LUCRARI LABORATOR MICROBIOLOGIE SPECIALA L.0. Protecţia muncii. Prezentare lucrări.

L.1. Tehnici de eșantionare, recoltare şi pregătire a probelor pentru analiza microbiologică Metode clasice de evaluare a principalelor grupe de microorganisme de alterare din alimente L.2. Determinarea numărului total mezofile L.3. L.4. L.5. L.6. de bacterii aerobe

Determinarea numărului total de drojdii şi mucegaiuri Determinarea bacteriilor sporulate aerobe şi anaerobe Determinarea microorganismelor osmofile Determinarea bacteriilor de putrefacţie

Metode rapide, clasice şi moderne de evaluare a calităţii microbiologice a alimentelor L.7. L.8. L.9. Proba reductazei Metode bazate pe utilizarea Petrifilmelor Bacterii coliforme. Coliformi fecali si Escherichia coli

Tehnici de evaluare a microorganismelor indicatori sanitari Analiza bacteriilor care induc risc biologic în alimente L.10. Determinarea numărului de bacterii Staphylococcus aureus (coagulazo pozitivi) L.11. Genul Listeria L.12. Genul Bacillus. Genul Clostridium L.13. Colocviu de laborator

MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EȘANTIONARE, RECOLTARE SI PREGĂTIRE A PROBELOR

TEHNICI DE EȘANTIONARE, RECOLTARE SI PREGĂTIRE A PROBELOR PENTRU ANALIZA MICROBIOLOGICĂ

1.

Eșantionarea probelor

Pentru efectuarea analizelor microbiologice, probele de analizat trebuie să reflecte condiţiile microbiologice existente în momentul recoltării și să reprezinte fidel lotul din care provine. De modul în .care se face recoltarea și transportuI probelor la laborator depinde de multe ori rezultatul analizei. De aceea, o etapă foarte importantă constă în stabilirea eșantioanelor, a condiţiilor de recoltare a probelor și de transport în condiţii corespunzătoare la laboratorul de analize. În activitatea de prelevare a probelor există o terminologie generală, și anume: ! lotul - reprezintă cantitatea de produse cu aceleași caracteristici, realizate în condiţii tehnologice uniforme, într-o şarjă, schimb de producţie sau într-o perioada limitată de timp; ! elementul - este partea indivizibilă a lotului; ! eșantionul global - reprezintă probă formată prin mai multe prelevări din același lot; ! eșantionul redus - este fracțiunea reprezentativă dintr-un eșantion global; ! eșantionul de laborator - este fracțiunea din eșantionul global sau redus destinată analizelor de laborator; ! prelevarea (recoltarea) - reprezintă tehnica de recoltare a unui eșantion elementar dintr-un lot sau a unui element indivizibil. Sunt posibile două tipuri de recoltare a eșantioanelor: prelevarea elementelor cu defecte pentru a evidenţia cauza producerii acestora; prelevarea la întâmplare a unor elemente care aparţin unor condiţii normale de producţie, pentru controlul calităţii microbiologice. În acest caz sunt aplicate metode statistice, astfel încât eșantionul să fie statistic semnificativ. Eşantioanele se aleg prin tragere la sorţi, după scheme prestabilite, pe baza tabelelor de recoltare ce conţin numere echivalente numărului de probe din lot, dar dispuse la întâmplare (tabelul 1). După numerotarea elementelor lotului, se corelează aceste numere cu cele din tabel, şi, apoi, se prelevează probele corespunzătoare numerelor din tabel în succesiunea stabilită de echipa de control. Astfel, pornind de la un punct şi într-o ordine arbitrar aleasă se compune eşantionul cu elementele corespunzătoare. De exemplu, dacă se doreşte ca dintr-un lot de 80 bucăţi să se preleveze la întâmplare 5 probe, se vor

Pag 1

MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EȘANTIONARE, RECOLTARE SI PREGĂTIRE A PROBELOR

preleva elementele corespunzătoare numerelor primei linii din tabel: 07; 59; 66; 63; 46 (valoarea 97 este exclusă pentru că nu există). Tabelul 1. Exemplu de ordonare aleatorie a elementelor unui lot în vederea eşantionării
07 45 32 62 84 96 74 54 80 96 53 52 45 98 89 59 01 36 44 88 44 50 41 95 47 62 50 53 26 39 66 64 52 03 65 92 33 90 01 23 97 28 94 99 07 97 32 26 61 64 77 45 46 67 51 78 59 02 26 26 63 48 54 09 14 26 66 51 22 45 95 26 22 14 11 46 85 28 37 01 52 25 73 84 37 08 29 22 91 26 18 43 95 48 20 29 42 98 05 83 84 62 08 52 45 42 84 13 42 79 34 27 35 97 09 61 89 91 01 52 62 10 08 28 16 45 25 84 09 17 71 83 36 85 63 56 24 32 49 11 04 09 59 46 71 59 10 76 24 65 68 32 92 58 22 45 39 78 62 96 49 13 59 45 79 93 26 24 54 54 37 18 96 73 79 20 25 69 52 03 43 62 87 36 46 23 08 05 17 58 83 32 05 95 12 12 65 91 07 39 66 90 59 63 92 56 72 89 27 93 48 90 13 15 79 02 72 89 46 78 61 83 14 25 28 68 57 18 68 14 05 75 61 45 70 85 58 98 94 37 87 06 72 12 89 92 26 38 83 80 88 75 14 63 45

Alegerea elementelor pentru analiză (x) se poate stabili pe baza formulelor:

x=

N sau x = N n

în care: N = numărul elementelor unui lot; n = numărul eşantioanelor de prelevat.

După stabilirea valorii x se numerotează şi se asociază în grupe diferite elemente ale lotului notate de la 1 la x. Se extrage din fiecare grupă elementul notat cu x. Aceste tehnici sunt aplicabile atât loturilor de produse finite din depozite, cât şi pe fluxul de fabricaţie sau în momentul livrării. Pe fluxul de fabricaţie prelevarea se efectuează, de obicei, după terminarea unei etape de procesare. Pentru a fi semnificativă, eşantionarea trebuie să fie realizată în timp, deoarece un eşantion constituit exclusiv din elemente succesive este puţin reprezentativ pentru ansamblul unei producţii sau al unui lot. Frecvenţa prelevărilor şi a controlului depinde în general de nivelul producţiei, riscurile de contaminare, sau de apariţia defectelor de fabricaţie. În cazul unei producţii mari, frecvenţa prelevărilor va fi mai mare. Este de asemenea important să se efectueze analize ori de câte ori au loc variaţii la nivelul fabricaţiei, generate de: - schimbarea lotului de materie primă; - fluctuaţiile generate de modificarea schimbului; - modificări sau reparaţii ale utilajelor, ş.a.

Pag 2

În alte cazuri. Pag 3 .TEHNICI DE EȘANTIONARE. cutii. Prelevările ce corespund primului caz sunt simple și nu necesită masuri de precauţie suplimentare. de forma și volumul recipientului. De aceea este foarte important să se cunoască zonele cu riscuri mari de contaminare. se flambează gura robinetului. sticle. probele se recoltează din produse în vrac sau parţi dintr-un element de dimensiuni mari. pentru brânză). Recoltarea produselor solide În funcţie de natura produsului. RECOLTARE SI PREGĂTIRE A PROBELOR Prelevările se efectuează pe elemente indivizibile (produse de dimensiuni mici. pipeta tip harpon. sonda (de exemplu. pachete mici ş.MICROBIOLOGIE SPECIALA . Înainte de recoltare se recomandă omogenizarea probei. care se poate realiza manual. în funcţie de natura produsului. pachete mici. ş. Condiţii generale de prelevare (recoltare) Cantitatea de probă recoltată depinde de natura analizei și de planul de eşantionare.a. etc. Pentru acest domeniu se recomandă analize în cadrul unui plan cu 2 sau 3 clase. Măsuri aseptice Este absolut necesar să se evite contaminarea suplimentară a probelor în timpul recoltării sau după această etapă. pentru recoltare se foloseşte scalpelul. sau părţi dintr-un element de dimensiuni mari. fiecare prelevare trebuie să fie compusă din 5 probe (n=5). se lasă ·să curgă o parte din produs pentru a elimina microorganismele stagnante pe conductă și apoi se face recoltarea propriu-zisă. Recoltarea produselor lichide Se realizează apelând la diferite tehnici. Unele instrumente trebuie sterilizate la locul de recoltare. produse de dimensiuni mici. Omogenizarea Repartizarea microorganismelor în produsul analizat nu este întotdeauna omogenă. În cazul în care recoltarea se face de la reţea. mai ales în cazul produselor voluminoase sau cu structuri eterogene. În asemenea cazuri se recomandă ca prelevările să se realizeze din mai multe zone. În funcţie de volumul de produs ce trebuie recoltat se pot utiliza pipete sterile sau instrumente speciale de recoltare (polonic steril sau flacon special). sau cu ajutorul unui agitator mecanic steril. Pentru aceasta recipientele utilizate și instrumentele de recoltare trebuie să fie sterile și protejate în ambalaje sterile. din produse ambalate în vrac. precum și prin utilizarea sistemelor de omogenizare mecanică cu care sunt prevăzute recipientele. Tehnici de prelevare De cele mai multe ori prelevările se efectuează pe elemente indivizibile (cutii de conserve. cu ajutorul unei baghete.). sau se impune omogenizarea produselor vrac înainte de prelevarea probelor.a.). 2.

. în funcţie de cantitatea de probă. RECOLTARE SI PREGĂTIRE A PROBELOR Instrumentele trebuie să fie sterilizate. Pentru produsele solide este necesară obţinerea şi standardizarea suspensiei iniţiale. cutii de conserve). protecţia fata de contaminările externe.). Principalii factori care influenţează stabilitatea sunt: temperatura și durata de păstrare. modalitatea de recoltare (metoda eșantioanelor.expusă contactului cu aerul. Rezultatele analizei se raportează la 1 ml suspensie sau 1 g produs. apoi se adaugă un volum cunoscut de lichid de diluţie (40 ml pentru diluţia 1/5. numărul de ordine. microorganismele de la suprafaţa produsului.. În general. x ml suspensie corespund la y g produs analizat. Astfel. După cântărire în condiţii aseptice. omogenizarea și pregătirea extractelor lichide (în cazul produselor solide).MICROBIOLOGIE SPECIALA . tehnica de recoltare ş.se introduc în recipientul de mărunţire o cantitate aproximativă de probă şi se cântăreşte tot ansamblul (tara recipientului fiind cunoscută). 90 ml pentru diluţia 1/10). 3.a. ora. Stabilitatea eșantioanelor Calitatea microbiologică a eşantionului nu trebuie să se modifice în intervalul de timp de la recoltare până în momentul analizei. și anume: numărul lotului. În cazul în care structura produselor este neomogena semisolida sau semilichidă este absolut necesară omogenizarea probelor.TEHNICI DE EȘANTIONARE. se analizează prin metoda tamponului. în cazul produselor dense se procedează în două moduri: . sticle. data. Astfel. iar cele din profunzime se analizează prin recoltare de probe după ce s-a îndepărtat o porţiune de produs de la suprafaţă sau s-a cauterizat suprafaţa cu ajutorul unei spatule încălzite la roşu. Eticheta trebuie să cuprindă toate elementele necesare. direct în sistemul de mărunţire. apoi se adaugă lichidul de diluţie. În ambele cazuri concentraţia suspensiei iniţiale este perfect definită în raport cu produsul de analizat. Pregătirea probelor pentru analiză Prepararea eşantionului presupune deschiderea aseptică a recipientelor închise (produse ambalate. Etichetarea O mare atenţie trebuie să se acorde etichetării eșantioanelor·.se cântăreşte în condiţii aseptice o cantitatea de produs (de exemplu 10g). în paralel cu extracţia microorganismelor în lichidul de diluţie. probele constituite din produse solide sau eterogene sunt omogenizate. Omogenizarea și măcinarea În cazul produselor lichide proba ca atare reprezintă suspensia iniţială . aplicând Pag 4 . locul exact de unde s-a realizat recoltarea. prin stabilirea raportului de diluţie (în general 1:10 sau 1:5) între proba de analizat şi lichidul de extracţie (diluare).

însă asigură obţinerea unui extract clar cerinţă impusă de analizele moderne precum: evaluarea cantitativă a microbiotei prin ATP bioluminiscenţă. volumul recipientului trebuie să fie egal cu aproape de două ori volumul probei plus volumul soluţiei de diluare. În general. apoi se colectează supernatantul într-un vas steril. teste imunologice şi analize PCR (din limba engleză Polymerase Chain Reaction) (Fung 1999).TEHNICI DE EȘANTIONARE. prin intermediul unor palete speciale. Pe parcursul mărunţirii se adaugă 2-5 volume de apă sterilă. la care însă s-a îmbunătăţit tehnica de omogenizare prin vibraţii (fig. Această metodă nu este întotdeauna practică. Tehnicile moderne de omogenizare prevăd utilizarea sistemelor performante. etc. Pungile sterile din material plastic trebuie să aibă o capacitate suficientă pentru a permite amestecarea corectă a probei cu o cantitate echivalentă de lichid de diluare. dar este simplă şi nu necesită aparatură specială. Acest tratament (viteză vibratorie mare) oferă o eliberare a microorganismelor (în general a bacteriilor) în lichidul de diluare similar cu cazul prelucrării probei în stomacher (grad de similaritate a rezultatelor de 96%). g) şi un volum corespunzător de lichid de extracţie (diluţie) sunt introduse într-o pungă de plastic sterilă (de unică folosinţă). care permit menţinerea condiţiilor aseptice şi o bună eliberare a microorganismelor în lichidul de extracţie. Proba se lasă în repaus timp de 5 minute. RECOLTARE SI PREGĂTIRE A PROBELOR diverse tratamente precum: mojarare manuală cu nisip steril sau bile de sticlă sau mărunţire mecanică .1). Sisteme de omogenizarea tip Pulsifier Pentru unt şi margarină protocolul de pregătire a probelor prevede o serie de etape preliminare.MICROBIOLOGIE SPECIALA . Digi-system. Pentru mojararea cu nisip steril sau bile de sticlă se utilizează un mojar care conţine 5-20 g nisip special. steril. 2002): Pag 5 . În cazul utilizării omogenizatorului Stomacher proba de analizat (dimensionată. Waring Biender/ Bioblock-OSI-Prolabo. particulare.5 mm). care funcţionează după un principiu similar cu aparatul tip Stomacher. Ultraturax. Mojararea se realizează manual în apropierea becului Bunsen. a fost realizat un nou aparat. Recent. în concordanţă prevederile impuse de unele normative (adaptare după Tofan şi colab. care se închide ermetic şi se montează în aparat pentru omogenizare. Figura 1. sau bile din sticlă (Φ=0. Pentru acest scop sunt comercializate diferite tipuri de omogenizatoare peristaltice: Stomacker (Stomacker / Seward-Bioblock-OSI-Prolabo).

cu respectarea regulilor generale de analiză. Prin realizarea unui instrument de dispersie (dispersor) este posibil transferul automat şi aseptic a unui volum cunoscut de lichid de diluare pentru realizarea suspensiei iniţiale sau a diluţiilor decimale. Diluantul şi pipetele trebuie să aibă temperatura de 45oC. Separarea fazelor este realizată în final prin centrifugare în condiţii aseptice. În absenţa unor standarde specifice disponibile. şi se termostatează la 45oC până la topire. 2) Se prelevează în condiţii aseptice 2. După omogenizare. Figura 2.1 ml de soluţie Ringer ¼. Sistem automat de realizare a suspensiei iniţiale În general. în care s-a introdus în prealabil aseptic proba de analiză .1% geloză.MICROBIOLOGIE SPECIALA . O altă îmbunătăţire a vizat tehnica de realizare a diluţiilor.TEHNICI DE EȘANTIONARE. cu agitare intermitentă ). cuprinse între 0. care conţine 90 ml soluţie Ringer ¼ cu 0. 1:50.5 g produs.0). direct în pungi sau vase sterile. cu ajutorul unui dispozitiv denumit DILUFLO pot transfera volume variabile de lichid de diluţie. 3) O cantitate de 50 g de probă se suspendă în 42 ml de soluţie 0. pentru stabilizarea emulsiei. Faza apoasă este utilizată pentru analiza microbiologică . sau în cazuri speciale.1 M tampon fosfat (pH=7. Faza apoasă este utilizată pentru examen microbiologic. 2). în funcţie de greutatea probei solide sau volumul probei lichide luate în analiză (fig. Pag 6 . realizând transferul automat a unui volum corespunzător de lichid. Alte diluţii şi analizele microbiologice trebuie realizate în următoarele 10 minute.1 ml şi 100 ml. Se prepară diluţia 1:10 prin prelevarea a 10 ml produs topit şi transferare într-un flacon de 200 ml. RECOLTARE SI PREGĂTIRE A PROBELOR 1) Proba este topită pe baie de apă la 45oC şi omogenizată. 1:100 sau orice raport de diluţie.5–8. Astfel. timp de 1÷10 minute. Instrumentul poate fi programat pentru a realiza diluţii 1:10. metodologia se adaptează la condiţiile specifice din laborator. condiţiile particulare de eşantionare şi pregătire a probelor de analiză sunt precizate în standardele specifice pentru evaluarea calităţii microbiologie a fiecărui produs. amestecul este menţinut pe baie de apă (la 45oC) până la separarea celor două faze. la 2000-3500 rpm. apoi se termostatează la 40…45oC până la topire (timp de maximum 1 h. care sunt apoi transferate într-o eprubetă de analiză conţinând 2.

a mediilor solide. Cu o pipetă sterilă se introduc. mediul utilizat. Mediile se uniformizează rapid în plăci.MICROBIOLOGIE SPECIALA . PARTICULARITĂŢI PRIVIND NUMĂRAREA COLONIILOR După termostatare. pe baza numărului de colonii generate de celulele acestor microorganisme prezente în proba de analizat.METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE DETERMINAREA NUMĂRULUI TOTAL DE BACTERII AEROBE MEZOFILE DEFINIŢII Microorganismele aerobe sunt dependente de oxigenul din aer. Se notează pe capacul plăcilor numele probei. Bacteriile mezofile reprezintă grupul majoritar cu temperaturi minime la 15-20°C. Pentru numărare se poate adopta: Pag 1 . timp de 48 de ore. câte 1 cm2 probă de analizat. după termostatare la 37°C. temperaturi optime în intervalul 30 . Plăcile ce conţin mediul solidificat se plasează cu capacul în jos. în cazul altor produse. care se formează când proba sau o diluţie a acesteia vine în contact cu un mediu nutritiv. temperatura la care se va face termostatarea. prin rotirea plăcilor în plan orizontal. se aleg pentru numărare plăcile care conţin un număr colonii cuprins între 25 şi 250. Se repetă aceste operaţii cu diluţiile următoare. în termostat cu temperatura de 37°C. apoi sunt lăsate în repaus până se produce solidificarea lor. se dezvoltă la suprafaţa lichidelor. Numărul de bacterii aerobe mezofile reprezintă un indicator valoros pentru aprecierea calităţii generale şi a stabilităţii la păstrare a produselor alimentare. 15 cm2 mediu PCA (Plate Count Agar) cu temperatura de 45±5°C. Se realizează apoi prima diluţie decimală a probei de analizat (10-1). MODUL DE LUCRU Se iau două cutii Petri sterile. folosind câte o nouă pipetă sterilă pentru fiecare diluţie decimală. pentru 48 de ore. diluţia inoculată.40°C și maximum la temperaturi peste 45°C PRINCIPIUL DE DETERMINARE A NUMĂRULUI DE BACTERII AEROBE MEZOFILE Numărul de bacterii aerobe mezofile se apreciază indirect. acestea trebuie să fie repartizate pe o suprafaţă mai mare de 25% din suprafaţa totală a mediului de cultură. dacă produsul este lichid sau câte 1 cm2 diluţie iniţială. în fiecare cutie. Se toarnă în fiecare cutie Petri câte cca.

MICROBIOLOGIE SPECIALA .022 [2 + (0. numărare automatizată. cu ajutorul unui numărător electronic (care la atingerea fiecărei colonii o contabilizează în memoria sa). nu se obţin rezultate bune când coloniile au diametru mare şi sunt răspândite pe o suprafaţă mare etc. pentru a evita erorile de numărare. unde x este puterea atribuită numărului 10. 10-2: 232 şi 244 colonii. În acest caz se va număra întregul lanţ ca o singură colonie.METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE numărarea manuală. Rezultatele se exprimă.9)·10x. Exemplu: Dacă la numărare au fost alese câte 2 plăci corespunzătoare diluţiilor a doua şi a treia. Există totuşi şi unele limitări ale acestui procedeu şi anume: pot să apară erori de numărare în cazul prezenţei în mediu a unor impurităţi solide sau bule de gaz. pachete etc. la a doua diluţie reţinută. n1 = numărul de plăci reţinute din prima diluţie. d = factor de diluţie corespunzător primei diluţii Rezultatele se exprimă printr-un număr de forma (1. care aparţin unei singure surse (celule asociate. ufc / g (ml ) = ∑C ( n1 + 0. colonii dezvoltate în filmul de apă de la suprafaţa mediului cu agar.1 ⋅ n 2 ) ⋅ d ∑ C = suma coloniilor numărate în toate plăcile reţinute. n2 = numărul de plăci reţinute din a doua diluţie succesivă.). când se consumă numai 10% din timp. colonii dezvoltate în filmul de apă dintre baza mediului de cultură şi suprafaţa capacului inferior. lanţuri.0 ÷9. astfel: 1) Plăcile din două diluţii succesive conţin 25÷250 colonii pe placă: ufc / g (ml ) = în care: ∑C (n1 + 0.4 ⋅ 10 4 −2 0. La numărare pot fi întâlnite următoarele tipuri de colonii: lanţuri de colonii. iar numărul de colonii din cele 4 plăci reţinute este: la prima diluţie reţinută.1 ⋅ 2)] ⋅ 10 (prin rotunjire la două cifre semnificative*) Pag 2 . în perechi. în unităţi formatoare de colonii (ufc) per gram sau ml produs. după caz. utilizând instrumente speciale de numărare. 10-3: 33 şi 28 colonii.1 ⋅ n2 ) ⋅ d = 232 + 244 + 33 + 28 537 = = 24409 ⇒ 2. comparativ cu numărarea manuală.

intervalele de variaţie a numărului posibil de ufc. Plăcile inoculate în paralel din proba de analizat (d = 1.MICROBIOLOGIE SPECIALA . În practică însă se pot obţine variaţii mai mari ce derivă din condiţiile de analiză aplicate şi experienţa analistului.95. Limite de încredere pentru estimări în cazul unui număr de colonii sub baremul minim Număr de colonii/placă 1 2 3 4 5 6 7 8 Interval posibil de variaţie a ufc <1÷2 <1÷4 <1÷5 1÷6 2÷9 2÷10 2÷12 3÷13 Număr de colonii/placă 9 10 11 12 13 14 15 Interval posibil de variaţie a ufc 4÷14 4÷16 5÷18 6÷19 7÷20 7÷21 8÷23 3) În plăcile inoculate în paralel din proba de analizat (d = 1. Se aplică modul de calcul prezentat mai sus. pentru o abatere medie pătratică r2=0.METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE * Exemplu: ufc calculat 12700 12400 15500 14500 ufc estimat 13000 12000 16000 14000 Prin analiză statistică s-a stabilit că în 95% din cazuri limitele de încredere ale acestei metode variază de ± 12% la ± 37% (pentru numărul total de microorganisme aerobe) şi între ± 16% la ± 52%. pentru plăcile în care se dezvoltă mai puţin de 15 colonii. produse lichide) sau suspensia iniţială (d =10-1. sunt prezentate în tabelul 1. produse solide). produse lichide) sau suspensia iniţială (d =10-1. Tabelul 1. produse solide) nu s-a dezvoltat nici o colonie: ufc/ml < 1 (produse lichide) ufc/g < 1 ·10-1 (produse solide) Pag 3 . 2) Plăcile inoculate din două diluţii succesive conţin mai puţin 25 colonii. conţin mai puţin de 25 colonii: ufc / g (ml ) = ∑C 2⋅d Conform SR ISO 4833.

apoi se raportează la suprafaţa totală a plăcii Petri. 5) Când numărul de colonii pe placă este foarte mare rezoluţia este imposibilă numărarea. se determină media aritmetică. sec tor ⋅ nr. numărarea se poate realiza: pe anumite sectoare delimitate ale suprafeţei plăcii ⇒ n = n delimitate (4. sectoare Pag 4 .METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE 4) Când plăcile conţin mai mult de 250 (sau 300) de colonii. concentraţie de celule mult mai mare decât diluţia estimată. se determină media aritmetică. astfel: când numărul de colonii pe un pătrat este mai mare de 10 se numără la întâmplare coloniile de pe 4 zone reprezentative. 8 sau 16) pe o suprafaţă delimitată (pătrat) de 1 cm2. apoi se raportează la suprafaţa totală a plăcii Petri. când numărul de colonii distribuite pe un pătrat este mai mic decât se numără coloniile de pe 12 pătrăţele reprezentative. 6) Când se produce contaminarea accidentală sau se obţin rezultate neconcludente rezoluţia este analiză efectuată necorespunzător.MICROBIOLOGIE SPECIALA .

Înregistraţi în tabelul de mai jos numărul de colonii/placă (în plăcile selectate pentru numărare) Proba Diluţia 1 2 3 4 Nr. __________ Nume______________________________ Grupa______________________________ Data_______________________________ DETERMINAREA NUMĂRULUI TOTAL DE BACTERII AEROBE MEZOFILE 1.METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE REZULTATE LUCRARE nr. colonii/placă 2. Stabiliţi gradul de contaminare exprimat în unităţi formatoare de colonii (ufc) per gram sau ml produs: Proba 1 _______________ Proba 2 _______________ Proba 3 _______________ Proba 4 _______________ .MICROBIOLOGIE SPECIALA .

1% apa peptonată Cutii Petri Φ10 cm sterile Pipete de 1 cm3 şi 10 cm3 sterile Eprubete cu ser fiziologic steril. numărul de drojdii şi mucegaiuri se apreciază indirect. Mucegaiuri – microorganisme eucariote. câte 9 cm3 per eprubetă Baloane cu ser fiziologic steril Pag 1 . care se reproduc asexuat prin înmugurire sau.MICROBIOLOGIE SPECIALA . Unele drojdii se pot reproduce si sexuat (meioză). prin sciziune. mono sau pluricelulare. Majoritatea drojdiilor sunt saprofite şi multe dintre ele au activitate fermentativă. după termostatare la 25°C timp de 72 de ore. Sunt agenţii mucegăirii. Tipuri de produse alimentare pentru care se recomanda analiza (Anexa 1) PRINCIPIUL METODEI Prin această metodă.METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE DETERMINAREA NUMĂRULUI TOTAL DE DROJDII SI MUCEGAIURI DEFINIŢII Drojdii – microorganisme eucariote. pe baza coloniilor generate de celulele acestor microorganisme prezente în proba de analizat. ECHIPAMENTE Omogenizator Balanţă analitică Termostat reglat la 25°C Baie de apă pentru fluidificarea mediului de cultură reglată la 45°C MATERIALE ŞI STICLĂRIE 25g produs alimentar 225 ml 0. mai rar. care se formează când proba sau o diluţie a acesteia vine în contact cu un mediu nutritiv gelozat. care prezintă organe de reproducere diferenţiate.

peste care se adaugă 225 ml apa peptonată.MICROBIOLOGIE SPECIALA . dacă produsul este lichid sau câte 1 cm2 diluţie iniţială. Se omogenizează timp de 1 min. Se repetă aceste operaţii cu diluţiile următoare. 15 cm2 mediu PCA (Plate Count Agar) cu temperatura de 45±5°C. în cazul altor produse. diluţia inoculată. folosind câte o nouă pipetă sterilă pentru fiecare diluţie decimală (Fig. prin rotirea plăcilor în plan orizontal. apoi sunt lăsate în repaus până se produce solidificarea lor. * Se notează pe capacul plăcilor numele probei. Se realizează apoi prima diluţie decimală a probei de analizat (10-1). Pag 2 .METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE Pungi sterile pentru omogenizarea probelor solide sau semisolide Numărător de colonii Reactivi pentru determinare Mediu de diluare: Soluţie ser fiziologic Mediu de cultură: Anexa 2 DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU Se cântăresc 25 g proba produs alimentar. mediul utilizat. Mediile se uniformizează rapid în plăci. Pentru diluarea probei se aplică schema de diluţie din figura 1. temperatura la care se va face termostatarea. Cu o pipetă sterilă se transferă în fiecare cutie Petri sterila. Figura 1 Schema de lucru pentru realizarea diluţiilor si inocularea probelor *Toate probele se realizează in duplicat.1). câte 1 cm2 probă de analizat. Se toarnă în fiecare cutie Petri câte cca.

se face media aritmetică. n1 – numărul de cutii reţinute dintr-o diluţie n2 – numărul de cutii reţinute din diluţia succesivă d – factorul de diluţie corespunzător primei diluţii din care s-a realizat reţinerea plăcilor. unde x este puterea atribuită lui 10. în care d este factorul de diluţie al diluţiei iniţiale (alte produse).1 ⋅ n 2 ) ⋅ d unde ΣC – suma coloniilor numărate în toate cutiile reţinute. Rezultatele calculate se rotunjesc la două cifre semnificative. pentru 3-5 zile la temperatura de 25-28°C. Dacă cele două cutii Petri . la nivelul probei de analizat (produse lichide) sau al diluţiei iniţiale (alte produse) conţin mai puţin de 15 colonii. rezultatul se exprima sub forma: mai puţin de o ufc de drojdii sau mucegaiuri per ml (produse lichide).MICROBIOLOGIE SPECIALA .9 multiplicat cu 10x.număr de ufc de drojdii şi mucegaiuri estimat per gram NE=m·d-1 (alte produse). a coloniilor numărate în cele două cutii. REZULTATE Se reţin cutiile care conţin 15…300 de colonii. m.0 şi 9. la nivelul probei de analizat (produse lichide) sau al diluţiei iniţiale (alte produse) nu conţin nicio colonie. cu formula următoare: ufc / g (ml ) = ∑C (n1 + 0. Se exprima gradul de contaminare printr-un număr cuprins între 1. mai puţin de 1·d-1 ufc de drojdii sau mucegaiuri pe gram (alte produse) Pag 3 .METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE După solidificarea mediului plăcile se termostatează cu capacul în jos. Rezultatul se exprima sub forma: . Numărul de ufc de drojdii şi mucegaiuri per ml sau gram de produs se calculează ca medie ponderată.număr de ufc de drojdii şi mucegaiuri estimat per ml: NE=m (produse lichide) . Dacă cele două cutii Petri.

4. 1. salate Pag 4 . sosuri.METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE ANEXA 1 GRUPELE PRINCIPALE DE PRODUSE PENTRU CARE SE RECOMANDA ANALIZA Nr. 3.crt. 2. 8. 5. furaje . 6. grăsimi şi seminţe oleaginoase Fructe. 9. 7. şroturi Zahăr şi produse zaharoase Cereale şi produse din cereale Produse de cofetărie şi patiserie Condimente. Grupe de produse Pâine şi produse de panificaţie Produse lactate acide si brânzeturi Carne şi produse din carne Uleiuri. 11. 12.MICROBIOLOGIE SPECIALA . supe. Legume şi produse prelucrate Băuturi alcoolice Băuturi nealcoolice Făinuri proteice. 10.

... 5. 1000ml pH=7.. Tabelul 2....Standard methods agar2)) Triptonă .....1g Pag 5 .MICROBIOLOGIE SPECIALA . cloramfenicol agar ) Extract de drojdie ... 20g Cloramfenicol ........ SMA.0g Extract de drojdie ......... 5g Glucoză ....METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE ANEXA 2 CONDIŢII DE CULTIVARE ŞI COMPOZIŢIA MEDIILOR DE CULTURĂ PENTRU NUMĂRAREA MICROORGANISMELOR Condiţiile particulare de lucru conform prevederilor din normativele româneşti adaptate la condiţiile ISO (SR ISO) sunt prezentate în tabelul 1..0g Apă până la . YGC PCA Drojdii şi mucegaiuri (Extract de drojdie. g·l-1 (engl... 0...5g Glucoză anhidră .. 12........... drojdii şi mucegaiuri) Drojdii şi mucegaiuri Medii de cultură ...OGA (OGYE) 25ºC/5 zile Compoziţia mediilor de cultură recomandate pentru evaluarea diferitelor categorii de microorganisme este prezentată în tabelul 2.. Tabelul 1............... care se dezvoltă la 30ºC (bacterii. Compoziţia mediilor de cultură recomandate pentru determinarea şi confirmarea numărului de unităţi formatoare de colonii Indicator microbiologic Număr total de microorganisme Compoziţie medii de cultură...... 1.0 Agar-agar ..2 Mediul este disponibil comercial... 2. Plate count agar1).........YGC .. Condiţii de cultivare pentru numărarea microorganismelor impuse de normativele ISO Grup de microorganisme Număr total de microorganisme aerobe.. glucoză.....0-18.....PCA Condiţii de termostatare Temperatură/timp 30ºC/72h ± 3h .

........ 15g Apă până la ..... 1000 ml pH=6................. 1000 ml Pag 6 .......... 5g Glucoză ...... 12…18g Apă până la .... 20g Agar-agar ...... Geloză nutritivă (geloză alba) Agar-agar .......6 OGA (OGYE) (Oxitetraciclina glucoză agar) Extract de drojdie .......................MICROBIOLOGIE SPECIALA . 16g Apă până la ....... în mediul fluidificat se adaugă 100 ml soluţie 1mg/ml oxitetraciclină.........METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE Agar-agar ....2 În momentul utilizării...................... 1000ml pH=7..............

Stabiliţi gradul de contaminare exprimat în unităţi formatoare de colonii (ufc) per gram sau ml produs Proba 1 _______________ Proba 2 _______________ Proba 3 _______________ . Înregistraţi în tabelul de mai jos numărul de colonii/placă (în plăcile selectate pentru numărare) Proba Diluţia 1 2 3 Nr.METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE REZULTATE LUCRARE __________ Nume______________________________ Grupa______________________________ Data_______________________________ DETERMINAREA NUMĂRULUI TOTAL DE DROJDII ŞI MUCEGAIURI 1.MICROBIOLOGIE SPECIALA . colonii/placă 2.

Reactivi si medii de cultura: mediu de diluare (apă peptonată). Bacteriile sporulate anaerobe sunt bacterii care aparţin genului Clostridium. cultivarea realizându-se in condiţii particulare in condiţii aerobe sau anaerobe. Numărător de colonii 7. medii de cultură: (Anexa 2). cu capetele drepte sau rotunjite. sunt sferici sau ovali. mobile. DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU Testul se efectuează în conformitate cu instrucţiunile de mai jos: Pag 1 .MICROBIOLOGIE SPECIALA . care dau celulelor forma de suveică sau paleta.METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE DETERMINAREA BACTERIILOR SPORULATE AEROBE ŞI ANAEROBE DEFINIŢII Bacteriile sporulate aerobe sunt bacterii care aparţin genului Bacillus. 4. singulare sau asociate in unghiuri (Bacillus subtilis) sau lanţuri. cu dimensiuni diferite. cu celule de forma cilindrica cu dimensiuni mai mari decât cele din genul Bacillus. apoi se răceşte si se inoculează in medii specifice. Proba de analizat sau diluţii succesive se supun pasteurizării la 80°C timp de 10 minute. singure sau in lanţuri. PRINCIPIUL METODEI Determinarea microorganismelor sporulate aerobe şi anaerobe estimează numărul microorganisme in stare sporulata prezente per g sau ml de produs. Sunt bacterii Gram+. fiind poziţionaţi central sau terminal. Baie de apă reglabilă la 45°C şi la 80°C 2. Tipurile de produse alimentare pentru care se recomandă analiza sunt prezentate în Anexa 1. 3. cu celule de forma cilindrica. MATERIALE ŞI ECHIPAMENTE SPECIALE 1. Sunt bacterii Gram+. Termostat reglabil la 37°C 5. pentru a distruge toate formele vegetative . Sporii nu se colorează prin colorare Gram. Plăci Petri. Stomacher pH-metru. mobile. cu diametru mai mic sau egal decât al celulei. care formează endospori dispuşi central sau terminal. Anaerostat sau Recipient pentru cultivare in anaerobioza 6..

prin rotirea plăcilor în plan orizontal. Pentru bacteriile aerobe sporulate.10-2. diluţia şi data termostatării.MICROBIOLOGIE SPECIALA . fie congelate. cu excepţia produselor alimentare care nu necesită condiţii speciale de depozitare. Se temperează mediul de cultură într-o baie de apă la temperatura de 45°C. se pipetează 20-25 ml din diluţia 10-1 într-o eprubetă sterilă.5 min. Mediile se uniformizează rapid. în cazul produsele alimentare care au tendinţa de a spuma. După solidificarea mediului plăcile se termostatează cu capacul în jos. probele se păstrează fie la frigider la temperatura de 0-5°C. Pentru fiecare probă de analizat. Se marchează în mod clar plăcile Petri cu numărul probei. si se menţin timp de 20 de minute. în scopul prevenirii supraîncălzirii. prin suspensionare a de 10g (ml) produs în 90 ml apă peptonată. Se plasează eprubetele în baia de apă la 80°C. printr-un arc de 30 cm. în aproximativ 7 sec). Se toarnă în fiecare placă Petri câte cca. Pag 2 .5oC timp de 48 ± 2 ore. este indicată agitarea moderata. Prepararea mediilor de cultură Se pregăteşte mediul Trypticase Soy Agar în cantităţi corespunzătoare şi se sterilizează. şi 10-3). diluţiile se omogenizează prin menţinere pe vortex ( de 25 de ori. După răcire se prepară diluţii (diluţii recomandate sunt de 10-1. în funcţie de natura produsului. asigurându-se că nivelul apei este de 1 cm peste nivelul de mediu din eprubete. apoi sunt lăsate în repaus până se produce solidificarea. Se curăţă zona de lucru cu un dezinfectant adecvat. 15 ml mediu de cultură cu temperatura de 45±5°C. câte 1 ml probă de analizat. înainte de analiză. plăcile se termostatează la 35oC ± 0.METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE Manipularea eşantioanelor În laborator. Inocularea si termostatarea probelor Cu o pipetă sterilă se transferă în fiecare placă Petri sterilă. Pregătirea diluţiilor Se prepară un raport de diluţie de 1:10 a produsului alimentar. Probele se omogenizează: timpul de amestecare nu trebuie să depăşească 2.

5oC timp de 48 ± 2 ore. n1 = numărul de plăci reţinute din prima diluţie.METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE Pentru bacteriile anaerobe sporulate. Pag 3 . Dacă este posibil.MICROBIOLOGIE SPECIALA . într-un sistem anaerob de cultivare cum ar fi sistemul BBL Gaspack (Anexa 3). unde x este puterea atribuită numărului 10. d = factor de diluţie corespunzător primei diluţii Rezultatele se exprimă printr-un număr de forma (1. Numărarea coloniilor Coloniile se numără imediat după perioada de termostatare.0 ÷9. plăcile se termostatează 35oC ± 0.1 ⋅ n 2 ) ⋅ d ∑ C = suma coloniilor numărate în toate plăcile reţinute. REZULTATE Numărul de bacterii formatoare de spori per ml sau gram de produs se calculează cu următoarea formula: Plăcile din două diluţii succesive conţin 25÷250 colonii pe placă: ufc / g (ml ) = în care: ∑C (n1 + 0.9)·10x. se selectează plăcile cu 20-200 colonii. n2 = numărul de plăci reţinute din a doua diluţie succesivă.

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

PROCEDURI PARTICULARE DE ANALIZA PENTRU ANUMITE GRUPE DE PRODUSE ALIMENTARE

Bacterii sporulate aerobe mezofile din zahăr Din proba de analizat se executa in condiţii aseptice diluţia 1/5 prin cântărire a 20g zahăr şi dizolvarea în 80 ml apă sterilă. Pentru inactivarea termică a formelor vegetative se face pasteurizarea prin menţinerea diluţiei 1/5 pe baie de apă la 80°C, timp de 20 minute şi răcire în jet de apă rece. Din proba pasteurizată si răcită, cu o pipetă sterilă se transferă în fiecare placă Petri sterilă, câte 1 ml probă de analizat. Se toarnă în fiecare placă Petri câte cca. 15 ml mediu de cultură cu temperatura de 45±5°C. Plăcile se termostatează la 32oC ± 1oC timp de 48 ± 3 ore. Numărul de bacterii sporulate aerobe mezofile se raportează la 10 g zahăr. Bacterii anaerobe sporulate din lapte Se execută prin metoda Weinyirl în probe de lapte destinat fabricării brânzeturilor. În 5 eprubete sterile ce conţin parafină (cca. 1ml in stare fluida) se introduc câte 5 ml proba de analizat (lapte destinat fabricării brânzeturilor). După pasteurizare (menţinere 10 minute la 80°C) şi termostatare 48 ore la 24-48°C se apreciază eprubetele pozitive, în care s-a produs deplasarea dopului de parafină. Interpretarea rezultatelor Lapte calitate buna - Toate eprubetele sunt negative Lapte calitate satisfăcătoare – 1 eprubeta pozitiva din 5 Lapte de calitate nesatisfăcătoare – 2 până la 5 eprubete pozitive.

Pag 4

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

ANEXA 1

GRUPELE PRINCIPALE DE PRODUSE PENTRU CARE SE RECOMANDA ANALIZA

Nr.crt. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Grupe de produse

Făinuri Lapte Produse lactate acide şi brânzeturi Carne şi produse din carne Conserve alimentare Zahăr şi produse zaharoase Produse deshidratate Condimente şi plante aromate

Pag 5

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

ANEXA 2
CONDIŢII DE CULTIVARE ŞI COMPOZIŢIA MEDIILOR DE CULTURĂ PENTRU NUMĂRAREA MICROORGANISMELOR

Compoziţia mediilor de cultură recomandate pentru evaluarea diferitelor categorii de microorganisme este prezentată în tabelul 2.

Tabelul 2. Compoziţia mediilor de cultură recomandate pentru determinarea şi confirmarea numărului de unităţi formatoare de colonii Indicator microbiologic Bacterii sporulate aerobe Compoziţie medii de cultură, g/l BD Trypticase Soy Agar Extract pancreatic de cazeină….15,0 g Clorură de sodiu …………5,0 Extract papaic de soia …………..5,0 Agar ………………….15,0 pH 7,3 ± 0,2*Ajustată şi/sau completată în funcţie de necesităţi pentru a corespunde criteriilor de performanţă. MYP Mediu de bază ................. 90 ml Soluţie polimixină B ......... 1,0ml Emulsie de gălbenuş de ou10,0ml Se lichefiază mediul de bază, se temperează la 50ºC, apoi se adaugă aseptic celelalte componente. Mediul de bază Soluţie de polimixină B Extract de carne ..................1,0g Sulfat de polimixină B ...... 106 UI Peptonă ............................10,0g Apă până la .....................100 ml D-manitol ..........................10,0g Clorură de sodiu ..............10,0g Roşu de fenol ................. 0,025g Agar-agar .................. 12g-18g 3) Apă până la ................... 900 ml pH=7,2, la 25ºC Agar glucozat Triptonă ............................10,0g Purpur de bromcrezol .... 0,015g Extract de drojdie ...............1,5g Agar-agar ................... 12g-18g 3) Glucoză .............................10,0g Apă până la .................. 1000 ml Clorură de sodiu .................5,0g pH=7,0 (la 25ºC, după sterilizare) Mediul Voges-Proskauer (VP) Peptonă ..............................7,0g K2HPO4................................ 5,0g Glucoză ...............................5,0g Apă până la .................. 1000 ml Clorură de sodiu .................5,0g pH=7,0 (la 25ºC, după sterilizare) Mediul cu nitrat Peptonă ..............................5,0g Apă până la .................. 1000 ml Extract de carne ..................3,0g pH=7,0 (la 25ºC, după sterilizare) Azotat de potasiu................1,0g

Bacillus cereus

Pag 6

Sistemele GasPak sunt sisteme utilizate pentru crearea atmosferei controlate (anaerobioza. Pag 7 . Sisteme anaerobioza (GASPACK) Containerele sunt rezistente la şocuri si sistemul perfect de etanşeizare transforma sistemele GasPak EZ in condiţii ideale de stocare si transport. bazata pe un sistem rectangular de termostatare. 2. asigurând astfel o vizibilitate perfecta a coloniilor bacteriene.METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE ANEXA 3 SISTEME DE CULTIVARE IN ANAEROBIOZA 1. etanşeizare uşoară si rezistenţă la şocuri. microaerofilie. Noua tehnologie. minimizează riscul apariţiei condensului. Anaerostate sunt sisteme din care oxigenul a fost îndepărtat sau înlocuit cu un amestec controlat de alte gaze. Figura a. îmbogăţita in CO2). Structura sistemului anaerob si indicatorii CO2 asigura metoda optima de obţinere a condiţiilor anaerobe.MICROBIOLOGIE SPECIALA .

METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE REZULTATE LUCRARE __________ Nume______________________________ Grupa______________________________ Data_______________________________ DETERMINAREA BACTERIILOR SPORULATE AEROBE ŞI ANAEROBE 1. colonii/placă Stabiliţi gradul de contaminare exprimat in unităţi formatoare de colonii (ufc) per gram sau ml produs Proba 1 _______________ 2. Înregistraţi in tabelul de mai jos numărul de colonii/placă (în plăcile selectate pentru numărare) Proba Diluţia 1 Nr. Înregistraţi in tabelul de mai jos eprubete pozitive şi negative. stabilind in funcţie de rezultatele obţinute calitatea probei analizate Proba 1 1 2 Eprubetele testate 3 4 5 Proba 1 _______________ .MICROBIOLOGIE SPECIALA .

Aceasta reprezintă diluţia iniţială 1:5 (proba martor). obţinând diluţia întâi. 1. Tipuri de produse alimentare pentru care se recomanda analiza: zahăr şi produse derivate. Mediul de diluare:zaharoză sau NaCl 400 g. Pag 1 . sau o diluţie a acesteia.MICROBIOLOGIE SPECIALA . numărul de microorganisme osmofile se apreciază prin examen cultural indirect. proba este astfel diluata cu un factor de diluare de 25. prin cultivare pe medii specifice solidificate. produse conservate prin adaos de zahar. din care se obţin alte diluţii decimale prin diluare succesiva.METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE DETERMINAREA MICROORGANISMELOR OSMOFILE PRINCIPIUL METODEI Drojdiile. Pentru drojdii şi mucegaiuri: mediu hiperglucidic 2. amestecuri de sărare. Plate Count Agar 23. mucegaiurile şi bacteriile osmofile sunt microorganisme capabile să se crească într-un mediu cu concentraţii ridicate de zahăr sau sare producând alterări care conduc la modificarea calităţii senzoriale şi a valorii nutritive a alimentelor (Anexa 1). pe baza coloniilor formate microorganismele prezente în proba de analizat. DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU Pentru obţinerea diluţiilor decimale pot fi folosite două tehnici pentru orice tip de probă luată în analiză. apă distilată 1000 ml. după termostatare optimă. MATERIALE ŞI ECHIPAMENTE 1. Numărul de diluţii depinde de calitatea microbiologica a probei luate in analiza. apă distilată. Mediu de baza (Anexa 2): • • Pentru bacterii: dextroză. 110 g. Se cântăresc in condiţii aseptice 10 g probă de analiza şi se transfera în 90 ml mediu de diluare.000 ml. lapte condensat.5 g. Prin această metodă. prin transferul a 20g probă în 80 ml mediu de diluare. Se transferă aseptic 20 ml din proba martor în 80 ml mediu de diluare. suplimentate cu 10% zahar sau sare. saramuri şi produse conservate prin sărare. şi anume: Din proba de analizat se executa in condiţii aseptice diluţia 1/5.

Se reţin plăcile care conţin 25…250 de colonii. prin rotirea plăcilor în plan orizontal. După solidificarea mediului plăcile se termostatează cu capacul în jos in următoarele condiţii: A. Se înregistrează numărul de drojdii/mucegaiuri per ml sau gram de produs REZULTATE Numărul de microorganisme osmofile per ml sau gram de produs se calculează cu următoarea formula: ufc/g(ml) = n·d unde n este numărul mediu de colonii/placă d este factorul de diluţie. Bacterii osmofile Plăcile Petri se termostatează la 35-37°C timp de 48 ± 3 ore (2 zile). apoi sunt lăsate în repaus până se produce solidificarea lor1. B. realizându-se media aritmetică a plăcilor realizate în dublu exemplar şi se stabileşte numărul de unităţi formatoare de colonii per ml sau gram de produs. Drojdii şi mucegaiuri osmofile Plăcile Petri se termostatează la 25-30°C timp de 72 h (3 zile). 15ml mediu de cultură fluidificat şi temperat la temperatura de 45±5°C. se extinde perioada de termostatare la 96-120 h (4-5 zile).MICROBIOLOGIE SPECIALA . 1 Pag 2 . mediul de cultura. Se aplica aceeaşi formula de calcul ca şi la bacterii aerobe mezofile sau drojdii şi mucegaiuri Pe capacul plăcilor Petri se notează: denumirea şi numărul probei. câte 1ml probă de analizat. Daca coloniile formate sunt de dimensiuni mici. Se repartizează în fiecare cutie Petri câte cca. Mediile se uniformizează rapid în plăci. temperatura la care se realizează termostatarea.METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE Cu o pipetă sterilă se transferă în 2 placi Petri in paralel. realizându-se media aritmetică a plăcilor realizate în dublu exemplar şi se stabileşte numărul de unităţi formatoare de colonii per ml sau gram de produs. Se numără colonii formate. diluţia din care se realizează inocularea. Se numără colonii formate.

salinarium. H.MICROBIOLOGIE SPECIALA .62 0.80 0.90 0. morrhnae) Genul Hallococcus Pag 3 .METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE ANEXA 1 MICROORGANISME OSMOFILE CONTAMINATE ALE PRODUSELOR ALIMENTARE Microorganism Drojdii Saccharomyces rouxii Saccharomyces bailii Saccharomyces cerevisiae Debaryomyces aW min 0.83 Bacterii Genul Hallobacterium (H.

. g·l-1 Triptonă ..0 Agar-agar . 1000ml Pag 4 .. Compoziţia mediilor de cultură recomandate Mediu de cultura/Denumire PCA (engl.................METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE ANEXA 2 COMPOZIŢIA MEDIILOR DE CULTURĂ Tabelul 1....0 g Uree ...0-18. 5..........1.................0-18................MICROBIOLOGIE SPECIALA .....5g Glucoză anhidră ..0g Extract de drojdie ...........200............ 12. Plate Count agar) Compoziţie medii de cultură............................0g Apă până la ...... 1000ml pH=7............ 1....... Mediu hiperglucidic Extract de drojdie . 2...0 g Agar-agar ....... 10g Glucoză ..... 12....0g Apă până la .2 Mediul este disponibil comercial....

colonii/placă 2.METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE REZULTATE LUCRARE __________ Nume______________________________ Grupa______________________________ Data_______________________________ DETERMINAREA MICROORGANISMELOR OSMOFILE 1.MICROBIOLOGIE SPECIALA . Înregistraţi în tabelul de mai jos numărul de colonii/placă (în plăcile selectate pentru numărare) Proba Diluţia 1 2 Nr. Stabiliţi gradul de contaminare exprimat în unităţi formatoare de colonii (ufc) per gram sau ml produs: Proba 1 _______________ Proba 2 _______________ .

Evidenţierea hidrolizei substratului de natură proteică. Evidenţierea produşilor finali ai hidrolizei proteinelor prin realizarea de teste biochimice reunite in testul HIL (H .evidenţierea producerii de indol. I . brânzeturile.METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE DETERMINAREA BACTERIILOR DE PUTREFACŢIE PRINCIPIUL METODEI Bacteriile de putrefacţie sunt microorganisme care produc hidroliza proteinelor de origine animală până la produşi simpli. NH3. preparatele din carne sau peşte. Enterobacter. acetat de plumb. Determinarea lor are la bază două principii: I. Bacillus. gaze. astfel se determină bacteriile cazeinolitice (produc hidroliza cazeinei). Mediul de diluare: apă peptonată. Proteus. Escherichia.evidenţierea producerii de hidrogen sulfurat. 1 Anexa 1 Pag 1 . a.MICROBIOLOGIE SPECIALA . Clostridium etc. peste care se adaugă 90 ml apă peptonată. DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU Se pregăteşte suspensia iniţială prin cântărirea a 10 g probă. L. Prin tehnica culturală Koch se fac inoculări in mediu PCA suplimentat cu 1% cazeină sau 10% lapte. 2. amine biogene. compuşi indolici. Reactivi pentru testele biochimice: reactiv Erlich sau Kovacs. MATERIALE ŞI ECHIPAMENTE1 1. Bacteriile de putrefacţie aparţin următoarelor genuri: Pseudomonas. Se omogenizează timp de 1 min. Primele semne ale alterării prin putrefacţie sunt formarea de mucus. II.capacitatea de a lichefia gelatina) Tipuri de produse alimentare pentru care se recomanda analiza sunt: carnea. 3. determinarea bacteriilor cazeinolitice Se realizează diluţii decimale. Mediul de baza:Plate Count Agar cu 1% cazeină sau 10% lapte. H2S. apariţia mirosului neplăcut şi modificarea gustului.

Se plasează deasupra lichidului o hârtie sterilă îmbibată în acetat de plumb.METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE Mediile se uniformizează rapid în plăci Petri sterile. care indică prezenţa indolului. apoi se adăugă 1 ml reactiv Kovacs sau Erlich. Se termostatează la temperatura de 20˚C. Proba este pozitivă dacă hârtia se înnegreşte. REZULTATE Stabilirea numărului de bacterii cu activitate cazeinolitică se aplica aceeaşi formula de calcul utilizata pentru stabilirea numărului de unitatea formatoare de colonii (metoda indirecta de numărare) 2 Se notează pe capacul plăcilor numele probei. timp de 7 zile3. apoi sunt lăsate în repaus până se produce solidificarea lor2. diluţia inoculată. Testul L– evidenţiază bacteriile care lichefiază gelatina Se recoltează cu ansa celule din suspensia iniţială şi se înţeapă un tub de gelatină într-o eprubetă sterila. Proba este pozitivă dacă se produce lichefierea parţială sau totală a tubului de gelatină. temperatura la care se va face termostatarea. După solidificarea mediului plăcile se termostatează cu capacul în jos. timp de 48h. timp de 48h. prin rotirea plăcilor în plan orizontal. prin reacţia dintre acetatul de plumb si H2S care se degaja. timp de 48h. probele se menţin timp de 30 min la frigider Pag 2 . 3Înainte de analiza. determinarea produşilor finali ai hidrolizei proteinelor . mediul utilizat. Testul I – evidenţiază prezenţa indolului Se transferă 1ml suspensie iniţială într-o eprubetă cu 9 ml apă peptonată sterilă. Aceasta deoarece. bacteriile cazeinolitice produc enzime proteolitice extracelulare care difuzează în exteriorul coloniilor şi hidrolizează cazeina.MICROBIOLOGIE SPECIALA . b. ca urmare a formarii de sulfura de plumb. la temperatura de 37°C. Proba se termostatează la temperatura de 37˚C. Bacteriile care prezintă capacitatea de a hidroliza cazeina vor prezenta în jurul coloniilor o zonă clară incoloră comparativ cu restul mediului care este opac. Proba se termostatează la temperatura de 37˚C.testul HIL Testul H – evidenţiază prezenţa hidrogenului sulfurat. rezultat din proteoliza proteinelor Se transferă 1ml suspensie iniţială într-o eprubetă cu 9 ml apă peptonată sterilă. Proba se consideră pozitivă prin apariţia unui inel de culoare roşie la interfaţa mediu-reactiv.

Compoziţia mediilor de cultură recomandate Mediu de cultura/Denumire PCA (engl.. 10....... 12... 10.... 1000ml pH=7..0 Agar-agar ........... 1000ml Soluţie de acetat de plumb Acetat de plumb .. 100ml Reactiv Kovacs p dimetilnanobenzaldehida…………... 2. 5.0-18. Compoziţia soluţiilor si a reactivilor utilizaţi Reactiv .....0ml Alcool amilic până la ………………………....10.....2 Mediul este disponibil comercial..................... Tabelul 2...0g Extract de drojdie ... Plate count agar) Compoziţie medii de cultură..METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE ANEXA 1 COMPOZIŢIA MEDIILOR DE CULTURĂ SI A REACTIVILOR UTILIZATI Tabelul 1..0g Apă până la ..0g HCl………………………………………………….........0g Apă până la .........100ml Pag 3 .......... 1.................MICROBIOLOGIE SPECIALA ..............5g Glucoză anhidră .Soluţie/Denumire Apă peptonată Compoziţie medii de cultură.. g·l-1 Triptonă .0g Apă până la . g·l-1 Peptonă .......25........

prin aplicarea testului HIL Proba Testul H 1 2 Testul HIL Testul I Testul L Proba 1 _______________ Proba 2 _______________ . colonii/placă Stabiliţi gradul de contaminare exprimat in unităţi formatoare de colonii (ufc) per gram sau ml produs Proba 1 _______________ Proba 2 _______________ 2.METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE REZULTATE LUCRARE __________ Nume______________________________ Grupa______________________________ Data_______________________________ DETERMINAREA BACTERIILOR DE PUTREFACŢIE 1. Înregistraţi in tabelul de mai jos probele pozitive şi negative. Înregistraţi în tabelul de mai jos numărul de colonii/placă (în plăcile selectate pentru numărare) Proba Diluţia 1 2 Nr.MICROBIOLOGIE SPECIALA .

se transferă 20 ml lapte într-o eprubeta sterilă peste care se adaugă 1 ml soluţie de albastru de metilen. diluţie 1/10. Indicatorii redox au in forma oxidata culoare albastru (in cazul albastrului de metilen) si albastru violet (in cazul resazurinei). parametrii in funcţie de care se poate aprecia gradul de contaminare si calitatea microbiologica a produsului. in cazul utilizării albastrului de metilen.MICROBIOLOGIE SPECIALA . 120. In funcţie de tipul indicatorului si concentraţia acestuia variază durata analizei si culoarea probei. CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR PROBA REDUCTAZEI PRINCIPIUL METODEI Proba reductazei este o metodă indirectă de apreciere a numărului de microorganisme vii dintr-un produs. Resazurina îşi schimbă culoarea de la albastru la violet spre roz şi apoi incolor. Pag 1 . apoi proba se termostatează la temperatura de 38-40°C. Eprubeta se menţine în baie de apa termostatată la temperatura de 38-40°C. Există şi varianta rapida a acestei metode când se utilizează aceeaşi tehnică de lucru utilizând următoarele cantităţi: 10 ml lapte şi 1 ml soluţie albastru de metilen.05%. Soluţie de resazurină 0. sub acţiunea enzimelor din categoria reductaze sintetizate de celulele vii prezente în produs. MATERIALE ŞI ECHIPAMENTE 1. in funcţie de corelaţia dintre gradul de contaminare si durata în care se produce modificarea culorii unor indicatori redox (albastru de metilen şi resazurina). urmărindu-se modificarea culorii in intervalul 20 şi 60 minute. 330 minute. Se fac notaţii asupra modificării culorii la intervale de 20. Proba reductazei cu resazurina În eprubete sterile se transfera 10 ml lapte de analizat peste care se adaugă 1 ml soluţie de resazurina 0.METODE RAPIDE. Analiza se pretează cel mai bine pentru evaluarea calităţii microbiologice a laptelui materie prima.05% DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU a. 60. Soluţie de albastru de metilen 1% 2. 180. proba are culoarea albastru care in timp se transforma in incolor. b. iniţial. iar prin reducere (in prezenta reductazelor) se transforma in leucoderivaţi incolori. Astfel. Proba reductazei cu albastru de metilen Pentru analiza laptelui. astfel încât nivelul apei să fie superior probei.

4·10 6 Satisfăcătoare 6 4·10 – 20·10 20·10 6 Slaba Foarte slaba b. streptococii şi bacteriile coliforme.METODE RAPIDE.MICROBIOLOGIE SPECIALA . Tabelul 2 Aprecierea numărului de bacterii din proba de lapte Timp de modificare a culorii După 1h După 1h După 1h După 20 min. Proba reductazei cu albastru de metilen Aprecierea calităţii laptelui se face in conformitate cu specificaţiile din tabelul 1. Dacă probele se menţin la temperatura de 22°C la reducere participă şi bacterii din genurile Achromobacter. Se apreciază că la temperaturi de 38-40°C. Aprecierea calităţii laptelui în proba reductazică cu albastru de metilen Durata decolorării probei. Tabelul 1.4·10 6 6 Satisfăcătoare 6 4·10 – 20·10 20·10 6 Slaba Foarte slaba Pag 2 . Culoare proba Albastru Albastru violet Roşu-alb Alb Număr de bacterii per ml 5·10 5 5 Calitatea laptelui Buna Categoria I II III IV 5·10 . Bacillus. CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR REZULTATE a. minute Metoda clasica 330 120-330 20-120 20 Metoda rapida 180 60-180 8-60 8 5·10 5 5 Număr bacterii per ml Calitatea laptelui Categoria Buna 6 I II III IV 5·10 . Enterococcus. Proba cu resazurina In proba cu resazurina aprecierea calităţii laptelui si a gradului de contaminare se face realizează in conformitate cu datele înscrise în tabelul 2. o capacitatea reductazică superioară o au lactobacilii.

MICROBIOLOGIE SPECIALA . Înregistraţi în tabelele de mai jos variaţia culorii probelor analizate.METODE RAPIDE. 2. Proba reductazei cu resazurină Timp de modificare a culorii Culoare proba Număr bacterii per ml Calitatea laptelui . stabilind în funcţie de rezultatele obţinute calitatea acestora 1. PROBA 1. PROBA 1. CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR REZULTATE LUCRARE __________ Nume______________________________ Grupa______________________________ Data_______________________________ PROBA REDUCTAZEI 1. 2.2. Proba reductazei cu albastru de metilen Durata decolorării probei. minute Metoda rapida Număr bacterii per ml Calitatea laptelui 1.1.

1999). fără ca acesta să stagneze. creşterea numărului de probe analizate. Se ridică filmul superior. punctele critice de control). Pag 1 . ceea ce impune analiza unui număr mare de probe. conform metodologiei clasice.METODE RAPIDE. până la o concentraţie de celule de aproximativ 104 celule per ml. deshidratat. Practica a demonstrat că Petrifilmele constituie sisteme eficiente de analiză microbiologică. Petrifilmele au fost concepute în vederea satisfacerii conceptelor sistemului HACCP (analiza hazardului. asigurarea inocuităţii alimentelor şi îmbunătăţirea substanţială a productivităţii (Jordano şi Medina. obiective ce nu pot fi realizate prin aplicarea metodelor clasice de control microbiologic (Bahrim. lichidul hidratează mediul şi prin termostatare este posibilă dezvoltarea microorganismelor. pe tot parcursul procesului de producţie. Tehnica de utilizare a Petrifilmelor în analiza microbiologică este extrem de simplă şi presupune parcurgerea următoarelor etape: Se pregăteşte proba. Petrifilms). şi se diluează prin tehnica diluţiilor decimale. aplicabile mai ales pentru evaluarea calităţii materiilor prime şi controlul în punctele critice pe parcursul procesării acestora.MICROBIOLOGIE SPECIALA . dar uşor rehidratabil este fixat sub forma unui film (cu diametru şi grosime variabilă) pe un suport din carton plastifiat şi acoperit cu o folie din plastic. care se regăsesc în reducerea timpului de analiză. reducerea costului analizei per probă. cu obţinerea unor rezultate prompte şi în scurt timp. oferind numeroase avantaje. denumite Petrifilme (în limba engleză. 2003). CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR METODE BAZATE PE UTILIZAREA PETRIFILMELOR Metodele culturale sunt în prezent mult simplificate prin utilizarea unor sisteme comerciale. care prevăd aplicarea unor măsuri corective. un mediu selectiv). Prin inocularea suspensiei de celule. în care mediul de cultură specific (în general.

Cu ajutorul dispozitivului de răspândire se presează uşor deasupra zonei inoculate pentru distribuţia uniformă a celulelor din suspensie pe toată suprafaţa circulară a mediului de cultură. Se îndepărtează dispozitivul de răspândire şi se aşteaptă un minut pentru solidificarea mediului. Pag 2 .METODE RAPIDE. CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR Se inoculează 1 ml suspensie dintr-o diluţie corespunzătoare în centrul Petrifilmului aşezat pe un suport special. Se eliberează filmul superior. Se termostatează (pachete de până la 20 Petrifilme) în condiţii optime. care se lasă să cadă liber.MICROBIOLOGIE SPECIALA . în funcţie de recomandările din instrucţiunile de utilizare a Petrifilmului. specifice pentru dezvoltarea microorganismelor analizate.

CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR Se realizează numărarea coloniilor (pragul optim de detecţie 25-250 colonii/petrifilm). a pastelor făinoase. faptul ca pe suportul pentru mediu este imprimat un caroiaj care împarte suprafaţa mediului în pătrate cu suprafaţa de 1cm2. inclusiv în industria de panificaţie pentru analiza făinii. uşurează mult numărarea. a cerealelor şi a cerealelor pentru micul dejun. În tabelul 1 sunt prezentate tipurile de Petrifilme comerciale.METODE RAPIDE. similar cu metodele clasice. Se calculează ufc/g (ml). existente pe piaţă şi principalele lor caracteristici.MICROBIOLOGIE SPECIALA . Pag 3 . Eficienţa oferită de utilizarea Petrifilmelor a condus la extinderea utilizării acestora pentru evaluarea calităţii microbiologice a numeroase alimente.

• conţine indicator β-glucuronidază pentru evidenţierea selectivă a tulpinilor de E. Tipuri de Petrifilme comerciale (Bahrim. • analiza este înlesnită de prezenţa unui indicator ce colorează coloniile în roşu. CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR Tabelul 1.. • evidenţierea coliformilor totali. coli) Escherichia coli 48 ± 2 ore. • dezvoltarea rapidă a bacteriilor coliforme. ce facilitează developarea unei zone de culoare roz (reacţie DN-ază pozitivă). cu apariţia specifică a bulelor de gaz în jurul coloniilor. • filmul superior reţine gazele rezultate prin fermentaţia substratului lactoză. care conţine albastru-toluidină-O. • • Particularităţi PYM (Petrifilm yeast/mould) PAC (Petrifilm aerobic count) PCC (Petrifilm coliforms count) determinarea numărului total de drojdii şi mucegaiuri. cu ajutorul discului. 35 ± 1ºC sau 24 ± 2 ore. • evidenţierea serotipurilor E. ce virează în galben în mediu acid. • evaluare similară ca şi în cazul utilizării Petrifilmelor tip PCC. • două teste în unul singur: evaluarea cantitativă a coliformilor fecali şi a lui E. 42 ± 1ºC 24 ± 2 ore. • evidenţierea bacteriilor coliforme la diluţii mari în probele de analizat (1-2 celule g-1). • rezultate test prezumtiv în 6-14 h. • evidenţierea selectivă a tulpinilor de Staphylococcus aureus prin formarea de colonii de culoare roşu-violet. 35 ± 1ºC PEC (Petrifilm E. 2003b)1 Tip Petrifilm Grup de microorganisme analizate Drojdii şi mucegaiuri Bacterii mezofile aerobe Condiţii de termostatare 72-120 25ºC ore. în jurul coloniilor specifice.35ºC ore. sau diluţii ale acesteia. 35 ± 1ºC sau 24 ± 2 ore.. 37 ± 15ºC • determinarea numărului total de bacterii aerobe. • permite inocularea a 5 ml probă. • se bazează pe utilizarea membranei active ELISA. P 2000 CC (Petrifilm rapid coliforms count) Bacterii coliforme 24 ± 2 ore. coli. nu necesită adăugarea de antibiotice sau acid tartric. coli. • analiza este eficientă prin prezenţa unui indicator care colorează coloniile în roşu.48 ore. 42 ± 1ºC 48 ± 2 ore. • reducerea timpului de analiză prin asigurarea unei creşteri accelerate. • confirmarea prezenţei lui Staphylococcus aureus. • înaltă selectivitate.MICROBIOLOGIE SPECIALA . • evidenţierea formării de gaz prin fermentaţia heterolactică a lactozei. 1 |Anexa 1 Pag 4 . • rezultate pozitive în 24 . chiar de la începutul formării coloniilor. • evidenţierea bacteriilor din familia Enterobacteriaceae. iar după 18 ore de termostatare testul pozitiv se evidenţiază prin apariţia unor pete gri pe membrană. care se menţine 2 minute în contact cu Petrifilmul. • indicator de pH foarte sensibil. cu confirmare în 18 -24 h. 48 ± 2 ore. 30 ± 1ºC sau 37 ± 1ºC Petrifilm Kit HEC Escherichia coli tip enterohemoragic Petrifilm Enterobacteriaceae Enterobacterii Petrifilm Staph Express Count System (Petrifilm Staph Express Count Plate + Petrifilm Staph Express Disk) Staphylococcus aureus 24 ± 2 ore. • producerea de acid este pusă în evidenţă cu ajutorul unui indicator de pH. 30 ± 1ºC 24 ± 2 ore. care produc glucuronaze. cu evidenţierea producerii de acid. coli enteropatogene (O157: H7). 35 ± 1ºC sau 37 ± 1ºC Bacterii coliforme PHSCC (Petrifilm sensivity count) Bacterii coliforme high coliforms 24 ± 2 32.METODE RAPIDE.

MICROBIOLOGIE SPECIALA . ceea ce conduce în multe cazuri la suprapunerea coloniilor. De remarcat este faptul că la Petrifilmele destinate evaluării drojdiilor şi mucegaiurilor. în variantele analizelor realizate cu Petrifilme. în cazul majorităţii Petrifilmelor concepute pentru studiul bacteriilor (Jordano şi colab. comparativ cu metodele convenţionale. Pag 5 . VDIA – Victorian Dairy Industry Authority (Australia). a evidenţiat că evaluările privind numărul total de drojdii şi mucegaiuri au condus la rezultate inferioare. PCA. bacterii aerobe mezofile. HPB – Health Protection Branch. pentru patru indicatori microbiologici: drojdii şi mucegaiuri. Explicaţia constă probabil în existenţa unei suprafeţe insuficiente pentru creşterea extinsă a coloniilor de mucegai. generând erori în evaluarea corectă a unităţilor formatoare de colonii (ufc). 1995). Tabelul 2. bacterii coliforme şi Escherichia coli.. repetabilitate şi precizie. Validarea s-a realizat pe trei criterii de bază: reproductibilitate.METODE RAPIDE. în paralel cu tehnicile culturale clasice ce utilizează medii selective (OGYE. comparativ cu 20 cm2. CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR Garanţia utilizării Petrifilmelor este validată oficial de numeroase asociaţii de renume din întreaga lume (tabelul 2). EMB). Validarea oficială a utilizării Petrifilmelor pentru evaluarea calităţii microbiologice a alimentelor Organizaţia internaţională* AOAC Produse pentru care s-a realizat validarea Majoritatea alimentelor Indicator microbiologic Drojdii şi mucegaiuri Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme şi Escherichia coli Petrifilm seria 2000 (P 2000 CC) pentru determinarea rapidă a bacteriilor coliforme Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme şi Escherichia coli Petrifilm seria 2000 (P 2000 CC) pentru determinarea rapidă a bacteriilor coliforme Enterobacterii Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme şi Escherichia coli Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme Drojdii şi mucegaiuri Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme şi Escherichia coli Test Kit HEC ANFOR Majoritatea alimentelor NMKL VDIA HPB Majoritatea alimentelor Lapte şi produse lactate Lapte şi produse lactate Alte alimente Evaluarea calităţii mediului * AOAC – Association of Official Analytical Chemists (SUA). AFNOR – French Standardization Association (Franţa). realizată pentru tipuri diferite de produse alimentare prin utilizarea Petrifilmelor. NMKL – Nordic Committee of Food Analysis. VRBL. suprafaţa mediului de cultură este de 30 cm2. Compendium of Analytical Analiza comparativă a fidelităţii evaluărilor cantitative.

5). pentru cinci probe în paralel (n = 5). stabilite prin calcul statistic (P > 0. comparativ cu metodele convenţionale (Jordano 1995.897 0. 4 – bacterii coliforme/ Escherichia coli Pag 6 .METODE RAPIDE. cât şi în cazul materiilor prime şi al produselor finite (tabelul 3). 2 – bacterii aerobe mezofile.05). 3 – enterobacterii. exprimate ca valori medii. ceea ce permite evaluarea corectă şi distinctivă a speciilor analizate (fig. certifică fidelitatea şi acurateţea analizelor realizate cu Petrifilme.861 0. oferă certitudini privind fidelitatea rezultatelor pentru principalii indicatori microbiologici şi recomandă utilizarea Petrifilmelor ca o alternativă la metodele microbiologice convenţionale pentru controlul microbiologic. CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR Evaluările statistice. amplificarea preciziei realizându-se prin asigurarea condiţiilor selective de cultivare şi interpretare a rezultatelor. Tabelul 3. realizat atât pe faze de fabricaţie. realizate pe baza coeficienţilor de corelaţie şi a pantei ecuaţiilor de regresie liniară. 5.599 1.981 0.MICROBIOLOGIE SPECIALA . Dezvoltarea selectivă a microorganismelor în funcţie de natura Petrifilmelor 1 – drojdii şi mucegaiuri. Evaluări statistice privind acurateţea analizelor microbiologice realizate cu Petrifilme. 1 2 3 4 Fig.998 Panta ecuaţiei de regresie * Valori medii pentru 5 probe în paralel (n = 5) Datele obţinute. 1999) Parametrul statistic Coeficient de corelaţie Indicatorul microbiologic Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme Drojdii şi mucegaiuri Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme Drojdii şi mucegaiuri Petrifilme/ Metode culturale clasice* 0.051 0.

prin menţinere la 4ºC). comparativ cu tehnicile clasice. 1999b): capacitatea unor microorganisme de a produce hidroliza agentului de solidificare.MICROBIOLOGIE SPECIALA . privind eficienţa economică a tehnicilor de evaluare a calităţii microbiologice. săruri etc. reducerea la jumătate a timpului necesar pentru realizarea analizelor microbiologice. volum redus de produse reziduale la finalul analizei care pot fi uşor anihilate pin incinerare. economie de spaţiu la transport. termostatare şi evaluare cantitativă şi calitativă. care delimitează suprafeţe de 1 ml. chiar în cazul dezvoltării unui număr mare de colonii. îmbunătăţirii calităţii şi asigurării inocuităţii produselor finite. prin crearea unor condiţii selective de creştere şi de evaluare a microorganismelor testate. reducerea semnificativă a costului manoperei per analiză. Pag 7 . prin eliminarea operaţiilor de pregătire şi sterilizare a mediilor de cultură şi a ustensilelor de laborator. impact pozitiv asupra organizării laboratorului de microbiologie. eficientizării procesării. impuse de metodele convenţionale de analiză microbiologică. creşterii numărului de analize efectuate. iar prin utilizarea Petrifilmelor se pot economisi anual 99-400 ore. implementarea utilizării Petrifilmelor în controlul calităţii microbiologice a alimentelor oferă numeroase facilităţi care se reflectă în: uşurinţa în exploatare.7 % în costul tot al analizelor.METODE RAPIDE. prin caroiajul tipărit pe filmul inferior. Practica a demonstrat că există şi unele limitări în utilizarea Petrifilmelor generate de (Williams şi Busta. valabilitate prelungită (mai mult de un an. riscuri reduse pentru mediul înconjurător după utilizare. analiza presupune parcurgerea a numai trei etape: inoculare. păstrare şi termostatare (un pachet de 50 de Petrifilme ocupă un spaţiu similar cu cel ocupat de 2 plăci Petri clasice). 1999). ceea ce conduce la răspândirea şi suprapunerea coloniilor. unii compuşi din alimente (acizi. optimizării strategiilor de control. Evaluările cantitative sunt facilitate.) pot exercita efect inhibitor asupra dezvoltării coloniilor în cazul utilizării Petrifilmelor. simplitate în utilizare şi în interpretarea cu acurateţe a rezultatelor. CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR În concluzie. au demonstrat că manopera se reflectă în proporţie de 70. cu impact pozitiv asupra: controlului eficient al punctelor critice. Studii efectuate în 85 de companii producătoare de alimente. timp ce poate fi valorificat pentru elaborarea de programe eficiente pentru evaluarea calităţii şi creşterea numărului de analize (Jordano.

coli Petrifilm Enterobacteriaceae Enterobacterii Petrifilm Staph Express Count System (Petrifilm Staph Express Count Plate + Petrifilm Staph Express Disk) Staphylococcus aureus Petrifilm Environmental Listeria plate Listeria Pag 8 .MICROBIOLOGIE SPECIALA . coli Escherichia coli Petrifilm E. coli / Coliform count plate Bacterii coliforme şi E. CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR ANEXA 1 Tipuri de Petrifilme comerciale Tip Petrifilm/ Grup de microorganisme analizate Exemple Tip Petrifilm/ Grup de microorganisme analizate Petrifilm high sensivity coliforms count) Bacterii coliforme Exemple Petrifilm yeast/mould Drojdii şi mucegaiuri Petrifilm aerobic count Bacterii aerobe mezofile Petrifilm rapid coliforms count Bacterii coliforme Petrifilm coliforms count Bacterii coliforme Petrifilm E.METODE RAPIDE.

bazate pe capacitatea bacteriilor de a fermenta lactoza cu producere de acid lactic. este indicatorul care certifica o contaminare fecală recentă. Citrobacter diversum. Grupul bacteriilor coliforme cuprinde speciile: Escherichia coli. Pag 1 . Enterobacter cloaceae. capabile de a produce fermentaţia heterolactică a lactozei cu producere de acid lactic şi gaze.MICROBIOLOGIE SPECIALA . Etapa de îmbogăţire (testul prezumtiv) are rolul de a previziona prezenţa bacteriilor coliforme şi multiplicarea acestora. în vederea evidenţierii lor facile în etapa următoare. în timp de 48 ore la 35°C. oxidazo-negative. băuturi alcoolice. produse de cofetărie şi patiserie PRINCIPIU METODEI Metoda pentru determinarea bacteriilor coliforme include trei etape diferite de analiza concretizate in: testul prezumtiv. peşte şi produse din peşte. COLIFORMI FECALI SI ESCHERICHIA COLI Bacteriile coliforme conform definiţiei ISO sunt bacterii Gram negative nesporulate. CO2. băuturi nealcoolice. aerobe sau facultativ anaerobe. in timp de 48 ore si la temperaturi de 35-37°C. dacă sunt în concentraţii reduse. fie ca urmare a scăderii pH-ului prin acumularea de acid lactic. Klebsiella oxytoca. Aprecierea probelor pozitive se face fie în funcţie de prezenţa gazelor acumulate în tubul Durham. Citrobacter amalonatica Tipuri de produse alimentare pentru care se recomanda analiza sunt: lapte şi produse lactate.TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI SANITARI BACTERII COLIFORME. Citrobacter freundii. Testul complet permite identificarea speciilor grupului bacteriilor coliforme şi se bazează pe testarea unor proprietăţi biochimice caracteristice. ce pot să se înmulţească în prezenţa sărurilor biliare (care inhibă dezvoltarea bacteriilor Gram pozitive sau a altor agenţi cu proprietăţi echivalente). carne şi produse din carne. Din grupul bacteriilor coliforme specia Escherichia coli. Klebsiella pneumoniae. testul de confirmare şi testul complet. după cum urmează: 1. Testul de confirmare constă in transferul si inocularea din eprubetele pozitive ale testului prezumtiv in medii selective care favorizează dezvoltarea bacteriilor coliforme de origine fecala. Testul prezumtiv constă in inocularea probei în mediu nutritiv cu lactoză. Enterobacter aerogenes. MODUL DE LUCRU DETECTIA COLIFORMILOR TOTALI Analiza se efectuează în două etape. H2.

repartizat în plăci pentru a obţine colonii distincte. în eprubete cu mediu E.TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI SANITARI 2. după termostatare la temperatura de 45. 10-2.. si virajul culorii indicatorului verde briliant de la verde la galben. *I – producere de indol din triptofan M – reacţia faţă de roşu de metil V – reacţia Vages Proskauer de producere a acetoinei C – utilizarea citratului. după termostatare la temperatura de 37°C. care permit diferenţierea a lui E. în funcţie de gradul de contaminare presupus se pot adopta două modalităţi de evaluare. timp de 24-48 h. Etapa de confirmare certifică prezenţa bacteriilor coliforme prin cultivare în condiţii selective specifice. CERTIFICAREA PREZENTEI SPECIEI Escherichia coli Din eprubetele pozitive ce conţin mediu E.…. se confirma ca în produsul analizat sunt prezente bacteriile coliforme (fig. sau câte 1 ml de probă prin inoculare în mediu selectiv de îmbogăţire simplu concentrat. se pot folosi pentru inoculare câte 10 ml de probă (pentru probele cu grad de contaminare mai redus) utilizând mediu selectiv de îmbogăţire dublu concentrat. coli de Enterobacter aerogenes. Pentru confirmare.C.a. EVIDENTIEREA FECALA PREZENTEI BACTERIILE COLIFORME DE ORIGINE Testul constă în transferul cu o ansă a probelor din eprubetele pozitive ale testului prezumtiv.. Se termostatează apoi la temperatura de 35°C.ş. se fac trasări aplicând metode scarificate pe suprafaţa mediului Levine cu agar. timp de 48 h. iar eprubetele negative sunt din nou termostatate timp de 24 h şi se înregistrează din nou eprubetele pozitive. bule de gaz în plutitor). şi termostatare la temperatura de 45. Se înregistrează eprubetele pozitive (mediu tulbure.5°C. 1). se inoculează serii de câte trei eprubete în paralel pentru şi pentru următoarele diluţii succesive: 10-1.+ + Mobilitate + - Pag 2 .5°C. timp de 18-24 de ore. Probele inoculate se termostatează la temperatura de 37°C. în condiţiile în care se produc gaze în plutitor. Din coloniile caracteristice se fac inoculări pentru testele biochimice denumite generic IMViC*. Pentru acest din urmă caz.MICROBIOLOGIE SPECIALA . din eprubetele pozitive se recoltează câte o ansă şi se inoculează eprubete cu bulion lactoză bilă verde briliant. Pornind direct de la eşantionul de analiză (în cazul unui produs lichid) sau de la suspensia iniţială (10-1) (în cazul unui produs solid). Diferenţiere intre specii se face pe baza proprietarilor dopa cum urmează : Specii I Escherichia coli + Enterobacter aerogenes M + V C . tulburare. timp de 24 de ore. Astfel. timp de 24 de ore.C.

în anumite cazuri testul pozitiv poate fi evidenţiat şi după o perioadă de termostatare de 24 h ± 2h * Probă pozitivă: modificarea turbidităţii. reducerea pH-ului. virajul culorii mediului din verde în galben.MICROBIOLOGIE SPECIALA . 1. Schema de lucru pentru evaluarea cantitativă a bacteriilor coliforme prin tehnica numărului probabil Legendă: 1) Mediu selectiv de îmbogăţire dublu concentrat (Mîdc) + tub Durham 2) Mediu selectiv de îmbogăţire simplu concentrat (Mîsc) + tub Durham 3) Mediu selectiv de confirmare + tub Durham 4) Temperatura de termostatare poate fi 30ºC. acumularea de gaz în tubul Durham ** Probă pozitivă: modificarea turbidităţii.TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI SANITARI Suspensie iniţială (produs solid) Eşantion de analiză (produs lichid) Etapa de îmbogăţire 10 ml + 10 ml Mîdc 1) 1 10 -2 /10 - 10 /10 -2 -3 10 ml + 10 ml Mîdc 1) 10 ml + 10 ml Mîdc 1 ml + 10 ml Mîsc 1 ml + 10 ml Mîsc 2) 1 ml + 10 ml Mîsc Idem Idem 1) 2) 2) Termostatare 24h Etapa de confirmare Termostatare 48h4) Idem Idem +* + - 10 ml BLBV 3) 10 ml BLBV 10 ml BLBV 10 ml BLBV 10 ml BLBV Idem Idem Termostatare 48h ± 2h 4) Termostatare 48h ± 2h 4) Interpretarea rezultatelor Calculul MPN +** + - +** - Idem Idem Fig. 35ºC sau 37ºC şi este stabilită în funcţie de scopul analizei şi anume: scop tehnologic sau evaluarea riscului privind siguranţa alimentară. acumularea de gaz în tubul Durham Pag 3 .

3) Cazuri particulare.5 4. Cazul 1 nu poate fi aplicat.0 3. chiar dacă seria include două diluţii care nu prezintă nici o probă pozitivă.6 0.0 Cifra caracteristica 302 310 311 312 313 320 321 322 323 330 331 332 333 Număr probabil de microorganisme 6.0 25. Se alege diluţia cea mai mare (adică cea care corespunde celei mai mici concentraţii de eşantion inoculat) care prezintă trei eprubete pozitive.0 1.0 3. adică nu există diluţii la care să se fi înregistrat şi probe negative.TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI SANITARI CALCULUL ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR Folosind. doar la prima diluţie preparată. care.0 2. 1) şi 2) nu prezintă eprubete pozitive (adică cea în care s-a inoculat cea mai mare cantitate de probă) şi cele două diluţii consecutive mai mici (adică cele în care concentraţiile de probă inoculată sunt de 10 şi respectiv 100 de ori mai mici decât în prima diluţie aleasă). excluzând cazul în care se înregistrează probe pozitive.5 4. şi încă două diluţii succesive.6 0.0 30.5 4.0 20. Dacă schema de diluţie adoptată este necorespunzătoare.0 3.5 7.0 45. in funcţie de numărul eprubetelor pozitive se stabileşte cifra caracteristica si din tabelul lui Mac Cready (tabel 1).5 16. Se aleg cele mai mari trei diluţii succesive din serie (adică cele care au cea mai scăzută concentraţie de probă inoculată).5 1.5 2.4 2. se vor reţine primele trei diluţii.5 15. pornind de la eşantion.7 1. după caz. se determina numărul probabil de coliformi (MPN) Pentru a calcula numărul probabil de coliformi/cm3 probă. se aleg cele mai mari trei diluţii succesive din serie (adică cele care au cea mai scăzută concentraţie de probă inoculată).1 1.0 9.0 3. valoarea din tabel se înmulţeşte cu factorul de diluţie corespunzător primei cifre din cifra caracteristică. În acest ultim caz.3 0. Tabel Mac Cready Cifra caracteristica 000 001 010 011 020 100 101 102 110 111 120 121 130 200 Număr probabil de microorganisme 0.0 110 140 Interpretarea rezultatelor Pentru fiecare eşantion examinat se reţin trei diluţii consecutive.1 1.0 0. Pag 4 .9 Cifra caracteristică 201 202 210 211 212 220 221 222 223 230 231 232 300 301 Număr probabil de microorganisme 1.3 0.5 4.7 1.MICROBIOLOGIE SPECIALA . 2) Nu există cazuri e să prezinte trei eprubete pozitive. corespund uneia dintre situaţiile următoare: 1) Cel puţin o diluţie prezintă trei eprubete pozitive. metoda titrului. care conţin cel puţin un răspuns pozitiv.0 3.5 11.0 2. corespunzător cifrei caracteristice si numărul de eprubete inoculate in paralel. În toate cazurile în care mai mult de una dintre cele trei diluţii de la pct.6 0.4 0.1 0.

Acceptabilitatea depinde totodată de numărul de eşantioane analizate şi de decizia de a accepta sau refuza rezultatele din categoria 2. sau 1. stabilită prin formula: MPN / g (ml ) = P (N + T ) 12 în care: P – numărul de eprubete pozitive. 2 şi 3. Există şansa de cel mult 1% de a obţine un rezultat mai puţin probabil decât cel mai puţin probabil în această categorie. Rezultatul este unul din cele care au cea mai mică şansă de a fi obţinute. gradul de contaminare va corespunde cu MPN calculat. Rezultatul este unul dintre cele care au cea mai mică şansă de a fi obţinute. adică 1. Tabelul 1. Un exemplu de alegere a diluţiilor pentru calculul valorii MPN este prezentat în tabelul 2. Astfel. conform uneia din situaţiile de mai sus. combinaţia 221 nu poate fi 1 numărul cel mai probabil (MPN) Pag 5 . chiar decât cel mai puţin probabil din categoria 2. fără erori de analiză 2 3 0 După alegerea setului de trei diluţii reprezentative pentru stabilirea MPN.MICROBIOLOGIE SPECIALA . atunci când sunt acceptate numai rezultate numai din categoria 1. Şansa de a obţine acest rezultat (care este mai puţin probabil decât cel mai puţin probabil) este de cel mult 5% în această categorie. conform specificaţiilor din tabelul 1. Măsuri privind interpretarea şi acceptabilitatea rezultatelor analizei Categoria Definiţie 1 Rezultatul este unul din cele care au cea mai mare şansă de a fi obţinute. Astfel. N – cantitatea de probă inoculată în probele negative.TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI SANITARI Calcul MPN1 Pentru a stabili MPN/g sau ml probă se recomandă utilizarea aproximaţiei propusă de Thomas. sunt acceptabile din punct de vedere statistic.1% de a obţine un rezultat care este mai puţin probabil decât cel mai puţin probabil în această categorie. Acceptarea rezultatelor va ţine seama de categoria impusă. Nu există decât o şansă de 0. chiar decât cel mai puţin probabil din categoria 1. g sau ml T – cantitatea totală de probă luată în analiză (inoculată în toate seturile de probe realizate în paralel).1% de a obţine un rezultat în această categorie. care. 1 şi 2. Există şansa de cel mult 0. chiar decât cel mai puţin probabil din categoria 3. Rezultatul este unul dintre cele care au cea mai mică şansă de a fi obţinute. g sau ml Pentru fiecare analiză trebuie să se decidă categoria de rezultate acceptată.

Stabilirea valorii MPN în funcţie de diagrama probelor pozitive (adaptare după SR ISO 4831. Tabelul 2. corespunzând următoarelor cantităţi 1) de eşantion inoculate în fiecare eprubetă -1 -2 -3 Produs 10 ml 1ml 10 ml 10 ml 10 ml lichid -1 -2 -3 -4 Alt produs 1g 10 g 10 g 10 g 10 g MPN 2) MPN/ml MPN/g 1 2 3 4 5 1) 2) 3 3 2 3 2 3 3 2 3 2 2 3 1 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 1 1.1 Seria (combinaţia) de eprubete aleasă Conform datelor din tabelele întocmite pe baze statistice Pag 6 . acesta nu poate constitui o bază pentru stabilirea MPN.4·10 2.1·10-1 1.4·101 7. 3 sau 5 probe în paralel. În cazul când sunt acceptate mai puţin probabile (din categoria 2).4·10 2. 1992) Exemplu Numărul de eprubete pozitive corespunzător seturilor de trei eprubete termostatate.4 2. Dacă combinaţia 221 este rezultatul unei singure analize.MICROBIOLOGIE SPECIALA .4 2.TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI SANITARI reţinută decât dacă au fost examinate 10 probe în paralel (din lotul considerat).5·102 2.4·102 7. combinaţia 221 va fi reţinută în cazul în care au fost examinate 2.5·101 2.

. până la 1000ml pH=6............ fără tub Durham.................. 5....1g Apă ....0g comercial în apă................ 10........... KH2HPO4 ......................... 20..... 40. până la 1000ml Se repartizează câte 10 ml de mediu pH=7........ 20....... Verde briliant ......5 g Se repartizează câte 10 ml de mediu NaCl... K2HPO4 .....2.......... 2................. 4...... 10............0g nevoie... 5....................... cu tub Durham......... K2HPO4 ........0g în eprubete mici...0g Eozină .......... până la 1000ml pH=7.8........ 10.......... 2........ 0...............0g Se dizolvă componentele sau mediul Lactoză . cu tub Durham........................ 0............ până la 1000 ml pH=6....0g comercial în apă............... Mediu simplu concentrat timp de 15 minute...5g Se repartizează câte 10 ml de mediu Fosfat dipotasic . Tuburile Durham nu trebuie să conţină bule de aer după sterilizare... Săruri biliare ............... Se sterilizează în autoclav la 121ºC......... 5....9............... 65......75g NaCl.0g Lauril sulfat de sodiu .......... Lactoză ......... Etapa de confirmare Bulion lactozat cu bilă şi verde briliant (BLBV) (mediul de confirmare) Mediu Levine Mediu EC (mediul selectiv confirmare) Pag 7 . 5.....................75g KH2HPO4 .. Apă ........0g Apă ............ 2...........................................0g Tuburile Durham nu trebuie să conţină Lactoză ............. 5.0g nevoie............0133g Se ajustează pH-ul dacă este nevoie......... timp de 15 minute............................0g timp de 15 minute..... cu (după sterilizare) tub Durham..................... 10....... Se sterilizează în autoclav la 121ºC........................................................1............... 0.0g Apă ............0g timp de 15 minute.8. 1...........0g dublu concentrat în eprubete mari Lauril sulfat de sodiu ....... la temperatura de 25ºC simplu concentrat în eprubete mici (după sterilizare) (16mm x 160mm)............5 g Se ajustează pH-ul dacă este nevoie....................................TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI SANITARI ANEXA 1 COMPOZIŢIA MEDIILOR DE CULTURĂ Denumirea mediului Buliontriptonă şi lauril sulfat (mediul selectiv de îmbogăţire) Compoziţie Instrucţiuni de pregătire Etapa Etapa de îmbogăţire Mediu dublu concentrat: Se dizolvă componentele sau mediul Triptonă ...................... 1............................. încălzind dacă este Bilă..4g Albastru de metilen. Peptonă ........... Triptonă ... Apă .........2g (20mm x 200mm)............... 15......... Lactoză ...0g Se sterilizează în autoclav la 121ºC.... 10................. 5... 10....MICROBIOLOGIE SPECIALA ................ încălzind dacă este Lactoză . Fosfat monopotasic . Triptoză .5g Clorură de sodiu .................0g bule de aer după sterilizare........... 20.. K2HPO4 .... la temperatura de 25ºC în eprubete mici (16mm x 160mm)........... 0............. la temperatura de 25ºC (după sterilizare) Peptonă ........... până la 1000 ml Se repartizează câte 10 ml de mediu pH=6...0g Se sterilizează în autoclav la 121ºC.0mg Geloză .

MICROBIOLOGIE SPECIALA . Etapa de confirmare Proba Diluţia 1 2 Stabiliţi gradul de contaminare exprimat in numărul probabil de bacterii coliforme/cm3 probă: Proba 1 _______________________ Proba 2 _______________________ . Etapa de îmbogăţire (testul prezumtiv) Proba Diluţia 1 2 b. Înregistraţi in tabelul de mai jos probele pozitive: a.TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI SANITARI REZULTATE LUCRARE __________ Nume______________________________ Grupa______________________________ Data_______________________________ BACTERII COLIFORME. COLIFORMI FECALI SI Escherichia coli 1.

Baloane cu ser fiziologic steril. pe baza numărului de colonii generate de celulele acestei bacterii prezente în proba de analizat.bacterii care formează colonii caracteristice şi/sau necaracteristice la suprafaţa unui mediu de cultură selectiv şi care dau o reacţie puternic coagulază pozitiv. Numărător de colonii. care se formează când proba sau o diluţie a acesteia vine în contact cu un mediu nutritiv gelozat (inoculat în două probe în paralel). Eprubete sterile. MATERIALE ŞI STICLĂRIA PENTRU DETERMINARE Plăci Petri Φ10 cm sterile. după termostatare la temperatura de 35°C sau 37°C. timp de 24-48 de ore. Pipete de 1 cm3 sterile.ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE DETERMINAREA NUMĂRULUI DE BACTERII Staphylococcus aureus (COAGULAZO POZITIVI) Staphylococcus aureus (stafilococi coagulazo-pozitivi) . PRINCIPIUL METODEI Prin această metodă. Prezenta procedură de lucru stabileşte modul de evidenţiere şi numărare a stafilococilor coagulazo-pozitivi din produsele alimentare (Anexa 1). MEDII DE CULTURĂ ŞI REACTIVI PENTRU DETERMINARE Mediile de cultură utilizate pentru determinare sunt (Anexa 2): Mediu cu geloză Baird-Parker Bulion de inimă-creier Plasmă de iepure Pag 1 . Eprubete cu câte 10 ml bulion inimă-creier steril. Pungi sterile pentru omogenizarea probelor solide sau semisolide. numărul de bacterii aparţinând speciei Staphylococcus aureus se apreciază indirect. Eprubete cu câte 10 ml mediu Baird-Parker cu geloză. Ansă cu buclă cu diametrul de 3 mm.MICROBIOLOGIE SPECIALA .

după turnarea în plăci a mediului fluidificat şi răcit la 47±1°C. Se continuă termostatarea la temperatura de 35± 1°C sau la 37±1°C. se inoculează câte 1 cm3 în câte două plăci Petri.MICROBIOLOGIE SPECIALA . Se reţin pentru numărare plăcile Petri care conţin între 15-150 colonii caracteristice şi/sau necaracteristice. se omogenizează conţinutul cutiei Petri prin mişcări de rotaţie executate în plan orizontal. prezente în proba de analizat. După inoculare. Reactivii chimici utilizaţi trebuie să fie de calitate recunoscută. folosind drept suport o pungă sterilă. Din probele lichide se pot realiza diluţii decimale direct în eprubete. Se adaugă 90 cm3 ser fiziologic steril. MODUL DE LUCRU Pentru evidenţierea bacteriilor Staphylococcus aureus se fac inoculări în mediul BairdParker cu geloză. după care se lasă în repaus până la solidificare totală. Prin numărare se stabileşte numărul de ufc (unităţi formatoare de colonii) care reprezintă numărul prezumtiv de bacterii ale speciei Staphylococcus aureus. după care se continuă diluarea în eprubetele cu ser fiziologic steril. Pentru emulsia de gălbenuş de ou se recomandă utilizarea unui preparat comercial. Pag 2 . Pentru prepararea soluţiilor de diluare şi a mediilor de cultură se vor utiliza componente de bază deshidratate sau medii comerciale deshidratate. apoi se marchează pe reversul mediului coloniile caracteristice. Pentru a obţine colonii uniform repartizate. în funcţie de gradul presupus de contaminare a probei. Se omogenizează timp de 1 min în treapta a doua. Inoculările se fac din 3 diluţii succesive ale probei. Pentru fiecare din diluţiile alese. în timp ce pentru probele solide sau semisolide se realizează o omogenizare şi suspendare în ser fiziologic steril. probele sunt termostatate timp de 24-48 de ore la temperaturi de 35± 1°C sau la 37±1°C. Se cântăresc în condiţii aseptice 10 g din produsul de analizat. se închide punga şi se introduce în omogenizator. prin metoda încorporării în mediul nutritiv. se marchează şi coloniile necaracteristice eventual prezente.ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE Cerinţe: Apa folosită trebuie să fie distilată sau demineralizată. alese convenabil. lipsită de substanţe care să inhibe dezvoltarea celulelor de Staphylococcus aureus în condiţiile analizei. Din fiecare placă Petri se aleg pentru confirmare cinci colonii caracteristice şi/sau necaracteristice (după caz). respectând cu stricteţe instrucţiunile fabricantului. timp de încă 22-24 de ore şi se marchează toate coloniile caracteristice.

în acest caz se reţine ca rezultat valoarea cea mai mică.1 ml cultură recoltată în condiţii sterile 0. numărul de ufc de Staphylococcus aureus se calculează media aritmetică a valorilor obţinute.ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE Pentru confirmarea prin proba coagulazei se procedează astfel: din fiecare colonie reţinută se prelevează biomasă cu ajutorul unei anse sterile şi se inoculează în câte o eprubetă ce conţine 10 ml bulion inimă-creier. numărul de ufc obţinut prin numărarea coloniilor selectate pentru numărare.coloniile caracteristice sunt negre. Pot fi întâlnite următoarele situaţii: 1) Dacă cel puţin 80% dintre coloniile selecţionate sunt coagulazo-pozitiv se ia ca număr prezumtiv de Staphylococcus aureus.5 mm. Calculul pentru determinarea bacteriilor Staphylococcus aureus prin numărare Pentru plăcile care conţin între 15 şi 150 de colonii caracteristice şi/sau necaracteristice pentru două diluţii consecutive.5 mm. iar la o diluţie diferită predomină alt tip de colonii. timp de 18-24 de ore. dar sunt lipsite de zonă clară.3 ml plasmă de iepure şi termostatează în condiţii similare cu probele de analizat. diametrul de 1. Plasma din eprubeta martor nu trebuie să prezinte semne de coagulare. strălucitoare şi convexe. şi de 1. Probele inoculate se termostatează la 37±0. şi sunt înconjurate de o zonă clară sau parţial opacă. Se consideră că reacţia este pozitivă când coagulul ocupă mai mult de trei pătrimi din volumul ocupat iniţial de lichid. exceptând cazul când raportul dintre valoarea cea mai mare şi valoarea cea mai mică este mai mare decât 2.5-2. Dacă în plăcile Petri alese pentru numărare sunt Pag 3 .coloniile necaracteristice au caractere culturale asemănătoare.dacă la o diluţie predomină un tip de colonii.. se reţin plăcile corespunzătoare ambelor diluţii. după 48 de ore de termostatare. Se amestecă în eprubete sterile 0. timp de 1-6 ore. Pentru control. după 24 de ore de termostatare.3 ml plasmă de iepure şi se termostatează la temperaturi de 35-37°C. . numărul se calculează pornind de la procentul de Staphylococcus aureus prezumtiv.1 ml bulion inimă-creier steril în 0. care sunt coagulazo-pozitiv. se adaugă 0. 2) În toate celelalte cazuri.MICROBIOLOGIE SPECIALA . INTERPRETAREA REZULTATELOR În interpretarea rezultatelor se vor ţine cont de următoarele recomandări: .1. coloniile necaracteristice sunt constituite adesea de tulpini de Staphylococcus aureus care contaminează produsele lactate. .5°C.

procedând după cum urmează: . se rotunjeşte la cel mai apropiat multiplu de 20. Rezultatul se exprimă printr-un număr cuprins între 1.m x Ne Staphylococcus aureus per gram.mai puţin de 15x Ne Staphylococcus aureus per gram.MICROBIOLOGIE SPECIALA . unde Ne = 1/volum de inocul x 1/diluţia eşantionului analizat c) estimarea numerelor mici în produsele lichide: . atunci când numărul mediu de colonii confirmate în două plăci Petri Pag 4 .0 şi 9. . Nu se reţin decât două cifre semnificative.dacă numărul este mai mare de 100 şi se termină cu 5. pentru fiecare. după caz. unde n este puterea corespunzătoare. Se adună mediile obţinute din coloniile caracteristice şi/sau necaracteristice.mai puţin de 15x ne Staphylococcus aureus per mililitru. unde ne = 1/volum de inocul b) pentru alte tipuri de produse: . Limitele de încredere cu o probabilitate de 95% din estimările de numere mici (variantele c) şi d)).ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE prezente colonii caracteristice şi/sau necaracteristice. se multiplică valoarea obţinuta anterior cu inversul volumului inoculului şi apoi cu inversul diluţiei eşantionului analizat. luând în considerare. .9 multiplicat cu 10n. se rotunjeşte la cel mai apropiat multiplu de 10 Pentru a obţine ufc/ml produs lichid sau ufc/g produs solid. unde m = numărul de colonii confirmate Limitele de încredere ale estimărilor de numere mici sunt prezentate în tabelul de mai jos. caracteristice şi necaracteristice şi se rotunjeşte la numărul întreg următor cel mai apropiat. unde m = numărul de colonii confirmate d) estimarea numerelor mici în alte tipuri de produse: .dacă numărul este mai mare de 100 şi nu se termină cu 5. se rotunjeşte la cel mai apropiat multiplu de 5. Dacă numărul mediu al coloniilor confirmate este mai mic de 15.dacă numărul este mai mic de 100. Pentru o estimare a numerelor mici. aceste colonii se numără separate. se face o medie din numărul coloniilor confirmate. rezultatul se exprimă sub forma: a) pentru produse lichide: .m x ne Staphylococcus aureus per mililitru. factorul de diluţie.

.MICROBIOLOGIE SPECIALA ..mai puţin de 1 x Ne Staphylococcus aureus per gram Pag 5 .mai puţin de 1 x ne Staphylococcus aureus per mililitru b) pentru alte tipuri de produse: .ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE inoculate cu eşantionul de analiză sau o diluţie a acestuia este mai mic de 15 ufc sunt prezentate în tabelul de mai jos: Limite de încredere pentru estimări de numere mici Staphylococcus aureus ufc/ml sau ufc/g 1 2 3 4 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Limita de încredere la nivelul de 95% inferioară superioară <1 2 <1 4 <1 5 1 6 2 9 2 12 3 13 4 14 4 16 5 18 6 19 7 20 7 21 8 23 Dacă nu există nici o colonie confirmată rezultatul se exprimă sub forma: a) pentru produse lichide: .

9. 3. 12. Pâine şi produse de panificaţie Lapte şi produse lactate Carne şi produse din carne Peşte şi produse din peşte Uleiuri şi grăsimi Ouă şi produse pe bază de ou Zahăr şi produse zaharoase Fructe.ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE ANEXA 1 GRUPELE PRINCIPALE DE ALIMENTE 1. 14. 7. 2. 8. 17. 18. 13. 4. 10. 16. Legume şi produse prelucrate Băuturi alcoolice Băuturi nealcoolice Produse de cofetărie şi patiserie Produse de catering Semipreparate Cereale şi produse din cereale Condimente. sosuri. 6. 11. salate Îngheţate Alimente cu destinaţie specială Alte alimente Pag 6 . 5. supe. 15.MICROBIOLOGIE SPECIALA .

....1............................... Se completează volumul până la 100 ml cu apă...... 5........................ Soluţie de sulfamezatină (sulfadimidină.... apoi se răceşte la circa 50°C pe baia de apă.............0g Glicină ...0 ml Emulsie de gălbenuş de ou ......... după sterilizare...2g Soluţie hidroxid de sodiu 0......... Se repartizează mediul câte 10 de ml în eprubete............. Soluţia poate fi conservată mai multe luni la temperaturi de 0°C-.2.......... 5...............5°C....... Se sterilizează mediul la 121°C... 100ml Preparare: Se dizolvă teluritul de potasiu în apă. 1.......2 la temperatura de 25°C....3...................................................MICROBIOLOGIE SPECIALA ........ 12.................................................0g Agar-agar ............0............. Mediul cu geloză Baird-Parker Compoziţie: Mediu de bază ..... 10........ Soluţie de piruvat de sodiu Compoziţie: Piruvat de sodiu ........... 5.............1M ......... Se ajustează pH-ul astfel încât............ INN) se foloseşte numai în cazul în care se suspectă prezenţa bacteriilor din genul Proteus)........... se adaugă 27..20..... INN)......0g Clorură de litiu ...........................0g Extract de drojdie ............ 12-20g Apă ..................... 90 ml Soluţie telurit de potasiu ............................................0 ml Preparare: Se solubilizează mediul de bază........... 1000 ml şi dacă este necesar: Soluţie de sulfamezatină ...................................... Se sterilizează prin filtrare........ Soluţie de telurit Compoziţie: Telurit de potasiu (trioxotelurat dipotasic) ............................................... Compoziţie: Sulfamezatină ....................0g Apă ..... Dacă este necesar...... 1ml Soluţie piruvat de sodiu .....0g Extract de carne .......................................................... 100ml Preparare: Se dizolvă sulfmezatina în soluţie de hidroxid de sodiu................... 10ml Apă ...... 1.............0g Apă ................. 5.......... la temperaturi de 0°C-........... 1.........1.........................ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE ANEXA 2 Prepararea mediilor de cultură şi a reactivilor pentru determinare 1................ omogenizând cu grijă după fiecare adaos.............................. Se adaugă celelalte componente..............5 ml soluţie de sulfamezatină (sulfadimidină. încălzind cât mai puţin posibil. 27..............................5 ml Preparare: Se dizolvă componentele sau mediul gelozat comercial în apă distilată prin încălzire până la fierbere.......... acesta să fie 7............ timp de 15 minute.................. 1....................5°C........................................... Mediul poate fi conservat timp de 1 lună............ 100ml Pag 7 .... Mediu de bază Compoziţie: Triptonă ....

...................... Se poate utiliza plasmă de iepure proaspătă sterilă şi apă sterilă... 2........... acesta să fie 7.......... Se lasă să se decanteze...... timp de 20 de minute....... Înainte de a fi utilizat........ apoi lichidul supernatant se sterilizează prin filtrare..5g Extract deshidratat de inimă de bou .... în eprubete.........0g Glucoză .......... Se ajustează pH-ul astfel încât....5°C....................................... Soluţia poate fi conservată maxim o lună la temperaturi de 0°C-5°C....... timp de 18-24 de ore............... câte 10 ml... Emulsie de gălbenuş de ou (cu o concentraţie de circa 20%) Este recomandată utilizarea preparatului comercial............... Se completează cu apă până la volum final..... care se rehidratează conform instrucţiunilor fabricantului.... Se adaugă o soluţie de EDTA (acid etilen-diamino-tetra acetic) (plasma oxalată sau heparinizată nu necesita EDTA).....MICROBIOLOGIE SPECIALA .... Emulsia poate fi conservată maxim 72 de ore. Se sterilizează prin filtrare............. Pag 8 ..... Se încălzeşte amestecul pe baia de apă reglată la temperatura de 45±5°C apoi se menţine la temperatura de 0°C-5°C...... Mediul poate fi conservat timp de mai multe luni la temperatura de 0°C-......................5°C........... 12................... în raport de 1:3............................................ Plasmă de iepure Se foloseşte plasmă de iepure deshidratată din comerţ........ 5............................................ 5.................1% EDTA în plasma rehidratată... Se amestecă gălbenuşurile cu un volum de apă egal cu de patru ori volumul lor.............5g Apă ................4................ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE Preparare: Se dizolvă piruvatul de sodiu într-un volum de apă..... 2.............4 la temperatura de 25°C............. 10g Extract deshidratat din creier de viţel ........ 2.. Bulion de inimă-creier Compoziţie: Peptonă ........ astfel încât să se obţină o concentraţie de 0... Se sterilizează mediul la temperatura de 121°C.. 1. fiecare lot de plasmă trebuie controlat cu tulpini de Staphylococcus aureus slab şi intens pozitive.... În lipsa preparatului comercial emulsia se va prepara respectând cu stricteţe următoarea reţetă: Se folosesc două ouă proaspete de găină şi se separă gălbenuşurile de albuşuri..........0g Ortofosfat disodic (Na2HPO4) ..... Se repartizează mediul de cultură..... 3......... aducând la fierbere... 1000 ml Preparare: Se dizolvă componentele sau mediul complet în apă... la temperaturi de 0°C-............. după sterilizare......0g Clorură de sodiu .. precum şi cu tulpini de stafilococi coagulazo-negativi....

După o perioada de 24 h la temperatura de 30°C se face o ultimă izolare (pe geloza Oxford sau PALCAM). Acest mediu se termostatează timp de 2 zile la temperatura de 25°C. Bulioanele de îmbogăţire pentru Listeria.ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE GENUL LISTERIA Genul Listeria monocytogenes. acid nalidixic. se izolează şi se retermostatează timp de 24 h la temperatura de 30°C. TEHNICI DE IZOLARE Izolarea bacteriei Listeria monocytogenes se realizează adesea pe geloza Oxford sau PALCAM. Îmbogăţirea se realizează de obicei în două etape: se termostatează mai întâi. esculină şi citrat de fier. se reizolează şi se face repicarea pe UVM II. metodă bazată pe caracterul psihrofil. polimixină B şi acriflavină. UVM I. dar conţine clorura de litiu şi citrat de fier. timp de 4 h. apoi se realizează o repicare pe mediul de izolare. acidul nalidixic şi acriflavina sunt agenţii selectivi ai mediului. Selecţia se datorează clorurii de litiu Pag 1 . II se bazează pe aceiaşi agenţi selectivi: acriflavina (12 mg/l pentru UVM I şi 25 mg/l pentru UVM II) şi acid nalidixic. Se utilizează apoi (făcându-se eventual prelevări la timpi diferiţi) un bulion de îmbogăţire care conţine ramnoză. cuprinde 7 specii. albastru de metilen. Bulionul de îmbogăţire pentru Listeria (LEB) permite evidenţierea bacteriei Listeria monocytogenes: Cicloheximida. Produsul de analizat este menţinut la temperatura de 4°C (eventual în tampon PBS) sau preîmbogăţit într-un bulion cu triptoză la temperatura de 4°C. Mediul este termostatat timp de 24-48 h la temperatura de 30°C.MICROBIOLOGIE SPECIALA . pe UVM I. Bulionul Fraser este un mediu asemănător mediului UVM. Înnegrirea mediului indică posibila prezenţă a bacteriilor din genul Listeria. Se poate utiliza şi un bulion cu acridină sau mediul de îmbogăţire Feindt. TEHNICI DE ÎMBOGĂŢIRE Îmbogăţirea se poate realiza cu o metodă la rece (metoda Gray). care conţine acridină (tripaflavină) şi tiocianat de potasiu. Esculina (hidrolizată de Listeria) este în acest mediu un agent de diferenţiere. Alte medii permit să se efectueze o îmbogăţire la temperatură clasică de 30-37°C. Geloza Oxford conţine amidon. dintre care cea mai important ă este L.

Se pot utiliza şi alte medii: geloză Mac Bride cu feniletanol şi cicloheximidă. aureus. urează (-). manitol. Aceste medii sunt foarte selective. glicină ş i ceftazidină). unghi 45°) coloniile apar albăstrui şi granuloase (testul de iluminare Henry). geloză nutritivă cu acridină şi acid nalidixic. aureus şi de Rhodococcus equi. ID32 (Biomerieux). oxidazo -. monocytogenes şi L. aero-anaerobi. Bacteriile din genul Listeria sunt bacili mobili. Listeria monocytogenes formează colonii verde-oliv cu halou negru. fosfomicină. perpendicular pe aceştia. etc. Selecţia este datorată prezenţei clorurii de litiu şi inhibitorilor: ceftazidină. Geloza PALCAM conţine glucoză. în timp ce L. Geloza cu esculină este inoculată prin înţepare şi termostatată timp de 48 h la temperatura de 37°C. colistină. amidon. monocytogenes. Speciile genului Listeria şi. se inoculează o tulpină de S. TEHNICI DE IDENTIFICARE Identificarea este realizată după repicare timp de 24 h la temperatura de 35-37°C pe o geloză TSYEA. ivanovii produce hemoliza cu R. Pag 2 . Principalele caractere biochimice studiate pentru identificarea genului sunt: VP (+). polimixină şi ramnoză. Adaosul de CCCFA poate fi înlocuit de un amestec de colistină şi moxalactam. H2S (-) etc. în particular. Caracterul hemolitic este studiat cu testul Camp. catalazo +. esculină şi citrat de fier. geloză cu sânge suplimentată cu acid nalidixic. dau un răspuns pozitiv (culoare neagră). RM(+). Pentru identificare rapidă se pot utiliza următoarele teste: API Listeria (Biomerieux). După o perioadă de termostatare de 24 h la temperatura de 37°C. polimixină şi acriflavină.ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE şi amestecului de inhibitori CCCFA (cicloheximidă. Folosind un fascicul luminos oblic (lumină albă. L. geloză LCA (geloză inima-creier conţ inând clorura de litiu. acriflavină). translucide şi cu margini neregulate. dar pe ele pot creşte stafilococi şi enterococi (colonii galbene datorate fermentaţiei manitolului din mediul PALCAM). Listeria monocytogenes formează colonii verde-oliv cu halou negru. polimixina şi ramnoză. indol (-). seeligeri produc hemoliza β cu S. sistemul VITEK Biomerieux (VITEK GPI). geloză cu sânge sau geloză Columbia sau tripticază soia conţinând acid nalidixic. După o perioadă de termostatare de 24-48 h la temperatura de 37°C.MICROBIOLOGIE SPECIALA . cefotetan. equi. L. Micro ID (AES). Tulpinile de studiat se inoculează prin metoda striilor pe o geloză cu sânge de oaie şi. care conţine în plus tiamină. geloză Despierre. Pe acest mediu coloniile sunt mici (1-2 mm).

MICROBIOLOGIE SPECIALA . welshimeri L. innocua L. murrayi .Variabil N . imunofluorescenţă cu anticorpi fluorescenţi (Difco) poli Listeria. grayi Caracteristica V - + + + + + + + + + + V + + + V N + V V N V + V V . Listeria Tek Elisa (Sistem Organon Technika/AES). În tabelul 1 sunt prezentate caracteristicile bacteriilor din genul Listeria.Nedeterminat Pag 3 L. Tabelul 1 Caracteristicile bacteriilor incluse în genul Listeria L. Listeria Micro ID Listeria (Organon-Technika).ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE Pentru detectarea şi identificarea speciilor genului Listeria se folosesc şi metode imunologice: imuno-analiza ELFA (Vidas Biomerieux): identificarea genului Listeria şi L. equi) Nitrat reductază Amidon Ramnoză Xiloză Manitol Hipurat + + - L. Assurance IA pentru Listeria (Biocontrol). ivanovii L. monocytogenes kit-ul TECRA (3M) de detectare imunologica prin microplăci pentru Listeria. aureus) Testul Camp (R. seeligeri L. Liste Test (AES): îmbogăţire prin captură imunomagnetică şi confirmare imunoenzimatică după izolarea în placă Petri şi replicare pe membrană (numărare în 24h). Kit Transia utilizând microplăci (ELISA sistem "sandwich"). monocytogenes β-hemoliză Testul Camp (S. Clearview Listeria test (Unipath).

Bacteriile genului Bacillus sunt catalazo+. coagulans. Bacillus subtilis). grupa V sau grupa Bacillus thermophilus: specii cu spori de tip 2 (include B. sunt sferici sau ovali. stearothermophilus şi B. metabolism strict aerob. grupa II sau grupa B. după Priest. Sporii nu se colorează prin colorare Gram. se disting următoarele grupe: grupa 1: spori ovali nedeformanţi. de multe ori se realizează doar izolarea sau numărarea.MICROBIOLOGIE SPECIALA . care includ caracterul respirator sau fermentativ. Principiul de selecţie al formelor sporulate este bazat pe proprietăţile de termo-rezistenţă ale sporilor şi pe caracterul aerob sau aero-anaerob al celulelor vegetative. cu perete subţire (ex. Se clasifică în funcţie de morfologia sporului studiat prin examen microscopic sau în funcţie de mai multe criterii. aerobe sau anaerobe. polymyxa).). fiind poziţionaţi central sau terminal. grupa III sau grupa B. grupul 3: spori sferici deformanţi (B. B.ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE GENUL BACILLUS Bacillus cereus Bacteriile aparţinând genului Bacillus sunt bacterii Gram+. alvei. grupa 2: spori ovali deformanţi cu perete subţire (B. circulans. macerans etc. cu capetele drepte sau rotunjite. singulare sau asociate în unghiuri (Bacillus subtilis) sau lanţuri. mobile. grupa IV sau grupa B. pasteurii. cu dimensiuni diferite. Dacă se ţine cont de forma şi dispunerea sporului. polymyxa: specii cu spori de tip 2. cu diametru mai mic sau egal decât al celulei. B. cu celule de formă cilindrică. metabolism facultative anaerob cu fermentaţie acidă (include B. B. se definesc următoarele grupe: grupa I sau grupa B. sphaericus: specii cu spori de tip 3. subtilis: specii cu spori de tip 1. metabolism aerob cu fermentaţie acidă. Dacă se consideră ansamblul caracterelor. brevis: specii cu spori de tip 2. grup subdivizat în 6 subgrupe. TEHNICI DE IZOLARE Izolarea şi numărarea bacteriilor sporulate aerobe se pot aplica fie formelor sporulate singure. astfel încât. Proba plasată într-o eprubeta este supusă unei încălziri de 10 min pe baie de apă. fie ansamblului de forme vegetative şi sporulate. B. termofilia. Aptitudinea de a sporula poate fi pusă în evidenţa prin testul termorezistenţei (10 min la temperatura de 80°C). etc. la o Pag 1 . sphaericus). stearothermophilus).

Aceştia se prezintă sub forma de particule endocelulare. În unele cazuri particulare tratamentul termic se poate face prin menţinere timp de 10 min la temperatura de 100°C.polimixina MYP). În continuare. uscate. compus care poseda proprietăţi de stimulare a germinării şi de detoxificare.gălbenuş de ou . poate fi şi el utilizat: B. Coloniile de Bacillus cereus sunt rugoase. actidionă şi gălbenuş de ou. Mediul de izolare şi de numărare al bacteriilor sporulate aerobe selectate prin tratament termic nu trebuie să fie specific. Uneori. înconjurate de un precipitat de gălbenuş de ou. Geloza nutritivă obişnuită cu gălbenuş de ou permite diferenţierea speciilor lecitinazo + şi -. Aceasta serveşte apoi la efectuarea unei serii de diluţii destinate numărării bacteriilor pe mediu cu geloză.albastru de bromtimol .2% amidon solubil. Mediul Reuter conţine piruvat. mediu selectiv pentru B. Pentru numărarea formelor vegetative (numărare realizată pentru anumite specii) trebuie să facă apel la medii mai selective sau de diferenţiere. Numărarea în mediu lichid pe bulion glucozat cu BCP sau bulion TSB (bulion triptonă soia) este mai puţin specifică. sporii manifestă fenomenul de repaus. ! TEHNICI DE IDENTIFICARE Capacitatea de sporulare Bacilii sunt caracterizaţi prin capacitatea de sporulare şi prin producere de catalază. gălbenuşului de ou şi polimixinei. În acest caz. cel mai frecvent folosite sunt geloza glucozată conţinând BCP sau laptele gelozat. aceste două medii fiind îmbogăţite cu 0. fiind urmarea unui anumit grad de anaerobioză care poate să existe la baza eprubetelor. care să favorizeze germinarea sporilor. Mossel a descris un mediu de izolare pentru Bacillus cereus. tiocianat. deoarece. roşului de fenol. Mediul PEMBA (polimixina . sferice sau ovale. dantelate. cereus formează colonii albastre.manitol . sporii de bacterii din genul Bacillus. care au rezistat tratamentului termic şi pot apoi să se dezvolte în condiţii aerobe. ceea ce generează o întârziere a dezvoltării lor.agar). Alte medii se bazează pe un principiu asemănător (geloză manitol . în plăci Petri. necolorate şi alunecoase. În toate cazurile poate fi realizată o colorare Pag 2 . roz (manitol -) şi înconjurate de un halou albicios (produşi de hidroliză insolubili formaţi pornind de la lecitină). practic. nu mai au concurenţi. este necesar să se utilizeze un mediu bogat.MICROBIOLOGIE SPECIALA . care este bazat pe prezenţa manitolului.ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE temperatură de 70-80°C. Prezenţa sporilor poate fi pusă în evidenţă direct prin examinare microscopică a unui frotiu colorat prin metoda Gram. Pentru numărare sau izolare pe mediu solid.gălbenuş de ou . sporii supravieţuitori corespund speciilor termorezistente. clorurii de sodiu. cereus. Fenomenul este limitat prin adăugarea în mediu a amidonului. Termostatarea diferenţiată a mediilor permite selecţionarea următoarelor grupe de bacili: bacili mezofili (termostatare la temperatura de 30°C) şi bacili termofili (termostatare la temperatura de 55°C).

apoi spălat rapid.frotiul fixat termic (20 de treceri ale lamei prin flacără) este colorat timp de 10 min cu ajutorul unei soluţii apoase. Frotiul este recolorat cu safranină 25% timp de 15 min. Caractere fiziologice În afara de prezenţa şi morfologia sporului. mediul Schaeffer. doar câteva specii rare nesporulate sunt capabile să reziste acestor condiţii.ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE specifică. După 10 min de contact şi după o spălare abundenta cu apă. eventual cu o colorare specifică.preparatul uscat este fixat în alcool. tipul respirator . Cultura este apoi inoculată prin înţepare pe un bulion nutritiv şi termostatată la temperatura de 30°C.004% sulfat de mangan (agent ce favorizează sporularea). după care este spălat cu apă. timp de 2-3 zile sau mai mult. După spălare. identificarea se bazează pe următoarele caractere (termostatarea are loc la temperatura de 30°C timp de 24 h sau mai mult): termorezistenta sporilor . Sporii sunt coloraţi în verde. dar este mai puţin sigură decât precedenta. diferenţa depăşeşte 5 (∆ log10N > 5). Acest test constă în inocularea unui bulion cu extract de drojdie şi glucoza (YG) dintr-o eprubetă. Capacitatea de sporulare poate fi pusă în evidenţă şi prin testul de termorezistenţă: o cultura în vârstă de 3-10 zile. dintre care citam doar două: metoda Moeller modificată . După termostatare se observa dezvoltarea. Suprafaţa mediului se acoperă cu un strat de parafină lichidă. uscat şi examinat. Se spune că sporii sunt termorezistenţi dacă se observă o diferenţa mai mică de două reducţii decimale (∆ Iog10N < 2). Operaţia de colorare se repetă de doua ori. apoi este spălat rapid cu apă. până la evaporare. Pentru caracterizarea sporilor sunt utilizate mai multe colorări specifice. Frotiul este apoi decolorat cu alcool absolut. metoda Bartholomew şi Mittwer .după cultivare pe un mediu de sporulare. Frotiul este apoi recolorat cu câteva picături de albastru de metilen diluat timp de 30 s. lama este acoperit ă cu fucsina şi este încălzită uşor la flacăra unui bec Bunsen. când sunt sensibile. timp de 10 min. aceasta presupunere trebuie confirmată întotdeauna printr-un examen microscopic. Pag 3 . mediul SEC. inoculată pe un bulion nutritiv obişnuit conţinând 0. se presupune că a existat sporulare.este studiat prin inocularea unei geloze profunde VF sau pe mediu glucozat în anaerobioză. Diverse alte medii favorizează sporularea: mediul Duncan şi Strong. după regenerare. iar corpul bacterian în roşu. Această metodă este mai practică. este supusă timp de 10 min la încălzire pe baie de apă la temperatura de 80°C. mediul Ellner. apoi cu acid clorhidric 1/3. cu apă rece. Frotiul se acoperă cu câteva picături de acid cromic 5%. etc. Dacă există dezvoltare microbiană. lama este uscată şi conservată. de verde malahit.MICROBIOLOGIE SPECIALA . mediul glucozat obţinut cu carne fiartă. se compară numărul sporilor care rezistă la un tratament de 10 min la temperatura de 80°C şi la un tratament de 5 min la temperatura de 95°C. saturate. Sporii sunt coloraţi în roşu şi corpul bacterian în albastru.

hidroliza lecitinei . eprubetele sunt aşezate în poziţie semi-înclinată. După solidificarea mediilor.studiul fermentării glucidelor este bine să se realizeze pe un mediu gelozat pentru studiul fermentaţiilor. producerea de acetoină (test Voges Paskauer: VP) . hidroliza cazeinei . producere de indol. termostatat şi examinat. evidenţierea ureazei. De asemenea. Acest ultim test permite studierea acidifierii şi producerii de gaz. în mod clasic.MICROBIOLOGIE SPECIALA . celobioza şi zaharoza. prezenţa glucozei inhibă parţial creşterea anumitor specii. hidroliza amidonului .004% roşu de fenol în care se introduce un tub Durham.ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE fermentarea glucidelor . Acest mediu termostatat în anaerobioză permite diferenţierea bacteriilor Bacillus şi Clostridium prin reacţia LV legată de haloul caracteristic obţinut: tulpinile LV+ formează precipitat şi o zonă luminoasă (reacţia Nagler la lecito-vitelina). este posibil să se utilizeze bulion nutritiv adiţionat cu 0. Acest mediu nu conţine peptonă (mediu semisintetic). altul fără glucoză. amoniu ca singură sursa de azot şi un indicator de pH (mediu Knigh şi Proom) este inoculat.este pusă în evidenţă.se studiază printr-o metodă clasică (Frazier). ramnoza. Utilizarea glucidelor se manifesta prin virajul culorii indicatorului. pe geloză nutritivă obişnuită conţinând 10 g/l amidon solubil. hidroliza gelatinei .un mediu conţinând glucoza. după care se inoculează prin înţepare şi se incubează. unul cu glucoză (1%). comportamentul faţa de temperatură.este pusă în evidenţa în mod clasic pe geloză cu lapte. în plăci Petri.este evidenţiat ă prin reacţia O'Meara după o perioadă de 2-10 zile de cultivare pe mediul Smith. pH 7. Culturile sunt testate la temperatura de 60°C.este studiată în mod clasic. pH 6 şi la temperatura de 65°C. După introducerea glucidului (0. arabinoza. utilizarea citratului. prin inocularea unei geloze nutritive obi ş nuite cu g ă lbenu ş de ou (10%) sau pe mediu McLung. se repartizează în plăci Petri. întârzierea creşterii ca urmare a prezentei glucozei . Două medii cu geloză nutritivă obişnuită. manitolul. Aceste ultime teste sunt realizate cu medii şi metode clasice. alte testări: cultivare pe lapte turnesolat. acestea sunt inoculate prin striere şi prin înţepare în zona centrala. pH şi clorura de sodiu – acest studiu este realizat pe bulion nutritiv sau geloză nutritivă obişnuită.5%) în mediile fluidificate. Glucidele testate sunt glucoza. în prezenţa a 10% clorură de sodiu. Pag 4 . reducere de nitraţi. acidificare pe mediul glucoza amoniu . xiloza şi eventual lactoza.pe mediul peptonat. Se observă diferenţele dintre culturi. specific bacteriilor.

în cazuri particulare fiind mai mare. În acest caz. care dau celulelor formă de suveică sau paletă. mobile. nu este posibilă utilizarea acestei tehnici. termostatate în anaerobioză. câteva specii rare sunt aero-tolerante. Acest ultim mediu este folosit ca diluant pentru operaţia de numărare.ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE GENUL CLOSTRIDIUM Clostridium perfringes Bacteriile aparţinând genului Clostridium sunt bacterii Gram +. Sporii tuturor speciilor de Clostridium pot fi Pag 5 . Când termorezistenţa sporilor este scăzută sau când se doreşte să se tină cont de celulele vegetative. Pentru num ărare se utilizează fie tehnica pe mediu lichid sau solid în eprubetă. Reprezentanţii genului Clostridium sunt catalazo . cât şi pentru diluări. Sunt utilizate tehnicile clasice de cultivare în anaerobioză: condiţiile de anaerobioză trebuie respectate atât pentru cultivări. În afara de termorezistenţa sporilor. eventual adiţionat cu amidon. permiţând astfel dezvoltarea speciilor de Clostridium (de ex. sau mediu RCM (Reinforced Clostridium Medium sau mediul Hirch şi Grinsted). deoarece facilitează prelevarea coloniilor izolate pentru studiile ulterioare. Selecţ ia formelor sporulate este realizata prin încălzire timp de 10 min la temperatura de 80°C. folosind un mediu reducător sau protejat de parafină. Totuşi. Principiul de izolare şi numărare al bacteriilor din genul Clostridium este foarte apropiat de cel indicat pentru bacteriile genului Bacillus. care formează endospori dispuşi central sau terminal. TEHNICI DE IZOLARE Tehnici generale Bacteriile sporulate anaerobe sunt cultivate pe medii foarte reducătoare.MICROBIOLOGIE SPECIALA . selecţia este bazată pe cultivarea în anaerobioza strictă (sau în mediu foarte reducător).şi sunt strict anaerobi. va trebui să se folosească medii conţinând compuşi inhibitori specifici. Aceasta ultima metodă este preferabilă. fie tehnica de numărare pe mediu solid în plăci Petri. cu celule de formă cilindrică cu dimensiuni mai mari decât cele din genul Bacillus. antibioticele). Temperatura de termostatare variază între 30 şi 37°C. singure sau în lanţuri. cum ar fi mediul VL sau VF (lichid sau semi-solid) sau chiar pe medii lichide protejate de oxigenul din aer printr-un strat de parafină: mediu Rosenow simplu sau cisteinat.

Mediul Wilson Blair pentru Clostridium permite punerea în evidenţă a sulfito-reductorilor. cu îmbogăţire de CO2): coloniile colorate în negru sunt colonii prezumtive de Clostridium perfringens. prin inoculare în mediul RCM gelozat (geloză Hirch şi Grinsted) adiţionat cu amidon şi repartizat în eprubete sau plăci Petri (în acest caz. care este termostatat la temperatura de 37°C.05%. şi termostatată la o temperatura de 37°C. care este termostatat la temperatura de 46°C. Metoda este aplicată după realizarea pasteurizării. care este termostatat la temperatura de 46°C. celulelor vegetative.cicloserină. în general la o temperatura de 30-37°C timp de 24-48 h. Pag 6 . lactozo+. de exemplu bulion VL sau VF . prin compoziţia lor chimică. termostatarea trebuie să aibă loc obligatoriu în mediu anaerob). uneori. Confirmarea se poate face repicând coloniile pe geloza Willis şi Hobbs cu ou.MICROBIOLOGIE SPECIALA . care formează colonii negre. Sporii de Clostridium sulfito-reductori pot fi izolaţi şi număraţi utilizând medii conţinând sulfit.sulfit . Izolări specifice Există medii de izolare relativ specifice pentru grupele de Clostridium. gelatino+. Nu mai precizam că aceasta cultură trebuie să aibă loc în anaerobioză.ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE izolaţi şi număraţi după încălzirea necesară realizării selecţiei. mediul SPS Angelotti cu polimixină şi sulfadiazină. ca urmare a puterii reducătoare a mediului utilizat. Este vorba de mediul TSN Marshall cu neomicina şi polimixină. adaptate sporilor şi. deoarece acest fapt nu mai este necesar. Există medii bazate pe acelaşi principiu. conţinând cistină (sau pe mediu Rosenow). timp de 24-48 h. După inocularea mediului fluidificat şi omogenizare prin răsturnare. Termostatarea se efectuează în anaerobioză (eventual. Unele specii trebuie termostatate la temperaturi superioare. Pentru numărări în medii lichide se poate utiliza mediul Rosenow sau alte medii lichide enunţate mai sus. pe a cărei jumătate din suprafaţă se depun câteva picături de ser anti Clostridium perfringens (6000 unităţi/ml). care sunt specifice pentru Clostridium perfringens şi care. Cea mai bună concentrate de sulfit pe care trebuie să o conţină mediul este de 0. Se poate confirma apartenenţa la specie prin teste simple: nitrat reductazo +. Mediile studiate sunt inoculate pornind de la o cultură pe mediu lichid reducător. Pentru aceasta numărare este posibil să se utilizeze geloză VF sulfit. eprubeta este răcita imediat. Coloniile care nu se vor dezvolta pe mediul adiţionat cu toxine sunt desigur Clostridium perfringens. permit evitarea pasteurizării şi selecţionarea deodată a formelor vegetative şi a sporilor. plasată într-o placă Petri. însa ea elimină unele specii sulfito-sensibile. TEHNICI DE IDENTIFICARE Identificarea lui Clostridium este bazată pe studiul morfologiei sporilor şi caracterelor biochimice. sau de mediul TSC triptoză . prin imersie în apă rece. Termostatarea are loc obligatoriu în mediu reducător sau în anaerobioză.

peptonizarea eventuală a coagulului. Morfologia sporului Morfologia sporului este studiată prin examen microscopic pe un frotiu colorat Gram sau prin colorarea specifică a sporilor. Se poate efectua experimentul şi într-o placa Petri. coagul alveolar (+/-). producerea de gaz se indică prin deplasarea dopului de parafină. puterea reducătoare se manifestă prin decolorarea mediului. Mobilitatea Mobilitatea este observată între lamă şi lamelă. Virajul indicatorului la verde indică prezenţa bacteriilor reducătoare. un fragment redus de creier şi o bucăţică de marmura albă. folosind geloza Columbia îmbogăţită cu albumină serică bovină.ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE Acţiunea pe mediu Rosenow Acesta este un mediu lichid reduc ător recomandat pentru cultivarea bacteriilor anaerobe. Examenul poate fi realizat pornind de la o cultură mai veche obţinută în mediul Rosenow. mediul este inoculat şi acoperit cu un strat de parafină sterilă. retracţia coagulului (+/-). Pag 7 . Nu este absolut necesar să se parafineze eprubetele. Hidroliza gelatinei Hidroliza gelatinei este studiată utilizând un disc de gelatină Kohn cu cărbune.1% sulfat de magneziu. se examinează aspectul laptelui şi se remarcă următoarele: coagulare (+/-). peptonă.MICROBIOLOGIE SPECIALA . După termostatare. printre altele. Sporularea nu intervine în toate mediile.5% extract de came şi 0. Conţine. examinarea acestui mediu permite studierea următoarelor caracteristici: fermentaţia glucozei se indică prin virajul indicatorului de la roz la roşu: acest viraj trebuie să fie observat la începutul cultivării. Anaerobioza se obţine cu ajutorul unui strat de parafină. Acţiunea asupra laptelui cu cisteină Cultivarea este realizată în eprubete cu lapte cisteinizat după regenerare. După o regenerare de 15 min realizată pe baie de apă la fierbere şi răcire. deoarece contactul cu aerul inhibă rapid mobilitatea. Unele bacterii sporulează greu în mediu artificial: este cazul lui Clostridium perfringens care trebuie cultivat pe ser din carne de cal cu 0. care asigură anaerobioza. iar examinarea trebuie realizată rapid. glucoză. un indicator colorat. care se plasează pe mediul Rosenow. degradarea gelatinei este indicată de eliberarea particulelor de cărbune. pornind de la o prelevare efectuată din mediul Rosenow. în anaerobioză. Prelevarea trebuie efectuată la formarea biomasei de celule. Sporii nu se formează uneori decât pe medii uşor alcaline. peptonizarea fără coagulare. După termostatare. După o termostatare de 24 h sau mai mult.

acidifierea (îngălbenirea) şi lichefierea gelatinei sunt puse în evidenţă pentru C. pentru a sesiza dacă exista aciditate sau nu.MICROBIOLOGIE SPECIALA . astfel încât inoculul să rămână pe fundul eprubetei. se introduc în mediul de cultură 10 picături dint-un indicator de pH. adăugate în proporţie de 1%: maltoză. când cantitatea produsă este mică. dar fără amestecare. Pag 8 . Producerea hidrogenului sulfurat provoacă înnegrirea mediului. în anaerobioză. Caracterul hemolitic Caracterul hemolitic este determinat prin inocularea pe suprafaţa unui mediu solid îmbogăţit cu 10% sânge de oaie sau de cal defibrinat sau cu citrat. După 24 h sau mai mult de termostatare la temperatura de 37°C. Producerea indolului Este pusă în evidenţă prin cultivarea pe mediu VL sau VF semisolid în eprubete. după 24 h de termostatare la temperatura de 37°C. la temperatura de 37°C. Producerea hidrogenului sulfurat şi evidenţierea caracterului sulfito-reducător Producerea de H2S este pusă în evidenţă pe mediul VL (sau VF) semisolid sau solid. cu condiţia ca el să aibă o suprafaţă de contact cu aerul extrem de redusă (eprubet ă mică). sau în galben. Mediul este regenerat înainte de folosire şi se completează cu unul din următoarele glucide. sau prin înţepare centrală profundă. ca martor. prezenţa gazului. perfringens. lactoză. glicerol. TEHNICI DE EVIDENŢIERE A TOXINELOR Enterotoxina de Clostridium perfringens Enterotoxina produsă de Clostridium perfringens (CPE) poate fi pusă în evidenţa prin aglutinare pasivă pe reversul particulelor de latex: PET-RPLA (Oxoid). Nu este necesară parafinarea acestui mediu reducător. Este recomandat să se inoculeze şi o eprubetă fără glucid. amidon şi eventual alţi compuşi. Se pot utiliza geloze "sulfit" sau "sulfit-fier". zaharoză. Producerea acetoinei Acetoina este evidenţiată după cultivare pe mediu lichid VL (sau VF) prin reacţia Voges Proskauer. manitol. când cantitatea de acid este mare. apoi prin caracterizare cu reactivul Kovacs sau Ehrlich. Pe mediul gelatina-lactoză.ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE Studiul fermentaţiei glucidelor Acest studiu este realizat cu ajutorul medii lor VL. xiloză. îmbogăţ it cu 0. acidifierea este indicată de virajul în roşu al mediului.3 g/l hiposulfit de sodiu. care este apoi termostatat. Cu indicatorul universal Prolabo.2 g/l sulfat feros şi cu 0. Inocularea mediului este realizată în masă. VF sau TY semisolide. după regenerare.

85% şi 0. se examinează apoi hemoliza: martorul îmbogăţit cu antitoxina a trebuie să fie negativ. După centrifugare timp de 10 min la 20 000 rpm la temperatura de 5°C. După 20 min de centrifugare la 14 000 rpm la temperatura de 5°C şi filtrarea supernatantului.MICROBIOLOGIE SPECIALA .85%. Pag 9 . Se poate evidenţ ia activitatea lecitinazei pe eşantioanele rămase. Se realizează un martor prin amestecarea a 0. 0.25 ml de dializat. Aceasta toxină este stabilă la frig şi rezistentă în condiţiile în care celulele mor (congelare).45 µrn) apoi dializat faţă de polietilenglicol 20 000. supernatantul este filtrat (pori de 0. activitatea lecitinazei se manifestă prin limpezirea mediului (martorul îmbogăţit cu antitoxina α dă o reacţie negativă). Se mojarează. Din fiecare eşantion se introduce o cantitate mică în decupaje şi după 24 h de termostatare la temperatura de 35°C. Concentraţia se poate considera direct proporţională cu numărul de bacterii producătoare. adăugând un volum de gălbenuş de ou (în clorura de sodiu 0. în care se fac decupaje de 3 mm diametru. Hemoliza este pusă în evidenţă pe o geloză cu sânge.85%).1 ml antitoxina α.ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE Există o metodă indirect ă de detectare a enterotoxinei de Clostridium perfringens (tip A) prin titrarea α-hemolizinei (toxina α sau fosfolipază C).25 ml de clorură de sodiu 0. Dializatul este diluat binar în proporţie de 1/256 în clorura de sodiu 0. 5 g de aliment în 100 ml de tampon HEPES. timp de 2 min.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful