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El calibrado y el análisis cuantitativo instrumental

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El calibrado y el análisis cuantitativo instrumental

http://jmj-qa.blogspot.mx/2009/08/el-calibrado-y-el-analisisquantitativo.html Cuando un químico analítico se enfrenta a una muestra, éste tiene, desde un punto de vista muy general, dos tareas fundamentales: conocer que sustancias forman parte de la materia (análisis cualitativo) y conocer en qué cantidad aparecen dichas sustancias (análisis cuantitativo). Centrándonos en esta última, los métodos analíticos empleados pueden ser clásicos, donde se obtiene la cantidad de analito que reacciona estequiométricamente con un reactivo que se añade en cantidad perfectamente conocida a una porción de muestra, o instrumentales donde se mide una propiedad (utilizando un instrumento) que está directamente relacionada con la presencia de analito y cuya intensidad depende de la cantidad del mismo. Es aquí donde debemos introducir el concepto de calibrado. El calibrado en un método instrumental es el proceso mediante el que se obtiene una relación matemática (función analítica) entre la señal del analito y su concentración mediante la comparación con uno o más patrones. Generalmente se trabaja en disolución, con lo que se entiende por patrón a una disolución de analito de concentración perfectamente conocida. Utilizando esta función analítica se puede calcular la concentración de analito en la muestra a partir de la señal medida. La expresión de esta función analítica se corresponde con la ecuación de una curva (curva de calibrado). Siempre que sea posible se busca que la relación entre la señal analítica y la concentración del analito en los patrones sea lineal, obteniendo la línea de mejor ajuste a los datos experimentales obtenidos para los patrones mediante el método de mínimos cuadrados. La IUPAC ofrece guías sobre este tema, para uno (1) o múltiples (2) componentes, siendo recomendable su lectura para profundizar en el tema. Aquí simplemente nombraremos los tipos de calibrado que se suelen emplear en el análisis químico dando unas breves indicaciones de cómo y cuando se utilizan. -Calibrado externo Se lleva a cabo la comparación de señal de analito en la muestra con las obtenidas al medir una serie de patrones preparados. Los patrones suelen ser acuosos (es decir, se disuelve el analito en agua) pero también puede ser recomendable usar una matriz parecida a la de la muestra. Por ejemplo, para la determinación de metales en muestras sólidas, previamente digeridas con ácidos, se suele usar una disolución acuosa con la misma proporción de ácidos que la muestra tratada. En este tipo de calibrado se representa la señal de los patrones frente a su concentración y se obtiene la ecuación de la recta de mejor ajuste. Una vez hecho esto, para calcular la concentración de analito en una muestra se sustituye la señal medida para dicha muestra en la ecuación de la recta y se despeja la correspondiente concentración. Hay que asegurarse de que el valor de señal de la muestra se encuentre entre el mínimo y el máximo

de las señales de los patrones (se debe interpolar, no extrapolar) y, si no es así, tratar de diluir la muestra o los patrones, según sea necesario, para que se cumpla este requisito.

Se debe comprobar la presencia de efecto matriz (errores proporcionales, que varían con el nivel de concentración). En caso de existir, hace necesario el uso del método de adición patrón.

- Calibrado por adición patrón Se realiza añadiendo cantidades conocidas y crecientes de analito a distintas porciones de muestra para construir la curva de calibrado (se debe incluir la muestra sin adición). Se representa la señal obtenida para cada porción frente a la concentración o cantidad añadida a dicha porción. La concentración de la muestra se obtiene como el punto de corte de la prolongación de la recta en el eje de abscisas. Matemáticamente se iguala la señal a cero y se despeja la concentración (cambiando de signo).

Se aplica cuando se observa efecto matriz. Pero, ¿cómo se detecta dicho efecto matriz? Se puede comprobar de forma sencilla representando los datos del calibrado externo y los de adición patrón en el mismo gráfico. Si las rectas

son paralelas, es decir, tienen la misma pendiente, no existirá efecto matriz. En caso contrario si habrá efecto matriz.

-Calibrado con patrón interno En algunas ocasiones, debido a la forma de introducir una muestra en el sistema de medida o a un tratamiento previo de la misma, ésta puede sufrir pérdidas de analito. El problema surge cuando al repetir el mismo proceso una y otra vez las pérdidas de analito son diferentes, con lo que estaremos ante un problema en la repetitividad del método. Por poner un ejemplo, imaginemos que en el tratamiento de muestra acuosa se realiza una extracción con un volumen X de disolvente orgánico. Ese volumen X se lleva a un volumen final Y y se mide la propiedad proporcional a la cantidad de analito. Quien ha realizado una extracción líquido-líquido sabe que es prácticamente imposible recuperar todo el volumen X en cada extracción. Si en vez de recuperar X recupero X-1 y lo llevamos al mismo volumen final Y, la concentración de analito dependerá del volumen que he recuperado. Este es un caso en el que es aconsejable el uso de un patrón interno. La filosofía de un calibrado con patrón interno es introducir en todas y cada una de las muestras, así como en los patrones, una sustancia en concentración constante (la misma en todas las muestras y patrones) y perfectamente conocida, un patrón interno, que sufra pérdidas de manera análoga al analito. Entre las características básicas de un patrón interno debe estar que sea lo más parecido posible al analito, química y físicamente, y por supuesto, que no sea una especie que ya esté contenida en la muestra originalmente. Ni que decir tiene que debe ser de elevada pureza y estabilidad. El calibrado se realiza representando el cociente entre la señal obtenida para el analito y la obtenida para el patrón interno frente al cociente de sus concentraciones. Se calculan los parámetros de la recta de calibrado y se sustituye el cociente de señales obtenido para la muestra, obteniendo así el cociente de concentraciones en la muestra. Como conocemos la cantidad de patrón interno añadida, es sencillo calcular la concentración de analito.

Lecturas recomendadas 1) K. Danzer, L. A. Currie. Guidelines for calibration in analytical chemistry. Part 1. Fundamentals and single component calibration. Pure Appl. Chem. 70 (1998) 993-1014) K. Danzer, M. Otto, L. A. Currie. Guidelines for calibration in analytical chemistry. Part 2: Multicomponent calibration (IUPAC Technical Report). Pure Appl.

El efecto matriz
http://jmj-qa.blogspot.mx/search?updated-min=2012-01-01T00:00:00%2B01:00&updated-max=201301-01T00:00:00%2B01:00&max-results=12

El efecto matriz en Química Analítica se define, de acuerdo con la IUPAC, como el efecto de todos los componentes de la muestra distintos al analito en la medida de una cantidad (de analito). A la hora de aplicar un método analítico, el efecto matriz se traduce en una diferencia de sensibilidad del mismo cuando se prepara un calibrado en un disolvente frente a uno preparado en el mismo entorno de la muestra. La sensibilidad debe entenderse como la variación de la señal analítica frente a la concentración de la especie a determinar, id est la pendiente de la curva de calibrado. Por lo tanto, la diferencia entre las pendientes de calibrado en un disolvente determinado (calibrado externo) y en la matriz de la muestra (ya sea simulada o mediante el método de adición patrón), indica la presencia de efecto matriz, como se apuntaba en un post anterior. Cabe destacar que el efecto matriz es un efecto indeterminado de las especies que rodean a la muestra que afectan a la sensibilidad, cuando el efecto de una especie es determinado (y aditivo) se habla de interferencia. En este post vamos a repasar el procedimiento para detectar la presencia de efecto matriz a partir de la comparación entre calibrado externo y calibrado de adición patrón. Por lo tanto el primer paso es preparar una serie de patrones en el disolvente mayoritario de la muestra (agua o el que sea) y un calibrado en la propia muestra añadiendo cantidades conocidas de analito. Como sabemos, procuramos trabajar en un rango de concentraciones en el que la relación señal-concentración sea lineal. Se obtienen las ecuaciones de ambas rectas de calibrado y comparamos las pendientes de las mismas. Si existe efecto matriz, habrá una diferencia significativa entre las pendientes, lo que implica que deberemos trabajar en una matriz simulada o mediante adición patrón.

Centrémonos ahora en llevar a cabo esta comparación de forma estadísticamente correcta. Para ello es preciso conocer el valor de la pendiente de calibrado externo (bCE) y de adición patrón (bAP) además de sus respectivas varianzas (el cuadrado de sus desviaciones estándar). A partir de ahí se calcula la relación entre las pendientes, R (Ecuación 1) y la varianza

combinada correspondiente a esa relación (Ecuación 2). Con eso se calcula un valor de t de Student (Ecuación 3).

Lógicamente, se trata de comparar la relación entre ambas pendientes con la unidad. Si dicha relación no difiere de 1, no habrá efecto matriz significativo. Este valor de t calculado se debe comparar con un valor tabulado para los grados de libertad de la varianza combinada. Para conocer estos se debería obtener el número de grados de libertad efectivos de esta combinación. Será preciso emplear la fórmula de Welch-Satterthwaite donde para una varianza combinada (Ecuación 4) se obtienen los grados de libertad efectivos aplicando la Ecuación 5.

En nuestro caso se obtiene la Ecuación 6:

Donde n se refiere al número de puntos del calibrado externo (CE) o de adición patrón (AP). Este cálculo es un tanto engorroso, pero una vez realizada una hoja de cálculo de Excel y convenientemente validada, es muy sencillo hacer este tipo de comparaciones. No obstante, muchos autores recomiendan la comparación del t calculado con un factor de cobertura k=2 para un 95% de nivel de confianza. Véase González y Herrador (2007). Para que entendamos esta elección, el valor tabulado del estadístico de Student para un número infinito de grados de libertad es de 1.96 para p=0.05 (95% de nivel de confianza). De ahí que se tome un valor de k=2. Esta aproximación puede resultar incluso más restrictiva que el uso del t tabulado para los grados de libertad efectivos

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