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7 Cinetique Et Stochiometrie

7 Cinetique Et Stochiometrie

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Cinétique et stochiométrie

A. Garnier
GCH-2103
A-2010
Cinétique et stochiométrie
 Définition
 Les termes de base
 Les modes d’opération
 Les relations de base
 Détermination théorique
 Détermination expérimentale
– Taux initiaux
– Cuvée
– Chemostat
– Stop flow


Croissance cellulaire - variables
X S P
Taux de variation
(kg/(m
3
.s)
dX/dt dS/dt dP/dt
Taux de production
/consommation
r
x

r
s
r
p
Taux spécifique
(kg/(kg.s)
µ = r
x
/X q
s=
-r
s
/X q
p=
r
P
/X
Rendement (kg/kg) Y
x/s
= r
x
/r
s

= µ/q
p
Yp/x, Yp/s
Mode d’opération
 Système fermé: cuvée (batch)
•Aucune entrée ou sortie

•Régime transitoire

•dX/dt = r
X
, dS/dt = r
S

•À t = 0, X = X
0
, S = S
0

Cuvée alimentée (Fed-batch)
•Alimentation seulement

•Régime transitoire

•À t = 0, V= V
0
, X= X
0
, S= S
0

•F sera contrôlé de manière à
maintenir S constant, S=S
0
=S
c

•Si S est constant, µ le sera aussi,
µ= µ
c

F(t), S
in
V, X, S
Chemostat (continu, CSTR)
F, S
in
V, X, S, P
F, S, X, P

•Une entrée, une sortie

•Mélange idéal:
X
out
= X, S
out
= S, P
out
= P

•Après une période initiale
d’adaptation, ce système
atteindra un régime permanent:

V= cst, X= cst, S= cst, P= cst
Chemostat avec recirculation
F F(1+w)

V, X
Bioréacteur Décanteur
F(1+w)

wF, X
x
F
c
, X
c
F
ex
, X
x
•Permet de
concentrer les
cellules dans le
bioréacteur
•Permet de
repousser le
lavage
•Développement
pour X seulement
Croissance cellulaire –type de modèles
STRUCTURÉ/
SÉGRÉGÉ
NON-
STRUCTURÉ
STRUCTURÉ
NON-
SÉGRÉGÉ
+ simple
SÉGRÉGÉ
Structuré: Tient compte de métabolites intra-cellulaires
Ségrégé: Tient compte d’une distribution de population
Modèles de croissance
 Du plus simple au plus compliqué
– Exponentiel (ordre 0!!)
– Linéaire (logistique)
– Monod
– Autres
 Phénomènes connexes
– Maintenance
– Mortalité
 Production
– Luedeking-Piret combiné aux différents modèles
Modèle enzymatique - Monod
S K
S
S
MAX
+
·
=
µ
µ
X
dt
dX
· = µ
X
Y
X qs
dt
dS
S X
· = · =
/
µ
-Une variable indépendante, 3 variables dépendantes,
trois équations = Une solution!

(1)
(2)
(3)
-Pour un système fermé (cuvée) en supposant Y
X/S
constant:
Modèle de Monod
 Équation 3 n’est peut-
être pas nécessaire:


dt
dX
Y dt
dX
Y
X
Y dt
dS
s x s x s x / / /
1 1
= · = =
µ
µ µ
Xmax-X = Yx/s * S
Alors:
X
X X
Y
K
X X
Y
dt
dX
MAX
S X
S
MAX
S X
MAX
·
(
¸
(

¸

÷ +
(
¸
(

¸

÷
=
) (
1
) (
1
/
/
µ
X
X X Y K
X X
MAX S X S
MAX MAX
·
÷ + ·
÷ ·
=
) (
) (
/
µ
Modèle de Monod
X
X X Y K
X X
dt
dX
MAX S X S
MAX MAX
·
÷ + ·
÷ ·
=
) (
) (
/
µ
| |
} }
· =
(
¸
(

¸

· ÷
÷ + ·
t
MAX
X
X
MAX
MAX S X S
dt dX
X X X
X X Y K
0
/
0
) (
) (
µ
| |
} }
· =
(
¸
(

¸

· ÷
÷
+
· ÷
·
t
MAX
X
X
MAX
MAX
MAX
S X S
dt dX
X X X
X X
X X X
Y K
0
/
0
) (
) (
) (
µ
Modèle de Monod
| |
} }
· =
(
¸
(

¸

+
· ÷
·
t
MAX
X
X
MAX
S X S
dt dX
X X X X
Y K
0
/
0
1
) (
µ
a
x a x
x a x
) ln( ln
) (
1 ÷ ÷
=
÷
}
Sachant que:
| | t X
X
X X X
Y K
MAX
X
X
MAX
MAX
S X S
· =
(
¸
(

¸

+
(
¸
(

¸

÷ ÷
· · µ
0
) ln(
) ln( ln
/
t
X X
X X
X
Y K
X
X
X
X Y K
MAX
MAX
MAX
MAX
S X S
MAX
MAX S X S
· =
|
|
.
|

\
|
÷
÷
·
(
¸
(

¸

·
÷
|
|
.
|

\
|
·
(
¸
(

¸

+ ·
µ
) (
) (
ln ln
0
/
0
/
Modèle de Monod
t
X X
X X
X
Y K
X
X
X
X Y K
MAX
MAX
MAX
MAX
S X S
MAX
MAX S X S
· =
|
|
.
|

\
|
÷
÷
·
(
¸
(

¸
·
÷
|
|
.
|

\
|
·
(
¸
(

¸
+ ·
µ
) (
) (
ln ln
0
/
0
/
Modèle de Monod
0
2
4
6
8
10
12
0 2 4 6 8
temps (-)
X

(
-
)
0
4
8
12
16
20
24
S

(
-
) S = (Xmax-X)/Yx/s
Données
µmax= 1
Ks= 5
Yx/s= 0,5
So= 20
Xo= 0,1
Détermination théorique
 Cinétique…

 Rendement: modèles structurés
(stochiométriques et autres)
Une vue très simplifiée du métabolisme cellulaire
[C
6
H
12
O
6
]
n
C
6
H
12
O
6
G3P
glycerol
purines
pyruvate Acétyl-CoA
lactate
Acides gras
éthanol
Lipides
Ac.aminés pyrimidines
Cycle de
Krebs
Acides nucléiques
protéines
NAD+
ATP
H2O
NADH
ADP
O
2

Chaîne respiratoire
Le catabolisme génère de l’ATP
et du NADH
Modèle stochiométrique (cliquez ici)
Autres valeurs du coefficient de
rendement
(Bailey&Ollis, McGraw-Hill, 1986)
Détermination expérimentale
 Coefficient de rendement

 Cinétique
– Taux initiaux
– Stop-flow
– Cuvée
– Chemostat


Détermination expérimentale du
coefficient de rendement - Y
X/S
constant
t
X X
X X
X
Y K
X
X
X
X Y K
MAX
MAX
MAX
MAX
S X S
MAX
MAX S X S
· =
|
|
.
|

\
|
÷
÷
·
(
¸
(

¸
·
÷
|
|
.
|

\
|
·
(
¸
(

¸
+ ·
µ
) (
) (
ln ln
0
/
0
/
Modèle de Monod
0
2
4
6
8
10
12
0 2 4 6 8
temps (-)
X

(
-
)
0
4
8
12
16
20
24
S

(
-
) S = (Xmax-X)/Yx/s
Données
µmax= 1
Ks= 5
Yx/s= 0,5
So= 20
Xo= 0,1
Estimation des rendements en cuvée
Modèle de Monod -X vs S
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20
S (-)
X

(
-
)
Avec des données de t, X, S, on peut calculer,
Yx/s par un graphe de X vs S:

Ici, Yx/s = 0,5
Effet de maintenance
 AS = AS(croissance) + AS(maintenance)

 r
S
= 1/Y
G
* r
X
+ m * X

 q
s
= 1/Y
G
* µ + m

 1/Y
x/s
= q
s
/µ = 1/Y
G
+ m/ µ

Effet de maintenance
 1/Y
x/s
= q
s
/µ = 1/Y
G
+ m/ µ

1/Yx/s vs 1/mu
2
2,05
2,1
2,15
2,2
2,25
0 0,5 1 1,5 2 2,5
1/mu
1
/
(
Y
x
/
s
)
Effet de mortalité
 Le taux de mortalité cellulaire:

r
d
= - k
d
*X où k
d
=cste

 Donc en cuvée:

dX/dt = µ*X – k
d
*X = (µ– k
d
)*X


En général, on néglige la maintenance et la mortalité en cuvée
Mécanisme de débordement: effet sur la cinétique et
le rendement
glutamine
-Ljunggren and Haggstrom, Biotechnol. Bioeng., 44: 808-818, 1994 (Hybridoma)
GLUCOSE PYRUVATE
TCA cycle,
resp. chain
lactate
glucose pyruvate
GLUTAMINE
GLUTAMATE
OU
NH
3
NH
3
glutamate
Détermination de la cinétique –
Taux initiaux
Évaluation de qglc, qgln, qlact et qNH3
Systèmes d’analyse de cinétique rapide
Méthode de flux arrêté (Stopped-flow):
Un moteur va actionner 2 ou 3 seringues contenant les réactifs
qui seront mélangés.
Le mélange est ensuite aspiré dans la cuvette d’observation
par la seringue « stop ».
Systèmes d’analyse de cinétique rapide
Moteur
Mélangeur
Lumière
Détection
Moteur Moteur
Temps mort :
Temps pour lequel on ne peut
avoir de données (temps de
mélange)
De l’ordre de 1
milliseconde.

Réactif 1 Réactif 2
Les composés seront analysés par des méthodes
spectrophotométriques à l’aide de :
Systèmes d’analyse de cinétique rapide
 Photodiodes
 Dichroïsme circulaire
 Tube photomultiplicateur
 Matrice CCD (2048 longueurs d’ondes analysées en 3,5
millisecondes)

Systèmes d’analyse de cinétique rapide
Méthode de flux étanché (Quenched-flow) :
Méthode utilisées lorsqu’on ne dispose pas de méthodes
optiques satisfaisantes pour étudier l’apparition des produits et
des intermédiaires.
Il faut arrêter rapidement les réactions enzymatiques pour
pouvoir collecter les mélanges et les analyser.
Systèmes d’analyse de cinétique rapide
Méthode de flux étanché (Quenched-flow) :
Types d’étanchage :

 Étanchage chimique : Ajout d’acide ou de base
(ex. HCl 1M)
 Étanchage physique : Congélation ultra-rapide.
Moteur
Mélangeur
Moteur
Mélangeur
Récupération des
fractions
Systèmes d’analyse de cinétique rapide
Délai réactionnel
de l’ordre de 2 à
100 millisecondes
Chambre réactionnelle linéaire
Réactif 1 Réactif 2
Agent
étanchant
 Spectroscopie de masse « en ligne »
 Chromatographie HPLC ou en phase gazeuse
 Électrophorèse sur gel,
 Comptage à scintillation,
 etc…
Systèmes d’analyse de cinétique rapide
Les fractions recueillies sont analysées par des
méthodes non-optiques :
Estimation des paramètres de Monod en cuvée
 Puis on peut reformuler l’équation de X pour
isoler des termes reliés linéairement:
t
X X
X X
X
Y K
X
X
X
X Y K
MAX
MAX
MAX
MAX
S X S
MAX
MAX S X S
· =
|
|
.
|

\
|
÷
÷
·
(
¸
(

¸
·
÷
|
|
.
|

\
|
·
(
¸
(

¸
+ ·
µ
) (
) (
ln ln
0
/
0
/
÷t
÷t
(
(
(
(
(
¸
(

¸

|
|
.
|

\
|
÷
|
|
.
|

\
|
÷
÷
·
(
¸
(

¸
·
+ =
(
(
(
(
(
¸
(

¸

|
|
.
|

\
|
t
X
X
X X
X X
X
Y K
t
X
X
MAX
MAX
MAX
S X S
MAX
0 0
/
0
ln
) (
) (
ln ln
µ
Y = b + m X
Monod – estimation des paramètres
(
(
(
(
(
¸
(

¸

|
|
.
|

\
|
t
X
X
0
ln
(
(
(
(
(
¸
(

¸

|
|
.
|

\
|
÷
|
|
.
|

\
|
÷
÷
t
X
X
X X
X X
MAX
MAX
0 0
ln
) (
) (
ln
Modèle de Monod - Estimation des paramètres
y = 0,2475x + 1
0,5
0,55
0,6
0,65
0,7
0,75
0,8
0,85
0,9
-1,9 -1,7 -1,5 -1,3 -1,1 -0,9 -0,7 -0,5
µ
max
= 1
m = 0,2475
= K
s
*Y
x/s
/X
max


K
s
= 0,2475*10,1/0,5

K
s
= 5
Utilisation du Chemostat pour la
détermination des paramètres cinétiques
 Relation cinétique, par exemple Monod:
D
S K
S
S
MAX
=
+
·
=
µ
µ
( )
|
.
|

\
|
÷
=
÷
·
=
1
D
K
D
K D
S
MAX
S
MAX
S
µ
µ
Modèle de Monod -µ=D vs S
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 5 10 15 20 25
S (-)
µ

=

D
(
-
)
Modèle de Monod - S vs D
0
5
10
15
20
25
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
D (-)
S

(
÷
)
Prochain labo: Cuvée alimentée
(Fed-batch)
•Alimentation seulement

•Régime transitoire

•À t = 0, V= V
0
, X= X
0
, S= S
0

•F sera contrôlé de manière à
maintenir S constant, S=S
0
=S
c

•Si S est constant, µ le sera aussi,
µ= µ
c

F(t), S
in
V, X, S
Cuvée alimentée (Fed-batch)
 3 bilans seront nécessaires pour obtenir un modèle
de ce système:

F
dt
dV
=
dt F V V
t
}
+ =
0
0
} }
· =
t V
V
dt F dV
0
0
( )
V X
dt
X V d
· · =
·
µ
( ) ( )
V X
dt
X d
V
dt
V d
X · · = + µ
F
….
( )
) ( ) (
) (
) ( ) ( ) ( t V t X
dt
t X d
t V t F t X · · = + · µ
Cuvée alimentée (Fed-batch)
( )
( ) V X
dt
V X d
· · =
·
µ
( )
( )
dt
V X
V X d
c
· =
·
·
µ
( )
( )
} }
· = ·
·
t
c
XV
V X
dt V X d
V X
0
0 0
1
µ
t
V X
V X
c
· =
|
|
.
|

\
|
·
·
µ
0 0
ln
t
c
e V X V X
·
· · = ·
µ
0 0
Cuvée alimentée (Fed-batch)
( )
V X
Y
S F
dt
V S d
s x
c
in
· · ÷ · =
·
/
µ
( ) ( )
V X
Y
S F
dt
V d
S
dt
S d
V
s x
c
in
· · ÷ · = +
/
µ
F 0
( ) V X
Y
S S F
s x
c
c in
· · = ÷ ·
/
µ
( )
c in s x
c
S S Y
V X
F
÷ ·
· ·
=
/
µ
( )
t
c in s x
c
c
e
S S Y
V X
F
·
·
÷ ·
· ·
=
µ
µ
/
0 0
Cuvée alimentée (Fed-batch)
t
c
e V X V X
·
· · = ·
µ
0 0
( )
t
c in s x
c
c
e
S S Y
V X
F
·
·
÷ ·
· ·
=
µ
µ
/
0 0
dt F V V
t
}
+ =
0
0
( )
dt e
S S Y
V X
V V
t
t
c in s x
c
c
}
·
÷ ·
· ·
+ =
0
/
0 0
0
µ
µ
( )
( )
(
¸
(

¸

÷ ·
÷ ·
+ =
·
1 1
/
0
0
t
c in s x
c
e
S S Y
X
V V
µ
( )
( )
(
¸
(

¸

÷ ·
÷ ·
+
·
=
·
·
1 1
/
0
0
t
c in s x
t
c
c
e
S S Y
X
e X
X
µ
µ

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