AACAGGTCTG CCTTGTCCGA TCTTCAACGA CACCGCCCGT TACCGCTCAG GTTGGTGAAC GCCTCGGCGG GTGGAACTTC CGATGAAGAA ACGCACATTG GGTCACGTCG AACCCCAACT GGAGGAAAAG CTGGCTCTCG CGGGACGCCA CGAGTAGTTT GATAGCGCAC TGTTGAAAGG TTCCAGTCCA TGTTATAGCC GGTCATCAAC TTATATAAGT ATGCTAAAAA GGTGATTCAT TCAACTTTCG GGAGAAGGAG CACGGGGAGG TTAAATCCCT TAGCGTATAT TCACCGCGTG GGAAACAGGA GAATAATAGA GTCGGGGGCA GCATTTGCCA TAGTCTTAAC GAGAAATCAA GGGCACCACC AATGAGGATT TGGAGTGATT GGCAGTACGC TGATGCCCTT AAGGTCCGGG GGAATCCCTA CGCTACTACC GGCCGGAAAG CAGCGGAGGG ATCAGCCCGC TGAGTATAAA CGCAGCAAAA CGCCCGCTGG AGCTTCCATA TCTGAATGTT AAACCAACAG GGCCCGAGTT TAGAGGGTGA GGGAATGCTG AAGTAGAGTG GAAGCGTTTA GGCCAGCATC CGTTGTGTAA GACCCGTCTT TATCGTTTAT TCCCGACTTC GATAACTCCT ATGTTTGGGT CCTGAGAAAC TAGTGACAAT TAACGAGGAA TAAAGTTGTT TACTGGTCCG CTTTTACTGT ATAGGACGTG TCAGTATTCA AGGATGTTTT CATAAACTAT AGTGCTTGGG AGGGGTGGAG GACAGATTGA TGTCTGCTTA TGGCTTCTTA AGATGTTCTG TAATCTTGTT GTAAGCGCAA GATTGAATGG CTCTCCAAAC ATCATTACCG GCCCCGTAAA AAACAAATAA TGCGATAAGT TATTCCGGCG GCGTAGTAAT GACCTCGGAT GGATTGCCCT GTAATTTGTA GAGCCCCGTC CTCTAAATGG ATCGAAAGAT TGACCAGACT AGTTTTCGCC TACCCTGGCG GAAACACGGA 70 140 210 280 350 420 490 560 630 700 770 840 910 980 1050 1120 1190 1260 1330 1400 1470 1540 1610 1680 1750 1820 1890 1960 2030 2100 2170 2240 2310 2380 2450 2520 2590 2660 2730 2800

12

Lampiran 2 Cara membuat larutan buffer TAE 1x Komposisi Tris base Glacial acetic acid 0,5M EDTA Aquades 242 gr 57,1 mL 100 mL 1,25 liter

Cara membuat: 1. Pertama-tama, buat larutan stok buffer TAE 50x dengan cara mencampurkan Tris base 242 gr, Glacial acetic acid 57,1 ml, dan 0,5M EDTA 100 ml, kemudian tambahkan Aquades hingga 1 liter 2. Untuk membuat larutan buffer TAE 1x sebanyak 250 mL, campurkan 5 mL larutan stok buffer TAE 50x ke dalam 250 mL aquades.

13

Lampiran 3 Cara membuat larutan CTAB 2%

Komposisi: Cetyl Trimethyl-Ammonium Bromide 2 gr Aquades 100 ml

Cara membuat larutan CTAB: 1. 2. 3. Masukkan 2 gr CTAB ke dalam labu erlemeyer Tera hingga 100 ml Kocok labu Erlenmeyer agar larutan tercampur rata