Anexina A5, disfuncia endotelial i apoptoza n aterogeneza la pacienii cu lupus eritematos sistemic

V.Pompilian, Camelia Badea, Eugenia Blnescu Clinica Medical II, Spitalul Clinic Colentina, Bucureti Adresa coresponden: Dr. V. Pompilian Spitalul Clinic Colentina, Clinica Medical II Sos. Stefan cel Mare nr 19-21, sector II, Bucureti Email: vpompilian@yahoo.com

Rezumat Anexina A5 (ANXA5) este o molecul cu efect antitrombotic; ea intervine n patologia vascular la pacienii cu lupus eritematos sistemic (LES). Deplasarea ANXA5 de pe endoteliu de ctre anticorpii antifosfolipidici (AAFL) este un mecanism protrombotic i proaterogen important. Progrese recente n biologia molecular au identificat drept promotori ai aterogenezei: AAFL, anticorpii antiapoB100, anticorpii antioxLDL, procesul de apoptoz. Am urmrit evidenierea corelaiilor dintre ANXA5 i ateroscleroza subclinic, disfuncia endotelial, AAFL, tulburri mediate imunologic ale metabolismului lipidic (exemplificate de anticorpii antiapoB100 i antioxLDL ), fas/apo I (ca marker de apoptoz). Parametrii menionai, precum i corelaiile dintre acetia, au fost studiai comparativ la 130 pacieni cu LES cu i fr ateroscleroz clinic manifest. n lotul de pacieni cu ateroscleroz clinic manifest (cazuri, n=30 ) ANXA5 s-a corelat puternic cu IMT i FMD i moderat cu C3. n lotul de pacieni fr manifestri clinice aterosclerotice (control, n=100 ) a fost constatat doar o corelaie moderat a ANXA5 cu FMD i IMT; restul corelaiilor au fost absente. Rezultatele sugereaz c tulburrile metabolismului ANXA5 sunt implicate n disfuncia endotelial i aterogenez. Exist o diferen de rspuns al endoteliului vascular la aciunea factorilor pro- i antiaterogeni ntre pacienii cu LES cu i cei fr ateroscleroz clinic manifest. Considerm necesar extinderea studiului pe un numr mai mare de pacieni pentru a mri puterea statistic a acestor constatri. Cuvinte cheie: anexin A5, lupus, ateroscleroz, disfuncie endotelial, index intimomedial, vasodilataie fluxmediat, apoptoz. Abstract Annexin A5 (ANXA5) is an antithrombotic molecule, involved in vascular disease in systemic lupus erythematosus (SLE) patients. Displacement of ANXA5 from endothelium by antiphospholipid antibodies (APLAs) is a major prothrombotic and atherogenic mechanism. Recent advances in molecular biology identified as promoters of atherosclerosis, among others, the following: APLAs, immune-mediated disorders of lipid metabolism ( exemplified by antiapoB100 and antioxLDL antibodies ), the process of apoptosis. We seeked for correlations between ANXA5 and: subclinical atherosclerosis, endothelial dysfunction, APLAs, antiapoB100 and antioxLDL antibodies,

fas/apo I (as a marker of apoptosis). The above-mentioned parameters and the correlations between them were studied in 130 SLE patients with and without clinically manifest atherosclerosis. In the group of patients with clinical manifestations of atherosclerosis (cases, n=30) ANXA5 was strongly correlated with intimomedial thickness (IMT) and flow-mediated dilation (FMD) and moderately correlated with C3. In the group with no clinical manifestations of atherosclerosis (control, n=100) the only findings were moderate correlations between ANXA5, FMD and IMT; all other correlations were absent. The results suggest that disturbances in ANXA5 metabolism are involved in endothelial dysfunction and atherogenesis. There is a difference of endothelial response to pro- and antiatherosclerotic factors between SLE patients with and without clinically manifest atherosclerosis. Extending the study to a larger number of patients would be necessary in order to increase statistical power of the above-mentioned findings. Key words: Annexin A5, lupus, atherosclerosis, endothelial dysfunction, intimomedial thickness, flow-mediated vasodilation, apoptosis.

Premize Anexina A5 (ANXA5) este o molecul cu proprieti antitrombotice importante. Tulburrile metabolismului acesteia sunt incriminate n patologia vascular (trombotic, dar i aterosclerotic) la pacienii cu LES. Mecanismul principal este legat de nlocuirea ANXA5 de pe suprafaa endoteliului vascular de ctre diveri autoanticorpi, ndeosebi anticorpi antifosfolipidici (AAFL)1,2,3. ANXA5 este abundent n plcile avansate, mai ales n zonele cu mare risc pentru tromboz. Aici ea exercit un rol incert, dar este probabil s acioneze ca un plasture antitrombotic. Acest efect deriv din ecranarea situsurilor procoagulante ca i din inhibarea prelurii de material apoptotic de ctre celulele fagocitare. Ateroscleroza este un tip particular de rspuns inflamator, care este amorsat de promotori extrem de diveri. Printre acetia, studiile recente de biologie molecular au adugat: AAFL: un subset de pacieni cu SAFL dezvolt ateroscleroz precoce, urmare a unui rspuns imun ncruciat ntre antiB2GPI i oxLDL 4,5.La originea acestui rspuns st capacitatea oxLDL de a forma complexe nedisociabile cu 2GPI; anticorpii ( tip IgG ) mpotriva acestor complexe sunt intens proaterogeni, putnd fi considerai drept marker al riscului aterogen n SAFL.Un alt mecanism aterogen al AAFL este legat chiar de dislocarea ANXA5 de pe endoteliu, anterior descris. anticorpii antiapoB100: unele studii evideniaz un efect proaterogen al acestora, crend o interesant conexiune ntre dislipidemia cu patogenie autoimun (anticorpi antilipoproteinlipaz) caracteristic LES activ i ateroscleroz 6. anticorpii antioxLDLau un rol controversat n aterogenez; unele studii i descriu drept proaterogeni, altele neutri sau chiar ateroprotectori. procesul de apoptoz: acesta este implicat n mai mic msur n stadiile iniiale, avnd, ns, un rol extrem de important n instabilitatea i ruptura plcii 7,8. Inductorii apoptozei sunt numeroi i includ: Fas ligand, TNF i TNF related apoptosis inducing ligand (TRAIL), starvation growth factor i specii de oxigen reactive.

Indiferent de stimulul care a generat apoptoza, aceasta se efectueaz prin intermediul caspazelor (o familie de cistein-proteaze). Scop Ilustrarea implicrii ANXA5 n diferite etape ale aterogenezei - realizat prin evidenierea eventualelor corelaii existente ntre nivelul seric al ANXA5 i disfuncia endotelial, msurat prin vasodilataia flux-mediat (flow mediated dilation, FMD), ncrctura aterosclerotic ilustrat prin indexul intimomedial (intimomedial thickness, IMT), nivelul seric al fas/apoI (marker al apoptozei), AAFL i tulburrile mediate imunologic ale metabolismului lipidic (exemplificate prin antioxLDL i antiapoB100 ). Material i metod A fost studiat un lot de 130 pacieni cu LES internai n clinica noastr n intervalul 20032008. Acesta a fost submprit n dou grupuri: unii prezentau evenimente clinice atribuibile aterosclerozei (=cazuri LES, 30 pacieni) iar ceilali nu prezentau asemenea evenimente (=control LES, 100 pacieni). Caracteristicile legate de vrsta i sex ale celor dou grupuri sunt redate n Figurile 1-4.

Figura 1. Distribuia pe vrste la lotul de cazuri LES (n=30)

Se observ o populaie (semnificativ statisticp=0,01) mai vrstnic dect cea din lotulcontrol)

Figura 2. Distribuia pe vrste la lotul de control LES (n=100)

Figura 3. Distribuia pe sexe la lotul de cazuri LES (Procentul de brbai este puin mai mare dect la lotul-control; diferena nu este semnificativ statistic p=0,63)

Figura 4. Distribuia pe sexe a lotului de control LES

Principalele manifestri clinice ale LES n cele dou grupuri sunt redate n Figura 5
tulb psih 2 0 1 1 3 1 2 4 11 11 1 3 0 10 6 3 6 4 5 7 24 55 29 29 20 30 cazuri control 40 50 60 70

afect SNP

afect SNC

nefropatie

pericardita

pleurezie

artrita

livedo

Raynaud

purpura

vespertilio

Figura 5. Manifestri clinice ale LES n cele dou grupuri de pacieni (cifrele indic numrul de cazuri) Protocolul de examinare a pacienilor a inclus: evaluare cardiovascular complex, determinare: IMT, FMD, titru AAFL, fas/apoI, antioxLDL, antiapoB100. Rezultatele au fost prelucrate statistic cu un program Instat, urmrindu-se coeficienii de corelaie Pearson (R) ntre ANXA5 i ceilali parametri.

Rezultate Tabelul 1 red sintetic datele privind IMT, FMD, apoB100, antioxLDL, anexina V i fas/apoI n cele dou loturi de pacieni. parametru control cazuri N min max VM DS N min max FMD % 100 1,000 6,400 3,655 1,321 30 0,500 5,400 IMT mm 100 0,540 0,940 0,783 0,102 30 0,660 1,050 antiapoB100 UI/ml 100 56,762 1978,2 388,422 405,98 30 5,386 1470.0 antioxLDL UI/ml 100 33,413 640,00 295,442 125,48 30 107,61 605,44 anexinaV UI/ml 100 1,096 82,377 9,691 13,362 30 2,904 50,737 Fas/apoI UI/ml 100 22.220 87,740 62,079 11,681 30 22,220 85,470 Tabel 1. Valorile FMD, IMT, antiapoB100, antioxLDL, anexina V i fas/apoI la grupul de cazuri i la cel de control. (min, max i VM sunt valorile minine, maxime i respectiv medii ale parametrului; DS =deviaia standard ) U.M.

VM 1,900 0,924 499,72 383,66 18,994 59,190

DS 1,347 0,096 335,13 135,46 15,807 13,837

Corelaiile obinute ntre nivelurile ANXA5 i cele ale celorlali parametri (exprimate prin coeficientul R ) sunt redate n Tabelul 2. parametru FMD IMT C3 antioxLDL antiapoB100 Fas/apoI U.M. % mm UI/ml UI/ml UI/ml UI/ml Cazuri (R) -0,8128 (p=0,0002) 0,8101(P=0,0003) -0,440(P=0,08) 0,398(P=0,12) 0,363(P=0,166) 0,163(p=0,54) -0,231 (p=0,38) Control ( R ) -0,476(p=0,0001) 0,451(p=0,0001) -0,08(p=0,39) 0,147(p=0,251) 0,06(p=0,55) 0,09(p=0,44) 0,018(p=0,85)

Antifosfatidilserina UI/ml

Tabel 2. Corelaii ntre ANXA5 i: FMD, IMT, C3, antioxLDL, antiapoB100, fas/apoI, antifosfatidilserin la cele dou loturi. Aadar, n lotul de cazuri ANXA5 este corelat puternic cu IMT i FMD i moderat cu C3. n lotul de control se semnaleaz doar corelaii moderate ntre ANXA5 i FMD, respectiv IMT.

5 4 FMD (%) 3 2 1 0 5 10 15 20 25 30 Anexina A5 (UI/ml) 35 40 45 50

Figura 6. Corelaia anexin A5-FMD n lotul cu ateroscleroz clinic manifest (cazuri) Corelaia este invers: nivelul seric crescut de ANXA5 este asociat cu FMD mic, traducnd disfuncie endotelial

1.065 0.983 IMT (mm) 0.901 0.819 0.737 0.655 5 10 15 20 25 30 Anexina A5 (UI/ml) 35 40 45 50

Figura 7. Corelaia anexin A5-IMT la lotul de cazuri Corelaia este direct: nivelurile serice mari de ANXA5 se asociaz cu valori mari ale IMT (semnificnd ncrctur aterosclerotic) Discuii

n studiul nostru valorile serice ale anexinei A5 sunt semnificativ mai mari la pacienii cu fa de cei fr ateroscleroz clinic manifest. Este de presupus ca nivelul seric crescut provine din ANXA5 dislocat de pe endoteliu de ctre diveri autoanticorpindeosebi anticorpi antifosfolipidici. Dislocarea ANXA5 de pe endoteliu contribuie major la disfuncia endotelial. Acesta este unul dintre mecanismele prin care anticorpii antifosfolipidici sunt implicai n aterogenez; el intervine, de asemenea, n patogenia trombozelor i a avorturilor spontane la pacientii cu LES 1. n lotul de pacieni cu ateroscleroz clinic manifest, anexina A5 se coreleaz cu FMD (R= -0,812, p=0,0002) sugernd faptul c disfuncia endotelial se asociaz cu nlocuirea anexinei A5 de pe endoteliul vascular. Aceasta are drept consecine pe de-o parte creterea nivelului seric al anexinei A5, iar pe de alt parte un fenotip protrombotic i proaterogen al endoteliului. n lotul de lupici fr ateroscleroz clinic manifest corelaia anexina A5 - vasodilataie flux-mediat a fost mai slab dect cea de la pacienii cu ateroscleroz (R=-0,476, p=0,0001). Corelaia ANXA5-IMT urmeaz un pattern identic cu cel descris pentru FMD: corelaie nalt la cazuri (R= 0,810,p=0,0003) i corelaie moderat la grupul de control (R=0,451, p=0,0001). Aceasta reflect legturile dintre tulburarea metabolismlui ANXA5 i ateroscleroza subclinic. Cifrele cvasi-identice care descriu corelaiile ANXA5-IMT i ANXA5-FMD sunt de fapt consecina naltei corelaii FMD-IMT. Corelaiile ANXA5 cu FMD i IMT sunt mai slabe la pacienii din grupul de control dect la cel de cazuri (vezi mai sus); corelaia: ANXA5-C3 ( care era moderat la grupul de cazuri) este inexistent la lotul de control; corelaiile ANXA5 cu ceilali parametri sunt absente la acest ultim grup de pacieni. Aceasta sugereaz o diferen de rspuns al endoteliului vascular la aciunea factorilor proaterogeni ntre pacienii cu i fr ateroscleroz clinic manifest. Cauza acestei diferene este necunoscut; ar putea fi implicate profilul citokinic diferit, dar i consecinele terapiei LES. Corelaia moderat ANXA5-C3 de la lotul de cazuri poate fi explicat prin efectul complexelor imune care pe de-o parte disloc ANXA5 de pe endoteliu, iar pe de alt parte consum complementul. Studiul nostru sugereaz o necorelare (la ambele grupe de pacieni) ntre ANXA5 i antioxLDL, antiapoB100, antifosfatidilserina, fas/apoI. Aceste necorelri par surprinztoare, deoarece: a) ANXA5 este legat de procesul de apoptoz (al crui marker este fas/apoI ) n att de mare msur nct exist teste in vitro i chiar in vivo care utilizeaz ANXA5 pentru a evidenia procesul de apoptoz 9. b) Anticorpii antiapoB100, markeri ai unei dislipidemii aterogene s-ar putea asocia cu dislocarea ANXA5 de pe endoteliu i deci cu niveluri serice mai mari de ANXA5. Cei mai cunoscui markeri ai dislipidemiei de cauz autoimun din LES sunt anticorpii antilipoproteinlipaz, prezeni la 50% dintre pacieni, anticorpi care determin un profil lipidic foarte asemntor cu cel din sindromul metabolic 10.

c) Anticorpii antifosfatidilserin, care reprezint un subset important de anticorpi antifosfolipidici, au potenialul de a disloca ANXA5 de pe endoteliu i, deci, de a crete nivelul seric al acesteia. d) Anticorpii antioxLDL au o influen asupra aterogenezei apreciat diferit de diverse studii: unele i consider drept proaterogeni, altele-neutri sau chiar ateroprotectori 11. Substratul acestor opinii este probabil marea diversitate structural i probabil i funcional a anticorpilor antioxLDL. Ar fi necesar extinderea studiului pe un numr mai mare de pacieni pentru a crete puterea statistic a acestor constatri. Concluzii 1) Corelaia ANXA5-IMT i FMD denot implicarea tulburrilor metabolismului ANXA5 n disfuncia endotelial i aterogenez. 2) Prezena unor niveluri serice semnificativ mai mari (p=0,02) de ANXA5 la pacienii cu LES cu ateroscleroz clinic manifest fa de celalalt grup este o sugestie indirect a implicrii acestei molecule n aterogenez. 3) Pacienii cu LES cu ateroscleroz clinic manifest nregistreaz o diferen de rspuns vascular la aciunea agenilor pro-i antiaterogeni fa de cei fr evenimente aterosclerotice. 4) n mod surprinztor, ANXA5 pare necorelat (la ambele grupuri de pacieni) cu: fas/apoI, antioxLDL, antiapoB100, antifosfatidilserina. Extinderea studiului pe un numr mai mare de pacieni va putea elucida autenticitatea acestor constatri.

Bibliografie
1-Cederholm A et al:Decreased binding of annexin V to endothelial cells:a potential mechanism in atherothrombosis of patients with SLE Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005 Jan 25;1:198-203 2-Cederholm A:Annexins as a novel player in prevention of atherosclerosis in SLE and in general population:Ann NY Acad Sci 2007 Jun;1108:96-103 3-de Laat B:Annexin V polymorphism and antiannexin in antiphospholipid syndrome ARD 2006,nov;65(11):1468-72 4-Matsuura E:Antiphospholipid syndrome and atherosclerosis Lupus 1998,7,Suppl2:S135-9 5-Jora L:Atherosclerosis and antiphospholipid syndromeClin Rev Allerg Immunol Aug 2003;25(1):112116 6-de Carvalho JF et al:Antilipoproteinlipase antibodies:a new player in the complex atherosclerotic process in systemic lupus erythematosus Arthritis Rheum 2004;50:3610-15 7-KolodgieF:Apoptosis in cardiovascular diseases Cardiology Clinics 2001 feb;vol19(1): 233-241 8-Kavurma MM:Expression, regulation and function of TRAIL in atherosclerosis Biochem Pharmacol 2008 Apr 1;75(7):1441-50 9-Kenis H: Annexin A5:shifting from a diagnostic toward a therapeutic realm Cell Mol Life Sci 2007 nov;64(22):2854-62 10-Borba EF:Mechanisms of dyslipidemias in SLE Clin Rev Immunol 2006 jun-dec;13(2-4):203-8 11-RochB:Oxidatively modified lipoproteins and their antibodies in patients with antiphospholipid syndrome and systemic lupus erythematosus:Z Rheumatol 2004,Aug;63(4):331-7