1 Qué es y con qué objetivose practica la cromatografíade caPa fina

1.1 ¿Está muerta la cromatografía de capa fina? ¡Vivala cromatografíade capa fina! (de de sobrecromatografía capa fina de alta eficacia la cual En ocasiónde un congreso en R. más adelante) E. Kaiserpresentó 1985,y bajo el mismotítulo,nuevos hablaremos que parecía losrápidos de método[1].A principios losañossetenta de desarrollos un antiguo CLC) LiquidChromatography, y líquida columna(Column de en avances la cromatografía podíandesplazar la a líquidade alta eficacia(HPLC) en especialmente la cromatografía por la confundir el nombre: CCF Pero de cromatografía capafina(CCF,TLC). no nosdejemos líquidacomo también lo es la CLC. Bajo el nombre es un método de cromatografia desdeprincipios exclusivamente se especializada dedica "Cromatografía una Planar" revista (publica "publish perish" or joven, procedimiento. la máxima Si antiguo todavía de 1988a éste, la analíticos, entonces Fig. de viabilidad losmétodos de algoacerca la expresa o desaparece) de la CCF desde principios los años ochenta.Una de atractivo 1 muestraun creciente prácticadebe tener esto en cuenta- y por ello hemosescritoesta introducformación ción. 1.2 Un principiofabuloso:separaciónpor adsorción[3] tenÍauna Comoes de esperar, que en unavezun reypoderoso reinaba un paíslejano. Érase de másfuerley vigoroso su con casarprecisamente el hombre hija hermosa a la que quería reino.Pero¿cómoencontrarlo?.

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entrelos años sobreCFC/HPTLC científicas de Fig. 1: Distribución frecuencias publicaciones de (búsquedarealizada ChemicalAbstracts)[2]. en 1967-86

ya y Fué de Hizollamar todoslos sabios su reino les pidióconsejo. dificil que los sabios a Ésteteniauna idea Cromos. Exceptouno llamado todos de faltade creatividad. oadecían paraun "Majestad", "aloestede vuestro Utilizadlo fluyeun río impetuoso. reino original: dijo, separadas regularmenquevuestros ingenieros en el ríoestacas fijen superconcurso. Haced pueda un paraqueun nadador Si entonces asirlas. arrojáis altas te,suficientemente y gruesas lo sujetoa ellahastaque la corriente hombreal río,podráasirsea la estacay mantenerse Cuantomásfuerte dondetambiénse agarrará. Lo hastala próxima estaca, arrastre. llevará Si mantenerse agarrado. más tiempoconseguirá más a menudoy durante sea el hombre, y llegará la a entreel principio el final,con toda seguridad habéis fijadosuficientes estacas Va meta primeroel hombremás débil y en últimolugarel hombremás fuerte. a ser una paravuestros subditos." apasionante carrera de el ideas hizo a deportivas, acondicionar recorrido la carrera. Elrey, siempre abierto nuevas tan De así No debíaganarel más rápidosino el más lento.Y sucedió. esta manera simple, quiense casócon la hijadel y de se elegante sin derramamiento sangre buscóal vencedor, rey. y faseestacionariaal tiempo a llamaron riofasemóvil, lasestacas al Loseruditos deporte del ya que un atletanecesitaba paraefectuar recorrido, tiempode retención, que retención el al del honoral sabioconsejero rey llamaron nuevo o equivale agarrarse permanecer.Yen a un tan "Cromatografía".Ycomo conceptos sonaban científicos, buendía los estos depode posibilidades nuevo al No deporle. enviaron del cuentade lasfabulosas científicos dieron se químicas. lugarde un rÍo En a recorrido aspirantes la manode la hijadel reysinosustancias por las Sustituyeron estacas sustancias comofasemóvil. un impetuoso eligieron disolvente como puedeverseen estebreve o adsorbentes comoel gel de sílice el óxidode aluminio.Y libro.aún hov hacencromatoqrafías.

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1.3 Gómo empezótodo [4] paratratar tierras de adsorlivos distintas los se de Yaentiemoos Aristóteles utilizaban efectos "cromatográficas" (y de de mar.La paternidad la denominación) las separaciones el agua en en T.TSWEETquien, un congreso rusoMichail al con corresponde toda justicia botánico Sus experimentos de de por vez 1903,describió primera la separación colorantes plantas. derecha se en se de con cromatografÍas columna muestran la Fig.2: En la partesuperior separados de a los correspondientes colorantes lashojas coloreadas unasbandas distinguen cálcico. sobrecarbonato

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la segÚn para de de de 2: aparato cromatografía la separación colorantes hojas, Fig. Primer (2) con cromatográficas se llenaban columnas 1906.Laspequeñas publicación deTSWETTde (250 El sobrepresión - 300mbafl. tubohorizontal y bajo cálcico se utilizaban unaligera carbonato La de de 5 a para la transmitir presión un máximo hasta minicolumnas.cromatografía en (1)servía en porTSWETT, muestra (4). se presión también utilizada baja [4], la de 30 aproximadamente añoshastaquefue reconocida utilidad la cromatografía Pasaron Pocos añosmás (por y en analítica R.KUHN colaboradores, 1931). comotécnica de adsorción de a el rusostrasladaron principio capasdelgadas adsorbentes. tarde,unosinvestigadores de a STAHL[5] y KIRCHNER desarrollaron partir de aquí la cromatografía capa fina. [6] de de Y esta cromatografía adsorciónse muestraapropiadasobretodopara la separación se de el otro lipófilas. contraposición, principio, de la cromatografía partición, En sustancias y hidrófilas, como los aminoácidos de muestra apropiadoparala separación sustancias con por sobrepapelo sobregel de síliceimpregnada agua. azúcares, ejemplo y sobretodo en Merckha participado estaevolución ha contribuído, Desde1934lacompañía preparados, y de sistemas separación de estandarizados de del a través desarrollo materiales la especialmente CCF [7]. rutinaria la cromatografía, de a la aplicación
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1.4 ¿Quéconsiguela cromatografía capa fina? de La CCFno debetemerla comparación otrosmétodos (ver con cromatográficos 1.1). Quien profundizaren temapuede desee este consultar ,8,9]. estaintroducción haoptadopor En se [1 indicaral usuariolos casosen los que la CCF es más apropiada que otros métodos.Si se contestaafirmativamente una o más de las siguientes preguntas debe recurrir las a se a placasde CCF. (1 ¿Sequiere la separación pudiendo ver cromatográfica íntegra apreciar mismo al tiempo, ) por ejemplo, bondadde la separación, relación componentes la mezcla la la y la de de formación eventual colas(manchas de arrastradas "tailing")? o (2) ¿Se quiereevitarla contaminación muestras por utilizando sistemade anteriores el separación únicavez? una (3) ¿Sedeseapoderelegir parala muestra que éstese evapora (ya libremente disolvente el propiamente totalmente la antesde iniciar separación dicha)? (a) ¿Sedeseapoderelegir faseestacionaria en cualquier entrelasdisponibles el mercado, pudiéndolas y problemas preparación la de de modificar fácilmente sin que presenten fase? (5) ¿Essatisfactorio avancen y que solamente algunos componentes que otros,considepermanezcan puntode partida? radosno impodantes, inmóviles el en (6) ¿Se desea optimizarla separación pudiendomodificar rápiday económicamente, fácilmente fasesmóvily estacionaria? las (7) ¿Sedesea proseguir separación un cromatograma, vezterminado, la de una efectuando perpendicular la primera obteniendo una nuevacromatografÍa y a ademásuna mejor (CCFbidimensional)? separación (8) ¿Sebuscaun método "screening" (procedimiento la preselección sistemas para de de de que placas separación adecuados), puedatransferirse campopreparativo al utilizando de capa gruesao columnas? (9) ¿Sedeseaseparar mayornúmero posible muestras simultáneamente, ahorrando el de asítiempoy costesademás eluiralavez las sustancias estándar bajocondiciones de idénticas? (10) ¿Sedeseaelegir entretantossistemas detección comosea posibie, de eventualmente y, utilizables manera de consecutiva en casode detección adquirir UV soloun detector paravariospuestos trabajo (ya la de cromatográficos que,en general, detección los de puedeesperar)? cromatogramas terminados (11) ¿Sedesea y emplear métodode detección un muchas sustancias sencillo que abarque (la extinción la fluorescencia)? de La pregunta si la CCFes mejorqueotrosmétodosno se plantea. CCFy la cromatografía de La para los de columna complementan a la otra.La CCF es especialmente se una adecuada principiantes, para los laboratorios formaciónprofesional, para el controlrápido del de y desarrollo lassíntesis parael controlde medicamentos la farmacia. de Paraniveles de en y exigencia elevados cuantoa eficiencia reproducibilidad en existen el mercado en sistemas y de alta eficacia(HPTLCo CCFAE), aparatosde aplicación, cubetas de separación que detectores tienenuna eficiencia absolutamente comoarable la de otrosmétodos. a No cabe duda sin embargoque es precisotener un mínimode conocimientos básicosy de prácticapara ulilizarcon éxito la CCF, que existennumerosos ya experiencia factoresque El influyen abier1o". lectordebe por lo sobrela separación este"sistema en cromatográfico tanto familiarizarse el capítulo2 de este librocon los asoectosmás relevantes la CCF. en de pasara los experimentos ejemplos encuentran el capítulo (los Sóloentonces conviene se en prácticade la CCF. 4). En el capítulo3 se describirá realización la 12

2 Entre bastidores:¿cómofunciona la separaciónpor cromatogratía de capa fina?

equilibriosde adsorcióny partición. 2.1 Principiosde la separación: se hija.Nos enseñóque la cromatografía Acordémonos cuentodel rey y su hermosa del y porunafaseestacionariauna de afinidad lassustancias en fundamenta general la distinta en y fasemóvil,por el sorbente el eluyente. la durante experimenta sobreunaplacade capafina.¿Qué disuelta Aplicamos sustancia una por por Es separación? arrastrada la fase movil,se fija a la fase estacionaria un tiempo se De y de es determinado, arrastrada nuevo, así sucesivamente. este modo,la sustancia retarda, frena respectoal frente de la fase móvil.De hecho,tanto más cuanto más se de tambiénlas sustancias Así preferentemente ancleen la faseestacionaria. se separan se a conducen seanpequeñas, parecida ambasfases:aunqueestasdiferencias por afinidad númerode veces.La Fig. 3 muestralos dos distintassi actúanel suficiente eluciones de los las principiosbásicos en que se fundamentan distintasafinidades: equilibrios adsorcióny de paftición. siguiente: de fisicoquímicamente la manera se Estosfenómenos describen (se en en disueltas la fase móvilse acumulan adsorben) la sustancias Enlaadsorción,las p. ej. alúmina. de superficie un sorbente, por en La parliciónaparece la distintasolubilidad dos fasesinmiscibles. entre en disueltas la fasemóvilse distribuyen las de ografía partición sustancias En la cromat fijo a fluída, adherida un soporte (p.ej. gel de silicaen fasereversa fasey unasegunda, esta (RP) celulosa). o A de y Paraambos equilibrios para bajas concentraciones una sustancia (pocosUg de simplificada: muestra) válidala relación es

c" :K
C-

estacionaria en de de donde y C. sonlasconcentraciones equilibrio lasustanciaA lasfases C" y móvilrespectivamente. en de Cuandola concentración la sustancia la gráficamente relación. esta La Fig.4 muestra deja de a fasemóviles alta(cercana la concentración saturación) de serválidaestarelación se isoterma, dobla. La simplificada. curva,llamada de cromatográfico del el claramente efecto valorde K en el compodamiento La Fig.5 muestra por de afinidad lasustancia la K a observarse,mayor mayor B.Comopuede Ay dossustancias y de faseestacionaria menorvelocidad elución. se En es Debemosreconocerque este tratamiento muy simplificado. la bibliografía Todo usuariosabe sin embargo teóricosmás detallados tratamientos [9-13]. encuentran real rasgos comportamiento de las el predecir grandes a que la teoríasólo permite también (ver empírica Cap.2.3), marcadamente todavía unaciencia es La sustancias. cromatografía
IJ

La componente permanece preA ferentemente la suoerficie la en de fase estacionaria (adsorción) bien o (paren la fase líquidaestacionaria que la sustancia tición),mientras O permanece preferentemente la en fase móvil.

+ oo

Al fluirnueva fasemóvil,lasmoléculas que se encontraban el eluen yente son transporladasmás lejos. Alcanzan faseestacionaria una sólida o líquida todavíano ocupada,la cual adsorbe o bien disuelvede nuevopreferentemente la compoa nenteA. Al mismo tiemoo, las moléculas previamente adsorbidaso disueltas en la fase estacionaria oasan a la fase móvil y son transportadas otro trecho.

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I M

Trasmúltiplesrepeticiones estos de procesos dos sustancias han las se separado. Las moléculasO, que permanecenpreferentemente la en fase móvil, avanzan más rápidamenteque las moléculas A. En otras palabras: el R¡ de A es me n o ro u e e l d e O.

A
Fig.3: Fenómenos equilibrio el procesocromatográfico: de (A) en adsorción y parlición(B).G : soporlede la capa (placade vidrio), : superficie la faseestacionaria, : fasemóvil,S = fase O de M estacionaria. 14

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= x"^-: = KA- 0,3

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Fig. 4: Relación entre las concentraciones de equilibrio una sustancia la fase móvily en de en la fase estacionaria.La curva reoresentada se llamaisotermade sorción.

fig. S: Oepend""",ude la velocidadcromatográfica de avance de dos sustanciasA y B (arriba)con las isotermasde sorción (abajo).

C": Concentración equilibrio la sustande de cia A en la fase estacionaria G. : Concentración equilibrio la sustan- C.,,= Concentraciónde saturación de la fase de de estacionaria cia A en la fase móvil.

a tanto los debidoen partea que, parala mayoría sistemas, de contribuyen la separación procesos como los de paftición. adsortivos impregsopofteshidrofílicos Los procesos partición típicamente combinar al de aparecen polares,especialmente nados de solventes agua o mezclasacuosas,con un solvente la inverlir relación: fineses conveniente menospolarcomofasemóvil.Para algunos orgánico y sirve acuosa orgánico, una mezcla un portador hidrofobizado satura se con un disolvente (reversed phase) se y en Estavariante denomina se disposición fasereversa comofasemóvil. hablade materiales RP para separar que los procesos adsorción son adecuados puedeafirmarse de En general de cuyasenergías interacción estructurales didtintae isómeros componentes polaridad de permiten separación procesos partición la Los de con un mismoadsorbente seandistintas. p. ej. en una seriehomóloga. de sustancias distintasolubilidad, de y visto,en la adsorción la comohemos nombrados basan, se Losprocedimientos hasta ahora oaftición. con iónicoque utilizafasesestacionarias de Existeademásla cromatografía intercambio parala separación y adecuada positiva negativamentees especialmente grupos o cargados y así de cationes aniones como de proteínas. (GPC) segúnel tamañomolecular. separasustancias La cromatografía gel-permeación de que presentan huecosbien geleshinchados fase estacionaria Paraello se emplean como definidos. 2.2 Parámetrospara describir la eficacia de la separación. que terminado el compoftamiento es un información proporciona cromatograma La primera separadas. de de elución las sustancias to relate front): R1 mediante parámetro (en inglés, el Se expresa
Rr :

Distancia entreel puntode partiday la manchade la sustancia Distancia entreel puntode partiday el frentedel eluyente

(generalmente La posición la mancha la sustancia toma en su puntomás intenso de de se el centro). El Rt se considera valorsólo orientativo factores, un debidoa los numerosos difícilmente que controlables simultáneamente, influyenen la retención. Una sustanciaeluídabajo puede paradeterminar valorrelativo R,el condiciones idénticas un emplearse comopatrón de R, o R",:
F"t =

Distancia entreel punto de partiday la manchade la sustancia patrón de Distancia entreel puntode partiday la mancha la sustancia

Al contrario Rr,que es <1, el R"tpuedesertambién>1. La Fig.6 muestra unavez más del cómo se determinan ambosparámetros. Fig.6 que La eficaciade separacióndel sistema de CCF se manifiestaen el ensanchamiento cromatográfico. la de a experimenta manchaaplicada la sustancia lo largodel recorrido

y Fig.6: Esquemapara la determinación Rr(A) de R",(B). de

A Frente del eluyente

Parámetro R1

B

Parámetro R"

Patrón

@

Sustancia

@
Sustancia

@

Puntode partida
b - Recorrido: Sustancia F"_: "' a Recorrido: Estándar

Puntode parlida
^o Recorrido: Sustancia Recorrido: Eluyente

a

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