KROMATOGRAFI EKSKLUSI

Pemisahan makromolekul yang dapat larut dari air dan penting di bidang biologi, teknik ini biasanya disebut kromatografi penyaringan gel, Gel Filtration Chromatography (GFC), kromatografi permeasi gel atau GPC (gel permiation chromatography) dan disebut pula sebagai kromatografi eksklusi gel (Gel Exclude Chromatography)

Ukuran molekul merupakan kriteria utama dalam pemisahan dengan kromatografi ekslusi ukuran. Pemisahan terjadi karena solut-solut berdifusi masuk dan keluar pori-pori material paking kolom. Jelas bahwa ukuran masing-masing molekul mengontrol seberapa jauh molekul dapat menembus pori-pori paking kolom. Molekul-molekul yang lebih besar dari diameter pori-pori akan melewati kolom secara cepat dan dikenal dengan istilah volume terekslusi. Sebaliknya molekul-molekul kecil menempati volume pori dan tertahan lebih lama

Retensi maksimum terjadi ketika molekul yang cukup kecil menggunakan semua volume pori. Molekul-molekul tersebut terelusi dalam volume permeasi. Parameter pemisahan dikontrol terutama oleh pilihan dan material paking kolom. Material paking mempunyai berbagai ukuran pori dan material paking dengan tidak terlalu bervariasi ukuran pori akan memberikan resolusi yang baik tapi haya berguna untuk rentang berat molekul tertentu. Akan tetapi, kromatografi ekslusi ukuran merupakan teknik yang berguna untuk mengkarakterisasi distribusi berat molekul polimer, pemurnian cuplikan biologis, dan pemisahan senyawa-senyawa dengan berat molekul 2000 atau lebih

Bahan yang digunakan dalam kromatografi eksklusi salah satunya adalah dekstran, suatu polisakarida yang diproduksi dari mikroorganisme tertentu. Dekstran tersebut merupakan polimer glukosa dengan jumlah molekul kira-kira 10 sampai 300 juta dalam keadaan aslinya. Residu glukosa ini disambung dengan hubungan alfa-1,6. Pencabangan rantai terjadi sampai derajat tertenlu melibatkan hubungan glukosida 1,2 atau 1,3 atau 1,4. Pembuat Sephadex dilakukan dengan cara memurnikan dekstran mentah dan menghidrolisisnya

Bahan-bahan Sephadex sangat hidrofilik. Pada saat manik-maniknya disuspensikan di dalam air, terjadi pengambilan air secara besar-besaran, diikuti juga dengan membengkaknya partikelpartikel untuk membentuk gel Sephadex. Perolehan-ulang air, berkisar antara 1 g air pergram Sephadex kering di dalam bahan yang banyak mengandung hubungan-silang sampai 20 g atau lebih dalam preparasi dengan hubungan silang yang lebih sedikit. Suspensi manik-manik yang bengkak ini dimasukkan ke dalam kolom dan dibiarkan diam; volume akhir dari hamparan per gram Sephadex kering mungkin berkisar dari 2 sampai 40 ml, tergantung derajat hubungan silangnya.

Bahan-bahan yang disebutkan di atas bukanlah satu-satunya yang tersedia untuk penyaringan gel. Selain itu, ada beberapa bahan lain yang didasarkan pada agarosa, suatu polisakarida yang ditemukan di dalam produk rumput laut agar, dan bahan-bahan anorganik silika gel dan gelas berpori.

Mekanisme Pemisahan

Molekul zat terlarut yang cukup kecil dapat masuk dengan bebas ke fasa gel.Pada pengoperasian kolom, hal ini akan memiliki efek menghambat molekulmolekul yang dapat menembus gel akan menghabiskan sebagian dari waktunya terlindung dari fasa bergerak. suatu molekul yang sangat besar tidak dapat menembus pori-pori sama sekali. Molekul seperti itu akan menghabiskan seluruh waktunya di dalam fasa bergerak dan akan bergerak paling cepat melalui kolom.

Molekul yang berukuran intermediet yang dapat menembus sampai derajat tertentu dan pergerakannya menuruni kolom akan sedikit dihambat. Jadi, kita mempunyai dasar untuk memisahkan molekul-molekul dengan ukuran yang berbeda. Molekul yang mempunyai ukuran sesuai dengan ukuran pori gel adalah molekul yang tertahan dalam fasa diam sehingga gel dapat digunakan untuk memisahkan campuran molekul dengan ukuran berbeda

Berdasarkan jenis bahan pembentuk gel, maka kemasan kromatografi eksklusi gel dibedakan menjadi tiga yaitu : Gel kaku, gel setengah kaku dan gel lunak. Gel kaku, biasanya terbuat dari kaca atau silica. Kolom ini dapat dijumpai dalam berbagai ukuran pori. Karena sifatnya yang kaku, maka ukuran pori gel tidak mudah berubah, stabil pada perubahan fisik seperti kecepatan alir atau tekanan. Gel setengah kaku mempunyai kemasan yang lebih lentur. Terbuat dari polistirena yang disambungsilang dengan divinilbenzena sehingga menjadi suatu gel dengan struktur kurang kaku. Gel setengah kaku cocok untuk pelarut organik seperti aseton, tetrahidrofuran dan sebagainya.

Gel lunak merupakan jenis gel yang berukuran fleksibel. Terbuat dari dekstran yang disambungsilang misalnya Sephadex. Ukuran gel lunak bisa menggembung beberapa kali dari ukuran keringnya. Gel jenis lunak harus dipreparasi dahulu selama beberapa jam (tergantung jumlah) sampai tidak terjadi penggembungan ukuran lagi biasanya dalam pelarut berair.

Ukuran pori gel

Jika ukuran pori gel adalah 200-1000 maka hanya molekul yang berukuran antara 200-1000 saja yang akan ditahan olah pori gel. Molekul dengan ujuran diatas 1000 adalah yang paling cepat keluar kolom karena tidak dapat masuk pori. Molekul dengan ukuran dibawah 200 akan masuk pori namun tidak ditahan karena ukurannya terlalu kecil dan akan keluar dari kolom berikutnya. Molekul yang tertahan adalah molekul yang berhasil dipisahkan dan dielusi kembali untuk dianalisis

Pemisahan fraksi-fraksi protein dari suatu sampel biologi dapat menggunakan kolom Sephadex G-I00 berdiameter 6 cm dan panjang 185 cm. Protein merupakan senyawa kompleks dengan berat molekul cukup besar. Penggelompokan protein dalam rentang berat molekul tertentu akan mempermudah identifikasi selanjutnya. Elusi dengan penyangga berair menghasilkan pemisahan berdasarkan ukuran molekul