AISLAMIENTO DE ENZIMAS

Blga. Roxana Mestas Valdivia Area de Qumica Biolgica Departamento de Biologa Universidad Nacional de san Agustn

ESTUDIO DE UNA ENZIMA

Involucra la investigacin de un gran nmero de propiedades caractersticas que se detallan a continuacin, pero de las que generalmente se estudian solo unas pocas: a) propiedades fisicoqumicas: coeficientes de sedimentacin y difusin; peso molecular; forma; punto isoelctrico; estabilidad frente al calor, pH y oxidacin; reversibilidad de la reaccin y constante de equilibrio; calor, energa libre y entropa de la combinacin enzima-sustrato y de su conversin en productos; medida de las constantes de velocidad de la reaccin, efecto de activadores e inhibidores. b) estructura: composicin en aminocidos, secuencia, presencia de grupos prostticos, grupos sulfhidrilos, etc. c) propiedades enzimticas: naturaleza de la reaccin, coenzimas, especificidad. d) propiedades biolgicas: significado en el metabolismo, acoplamiento con otras enzimas, localizacin, gentica, efectos de su deficiencia, inmunologa.

ASPECTOS TCNICOS DEL TRABAJO CON ENZIMAS

Deben evitarse altas temperaturas y acidez o alcalinidad extremas. Durante el aislamiento y la purificacin conviene, en general, trabajar entre 0 y 4 C y evitar pH mayor que 9 o menor que 5.
Debe evitarse la formacin de espuma, ya que la misma es indicador de desnaturalizacin proteica.

 Los solventes orgnicos inactivan muchas enzimas a temperatura ambiente; de modo que los fraccionamientos con los mismos deben llevarse a cabo a baja temperatura y sta no debe elevarse hasta que el solvente se haya eliminado o diluido a concentraciones inocuas. Deben tomarse tambin varias precauciones en lo que se refiere a las condiciones de la reaccin: a) Elegir pH y temperatura en las zonas de mayor estabilidad de la enzima b) Llevar a cabo la reaccin a temperatura constante. c) Elegir un buffer adecuado para evitar cambios de pH d) Evitar la introduccin de trazas de otras enzimas (por ejemplo saliva). e) Elegir una cantidad de enzima adecuada para obtener variaciones apropiadas de la magnitud a medir.

Objetivos del Aislamiento y Purificacin de Enzimas

Obtener un rendimiento mximo Poseer actividad cataltica mxima Mxima pureza

Aislamiento y Purificacin
Las enzimas se encuentran formando parte de mezclas complejas, usualmente en el interior de clulas que adems poseen cientos de otras enzimas. Pueden formar parte de agregados moleculares, complejos con otras enzimas, protenas inertes, cidos nucleicos, polisacridos o lpidos. Para estudiar una en particular, se hace indispensable entonces un proceso de purificacin.

Mtodos de Estimacin - Unidades

Ensayo
El primer requerimiento para aislar una enzima es encontrar un ensayo cuantitativo de actividad mediante el cual pueda valorrsela convenientemente. Para decidir si un paso de la purificacin tiene sentido, es necesario medir la cantidad de enzima y la cantidad de impurezas antes y despus de ese paso, y comparar los resultados de varios procedimientos posibles. Slo en trminos cuantitativos se puede saber si se ha producido algn progreso. Puesto que una gran parte del tiempo empleado en el aislamiento de una enzima est dedicado a determinar la actividad de las distintas fracciones, es deseable que sta sea una operacin rpida; es preferible sacrificar precisin por rapidez en las determinaciones. La naturaleza del ensayo depender del tipo de reaccin que cataliza la enzima. A veces resultar conveniente la medicin de la aparicin de un producto y otras la medicin de la desaparicin de sustrato.

Actividad
La actividad de una enzima depende de condiciones tales como temperatura, pH, concentracin; por lo tanto es necesario especificarlas y usar las mismas condiciones para comparar actividades. La eleccin del sustrato es muy importante: debe ser barato, de fcil determinacin, estable en ausencia de enzima y no sufrir reacciones laterales. Es necesario usarlo en concentracin tal que sature la enzima, de modo que la velocidad sea independiente de la concentracin de sustrato y proporcional a la cantidad de enzima.

Unidad Enzimtica
Es necesario definir una unidad enzimtica arbitraria para poder expresar, en forma cuantitativa, la pureza y la actividad de las diversas fracciones obtenidas durante la purificacin. La unidad enzimtica se define en forma particular para cada reaccin segn sea conveniente. Es la cantidad de enzima que cataliza la formacin de una determinada cantidad de producto (desaparicin de reactivo) en un tiempo dado.
La pureza de la enzima se ve reflejada en la actividad especfica que es el cociente de actividad enzimtica (expresada en unidades enzimticas) y la cantidad total de protenas

Seleccin de la fuente
La actividad de una enzima vara considerablemente en diferente organismos y an en los diversos tejidos de un mismo organismo. Para estudios mecansticos generales, debe seleccionarse aquella fuente que sea rica en la enzima. En estos casos, particularmente en tejidos animales, la fuente debe ser fresca, dado que la mayora de las enzimas se deterioran rpidamente. Frecuentemente una buena eleccin de la fuente de enzima permite simplificar la extraccin y purificacin de la enzima. Recuerde la fuente debe ser: Abundante Disponible Se deben hacer estudios comparativos Se debe saber su localizacin subcelular

Importancia de la localizacion intracelular de la enzima

Las enzimas pueden localizarse dentro de los siguientes grupos: I. Enzimas en solucin verdadera en el citoplasma. Permanecen en el sobrenadante luego de la eliminacin de los componentes particulados. La ruptura de las clulas en un buffer adecuado libera tales enzimas al medio. II. Enzimas asociadas a estructuras celulares (membranas, mitocondrias, etc.). Pueden encontrarse a) en solucin dentro de una membrana y pueden ser extradas despus de la destruccin de la misma; b) asociadas a material lipoproteico insoluble. Para pasarlas a solucin debe disociarse el complejo. El conocimiento de la localizacin intracelular y solubilidad relativa de las enzimas ha permitido desarrollar procedimientos de extraccin diferencial que facilitan la purificacin

EXTRACCION DE ENZIMAS
Las condiciones para extraer las enzimas y pasarlas a solucin son a menudo crticas y requieren el estudio de muchas variables. Es necesario destruir las clulas, eventualmente las estructuras subcelulares y disociar las enzimas de otras molculas. A veces es necesario pasarlas a solucin como complejo mucoproteico o nucleoproteico y disociarlo luego durante la purificacin.
Aunque la dispersin de agregados moleculares puede frecuentemente lograrse mediante medios mecnicos, en muchos complejos enzimticos estn involucradas fuerzas especficas; de la naturaleza de las mismas depende el mtodo a emplear.

MTODOS DE PURIFICACIN
1. Mtodos de rotura celular 2. Precipitacin fraccionada por cambios de pH 3. Desnaturalizacin fraccionada por calentamiento 4. Precipitacin fraccionada con solventes orgnicos 5. Precipitacin fraccionada por sales 6. Absorcin fraccionada 7. Cromatografa en columna 8. Electroforesis

Mtodos de rotura celular

Implica la destruccin de la clula y el pasaje de las enzimas a solucin o suspensin. Esto puede llevarse a cabo por:

a) Homogenizacin mecnica: puede utilizarse un homogeneizador de vidrio, mortero,

licuadora, a veces con la ayuda de abrasivos como almina, arena o bolitas de vidrio y con un solvente adecuado, isotnico (sacarosa 0,25 M, NaCl 0,9%, KCl 0,15 M) o ligeramente hipertnico, en un buffer adecuado para controlar el pH. de presin de miles de atmsferas, que rompen la pared celular. Se usa generalmente para bacterias y levaduras y, a veces, para determinados tejidos animales (bazo, rin, eritrocitos). suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos. Por congelacin se forman cristales de hielo intracelulares, destruyendo la estructura. Al descongelarse, las clulas se destruyen osmticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su contenido. etanol, ter de petrleo, isopentanol, etc.

b) Homogeneizacin snica: el choque de ondas snicas o ultrasnicas provoca cambios

c) Desintegracin trmica: El congelamiento y descongelamiento rpidos y repetidos

d) Desintegracin qumica: se utilizan agentes que atacan la pared celular, como el

e) Homogeneizacin por deshidratacin: se basa en la precipitacin de protenas por solventes orgnicos. En la preparacin del "polvo acetnico" se utiliza acetona en fro.

Precipitacin por cambios de pH

The solubility of most globular proteins is markedly influenced by pH and ionic strength. This figure shows the solubility of a typical protein as a function of pH and various salt concentrations.

Desnaturalizacin por calentamiento

100

Solubilidad g/L 0 0 100 Temperatura, C

Precipitacin con solventes orgnicos

Etanol usado para la precipitacin de protenas sanguneas Acetona para separar enzimas de extractos de msculo

Precipitacin por sales

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA

CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR

La separacin se basa en el tamao de las partculas - Fase estacionaria: dextrano o agarosa entrecruzados - Fase mvil: solucin tamponada

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

La separacin se basa en la carga elctrica de las partculas - Fase estacionaria: grupos cargados unidos a un soporte insoluble - Fase mvil: gradiente de sal o de pH

Cromatografa en SP Sephadex C-50. La fraccin de la etapa anterior (50ml) del extracto de enzima preparado de tubrculos de Ullucus tuberosus "olluco" fue cromatografiada sobre una columna de SP Sephadex C-50 bajo las condiciones de ensayo de 2.3. La enzima fue eluda con 0.10 M de NaCl se colectaron fracciones de 4ml.
Mansilla B. Juan C. (2004). Purificacin Parcial y Caracterizacin Bioqumica de Fosfatasa Acida de Ullucus tuberosus Loz var. Rosascha lisa. Tesis para optar el Titulo Profesional de Bilogo

CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD

Separa segn la afinidad de la protena por un ligando inmovilizado Fase estacionaria: ligando unido a soporte insoluble Fase mvil: (1) solucin sin ligando (2) solucin con ligando libre

Cromatografa en Concanavalina A-Sepharosa. La fraccin de fosfatasa cida de Ullucus tuberosus "olluco" obtenida de la columna en SP Sephadex C-50 (32ml), fue cromatografiada sobre una columna de Concanavalina A-Sepharosa, bajo las condiciones de 2.4. La enzima fue eluda con 0.15 M de metil -D manopiransido. Se colectaron fracciones de 3ml, con un flujo de 1.2 ml por minuto

Mansilla B. Juan C. (2004). Purificacin Parcial y Caracterizacin Bioqumica de Fosfatasa Acida de Ullucus tuberosus Loz var. Rosascha lisa. Tesis para optar el Titulo Profesional de Bilogo

Cromatografa lquida de separacin rpida de protenas

ELECTROFORESIS

GEL DE APILAMIENTO PORO GRANDE CONCENTRAR Y ALINEAR PROTEINAS

GEL DE SEPARACION PORO PEQUEO SEPARA PROTEINAS POR TAMAO

DILISIS

ANLISIS DE LOS DATOS

Tabla de Purificacin Estndar

1. Da una breve descripcin de la fraccin probada 2. Volumen 3. Concentracin de la enzima 4. Unidades totales (= columna 3 x columna 2) 5. Concentracin protica 6. Actividad especfica (= columna 3/columna5) 7. Rendimiento ( obtenido a partir de la columna 4 tomando el primer valor de esta columna como 100%) 8. Grado de purificacin (obtenido a partir de la columna 6 tomando el primer valor de esta columna como equivalente a 1)

CRITERIOS DE PUREZA DE UNA ENZIMA

Ultracentrfuga Analtica Mtodos Electroforticos Enfoque Isoelctrico Prueba de Solubilidad

Mtodos para determinar Protenas

Mtodo de Kjeldahl
El mtodo se basa en la destruccin de la materia orgnica con cido sulfrico concentrado, formndose sulfato de amonio que en exceso de hidrxido de sodio libera amonaco, el que se destila recibindolo en: a) Acido sulfrico donde se forma sulfato de amonio y el exceso de cido es valorado con hidrxido de sodio en presencia de rojo de metilo, o b) Acido Poco sensible. En desuso. brico formndose borato de amonio el Se sigue empleando para anlisis que se valora con cido clorhdrico. elemental (p.e., alimentos)

Protena total= N x 100/16

Mtodo de Biuret
Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptdicos en medio bsico dando una coloracin violeta. La intensidad de coloracin es directamente proporcional a la cantidad de protenas (enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del mtodo es muy baja y slo se recomienda para la cuantificacin de protenas en preparados muy concentrados.

H N H2N C O C NH2 O

H C NH

H HN C

O NH O

HN C NH
-

Cu++ O

HN C H

Biuret Complejo cprico coloreado

Mtodo de Bradford
Se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue G-250 (tambin Serva Blue) a las protenas. El colorante, en solucin cida, existe en dos formas una azul y otra naranja. Las protenas se unen a la forma azul para formar un complejo protena-colorante con un coeficiente de extincin mayor que el colorante libre. Este mtodo es sensible (1-15 g), simple, rpido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinacin. Entre las sustancias que interfieren estn los detergentes y las soluciones bsicas.

Absorcin a 280 nm
Se fundamenta en la absorcin a 280 nm producida por los aminocidos aromticos Phe, Tyr y Trp Sensible y fcil de practicar Requiere soluciones puras de protena; no es aplicable a mezclas Distintas protenas dan diferente grado de absorcin, dependiendo de su contenido en aa. aromticos