You are on page 1of 7

Jurnal Matematika dan Sains Vol. 9 No.

2, Juni 2004, hal 233-239

Isolasi dan Karakterisasi Mutan sup45 Saccharomyces cerevisiae Sensitif Temperatur
Akhmaloka, R. Hertadi, Senam, P. E. Susilowati, M. Sindumarta dan H. Sutedjo Departemen Kimia, FMIPA, Institut Teknologi Bandung Jl Ganesa 10, Bandung Diterima Desember 2002, disetujui untuk dipublikasikan Oktober 2003
Abstrak Salah satu pendekatan untuk mempelajari struktur-fungsi suatu gen adalah dengan mempelajari mutan-mutannya. Beberapa mutan sup45 telah diisolasi dari Saccharomyces cerevisiae galur BSC483/1a yang telah diinduksi dengan mutagen EMS (etil metan sulfonat). Mutasi dilakukan secara in vivo dan diperoleh konsentrasi EMS optimal 1,5% (v/v). Delapan mutan sensitif temperatur (ts) sup45 diperoleh dari hasil seleksi 515 mutan allosuppressor. Karakterisasi profil pertumbuhan mutan menunjukkan bahwa setiap mutan sup45 memiliki laju pertumbuhan dan pertumbuhan maksimum lebih rendah dari galur induknya. Selain itu, masing-masing mutan sup45 memiliki fenotipik yang bervariasi, diantaranya 6 mutan bersifat sensitif temperatur dan 2 mutan bersifat sensitif temperatur dan hipersensitif paromomisin. Semua mutan menunjukan sifat allosuppressor dalam media YEPD. Analisis tingkat allosuppresi dari mutan sup45 dengan menggunakan plasmid yang membawa gen fusi PGK-oligonukleotida (kodon terminasi)-LACZ, menunjukkan adanya variasi tingkat allosuppresi. Studi sensitifitas mutan-mutan sup45 terhadap temperatur menunjukkan adanya perbedaan letalitas pada temperatur yang berbeda. Satu mutan mati pada temperatur 32oC, 3 mutan mati pada 34oC, 1 mutan mati pada 35,5oC dan 3 mutan lainnya mati pada 37oC. Analisis lebih lanjut pada dua mutan menunjukkan adanya kenaikan tingkat allosuppresi dengan naiknya temperatur pertumbuhan. Seluruh hasil-hasil karakterisasi di atas menunjunkan bahwa mutan-mutan sup45 yang diperoleh bersifat allele specific. Kata kunci: allosuppressor, sup45, Saccharomyces cerevisiae. Abstract One of the approachs to understand the structure-function of the gene is by studying its mutants. A few of sup45 ts mutants was isolated from Saccharomyces cerevisiae strain BSC483/1a induced by EMS. The concentration EMS of 1.5% (v/v) was found to be the most effective concentration on this study. Eight of sup45 ts mutants were selected from 515 allosupressor mutants. All of the mutants showed lower growth rate and maximum growth compared to that of the wild type. In addition of allosuppression phenotype, six of the mutant showed temperature sensitive and the other two exhibited temperature and paromomycine sensitive. Quantitation of an allosuppression phenotype using plasmid-borned gene fusion, PGK-termination codon-LACZ, showed that the mutants have a variation level of allosuppression. Temperature sensitivity analysis of the mutants showed that one, three, and one mutants were unviable at 32, 34, and 37OC, respectively. Further analysis on two of the mutants showed that the allosuppression level increased by increasing temperature growth. All the data suggested that the mutants were allelic specific mutants. Keyword: allosuppressor, sup45, Saccharomyces cerevisiae. 1. Pendahuluan Studi terminasi translasi baik di sel prokariot maupun eukariot saat kini banyak dilakukan melalui pendekatan identifikasi sejumlah mutan yang dapat menaikan maupun menurunkan efisiensi pengenalan kodon terminasi. Sejumlah besar dari mutan ini telah diisolasi dan terbukti sangat bermanfaat dalam penelitian mekanisme terminasi translasi di Escherichia coli1). Mutan-mutan yang banyak dipelajari adalah mutan yang berperan sebagai nonsense suppressor dan/atau mutan yang mengubah efisiensi nonsense suppressor seperti antisuppressor dan allosuppressor. Mutan allosuppressor yang banyak dipelajari pada Saccharomyces cerevisiae adalah sup35 dan sup45. 233 Mutasi pada lokus SUP45 menghasilkan berbagai allele dengan fenotipik yang spesifik disamping allosuppressor terhadap suppressor tRNA SUQ52), juga omnipotent suppressor, hipersensitif terhadap antibiotik aminoglikosida (paromomisin dan higromisin) dan sensitif temperatur3,4). Kloning dan analisis urutan nukleotida gen SUP45 telah dilakukan5,6). Dari hasil analisis urutan nukelotida diperoleh bahwa gen SUP45 mengkode protein dengan berat molekul 49 kD . Studi homologi pada E. coli menunjukkan bahwa protein ini memiliki homologi yang sangat rendah dengan protein ribosom7), tetapi urutan nukleotida pada daerah hulu dari gen SUP45 menyerupai daerah conserved lestari hulu 5’ pada gen yang mengkode protein ribosom pada S. cerevisiae. Analisis Western Blot ditemukan bahwa protein Sup45p terikat erat pada ribosom8,9).

Berdasarkan uraian di atas nampak adanya perbedaan mekanisme terminasi translasi di sistem eukariot dan prokariot. 2. ade2-1.5% (b/v) dan tripton 1% (b/v)). 818 dan 819 digunakan untuk uji allosuppresi. 2. 817. Galur S. cerevisiae yang akan dimutasi ditumbuhkan pada media YEPD hingga mencapai kerapatan optik 107 sel/mL.1. coli.1 M pH7 hingga volume akhir 2 mL. Ke dalam campuran ini kemudian ditambahkan bufer fosfat 0. Media Pertumbuhan dan Kondisi Kultur Kultur S.2. 2. coli ditumbuhkan pada suhu 37oC dalam media LB (ektrak ragi 0. cerevisiae Galur S. PNN1.15.1. 2. Sel kemudian diendapkan dan diresuspensi dengan bufer fosfat 0. 2. lys1-1. .67% (b/v). Metode 2. 1%. digunakan sebagai target sel untuk mutasi. 9 No. NaCl 0.2. berinteraksi satu sama lain untuk membentuk release factor yang fungsional11. Pada E.5%. cerevisiae. ura3-1. BSC483/1a. his5-2. diperoleh dari School of Biological Sciences.1. Galur E. Media SM (basa notrogen ragi tanpa asam amino 0. Pada tulisan ini dilaporkan karakterisasi mutan-mutan temperatur sensitif sup45 yang telah diisolasi melalui mutasi in vivo dengan menggunakan EMS.3 mg/mL dan diinkubasi pada suhu 30OC. Selain itu urasil dan adenin ditambahkan dengan konsentrasi akhir masing-masing 100 mg/mL dan 200 mg/mL.5% (v/v). Galur E. kodon UAA dan UAG dikenal oleh RF1. Semua plasmid di peroleh dari School of Biological Sciences.2.1 M dengan pH 7.3. 2. yaitu Sup35p11). [psi-]). 2. Bahan 2. ligasi DNA dan elektroforesis gel agarosa dilakukan menurut protokol standar18). cerevisiae ditumbuhkan pada media YEPD (Glukosa 2% (b/v). Karakterisasi mutan Untuk mengamati fenotipik hipersensitif terhadap antibiotik paromomisin. 2. Canterbury. [psi-]).1 M. Campuran kemudian diinkubasi pada suhu 30oC selama 1 jam kemudian reaksi dihentikan dengan menambahkan Na2S2O3 5% (b/v). Aktivitas protein ini bergantung pada produk gen lain. sedangkan media YPG juga dibuat seperti YEPD dengan mengganti glukosa dengan gliserol dengan konsentrasi akhir 3% (b/v). sedangkan plasmid pUKC815. Sel kemudian diendapkan dan diresuspensi dalam bufer fosfat 0. ektrak ragi 1% (b/v)) pada suhu 30oC.2.234 JMS Vol. 1. 600.1. Ampisilin 50 µg/mL ditambahkan ke dalam media LB untuk seleksi transforman. pepton bakteri 2% (b/v). coli DH5α (supE44 ∆lacU169 (φ80LACZ M15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1) digunakan untuk perbanyakan plasmid dan diperoleh dari Laboratorium Rekayasa Genetika PPAUBioteknologi ITB. cerevisiae10). University of Kent.1. can1-100.2.2. Fungsi RF3 adalah untuk memediasi aktivitas RF1 dan RF213). sup45-22 dan MT453/3c (MATa.17).5% (b/v). coli. University of Kent. Mutasi Sel S. Sedangkan untuk mengamati fenotipik sensitif temperatur. SUQ5. kompleks protein eRF1-eRF3 mengenal ketiga kodon terminasi.2. ade2-1. 1 mL kultur kemudian di tempatkan pada 5 tabung yang mengandung glukosa 2% (b/v) dan EMS dengan konsentrasi 0%. Walaupun demikian mekanisme rinci dari proses terminasi translasi pada S. leu2-1. Juni 2004 Data ini menyarankan bahwa protein Sup45p memainkan peranan penting dalam proses translasi pada S. 800 dan 1000 µg/mL. Selain itu juga digunakan mutan H48 sup45 sensitif antibiotik yang diperoleh dari Laboratorium Rekayasa Genetika PPAU-Bioteknologi ITB. can1-100. Manipulasi DNA Prosedur transformasi sel. 2% dan 2. Media pada yang mengandung paromomisin dibuat dengan menambahkan antibiotik paromomisin ke dalam media YEPD dengan konsentrasi akhir 300. Saat ini protein Sup45p telah diidentifikasi sebagai faktor terminasi pada S. cerevisiae masih belum banyak diketahui. mutan sup45 ditumbuhkan pada media YEPD yang mengandung paromomisin 0. Penelitian lebih lanjut dengan tujuan untuk mengidentifikasi domain-domain eRF1 yang bertanggung jawab untuk fungsi dari protein ini dalam proses terminasi translasi telah dan masih banyak dilakukan14.4. sedangkan RF2 dan RF3 dikenal oleh RF2. cerevisiae yang digunakan adalah BSC483/1a (MATα. Plasmid Plasmid yang digunakan dalam penelitian ini adalah pUKC802 digunakan untuk uji komplementasi. Suplemen asam amino ditambahkan dengan konsentrasi akhir 200 mg/mL untuk histidin dan lisin.12).16. coli E.3. Berbeda dengan faktor terminasi pada E. Campuran akhir kemudan ditumbuhkan pada media padat YEPD dengan pengenceran. ura3-1. isolasi plasmid. glukosa 2% (b/v)) digunakan untuk uji auksotrop. mutan sup45 ditumbuhkan pada media YEPD diinkubasi pada suhu 37OC. Kedua protein dikenal sebagai eRF1 dan eRF3. Media padat Y8 dibuat seperti media YEPD dengan mengganti kadar glukosa menjadi 8% (b/v). Bahan dan Metode Penelitian 2.1. SUQ5. pemotongan DNA dengan enzim restriksi.

Hubungan konsentrasi EMS dengan efisiensi mutasi. sehingga banyak digunakan untuk keperluan mutasi gen20). Diploid sup45 homozigot (sup45-2/sup45-x) akan memberikan warna putih. Semakin tinggi konsentrasi EMS. sedangkan diploid sup45 heterozigot (sup45-2/SUP45) akan memberikan warna merah.88 % Efisiensi 0 14.0 1.12 x 105 3.5. Pada [EMS] 1% (v/v).60 67. Sebaliknya pada [EMS] 2. walaupun efisiensi mutasinya sedikit lebih rendah dibanding pada [EMS] 2.00 87. 9 No.2. Mutan-mutan allosuppressor yang lolos seleksi masih berupa campuran mutan. Seleksi selanjutnya dilakukan dengan menumbuhkan mutan-mutan yang stabil pada media YPG.77% dan efisiensi mutasi 37. karena setidaknya terdapat enam lokus gen yang bertanggung jawab terhadap sifat allosuppressor. Dari 793 mutan diperoleh 770 mutan yang stabil berwarna putih.92 x 105 1. Perubahan warna koloni ini merupakan tanda bagi pemilihan mutan allosuppressor pada tahap awal.5 2. Selain itu BSC483/1a membawa mutasi ochre pada gen ade2-1 yang menyebabkan koloni ragi berwarna merah. Uji β-galaktosidase Galur S.55% dari total mutan yang diuji.36 x 105 Σ koloni Total 0 4. Oleh karena itu mutasi dengan EMS menghasilkan mutasi titik yang terjadi secara acak pada basa guanin dan timin. Juni 2004 235 2.88 37.12 x 105 0. Dari 770 mutan yang diseleksi 515 diantaranya merupakan non-petite. hanya 8 mutan yang merupakan mutan allosuppressor sup45 atau hanya 1. dimana viabilitas sel 67. Perubahan ini menyebabkan terjadinya perubahan pasangan basa pada replikasi DNA berikutnya.08 x 105 1.0 2. 3. maka kondisi mutasi optimal adalah pada [EMS] 1. sedangkan mutan-mutan allosuppressor non-petite dapat tumbuh dengan baik pada media ini23). dalam penelitian ini dilakukan variasi konsentrasi EMS. viabilitas dan jumlah mutan sup45.5 Σ Koloni Merah 4. mutasi pada gen ade2-1 dapat ditekan oleh suppressor SUQ5 dan menyebabkan terjadinya perubahan warna koloni.16 x 105 0.28 x 105 Σ Koloni Putih 0 0. Hal ini terjadi karena mutasi pada gen SUP45 bersifat resesif. SUP42 (kromosom IV). Isolasi dan Kondisi Mutasi Dalam penelitian ini isolasi mutan allosuppressor sup45 dilakukan secara in vivo dengan menggunakan mutagen EMS (etil metana sulfonat). Pada BSC483/1a yang merupakan target mutasi telah terdapat suatu suppressor tRNA SUQ5 yang dapat menekan mutasi nonsense.55%) tetapi viabilitas selnya rendah (33.55 . Meskipun EMS termasuk dalam kategori mutagen yang potensial. mutasi pada gen ade2-1 tidak dapat ditekan oleh SUQ5. Untuk mendapatkan mutan allosuppressor sup45 dilakukan pengujian melalui proses komplementasi dengan galur MT453/3c (sup45-2).67%. dimana koloni ragi menjadi putih22).JMS Vol. kemudian ditumbuhkan pada media minimal yang diperkaya dengan asam amino dan kofaktor yang sesuai tetapi tanpa urasil.64 33.04 x 105 2. Dalam penelitian ini diperoleh 793 mutan yang mempunyai potensi sebagai mutan allosuppressor. SUP44 (kromosom VII).24 x 105 3.5% (v/v) dan 2. Hasil dan Pembahasan 3. SUP43 (kromosom XV). tetapi EMS tidak bersifat toksik terhadap S.0 1. Pada [EMS] 1.0% (v/v) memiliki efisiensi dan vibilitas sel yang moderat (Tabel-1). Karena mutasi dengan EMS bersifat acak.60%) tetapi memiliki efisiensi mutasi yang rendah (14. diperoleh semakin tinggi efisiensi mutasi (Tabel-1).5% (v/v). Pada keadaan dimana produk gen SUP45 (eRF1) fungsional.88%).19%. Untuk itu diperlukan suatu dasar untuk menyeleksi mutan yang telah termutasi pada gen sup45 di antara sekian banyak mutan yang viabel.84 x 105 4.5% (v/v) efisiensinya tinggi (73. maka mutasi dapat terjadi pada seluruh gen. Tabel 1. dimana GC → AT dan TA → CG.24 x 105 0. Dari 515 mutan allosuppressor yang diuji. tetapi bila terjadi kerusakan pada fungsi gen SUP45. 2. koloni putih menunjukan sel mutan [EMS] (%v/v) 0. SUP45 (kromosom II) dan SUP46 (kromosom II)24). Akan tetapi kenaikan konsentrasi EMS juga diikuti dengan kenaikan tingkat letalitas sel.64 x 105 % Viabilitas 100.28 x 105 3.19 39. yaitu lokus SUP35 (kromosom IV). Mutan allosuppressor diketahui memiliki kemampuan untuk meningkatkan efisiensi suatu nonsense suppressor21). Untuk mendapatkan kondisi optimal. Koloni merah menunjukan sel wild type. Metode pengujian βgalaktosidase dilakukan sesuai dengan metode yang dikembangkan sebelumnya19).67 73. dimana pada media ini sumber karbonnya hanya gliserol.1. cerevisiae. Mutan petite tidak dapat menggunakan gliserol sebagai sumber karbon. Sehingga seleksi berikutnya ditujukan untuk mendapatkan mutan allosuppressor yang hanya mengalami kerusakan pada gen sup45. Akan tetapi. Seleksi berikutnya dilakukan dengan penumbuhan mutan dalam media kaya (YEPD dengan glukosa 8%). EMS telah dikenal sebagai mutagen kimia yang dapat mengalkilasi basa timin dan guanin sedemikian rupa sehingga terjadi perubahan orientasi ikatan hidrogen pada kedua nukleotida ini.0% (v/v) yaitu 39. viabilitas sel cukup tinggi (87.77 63. dengan membandingkan jumlah mutan yang viabel. cerevisiae yang telah ditransformasi dengan salah satu dari vektor pUKC815/817/818/ 819.88%).

sedangkan mutan lainnya tumbuh dengan tingkat kesuburan yang berbeda. Sifat hipersensitif paromomisin juga berassosiasi dengan kerusakan pada lokus SUP45. (+) viabel. Dengan demikian mutan sup45-33 dan sup45-34 memiliki fenotipik ganda (sensitif temperatur dan hipersensitif paromomisin). Letalitas mutan terhadap paromomisin disebabkan antibiotik ini dapat terikat pada ribosom 40S sehingga dapat menginduksi kesalahan interaksi kodon-antikodon25). diperoleh bahwa sifat sensitif temperatur dari semua mutan sup45 ini berassosiasi dengan kerusakan pada lokus SUP45. 2. Keadaan ini diperburuk dengan adanya mutasi pada gen SUP45 yang mengkode protein yang berperan dalam menjaga ketepatan translasi4).2. Semua mutan sup45 mempunyai laju pertumbuhan dan pertumbuhan maksimum lebih rendah dari induknya (Gambar-1). 1 mutan mati pada suhu 35. 9 No. Diploid hasil perkawinan dan haploid mutan sup45 yang berassosiasi akan menunjukan fenotipik yang sama. Sebagai contoh pada mutan sup45-33 dan sup45-34 yang memiliki fenotipik sensitif temperatur dan hipersensitif paromomisin. sedangkan mutan hipersensitif paromomisin didefinisikan sebagai mutan yang mati pada konsentrasi paromomisin 300 µg/mL. Profil Pertumbuhan mutan sup45 beserta galur induknya. Sensitifitas mutan sup45 terhadap variasi temperatur dan paromomisin (-) tidak viabel. Pola pertumbuhan mutan sup45 dan induknya BSC483/1a. Variasi pola pertumbuhan mutan-mutan sup45 terlihat tidak berkaitan langsung dengan fenotipik dari mutan tersebut. Satu mutan mati pada suhu 32OC. Bahkan mutasi pada gen sup45.5OC dan 3 mutan lainnya mati pada suhu 37OC. Hasil ini menyarankan bahwa gen SUP45 merupakan gen yang esensial bagi viabilitas sel. telah dilakukan uji assosiasi dengan mengawinkan mutan sup45 dengan mutan sup45 tester yang telah diketahui memiliki fenotipik sensitif temperatur dan hipersensitif paromomisin.236 JMS Vol. OD diukur pada panjang gelombang 600 nm. 3 mutan mati pada suhu 34OC. yang telah diketahui bersifat hipersensitif paromomisin. (H) haploid. Perbedaan fenotipik menunjukkan bahwa sensitifitas mutan sup45 terhadap temperatur dan parmomisin tidak disebabkan oleh kerusakan pada lokus SUP45. Selain itu untuk mengetahui sifat sensitif temperatur atau hipersensitif paromomisin disebabkan karena kerusakan pada gen sup45. Gambar-1. semula diperkirakan akan memiliki laju pertumbuhan dan pertumbuhan maksimum lebih rendah dari mutan sup45 lain yang hanya memiliki . setelah dibuktikan melalui uji assosiasi mutan dengan tester sup45-28. (D) diploid Temperatur (oC) Mutan BSC483/1a Sup45-30 Sup45-31 Sup45-32 Sup45-33 Sup45-34 Sup45-35 Sup45-36 Sup45-37 30 +++ ++ +++ ++ +++ ++ + +++ ++ 32 +++ + +++ + +++ + ++ ++ 34 +++ ++ ++ + + 35. ditentukan berdasarkan pengukuran OD (optical density) pada panjang gelombang 600 nm. Sensitifitas mutan terhadap paromomisin juga menunjukkan hasil yang bervariasi. Juni 2004 Tabel 2. Selain itu hasil uji assosiasi mutan sup45 dengan mutan sup45-2 yang telah diketahui bersifat sensitif temperatur. Sensitifitas mutan sup45 terhadap temperatur dan paromomisin Pengujian sensitifitas mutan terhadap temperatur dan paromomisin didasarkan pada konsensus bahwa mutan sensitif temperatur adalah mutan yang mati pada temperatur 37OC. dimana dua mutan (sup45-33 dan sup45-34) mati pada konsentrasi paromomisin 300 µg/ml. sehingga tingkat kesalahan menjadi lebih tinggi dan dapat menyebabkan kematian. Hasil ini menyarankan bahwa produk gen SUP45 penting untuk viabilitas sel.5 ++ + + + 37 H + D Paromomisin 300 µg/mL H D +++ ++ ++ ++ + + + ++ ++ ++ ++ + + 3. Hasil uji sensitifitas mutan terhadap temperatur dan parmomisin memberikan hasil yang bervariasi (Tabel-2). dapat menyebabkan laju pertumbuhan dan pertumbuhan maksimum mutan sup45-32 menjadi rendah sekali.

Pada plasmid ini promotor diletakan didepan gen PGK dan pada oligonukleotida disisipkan kodon terminasi UAA. Ekspresi gen LACZ hanya akan terjadi bila kodon terminasi pada plasmid dibaca salah (readthrough). Mutan sup45-36 memiliki tingkat supresi tertinggi (14. Untuk ini telah dilakukan kuantisasi allosuppresi dengan menggunakan plasmid yang membawa gen fusi PGK-oligonukleotida-LACZ26). sedangkan sup45-34 yang diperkirakan akan memiliki tingkat allosupresi yang tinggi karena memiliki fenotipik ganda malahan memperlihatkan tingkat allosupresi moderat. Hasil ini menyarankan bahwa kematian sel pada temperatur lebih tinggi kemungkinan disebabkan oleh terlalu tingginya tingkat kesalahan pembacaan kodon terminasi sehingga protein yang dihasilkan terlalu banyak yang salah. terutama pada temperatur 30OC dan 32OC. sehingga memungkinkan untuk mengamati tingkat allosupresi hingga suhu ~35OC. . yaitu pada 30. BSC483/1a. UAG dan UGA). hal ini disebabkan karena adanya aktifitas dari suppressor ochre SUQ5 yang dibawa oleh galur BSC483/1a.JMS Vol. pengujian dilakukan pada tiga temperatur yang berbeda. 2. Penumbuhan sel dilakukan pada 30 oC. UAG dan UGA dan digabungkan dengan gen LACZ. seperti tRNATrp27) dan tRNAGln28). 3. telah dilakukan pengukuran tingkat allosupresi pada beberapa temperatur dengan mengambil dua mutan sup45 sebagai sampel. Pengujian ini hanya dilakukan untuk kodon terminasi UAA agar perubahannya dapat diamati dengan jelas. sedangkan ekspresi pada kodon UAG dan UGA kemungkinan dilakukan oleh suppressor tRNA alam. sup45-31 dan sup45-37. Semua mutan sup45 memiliki tingkat supresi nonsense lebih tinggi dari galur induknya. Mutan sup45-32 yang memiliki laju pertumbuhan dan pertumbuhan maksimum terendah yang semula diperkirakakan akan memiliki tingkat allosupresi rendah malah memiliki aktifitas βgalaktosidase moderat. Tingkat Allosuppressi mutan mutan sup45 dan BSC483/1a. Walaupun demikian tingkat allosuppresi dari mutan mutan ini dapat berbeda. Hasil yang diperoleh menunjukan adanya kenaikan tingkat allosuppresi yang signifikan dengan naiknya temperatur (Gambar-3). Kedua mutan sensitif temperatur ini mampu hidup hingga temperatur 35. Gambar 2.3. Hasil studi sebelumnya menunjukkan bahwa sifat temperatur sensitif pada mutan sup45-2 terjadi karena adanya substitusi asam amino non polar pada daerah hidrofobik oleh asam amino polar6) yang menyebabkan ketidakstabilan struktur protein pada temperatur 37OC. 3% dan 1% untuk UAA. 9 No. Aktifitas β-galaktosidase yang dihasilkan setara dengan tingkat kesalahan pembacaan kodon terminasi. termostabilitas protein eRF1 mutan semakin menurun. Supresi pada kodon UAA dilakukan oleh suppressor SUQ5. Juni 2004 237 fenotipik hanya sensitif temperatur. sehingga kemungkinan mutasi yang terjadi pada mutan sup45-32 pada daerah yang esensial. tetapi data yang diperoleh menunjukan tidak ada perbedaan berarti pada laju pertumbuhan dibanding mutan lain. Tingkat allosuppresi mutan sup45 Kedelapan mutan sup45 ts bersifat allosuppressor. Disamping itu semakin tinggi temperatur. Variasi tingkat allosupresi ini menyarankan bahwa mutan-mutan sup45 yang diperoleh pada penelitian ini bersifat allele specific.5%. Besar kecilnya tingkat allosupresi nampaknya tidak memiliki korelasi langsung dengan fenotipik maupaun profil pertumbuhan dari mutan sup45. Fenomena ini menyarankan bahwa posisi mutasi sangat menentukkan fungsionalitas dari produk gen SUP45 (eRF1). Pada penelitian ini. hal ini ditunjukan dengan perubahan warna koloni dari merah menjadi putih. 32 dan 34OC. 5% dan 3% untuk UAA. Kondisi ini nampak jelas pada tingkat supresi kodon terminasi UAA dibanding kodon terminasi lainnya. Adanya supresi oleh supresor lemah di atas menunjukkan sifat allosuppressor dan omnipotent suppressor dari mutan sup45. Kerusakan yang terjadi pada protein eRF1 menyebabkan terjadinya readthrough pada kodon terminasi yang terletak pada oligonukleotida sehingga gen LACZ dapat terekspresi. Fenomena ini menyarankan bahwa sifat fenotipik dan fungsionalitas eRF1 tidak memiliki hubungan langsung dan kemungkinan fungsi protein eRF1 tidak hanya ditujukan oleh satu fenotipe. dimana protein eRF1 tidak dapat lagi bekerja dengan optimal dalam memediasi proses terminasi translasi. UAG dan UGA). bahkan pertumbuhan maksimumnya cukup tinggi.5OC dan mati pada 37OC. Untuk mengamati kerusakan produk gen SUP45 (eRF1) terhadap variasi temperatur. Hasil pengukuran aktifitas β-galaktosidase menunjukan adanya kenaikan aktifitas dari mutanmutan yang diuji dibandingkan dengan induknya (Gambar-2). sedangkan yang terendah terjadi pada mutan sup45-30 (8%.

537-543. Goff. X. I.. Grant. Zhouravleva. Sivobolova.M. Frolova.. “Transfer Ribonucleic Acid-mediated Suppression of Termination Codon in E.M. Res. 52. I.. W. 6: 3469-3478.. 32..R. Pengujian hanya dilakukan untuk kodon terminasi UAA.. (1992).. G. Ter-Avanesyan..G.Y. Stansfield. V. 354-374.R. 4. Th. 485-496. Kress. Eggerstsson. 2. S. 2. (1984). B... K. Juni 2004 6. “The crystal structure of human eukaryotic release factor eRF1... Crouzet. University of Kent at Canterbury. 187-205.. S.M. & Soll. (1999).. 10. I...R. Mol. Ucapan Terima Kasih Penelitian ini sulit dilakukan tanpa bantuan dari University Research for Graduate Education (URGE) Project. Grant. United Kingdom. Celis.L.I. C. M. C. M. (1988). (1995).. J. hal ini menyarankan bahwa mutan yang diperoleh merupakan mutan allele spesific. cerevisiae” Cur.. Gen. Microb.F. Poznyakovski. “A TemperatureSensitive Mutant of Escherichia coli That Shows Enhanced Misreading of UAG/A and Increased Efficiency For Some tRNA Nonsense Suppressors”. D. Webb. Pengaruh kenaikan temperatur pada tingkat allosuppresi mutan sup45-31 dan sup45-37. M.P. Caskey. 147-205.... A. Nucl.. (1995). & Piepersberg. MGG 193. Disamping bersifat allosuppressor kedelapan mutan juga bersifat temperatur sensitif. (1988). Kisselev. Frolova.. Dagkesamanskaya. N.. Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi.S. and Tuite. (1980). Cheperegin. “The Product of the SUP45 (eRF1) and SUP35 (eRF3) Genes Interact to Mediate Translation Termination in Saccharomyces cerevisiae”. “The Allosuppressor Gene SAL4 Encodes a Protein Important for Maintaining Translational Fidelity in S.L... Smirnov. L. A. 16. L.V. Breining.. G. Nierras. Cox.. L. Semua mutan mempunyai kecepatan pertumbuhan dan pertumbuhan maksimum yang lebih rendah dibandingkan dengan induknya. Graves.. Isaksson. (1999). Tsikovskii. “Mutation ini highly conserve GGQ motif of class 1 polypeptide release factor abolish abilility of human eRF1 to trigger peptidyl-tRNA hidrolysis” RNA.. Stansfield.Mechanisms of stop codon recognition .Y. N. Analisis tingkat kerusakan fungsi protein eRF1 menunjukan adanya variasi pada mutan-mutan yang diuji. Akhmaloka.M. and Biol. Ph.. Daftar Pustaka 1.F. “A Molecular Genetic Analysis of the Allosuppressor Gene SAL4 in Saccharomyces cerevisiae”. 18.P. Ryden. Rasmussen. (1991). Microb. Song. Eurwilaithirt. S... Grant. 5187-5197. Mutant Gene”.H. A.I. H... Evans. R.. 4365-4373. L..V. M. J. B. Departemen Pendidikan Nasional.A.L. M. Oparina. Rev.Y. “Conttrol of translational fidelity in yeast”. G. and Kisselev. H. 4.E. Phillipe. 7. and Philippe. United Kingdom. Phys. L..M.. Salah satu faktor yang menyebabkan kematian mutan pada temperatur 37oC adalah tingginya tingkat kesalahan protein eRF1 pada proses terminasi translasi.D. Goff. Akhmaloka. Frolova. Surguchov. Camb 30. A. F. R. Stansfield. 4.. Guellec.. Kesimpulan Delapan mutan sup45 ts telah diisolasi dari galur ragi BSC483/1a yang telah diinduksi dengan mutagen etil metana sulfonat.. Gent. Mugnier. C. Igzu.. & Tuite. 3.. (1986). Tuite.F. (1994). coli” Microb. P.K. Ac. M. 234-237. P. I. and Kisselev.F. Chem. and Tuite. Inge-Vecthomov. L. C.M. V. G. S. 15.F.. Blinov. 5...N. Rev. 9. (1977). 4065-4072.. Tatkov. X. Gambar 3. O. M. 38-45. 11.. “Yeast Omnipotent Suppressor SUP1(SUP45): Nucleotide Sequence of the Wild-Type and a 8..L. thesis..F. Haenni. Kushnirov. 14. 5. L. 12.. “Peptide Chain Termination” TIBS. G. Jones. M..S..D. Das.. Arman. “Termination of Translation in Eukaryotes is Governed by Two Interacting Polypeptide Chain Release Factors. A. eRF1 and eRF3” EMBO Journal 14.I. Res. C. Inge-Vectomov. “The C-terminus of eRF1 defines a functionally important domain for translation termination in Saccharomyces cerevisiae” Mol. Paushkin. M. and Tuite... (1990).. Nature 372. 1014-1020... “A Highly Conserved Eukaryotic Protein Family Possessing Properties of Polypeptide Chain Release Factor”.. 701-703.. “Ribosomal Association of the Yeast SAL4 (SUP45) Gene Product: Implication For its Role in Translational Fidelity and Termination”. Serspinsky. D.. sensitif temperatur dan hipersensitif paromomisin. 9 No. Cox. H. “Ribosomal suppression in eukaryotes”. S. Justesen. 14. M. L.. M. The EMBO Journal 14. University of Kent. Drugeon. PhD Thesis. S. 13. (1984)...238 JMS Vol. Dua dari mutan-mutan di atas mempunyai fenotipik ganda.. “Allosuppressor in Yeast”..

166-170.C.. “Class 1 translation termination factors: invariant GGQ mini domain is essential for release activity and ribosom binding but not for stop codon recognition”. S. J.F. (1982). S. 100. 273-281. Tuite. L. J. Maniatis. T. 19. Sambrook. W... Firoozan. J. “The Effects Of Paromomycine On The Fidelity Of Translation In A Yeast Cell-Free System”. Grant.. Cold Spring Harbour. L. “Quantitation of Readthrough of Termination Codons in Yeast using a Novel Gene Fusion Assay”. Bolotin-Fukuhara. 21. “Molecular Cloning: a Laboratory Manual”..A.. E..F. 4215-4221. “Suppression in the Yeast Saccharomyces cerevisiae. and peptidyl-tRNA Hydrolysis” Cell. 23. cerevisiae” Mol. J. F. New York.. Nucleic Acids Res. (1989). Kim. 18. 18. 463-486. 27.. M. C. (2001). (2000). “Classical Mutagenesis Techniques. F. and Strausberg.(1991). at Biophys. (1990). and Kisselev. 3. 2nd ed. D. Lawrence. The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae: Metabolism and Gene Expression” Cold Spring Harbour Laboratory. (1991). (1983).. M. 26. (1989). G.B. Duarte. “Heat Shock Regulated Production of E. Juni 2004 239 17. Wakem. in Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology” Methods in Enzymology. Nebi. Biol. and McLaughlin.A. Edelman. (1992). Tuite M.. 131-153. The EMBO Journal 10..D.R.M. Nucleic Acids Res. Coli βGalactosidase in S..J.. “Isolation and Characterization of Omnipotent Suppressor in the Yeast Saccharomyces cerevisiae” Genetics 124: 515-522. S.. Clark. Cold Spring Harbour Laboratory. 24..F. Acta 783. L. “Yeast Transfer RNA Trp Genes with Anticodon Corresponding to UAA and UGA Nonsense Codons”. 9 No. Vranko. “Exceptional Codon Recognition by Glutamin tRNAs in Saccharomyces cerevisiae”. (1991). “Genetic Approaches to the Study of Mitochondrial Biogenesis in Yeast” Antonie van Leeuwenhoek 62.A. D.P and Sherman. 25. M... and Tuite. Finkelstein. J.. (1984). J.. 1481-1491. 3982-3987. and Johnson. M. L. 28.D. New York. 173-183.. Frolova.. Justensen. and Grivell.A.JMS Vol. 22. 20. “Protein Synthesis” Biological Laboratory of Kent at Canterbury. 311321.. M. Raymond.F. Yeast 7. Cell. Fritsch.. Sherman. Biochem. 29. 2. . (1990).S. 1625-1633. I and Culbertson. C.