UNIVERDIDADE DE SAO PAULO FACULDADE DE CIENCIAS FARMACEUTICAS DEPARTAMENTO DE ANALISES CLÍNICAS E TOXICOLÓGICAS LABORATORIO DE BIOLOGAI MOLECULAR ALPLICADA AO DIAGNÓSTICO

Apostila de noções de Biologia molecular

Prof. Dr. Mario H. Hirata Profa. Dra Rosário D. C., Hirata

1999

ÍNDICE Tópico Página

Aula número 1: • Introdução........................................................................................................................................ 2 Estrutura do DNA e RNA...................................................................................................................... 2 Replicação, transcrição e tradução...................................................................................................... 4 Organização do genoma de eucariotos, procariotos e viral.................................................................. 7 Enzimas de restrição e suas aplicações.............................................................................................. 10 Aula número 2: • Extração do DNA genômico .......................................................................................................... 13 Aula número 3: • Princípios de eletroforese.............................................................................................................. Fatores que influenciam na eletroforese....................................................................................... Tipos de suporte........................................................................................................................... Tipos de eletroforese..................................................................................................................... Aplicações da eletroforese nas técnicas moleculares................................................................... Aula número 4: • Reação de polimerização em cadeia (PCR)................................................................................... Princípios da reação de PCR.............................................................................................................. Protocolo geral para PCR.................................................................................................................... Fatores que influenciam na PCR......................................................................................................... Escolha de iniciadores para PCR........................................................................................................ Aula número 5: • PCR no Diagnóstico das Doenças genéticas................................................................................. Polimorfismo e mutações.................................................................................................................... Diagnóstico de alguns polimorfismos por PCR.................................................................................... Polimorfismo de apolipoproteína......................................................................................................... Polimorfismo de receptores da LDL.................................................................................................... 19 20 22 22 23 28 28 31 31 35 39 39 41 42 44

Aula número 6: •−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− PCR no diagnóstico de Doenças infecto-contagiosas ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 46 Meningites bacterianas---------------------------------------------------------------------------------------------------- 47 Tuberculose-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 50 Infecção pelo virus da Hepatite C---------------------------------------------------------------------------------------- 59 Infecção pelo virus HIV----------------------------------------------------------------------------------------------------- 64 Aula número 7: • PCR e RFLP na identificação de indivíduos................................................................................... 68

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APLICAÇÃO DA PCR EM LABORATÓRIO CLÍNICO E MEDICINA FORENSE
• Aula número 1 Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata Prof. Assoc. Mario Hiroyuki Hirata

INTRODUÇÃO
Os avanços nos estudos da biologia molecular em eucariotos tem contribuido significantemente para

o entendimento da etiologia das doenças humanas. As técnicas de recombinação dos ácidos nucleicos têm permitido aos pesquisadores identificar os vários genes responsáveis por doenças hereditárias, avaliar os mecanismos de infecção dos microrganismos, conhecer os processos que regulam a diferenciação e proliferação celular (principalmente nos processos neoplásicos), entre outros. A biologia molecular vem também apresentando aplicação bastante expressiva na pesquisa de marcadores genéticos úteis no diagnóstico laboratorial. Por outro lado, as diferenças nas sequências do DNA, observadas entre as espécies ou entre os indivíduos, são extremamente úteis para as análises forenses, os testes de paternidade, a identificação de antígenos de histo-compatibilidade, a identificação de allelos mutantes, a identificação de gêneros e espécies de bactérias, fungos, leveduras, vírus e outros. Nesta apostila serão abordados os princípios básicos de biologia molecular, bem como serão descritas as aplicações da técnica de PCR no diagnóstico clínico e nos testes de identificação.

ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS (DNA E RNA)
As informações genéticas são armazenadas nos ácidos nucleicos. Há dois tipos de ácidos

nucleicos: ácido desoxiribonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA). O DNA é encontrado principalmente nos cromossomos no núcleo das células, enquanto RNA está presente no citoplasma, havendo muito pouco nos cromossomos. Os ácidos nucleicos consistem de cadeias de nucleotídeos. Cada nucleotídeo é constituido por uma base nitrogenada, uma molécula de açúcar e um grupamento de fosfato (PO4 =). Há dois tipos de açúcar nos ácidos nucleicos: 2-deoxiribose no DNA e ribose no RNA (Figura 1A). As bases nitrogenadas são as pirimidinas: citosina (C), timina (T) e uracila (U) e as purinas: adenina (A) e guanina (G). O DNA contém A, C, G e T, enquanto que o RNA contém U em vez de T. Em ambos DNA e RNA, os nucleotídeos estão ligados formando uma longa cadeia cadeia polinucleotídica. Essa cadeia é formada por ligações entre o grupo fosfato do carbono 5 de um nucleotídeo e o carbono 3 do açúcar do nucleotídeo adjacente (Figura 1B). Em geral, o RNA consiste de uma cadeia polinucleotídica simples, enquanto que o DNA é composto de duas cadeias polinucleotídicas pareadas, dispostas em direção contraria, sendo denominadas antiparalelas (Figura 1B). As ligações covalentes do esqueleto de açúcar-fosfato localizam-se na parte 3

Em resumo. (A) Molécula do açúcar. (B) Representação diagramática do arranjo antiparalelo das duas cadeias polinucleotídicas do DNA. Características estruturais das moléculas dos ácidos nucleicos. a quantidade da purina. É 4 . verificou que na molécula de DNA a relação entre as purinas e pirimidinas era constante na maioria das espécies animais. (A) 5’ fosfato C H 2O H 5 4 (B) 3’ hidroxila OH A O O H 1 P CH2 O 3 2 T O H O P CH2 CH2 2-deoxiribose O C H 2O H 5 4 P G C O O H 1 O CH2 P P 3 2 O H O H CH2 ribose P O T A O CH2 P (C) H CH3 H N O (p a ra a c a d e ia ) CH2 O C G O CH2 P O H N H N N H N N H H H N N N O H H O N N N H OH 3’ hidroxila 5’ fosfato (p a ra a c a de ia ) H N (p a ra a c a d e ia ) (p a ra a ca d e ia) T im ina A d e n in a C ito s ina G uan in a Figura 1. onde a citosina pareia apenas com a guanina e a adenina pareia apenas com a timidina ou uracila. CHARGAFF. P representa o grupo fosfato. somada à força de atração entre os átomos de cargas opostas (ligações iônicas ou pontes de hidrogênio). em 1951. da mesma forma. ou seja. (C) Pareamento da bases na molécula de DNA mostrando as pontes de hidrogênio. Dessa forma o DNA apresenta a estrutura tridimensional de dupla hélice. Essas propriedades são bastante específicas e no caso do DNA elas operam de forma conjunta e simultânea com significante energia de interação. como se fosse um molde perfeito. Essa característica importante é definida pela propriedade fisico-química das moléculas com formas semelhantes se atrairem mutuamente com significante afinidade (força de atração de Van Der Waals). pode-se dizer que a lei de CHARGAFF se baseia na especificidade da interação das bases puricas e pirimidicas. E. onde o ângulo e a distância entre um nucleotídeo e outro é sempre constante. timidina. de modo que guanina em uma cadeia é pareada com a citosina na outra cadeia e a adenina sempre pareia com a timina (Figura 1C).externa da estrutura e as bases nitrogenadas estão projetadas para a parte interna. adenina. O arranjo das bases na molécula de DNA segue uma sequência em que cada base de uma cadeia é pareada com outra base na segunda cadeia. a quantidade da purina guanina é igual à da pirimidina citosina. é igual a da pirimidina.

a estrutura de dupla hélice do DNA é bastante estável. enrolado com os nucleossomas formando um cilindro ou estrutura solenoide. descrita por Watson & Crick em 1953. ao submeter-se essas fitas simples a condições de associação (temperatura ≤ a 65°C. Entretanto. secundário. comparação e identificação desses compostos. duplex. transmitindo em absoluto as informações genéticas contidas na célula precursora. se essa estrutura for submetida a alta temperatura (90°C a 100°C) ou a pH extremos (menor que 3. sofrendo o processo de dissociação. Outra propriedade física muito importante dos ácidos nucleicos é a sua capacidade de absorver energia na região do ultravioleta.0 ou maior que 10. Esse fenômeno de associação é também denominado de renaturação. • REPLICAÇÃO. onde a informação genética está amplamente concentrada nos cromossomas dentro do núcleo. a sequência de uma das cadeias polinucleotídicas do DNA é complementar a outra (cadeia complementar). esse processo denominase replicação. ou pH próximo de 7. hibridização ou “annealing”. está disposta linearmente.0). ou seja a dupla fita somente se reassocia se as bases forem exatamente complementares. obedecendo a lei da complementariedade. enquanto que entre a C e a G a ligação se dá por 3 pontes de hidrogênio (ligação mais forte).importante salientar que a ligação entre a A e T ou U ocorre por interação de 2 pontes de hidrogênio. com as duas cadeias precursoras (DNA 5 . A estrutura secundária de dupla hélice (duplex) do DNA. pode ser também circular como nas bactérias. ela se separa em duas fitas simples. contribuindo enormemente para o isolamento. entretanto se extendido pode atingir muitos metros. Isto se deve a que o DNA é compactado na forma super-enrolada em vários níveis: primário. TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO Replicação Toda vez que uma célula se divide. principalmente do DNA. a disposição da molécula de DNA nos organismos superiores é de particular importância. Em condições fisiológicas. Da mesma forma. plasmídeos e certos vírus. Esta disposição super-enrolada é a forma natural do DNA. terciário. apresentando o pico de absorbância máxima em 260 nm. elas podem se reconstituir formando a dupla fita novamente. Entretanto. Esses processos de desnaturação e renaturação são essenciais para manipulação dos ácidos nucleicos in vitro. O comprimento total dos 46 cromossomas humanos tem menos que 0.0) por algumas horas. ao redor das proteinas ligadas ao DNA (histonas) formando os nucleossomos. todo o seu conteúdo de DNA é duplicado na íntegra. Esta propriedade é útil tanto para a quantificação quanto para avaliar a pureza dessas substâncias. Propriedades dos ácidos nucleicos Os ácidos nucleicos podem ser dissociados e associados por processos físicos e químicos. formando voltas ou “loops”.5 mm. Devido a essa especificidade do pareamento entre as bases. e pode ser também de fita simples como em alguns tipos de fagos. No entanto. desnaturação ou “melting”. A replicação ocorrre de forma semi-conservativa. e finalmente quaternária.

o RNA mensageiro (mRNA). Os fragmentos da cadeia discontínua são ligados pela enzima DNA ligase. localizada antes (“upstream”) da sequência a ser transcrita. Figura 2. Dessa forma. localizados no citoplasma. durante um simples ciclo celular. O processo de síntese de mRNA é conhecido por transcrição e o tamanho da molécula de mRNA é definido pela sequência de aminoácidos que o ácido nucleico codifica. ssDNA). Transcrição A síntese protéica não é resultante da leitura direta da sequência nucleotídica do DNA. sendo as fitas simples precursoras replicadas. então. para a replicação ocorrer é necessário que dupla fita precursora se abra formando 2 cadeias independentes (fita simples. As DNA polimerases possuem também. produzindo-a de acordo com a lei de pareamento das bases. que é reconhecida pela 6 . Esse é um processo energeticamente desfavorável e ocorre com a ação conjunta de uma proteina DNA-específica e várias enzimas. Muitas outras proteínas estão envolvidas na estabilização e manutenção da integridade das cadeias simples que são precursoras para a síntese da dupla fita. dsDNA) servindo de molde para a síntese da nova cadeia (Figura 2).de dupla fita. As informações genéticas contidas na sequência nucleotídica do DNA têm que ser transferidas para uma molécula intermediária que pode mover-se para o citoplasma. A replicação pode ter início em vários sítios. a síntese da proteina. enzima que utiliza como molde a cadeia precursora e incorpora os nucleotídeos de forma sequencial na nova cadeia. assim como no reconhecimento dos sítios de iniciação. Como essa polimerase sintetiza DNA na direção de 5' para 3'. Sabemos que o DNA está localizado no cromossoma do núcleo da célula e a síntese protéica ocorre quase que na sua totalidade nos ribossomas. a síntese de uma das cadeias complementares é realizada de forma contínua enquanto que a outra é sintetizada discontinuamente. A indicação de qual fita do DNA deve ser transcrita é orientada por uma sequência específica denominada promotor. então. Apenas uma das fitas do DNA é transcrita dando origem a uma única sequência de mRNA para cada gene. e que ordena. Representação da molécula de DNA durante a replicação: as duas cadeias precursoras são separadas e as cadeias complementares que são sintetizadas. além da função de sintetizar polinucleotídeos. atividade exonucleásica ou "a correção de leitura" na qual os nucleotídeos incorretamente incorporados são removidos. de forma independente e separada. mas cada origem de replicação é utilizada uma vez. A fita filha é sintetizada pela ação catalizadora da DNA polimerase III. Essa propriedade é fundamental para a manutenção a integridade da sequência original.

O código genético 1a. O material genético de certos virus (retrovirus) é o RNA e a informação genética segue. Cada tRNA tem 70-90 nucleotídeos em comprimento e é de fita simples. a polimerização ocorre na direção 5’ . o rRNA e o RNA de transferência ou tRNA.base(5’) U Phe Phe Leu Leu C Leu Leu Leu Leu A Isoleu Isoleu Isoleu Met* G Val Val Val Val * codon de iniciação U C Ser Ser Ser Ser Pro Pro Pro Pro Treo Treo Treo Treo Ala Ala Ala Ala 2a. Este processo é conhecido por transcrição reversa. Como a RNA polimerase adiciona sequencialmente monofosfatos de ribonucleosídeo à extremidade 3’ da cadeia de RNA em crescimento. rRNA) no citoplasma. O mRNA transcrito é transportado para os ribossomos (RNA ribossômico. um trinucleotídeo de sequência variável forma o anti-codon que pode parear com um codon da molécula de mRNA. Esse processo envolve o mRNA. Cada sequência de trinucleotídeo é denominada codon e a sequência de condons que codifica um polipeptídeo específico é denominada cistron.3’. Tabela 1. Esse código é universal e é encontrado em todos os organismos vivos.RNA polimerase (enzima sintetisadora de mRNA). cada um codificando um aminoácido (Tabela 1). adquire a forma de uma folha de trevo. Isto significa que cada molécula de mRNA será identica à sequência nucleotídica da fita de DNA que não é transcrita. mas devido ao pareamento de bases dentro da molécula. portanto. encontrado no citoplasma. Na outra extremidade da molécula de tRNA está uma sequência para 7 . Essa enzima tem importante função no ciclo vital dos retrovírus. base A Tir Tir Terminação Terminação His His Glu Glu Asp Asp Lis Lis AcAsp AcAsp AcGlu AcGlu 3a. a direção reversa (de RNA para DNA). O código genético é lido em grupos de três nucleotídeos. Dentro dessa estrutura. onde ocorre a síntese protéica. na qual a sintese de DNA é dirigida pelo RNA e a enzima responsável é denominada transcriptase reversa. Tradução A relação entre a sequência de nucleotídeos do DNA e a sequência de aminoácidos da proteina correspondente é denominada código genético.base (3’) G Cis Cis Terminação Trip Arg Arg Arg Arg Ser Ser Arg Arg Gli Gli Gli Gli U C A G U C A G U C A G U C A G O processo de decodificação pelo qual a informação genética presente na molécula de mRNA dirige a síntese proteica é denominado tradução.

Portanto. exatamente como a forma que lhe deu origem. PROCARIOTOS E VIRAL Estrutura Gênica Os cromossomas constituem-se de uma longa e ininterrupta sequência de nucleotídeos na qual estão dispostos muitos genes. O ribossoma. então. denominadas alelos. ATG) que ajusta a fase de leitura ("reading frame"). que determinam a expressão de alguma característica particular. o código genético não se sobrepõe. 8 . Em princípio as sequências de bases nos ácidos nucleicos devem ser traduzidas em qualquer fase de leitura diferente. A tradução é finalizada quando o ribossoma reconhece na fita de mRNA o codon de terminação ("stop codon"). as três fases de leitura possíveis são : UUA GCA AAG CUG CGA A UAG CAA AGC UGC GAA U AGC AAA GCU GCG AAU G Entretanto. se movimenta ao longo da molécula de mRNA. dependendo onde o processo de decodificação se inicia. Na tradução. Esse tipo de alteração é conhecido como descolamento de fase ("frameshift") e pode causar a perda total da função da proteina produzida.ligação a um aminoácido específico. sendo que a nova forma do gene é herdada de modo estável. pois a fase de leitura é ditada pelas sequências de iniciação e de terminação da tradução presentes na molécula de mRNA. traduzindo um codon de cada vez usando tRNAs para adicionar aminoácios ao final da cadeia polipeptídica em alongamento. A direção da leitura é de 5’-3’. Um gene pode existir em formas alternativas. o ribossoma liga-se primeiramente a um sítio específico na molécula de mRNA (codon de iniciação. O gene é uma entidade estável mas pode sofrer mutações. Para uma dada sequência UUAGCAAAGCUGCGAAUG. A fase de leitura pode ser alterada por mutações que removem ou inserem bases na sequência nucleotídica. O gene é uma unidade de herança constituida por uma sequência nucleotídeos que carrega as informações necessárias para a síntese de um dado polipeptídeo. F lu x od ain f o r m a ç ã og e n é t ic ain t r a c e lu la r R e p lic a ç ã oeT r a n s c rc iç ã o d oR N A T r a n s c r iç ã o R e p lic a ç ã o D N A R N A P r o t e in a s T r a d u ç ã o T r a n s c r iç ã or e v e r s a • ORGANIZAÇÃO DO GENOMA DE EUCARIOTOS. um codon particular no mRNA é relacionado através de um tRNA a um dado aminoácido. sendo que a sequência de nucleotídeos da fita de DNA corresponde à sequência de aminoácidos da proteina traduzida na direção do N-terminal para o C-terminal.

Embora todos genes funcionais sejam transcritos. Entretanto. Esse processo é denominado processamento do RNA ou “RNA splicing”. produzindo um mRNA maduro que codifica para uma proteína diferente da original. entretanto. Após a remoção dos introns. A quantidade total de DNA nuclear no genoma haplóide (gamético) humano compreende 3 x 10 6 kb. que são processadas de diferentes formas para produzir diferentes mRNA maduros que são traduzidos em polipeptídeos diferentes. A maioria dos mRNAs eucarióticos possuem 100 a 200 resíduos de adeninas ligadas à extremidade 3'. Alguns genes complexos tem moléculas de mRNA muito grandes. a sequência de nucleotídeos do gene é colinear com a sequência de aminoácidos de uma dada proteína. mutações que ocorrem nas regiões de junção dos exons podem modificar o mRNA processado. conhecida como poli-A. As diferenças na síntese proteica resultam de sinais moleculares que controlam as taxas em que as moléculas de mRNA são transcritas a partir do DNA ( controle transcricional) ou traduzidas (controle traducional) Processamento pós-transcricional do mRNA A transcrição e a tradução nos procariotos são processos concomitantes mas nos eucariotos são processos temporal e espacialmente desconectados. Durante a passagem do núcleo para o citoplasma. a maioria do DNA genômico não é totalmente transcrito. A maioria dos genes dos eucariotos são compostos por regiões codificadoras denominadas exons e regiões não-codificadoras denominadas introns. o mRNA sofre a adição de resíduos de 7-metilguanosina (Caps) na extremidade 5’. enquanto que os genes reguladores modificam os efeitos dos genes estruturais. Mesmo considerando todos os outros genes que conferem as características normais como altura e inteligência. denominada metilação Cap. nos eucariotos a transcrição ocorre no núcleo e a tradução no citoplasma. Esse processamento sofrido pelo mRNA torna a molécula mais estável e facilita o seu deslocamento para o citoplasma. Nos procariotos. mas somente 3000 locos de doença foram identificados. Genes que são responsáveis pela síntese de enzimas específicas ou peptídeos são denominados de genes estruturais. Antes que ocorra a remoção dos introns. nos eucariotos a sequência codificante é geralmente interrompida por sequências adicionais. Como vimos. Entretanto. adicionada pela enzima poli-A polimerase. o mRNA transcrito (denominado pre-mRNA) deve ser processado para que seja obtido o mRNA maduro. Esse processo é denominado processamento alternativo (“alternative splicing”) e ocorre no mesmo tecido 9 . Como a maioria dos genes tem 1 a 20 kb em comprimento. Estes introns são sequências posteriormente removidas durante o processamento do transcrito primário. uma grande porção do DNA genômico não tem função definida. denominada cauda de poli-A. a RNA polimerase II adiciona uma sequência AAUAAA extremidade 3’ do mRNA. deveria haver 1 milhão de genes. mais e mais tem se observado que este DNA tem funções importantes. incluindo o controle de ação gênica. Controle da expressão gênica Nas células existem mecanismos moleculares que controlam o número e a quantidade das proteinas produzidas.

Estes transposons contém os genes que codificam para as enzimas necessárias 10 . Nos procariotos. Estrutura gênica dos procariotos Existem regiões específicas no DNA. As mais frequentes são as TATA. O genoma dos eucariotos pode apresentam os pseudogenes que são replicas de genes ativos mas não produzem um produto reconhecível. possivelmente. glicose e galactose. O metabolismo deste substrato depende da hidrólise de seus componentes. por exemplo. os genes que codificam as enzimas pertencentes a uma mesma via metabólica são adjacentes uns aos outros e agrupados ("cluster") ao longo do cromossomos junto com sequências regulatórias. inibindo assim a síntese de mRNA que codifica para a β galactosidase. se integram a estes locais. pela enzima β -galactosidase. O repressor liga-se a uma sequência especifica no operador. dos promotores e das sequencias adjacentes. controlam o nível de expressão do gene associado. Nos procariotos. geralmente ocorrem devido a mutações acumuladas no gene. Estrutura gênica dos eucariotos Os promotores dos eucariotos são elementos que sinalizam o sítio onde a transcrição deve iniciar-se e. aumentando a taxa de ligação da RNA polimerase ao DNA e a taxa de síntese do mRNA da β-galactosidase. Além dos promotores. bloqueando a ligação da mRNA polimerase ao promotor. a regulação destes operons obedece a condições nutricionais ou ambientais. que podem estar muito distantes do promotor (antes ou depois. É importante salientar que estes amplificadores não são específicos e potenciam a transcrição de qualquer promotor que estiver na sua vizinhança. pode servir como fonte de carbono e energia para a Escherichia coli. a localização destes segmentos de DNA no genoma é instável. A eficiência da expressão de um gene em um tecido específico depende da adequada combinação e integração dos amplificadores. O operador encontra-se antes (“upstream”) da sequência do promotor. A presença de lactose (indutor ) induz a síntese de β-galactosidase por ativação do operon da lactose (operon lac). CAT e CG “boxes. Transposons são elementos genéticos móveis que se deslocam de uma região para outra do genoma e. sendo que a sequência que regula a expressão desses genes é denominada operador. Desta forma. Geralmente estão localizados cerca de 30 bases “upstream” do codon de iniciação (ATG) e ompreendemsêquencias denominadas “boxes” ou “motifs”. os genes dos eucariotos possuem sequências regulatórias adicionais conhecidas como amplificadores ("enhancers").mas em diferentes estágios de desenvolvimento e diferenciação e pode também ocorrer em diferentes tecidos. O estímulo da expressão de uma enzima em resposta à presença de um substrato particular é denominada indução. nas posições de -35 a -10 antes do início da sequencia codificante. A lactose. enzimaticamente. Este conjunto é denominado operon. Na ausência do indutor o operon é reprimido pela ação do repressor. “upstream” ou “downstream”) e que potenciam a taxa de transcrição. denominadas promotores que identificam o sítio de início da transcrição do RNA (região na qual a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição).

é causada pela expansão de um triplete (CGG) contendo 6 a 54 repetições. ensaios de hibridização. • IMPORTÂNCIA DAS ENZIMAS NA BIOLOGIA MOLECULAR Muitas enzimas que atuam na replicação e transcrição tem sido purificadas e a sua atividade biológica usada in vitro para reações moleculares específicas diretas. pois há milhares dessas sequências espalhadas no DNA humano. com especificidade de 3' para 5'. A consequência é que o número de repetições dentro de uma sequência varia largamente entre os indivíduos. A maioria dessas enzimas é isolada de bactérias. As nucleases podem ser específicas para DNA ou RNA. estão associados a alterações no tamanho dos microsatétiles. Essas enzimas são utilizadas das mais diversas formas. Geralmente. terá um padrão ou perfil de DNA pessoal (“Fingerprinting ”). Verificou-se também que disturbios neurológicos na distrofia miotônica e na doença de Huntington. Esses perfis são usados para estabelecer a identidade dos indivíduos em diversas situações. preparo de sondas de ácidos nucleicos. Esta descoberta forneceu a base científica para o fenômeno de antecipação no qual os disturbios genéticos tornam-se mais severos nas gerações subsequentes. Mini e microsatélites são sequências curtas. As nucleases representam uma categoria de enzimas específicas de ácidos nucleicos que hidrolizam as ligações fosfo-diester dos polímeros de ácidos nucleicos. a saber: clonagem e amplificação de genes de interesse. fungos. cada indivíduo. ou podem atuar somente em ligações internas (endonucleases). O DNA do 11 . Polimorfismo de DNA A análise do DNA humano progrediu na medida em que se conheceu a variabilidade de sequências entre os indivíduos. a síndrome do X frágil. O tamanho da repetição pode ser muito variável e pode fornecer excelentes marcadores genéticos para estudar o comportamento fenotípido das famílias. A maioria dessas sequências repetitivas não produz efeito deletério. repetidas consecutivamente. dependendo de qual das fitas de DNA está sendo lida. exceto gêmeos idênticos. As nucleases DNA-específicas podem catalizar apenas cadeias únicas (por exemplo. Sua natureza repetitiva faz com que sejam instáveis durante a replicação do DNA de geração para geração. As sequências de microsatélites mais comuns no DNA humano são CA ou GT. a S1 nuclease) ou cadeias duplas (DNAse I). entre outras aplicações. leveduras ou virus. que estão distribuidas ao longo dos cromossomas humanos. Em função dessa variabilidade (polimorfismo de DNA). uma de cada vez. As endonucleases de restrição são nucleases encontradas naturalmente em bactérias e são denominadas enzimas de restrição porque restringem sua atividade a DNA estranhos. entretanto foi demonstrado que uma forma de retardo mental em homens. representando cerca de 40% do DNA.à sua inserção e para remobilização para outro sítio. a inserção de um transposon produz mutação ou rearranjo cromossômico variável que abole a função do gene que recebe esse elemento móvel. As nucleases podem requerer um grupamento hidroxil terminal livre (exonucleases).

. A Taq DNA polimerase. 5 ou 6 nucletídeos. Muito poucas reconhecem sequências maiores. por exemplo. por clivar em diferentes sítios dentro de uma mesma sequência (Ex. Outras enzimas reconhecem diferentes sequências com o mesmo sítio interno (Ex. A transcriptase reversa. A transcrição reversa constitui-se um método útil para produzir uma copia complementar de um gene (denominado cDNA) a partir do mRNA. no entanto. Dessa forma. As Ligases. Algumas são denominadas isosquisomeros. Enzimas de restrição e suas aplicações Tecnologia de DNA recombinante Como vimos. Para cada região da molécula de DNA onde a sequência específica ocorre. o plasmídeo pode ser aberto e um fragmento de DNA estranho pode ser inserido. As DNA ligases requerem a presença de um molde complementar. cataliza a síntese de DNA a partir de moldes de RNA ou DNA. A EcoRI. por exemplo. Isto significa que fragmentos de DNA de tamanho reprodutível podem ser produzidos e esses fragmentos contendo um gene particular. como a DNA-ligase usada durante a replicação. mas pode ser usada in vitro para procedimentos de clonagem e para o preparo de sondas de DNA a partir de mRNA. XmaI e SmaI) e por clivar o mesmo sítio mesmo sendo obtidas de diferentes microorganismos (Ex. a enzima de restrição corta ambas as cadeias de forma reprodutível. A especificidade de cada enzima proporcionou o desenvolvimento da tecnologia de DNA recombinante. Estas enzimas são utilissímas para cortar duplas fitas de grande tamanho em fragmentos reprodutíveis e para preparar DNA de diferentes fontes utilizado em procedimentos de clonagem. as RNA ligases não tem essa exigência para o processamento do mRNA. é uma enzima obtida de Escherichia coli cepa R e foi a primeira enzima desse tipo isolada. o genoma dos retrovirus pode ser identificado em amostras biológicas utilizando esse método. é uma enzima extremamente útil para a amplificação do DNA in vitro pela reação de polimerização em cadeia (PCR). formando extremidades assimétricas ou coesivas (“stick-end”) ou simétricas ou cegas (“blunted-end”). Plasmideos são pequenos pedaços de DNA circular extracromossômicos que ocorrem naturalmente no citoplasma das bactérias e se replicam independentemente do DNA bacteriano hospedeiro. presente apenas nos retrovírus. As Polimerases catalizam a síntese do polímero de ácido nucleico complementar usando uma cadeia precursora como molde. A maioria das enzimas de restrição reconhecem sequências de 4. produzindo moléculas de DNA recombinado biologicamente funcionais. BamHI e Sau3A). por ação de uma DNA ligase. as endonucleases de restrição são enzimas que clivam a molécula de DNA em sítios sequência-específicos. Nos primeiros experimentos de recombinação foram utilizados os vetores plasmidiais para carrear fragmentos de DNA estranhos. HindIII e HsuI). podem ser removidos do restante da molécula de DNA e ser inseridos em um DNA carreador. Essas enzimas são fundamentais para a clonagem e ampificação de genes. Cada enzima é designada de acordo com o organismo do qual é derivada. produzindo um plasmídeo 12 . Essa enzima tem importante função no ciclo vital dos vírus.hospedeiro não é atacado porque os sítios vulneráveis a suas próprias enzimas são protegidos por um processo denominado metilação do DNA. Utilizando uma endonuclease particular. catalizam a formação de ligações fosfo-diester entre dois segmentos de ácidos nucleicos. por exemplo.

Literatura recomendada Emery. J. Lewin. Gilman.. este pode. 596 pág.. New York. de leucócitos ou de células do líquido amniótico. Se for demonstrado. Human molecular Genetics. Eles são denominados polimorfismos de tamanho de fragmento de restrição (RFLP) e são herdados como características genéticas simples obedecendo as leis mendelianas de herança. 1994. USA. Nesse método. J. fornecer um meio de 13 . 1995. Oxford University Press. Estas variações (alterações de bases) resultam na perda de um sítio de restrição existente ou de aquisição de um novo sitio. Zoller. Polimorfismo de restrição Em muitas doenças.. Chichester. ed. detectar o gene defeituoso sem efetivamente conhece-lo. USA. 1272 pág. embora em algumas células muitos destes genes estejam desligados ou reprimidos e somente relativamente poucos estejam ativos. 1996. Southern.. Watson. An Introduction to Recombinant DNA in Medicine. B. o defeito genético é desconhecido e a produção de sondas gene-específicas é muito difícil ou não é possível.. Oxford.. 626 pág. quando transfectados em bactérias (usualmente Escherichia coli). 2a. Sabe-se que variações nas sequências de DNA ocorrem aleatoriamente através do genoma inteiro e não estão associados a uma doença específica. J. Lewin. 1992. Recombinant DNA. Strachan.M.Read.P. as enzimas de restrição são utilizadas para fragmenttar o DNA e os fragmentos resultantes são separados por eletroforese e identificados por hibridização de ácidos nucleicos. M. eds. Malcon. Witkowrk.E. T. T. A. A. Tais alterações nas sequências de DNA significam que os fragmentos. produzidos por uma enzima de restrição particular.recombinate. utilizando uma sequência de nucleotídeos específica (sonda genética) que é capaz de reconhecer o gene de interesse. eds. o gene produtor da doença pode estar muito proximo (ligado) a um sítio de reconhecimento de uma enzima de restrição particular. Identificação de genes O DNA extraído de um fragmento de tecido. Os plasmídeos fornecem veículos úteis para carregar fragmentos de DNA ou genes e. 2a. Ed. Ed. produzirão cópias múltiplas do fragmento de DNA incorporado. Strachan & A. 1975). 206 pág. que um gene produtor de doença está ligado a um RFLP. podem produzir clones que ao serem replicados in vivo. New York. England.H Emery & S. Genes V. M.E. B. Scientific American Inc.. Johon Wiley & Sons Ltda. terão diferentes comprimentos entre diferentes indivíduos e podem ser reconhecidos por suas mobilidades em eletroforese.. Watson. em estudos de famílias. então. Bios Scientific Publications Ltd. Entretanto. A identificação de um gene ou sequência nucleotídica especifica em todo esse DNA pode ser realizada através do método de Southern blot (E. contém milhares de genes. UK.

A maioria dos testes de DNA para o diagnóstico envolve a extração de DNA dos leucócitos humanos. Correntemente. clorofórmio e álcool isoamílico.• Aula número 2 EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO Profa. 14 . as análises de DNA para o diagnóstico estão disponíveis somente para algumas desordens genéticas. ou utilizam solventes orgânicos como o fenol. Os estudos de ligação genética utilizando a técnica de polimorfismo de tamanho de fragmentos de restrição (RFLP). Rosario Dominguez Crespo Hirata Marcos de Oliveira Machado • INTRODUÇÃO O potencial de aplicações das técnicas de DNA recombinante em laboratórios de Bioquímica Clínica estão se tornando altamente evidentes. especialmente para a análise do diagnóstico das várias doenças genéticas e de outras mais. O DNA extraído fica livre de RNA. de proteínas e da degradação de enzimas. e requer um grande volume de sangue (10-15 ml).Dra. necessitam que o DNA extraído esteja em boas condições de uso. como as que utilizam o PCR e a digestão com enzimas de restrição. Tradicionalmente essas técnicas de extração consomem muito tempo e possuem procedimentos pouco eficientes. ou esteja livre de contaminantes e interferentes que possam prejudicar a reação. O uso da técnica de precipitação salina para a extração de DNA utilizando como detergente o Triton X-100. mas o campo de estudo está rapidamente se expandindo e novas análises estão sendo desenvolvidas. a técnica de transferência de DNA (“”Southern blot””). A maioria dos métodos populares para esse fim. rápido e econômico é necessário para a introdução das análises de DNA nos laboratórios de Bioquímica Clínica. Estes passos adicionais permitem o aumento das oportunidades de transferência cruzadas de amostras ou a introdução de contaminantes. os quais são altamente tóxicos. eles requerem muitos passos e podem incluir a transferência dos extratos de DNA para recipientes adicionais ou procedimentos de lavagem do material utilizando vários filtros comerciais ou colunas. que leva aproximadamente dois dias. evita o uso dos perigosos solventes orgânicos e o alto custo e demorada digestão da proteinase K. um método simples. Tais técnicas não são bem apropriadas para o uso na rotina dos laboratórios clínicos. Embora esses métodos consigam recuperar o DNA de alto peso molecular de uma grande variedade de amostras. Portanto. a reação em cadeia da polimerase (PCR). Esta técnica envolve a desidratação e precipitação das proteínas celulares com solução de cloreto de sódio concentrada. O DNA é apropiado para as técnicas de biologia molecular. A quantidade e a qualidade do DNA extraído é muito boa comparada com as outras técnicas de extração. e outras. envolve digestão com proteinase K.

com um mínimo de consumo de tempo e trabalho. com subsequente separação do RNA do DNA e das proteínas por ultracentrifugação em gradiente de cloreto de césio. O isolamento do DNA segue basicamente o princípio anterior. Isolamento de RNA de células ou de amostras biológicas A maioria dos procedimentos de purificação e concentração de RNA são semelhantes aos utilizados na purificação de DNA. e (3) precipitação alcoólica para isolamento do DNA.5 volumes de etanol devem ser usados rotineiramente para precipitação do RNA.. a lise celular com o detergente iônico SDS. ser reextraidas. (2) médodo enzimático ou químico para remover as proteínas contaminantes e outras macromoléculas. 1. Porém não é adequado para extrair DNA de tecidos pois não há etapa de ruptura do tecido conectivo. remoção das proteinas pela extração fenólica em pH ácido. seguida de precipitação do RNA. o que dificulta a quantificação por espectroscopia no UV. O método mais adequado para preparar RNA de boa qualidade envolve a solubilização simultanea do tecido ou células e inativação de Rnases endógenas na presença de isotiocianato de guanidina. Outro método compreende a solubilização dos tecidos ou células com SDS. seguida de digestão com Rnase para remover a maioria do RNA celular. extração fenólica das proteinas e precipitação etanólica do DNA. Uma quantidade substancial de RNA acompanha o DNA genômico. Algumas amostras de DNA não amplificam bem por PCR ou não são completamente digeridas com enzimas de restricão e devem. Os protocolos básicos geralmente são aplicáveis a um ampla variedade de materiais. O segundo método é frequentemente utilizado para isolamento de genoma dos virus RNA a partir de amostras biológicas 15 . Este método é adequado para extrair DNA genômico para análise de DNA por Southern blot ou construção de bibliotecas genômicas. Dois outros métodos que não requerem ultracentrifugação podem se utilizados: (1) lise com detergente não-iônico para proporcionar um método rápido para preparação de amostras de RNA citoplasmático e (2) lise celular com isotiocianato de guanidina. O DNA genômico produzido é adequado para amplificação por PCR ou para a disgestão com enzimas de restrição e análise de transferência de DNA. Este método é útil para preparação de DNA genômico de muitas amostras de tecido ou de linhagens celulares. remoção das proteinas por precipitação com cloreto de sódio concentrado (“salting-out”) e isolamento do DNA genômico por precipitação etanólica. exceto que 2. portanto. que inativa as DNAses endógenas.• PREPARAÇÃO E ANÁLISE DE ÁCIDOS NUCLEICOS Os métodos de isolamento e purificação dos ácidos nucleicos consistem de três etapas: (1) lise das células e solubilização do DNA ou RNA. A proteinase K é usada para digerir as proteinas celulares. 2. Isolamento de DNA genômico de tecidos e células: O método básico compreende a ruptura do tecido com um homogeinizador. O protocolo mais adequado à rotina laboratorial para avaliação de polimorfismos e mutações genéticas compreende a lise celular com SDS. É essencial que toda água usada diretamente ou nos tampões seja tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) para inativar as RNases.

1 a 0. menos facilmente precipitável com a amostra de ácido nucleico. enquanto que os ácidos nucleicos permanecem na fase aquosa. Para amostras contendo dodecil sulfato de sódio (SDS). Isolamento de DNA genômico de bactérias As bactérias de uma cultura líquida saturada são lisadas e as proteinas removidas por digestão com proteinase K. 1. (2) separação eletroforética do RNA em gel de agarose contendo formaldeido para detecção e quantificação de espécies específicas de RNA por Northern blotting e hibridização. ou quando soluções de DNA necessitam ser concentradas. entre outros. Na presença de altas concentrações de cátions monovalentes (0. Durante a precipitação com etanol. O fenol usado nesse protocolo deve ser tamponado para prevenir que os produtos oxidados presentes no fenol danifiquem os ácidos nucleicos. deve-se aumentar a proporção de etanol para o volume aquoso 16 . o sal recomendado é cloreto de sódio 0. e acetato de amonio sejam capazes de induzir a precipitação. como vários sais e pequenas moléculas orgânicas são solúveis em etanol a 70%. Alcool amílico frequentemente é adicionado à mistura fenol/clorofórmio quando ocorre a formação excessiva de espuma durante a extração. Embora cloreto de sódio. • PURIFICAÇÃO E CONCENTRAÇÃO DE DNA DE SOLUÇÕES AQUOSAS Os procedimentos de isolamento de dsDNA e ssDNA a partir soluções aquosas são úteis quando proteinas ou solutos necessitam ser removidos.4 ml. Durante a extração orgânica. O sal recomentado para a maioria das aplicações de rotina deste método é o acetato de sódio a 0. portanto.5 M). pois o SDS é solúvel em etanol nessas condições. acetado de sódio. a precipitação etanólica e lavagem do sedimento elimina os sais no DNA. 3. o etanol induz uma transição estrutural nas moléculas de ácido nucleico promovendo a agregação e precipitação das mesmas. Soluções de DNA diluídas: quando soluções de DNA estão diluidas (< 10 µg/mL) ou quando menos que 1 µg de DNA está presente. Extração fenólica e precipitação etanólica Um dos métodos mais úteis e usados para isolamento e concentração de ácidos nucleicos de soluções aquosas é a extração com fenol/clorofórmio seguida de precipitação com etanol.3 M e.Outros métodos de isolamento e identificação do RNA podem ser : (1) isolamento do mRNA por cromatografia com oligo-dT celulose.2 M.3 M (concentração final). as proteinas contaminantes são denaturadas e mantidas na fase orgânica ou na interface entre as fases orgânica e aquosa. Entretanto. é mais difícil remover cloreto de sódio devido a sua baixa solubilidade em etanol a 70%. que é mais solúvel em etanol que cloreto de sódio a 0. os sais e outros solutos como os resíduos da extração fenol/clorofórmio permanecem em solução enquanto os ácidos nucleicos formam um precipitado que pode ser facilmente separado por centrifugação. polissacarídeos e as proteinas remanescentes são removidas pela extração fenólica e o DNA genômico é recuperado do sobrenadante resultante pela precipitaçao com etanol. O protocolo básico é apropriado para purificação de DNA a 1 mg/mL a partir de volumes menores que 0. Os debris de parede celular.

o volume pode ser reduzido pela extração repetida com sec-butanol (2-butanol). em concentrações de 10 µg/mL. todos os solutos e sais são concentrados com os ácidos nucleicos. incubando-se a -20 oC (ou em gelo seco). portanto. mas será eficientemente fosforilado pela T4 polinucleotídeo quinase e não poderá ser usado se esta enzima for usada em marcações subsequentes. quando se deseja manter mínimo o volume dos ácidos nucleicos precipitados. Este procedimento não é suficiente para remover completamente grandes quantidades de ligadores (“linkers”) utilizados nos procedimentos de clonagem. Tubos de vidro devem ser siliconizados para facilitar a recuperação de pequenas quantidades de DNA (< 10µg). Se a amostra de DNA está em baixa concentração em um grande volume. pois os íons de amonio tesiduais inibem essas duas enzimas. cloreto de lítio pode ser usado como o sal de precipitação. Alternativamente. o ácido nucleico deve ser extraido com fenol/clorofórmio e precipitado com etanol. coli. DNA em grandes volumes aquosos: a extração pode ser simplesmente ampliada usando o mesmo procedimento. A centrifugação para separação do DNA precipitado deve ser feita a baixa temperatura para assegurar o máximo de recuperação do DNA dessas soluções. Nessa condição o DNA é coprecipitado com o tRNA. As etapas de centrifugação à temperatura ambiente não podem exceder velocidades de 2500 rpm (1200 x g). (tubos de poliestireno não resistem a mistura fenol/clorofórmio). Após essa etapa. pro 5 minutos. Acetato de amonia não é recomendável se a amostra de ácido nucleico for fosforilada na extremidade 5’ pela T4 quinase ou na extremidade 3’ com a transferase terminal. 17 . Entretanto. Grandes mRNA e rRNA podem ser purificados de dsDNS e pequenos RNAs (tRNA e 5S RNA) por duas etapas de precipitação seletiva com cloreto de lítio na ausencia de alcool. e podem ser precipitados com os ácidos nucleicos. Cabe lembrar que apenas a água é removida com essa extração. O isopropanol é menos volátil que o etanol e é. Alguns sais são menos solúveis em para eliminar isopropanol. como o tRNA de E. Remoção de oligonucleotídeos e trifosfatos: Pequenos oligonucleotídeos (< 30 bp) e nucleotídeos não incorporados usados na marcação ou outras reações de modificação do DNA podem ser efetivamente removidos das soluções contendo DNA por duas etapas de precipitação com etanol na presença de acetato de amonia. O precipitado etanólico deve ser centrifugado em um tubo Corning de parede reforçada por 15 minutos em fotor de angulo fixo a 10. pois o cloreto de lítio é muito mais solúvel no etanol e o precipitado resultante é relativamente isento de sal. a 4oC. É recomendado que a precipitação com isopropanol seja seguida imediatamente por uma precipitação onvencional com etanol isopopropanol residual e o sal. Variações do procedimento de precipitação: O isopropanol pode substituir o etanol. levedura ou fígado bovino. entretanto.(3:1) e aumentar o tempo de precipitação (4 a 16 horas). Cloreto de lítio deve ser evitado. se o precipitado de RNA for usado como molde para a transcrição reversa após precipitação. Pequenas quantidades de DNA (nanogramas): pode-se utilizar um ácido nucleico carreador.000 rpm (8000 x g). o DNA precipitado de soluções mais concentradas que 10 mM de íons magnésio ou fosfato são dificeis de dissolver e devem ser dulidas antes da precipitação com etanol. mais difícil de remover por evaporação. O tRNA não interfere com a maioria das reações enzimáticas. seguida de uma precipitação convencional com etanol. Recuperação de pequenas quantidades de fragmentos curtos de DNA e oligonucleotídeos pode ser aumentada pela adição de cloreto de magnésio a uma concentração inferior a 10 mM antes da adição do etanol.

Resina de purificação . e no tipo de solvente que é usado para eluir o oligonucletídeo ou o polinucleotídeo da matriz. (2) dissolução do gel de agarose e recuperação do DNA por ligação a partículas de vidro. que contém um adsorvente estável (NENSORB 20. tem muito mais resolução que métodos alternativos e é geralmente o método de fracionamento de escolha. e (3) eluição pelo aquecimento da agarose de baixo ponto de fusão a 70 oC. bem como separação de DNA genômico dos debris no lisado celular. solventes. e facilitado os experimentos iniciais de clonagem de DNA eucarioto.na presença de iodeto de sódio. 2.é uma resina de purificação com propriedades similares aos sistemas de matriz de sílica (Magic1. Esta matriz liga polinucleotídeos de dupla fita mais eficientemente que os de fita simples.Soluções concentradas de ácidos nucleicos: se a concentração de ácidos nucleicos é muito alta ( > 300 µg/mL). nucleotídeos etc) são lavados com uma solução de etanol tamponada. DNA e RNA ligam-se seletivamente à matriz de sílica. Uma variedade de sistemas eletroforéticos foram desenvolvidos para acomodar essa ampla faixa de variação.é um sistema de purificação de ácidos nucleicos. ou outras substâncias. incluindo oligonucleotídeos contendo menos que 12 resíduos. nos efeitos dos sais. e recuperação do DNA pela extração fenólica e precipitação etanólica ou usando uma matrix que liga especificamente o fragmento de DNA. RNA e DNA. O polinucleotídeo ligado é eluido em um reduzido volume de tampão Tris-EDTA (TE) ou água. dos solventes orgânicos e de outras substâncias na eficiência de ligação da matriz. Adsorção . há vários sistemas de purificação de fragmentos de DNA no mercado. Esses sistemas diferem no tamanho e o tipo de ácido nucleico que pode ser eficientemente isolado. não é necessário esfriar a amostra ou aguardar algum tempo antes de separar o precipitado por centrifugação. Técnicas cromatográficas são apropriadas para algumas aplicações e podem ser usados para separação dos plasmídeos do DNA genômico. em alguma etapa. Atualmente. mas inibida por alguns solventes orgânicos. As separações eletroforéticas podem ser analíticas ou preparativas e podem envolver fragmentos com peso moleuclar variando de menos que 100 Da a mais que 108 Da. Promega). Matriz de sílica (vidro) . um fragmento individual pode ser identificado por tecnica de hibridização após a separaração eletroforética de uma mistura complexa (Southern blot). nucleotídeos. Fracionamento dos ácidos nucleicos Geralmente todos os protocolo em biologia molecular requerem. 18 . um precipitado pode-se formar sem resfriamento durante a precipitação etanólica. Purificação e isolamento de DNA Os protocolos utilizados para purificação de DNA são geralmente divididos em três categorias: (1) eluição do DNA de um gel de agarose por diálise. o fracionamento dos ácidos nculeicos. DNA de dupla fita de menos que 220 bp ou oligonucleotídeos. DuPont-NEN) que liga quantitativamente proteinas. Se um precipitado visível é formado. A eletroforese. Outras substâncias presentes (sais. Além disso. A ligação não é afetada por altas concentações de sais. 3. e pouco eficientemente os RNAs pequenos (tRNA). proteinas. entretanto. Este método tem contribuido grandemente para ao mapeamento e identificação de sequencias de cópia única ou múltipla em genomas complexos. ureia. O material não ligado é removido com água e o DNA ou RNA (mas não proteinas) é quantitativamente eluido com um solvente alcoólico.

G. J. Green Publising Associates and John Wiley & Sons. W. Basic Methods in Molecular Biology. 19 . J. Maniats. J. F. NY. Cold Spring Harbor Laboratory Press. • QUANTIFICAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS A concentração de DNA ou RNA pode ser estimada por espectrofotometria de absorção no UV ou a concentração de DNA pode ser realizada por espectroscopia de fluorescencia.F. Ed. separados e fracionados usando colunas de gel filtração ou colunas de centrifugação (spin columns). 1992. Kuehl. M.G. Ausubel. Norwalk.. Davis. 1994. 777 p.F. 3 volumes. Eds. CN.Gel filtração . Appleton & Lange. L. Um método alternativo é o método de placa de brometo de etídio agarose. Molecular Cloning: a laboratorial manual. F. New York. L. Battey. Ausubel. enquanto que as de plástico ou vidro podem ser usadas para a região do visível. 1989. Literatura recomendada Davis. Sambrook.. 2nd ed.. Ed. . Sambrook.M. NY. New York.os ácidos nucleicos podem ser purificados. Short Protocols in Molecular Biology. 2a. 2nd ed. USA. Fritsch & T.M. E.. Cubetas de quartzo devem ser utilizadas para a espectrofotometria no UV.

Rosario Dominguez Crespo Hirata • INTRODUÇÃO Eletroforese é uma técnica de separação que envolve o movimento de partículas com cargas em solução. a corrente controlada por um potenciometro. Portanto. A substância estão conectadas a fonte elétrica. Um tampão pode ser feito com uma mistura de um ácido fraco com o respectivo sal. Fonte elétrica: Equipamento que transforma corrente alternada em corrente contínua. eletrodos: substâncias em contato com um condutor. a carga elétrica que se quer aplicar no sistema. medido pelo quadrado de suas cargas. Ex: ácido acético e acetato de sódio. uma partícula carregada positivamente(catiosn) migra para o polo negativo (catodo). • PRINCÍPIOS BÁSICOS DA ELETROFORESE Terminologia: ânion : partícula carregada negativamente ou íon cátion: partícula carregada positivamente tampão: Uma mistura de substâncias que doam e aceitam proton com a função de manter a concentração do proton (pH) constante ou dentro de um valor próximo. que permite variar a tensão. Portanto.• Aula número 3 PRINCÍPIOS DE ELETROFORESE Prof. a corrente. A separação eletroforética das partículas pode ser realizada em meio líquido(eletroforese livre de Tisellius) ou em um suporte inerte. qualquer partícula ou molécula carregada pode se mover nessas condições. e a potência elétrica (Watts). A carga eletrica aplicada sob a solução é realizada através de eletrodos que são colocadas na solução. quando uma diferença de potencial é aplicada. e consequentemente podem ser separadas. mobilidade: a velocidade de uma partícula ou ion que é dado pela voltagem aplicada. Assoc. 20 . a soma do produto da concentração da carga e a mobilidade da mesma. Condutividade: a propriedade de uma substância conduzir a corrente elétrica. Dra. força iônica: É a soma da concentração de todos ions na solução. que possa ser a tensão elétrica (em Volts). pode medir elétrica(Amperagem). sob ação de um campo elétrico. Mario Hiroyuki Hirata Profa. tendência da solução se mover em relação a uma substâncias estacionária adjacente. Um ion migra através da solução na direção ao eletrodo de carga oposta. Uma medida relativa de quanto rápido um ions se movimenta em um campo elétrico. enquanto as partículas negativas(anions) migram para o polo positivo(anodo). Numa solução iônica. desde que tenham diferentes cargas. Esse equipamento. eletro-osmose.

v. 3.Mobilidade efetiva: A real mobilidade de uma substância sob certas condições. Efeito do pH do meio 21 . menor o movimento. A força eletroforética e a fricçional se opõe uma a outra. Geralmente é menor que a mobilidade devido a menor carga. mas retém uma grande quantidade de solventes nos poros ou nos canais internos das malhas. voltagem ou volts por centímetro. e a carga da partícula. conformação da partícula. etc 1. o valor de v/V é também uma propriedade característica das partículas e é importante o suficiente para receber o seu próprio nome: mobilidade.sua carga e seu coeficiente de fricção. Força na partícula A força exercida em uma partícula carregada depende do campo elétrico. condutividade do meio. f é chamada de coeficiente de fricção (medida de resistência de uma partícula oferece quando em movimento em um solvente). e a velocidade dessa aumenta até as forças se igualarem (Feletrico = Fresistencia ). V. ou de polímeros que é sólida. menor seu movimento através do solvente. que uma particula alcança em um campo elétrico. resistência da matrix. Quanto maior ou mais assimétrica a partícula. O coeficiente de fricção de uma grande partícula tais como proteinas é uma propriedade característica de cada elemento. e forma da partícula Quanto maior a viscosidade. ela inicia a migração. a resistência. 2. o movimento da partícula no solvente será também influenciado pela resistência. Mobilidade da partícula Quando um campo elétrico é aplicado em uma partícula carregada. Q. ou resistência do suporte ou meio. quando exercida na partícula. A força sob a partícula carregada é o produto: Feletrica=QV A força elétrica. pH do meio. No entanto. carga da partícula. é determinado por duas propriedades das partículas . A velocidade. força iônica do meio. causará o seu movimento. devido a viscosidade. a qual exerce uma força é proporcional a velocidade: Fresistência= fv A constante de proporcionalidade. poder de resolução: E’ a habilidade de separar substâncias que migram muito próximas. Consequentemente. • FATORES QUE INFLUENCIAM NA SEPARAÇÃO E MOBILIDADE ELETROFORÉTICA A aplicação de um campo elétrico a uma solução que contém partículas carregadas pode separálos. A separação depende de vários fatores que influenciam e que podem ser resumidas em: Força aplicada nas partículas (voltagem). gel: É uma malha de fibras. Feletrica. eletroendosmose. Coeficiente de fricção depende da viscosidade do solvente e do tamanho. temperatura. 4.

a corrente é um fluxo de íons(em ambas direções). Feletrica. e a corrente portanto estão todos relacionados. No entanto. portanto. resultados ótimos podem ocorrer quando se conserva a concentração dos ions e portanto a condutividade em valores moderados. Desde que o aumento da condutividade mesmo em voltagem fixa ou corrente tenha efeito deletério. A condutividade é a soma das concentrações multiplicado pela mobilidade efetiva de todos os ions presentes. a distribuição das cargas não estão desvinculadas a sua conformação estérica. somente 50% das partículas estarão carregadas. Se a condutividade está aumentada numa voltagem fixa. a sua mobilidade efetiva também varia com o pH. A fração com uma carga será dependente do pK da substância e o pH da solução. As macromoléculas. V = resistência X Corrente ou V = corrente___ condutividade Na eletroforese. quando a solução contém uma substância a qual o pK é próximo do pH do meio. Se decresce a voltagem reduz a força elétrica. Um íon com maior mobilidade efetiva carreia uma maior fração da corrente A voltagem. Atmosfera iônica e o potencial zeta Contra-íons. Se a condutividade está aumentada pelo aumento da concentração salina a corrente se mantém constante. condutividade. pode-se alterar a carga de uma partícula dependendo de sua conformação. naturalmente tendem a circundar próximos a grupos carregados das macromoléculas. e a resolução diminui devido ao aumento da difusão. eles não chegam a neutralizar as cargas das macromolécuals mas. Condutividade e movimento dos íons Em qualquer sistema elétrico. para sua máxima separação. 5. No entanto. Muitas vezes. se mantenha em um estado máximo de carga. O pH da solução é escolhido de tal forma. que a partícula a ser separada pela eletroforese.Cada íon possui sua carga e mobilidade muito particular. o que determina a migração eletroforética é a carga da partícula que se quer separar. Carga e conformação Como já se discutiu. diminuindo o movimento das macromoléculas. formando uma dupla camada de carga em torno dessas. esta substância ocorre em ambas as formas: a carregada e a não carregada. tendem a apresentar alguns eletrólitos ligados fortemente. Os tampões são substâncias iônicas por si. 90% das partículas estarão sob a forma carregada. 6. Desde que a carga efetiva de uma substância varia com o pH. O aumento do tempo seria necessário para uma separação. portanto levando a uma alteração na sua mobilidade. a corrente produzida é proporcional a voltagem aplicada. exercem a função de manterem o pH o mais próximo possível da ideal e fazem parte do processo. a qual distorce o padrão eletroforético e pode também desnaturar as macromoléculas. desde que o aquecimento é proporcional ao quadrado da corrente. portanto aumentando o calor elétrico gerado pelo sistema. 7. ou íons de carga oposta. 22 . Quando o pH é igual ao pK de um ácido fraco. principalmente em se tratando de macromoléculas. denominadas de atmosfera iônica. em seu estado relaxado. nas partículas carregadas. a corrente deve aumentar. Uma unidade de pH abaixo da pKa. portanto. por sua vez estão localizados próximos dos grupos carregados das macromoléculas. a voltagem deve decrescer. O excesso do aquecimento produz distúrbios convectivo nas soluções.

A agaropectina tem um número relativamente grande de grupos carboxil.As macromoléculas movem-se com a camada de hidratação e com os contra ions. a. esse fenomeno denomina-se de eletro-osmose. poliacrilamida e amido. os contra-íons irão se mover. • TIPOS DE SUPORTE Os tipo de suporte podem variar desde uma solução de sacarose até em substância pouco solúveis como fibras de celulose. O tamanho dos poros do gel de poliacrilamida mais utilizados para macromoléculas está em torno de 5% a 10%. Suportes A grande meta da eletroforese é a separação de uma mistura heterogênea de substâncias iônicas seja ela macromoléculas ou íons simples. Os contra-íons carreia solvente o suficiente para que produza um fluxo significativo nesta direção. Mais comumente é o efeito dos grupos carregados que estão ligados ao suporte. Uma interação comum que pode ocorrer. a mudança da concentração do gel de agarose. Esses reduzem a carga efetiva das macromoléculas. Entretanto. A porosidade ou a média do tamanho do poro em alguns suportes é fixo. isso poderia impedir ou inibir a separação. que resulta em eletro-endosmose. agar e amido. 8. Esse tipo de suporte separa tanto pelo tamanho do poro como por carga elétrica. Esse potencial significa a energia produzida pela carga efetiva das macromoléculas na superfície de contato. a um nível dado pelo potencial zeta. não é a adsorção usual do material. Os suportes de meio contínuo mais comuns são: agar. que em pH neutro tem contra-íons. que as vezes é denominado de endosmose. Dependendo da matrix Eletroforese livre de Tiselius Eletroforese em acetato de celulose Eletroforese em gel de agar Eletroforese em gel de agarose Eletroforese capilar 23 .000 Daltons. Como exemplo. em alguns suportes podem ser controlados. O tubo capilar também exerce esse efeito. Se o campo elétrico for aplicado. que é a região limite do complexo macromolecular na solução e o material que o está envolvendo. mas o grupo carboxil ligados a matrix (agar) não migrarão. A maioria dos suportes oferecem esse princípio determinando o tamanho do poro para o movimento eletroforético das macromoléculas. Eletroendosmose O suporte não deve interagir com as moléculas a ser separadas. O ágar é uma mistura de agarose e agaropectina. Os suporte devem permitir a penetração do material a ser separado o máximo possível e ainda delimitar o fluxo de volume (eletroforese convencional). que é muito utilizado na eletroforese. 9. • TIPOS DE ELETROFORESE. que separam proteínas de 15. em zonas completamente identificáveis. agarose.000 a 250. Como exemplo típico temos o suporte ágar. pode mudar o tamanho do poro.

Gel de Agarose Um dos métodos eletroforéticos mais comuns utilizados na prática diária em biologia molecular é a de gel em agarose. dupla fita de DNA migram inversamente proporcional ao log10 do peso molecular através do gel de agarose.2% 1. τ = a constante que é relacionada as propriedades do gel e o tamanho e a forma da molécula em migração.3% 0.1 a 3 24 .8 a 10 0.Krτ Onde µo é a mobilidade eletroforética livre e Kr é o coeficiente de retardamento.5% 2. 1974) figura 1. As moléculas lineares. 1. rápida. O fragmento do DNA migra em diferentes proporção através do gel contendo diferentes concentraçào da agarose.6% 0.b. Baseada nessa correlação podemos separar várias moléculas de DNA (de variado tamanho) nas diferentes concentrações de agarose. Log µ=log µo.5 a 7 0.2 a 4 0.1.0% intervalo da efficiência da separação da molécula de DNA em Kb 5 a 60 1 a 20 0.9% 1.2. concentração da agarose.7% 0. Existe uma relação linear entre a mobilidade logaritimica do DNA e a concentração do gel que é baseada numa equação matemática(Helling e cols . prática e apresenta boa resolução na separação dos fragmentos de DNA. Essa técnica muito simples.4 a 6 0. Tamanho molecular do DNA. Uma boa separação eletroforética do DNA utilizando gel de agarose depende de vários fatores: 1. se comparados com outras bem mais demoradas como a separação por ultracentrifugação em gradiente de densidade de sacarose. Porcentagem de agarose 0. pH de separação pH ácido pH neutro pH alcalino • APLICAÇÕES DA ELETROFORESE NAS TÉCNICAS MOLECULARES 1.

em concentrações muito baixas (0. 25 . Um método geral para identificar as diferentes conformações do DNA é utilizar na corrida eletroforética em agarose diferentes concentrações de brometo de etídio(concentração crescente).5%) os géis são pouco consistentes. Tampões utilizados Existem uma variedade de tampões que podem ser utilizados para separação eletroforética de DNA. Numa concentraçao crítica do corante livre. mas são também influenciados pela corrente aplicada.1. 1966. A mobilidade relativa das 3 formas são dependentes primariamente da concentração do gel. 1977). Dessa maneira o intervalo efetivo da separação do gel de agarose decresce a medida que a voltagem aumenta. a medida que a carga elétrica aumenta.3. sendo convenientes trabalhar em baixas temperaturas. força iônica do tampão e da densidade superhelicoidal da torção na forma I do DNA (Johnsom and Grossman .1 a 0.5 µg/ml A corrente aplicada: A baixa voltagem. a mobilidade dos fragmentos de DNA de alto peso molecular aumenta diferentemente. No entanto. Em algumas condiçoes. em outras condições pode ser de ordem inversa. Quanto mais brometo de etidio mais se liga ao DNA. as mobilidades das formas II e formas III do DNA são diferentemente diminuidas como consequência da neutralização da carga e da maior tenacidade é dada ao DNA pelo brometo de etídio. Dessa forma.4. Conformação do DNA A forma circular (forma I). onde não permanece a forma superhelicoidal. forma circular contorcida(forma II) e forma linear (forma III) do DNA com a mesmo peso molecular migra através do gel de agarose em diferentes posições (Thorne. Simultaneamente. da mesma forma os géis de agarose de baixo ponto de fusão(“low melting” agarose). pois esses géis ganham mais firmeza. 1967). Para obter a máxima resolução dos fragmentos de DNA. Em geral. Para a maioria das formas I de DNA. o gel deve ser submetido a uma corrente de no máximo 5V/cm Composição das bases e temperatura: O comportamento eletroforético do DNA em gel de agarose não é significantemente afetado pela composição das bases do DNA ou pela temperatura do gel na corrida. a forma I do DNA migra mais rápido que a forma III. a razão da migração dos fragmentos de DNA linear é proporcional a da voltagem aplicada. os geis de agarose e a mobilidade eletroforética dos fragmentos de DNA de diferentes tamanhos não muda entre 40C a 300C. o índice de migração da forma I do DNA esta no seu mínimo valor. a concentração critica do brometo de etídio livre é de 0. Se ainda mais brometo de etídio for adicionado. Entretanto. torções superhelicoidais positivas são gerados e a mobilidade da forma I do DNA aumenta rapidamente. 1. As torções superhelicoidal negativas da a forma I do DNA vão sendo progressivamente removida e seu índice de migração diminui. os geis de agarose são submetidos a corrida em temperatura ambiente.

Coloração do DNA em gel agarose O método mais conveniente para visualizar o DNA no gel de agarose é a coloração por brometo de etidio. como ligases. Esse composto contém um grupo planar. bórico 20 ml EDTA 0.1 ml ácido acético 100ml EDTA 0. se houver necessidade da coloração posterior basta imergir o gel numa solução de brometo de etídio. no próprio tampão de corrida. po r 45 minutos a temperatura ambiente.5ug/ml. O inconveniente desta agarose é que possue contaminantes de polissacárides sulfatados que inibem enzimas. Mas. exceto se houver excesso de corante. ou a irradiação absorvida a 300 nm e 360 nm pelo corante ligado propriamente dito. a sua utilização é muito difundida.089M Tris borato 0.089M ac. pois o DNA pode ser purificado e ser utilizado com sucesso nas clonagens e como substratos de reações com essas enzimas 1.002M EDTA 0. sem a necessidade de remover o gel do suporte e da cuba.6. A radiação UV absorvida pelo DNA a 260 nm é transmitida para o corante. e a fluorescência emitida é fraca.0) 5X 54g Tris-base 27. baixa eletroendosmose. A posição fixa do grupo e sua proximidade às bases causa uma ligação do corante com o DNA.5M (pH8. No entanto. que intercala entre as bases do DNA. bórico 0. a afinidade do corante pela fita simples é relativamente baixa. e endonucleases.0) Tris-fosfato (TPE) Tris-borato (TBE) 1. Geralmente o brometo de etídio é incorporado no tampão de corrida e no gel a 0.5M (pH8. o que se recomenda para uso diário é o tipo II. fosfórico 85% 40ml EDTA 0.08M Tris-fosfato 0. que se destaca com um aumento da fluorescência comparada com o corante em solução sob a forma livre. polimerases. No entanto.01M EDTA 0. do espectro visível.0) 10X 108 g Tris Base 15. Nesse caso devemos considerar que a mobilidade linear das fitas duplas está reduzida na presença do corante em aproximadamente 15%. é emitido a 590nm na região da cor vermelho alaranjada.5M(pH8.04M Tris acetato 0.TAMPÕES Tris-acetato (TAE) CONCENTRAÇÃO 0.5. simplesmente incidindo a luz UV sob o gel. Quando a quantidade de DNA é muito reduzida. Uma vantagem deste procedimento é a possibilidade de visualizar o gel durante a separação eletroforética.5g ác. a pouca fluorescência do brometo de etídio pode interferir na visuallização da banda de DNA. que fluoresce sob luz ultra violeta. a temperatura ambiente 26 . O brometo de etídio pode detectar tanto os ácidos nucleicos de simples ou de dupla fita.5ml de ac. A descoloração normalmente é dispensada. Tipos de Agarose Muitos tipos de agarose estão disponíveis.002M EDTA FORMULAÇÃO 50X 242g tris base 57. Neste caso recomenda-se imergir o gel em uma solução de sulfato de magnésio a 1mM por uma hora.

sob ação de catalisadores. cuja reação cruzada entre elas é dada pela bisacrilamida. de espessura normalmente para DNA utiliza-se 0. o perssulfato de amônia. que realiza a reação de "cross linking" ou reação cruzada. 27 . tipo 57 ou 667.6 ou 8 e uma velocidade de 4 ou 8 segundos. que se tem dificudade por geis de agarose. O gel de poliacrilamida é utilizado para os fragmentos menores que 1kb. O produto de polimerização da acrilamida.N.N'N' tetrametilenodiamina(TEMED). dependendo do tamanho do fragmento de interesse para a separação e identificação. Eles podem ser preparados em uma variada concentração (3. que é o monômero.0 20. Polaroid.5 5.75 a 1.N'metilenobisacrilamida. com a N. mas pode variar com a intensidade das bandas e do tamanho do gel. cuja fonte de radicais livres é o N. Para padronização tente vários tempos de exposição com várias aberturas. 2. gera o suporte de poliacrilamida. Portanto. O filme mais sensível para essa finalidade é fornecida pela Sob a luz UV de no mínimo 2500uW/cm 2 e uma boa máquina .5 mm. utilizando filtro laranja. pois necessita de um ambiente isento de oxigêncio para se polimerizar. que darão subsídios para separação nesse tipo de gel. asa 3000.5% a 20%).7. O polímero formado são cadeias lineares de poliacrilamida. O comprimento médio das cadeias é determinado pela concentração relativa da acrilamida e a quantidade de bisacrilamida. Descrito por Raymond & Weintrab em 1959. Gel de poliacrilamida O gel de poliacrilamida é um suporte bastante utilizado em biologia molecular para separação e caracterização de fragmentos de tamanho menores de DNA. O tamanho do gel pode variar de 10cm de altura por 10cm de largura até 20 a 30cm de largura por 40 a 100 cm de altura dependendo da necessidade do sistema. o oxigênio é um inibidor da reação. expõe-se por alguns segundos.1. ACRILAMIDA (%) 3.0 INTERVALO DE SEPARAÇÃO (NUCLEOTÍDEOS) 10-1000 80-500 60-400 40-200 10-100 Os géis de poliacrilamida devem ser preparados entre duas placas de vidro.0 12. Recomenda-se para a máquina Polaroid modelo DS 34 uma abertura de 5.0 8. Portanto a relação entre a quantidade de acrilamida e bisacrilamida determina as propriedades físicas do gel. A polimerização ocorre por ligação vinílica. Documentação: O gel de agarose é facilmente documentado. utilizando um sistema de fotografia instantânea ou sistema automatizado de captura de imagem.

St Louis. 28 . 3a. Sambrook. 3 volumes. eds.. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Correlation. L. A. J. J.. Shanahar & J.F. E. Mosby-Year Book.F. New York.A. Molecular Cloning: a laboratorial manual.J. Clinical Chemistry: Theory. Maniats. NY.. Sambrook. & Pesce.. J. 1996. Ed. USA. Inc. 2nd ed. 1989.Literatura recomentada Kaplan. Analysis. Fritsch & T. Roche.

completando assim as fitas simples e tornando-as duplas (extensão). Nas duas fitas surgem. Rosario Dominguez Crespo Hirata • PRINCÍPIOS DA REAÇÃO DE PCR A reação de polimerização em cadeia (“Polimerase chain reaction”. A hibridização dos “primers” descrito como “Annealing” (do inglês). Extensão . então. e ocorre em 3 etapas: “Melting”(ou desnaturação que consiste na separação da dupla fita do DNA a ser amplificado). anexar as bases complementares. Este procedimento é chamado “Desnaturação” ou “melting”. 1. A solução. e muitas vezes a temperatura de desnaturação é determinada empiricamente e depende de alguns fatores como a quantidade de guanina e citosina (GC) do fragmento DNA alvo ou de interesse. isto é. um pequeno fragmento de DNA de dupla fita intacta. os “primers” ou iniciadores que são pequenos fragmentos sintéticos de DNA de fita simples. Desnaturação . 3.Quando os “primers” encontram e ligam-se aos segmentos complementares. as quais foram escolhidas. necessita de um fragmento de DNA já ligado na região previamente escolhida. incorporando um a um os nucleotídeos correspondentes. A DNA-Polimerase não 29 . 2. para hibridizar-se às seqüências complementares nas duas fitas simples (usualmente 5’). apenas nesse intervalo. “annealing”( anelamento ou hibridização.988): 1. Anelamento . a DNAPolimerase pode assumir sua função. Para isso adicionam-se. Dra. deve ser feito a uma tempertura inferior à da desnaturação (45 a 60 °C). O conhecimento da seqüência procurada é naturalmente pré-requisito para a síntese dos “primers”. oligonucleotídeos de 20 a 30 bases nitrogenadas de comprimento. Inicia-se a partir dos pequenos fragmentos de DNA de fita dupla (resultado do anelamento do “primer”). as bases juntamente com as moléculas de açúcar e fosfato. A DNA-Polimerase liga os nucleotídeos entre si. tornando-as duplas. à solução.Mario Hiroyuki Hirata Profa. A elevação da temperatura entre 90 a 95 ºC promove a separação da fita dupla de DNA em duas fitas simples.. Assoc.• Aula número 4 REAÇÃO DE POLIMERIZAÇÃO EM CADEIA (PCR) Prof. transformando as fitas simples em fitas duplas. Os “primers” perseguem na reação as regiões. é demarcar as extremidades do DNA-procurado ou de interesse nas duas longas fitas simples. assim. isto é. PCR) é a técnica que permite a amplificação do DNA ou RNA in vitro.A polimerase para assumir suas funções. utilizando-se basicamente de uma reação enzimática catalizada pela polimerase (enzima termoestável) cuja atividade depende de ions Mg++.Inicialmente é necessário que as duas fitas de DNA a ser amplificado sejam separadas.ligação do iniciador ou “primer” ao DNA a ser amplificado) e “extension”(extensão ou seja a polimerização propriamente dita) Metodologicamente a técnica de PCR requer três passos (SAIKI et al. que são sintetizados in vitro baseado na sequência do DNA a ser amplificado sendo eles complementares à seqüência do segmento de DNA de interesse.

e os dNTPs) são misturados com uma solução tampão que ajusta o pH ótimo da reação. O operador deve apenas programar e dar início para que transcorra a amplificação.. Anunciado na Conferência da Sociedade Americana de Genética Humana de 1985. cerca de um bilhão de cópias do fragmento de DNA de interesse. que na atualidade transcorre de forma totalmente automática. No entanto. 32. A PCR é uma ferramenta na biologia molecular tão poderosa quanto a descrição das enzimas de restrição e o Southern blot. resumindo. Uma importante condição para isto foi a substituição da DNAPolimerase originalmente utilizada (extraída de E. após 30 ciclos. Os fragmentos de DNA recém-formados fornecem mais moldes para a montagem de novas fitas nos ciclos subseqüentes. Automação da PCR O procedimento da PCR foi tão aperfeiçoada desde a sua primeira descrição. os vários ciclos transcorrem. cerca de um bilhão de cópias da seqüência de DNA de interesse. a DNA-Polimerase. Um aparelho de PCR ou um termociclo repete o correspondente programa de temperaturas. Técnicamente muitas mudanças tem sido introduzidas melhorando cada vez mais e ampliando a sua utilização. 8. 64..reconhece apenas o bloco de início como também consegue diferenciar as duas extremidades dos “primers” (3’ e 5’). é preciso salientar que para cada situação experimental. os “primers”. 128. Desta forma. de tal forma que pode ser definida matematicamente por: N = No × 2n N = número de moléculas amplificadas No = número de moléculas iniciais n = número de ciclos de amplificação O modelo teórico considera que a eficiência do processo de amplificação corresponde a 100%. O produto amplificado pode alcançar aproximadamente 106 cópias em 30 ciclos e pode ser realizado em 2 horas. em menos de duas horas. Um ciclo dura em média três minutos. dependendo do gene amplificado. no entanto. Assim. a técnica de PCR tem sido utilizada de forma multidisciplinar com um número crescente de publicações por ano(exemplo de 1985 a 1990 mais de 600). o que não é observado na prática. em um único tubo de ensaio. temos uma reação em cadeia. completando a fita simples daí em diante. Ela inicia a reação sempre pela extremidade 3’ do “primer”. de tal forma que é muito 30 . podem ser produzidas cerca de um milhão de cópias e. com região já determinada. seguidamente. 16. Experimentalmente. a eficiência da reação está abaixo da ideal e gira entorno de 78% a 97%. portanto. em uma hora. Após cada ciclo. Teoricamente após 20 ciclos têm-se cerca de um milhão. Todos os reagentes necessários (o DNA-template. sempre na direção do fragmento procurado. e então novamente 4. novas modificações têm de ser introduzidas. o número de fragmentos se duplica: de um formando-se 2. sem necessidade de interrrupção para a adição de nova DNA-Polimerase ativa. coli) por uma DNA-Polimerase termoestável extraída da bactéria Thermus aquaticus (Taq-polimerase).

na Microbiologia a atuação da biologia molecular é muito ampla.1986. substratos antigenicos. • PROTOCOLO GERAL PARA PCR 31 . a necessidade de meios mais sensíveis e precisos farão com que a técnica de PCR se torne uma ferramenta impressindível e quase obrigatória no diagnóstico precoce de várias doenças. muitas doenças infecciosas dependem de um diagnóstico rápido e seguro. que uma simples cópia de gene pode ser extraida de uma mistura complexa da sequência genômica de forma rotineira e visualizada como uma simples banda no gel de Agarose. Os principais problemas citados na literatura para a padronização pode-se assim resumir: Não detecção do produto. Como se pode notar. para um desenho experimental com sucesso. mutação ou heterogeneicidade devido a erro de incorporação.683. A liberação para uso rotineiro no laboratório clínico ainda não é permitido para toda as possíveis aplicações. podemos dizer que um protocolo geral pode ser seguido. Na aplicação diagnóstica e. apesar de estar ainda no cunho de afirmação e de uso restrito à pesquisa e ao ensino. presença de bandas não específicas devido a “mispriming” ou “misextension” dos “primers”. Sonda (probe): É um segmento de DNA ou RNA que foi marcado seja com enzimas. geralmente sintetizado quimicamente por instrumentos automáticos. substâncias quimioluminescentes ou radioativas. que podem ser adquiridos no comércio para fins já definidos ou se escolhe a região desejada do DNA ou RNA a ser amplificada. é fundamental o conhecimento básico das etapas envolvidas na técnica. A utilização de PCR é tão ampla que podem ser editados compêndios sobre a metodologia de PCR em cada especialidade diagnóstica. baixo rendimento do produto desejado. no entanto. que com certeza a única solução está na PCR. que podem ligar-se com alta especificidade a uma sequência complementar do ácido nucleico alvo (escolhido). Porém. Por outro lado. Primer: é um seguimento de DNA ou RNA de 15 a 40 bases. a sensibilidade e a especificidade que o método pode oferecer é algo singular. geralmente baseado na sequência já conhecida do ácido nucleico.195. Mullis e cols. A PCR utilizando DNA polimerases termoestáveis foi descrita pela primeira vez por Kary Mullis e patenteada nos EUA sob o n° 4. 1985. Mullis e Faloona 1987 introduziram as diversas aplicações do PCR para a comunidade científica e atualmente é inesgotável a sua aplicação prática tanto na pesquisa básica como na aplicada. formação de dímeros dos “primers” que competem pela amplificação com o produto desejado.202. Saiki e cols. em julho de 1987 e n° 4. particularmente. A técnica de PCR é tão sensível que é capaz de amplificar uma simples molécula de DNA e tal é a sua especificidade. mas com a ressalva da necessidade da optimização para cada tipo de aplicação.difícil descrever um único procedimento para um uso generalizado. Em termos práticos.683. apesar do custo ainda estar um pouco elevado.

a quantidade de produto desejado será insuficiente. Pré-incubar (se for DNA genômico) 10 minutos a 94o C 4. 50 µM de cada dNTP(dATP.5 a 5 U/100µl. Quando em etapa de optimização. ocorre o aparecimento de produtos inespecíficos que podem se acumular. e ao contrário.7. Obs: A quantidade de enzima necessária varia com as características do “template” e do “primer. 0.Tm>55°C é preferido) 2.1. 100µg/ml de gelatina autoclavada ou albumina bovina livre de nuclease 2. 2.8. por 30 segundos a 2 minutos Polimerização (Extension): 72°C(pode variar de 55 a 72°C) por 1.5. MgCl 2 1.4. 20°C) 2. 20 mM Tris-HCl (pH8. 20 pmol de cada “primer” (ou iniciadores.2 a 2 unidades de Taq polimerase 3.5 U são suficientes para uma boa amplificação em 100µl de volume total. Kcl 25 mM 2. 2.3. se baixo.5 mM 2.5 minutos Extensão final do programa: de 25 a 30 ciclos.6. Escolha o volume a ser usado. A reação pode ser realizada no volume de 100µl ou 50µl. dCTP.” Se a concentração de enzima for muito alta.2. Tween 20 a 0. colocar em um tubo de 0. • FATORES QUE INFLUENCIAM A PCR 1.3.9. Programar o termociclo em: Desnaturação: 96 °C (pode variar de 94 a 96°C). 32 .1. dGTP. DNA a ser amplificado 105 a 106 moléculas(“target DNA” ou “Template”) 2.05% 2. as quantidades da enzima a serem utilizadas coompreendem o intervalo maior entre 0.5 ml com tampa com fechamento hermético. por 15 segundos a 2 minutos Hibridização (Primer Annealing): 55 °C (pode variar de 45 a 62°C). de 72°C por 5 a 10 minutos Estabilização e parada de reação: 4°C ou adição de 10 mM de EDTA. Atividade enzimática da Taq polimerase Se os outros componentes da reação estiverem optimizados. Para o volume de 100µl. de 1 a 2. dTTP) 2.

8 medido a 20°C. O DMSO (dimetilsulfoxido) é util para a reação de amplificação com Klenow fragmento de E.5 mM acima da concentração total do dNTPs. Deoxinucleotídeo trifosfato: Se a solução de uso for preparada a partir de solução estoque é necessário neutralizar para pH 7. Este tampão dipolar tem um pKa de 8. Deve-se utilizar as mesmas concentrações de dNTP ou valores equivalentes.6 µg de DNA ou 10pmol de uma sequência de 400bp. 2. O Cloreto de sódio a 50 mM. ou KCl abaixo de 50 mM inibe a atividade da Taq polimerase.8 durante as condições de termociclagem. De qualquer modo. A estabilidade dos dNTPs após os vários ciclos de amplificação permanece em aproximadamente 50% da concentração inicial. Quanto menor a concentração de dNTPs menor o risco de “mispriming” ou erro de incorporação de nucleotídeos. A solução de trabalho recomendada é de 1mM de cada dNTP. pois afeta a hibridização(“annealing”).3 a 8.3 a 20°C e um pKa de -0. o produto de PCR. a concentração recomendada varia de 20 a 200µM para um resultado com boa especificidade e reprodutibilidade. para cada experimento deve-se encontrar uma quantidade ótima. Na reação. se a aquisição for de vários fornecedores. 33 . seguida de determinação espectrofotométrica da concentração. Sempre deve-se considerar a concentração de EDTA na amostra que pode interferir na concentração dos íons Mg++. quantidade suficiente para sintetizar 2. 3. distribuida em alíquotas e estocada a -20 °C. 4. Outros componentes O tampão recomendado para o PCR é o TRIS-HCl na concentração de 10 a 50 mM com pH entre 8. apesar de Chamberlain e cols. A solução primária deve ser preparada a 10mM.5 a 2. A concentração dos ions Mg++ deve estar entre 0. Pode-se adicionar cerca de 50mM de KCl na mistura de reação para facilitar a hibridaçào dos “primer”. pode-se obter resultados diferentes. coli DNA polimerase I. diferentes condições de ensaio e pode diferir na definição da unidade. a temperatura de separação do DNA alvo (“melting”). 10% de DMSO inibe a atividade da Taq polimerase em 50%. o pH verdadeiro de 20mM de TRIS pH 8. leva à formação de dimerização de “primer”. a atividade da enzima Taq.0. Concentração de Magnésio. o recomendarem para amplificação de sequências multiplas. prejudicando a fidelidade do experimento. devido as diferentes formulações.A origem comercial da Taq polimerase é um importante fator.8 e 6.3 a 20°C varia de 7. portanto. A quantidade mínima recomendada é de 20µM de cada dNTP para 100µl de reação. isto minimiza os erros de incorporação. a especificidade do produto. Ultimamente se estabeleceu que 2µM foi capaz de dar uma alta sensibilidade de detecção e amplificação de pontos de mutação do gene ras. A concentração de magnésio é bastante importante. na mesma reação.0021/°C.

A gelatina, a proteína (albumina bovina, 100(g/ml) e o detergente não iônico como o Tween 20(0,05-0,1%) podem ser utilizados para estabilizar as enzimas, mas muitos protocolos tem dispensado a sua utilização.

5. HIbridação dos iniciadores (“Primer Annealing”) A temperatura e tempo requerido para o hibridação de “primer ” depende da composição em bases, do comprimento e da concentração. A temperatura básica aplicável seria de 5 °C abaixo da Tm verdadeira dos primers. Devido a Taq DNA polimerase ser ativa abaixo do intervalo de temperaturas, a extensão dos primers ocorrerá em baixas temperaturas, incluindo a etapa de hibridação. O intervalo de ação da atividade enzimática varia na ordem de 2 vezes a magnitude entre 20 a 85°C. A temperatura de “annealing” no intervalo de 55 a 72°C, geralmente dá melhor resultado. Numa concentração típica de primers(0,2µM), o “annealing” só requer poucos segundos. O aumento da temperatura de “annealing” aumenta a discriminação contra os erros de hibridização dos primers “mispriming”, reduzindo a extensão ou polimerização dos nucleotídeos incorretos no final 3’ dos “primers”. Portanto, as temperaturas de “annealing” mais estringentes, especialmante nos primeiros ciclos poderá aumentar a especificidade. Para se obter uma especificidade máxima, no início dos ciclos aumenta-se a temperatura de “annealing” e adiciona-se a Taq polimerase após a primeira etapa de desnaturação e “annealing” do primer. Baixas temperaturas de etapas de “extension” com altas concentrações de dNTPs favorecem os erros de polimerização, ou seja, os nucleotídeos são incorporados erroneamente, motivo pelo qual alguns autores recomendam a utilização de “primers” mais longos e de 2 temperaturas para o PCR. As temperaturas são de 55 a 75°C para “annealing” e “extension” e 94 a 97°C para desnaturação e separação de cadeias. 6. Extensão (ou polimerização) O tempo de polimerização ou “extension” também depende de alguns fatores como a concentração e o comprimento do DNA a ser amplificado. A extensão dos “primers” tradicionalmente é realizada a 72°C, porque esta temperatura é próxima do ótimo para extensão de “primers” no modelo de DNA do M13. A média de incorporação dos nucleotídeos a 72°C varia de 35 a 100 nucleotídeos por seg-1 dependendo do tampão, pH, concentração salina e natureza do DNA alvo. O tempo de 1 minuto a 72°C é considerado suficiente para a extensão de produtos de até 2kb. No entanto, tempos mais prolongados podem ser úteis em casos de poucos ciclos e se a concentração do substrato for muito baixa e também em ciclos prolongados quando a concentração do produto ultrapassa a concentração da enzima. 7. Tempo e temperatura de desnaturação 34

A maioria das causas de insucesso do PCR é a incompleta desnaturação do DNA a ser amplificado ou do produto de PCR. Uma temperatura típica de desnaturação é 95°C por 30 segundos, ou 97°C por 15 segundos, porém, temperaturas mais altas podem ser apropriadas especialmente para DNA ricos em G+C. Apenas alguns segundos são necessários para desnaturar e separar as cadeias de DNA, porém, um maior tempo é necessário para se atingir a temperatura dentro do tubo de reação. Seria desejável a monitoração da temperatura dentro do tubo de reação utilizando uma sonda térmica de medida exata. A desnaturação incompleta reduz a possibilidade hibridização entre o DNA alvo e os “primers”, diminuindo o rendimento do produto do PCR. Por outro lado, a desnaturação por longo tempo ou alta temperatura leva a perda de atividade da Taq polimerase, que é maior que 2 horas, 40 minutos e 5 minutos nas temperaturas de 92,5; 95 e 97,5°C, respectivamente. 8. Número de ciclos. O número de ciclos dependerá da quantidade de DNA inicial, quando todos os parâmetros estão optimizados. Um erro comum que se comete é um excesso de número de ciclos. Segundo Kary Mullis “Se você tem que ir mais que 40 ciclos para amplificar uma simples cópia de gene, existe alguma coisa seriamente errada com o seu PCR”. Muitos ciclos pode aumentar a quantidade e a complexidade de produtos não específicos. Obviamente, um número muito baixo dará um baixo rendimento do produto desejado. 9. Iniciadores (“Primers”) A concentração dos “primers” entre 0,1 a 0,5 mM são, na maioria das vezes, satisfatórios. Concentrações maiores podem promover “mispriming” e acúmulo de produtos não específicos e podem aumentar a probabilidade de gerar um artefato independente do “template” denominado de “primerdimer”(dimerização de primer). Produtos não específicos e dimerização de “primer” são por si só substratos para o PCR e competem com o produto desejado pela enzima, dNTPs, e os primers, resultando em baixo rendimento do produto desejado. Algumas das regras gerais para um bom desenho de primers eficientes seriam: de 18 a 28 nucleotídeos em comprimento, tendo cerca de 50 a 60% de G+C na sua composição. A temperatura de “melting” (Tm) dos pares de primers deve ser adequada. Para esse propósito, pode-se usar a regra da prática de 2°C para o A ou T e 4°C para o G ou C. Dependendo da aplicação, o Tm entre 55°C e 80°C são os recomendados. Deve também evitar a complementaridade na porção 3’ do par de "primers", pois isso pode promover a formação de artefatos de dimerização de primers e reduzir a produção do produto desejado. Outra observação é evitar três ou mais C+G na porção 3’ dos primers que pode promover “mispriming” na sequência rica em G+C. Deve-se evitar, quando possível, a presença de sequências palindrômicas dentro dos primers. Se ainda, depois desses cuidados, continuar a falhar, é salutar então tentar outro par de primers. Uma razão menos óbvia para alguns primers falharem é a presença de estrutura secundária no DNA “template”. Neste caso, substituir com 7-deasa-2’deoxiGTP o dGTP e avaliar. O desenho de primers 35

para propósitos especiais também podem ser elaborados tais como a adição de sítios de enzimas de restrição, mutação in vitro, ATG “start codon”, e outros. 10. Efeito Plateau O termo efeito plateau é usado para descrever a atenuação exponencial da taxa de formação de produto de PCR, que pode ocorrer durante a fase tardia do PCR concomitantemente com o acúmulo de 0,3 a 1 pmol do produto desejado. Dependendo das condições da reação e da ciclagem térmica, um ou mais parametros podem ser afetados: 1)utilização dos substratos (dNTP ou “primers”), 2)estabilidade dos reagentes(dNTP ou enzimas), 3)inibição por produto formado(pirofosfato,DNA duplex), 4)competição por reagentes pelos produtos inespecíficos ou dimerização de primers, 5) “reannealing” de produto específico na concentração acima de 10-8 (pode diminuir a eficiência da extensão ou o processamento da Taq DNA polimerase ou causar subdivisão na migração das cadeias e deslocamento de primers) e 6) incompleta desnaturação dos “templates” ou DNAs formados ou separação do produto em alta concentração. Um importante fator que determina o aparecimento do efeito plateau é a presença inicial de baixas concentração de produtos desejado com presença de produtos não específicos resultantes de eventos de “mispriming” que podem continuar a ser amplificados preferencialmente. A optimização do número de ciclos de amplificação é a melhor maneira de evitar a amplificação de produtos indesejáveis.

• ESCOLHA DOS INICADORES PARA PCR
A. Protocolo básico para desenhar um iniciador (“primer”) 5’para 3’( sense)
Regras gerais: Determinar a prioridade da utilização(clonar, PCR, hibridizar, outros) Se for para clonar: analisar a sequência do cDNA estudando as enzimas de restrição do DNA alvo e seguir o protocolo a seguir: 1. Copiar a sequência e região desejada do cDNA de interesse (não mais que 6 aminoácidos ou 18 bp) 2.Adicione no início 6 bases aleatórias 3.Adicione a sequência a enzima de restrição desejada (Hind III, EcoRI, etc) 4. Acrescentar a sequência que codifica o início da síntese de aminoácido(metionina -ATG) 5. Checar a sequência em voz alta e verificar a porcentagem de Base C+G, que não deve ultrapassar 50% 36

Se não usar para clonagem apenas copie a sequencia desejada. Checar a sequência em voz alta. 3. faça a complementariedade e copie a sequencia inversa. Faça a complementar dessa sequência 6. não deixando ultrapassar 50% (aceite com as base aleatórias acrescidas). para avalia-los adequadamente antes de requerer a síntese. Adicione a sequência que codifica o “stop codon” no final da sequência(TAG TAA) 3. omita as etapas 2. Adicione a sequênicia da enzima de restrição 4. Copiar a sequencia da região desejada do cDNA de interesse( não mais que 6 aminoácidos ou 18 bp) 2. Ex. PCR diagnóstico etc. e acrescente mais pares de base para ajustar a relação C+G se necessário(não > 30). Literatura recomendada 37 . Protocolo básico para desenhar um iniciador (“primer”) 3’para 5’ (anti-sense) Regras gerais: Determinar a prioridade da utilização Se for para clonagem seguir os mesmos critérios acima para o “sense primer” 1. Adicione 6 bases aleatoriamente(acertar a relação C+G) 5. calcular a relação C+G. checando a sequencia em voz alta. 4. 8.Caso o primer for utilizado para outras finalidades como: hibridização. 5’ CGC AAA GCT CAG ATT GGT 3’ 5’CGC AAA GCT CAG ATT GGT TAG TAA AAG CTT AGA AGC STOPSTOPHindIII bases aleatórias 3’ GCG TTT CGA GTC TAA CCA ATC ATT TTA GAA TCT TCG 5’ 5’GCT TCT AAG ATT TTA CTA ACC AAT CTG AGC TTT GCG 3’ Recomenda-se avaliar o primer desenhado em um programa de computador.Copie a sequencia complementar em direção oposta ou seja do 5’ para o 3’(pois o sintetizador sempre iniciado 5’) 7. Ex 5’ AAA AAT CTA AAA TCT CCT 3’ GAT ATG CAT ATG AAA AAT CTA AAA TCT CCT 3’ random NdeI+iniciador B.

J. Mullis. 1989.K. Biochem Biophy.& Gelfand. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification. Cold Spring Harbor Symp.A. & Faloona. Saiki R.S. K. Res. Methods Enzymol. et al 1988. Mullis K. Introducing amplitaq DNA polymerase .K. D. Enzymatic amplification of (globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. 16:11141-11156. Nucleic Acids Res. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Ehln T. Quant. Amplifications1:4-6.155:335-50. Saiki. et al 1986.Chamberlain.H. Detection of ras point mutations by polymerase chain reaction using mutation-specific. Biol. 160:441-7. L. & Dubeau. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed reaction. 51:263-73. 38 . Commun.m inosine containing oligonucleotide primers. R. et al 1985. 1987. F. 1989.B.B. Science 230: 1350-1354.

3 4 .. 39 .... Taq DNA polimerase 1 2 ..MODELO DE PROTOCOLO DE PCR Data: ___/ ___/ REAGENTES ORDEM DE ADIÇÃO ÁGUA ESTÉRIL Tampão PCR 10X dATP (___mM) ..... dGTP (___mM) .. Primer 1 _________ Primer 2 _________ MgCl2 25 mM Dimetilsulfoxido DNA ( amostra) DNA (controle +) água (controle .13. dCTP (___mM) ....)....... 5 6 7 8 9 10 11 12 ..... 12 ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ VOLUME CONCENTRAÇÃO FINAL Se necessário fazer um mistura dos reagentes comuns evitando contaminação e erros na pipetagem.. dTTP (___mM) ..

O código do DNA e seu correspondente polipeptídeo são colineares. A maioria das doenças genéticas são raras. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata Prof. Para mais de 800 desordens clínicas a lesão intragênica é conhecida. Assoc. os seguintes tem sido mais freqüentemente utilizados: (1) posição do clone baseado na posição conhecida do cromossomo. em torno de 2800 genes foram mapeados nos cromossomas autossômicos humanos. já que o modo da herança e o curso da doença podem diferir.. As doenças determinadas geneticamente não são apenas um grupo marginal para a medicina. e (3) mapeamento de pequenas regiões para verificar deleções ou para analisar pontos de ruptura (“breakpoints”) com translocações de cromossomas. As doenças genéticas são causadas por alterações. Numerosas doenças são clinicamente similares (fenótipo similar). (2) estratégia do gene candidato.• Aula número 5 PCR NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS GENÉTICAS Marcos de Oliveira Machado Profa. mas representam juntas uma considerável proporção de todos os processos das doenças médicas. a sequência de aminoácidos pode estar alterada no sítio correspoondente (mutação à nível protéico). Até o presente. onde um gene previamente conhecido com um papel funcional normal sabe-se conter mutações. mas a ocorrência de uma doença em particular representa um urgente problema para uma família afetada. Na prática. Mutações nestes genes levam a doenças genéticas monogênicas. isto é importante para o diagnóstico e aconselhamento genético. toda mutação tem uma posição definida. Se a sequência de DNA sofre mutações. e aproximadamente 230. Uma mutação na sequência de bases do DNA produz um códon dferente. Dos vários métodos desenvolvidos para isolar e identificar os genes defeituosos (Ex: loco no qual as mutações causam uma doença). A heterogeneidade alélica (devido a diferentes alelos mutados em um loco genético) e heterogeneidade hetero-alélica (devido a mutações em diferentes locos genéticos) podem ser diferenciadas. e eles complementam um ao outro. • POLIMORFISMOS E MUTAÇÕES A sequência de nucleotídeos do DNA determina uma correspondente sequência de aminoácidos através da transcrição e tradução. no cromossoma X. Assim. 40 . denominadas mutações. Mario Hiroyuki Hirata • DOENÇAS GENÉTICAS Atualmente já foram mapeados aproximadamente de 800 a 2800 locos gênicos. nesses locos ou em outros a serem ainda mapeados. A posição onde resultou a mudança da sequência de aminoácidos corresponde a posição da mutação. Os métodos de mapeamento são muitos e variados. mas tem diferentes causas (princípio da heterogeneidade genética).

Na natureza. Uma substituição pode alterar um códon de modo que um aminoácido diferente estará presente neste sítio. caracterizando a mutação de sequencia trocada (“missense mutation”). 41 . os organismos das mesmas espécies usualmente diferem em alguns aspectos quanto a sua aparência. e como um resultado.os chamados pontos quentes (‘hotspots’). pelo qual o menos frequênte alelo não pode ser mantido somente por repetidas mutações.01 (1%). de mutação. características morfológicas dos cromossomos (polimorfismo cromossomal). Dois tipos de substituição podem ocorrer: transição (troca de uma purina por outra purina ou uma pirimidina por outra) e transversão (mudança de uma purina por uma pirimidina ou vise versa). A maioria dos pares de base incorretamente formados durante o processo de polimerização não se torna permanentemente incorporados ao DNA. Os agentes químicos possuem estruturas suficientemente similares às bases normais para serem metabolizadas e incorporadas ao DNA durante a replicação. e inserção (adição).polimerase III. deleção (perda). há três diferentes tipos de mutação envolvendo um só nucleotídeo ( mutação pontual): substituição (troca). Todos os seres vivos sofrem um certo número de mutações como resultado de funções celulares normais ou interações aleatórias com o ambiente. heterozigotos para tais alelos ocorrerem com uma frequência de pelo menos 2%.Basicamente. mas existem determinados sítios em que ela ocorre com maior frequência . portanto. elas são suficientemente diferentes para aumentar a frequência de pareamento errado e. As radiações aumentam a excitabilidade dos átomos presentes no DNA. Alguns agentes podem aumentar o grau de mutações. em formas variantes de proteínas e substâncias de grupos sanguíneos (polimorfismo bioquímico). denominadas de mutações espontâneas.). cerca de um em cada dez nucleotídeos corretamente pareados é removido pela atividade de exonucleásica 3’→ 5’da DNA.V. e isto é a base dos efeitos mutagênicos da luz ultravioleta e da radiação ionizante. mas isto não tem efeito na fase de leitura. Um loco genético é definido como polimórfico se o (s) alelo (s) raro (os) tem uma frequência de pelo menos 0. O polimorfismo genético é definido como a ocorrência em uma população de dois ou mais fenótipos alternativos determinados geneticamente devido a diferentes alelos. Além disso. as sequências seguintes não codificam para um produto genético funcional (mutação de sequencia interrompida ou nonsense mutation). os agentes mutagênicos. Estes agentes podem ser químicos (ex: ácido nitroso) ou físicos (ex: raios U. constituindo o polimorfismo genético. e as modificações que eles causam são denominadas mutações induzidas. dois ou mais alelos podem ocorrer. enquanto que uma deleção ou inserção causam uma mudança na fase de leitura (mutação de sequencia descolada ou “frameshift mutaion”). que exerce função de revisar a polimerização. Na substituição o codon é alterado e pode codoficar para um diferente aminoácido. Na mutação de sequencia deslocada. O polimorfismo pode ser observado à nível do indivíduo como um todo (fenótipo). As DNA-polimerases possuem uma atividade exonucleásica 3’→ 5’ que garante uma remoção de praticamente todo nucleotídeo erroneamente pareado. Contudo. Em muitos locos gênicos. As diferenças são geneticamente determinadas e são denominadas de polimorfismo. As mutações podem ocorrer em vários sítios do DNA. ou à nível de diferenças na sequência de nucleotídeos do DNA (polimorfismo de DNA ou genético).

como a anemia falciforme. Nesse caso. tornando possível amplificar-se um segmento de DNA que pode ser então. um diferente aminoácido será incorporado no sítiocorrespondente. A análise do produto de PCR por determinação da sequência de nucleotídeos é a mais informativa em relação aos polimorfismos. após a atividade dessas enzimas. À nível molecular.Geralmente. O desenvolvimento da técnica de amplificação de segmentos de DNA utilizando a reação de polimerização em cadeia (PCR) abriu enormes perspectivas para a análise de genes. por eletroforese em gel. entre outros exemplos. o alelo forma um produto gênico que pode ser distinguido devido sua diferente velocidade de migração em um campo elétrico (eletroforese). bem como na tipagem de HLA. 42 . O polimorfismo de uma proteína (produto do gene) pode ser demonstrado por eletroforese em gel quando a forma variante difere de outras pela presença de um aminoácido com carga elétrica diferente. Diferenças individuais nas sequências das bases dos nucleotídeos do DNA podem ser determinadas. Quando já se tem informação sobre a presença de polimorfismo em um determinado loco. A mudança em uma das bases da sequência determinará a atividade ou não da enzima naquele sítio específico. usando-se condições em que a diferença de uma única base pode ser detectada. talassemias e fibrose cística. como por exemplo. iniciadores contendo a região 3’correspondente à sequência polimórfica são utilizados e somente ocorre a amplificação quando há o pareamento correto das bases na região 3’. em nível da sequência de nucleotídeos. métodos rápidos e simples podem ser utilizados para detecção dos produtos de PCR por técnicas de hibridização com sondas genéticas específicas. o polimorfismo pode ser identificado pelo uso de enzimas de restrição que reconhecem no DNA determinadas sequências de bases nucleotídicas (sítios). o polimorfismo não é perceptível pelo fenótipo. podese identificar este tipo de polimorfismo. diagnóstico de doenças genéticas. Cada enzima (obtidas de uma ampla variedade de bactérias) tem em particular um alvo na dupla fita de DNA. O polimorfismo de DNA também pode ser detectado diretamente na reação de PCR. por sequênciamento direto do DNA. específicas para a sua atividade de clivagem. Dessa forma. Se a diferença na sequência levar a uma mudança no códon. ou por hibridização com sondas genéticas. Neste caso. Isto pode ser demonstrado pela análise do produto do gene. geralmente uma sequência específica de 4 a 6 bp. detecção de agentes infecciosos. • ANÁLISE DO POLIMORFISMO DE DNA POR PCR O surgimento de novas técnicas em Biologia Molecular tem alterado significativamente as formas de abordagem dos problemas básicos e aplicados nessa área. analisado de diferentes formas. Os métodos laboratoriais são o meio pelo qual ele é detectável. por clivagem com endonucleases de restrição (RFLP). Esse método tem sido aplicado na detecção de mutações em doenças genéticas. O polimorfismo que não leva a uma mudança na carga elétrica não pode ser identificado dessa maneira. A análise do polimorfismo de DNA por PCR é realizada a partir de iniciadores adjacentes a uma determinada região polimórfica do DNA.

onde se ligam e cortam. pode-se identificar alelos de um loco genético em particular que estão associados com um 43 . esclerose múltipla e artrite reumatóide. distrofia muscular de Duchenne. que possuem massa molecular relativa (Mr) de 513 Kda e 246 kDa. A apo B Defeituosa Familiar ocorre por substituição do amino ácido arginina (Arg) pela glutamina (Gln) no resíduo 3500. estão associadas aos alelos específicos dos locos HLA classe II. síndrome de Lesch-Nyham. como a β. A apo B-100 é uma das maiores proteínas já conhecidas. resultado da substituição da arginina. Mutações no gene do receptor da lipoproteína de baixa densidade (LDL) e polimorfismos nos genes da apolipoproteína B e E (Apo B e Apo E) têm sido detectados por PCR e relacionados com o risco de doenças cardiovasculares. na amplificação de DNA genômico para a detecção de anemia falciforme. Essas alterações metabólicas estão fortemente associadas com a doença coronariana prematura.Talassemias. doença de Tay-Sachs e doença de Gaucher. o uso da PCR tem sido de grande utilidade. secundária ao aumento da síntese de apo B-100 e na remoção plasmática da LDL. tem permitido estudar a variação do gene à nível de DNA. produzindo diversos fragmentos de acordo com o número de sítios para aquela enzima. localizado no braço curto do cromossoma 2 (2p 23-24). contendo 4536 resíduos de amino ácidos e 8-10% de carboidratos. As endonucleases (enzimas de restrição) reconhecem sitios específicos na sequência de nucleotídeos do DNA (sítios de restrição). várias outra doenças.A técnica de PCR foi utilizada. embora alguns pacientes com hiperapo-B apresentem níveis normais de colesterol e triacilgliceróis no plasma. A hiperapo-B consiste em uma alteração do gene da apo B-100. Analisando estes fragmentos de restrição polimórficos. pelo triptofano. pela primeira vez. Recentemente. Com isso há uma redução na remoção plasmática da lipoproteínas. tem sido diagnosticada por PCR. O polimorfismo ocorre quando as mutações na sequência de DNA criam ou abolem um sítio de restrição. fenilcetonúria. respectivamente. • POLIMORFISMO DE APOLIPOPROTEÍNAS Apolipoproteína B A apo B ocorre no plasma em duas formas primárias designadas apo B-100 e apoB-48. a clonagem e o sequênciamento do gene da apo B. como a hiperapoliproteinemia B (hiperapo-B) e a apo B defeituosa familiar. tais como doenças cardiovasculares e doenças auto-imunes. devido a uma superprodução de LDL. Doenças auto-imunes. Essa mutação altera a corformação do domínio de ligação da apo B-100 aos receptores da LDL. que podem resultar em diminuição da remoção plasmática dos remanescente de VLDL e das LDL. Desde então. da posição 4019 na sequência primária da molécula de proteína. A hiperapo-B é caracterizada pelo aumento de partículas de LDL pequenas e densas. Para algumas doenças em que a predisposição genética é bastante alta. que se acumula no plasma. fibrose cística. prejudicando a interação da LDL com esses receptores. levando a hipercolesterolemia moderada ou severa que é importante fator de risco para o desenvolvimento de doenças ateroscleróticas. como a diabete melito insulina-dependente. Defeitos genéticos da apo B têm sido descritos.

Em outras lipoproteínas. Alguns dados revelam que a LDL de indivíduos com o genótipo X-X. os quais podem ser detectados pela enzima XbaI: o alelo X+ (presença do sítio de restrição) e o alelo X. A mais consistente associação entre os RFLP e os lipídeos plasmáticos envolve o polimorfismo XbaI. A associação do polimorfismo genético com uma dada doença ou com um fator de risco pode existir por algumas das seguintes razões: o polimorfismo por sí só pode constituir uma mutação funcional. Ela também está presente nos quilomícrons e seus remanescentes. um à nível de gene e outro à nível de pós-tradução. a qual pode influênciar na afinidade pelo receptor ligante. Por outro lado. a apo E divide a propriedade de ligante-receptor com a apo B-100. A apo E é o único ligante para o receptor da VLDL em algumas lipoproteínas tais como os quilomícrons e seus remanescentes. também vem sendo pesquisados com relação a eventuais influências no mecanismo das doenças coronarianas ateroscleróticas e no seus fatores de risco ambientais. como a dieta. ou a associação pode ser devido a outros fatores.(ausência do sítio de restrição). apo B e triglicerídeos. provavelmente influênciam no metabolismo dessas lipoproteínas sob condições normais e patológicas.possuem maior afinidade pelo receptor da LDL quando comparada com a LDL de indivíduos com o genótipo X+X+. localizado na terceira base do códon 2488 do gene da apo B. Diversos RFLP da apo B foram descritos. MspI e Ins/Del. é suficiente para determinar dois tipos de alelos para este tipo de polimorfismo. O catabolismo de partículas ricas em triglicerídeos. A sua principal função está na contribuição para a interação das lipoproteínas com os receptores celulares responsáveis pela captação destas lipoproteínas. o primeiro polimorfismo da apo 44 . tais como o polimorfismo EcoRI. A estrutura e conformação da apo E em solução. mas estar acoplado a um desequilíbrio através da mutação funcional. Outros RFLP do gene da apo B. pode não ter um efeito direto. e nas IDL. tem se observado que o polimorfismo da apo E influência na concentração de colesterol da LDL em diferentes popula!ões. Em humanos o gene da apo E está localizado no cromossoma 19 cercado nas proximidades pelos genes da apo C-I e C-II e bastante distante do gene do receptor da LDL. formando assim três genótipos: X-X-. caracterizando o polimorfismo de tamanho de fragmentos de restrição (RFLP). incluindo a VLDL e a LDL. X-X+ e X+X+. colesterol da LDL. Dois tipos de polimorfismos da apo E tem sido detectados. Muitos estudos foram feitos relacionando os alelos e/ou genótipos do polimorfismo XbaI com os níveis plasmáticos de colesterol total.fenótipo clínico. A função da apo E no desenvolvimento da aterosclerose não está totalmente esclarecida e especialmente o mecanismo de regulação dos níveis de colesterol através desta apolipoproteína ainda é obscuro. Uma única mudança na terceira base deste códon. Apolipoproteína E A apo E é o principal constituinte protéico das VLDL e possui um papel importante no metabolismo das lipoproteínas. sem alteração na sequência de aminoácidos da apo B. através de receptores pelos quais a apo E serve como ligante. Alguns desses RFLP podem estar associados com variações nos níveis plasmáticos de lipídeos e aterosclerose. e especialmente sua topografia na superfície das partículas lipoprotêicas. podem desta maneira ser modulados pela conformação da apo E.

sendo três heterozigóticos (E3/2. também denominados receptores B. surgiram novas possibilidades para examinar este problema. sendo que o fenótipo E2 possui afinidade aproximadamente 100 vezes menor por esse receptor.E). E3/3 e E4/4). ε 3 e ε 4) presentes em um único loco. Os indivíduos que apresentam o fenótipo E2 têm níveis plasmáticos das VLDL e de seus remanescentes aumentados. principalmente do colesterol. O resultado deste alto nível de LDL induz enfim a uma aterosclerose prematura e ao infarto do miocárdio. Os receptores são estruturas glicoprotêicas que estão agrupados em regiões definidas da membrana celular. A deficiência funcional no receptor da LDL na FH resulta no acúmulo de LDL no sangue.E é devido a presença de três alelos comuns (ε 2. Mutações no gene do receptor da LDL causa uma doença hereditária do metabolismo lipídico chamada de Hipercolesterolemia Familiar (FH). Nos meados de 1980. enquanto que o genótipo E4/4 (E4) difere do E3/3 por substituição da cisteína-112 pela arginina. com o advento da tecnologia do DNA. onde a lipoproteína se liga por intermédio da apolipoproteína. que estão associados com a disbetalipoproteinemia familiar (Hiperlipoproteinemia tipo III) e representam riscos em potencial para o desenvolvimento da aterosclerose. No fenótipo E4 a capacidade de ligação do receptor da LDL. • POLIMORFISMO DO RECEPTOR DA LDL Além das apolipoproteínas os receptores celulares das lipoproteínas também estão relacionados com as variações nos níveis séricos lipídicos e lipoprotêicos. porém os níveis plasmáticos de colesterol e de LDL estão aumentados. específicas para estas regiões polimórficas. 45 . é normal. A determinação desses alelos pode gerar seis diferentes genótipos.E. No primeiro tipo de polimorfismo da apo E. protegem as células do acúmulo desses lipídeos. que o E3. A LDL liga-se a estes receptores por intermédio da apo B-100 presente nas partículas. O receptor da LDL humano é constituído de 839 resíduos de amino ácidos e apresenta cinco domíneos. E4/2 e E4/3) e três homozigóticos (E2/2). o genótipo E2/2 (associado ao fenótipo E2) difere do E3/3 (E3) pela substituição da arginina pela cisteína na posição 158 da sequência de amino ácidos da apo E. O genótipo E3/E3 é o mais comum e está presente em 60% da população. Eles fazem parte do mecanismo de remoção das lipoproteínas do plasma e fornecimento do colesterol e triacilglicerídeos para as células. Uma variedade de células humanas contêm receptores de alta afinidade para a LDL. Essas diferenças na estrutura primária influenciam na capacidade de ligação da apo E pelo receptor da LDL (B. Alguns anos atrás um grupo de pesquisadores sugeriu que os genes normais do loco do receptor da LDL poderiam contribuir para variação populacional nos níveis séricos de colesterol. ao mesmo tempo. Esse polimorfismo da apo E também pode ser analisado pela técnica da PCR seguido do uso de enzimas de restrição. Por isso são responsáveis pela manutenção da homeostase dos lipídeos e das lipoproteínas no plasma e nos tecidos e.

1996.156-158.. foi associado ao aumento dos níveis séricos de colesterol total e da LDL em várias populações européias. 1987 46 . Também. Color atlas of genetics/Eberhard Passarge.M. BOERWINKLE. J. A. & WEINER. J. J. 307-331. HOPKINS. E.(ausência do sítio de restrição PvuII). A. Biologia molecular básica. ZAHA. In: ZAHA. cap. 1996. como a dieta. D. Estudando tais polimorfismos detectou-se correlação com os níveis de colesterol total e LDL alterados. Thieme ed. uma alta frequência do alelo A. A. Biologia molecular básica.. v. STEITZ. 15. Literatura recomendada HALLMAN. Mutação. Técnicas de DNA recombinante. In: ZAHA.. S. L. 1995 WATSON.do polimrfismo AvaII foi encontrada em pacientes brancos Africanos com FH. O alelo P. Outros mostraram que a frequência do alelo N.. The effect of variation in the apolipoprotein B gene on plasma lipid and apolipoprotein B levels: A likelihood-based approach to cladistic analysis. VISVIKINS.M. N. Mercado Aberto ed. Inc. 46. Porto Alegre.. do polimorfismo PvuII do gene do repector da LDL. 116-155. A ligação entre o polimorfismo do loco do receptor da LDL e um perfil lipoprotéico aterogênico sugere que uma mutação no gene do receptor da LDL deve ser responsável por este fenótipo. A. PASSAGLIA. Menlo Park: The Benjamin/Cummings Publishing. 58.P. cap.H.P. coord. PASSAGLIA..M. p.M. Ann.. Hum. Mercado Aberto ed.do polimorfismo NcoI) foi significantemente maior em pacientes com FH do que nos indivíduos do grupo controle. Diante de todos estes dados podemos concluir que o polimorfismo genético das apolipoproteínas B e E. 6. Um amplo espectro de mutações localizadas na parte estrutural do gene do receptor-LDL tem sido analisadas... 1994.A. e do receptor da LDL contribuem de alguma forma para a elucidação dos casos em que ocorrem respostas individual e populacional diferentes frente a determinados fatores de risco. coord. ROBERTS. 4rd ed. L. p 35-84.W. Genet.D. p.. Vários RFLP foram encontrados no gene do receptor da LDL.O gene do receptor humano para a LDL foi clonado e mapeado no cromossoma 19p 13-2. STEINMETZ. PASSARGE E. J. p. para as doenças cardiovasculares. mecanismos de reparo do DNA e recombinação. Molecular Biology of the Gene. Porto Alegre.

fungos. a utilização de técnicas em biologica molecular tornou-se importante em muitos laboratórios inclusive para diagnóstico em cortes histológicos. coli Espécies de Shigella enteroevasiva e de E. A seguir surgiram probes dirigidos para DNA de virus. gonorrhoeae Aminoglycoside modifying enzyme Beta lactamases de espectros estendidos.Assoc. Eles mostraram no primeiro estudo que a bactéria E. leprae Eritromicin e methicilina para Staphylococcus aureus Penicilinase em N. Mario Hiroyuki Hirata Moseley e colaboradores. coli poderia ser detectada por Hibridização de DNA-DNA em amostras impregnadas em papel de filtro e incubadas uma noite em placa de agar MacConkey. PCR para pesquisas de Virus HIV I Hepatite B RNA de Hepatite C Herpes simplex Epstein-Barr Cytomegalovirus Varicella-Zoster Parvosvirus B19 Rotavírus Adenoviroses Rubeola Enteroviroses Papilomavírus Papilomavírus tipo 16 e 18 mRNA E6 e E7 por 3S PCR para pesquisa de parasitas Trypanosoma cruzi Leishmania sp Plasmodium sp Entamoeba histolytica Babesia microti Giardia lamblia Microsporidium Toxoplasma gondii 47 . mostrando sensibilidade e especificidade quando comparados com os métodos de cultura até então conhecidos.• Aula número 6 APLICAÇÃO DO PCR NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS INFECTO-CONTAGIOSAS Prof. Técnicas disponíveis de PCR de importância epidemiológica PCR para pesquisa de bactérias patogênicas Neisseria menigitidis Mycobacterium tuberculosis Richettsia rickettsii Borrelia burgdorferi Yersinia pestis Treponema pallidum Chlamydia trachomatis Mycoplasma pneumoniae Legionella pneumophila Genes de toxinas de Vibrium cholerae 01 Genes de toxinas de termosensível e termolábil de “Shiga-like” em E. Ultimamente. em 1980. Com o aparecimento dos sintetizadores automáticos de oligonucleotídeos houve um grande avanço na tecnologia de probes sintéticos baseados nas sequências publicadas e disponíveis nos bancos dos genes. parasitas e helmintos patogênicos. Na década seguinte probes de DNA capazes de identificar varias bactérias patogênicas já eram disponíveis no mercado. coli Helicobacter pylori PCR para detecção de locus de resistência a antibióticos Rifampicina em Micobacterium tuberculosis e M. foram os pioneiros da aplicação de tecnologia de DNA em doenças infecciosas.

há necessidade de rápida detecção de microrganismos para o diagnóstico clínico. especialmente quando não se realiza um tratamento adequado. com uma letalidade de 20. e seus determinantes: pobreza. 1991). Elas representam um capítulo de importância pelos altos índices de morbi-mortalidade. foi de 7.negativos. aproximadamente. Além da alta sensibilidade. Atualmente. 1993). A meningite bacteriana é a mais notável e comum infecção que ataca o Sistema Nervoso Central (SNC). O diagnóstico da meningite meningocócica inicia-se com a suspeita clínica. principalmente em crianças. o método de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) tem sido empregado para amplificar e detectar DNA microbiano em amostras clínicas. vírus. Elza Masae Mamizuka Jane Atobe A meningite é um conjunto de síndromes cujo denominador comum é a inflamação meníngea (Gomes. 1992). a vantagem deste método é a detecção de bactérias mortas ou inibidas pelo antibiótico.. o coeficiente de incidência das meningites meningocócicas. são bem conhecidos no que diz respeito à sensibilidade e especificidade (Gray & Fedorko.PCR NO DIAGNÓSTICO DAS MENINGITES BACTERIANAS Professora Dra... 48 . O período de incubação varia de acordo com o agente etiológico (bactérias. ou pela detecção de diplococos Gram . falta de higiene e baixa nutrição que contribuem para a disseminação e implantação da meningite. Dados da literatura relatam que 70% das ocorrências se dão em menores de 5 anos de idade e a taxa de mortalidade chega a 28% (Kilpe et al. 1994). As desvantagens da microscopia direta e dos testes imunológicos para detecção de antígenos. sendo as bactérias causadoras mais frequentes de meningite. Na Grande São Paulo.CVE). no ano de 1995. 50% dos pacientes. é fundamental que o diagnóstico e tratamento apropriados realizem-se especifica e prontamente (Radstrom et al. sangue e líquor. A cultura de sangue apresenta-se positiva em. As meningites bacterianas constituem um sério problema de saúde pública em todo o mundo. O risco de morte é muito alto. além do precário sistema de Saúde Pública que dificulta o diagnóstico precoce e o tratamento adequado. 1992). seguida de identificação (necessidade de 12 a 24 horas de incubação). Como a meningite bacteriana deve ser tratada de imediato. protozoários. antes da admissão em hospital.95 casos/100 mil habitantes.42% (Dados provisórios do Centro de Vigilância Epidemiológica . No Brasil. o problema se agrava devido ao baixo nível sócio-econômico da população. A mortalidade dos indivíduos com doença meningocócica é reduzida quando os antibióticos são administrados em casos suspeitos. helmintos ou espiroquetídeos). porém a confirmação é feita pelo isolamento e identificação da Neisseria meningitidis em amostras biológicas como tecido. O método mais específico para diagnosticar a meningite bacteriana é através do isolamento do patógeno em cultura. na vigência da antibióticoterapia. As sequelas variam desde os problemas de comportamento até danos cerebrais irreversíveis. Entretanto. fungos. Assim sendo. a taxa de isolamento do meningococo no sangue ou no líquor é reduzida de 50% para menos de 5% (NI et al.

Literatura recomendada Gomes. A terceira estratégia é a amplificação por PCR multiplex.. descrito por Ni. Purohit. Outro gene que pode ser utilizado para detecção de Neisseria meningitidis por PCR é o 1S1106. Essa estratégia tem sido utilizada para detectar DNA de Neisseria meningitidis. justificada tanto pela letalidade como pelo grau de sequelas neurológicas. denominados marcadores universais de eubactérias. Nesse caso são utilizados iniciadores adjacentes à extremidade 5’ do gene na posição 850 e na extremidade 3’ na posição 1445 do gene. Esse gene foi clonado a partir do DNA isolado de cepas de Neisseria meningitidis sulfonamida sensível e resistente pertencentes aos sorogrupos A. Rev. A segunda estratégia é utilizar duas etapas de amplificação que permitem a detecção de amplo espectro de patógenos (Radstrom et al.. correspondente a um gene de uma região conservada no genoma como o gene da subunidade 16S do rRNA. (1992). O DNA do meningococo pode ser especificamente detectado pela amplificação do gene da hidropteroato sintetase (dhps) . os produtos da primeira etapa são amplificados utilizando iniciadores específicaos para Neisseria meningitidis. a prova da PCR em líquor é um teste rápido. H. sonda universal COR28). extremamente útil para a confirmação precoce do diagnóstico da meningite meningocócica e em situações onde a cultura é dificultada devido à prévia terapia antimicrobiana muitas vezes necessária ou imprescindível. 1994).. 32: 335351. Greisen.. B e C. sonda RDR 47D1). Med. Microbiol.. três estratégias de PCR. A. o que reduz consideravelmente o tempo utilizado na detecção do meningococo. CLin. A primeira emprega o PCR para detectar o DNA de um único patógeno na amostra biológica. Loftelholz.Como diagnosticar e tratar meningite. 1994.. A finalidade desta etapa é de detectar qualquer agente bacteriano na amostra biológica. a conduta clínica e terapêutica. A primeira etapa de amplificação utiliza um par de iniciadores. orientando. including bacteria found in cerebrospinal fluid. Bras. K. et al. através da técnica de PCR "semi-nested" ou são hibridizados com sondas de DNA espécie-específicas. 1994).. 1992).. emprega-se. M. M. Listeria monocytogenes (Kilpi et al. as duas sequências (universais e espécie-específicas).PCR primers and probes for 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria.Para o diagnóstico da meningite meningocócica. O. 48: 9-27. Estudos demonstram que cerca de 23% dos casos com diagnóstico clínico de meningite aguda não apresentam confirmação em exames microscópicos ou em culturas (Grey & Fedorko. J.. . atualmente. O produto de amplificação tem 950 bp de tamanho. meningitidis) são amplificadas em uma única etapa de PCR. O sequenciamento desse gene permitiu construir dois iniciadores para a amplificação do gene dhpa por PCR. Leong. Na PCR multiplex . é de suma importância que o diagnóstico etiológico seja determinado o mais rápido possível. 1991. 1993) e de Haemophilus influenzae (Ketil et al. de 370 bp (universal) e 279 bp (N. desta maneira. denominados NM1 e NM2. Pela gravidade da enfermidade. Na segunda etapa. e iniciadores específicos para N. . Dados da literatura mostram que o método de PCR como teste de triagem permite uma rápida detecção do DNA bacteriano de várias espécies que causam meningite (Greiser et al. 49 .. Devido à sua alta sensisibilidade e especificidade. meningitidis (ex. C. produzindo um fragmento de 596 bp. empregando-se iniciadores universais para amplificar o gene de qualquer tipo de bactéria gram-negativa (ex. 1990). D.

Laboratory diagnosis of bacterial meningitis. 1992. J. Rev. 1990..Length of prediagnostic history related to the course and sequele of childhood bacterial meningitis.. J. Qian.. . Fedorko. Pahlson. Clin. J.. Skold.. Microbiol.... D. Clin. Microbiol. 33: 271-276. Kragsbjerg. 1991.Detection of bacterial DNA in cerebrospinal fluid by an assay for simultaneous detection of Neisseria meningitidis.. C. N..Ketel Van. Ask. T. Cartwright. W. E.Rapid diagnosis of meningococcal meningitis by polymerase chain reaction. Knight. Backman A. Antiba.. Kristiansen.Polymerase Chain Reaction for diagnosis of meningococcal meningitis. 12: 184-188. Kilpi. H. 32: 2738-2744. Pitold. 50 . T. J. .Detection of Haemophilus influenzae in cerebrospinal fluids by polymerase chain reaction DNA amplification. O. Pediat. D.. Med. Dis. . Microbiol. L. Lancet. Infec. I. B... Ni. C.. 340: 1432-1434. P.. . . A. P. 5: 130-145. Lancet. Wever. B. P. Fermer.. . MacFadden. M. A. Palmer. M. 1991. Jenkins. Haemophilus influenzae and Streptococci using a seminested PCR strategy. 1994. P.. P. Alphen Van. Markku. Olcen. E. H. Rasdtrom.. 1993. K. . Gray. R. L. 337: 1568-1569. J. Radstrem.

1....987. com a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). Um fator bastante relevante na identificação de micobactérias é a demora no crescimento bacteriano na cultura.989). com incidência anual de 8 milhões de casos novos da doença (KOCHI et al. sendo as de maior interesse em saúde pública as pertencentes aos complexos M. Elza Masae Mamizuka • INTRODUÇÃO A infecção por micobactérias.1 % no Rio de Janeiro (CVE/SP. 1. Mario Hiroyuki Hirata Profa.. 1. Dra. 1.995. Rosario Dominguez Crespo Hirata Profa. Atualmente. et al 1.PCR NO DIAGNÓSTICO DA TUBERCULOSE Prof. tuberculosis multi-resistentes às drogas como a rifampicina e isoniazida. GUTHERTZ et al. 1.5% no estado de São Paulo e de 19. acomete pacientes de qualquer idade. 1..994. Simultaneamente ao aumento da incidência da tuberculose. ainda são escassos os recursos econômicos e a falta de apoio aos centros de pesquisa tecnológica. 1. 1. COOKSEY. KOX et al. 1. também surgiram cepas de M. A tuberculose como doença continua a figurar entre as principais enfermidades que afetam a humanidade (BOOM et al. . Os recentes avanços da biotecnologia vem sendo conhecidos nos países subdesenvolvidos no entanto. a PCR provavelmente.. os principais problemas que se enfrentam na tuberculose são: o problema sócio-econômico.994. 1. e principalmente com implicações epidemiológicas diferentes. principalmente nos casos em que a terapia seja retardada ou inadequada (VIAMONT. onde os reagentes são estáveis e os equipamentos de baixo custo (CLARRIGDE 1994). Sem dúvida. tem aumentado dramaticamente.992). Estudos iniciais têm demonstrado que o custo de insumos e recursos humanos para a realização da técnica da PCR e da cultura são semelhantes. BRISSON-NOEL et al. a técnica da PCR deve ser proposta também como tecnologia apropriada até para laboratórios de saúde pública do terceiro mundo. 1995). Estima-se que aproximadamente 1/3 da população mundial esteja infectada por M.. Os dados sobre resistência primária ou secundária no Brasil variam de região para região.990. sexo ou grupo étnico e não sendo tratada oportunamente poderá ser fatal ou trazer consigo um alto risco de seqüelas graves.993. Entretanto. 1. Com o aprimoramento de sondas genéticas não radioativas específicas para detecção de micobatérias com emprego de técnicas eletroforéticas e de hibridização. Assoc.992.991). a técnica de amplificação do DNA pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) tem sido aplicada nos vários centros de pesquisa em diagnóstico e indica ser um procedimento simples e rápido. diagnóstico clínico-laboratorial adequado e rápido.992). WILLIANS et al. sendo de 16.. tuberculosis. especialmente aos pesquisadores que atuam na área de saúde. fortuitum que apresentam distinto significado clínico. tratamento e controle profilático da doença (WHITE WHELEN et al. 1.996). o ressurgimento de micobactérias não tuberculosas. Dra. (KIEHN & EDWARDS. tanto no tratamento como no prognóstico dos pacientes acometidos. além da dificuldade da realização dos testes de sensibilidade às drogas pelos 51 & GOLD. Em razão disso. avium e M.995). representa um instrumento alternativo interessante para o controle da infecção especialmente na detecção precoce da tuberculose e da identificação de cepas bacterianas resistentes aos quimioterápicos (KIRSCHNER et al.

Considerando as dificuldades encontradas com esses métodos e a gravidade atual da situação da tuberculose a nível mundial. 1. No entanto. 1. A sensibilidade da cultura varia entre 20 e 90 %. o tempo do diagnóstico.979. A coloração fluorescente tem melhorado a sensibilidade da microscopia direta. melhorando o diagnóstico (KENNEDY & FALLON.985).990). De todas as desvantagens apresentadas pelos métodos anteriormente mencionados. • PESQUISA DE MICOBACTÉRIAS POR TÉCNICAS MOLECULARES 52 . • • DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA TUBERCULOSE Microscopia Direta A microscopia ou baciloscopia é um método rápido para pesquisar micobactérias. Exames múltiplos das amostras. mas esta porcentagem pode ser consideravelmente reduzida em zonas endêmicas de infecções pelas bactérias do Complexo Mycobacterium avium (MAC). Outro problema é que os métodos tradicionais apresentam baixa sensibilidade e especificidade. que apesar de apresentar especificidade de 99 %. 1996). sem superar de forma considerável à obtida com a coloração de Ziehl-Neelsen.979) • Cultura A cultura é um método mais sensível e específico do que a microscopia. o abandono do tratamento propicia o aumento de transmissão da doença e também contribui para o aparecimento de cepas resistentes por seleção de mutantes na população das micobactérias.100 %) (DANIEL. MOLAVI & LEFROCK. mas requer aproximadamente 104 bactérias/mL de amostra para ser detectado com segurança na maioria das espécies. seria muito importante estabelecermos uma metodologia que gere diagnóstico mais rápido com garantia de alta sensibilidade. 1. o alto custo do equipamento e a necessidade do 14 C. além de ter baixa reprodutibilidade. Entretanto. A optimização de meios seletivos acoplados a métodos radiométricos (BATEC) de detecção de crescimento precoce de micobactérias. especialmente se o inóculo inicial é alto e adequado. tem uma sensibilidade baixa. pode diminuir. mas requer de 3 até 8 semanas para o crescimento.métodos tradicionais. 1. a biologia molecular pode ser considerada uma excelente alternativa no diagnóstico deste gênero bacteriano. especificidade e reprodutibilidade. aproximadamente de 30 % a 40 % por necessitar de uma concentração aumentada de bacilos na amostra a ser estudada. A especificidade das baciloscopias positivas é alta (84 . torna-o inacessível para a maioria dos laboratórios de médio e pequeno porte. pela facilidade de treinamento técnico para a formação de recursos humanos nesta área (HERNANDEZ. A introdução de tal técnica na rotina diagnóstica será de grande utilidade não somente pela abreviação do tempo mas também. consideravelmente. aumentam a sensibilidade. dependendo da quantidade da amostra submetida à cultura e da infraestrutura do laboratório (KENNEDY & FALLON.

Como a hibridização é quantitativa. que permite a detecção de quantidades mínimas de ácido nucléico não acessíveis por outros métodos. Procede-se à desnaturação do DNA da amostra seguida da incubação com uma sonda genética complementar ao segmento gênico de interesse. com o aprimoramento de sondas genéticas (DNAProbe) não radioativas e iniciadores mais específicos para detecção com eletroforese. mediante a técnica denominada hibridização in situ. 1.Os recentes avanços da engenharia genética e da biotecnologia trazem interesse àqueles que estão familiarizados em inovação e desenvolvimento.993): • Hibridização de Ácidos Nucléicos Esta técnica está baseada nas propriedades de complementaridade e estabilidade das fitas do DNA. 1. representará um instrumento alternativo para o controle da tuberculose nos países em desenvolvimento. Uma aplicação comum da hibridização de ácidos nucléicos é a identificação de um determinado segmento gênico em uma amostra. Há sondas comerciais disponíveis para detecção de genoma de diversos microrganismos (COATES. empregada na identificação dos fragmentos de DNA e de moléculas de RNA separadas e imobilizadas pelas técnicas de Southern e Northern blot. pode ser inferida a quantidade do mRNA em questão pela comparação da intensidade do sinal obtido na auto-radiografia utilizando densitometria (SOUTHERN. em temperaturas próximas a 100ºC. 1.991. 1. respectivamente. 53 . Dentre as principais técnicas de biologia molecular. Os ácidos nucléicos podem ser hibridizados com sondas genéticas. que não teriam os incovenientes inerentes ao uso de radioisótopos (ROBERT et al. as pontes de hidrogênio desestabilizam-se e as fitas separam-se. Entretanto. ainda que mantenha intacta a estrutura morfológica dos tecidos. freqüentemente.. A desnaturação não é irreversível. ou podem parear-se a qualquer outra seqüência de nucleotídeos.991). A hibridização com sondas marcadas é. o que não é possível por Southern ou Northern blot. Durante a renaturação as fitas tanto podem ligar-se entre si como ligadas previamente. SHANWAR et al.993). 1. FRIES et al. A hibridização in situ evidencia a distribuição de um determinado gene ou RNA entre as várias células de um mesmo tecido. seguindo o princípio da complementariedade das bases (MUSIAL et al.988). alguns dos nucleotídeos da sonda serão marcados com elementos radioativos como 32P. 1. É um método extremamente sensível...975. E. desde que haja complementariedade de bases (TENOVER.991. a PCR provavelmente. Dispondo de sondas apropriadas é possível investigar um determinado gene ou molécula de DNA ou RNA quanto à presença do agente etiológico na amostra.. 1. Caso exista na amostra o segmento gênico procurado. mesmo que seja RNA. o DNA é dito desnaturado. utilizadas no diagnóstico de micobactérias conforme segue (CLARRIDGE et al. Há uma tendência recente ao emprego de nucleotídeos marcados com enzimas ou compostos luminescentes.. 1. 1. Já as ligações covalentes entre os nucleotídeos da mesma fita permanecem estáveis. pois com a diminuição da temperatura da solução para 50 ºC as duas fitas pareiam-se novamente. A sonda genética pode consistir de oligonucleotídeos sintéticos ou fragmentos de cDNA (DNA complementar). A estrutura nativa do DNA é mantida por pontes de hidrogênio entre as bases complementares das duas fitas opostas. ou em pH alcalino. como a digoxigenina marcada.991). a sonda irá hibridizar especificamente e será detectada em auto-radiografia. Nesta forma.987). Em ambos os casos.

. 1. Quando um segmento de DNA é monomórfico. Este método requer (aproximadamente 104 bactérias para a detecção) quantidade similar a que necessita a baciloscopia. São enzimas bacterianas com a propriedade de clivar moléculas de DNA estranho. O tempo gasto para o diagnóstico pelo método de hibridização torna-se sempre dependente da cultura bacteriana e do inóculo inicial (WILSON et al. já que é muito difícil encontrar tal quantidade de microrganismos na maioria destas amostras. que porventura. são comerciais e podem ser marcadas com elementos et al.992.993). M. radioativos ou não. 1. 1. intracellulare). que são seqüências de 4 a 8 nucleotídeos específicos para cada enzima. avium. A clivagem da dupla hélice de DNA ocorre em pontos conhecidos como sítios de restrição. penetram a célula. as endonucleases de restrição. . separação eletroforética. Merecem destaque. poderá mudar alguns sítios de restrição e conseqüente há variação no número de fragmentos gerados pela respectiva endonuclease de restrição. não exibe variação individual na sua seqüência de nucleotídeos.. No entanto. • Endonucleases de Restrição e RFLP A tecnologia atual da Biologia Molecular tornou-se possível graças à identificação e purificação de enzimas nucleares. o tempo de detecção e quando associados aos métodos de cultura radiométrica podem reduzir o tempo em até 2 semanas (ELLENER 1. VAN ECHOUTTE et al. o padrão de fragmentos gerados por uma determinada endonuclease de restrição é sempre o mesmo.990). Este é o princípio em que se baseia a técnica de RFLP.987) . As sondas genéticas de DNA com capacidade de hibridizar com as seqüências de RNA ribossomal 16S para as espécies mais comuns do gênero Mycobacterium (M. Caso haja variação na seqüência de nucleotídeos. pela ampla variedade de seus membros e pelas aplicações práticas. diminuindo. ou seja. A distribuição dos sítios de restrição num determinado gene é específica para a endonuclease. podendo estas apresentar uma alta especificidade e sensibilidade para detectar bactérias deste gênero (ROBERTS et al.987.993). e M. Representam. A amostra de DNA a ser estudada é inicialmente digerida por uma ou mais endonucleases de restrição e separada eletroforeticamente. a técnica de hibridização pode apresentar uma alta especificidade e sensibilidade (GONZALES & HANNA. “Southern blot” e hibridização de ácidos nucléicos. 1. isto não é tão satifatório para a identificação de micobactérias a partir de amostras clínicas... consideravelmente. Há uma grande variedade de enzimas de restrição que reconhecem uma ampla gama de sítios de restrição. tuberculosis.. exceto por esses inconvenientes.988. Após a transferência para membranas de 54 et al. que é a sigla inglesa relativa a polimorfismo do tamanho de fragmentos gerados por endonucleases de restrição. a técnica de hibridização de ácidos nucleicos é limitada por sua baixa sensibilidade.993). O estudo do RFLP envolve técnicas de digestão de DNA. 1. STOCKMAN et al. em função da seqüência de nucleotídeos do gene.. Deleções ou inserções fora dos sítios de restrição poderão também ser identificados por ocasionarem alterações no tamanho de alguns dos fragmentos de restrição gerados (PLIKAYTIS 1. uma defesa primitiva de organismos procariontes. KEMP et al. 1.Também os métodos de hibridização de ácidos nucleicos podem utilizar sondas genéticas de DNA que são capazes de hibridizar com seqüências complementares de RNA (35) ribossomal 16S.. portanto.

Assim. Apesar do sucesso realizado nos laboratórios de pesquisa mediante a utilização da PCR.. o trecho do DNA a ser amplificado. 1. podem ser superadas com a amplificação de fragmentos específicos destes ácidos. A PCR é uma técnica que permite a amplificação in vitro de um fragmento de DNA. a sensibilidade desta técnica pode superar a cultura. pois com a sua utilização é possível marcar todo e qualquer segmento de informação genética entre. muitas vezes nucléicos (DRAKE insuficiente para ser detectada. identificou M. realizado pelas DNA polimerases. Esta variação pode ser normal no caso de regiões polimórficas do genoma ou pode traduzir uma mutação específica no caso de genes monomórficos. 1. O trabalho publicado por ALTAMIRANO et al. A detecção da presença ou ausência de micobactérias pode ser feita por hibridização de ácidos et al. Recentemente.995) • Detecção e Identificação de Micobactérias por Amplificação do DNA.993). Uma vez que o processo de amplificação detecta a presença de micobactérias não viáveis.987). sobre fitas pareadas de DNA. mostra uma sensibilidade e especificidade aumentadas sendo próximas a 100%. A amplificação da seqüência do DNA micobacteriano tem permitido a detecção e identificação rápida destas bactérias em amostras clínicas.988). discutindo-se melhorias na técnica da PCR para a pesquisa dessas bactérias em material biológico. tuberculosis 55 . reproduz-se o processo de replicação natural do DNA com as vantagens de extrema rapidez e de ser possível determinar..991). precisamente. sob luz UV ou calor. Portanto. 1. 1.. Têm sido feitas pesquisas de novos métodos que permitem a amplificação de seqüências de DNA específicas. como: a contaminação do produto amplificado (BOOM et al. 1.. Boa parte dos estudos utilizando RFLP não analisa diretamente o gene de interesse. A hibridização da sonda identifica os fragmentos de restrição em um gene. milhões de vezes em poucas horas. SHANKAR et al. na PCR. vários trabalhos têm descrito esta técnica como uma boa alternativa para a identificação de micobactérias. enzimas que agem. Introduzida em 1. exclusivamente. O princípio da reação em cadeia da polimerase é simples e baseia-se no mecanismo natural de duplicação do material genético que ocorre sempre que uma célula se divide para formar duas novas.992) para o diagnóstico de tuberculose pulmonar. posteriormente esta é incubada com a sonda genética (marcada) complementar a segmentos do gene de interesse.nitrocelulose ou nylon (Southern blot) e fixadas. e sim regiões polimórficas vizinhas.polimerase quando se preparam amostras de escarro para a obtenção de uma boa purificação do DNA para a aplicação pela PCR (AMICOSANTE.. a PCR deve satisfazer as condições básicas do processo de replicação do DNA. (1. bilhões de unidades e reproduzi-lo milhões de vezes. ou seja não haja necessidade de crescimento in-vitro. o tamanho e número dos fragmentos gerados obedecerá às variações na seqüências de nucleotídeos. esta técnica enfrenta alguns problemas.986 por MULLIS & FALOONA (1. presença de inibidores da Taq .987). para as quais existem mapas de restrição definidos (TELENTI et al. (1. ao passo que na replicação normal todo o genoma é amplificado lentamente.991). • Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) As limitações dos métodos de diagnóstico utilizando ácidos nucléicos. sendo a quantidade do DNA presente na amostra. et al. mediante a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) (SAIKI et al.

ROGALL 1. onde existem seqüências repetitivas de 1 a 20 vezes no cromossomo de membros do Complexo M. KANEKO et al.989).. tuberculosis (EISENACH et al. KIRSCHNER et al. 1. As de primeira geração incluem.990b. sabe-se que para detectar micobactérias precisa-se de aproximadamente um fentograma de DNA bacteriano (o que equivalente a 1/5 do microrganismo) (PATEL et al.990..991.. que codificam as proteínas 65 e 38 KDa respectivamente (HANCE et al.b et al. Também estão sendo utilizadas seqüências de oligonucleotídeos da subunidade menor do ribosomas 16S (rRNA) para amplificar fragmentos de DNA capazes de hibridizar com sondas genéticas gênero e espécie específicas..... Esta alternativa está sendo utilizada para a identificação a partir de amostras clínicas das diferentes espécies de micobactérias (WOESE et al. TAKEWAKI et al. VUORINEN et al.993).. 1. Estas zonas são empregadas devido à capacidade de serem altamente conservativas nos diferentes grupos bacterianos (CHEN et al. 56 et al. IS6116 ou IS986.. onde existe a necessidade de se descontaminá-los e concentrá-los (exemplo: escarros.992). MENDIOLA et al. como a utilização de genes que codifican proteínas como a IS6110. 1. Os parâmetros de sensibilidade da técnica do PCR para identificar Mycobacterium spp. já que se utilizam métodos de extração em condições extremas (exemplo: pH).. HERMANS al. BÖTTGER et al. Outros autores classificam as reações de amplificação existentes para micobactérias em gerações.mediated RNA amplification). 1. aspirado ganglionar). HERMANS et al.990 a.. THIERRY et al.989) ou seqüências et repetitivas de inserção como as IS6110.em diferentes tipos de amostras de pacientes com diagnóstico clínico presuntivo de tuberculose.992.. Tudo depende do nível ou sítio em que vão se ligar os “primers” e os genes que se procura.990. 1. KENT 1..990 a ) Existem “primers” que são utilizados para amplificar genes que codificam proteínas conservativas nas diferentes espécies de micobactérias. SDA (Strand. VANDER ULIET et al.. os genes groEL e phoS.. as reações diretas. Pela natureza química da bactéria muitas vezes perde-se uma considerável quantidade de DNA. 1. 1. e isto é agravado quando se processam amostras com um alto índice de contaminação..b . 1.995. tuberculosis no LCR em 84% do pacientes com diagnóstico clínico de meningite tuberculosa. 1..000 organismos (HANCE et al. Teoricamente. BÖDDINGHANS et al. 1. Exemplificamos. As de segunda geração incluem metodologias mais complicadas que geralmente constam de duas ou mais técnicas: NASBA (nucleic acid sequence based amplification). 1989.990) utilizando a PCR detectou M. 1.. 1.995).. displacent amplification) e em ambos casos podem ser utilizadas seqüências que codificam IS6110 e 16S rRNA. podem ser afetados diretamente pelos métodos de extração do DNA..989. KLATSER.995). 1989. EDWARDS et al. OLA (oligonucleotide ligation assay) (VAN SOOLINGEN et al. 1.. embora em amostras clínicas como escarro seja necessário de 100 a 1.992. 1. principalmente. Para a identificação de micobactérias foram elaborados alguns tipos de “primers” para detectar gênero ou espécies de micobactérias (HANCE et al. 1..987. existindo técnicas baseadas na amplificação de seqüências específicas de DNA ou RNA que estão presentes em todas ou em algumas espécies de micobactérias (BÖDDINGHANS et al. SOINI et al. como as proteínas “heat shock”. TMA (transcription . (1. 1. 1.993 . 1. a..990b). .990.993. 1.993). 1.

1.1. 1..993)..992. O procedimento mais comum é a visualização do produto em gel de agarose corado com brometo de etídio sob luz ultravioleta. biotina ...990. variando de 95 a 100 %. A sensibilidade pode ainda ser melhorada submetendo-se os produtos pós-PCR a outra amplificação utilizando “primers” que sejam capazes de amplificar um fragmento interno do produto pós-PCR. onde a sensibilidade varia de 55 a 100 %.993.. Para uma melhor ilustração dos métodos que estão sendo aplicados na identificação de micobactérias a partir de amostras clínicas. 1. seja a nível de gênero ou espécie (PLIKAYTIS et al. 1. 1.993.. Por combinação da hibridização e PCR ou digestão do produto amplificado utilizando enzimas de restrição (RFLP) as micobactérias podem ser identificadas prontamente. Outro método comumente utilizado é a hibridização com sondas genéticas complementares as regiões internas dos produtos amplificados. Já que as extrações com detergentes iônicos resultam em uma queda da sensibilidade (SHANWAR et al. utilizando PCR.993)..993) ou métodos et al. 1.. COUISINS et al. 1. 1.1. TAKEWAKI et al..991. 1. 1.. extração com fenol clorofórmio e precipitação do DNA com etanol.A sensibilidade pode ser recuperada se utilizarmos métodos de extração com digestão enzimática. conjugados enzimáticos ligados a fosfatase et al. et al. 57 .993).995). HAAS et al. 1. WILSON quimioluminescentes (BRISSON et al.993. WILSON et al.. EISENACH et al.990.991.991) e dependendo do sistema de revelação utilizado pode-se melhorar a sensibilidade em relação ao método de coloração com brometo de etídio. Geralmente os sistemas de hibridização são variados. 1. 1989.993. Este procedimento é mais recomendável quando se processam amostras clínicas. onde se adicionam as sondas genéticas marcadas com radioisótopos como o alcalina.988.. mas em geral. os produtos pós-PCR podemse ligar a uma matriz ou membrana de nylon ou nitrocelulose (dot-blot ou slot-blot). mas a especificidade é alta.992.. WILSON et al. digoxigenina.. 1.. A sensibilidade também pode ser afetada pelo tempo de detecção do produto pós-PCR. seja direto ou ligado a outros sistemas. KUSUNOKI et al..991. 1.989. 1. BRISSON et al. SHANWAR et al.avidina (SHANWAR 32 P. tendo sempre um marcador de peso molecular como referência para caracterizar as bandas de DNA observadas. 1.1. A tabela 3 apresenta alguns resultados referentes ao tipo de “primer” utilizado (PAO et al.993.. Estas aplicações dependem das condições de cada laboratório e de acordo com o tipo de identificação necessário. A este novo processo denomina-se “Nested-PCR” ou segunda amplificação (SHANWAR 1. VUORINEN et al.

.M. J.991. Clin. et al.995) os quais identificam. poderemos identificar espécies.15-27.. R.deve-se procurar optimizar as técnicas tornando-as viáveis para aplicação em laboratórios de rotina.993 VUORINEN. JANSEN P. 1.992 WILSON et al..993. 1. Reunião de avaliação operacional e epidemiológica do PNCT.992..991. KIRSCHNER et al. 1.. WERTHEIM-VAN DILLEN.90. 1. Ministéro da Saúde. CARPENTIER et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids.2 % Especificidade 63 % * 95 % 76 % 99 .995 Número de Amostras 248 514 162 177 171 389 243 Primers 65 k prot 65 k prot IS6110 IS6110 MPB70 prot IS6110 IS6110 rRNA 16S + Hibridização Sensibilidade 100 % 80 .. na decáda de 80 .100 % 95 . BRASIL.991). submetendo este produto a uma segunda amplificação (Nested-PCR) utilizando “primers” para os Complexos: M.b. Para superar os diferentes inconvenientes apresentados pelas técnicas descritas na literatura. 1992. Washington.. BÖTTGER (1989.995.92 % 55 . Os dois primeiros “primers” que serão utilizados (MB1 . p..MB2) permitem identificar o gênero Mycobacterium. A eleição dos “primers” baseada nos trabalhos de ANDREAS et al. e muitos deles apresentam alguns problemas na correlação da sensibilidade e especificidade (BOOM et al.993).. tuberculosis e M. SOL. et al.. 1. INDERLIED.. A partir deste produto pós-PCR.98 % 100% * Não avaliado pelo excesso de culturas negativas das amostras PCR-positivas Como podemos verificar existe uma grande variedade de métodos diagnósticos para micobacterioses. 1. 1. VUORINEN et al. v. (1.(1.. Brasília.1.97 % 100 % 97 % 75 .28. tuberculosis diretamente de amostras clínicas Referência PAO et al. M. avium (esquema 1). J.991 EISENACH et al.J. p. 58 .1.. 1.74 % 86. seqüências específicas de oligonucleotídeos da subunidade menor do ribossoma 16S (rRNA). SALIMANS. et al.Tabela 3: Detecção de M. BUCK et al.993 SHANWAR et al.993)a.. MS/FNS/CRPHF/PNCT. Literatura recomendada BOOM.991 COUSINS et al. Microbiol.. C. poderemos contar com um método rápido e relevante para a identificação através da amplificação gênica por “PCR” e “Nested-PCR”. MANJUNATH et al. VAN DER NOORDAS. 1..990 BRISSON. 1. (1.495-503.992). utilizando fragmentos de nucleotídeos altamente específicos para o gênero Mycobacterium e espécies de micobactérias de importância na medicina humana. 1991. WILSON et al. 1. Assim... 1.

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utilizando técnicas de Biologia Molecular. vírus da hepatite B (VHB). construiram uma biblioteca de cDNA a partir do ácido nucleíco proveniente do plasma de chimpanzé infectado com hepatite C.010 à 3. Paralelamente. usualmente crônica e comumente assintomática por muitos anos. com uso de drogas injetáveis ou de outra forma de exposição parenteral também podiam apresentar clínica. não-B pós-transfusional (HNANBPT). sense positiva de aproximadamente 9. Atualmente. Análise da sequência de DNA do HCV revelou que a organização genômica e o perfil hidrofóbico eram similares aos dos vírus pertencentes à família do Flaviviridae. estudos baseados na transmissão da hepatite C à chimpanzés. dificuldades relacionadas principalmente com a baixa concentração do antígeno obtida. foram juntamente com outros antígenos clonados. através do plasma de pacientes portadores de hepatite C. Doença idêntica foi também verificada em pacientes expostos a derivados do sangue (especialmente nos receptores de fatores de coagulação. A região N-terminal codifica para as 60 . laboratorial e histologicamente a doença identica à hepatite transfusional.PCR NO DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE C (HCV) Rozangela Verlengia. essas hepatites passaram a receber a denominação de hepatite C. o HCV foi classificado como um gênero separado dentro desta família. A descoberta do vírus da hepatite C tem sido descrita como um evento totalmente dependente das técnicas da Biologia Molecular. O conceito e a importância da hepatite não-A. Consequentemente. Tais casos passaram a ser denominados de "forma esporádica". observou-se que alguns pacientes sem antecedentes de transfusão. O genoma do HCV contém uma única e longa fase de leitura aberta (“Open Reading frame”. Esta poliproteína é clivada em proteínas funcionais através de proteases virais e do hospedeiro. obtida através do isolamento por ultracentrifugação e clonagem em bacteriófago λgt 11. No final da década de 70. Os quais. Assoc. impediam de se obter resultados conclusivos nos ensaios imunológicos empregados. Dra. após a identificação do agente etiológico dessas hepatites e constatação de tratar-se de um agente único.033 aminoácidos. dos quais 90% não apresentavam evidência de infecção aguda pelo vírus da hepatite A (VHA). O genoma do HCV é uma molécula de RNA fita simples. ORF). já haviam sugerido que o agente etiológico dessa doença era um vírus. Porém. denominados 5-1-1 e c100-3. (1989). utilizados no desenvolvimento de ensaios imunológicos (ELISA e RIBA) para a detecção de anticorpos anti-HCV. Rosario Dominguez Crespo Hirata Prof. como é o caso dos hemofílicos) e entre os usuários de droga endovenosas. Estas hepatites passaram a ter a denominação de hepatite não-A. não-B surgiram da observação que cerca de 2 à 20% dos pacientes transfundidos desenvolviam hepatite. Choo et al. Mario Hiroyuki Hirata A infecção pelo vírus da hepatite C é uma doença infecciosa. a qual codifica para uma poliproteína de 3. citomegalovírus (CMV) e vírus EpsteinBarr. Msi Profa. estando relacionada com o desenvolvimento de cirrose e carcinoma hepatocelular. A triagem dos fagos recombinantes λgt 11 permitiram a identificação de dois clones positivos.400 nucleotídeos.

somado à alta taxa de cronificação com o desenvolvimento de cirrose e carcinoma hepatocelular. mostraram uma tendência a ter um título 100 vezes maior do que mães RNA-HCV positiva. O fato de ser uma doença transmissível. que a exposição a uma quantidade relativamente pequena de sangue ou de outros fluídos biológicos pode tornar-se um fator significante de risco para HCV nos casos em que os níveis de vírus circulantes são elevados. as mães que apresentaram anticorpos antiHCV e que foram RNA negativas não transmitiram HCV para seus bebês. as infecções com HCV apresentam tendência significativa em cronificar-se. Vale a pena salientar. evitando uma disseminação desenfreada da doença. chamadas de “quasispecies” que contém uma ou mais sequências principais e um largo espectro de variantes completamente relacionadas. Como resultado. sêmem e secreção vaginal ocorre com menor freqüência. A presença de anticorpos anti-HCV em pacientes infectados com o vírus C e a clonagem de vários segmentos do genoma viral. os vírus RNA in vivo forma populações diversas. possibilitando um grande avanço na descoberta do controle da infecção por HCV. Recentemente foi mostrado que a transmissão do HCV a partir de mães infectadas para às crianças. tais como icterícia. lágrima. provalvelmente devido ao baixo título do vírus C no sangue e no fluído biológico dos portadores de HVC (10 2 a 107 cópias/ml). urina. Dentro deste contexto. O uso de drogas injetáveis. 61 . tem-se apresentado como um fator de risco importante para a infecção com o vírus da hepatite C. são raros. por exemplo 5-1-1. correntemente aprovados para a triagem do sangue dos doadores. estava relacionada ao título do RNA do HCV na mãe. estudos recentes indicam que o genoma do HCV é heterogêneo tanto entre indíviduos quanto no mesmo indíviduo. A fase aguda da hepatite C é usualmente subclínica ou moderada e clinicamente indistinguível de outras forma de hepatites virais. Uma das características dos vírus RNA é a alta frequência de mutações devido a perda da atividade na correção de leitura “proof reading” da polimerase dependente de RNA.proteínas estruturais do núcleo (“core”) e do envelope (E1 e E2/ NS1). A região C terminal codifica para as proteínas não estruturais (NS) as quais estão envolvidas no ciclo de replicação. porém a maioria dos casos são assintomáticos por um período significativamente prolongado. c100-3. saliva. associado a infecção crônica com o vírus C. Pacientes apresentando sinais clínicos de doença hepática. Além do desenvolvimento de cirrose hepática. possibilitou classificar o HCV em 9 grandes grupos e 28 subtipos. A diversidade na sequência de nucleotídeos do genoma viral. cujas crianças tornaram-se infectadas. A transmissão por outros fluídos biológicos. A hepatite C é transmitida principalmente via produtos do sangue. c-33c. cujo processo é bastante lento. tais como. Neste estudo. Apesar da manifestação clínica discreta. destacando a transfusão de sangue e seus derivados. cujas crianças não adquiriram o HCV. levaram ao desenvolvimento de ensaios imunológicos. torna a hepatite C uma doença de importância tanto social quanto médica. Mães RNA-HCV positivas. até que se desenvolva disfunção hepática crônica. Sintomas semelhantes a fadiga e sensibilidade hepática são eventualmente observados. c-22-3 e c-200. tem-se observado também a presença do carcinoma hepatocelular (HCC).

Ortho Diagnosis. os imunoensaios consistem da detecção de anticorpos contra vários antígenos recombinantes HCV-específicos fixados sob uma fase sólida. Claramente. este período torna-se mais significativamente prolongado. a sensibilidade para a detecção dos anticorpos anti-HCV é de cerca de 94% à 100% e a especificidade é maior que 97%. com as quais os anticorpos anti-HCV presentes no soro podem reagir. que poderiam resultar em teste falso-positivo. é introduzido um controle com a proteína SOD sozinha. Atualmente.O primeiro teste imunológico a ser utilizado. Nos testes de segunda geração. Os testes são produzidos a partir de sequências de genótipos predominantes de HCV (tipo 1a). ocorre após o início dos sintomas clínicos da doença ou a elevação das transaminases (ALT e AST). Usando esses ensaios atuais de ELISA. definiu a necessidade de novos ensaios diagnósticos que proporcionem maior confiabilidade quanto: (i) 62 . ocasionalmente. uma vez que. Outras limitações constadadas com uso dos ensaios imunológicos são as relacionadas com o perfil de soroconversão. Outro aspecto..J. Comumente. Pacientes na fase inicial da soro-conversão apresentam resultados inconclusivos pelos ensaios imunológicos. pacientes infectados recentemente apresentam soro com reação fraca (indeterminada) que. podendo então o anticorpo antiHCV ser detectado entre a oitava e décima semana após o contato com o vírus. As falhas metodológicas observadas nos ensaios imunológicos para o diagnóstico da hepatite C. Entre as possíveis causas de resultados falso-negativos com os ensaios correntes é a heterogeneidade viral. Neste estágio. é o fato de que os ensaios de anticorpos podem promover evidências de exposição ao HCV porém. A alta freqüência de resultados falso-positivo e falso-negativo (ambos acima de 20%). torna-se positivo. O RIBA consiste de uma fita de nitrocelulose contendo proteínas recombinantes indíviduais associadas com a proteína Superoxido Dismutase (SOD). o tempo de soro-conversão e a evolução da resposta imune são manifestados tardiamente. para detectar auto-anticorpos anti-SOD. C 100-3. Esses antígenos tem sido também empregados em ensaios denominados de RIBA (Radio imunoblot assay . USA) para confirmação da triagem de resultados anti-HCV. NS4. NS4. a reação EIA é fraca e deve ser confirmada através do RIBA ou Western blot. particularmente quando usado para triar populações de baixo risco. Raritan. proveniente da região não estrutural do vírus. os antígenos utilizados são: C100-3. N. Já no caso dos pacientes imunossuprimidos. ou seja. NS5/5N1S (core). C33c (NS3) e C22-3 (core). a soro conversão para o anti-HCV é completamente tardia após o início da ictéricia ou elevação dos níveis das transaminases e o anticorpo pode não ser detectado até 8 a 12 semanas após a infecção. Já condições associadas com resultados sorológicos falso-positivo incluem hipergamaglobulenemia e desordens do tecido conjutivo. tais como. Normalmente a soro-conversão do anti-HCV é tardia. foi um imunoensaio enzimático de primeira geração (EIA) contendo um antígeno recombinante. com o passar do tempo se obtidas outras amostras em coletas posteriores. Já os de terceira geração utilizam os antígenos: NS3. cujos antígenos não reagem com anticorpos de pacientes infectados com genótipos menos comuns. Nesse ensaio. denominados testes de ELISA de segunda e terceira geração. são incapazes de diferenciar entre uma infecção presente ou passada. levou a necessidade de se desenvolver novos ensaios. doadores de sangue.

amplificado pela PCR cujo produto pode ser analisado por eletroforese ou por um sistema de hibridização. que faz a cópia de DNA complementar (cDNA). Com relação ao genótipo. onde ocorre a amplificação do genoma viral. também. com ou sem o passo intermediário da cirrose. a avaliação da eficácia terapêutica ao IFN α é mais adequadamente realizada pela quantificação do RNAHCV. No caso do HCV. o HCV tipo 1b parece estar particularmente associado com doença crônica do fígado mais severa. destaca-se a reação em cadeia da polimerase (PCR). Um ponto crucial na detecção do RNA-HCV é a escolha dos iniciadores para o uso diagnóstico. seu prognóstico e a conveniência a terapia antiviral. pesquisa-se a região 5' não transcrita. para detectar o RNA-HCV no soro. Alguns pesquisadores tem utilizado. O IFNα promove o rápido decréscimo dos níveis séricos de alanina aminotransferase (ALT). os métodos de detecção do genoma viral devem ser mais indicados para solucionar estes problemas. então. o RNA-HCV pode ser detectado no soro uma a duas semanas após a transfusão sanguínea. Por essa técnica. A detecção do vírus da hepatite C processa-se através da transcrição reversa e subsequente amplificação do genoma viral através da PCR (RT-PCR). pacientes infectados com HCV tipo 2 mostra um nível significantemente menor de RNA-HCV circulante. a partir do RNA viral extraído. tem significativa aplicação nos casos onde o imunoensaio RIBA fornece resultados indeterminados ou não-reativos. cirrose e carcinoma hepatocelular. a erradicação do genoma do HCV do soro e a melhora do estado de inflamação e necrose do fígado. Alta viremia do HCV (superior a 107 cópias/ml de soro) é prognóstico negativo para uma completa e adequada resposta ao tratamento com o IFN α. aprofundando o conhecimento dos mecanismos das infecções por HCV e. oferecendo um parâmetro mais adequado para diferenciar os pacientes virêmicos dos pacientes sem virêmia.especificidade e sensibilidade (ii) definição de infecção passada ou recente e (iii) avaliação da atividade viral. especificiade e a sensibilidade da técnica de PCR original. que possibilita o diagnóstico da infecção pelo vírus C antes de qualquer outro método tradicional. A PCR. teoricamente. O cDNA pode ser. Todos os protocolos dependem da reação de transcrição reversa. um ciclo adicional de amplificação com a utilização de iniciadores internos (Nested PCR). 63 Essa técnica aumenta significativamente a . Estudos recentes tem sugerido que o genótipo do HCV e o nível de viremia estão associados com o desenvolvimento clínico da doença. uma vez que. em relação a doença hepática. de modo a garantir uma boa sensibilidade. Cada vez mais. Nesse campo de pesquisa. tem-se demonstrado a importância da PCR na investigação da infecção pelo vírus da hepatite C. além da amplificação convencional. Outra importante aplicação da PCR para o HCV é o acompanhamento da resposta à terapia antiviral em pacientes com hepatite C crônica. em particular ao interferon α (IFNα). seja no reconhecimento do tipo de vírus infectante e posterior classificação ou na avaliação da carga viral. os quais devem corresponder as sequências genômicas bem conservadas nas diferentes variantes do HCV. antes do início clínico da infecção pós-transfusional pelo HCV. que é a mais conservada dentro do genoma viral. A quantidade de partículas virais no sangue também parece ser dependente do genótipo viral. Portanto. Considerando as limitações observadas no uso dos ensaios imunológicos e a ausência de um sistema de cultura in vitro para o HCV. que somente é possível por técnicas moleculares.

H. Nessa técnica. et al. Literatura recomendada CHOO.000 cópias/ml) do que o PCR competitivo (detecção limite aproximadamente 2000 cópias/ml). RUBIN. RÜSTER. G. Hepatitis C virus shares amino acid sequence similarity with Pestiviruses and Flaviviruses as well as members of two plant virus supergroups. et al. Hepatology. . et al. . Med. onde ocorre a lise do vírus. al. Intern. Infec. 1987. et al. o soro é adicionado sob um suporte sólido. 154: 387392. Treatment of chronic hepatitis C.L. 19: 1337-41. 300: 744-750. Med. os resultados obtidos tem mostrado variação do nível de viremia dos pacientes infectados. STEINHAUER. Clin. o mais usualmente empregado é a PCR competitiva (Roche Monitor Kit).A. R. 1994. DAVIS. N. R.A. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. um método de amplificação de sinal de fase-sólida. Lab. chronic hepatitis C Advances in Diagnostic testing and Therapy. et. tem sido realizada por vários métodos de amplificação do RNA-HCV. Um estudo recente de comparação entre 31 laboratórios mostrou uma substancial variação de sensibilidade e especificidade desses métodos. Portanto. L. Chiron Corp). 22 (4): 509. Liver. non-B hepatitis: a 13year follow-up study of hepatitis C virus markers. Neste método. R. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A. Quantification of hepatitis C virus RNA by competitive Reverse Transcription and Polymerase chain Reaction using a modified Hepatitis C Virus RNA transcript. B. et al. 1994. O. DI BISCEGLIE. Med. H. 1990. 1994. SHINDO. 1990. Ann. Analysis. REICHARD.A quantificação do RNA viral. com o qual compete. Sequential change of the hypervariable region of the hepatitis C virus genome in acute infection. 87: 2057-2061. Engl. Hepatology. Arch. Decrease in hepatitis C viral RNA during alpha-interferon therapy for chronic hepatitis C. J. OTHO. Med. non-B viral hepatitis genome. Intern. laboratory Diagnosis of Human Hepatitis Viruses. verifica-se a necessidade de aprimoramento metodológico e aplicação das técnicas moleculares de forma mais rotineira na busca do diagnóstico precoce e do acompanhamento terapêutico adequado. Embora essas técnicas sejam muito sensíveis. Outro ensaio também disponível é o “branched DNA” (Quantiplex. 1990. Sacand.H. No caso do “branched DNA”. D. 8: 369-377. 42: 103-108. revelando diferentes sinais. R. 1989. Virol. a captura e a hibridização do ácido nucleíco a ser detectado e a amplificação do sinal. 115: 700-4. Transmission of hepatitis C virus from mothers to infants. Quantitative detection of hepatitis C virus RNA with a solid-phase signal amplification method: definition of optimal conditions for specimen collection and clinical application in interferontreated patients. MILLER. este demonstrou ser significativamente menos sensível (detecção limite 350. J. et al. A. Science. Long-term clinical and histopathological follow-up of chronic posttrasnfusion hepatitis. 244: 359-62. 64 . A. 1993. 13: 274-278. PURCELL. Outcome of acute symptomatic non-A. 1995. M.13 MATTSSON. 1994. McPHERSON. J. J. 1991. Diseases. a amostra é diluida seriadamente e cada diluição é submetida à reação de amplificação juntamente com um controle interno. Analytical Biochemistry 224: 597-600. 14: 969-74. et al.

Genoma do HIV rev vpr LTR gag pol vif vpu tat env nef LTR 65 . O gene env codifica a glicoproteína precursora gp160. O genoma HIV já foi totalmente seqüenciado e analisado. com polaridade positiva em relação a tradução (Fields). indispensável à replicação viral. Transcriptase Reversa e RNase-H (p51/66) e Integrase (p32). vpr. transmembranar. p9 (proteína do núcleocapsídio que se liga fortemente ao RNA viral) e p7.2kb. p24 (proteína estrutural do capsídio). env. e a gp120. de 9. rev. glicoproteína de face externa. É um vírus contendo um envelope com nucleocapsídeo em forma de cone. possuem uma forma aproximadamente esférica com algo em torno de 110nm de diâmetro. responsáveis pela ligação do vírus ao receptor celular. O gene pol também é traduzido na forma de um precursor. O gene rev (proteína p19). O gene vpu (proteína p16) influencia a liberação das partículas virais e aumenta o turnover do antígeno CD4 +. que é posteriormente clivada para compor as proteínas p17 (proteína de matriz). O gene gag é traduzido na forma de uma proteína precursora Pr55gag. O genoma viral é composto por 2 moléculas de RNA simples-fita. O gene vif (proteína p23). atua como transativador transcripcional. A proteína p14.PCR NO DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO PELO VÍRUS HIV Claudio Mortensen 1. vpu. o gene nef (proteína p27) potencializa a infectividade viral (18). seus vírions (partículas individuais). ligando-se à seqüência RRE viral e fatores celulares. interagindo com fatores de transcrição celulares e a seqüência TAR viral. Detecção e Quantificação do Vírus HIV Por PCR: 1. Introdução: O vírus HIV é membro da família dos retrovírus sendo que. pol. Pr160 gag-pol e codifica para as enzimas virais: Protease (p10). nef. Por fim. age como transativador pós-transcripcional.1. promovendo a iniciação e elongação dos transcritos virais. A função do gene vpr (proteína p15) ainda não é conhecida. vif. As proteínas sintetizadas a partir do gene gag compõem o núcleo (“core”) que envolve o genoma viral. sendo que seu genes receberam a seguinte nomenclatura (6): gag. tat. mas sua função ainda não foi totalmente elucidada. promovendo "splicing" e/ou transporte do mRNA viral. parece atuar como um fator de infectividade. codificada pelo gene tat. que posteriormente é clivada para formar a gp41.

a qual integra-se ao genoma celular. Entretanto. O risco de um recém nascido. codificada pelo vírus e transportada no interior da partícula viral. pois o vírus replica-se numa velocidade bastante alta. trabalhos publicados por Ho. A este ponto. é importante esclarecer determinados aspectos da história natural da infecção pelo vírus HIV. o paciente poderá não apresentar sintomas. poderão ser encontradas partículas virais circulantes. Este período de tempo foi estimado em aproximadamente 9 dias póscontaminação. Em vista disso fica claro que em qualquer momento pós-infecção. Outro ponto que deve ser observado. Detecção do Genoma Viral por PCR: O mecanismo. de mãe portadora do HIV. Tanto a Transcriptase Reversa quanto a Integrase. também presente no vírion. o HIV necessita da formação de uma molécula intermediária de DNA. até que se esgote a capacidade do organismo em manter este dispendioso equilíbrio. já imediatamente após infectar a primeira célula e. Esta molécula intermediária de DNA é sintetizada a partir do "molde" de RNA viral. pela enzima Transcriptase Reversa. os quais consideravam um período de latência virológica durante a fase assintomática da mesma. Até pouco tempo atrás. ou seja. foram desenvolvidos modelos para a doença AIDS. seu limite de sensibilidade será de 200 cópias do genoma por ml de plasma. com relação ao PCR aplicada à AIDS. tendo-se um protocolo muito bem otimizado para a reação de PCR. X. é proveniente deste DNA (denominado DNA pró-viral) integrado. diz respeito ao diagnóstico de crianças nascidas de mães portadoras do HIV. são produtos do gene pol. é transportada para o núcleo celular onde será integrada ao genoma por ação de outra enzima viral.. de replicação dos retrovírus. bastante peculiar. permanecendo como parte integrante deste. em que não será possível detectar-se a presença do vírus. É muito importante que se tenha consciência destes dados. através de mecanismos ainda não muito bem definidos.Em seu processo de replicação (produção de novas partículas virais). livre no plasma. durante a maior parte do curso clínico da doença. pois haverá um período de tempo pós-contaminação.2. mais recentemente. a Integrase. Sob condições ideais. é necessário que haja uma quantidade mínima de partículas virais para que a técnica de PCR seja capaz de detectá-las. 1. havia um certo consenso entre os cientistas e os clínicos de que muito poucas células estariam infectadas ou expressando o genoma viral e que existiria muito pouco vírus circulante. A seguir. embora muito menor do que para os testes imunológicos. possibilita dois caminhos para a detecção da presença do vírus HIV no organismo humano: a demonstração da presença do DNA pró-viral integrado ao genoma celular e a detecção do RNA viral presente nas partículas livres circulantes. e Wei. A informação genética para a síntese dos componentes do vírus. ter sido infectado por via placentária (transmissão vertical) foi calculado em um valor 66 . durante todo o período de vida da célula em questão. um equilíbrio entre esta produção de vírus e a reposição de células CD4+ acaba por estabelecer-se e. Sendo assim. a molécula de DNA recém sintetizada. contudo. D. inclusive do genoma RNA. Estes trabalhos provaram que o período de latência é na verdade clínico. demostraram que o vírus HIV replica-se muito mais rapidamente e muito mais precocemente do que era imaginado.

é importante seguir uma determinada ordem. o DNA. retira-se os tubos colocando-os em gelo imediatamente.. que não teriam estabelecido uma infecção produtiva. as quais poderiam afetar sensivelmente a assessibilidade dos primers aos seus sítios correspondentes. sempre respeitando a ordem de adição dos componentes. Após a adição do DNA aos tubos de reação. o método mais seguro de detectar-se a presença do vírus. tornando a solução em que está contida. Assim sendo. que pode ser mantido no banho-maria a 58OC até o momento de ser adicionado aos tubos. Cuidados especiais devem ser tomados a este ponto. Entretanto. Portanto. Quando terminados os 10min. complementares a regiões altamente conservadas. No interior do fluxo laminar. antes de ser adicionado à reação. dNTP. pois uma grande parte dos vírions produzidos pelas células. é comprovar o genoma próviral integrado no genoma celular. O protocolo descrito a seguir utiliza um conjunto de primers. apresentamos aqui um método de PCR para o diagnóstico de infecção pelo vírus HIV que utiliza a técnica de “Nested PCR” na detecção do DNA pró-viral integrado ao genoma celular. pois o DNA genômico humano é uma molécula bastante grande.aproximado de 30%. só então. herdados durante a gestação. Sendo assim. é aquecido a 58OC durante 20 min. sendo assim. normalmente estoca em geladeira ou freezer. serão retirados 10µl desta reação e adicionados em outra contendo o segundo conjunto de primers (nested). Este DNA. cortar as pontas para torna-las mais largas em sua abertura. retornando os tubos ao aparelho e liberando-se a função pausa. estes são transferidos ao aparelho de PCR para a primeira etapa de reação. após descongelar todos os componentes. O DNA é isolado das células mononucleares do sangue periférico utilizando-se o mesmo protocolo já descrito nesta apostila. presentes na seqüência do gene gag. adiciona-se a Taq DNA polimerase. Literatura recomendada 67 . até 3-6 meses após o nascimento. o “HOT START” . pois aqui as moléculas alvo já possuem um tamanho milhares de vezes menor do que as da amostra inicial. os métodos imunológicos ficam sujeitos a resultados falso-positivos devido ao fato da criança. gerando um produto de amplificação de 495pb. A diferença desta reação com a primeira. Finalizado o primeiro PCR. A reação prosseguirá por 35 ciclos. Recomenda-se utilizar ponteiras especiais de ponta larga ou. portanto é bastante importante que se possa diagnosticar o quanto antes o nível de infeção da criança. aciona-se a função PAUSA do aparelho. na falta destas. muito viscosa. a criança poderia portar partículas virais inativas em sua circulação. O objetivo desta prática é desfazer possíveis estruturas secundárias da molécula de DNA. o primeiro a ser adicionado é a água. são inativos (não infectantes) e. Ao adicionar-se os componetes de reação aos tubos. desenvolvidos por este laboratório. A pesquisa de partículas livres no plasma da criança também poderia levar a resultados falsos. Primers e. mas que estariam sendo detectadas pela alta resolução da técnica de PCR. a seguir o Tampão de Reação. ou pré-aquecimento da amostra a 98OC durante 10min. estar portanto anticorpos provenientes da mãe. é a inexitência de “HOT START”.

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em 1939-1940. Esses marcadores genéticos são características herdadas que diferenciam os indivíduos uns dos outros e são controlados por genes localizados em um par de cromossomos. foram realizadas uma série de estudos de marcadores genéticos para determinar a real definição de um vínculo familiar. O próximo evento significante ocorreu em 1927 quando o sistema MN foi descrito por Landsteiner e Levine. quando o par de genes for diferente. e os testes de parentesco foram reconhecidos pelo seu valor de exclusão. Stetsun. porém a aplicação da descoberta para a determinação de paternidade. atualmente. no entanto. Apenas dois alelos estão envolvidos na formação de uma característica específica. Apesar dessas deficiências. Por essas razões. A aplicação do conhecimento desses sistemas fornece uma média de exclusão da paternidade de aproximadamente 55% dos homens supostamente acusados. Landsteiner e Wiener. técnicas baseadas no estudo de sequências polimórficas do DNA tem dado de forma muito segura a definição adequada para a identificação de indivíduos. e podem solucionar de forma segura os resultados tidos como inconclusivos pelos métodos considerados tradicionais. Este foi seguido pela descoberta. Recentemente. A análise de sequências polimórficas no DNA é. esses testes foram utilizados até fins de 1960 e meados de 1970. Mario Hiroyuki Hirata Adriana Ozaki Erik Martins Ueda • Introdução A necessidade de confirmar disputas de paternidade ou relacionamento familiar sempre existiram. mesmo que estes tivessem alcance limitado. O progresso no desenvolvimento de um meio seguro para a determinação de relacionamento tem ocorrido muito lentamente. Assoc. é chamado de homozigoto. quando a utilidade do sistema de antígenos leucocitários humanos (HLA) foi reconhecido legalmente e científicamente como um método para avaliação nos testes de paternidade. Os testes. um do pai outro da mãe. tornou possível excluir 70% dos homens caucasianos supostamente acusados da paternidade. denominados alelos. de 69 . A crescente demanda de testes de identificação. só foi demostrado em 1910 por von Dungern e Hirszfeld. Rh e MN. Os testes com DNA superam os resultados obtidos pelos métodos tradicionais. Quando o par de genes for idêntico. conhecida como herança Mendeliana do grupo sanguíneo. incluindo o HLA. ainda não totalmente adequada para esse fim.• Aula número 7 PCR E RFLP NA IDENTIFICAÇÃO DE INDIVÍDUOS Prof. A combinação dos sistemas ABO. usando múltiplos sistemas. então forneceram um meio prático para a exclusão de pelo menos 95% dos supostos pais. a ferramenta mais poderosa para distinguir geneticamente os indivíduos ou determinar níveis de relacionamento familiar. estabeleceu o que se tornou a base para os estudos de parentescos dos dias modernos. do sistema RhHr por Levine. estimulou a comunidade científica a desenvolver metodologias com maior grau de discriminação que permite com segurança incluir ou excluir a paternidade ou relação familiar. A descoberta de Landsteiner do grupo sanguíneo ABO em 1900.

Isso se deve ao fato de que resíduos de C ligados em sua extremidade 3’ por um resíduo G (CpG) são suscetíveis à metilação e desaminação. No caso de repetições de dinucleotídeos. É necessário também uma escolha adequada dos alelos para um estudo detalhado da ocorrência. Em contraste. entretanto. Os locos VNTR são particularmente convenientes como marcadores para identificação. são comuns e juntos são responsáveis por cerca de 10 Mb ou 0.2% do genoma. resultando em TpG (ou CpA na fita complementar). pois eles possuem um grande número de alelos diferentes. ocorrendo em cada 50 kb. e quando diversos locos são combinados. o número total de genótipos é muito grande. em média. varia de um alelo para outro. • Repetições Sucessivas de Número Variável (VNTR) e Repetições Sucessivas Pequenas (STR) Vários locos de DNA são amplamente utilizados em análises forenses. Estas sequências não codificam um gene específico. O número de possíveis genótipos em um loco é muito maior que o número de alelos. geralmente 100 ou mais. compreendendo 0. como as VNTR). Normalmente repetições dos mononucleotídeos A e T. arranjos de repetições CA (repetições de TG na fita complementar) são comuns. sequências de CG/GC são raras. sendo candidatas a marcadores genéticos do polimorfismo entre indivíduos. embora apenas 15 a 25 possam ser distinguidas (A palavra alelo é tradicionalmente aplicada como forma alternativa de um gene.5% e são altamente polimórficos. os mais utilizados são aqueles contendo as denominadas Repetições Sucessivas de Número Variável ((Variable Number “ Tandem Repeat). O número exato de repetições assim como o comprimento da região de VNTR. levando as mudanças no comprimento. O resultado é um grande número de alelos na população com diferentes sequências. sequências de G e C são bem mais raras. porém altamente polimórficas. e diferentes alelos podem ser identificados pelo seu comprimento. Famílias de microsatélites de DNA compreendem arranjos de repetições consecutivas de pequeno tamanho (“Short Tanden Repeat”. a fim de aumentar a precisão e exatidão no resultado final. pode-se extrapolar o significado para regiões não gênicas do DNA. que apresentam sequências simples (1-4 bp) e estão localizados ao longo do genoma. Uma mutação individual usualmente muda o comprimento por apenas uma ou poucas unidades de repetição. Por outro lado. • RFLP na Identificação de Indivíduos 70 . cada uma com 15 a 35 bp em comprimento. STR).000 bp.heterozigoto. Repetições consecutivas de trinucleotídeos e tetranucleotídeos são raríssimas. As VNTR tem uma alta taxa de mutação. As VNTR tem sido também denominadas de minisatélites.3% do genoma nuclear. Isto é uma vantagem pois as VNTR são menos suscetíveis a seleção natural. que poderia levar a diferentes frequências de alelos em populações diferentes. compreendendo várias unidades de repetições sucessivas. Uma região típica de VNTR consiste de 500 a 10. e sendo responsável por cerca de 0. podendo assim serem utilizadas para análises forenses sem nenhuma consequência ao indivíduo. Repetições CT/TG são também comuns.

Uma outra aplicação seria estabelecer suscetibilidade a patologias autoimunes em indivíduos com alterações específicas nos genes HLA. a exposição múltipla do filme. O método luminescente tem seus incovenientes. Hae III). e hibridização com sondas alelo-específicas. pois não necessitam dos cuidados na manipulação que a conduta de segurança exige para os materiais radioativos. Essa aplicação fornece uma oportunidade para se encontrar os melhores doadores. pois requer um sistema com produção contínua de luz para que o sinal possa ser coletado com o decorrer do tempo (para aumentar a sensibilidade) e se for necessário..A maioria do DNA no genoma humano não parece codificar genes específicos. O uso de vários locos VNTR independentes e hipervariáveis fornecem informação muito importante condiderando uma fonte de espécime biológico a ser identificado. Os fragmentos de DNA resultantes são separados por eletroforese. utilizando gel de agarose. o teste de DNA tem a capacidade de fornecer as probabilidades mais exatas de inclusão ou exclusão de indivíduos num contexto forense ou de vínculo familiar. A membrana é então hibridizada com sondas marcadas isotopicamente ou por métodos não-isotópicos (p. mas parece ter um papel na integridade estrutural do cromossomo ou em sua replicação. A enzima fosfatase alcalina é muito utilizada na revelação. Estudos sobre populações humanas tem revelado que o número de repetições sucessivas presentes em um determinado loco pode exibir uma grande variação de um indivíduo para outro.2-dioxitanos estabilizados. o DNA não codificante contém várias sequências repetitivas. Os locos de VNTR consistem em numerosas cópias de sequências simples de DNA. em um intervalo de comprimento que varia de 9 a 14 pares de base (bp). ex. sendo possível a análise de DNA para identificação de indivíduos. Esses sistemas tem sido amplamente aplicados em pesquisas 71 . após digestão do DNA com enzimas de restrição. A análise por RFLP de locos de VNTR envolve a purificação do DNA de fluídos corporais ou esfregaços de biópsias. o torna singular pelo número característico dessas repetições. ou polimorfismo. ex. Os sistemas quimioluminescentes mais sensíveis são aqueles que emitem luz continuamente e a reação enzimática envolve a clivagem de substratos 1. Considerando a frequência desses fragmentos polimórficos na população e possíveis variações étnicas. porque diferentes tamanhos de fragmentos de DNA são encontrados. Uma aplicação potencial é a análise da sequência dos nucleotídeos nos gens HLA para definir identidade imunológica. onde são utilizados substratos coloridos ou quimioluminescentes. Como vimos. Técnicas similares tem sido usadas para teste de paternidade em casos legais. Consequentemente muita atenção tem sido dada para a padronização desses novos métodos em laboratórios forenses. dessa forma se estabelecem como marcadores genéticos que são altamente informativos de acordo com o espécime biológico. Os fragmentos separados são então desnaturados e transferidos para uma membrana de nylon ( Southern Blot). alinhados de forma contínua. enzimático) específicas para o locos de VNTR de interesse. seguida da digestão do DNA com a enzima de restrição (p. Neste contexto. essa caracteríctica muito singular pode servir como parâmetro muito importante na caracterização de um indivíduo. A garantia de que o DNA apresenta repetição única para cada indivíduo. Os métodos não-isotópicos são preferidos.

D17S30 e microsatélites SE33. que permitem espécimes de até 1 µL de sangue ou sêmem para análise. A técnica permite o aumento da quantidade de DNA de tal forma que uma simples sequência pode ser analisada. Atualmente. parafinados e em peças de necrópsia ou manchas de sangue secas. D1S80. nem todos os locos de minisatélites e microsatélites 72 . podemos citar a amplificação de minisatélites nos locos: Apo B (apolipoproteína B). O sistema de detecção quimioluminescente pode substituir as sondas marcadas com 32P usadas nos sistemas de quantificações de DNA e tipagem por RFLPs. estes locos altamente polimórficos demonstrados por PCR são os marcadores genéticos mais informativos para a caracterização do indivíduo. Dentre os genes polimórficos utilizados para a caracterização de indivíduos. que correspondem aos alelos respectivos. o que facilita a utilização tanto para fins de identificação criminal como para testes de identificação de paternidade. No método de RFLP. presentes em determinados alelos humanos. As vantagens em relação aos outros métodos estão no aumento da sensibilidade. A PCR permite um aumento da sensibilidade de um procedimento subanalítico para níveis analíticos em um período de tempo relativamente curto. o que possibilita observar as características de cada indivíduo e suas relações com os pais. após a PCR. Esses alelos podem ser amplificados de amostras contendo pouca quantidade de DNA. identifica-se um loco polimórfico do DNA de cada vez. Outra vantagem na utilização da PCR é que ela pode ser realizada com muito pouca quantidade de amostra (a técnica de PCR pode detectar até 1 fentograma de DNA alvo) e em material fixado com formaldeído. Essa sensibilidade significa que embora as sondas multilocais fornecerem melhor distinção individual as sondas unilocais são as mais utilizadas no contexto forense. através da hibridização de oligonucleotídeos (iniciadores ou “primers”) flanqueando a região que contém a VNTR. em um simples procedimento sem a utilização de material radioativo ou qualquer outro procedimento mais complexo. D12S67. as sondas unilocais apresentam limites muito menores onde quantidades em torno de 30 ng podem ser visualizadas. Y-27H39. Tipos de Sondas utilizadas no RFLP Para análise de regiões hipervariáveis (VNTR) são utilizadas sondas moleculares complementares a estas sequências repetitivas. O limite de detecção das sondas multilocais é de 500 ng de DNA. entretanto. • PCR na identificação de indivíduos Uma alternativa que vem dominando as técnicas moleculares para fins de identificação é baseada na técnica de amplificação do gene utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR). Essa técnica tem sido denominada Polimorfismo de Tamanho de Fragmento amplificado (AMP-FLP). Porém. sendo analisadas várias bandas de DNA.genéticas. permitindo com simplicidade observar um alelo de origem materna e outro de origem paterna. há sondas multilocais que hibridizam com vários locos ao mesmo tempo. Esse procedimento baseia-se na amplificação específica de VNTR. Os testes com sondas unilocais utilizam a mesma metodologia. especificidade e a redução no tempo de ensaio. vWF (von Willerbrand). Outra vantagem é a possibilidade do uso das sondas unilocais em amostras misturadas.

pode-se escolher alelos com frequência mínima de 2%. 3. 2.5)/(0. A informação genética do suposto pai não é considerada dentro da determinação da Probabilidade de Exclusão. indivíduos da população dados os alelos da criança e da mãe. então: PI = (0. Em ordem de determinação da Probabilidade de Paternidade. A probabilidade do teste de paternidade supor que o suspeito pai é o pai biológico. Se ambos os pais são heterozigotos. a = frequência do alelo da criança herdado do seu pai biológico (obrigatoriamente o alelo paterno).existentes podem ser utilizados na investigação de paternidade. comparado com a probabilidade de que ele não seja o pai biológico. Cálculo estatístico 1. a suposição deve ser marcada (antes do teste) como uma prévia probabilidade de que o suposto pai seja o verdadeiro 73 . que se construiu. Índice de Paternidade O Índice de Paternidade (PI) é a razão de verossimilhança nas quais os testes apresentam duas probabilidades condicionais. Padrão de banda simples do suposto pai são tratadas como heterozigotos para o cálculo de PI. Probabilidade de Exclusão A Probabilidade de Exclusão (PE) é definida como a probabilidade de excluir ao acaso. • Cálculo da Frequência dos Alelos A frequência dos alelos é baseada na ocorrência de todos os alelos para um dalo loco estudado dentro de mais ou menos 3% do tamanho do banco de dados. A análise dos polimorfismos genéticos tem sido utilizada como parâmetro importante na área médica e também em análises forenses. Probabilidade de Paternidade A Probabilidade de Paternidade (W) é baseada sobre o Teorema de Baye’s nas quais proporciona a determinação de posterior probabilidade para paternidade baseados nos resultados genéticos dos testes da mãe. da criança e do suposto pai. sendo os mais adequados os que apresentam maior polimorfismo e maior grau de heterozigose. A Probabilidade de Exclusão é igual a frequência de todos os homens da população que não contém os alelos compartilhado obrigatoriamente do alelo do pai e da criança.5)x(fPa) ou PI = (0. A equação utilizada para determinar esta probabilidade é: PE = (1-a)2 Onde.5)/(fPa) Onde (fPa) é a frequência do alelo paterno. Em adição.5)x(0.

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