3.6 Prosedur Penelitian 3.6.1 Ekstraksi silika amorf a. Pencucian sekam padi, untuk menghilangkan kotoran yang melekat b.

Penimbangan sekam padi sebanyak 700 gram c. Proses pengeringan sekam padi dibawah sinar matahari selama 1 jam d. Pengarangan sekam padi untuk kedua sampel ini dilakukan dengan cara pada suhu 3000C selama 30 menit e. Proses pengabuan dilakukan untuk mengetahui kandungan abu dari sekam padi dengan cara dioven pada suhu 6000C selam 1 jam f. Proses pemurnian sampel dilakukan untuk memisahkan silika dari abu sekam,dengan cara pengasaman dengan menggunakan larutan HCL pekat. Proses pemurnian dilakukan cara sampel berupa abu sekam dimasukkan ke dalam gelas piala dan dibasahi dengan aquades panas. Selanjutnya campuran ditambahkan 5 ml HCl pekat dan diuapkan sampai kering. Pekerjaan ini diulangi tiga kali. Selanjutnya dituangkan 20 ml akuades dan 1 ml HCl pekat ke gelas piala tadi dan dibiarkan diatas penangas air selama 5 menit g. Campuran tersebut kemudian disaring dengan kertas saring bebas abu dan dicuci 4 sampai 5 kali dengan akuades panas. Hasil dari penyaringan residu padat beserta kertas saringnya dipanaskan mula-mula pada suhu 3000C selama 30 menit hingga kertas aring menjadi arang. Kemudian dilanjutkan dengan memanaskan pada suhu 600 0C hingga yang tersisa hanya endapan silika (SiO2) berwarna putih h. Proses identifikasi kadar silika dengan menggunakan metode Gravimetri

3.7.3 Isolasi dan kultur sel Primary murine osteoblast diperoleh dari kalvaria tikus wistar umur 2 hari yang dihancurkan dengan kolagenase. Prosesnya adalah sebagai berikut: a. Kalvaria diambil b. Dicuci dengan phosphate buffer saline (PBS) c. Selanjutnya dipotong kecil-kecil dengan gunting d. Fragmen-fragmen jaringan kemudian dihancurkan 5 kali dengan kolagenase (tipe II, 1,5 mg/ml) selama 10 menit pada suhu 370 celcius

4. Kompleks collagen-dye mengendap dari larutan. g. Sel dipertahankan dalam media kultur dan passaged 3 kali sebelum digunakan untuk eksperimen dalam medium yang diberi suplemen h. kolagen standard dan reagent blank (100µL) dicampur dengan Sircol Dye reagent 1 ml di dalam microcentrifuge tube selama 30 menit.6. kemudian diresuspensi dalam Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) dengan 15 % FBS. Masing-masing digest. supernatannya dipindahkan dalam fetal bovine serum (FBS). 58S bioactive glass dan kontrol. Dye yang terikat terlepas dan terlarut melalui penambahan alkali reagent (250 µL atau 1000µL) dan dicampur selama 10 menit. d.5 digest. f.2 Pengukuran ekspresi kolagen tipe I setelah pemberian dengan silika amorf. sel-sel ditripsinasi.000 rpm selama 10 menit dan dicuci. medium yang dikondisikan dengan 58S bioactive glass dan pada medium yang tidak dikondisikan ditumbuhkan di dalam plate 96 well selama 7 hari. diukur dengan trypan blue viability staining dalam hemositometer. Dye yang terlepas diukur diukur pada 555 nm dengan panjang gelombang 650 nm. pada MRXII plate reader. silika 58S bioactive glass dan pada medium yang tidak dikondisikan dengan Sircol Collagen Assay Incorporation ELISA a. Tube disentrifugasi pada 12. dan direplated pada 1x103/well dalam well 96. Ekspresi kolagen diukur dengan Sircol Collagen Assay Incorporation ELISA. c. Dye yang tidak terikat dibuang dengan cara membalik dan mengaliri tube. 3. f.e. b. Kumpulan dari 3. Ice-cold acid-salt wash (750µL) dengan perlahahan ditambahkan untuk membuang dye yang tidak terikat dari microcentrifuge tube. . penisilin G (50U/ml) dan streptomysin (50μg/mL) g. e. Sel sampel. disentrifuse.000 rpm selama 10 menit. Untuk mengamati efek silika amorf sekam padi. Kompleks yang terbentuk dipindahkan ke dalam tube dengan sentrifugasi pada 12. dikumpulkan dan disentrifuse pada 1500 rpm selama 5 menit. Sel-sel osteoblas yang diperoleh dari kultur pada dalam Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) yang dikondisikan dengan silika amorf.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful