PARTE I Biotecnología y Agricultura

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IZQUIERDO, Juan

I.-Capítulo1
Hacia una agricultura sustentable: las alternativas de las ciencias de la vida y de la biotecnología
Izquierdo, Juan 1 El contexto del debate En línea con las conclusiones de la última Cumbre de la Alimentación de la FAO y diez años después de la Cumbre de Río y de la adopción de la Agenda 21, la Cumbre Mundial sobre Desarrollo Sustentable organizada en Johannesburgo, Africa del Sur, por el Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente (PNUMA), reforzó que la sostenibilidad es cada vez más un precepto crucial, ampliamente aceptado y prioritario en el plano internacional dentro de un contexto integral que involucra la lucha contra la pobreza, el hambre y la malnutrición, la lucha contra las enfermedades infecciosas, la cooperación tecnológica, la educación y la liberalización de los intercambios. Las previsiones indican un importante aumento de la demanda alimentaria, especialmente en los países en vías de desarrollo, lo que implica que para poder dar respuesta a este reto una de las posibilidades es aumentar la superficie de terrenos cultivados. Sin embargo, estos terrenos adicionales, limitados por la protección indispensable de los entornos naturales, tan sólo representarían una quinta parte del crecimiento de la producción mundial de cereales. Por consiguiente, resulta obligatoria la mejora del rendimiento y/o la adaptación a condiciones extremas de producción (sequía, salinidad, frío, altas temperaturas y otras) en zonas poco aptas para la agricultura convencional que permitan intensificar a los cultivos alimenticios y diversificar, sobre la base de especies de cultivos introducidas o autóctonas, alimenticias o volcadas al agroprocesamiento, la base productiva de los países de la región. En este desafío, en donde las ciencias de la vida y la biotecnología tienen un rol central, deben estar juntos todos los actores del proceso del desarrollo (científicos, legisladores, expertos en desarrollo, agricultores y

los representantes de la sociedad civil) para abordar los aspectos tecnológicos y económicos, más urgentes y polémicos, relacionados con el desarrollo y utilización segura de las biociencias y su capacidad de ofrecer soluciones sustentables para la producción de alimentos y la reducción de la pobreza. En este contexto, la cooperación entre el mundo desarrollado y el mundo en vías de desarrollo resulta crucial si se quieren lograr los objetivos relativos a la sostenibilidad. La seguridad y el uso de organismos genéticamente modificados (OGM) implican a priori, situar a la ciencia en un contexto de desarrollo mucho más amplio, tratando de asegurar que los agricultores de los países en vías de desarrollo formen parte del proceso colaborativo de investigación. Compartiendo el derecho de la sociedad civil a cuestionar, sobre bases bien informadas, los avances científicos y las consecuencias que de ellos eventualmente pudieran derivar, debe tomarse nota de que un cierto grado de escepticismo es un elemento saludable y esencial del «proceso de demostración» que permite dar a conocer las cuestiones científicas apropiadas para así poder proceder a un debate en toda regla. 2 Movilizar los recursos El proceso anterior significa movilizar recursos tanto para apoyar a la innovación y a la investigación en biotecnología, así como para desarrollar un marco regulatorio alcanzable dentro de las realidades de los países de la región, acompañado por canales de información tecnológica confiables y honestos, que permitan y promuevan una percepción pública crítica pero realista de las ventajas que ofrecen los nuevos desarrollos de las ciencias de la vida y la biotecnología. Este proceso es, en la actualidad, el centro vital de la cooperación horizontal que lleva adelante la red REDBIO/FAO (http:// www.redbio.org) con más de 12 años de existencia y un cuerpo de laboratorios de más de 650 instituciones de 32 países de América latina y el Caribe. Si la solución a tal desafío dependiera en primer y único lugar de la movilización de los recursos humanos y de los medios financieros, los progresos actuales y futuros de las

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ciencias de la vida y de la biotecnología, representarían un potencial nada desdeñable para el impulso de una agricultura sustentable y segura en los países en vías de desarrollo. En concreto, dicha acción podría permitir abandonar el uso de métodos más agresivos para el ambiente como, por ejemplo, los métodos mecánicos y químicos que inciden en los costos de producción, en sus efectos desfavorables sobre las fuentes hídricas, la fauna y la flora y sobre la salud de los agricultores. Este planteamiento no queda exento de fuertes reticencias en ciertos sectores de la opinión pública mundial y especialmente en Europa, que expresan su desconfianza en cuanto al uso de organismos modificados genéticamente en el ámbito de la agricultura y la alimentación. Estas fuerzas compuestas de variados actores de la sociedad civil representan, a su vez, un fuerte desafío que limita la movilización de los recursos. El tema de los OGM es ineludible pero no supone más que una parte de la totalidad del debate. La salud de los suelos y de los cultivos, el conocimiento real del estado de la biodiversidad, las producciones vegetales en los límites ecoclimáticos y la emancipación tecnológica en las zonas rurales son también temas que revisten la misma importancia. 3 Un contexto propicio para la acción La producción agrícola en los países en vías de desarrollo ha de aumentar en la medida en que continúe creciendo el número de bocas que alimentar. Este incremento se ha de lograr en gran medida con los terrenos agrícolas existentes y mediante el uso de métodos que no agoten los recursos de la tierra o causen daños medioambientales duraderos. Las perspectivas de las generaciones venideras resultarán dañadas irreversiblemente si no se emplean adecuadamente formas sustentables de cultivar la tierra. La adopción de métodos agrícolas sustentables es un elemento importante en todo el proceso del desarrollo rural. La Agenda 21 indica que: Con el fin de crear las condiciones para la agricultura y el desarrollo rural sustentables es preciso reajustar considerablemente la política agrícola, ambiental y macroeconómica, a nivel tanto nacio-

nal como internacional, en los países desarrollados y en los países en desarrollo. El principal objetivo de la agricultura y el del desarrollo rural sustentables es aumentar la producción de alimentos de manera sustentable y mejorar la seguridad alimentaria. La reciente conferencia «Rio+10», celebrada en Johannesburgo en septiembre de 2002, reforzó el compromiso mundial con los principios del desarrollo sustentable. Entre los muchos logros importantes de la cumbre hay que destacar el mejor entendimiento de lo que representa el desarrollo sustentable y, en particular, en cuanto a la interrelación entre la pobreza, el medio ambiente y el uso de los recursos naturales. América latina y el Caribe, como región productora y exportadora de alimentos, debe transformarse en uno de los protagonistas en el campo de las ciencias de la vida y la biotecnología. Dentro de este interés superior por ayudar al desarrollo de nuevas tecnologías no se debe olvidar la necesidad de generar, acceder y compartir los avances con el mundo desarrollado de un modo justo y responsable. La región debe preparar y endosar una declaración de política en donde «las ciencias de la vida y las biotecnologías son una opción estratégica para los países» (http://europa.eu.int/comm/ biotechnology/pdf/com2002-27_en.pdf) subrayándose con claridad la necesidad de poner los medios necesarios a la disposición de los países en vías de desarrollo. El progreso en estos ámbitos ayudará a la investigación y a la evaluación cuidadosa de las aplicaciones potenciales, con el fin de cubrir los temas de seguridad medioambiental y las necesidades locales relacionadas con la reducción de la pobreza, la mejora de la seguridad alimentaria y el aumento de la calidad nutricional. El desarrollo rural sustentable y la seguridad alimentaria son componentes importantes de las estrategias regionales contra la pobreza. Habida cuenta de que el sustento de la población rural depende de una agricultura sostenible, no se podrá erradicar la pobreza sin una modernización sustancial de la producción agrícola en los países en vías de desarrollo. 4 Alimentar sin destruir Según las estadísticas de la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación

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y la Agricultura (FAO), hay alrededor de 800 millones de personas en el mundo que sufren malnutrición. Muchas más dependen de aprovisionamientos poco fiables de alimentos a causa de problemas naturales, económicos o políticos. Las prácticas agrícolas no sustentables tan sólo vienen a sumarse a todas estas dificultades. El uso adecuado de las ciencias de la vida y de la biotecnología puede contribuir al logro de aumentos sustentables de la producción agrícola mediante la transferencia de prácticas de gestión mejoradas, un mejor rendimiento, la resistencia a plagas y enfermedades y el aumento de la tolerancia al estrés abiótico de las cosechas, el ganado y la pesca. La selección adecuada de estas tecnologías reducirá la necesidad de recurrir a sustancias agroquímicas, de modo que se protegerá el medio ambiente y a los agricultores de sus efectos negativos. Además, las ciencias de la vida y la biotecnología pueden contribuir a la conservación de la diversidad genética. Por ejemplo, ya hay proyectos en marcha que evalúan cómo se explotan y se extenúan los ecosistemas a causa del uso humano de los recursos naturales. Con la información recopilada se puede lograr un uso más razonable de los ecosistemas que reduzca el riesgo de pérdida de especies esenciales. 5 La creación de un diálogo responsable Organizar y promover una Plataforma de Debate sobre las Ciencias de la Vida, que permita a los científicos participar en un debate con las diversas «partes implicadas» interesadas en las aplicaciones beneficiosas y en la divulgación de los nuevos conocimientos, es parte del proceso. En este sentido se debe organizar un debate informativo y plural sobre el papel de las ciencias de la vida en un contexto de urgencia económica y social, centrado en las necesidades de los países en vías de desarrollo y apoyar foros de debate con la sociedad civil presentando estudios de científicos nacionales, cada uno claramente ubicado en su contexto social y económico. Las presentaciones deben realizarse en un lenguaje comprensible para los legos en la materia, porque se evitarán las referencias a teorías e ideologías y se prestará atención a las soluciones prácticas a problemas con-

cretos. Estas presentaciones servirán de valiosa introducción general a los diversos temas e irán dirigidas a un público amplio, con el fin de que ofrezcan una base para el inicio del debate público. 6 Reforzar los conocimientos Las «ciencias de la vida y biotecnología» (http://europa.eu.int/comm/ biotechnology/pdf/com2002-27_en.pdf) son pilares en el contexto de la construcción de una sociedad y una economía basada en el conocimiento. Las inversiones en investigación y desarrollo, en educación y formación y en los nuevos enfoques de gestión tienen una importancia clave para hacer frente a los desafíos de la biotecnología y las ciencias de la vida. Coherente con lo anterior, el reforzamiento de los vínculos entre la investigación y otras políticas socioeconómicas y la necesidad de la participación de los científicos en el proceso de creación de un consenso es parte de la creación de nuevas asociaciones de investigación entre los países desarrollados y los países en vías de desarrollo, a fin de aprovechar al máximo las ventajas de tecnologías prometedoras y el potencial de la biodiversidad. El libro «Biotecnología y Mejoramiento Vegetal», para el cual he tenido el honor de escribir este capítulo, es producto del trabajo de un número importante de investigadores jóvenes latinoamericanos. La obra representa una contribución significativa a la realidad de las instituciones académicas y de investigación en ciencias agronómicas y biológicas al aportar conocimientos y el estado del arte y llenar el vacío temporal en la disponibilidad de un libro en español de consulta actual, dando seguimiento a la obra pionera «Cultivo de Tejidos en la Agricultura: Fundamentos y Aplicaciones» realizada en 1991 y llevada a cabo por el Centro Internacional de Agricultura Tropical bajo la edición de los Drs. William Roca y Luis Mroginski. La Oficina Regional de la FAO para América Latina y el Caribe colaboró con la edición de dicho libro y reafirma el interés por este tipo de material, que provee un conjunto de documentación consolidada para el uso de estudiantes y profesionales.

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I.-Capítulo 2
El papel de las nuevas biotecnologías en la producción agropecuaria
Pagliano, Daniel 1 Introducción La nueva economía determina que aquellas naciones que pretendan crecer y generar riqueza deberán necesariamente aceptar el desafío que implica el aprender a utilizar los idiomas «digital y genético». Es así entonces que las empresas e instituciones basadas en el uso intensivo del conocimiento son fundamentales en la creación de prosperidad. Empresas de distinto porte han evolucionado y crecido en el sector de la biotecnología generando, directa e indirectamente, cientos de miles de puestos de trabajo en todo el mundo1 como resultado de inversiones que se realizaron tanto en el sector público como en el privado, y que hoy «se consolidan» a través de la generación de un modelo productor de bienes y servicios. Entender este continuum es vital. Pero el punto principal es la creación de comunidades con visión competitiva. Es así que desde un tiempo a esta parte muchos países desarrollados están implementando diferentes estrategias para impulsar el sector de la biotecnología como un área prioritaria de su economía, no sólo por lo que significa en términos productivos sino también por lo que significa culturalmente. Para los países latinoamericanos es entonces fundamental entender que hay que buscar un lugar dentro de esta nueva economía, que es una economía de conceptos más que una economía de toneladas, y a la vez tratar de establecer parámetros de desarrollo sustentables que generen inversión, empleo genuino y valor agregado. El incremento de la demanda por factores de productividad y calidad en el producto terminado exige la utilización de tecnologías que introduzcan calidad en el material inicial y que la continúen y expandan hasta
The economic contributions of the biotec industry of the US economy. Informe realizado por Ernst & Young, Mayo 2000. www.bio.org
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la obtención de un producto final de mayor calidad. Considerando que los sectores productivos más importantes son la producción animal, de granos, hortifruticultura y forestales, la biotecnología incide fundamentalmente desde el inicio de las cadenas productivas. Son básicamente nuevas semillas, plantas o animales con nuevas características genéticas que confieren caracteres sanitarios, de calidad o adaptativos, los que llevan un valor agregado biotecnológico. A modo de ejemplo, si consideramos al sector lácteo, las demandas comenzarían en pasturas con especies forrajeras de alta productividad, seguirían en una genética animal que aporte la mejor capacidad de una producción de calidad, se continúan en la industria con elaboración de productos diferenciados y más aún, sigue en la valorización de los desechos industriales. Hay un continuum tecnológico donde la suma de los valores agregados en cada tramo expande el valor agregado final. Por otra parte, la agricultura y la industria farmacéutica comparten ahora una misma caja de herramientas. El desarrollo de tecnologías que pueden ser usadas en cualquier campo de la vida es un elemento dinamizador nuevo que permite que un logro en un campo pueda ser rápidamente traspasado a otro. Los códigos usados en genómica, bioinformática, química combinatoria y proteómica también son compatibles. Por todo esto, se habla de una industria de las ciencias de la vida. Los países de la región poseen una especial habilidad para el agregado de valor a su producción agropecuaria mediante la utilización de conocimientos de base biológica. Los países poseen no sólo el «know how» (conocimiento) sino también la experiencia de haber llevado esos conocimientos al campo productivo, como lo demuestran las industrias láctea, forestal, citrícola, cafetera y el complejo ganadero, entre otros. Pero es necesario comprender que la actual revolución existente en las ciencias de la vida modificará o sustituirá progresivamente tecnologías existentes, permitiendo superar límites técnicos básicos, haciendo viables nuevos parámetros de productividad y de calidad para productos y procesos existentes, sentando la base de nuevas industrias.

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Esto generará cada vez más cambios sustanciales en toda la cadena productiva agroalimentaria, donde nuevos patrones tecnológicos serán los responsables de la aparición de nuevos productos en los mercados. Estar preparados o ser parte de estos cambios se torna una cuestión de soberanía. 2 Desarrollo de una visión La sociedad de un país, como sistema humano, se mueve en dirección a las preguntas que se formula, y actúa en función de éstas. Para el diseño de una visión, la región debe lograr entender los cambios que en el plano mundial se están procesando. Cualquier tecnología compleja necesita para su desarrollo de una infraestructura sustentada en una comunidad que involucra la investigación, el gobierno, la educación, los negocios, las finanzas, la legislación y otros. Se requiere de varios actores para hacer que una tecnología pase por etapas de prueba de concepto, desarrollo, maduración, extensión y finalmente termine con su adopción. Es fundamental tener una capacidad de seguimiento de lo que ocurre mundialmente en el desarrollo de nuevos productos, programas marcos de investigación, prioridades estratégicas de programas de ciencia y tecnología, etc. Luego de tener estas tendencias mundiales es menester generar una estrategia regional de desarrollo y posicionamiento en el contexto mundial. Los ejercicios de prospectiva tecnológica son una herramienta válida en este sentido. De acuerdo con la definición de la OCDE (Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico), prospectiva tecnológica es «un conjunto de intentos sistemáticos para mirar a largo plazo el futuro de la ciencia, la tecnología, la economía y la sociedad, con el fin de identificar aquellas tecnologías genéricas emergentes que probablemente generarán los mayores beneficios económicos y/o sociales». El objetivo central de una prospectiva tecnológica es la estimación de las tendencias futuras para llevar a cabo en forma anticipada acciones para diseñar el futuro deseado. En este sentido la prospectiva tecnológica identifica aquellas tecnologías emergentes

y estima el impacto de éstas sobre el mundo de los negocios y la sociedad en general. Históricamente, la región ha invertido de forma sistemática en programas de I+D (Investigación y Desarrollo) en apoyo a la investigación biológica aplicada, lo cual ha permitido mantener y aumentar la competitividad de los sectores productivos de base natural. En la actualidad, es prioritario para los sistemas de I+D y producción de la región tener una visión prospectiva para poder alcanzar un nuevo paso en su nivel de desarrollo. Es prioritario que los líderes comprendan la profundidad del cambio, los cambios tecnológicos, económicos, culturales y que se promuevan las reformas y los cambios estructurales necesarios para lograr desarrollar sistemas de innovación propios en biotecnología. Esto permitirá a la región seguir liderando el desarrollo de productos y procesos de base biológica. Las estrategias de «Usuario de Biotecnología» son una posibilidad para aquellos países que tengan importantes industrias agrícolas y agroindustriales, pero que carecen de industrias productoras de insumos biológicos. Sin embargo, países que quieran potenciar estas últimas y ser parte del «mercado del conocimiento», se verán forzados a acciones más proactivas y ambiciosas. 3 Interacción sistema académico y sector privado Hoy, la mayor parte de la infraestructura y de las capacidades disponibles en la región se encuentran fuertemente orientadas a la investigación. Esto es fundamental para avanzar hacia las etapas de desarrollo y posteriores, que permitan alcanzar los mercados con productos y servicios. Estas etapas sucesivas necesitan ser practicadas y es fundamentalmente en el sector privado donde deben articularse, contando con un sistema productivo organizado para hacer demandas al sistema científico. La ciencia pura es tan pertinente como la aplicada, pero en el mediano y largo plazo la única forma de competir seriamente es a través de productos y servicios innovadores. En la nueva sociedad del conocimiento el rol que cumplen las universidades se torna aún más clave. Es importante que las universi-

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dades de la región puedan analizar y canalizar lo que está pasando en países como Estados Unidos, Inglaterra, Bélgica, Canadá y Australia, donde existe una fuerte integración de las carreras científico-tecnológicas con escuelas de negocios, integrando la visión comercial al desarrollo de la ciencia y la tecnología. En este sentido la región posee una excelente capacidad científica-tecnológica, pero debe complementarla con la capacidad de «gestión» de la tecnología. Se requiere, por ejemplo, del «marketing» (mercadeo) para poder vender productos fuera de la región, para lo cual habrá que estudiar y comprender los mercados que van a recibir nuestros productos. Para esto, es menester lograr sinergias entre científicos y empresarios, y potenciar la formación de nuevas empresas a partir del reconocimiento de la capacidad de la biotecnología de la región. 4 Conclusiones Para la región es muy importante, sin duda, continuar trabajando en el camino emprendido, buscando forjar las alianzas estratégicas entre los ámbitos público y privado de las bioindustrias, coordinando esfuerzos en investigación y desarrollo hacia obje-

tivos que potencien las capacidades. De esta forma se podrán lograr mejores parámetros de competitividad global que permitan continuar con la creación de emprendimientos y puestos de trabajo altamente calificados y así contribuir al desarrollo. La región tiene una gran oportunidad generada por la globalización pero, para aprovecharla, necesita entender que es indispensable involucrar a la comunidad entera y participar activamente para capturarla. Se debe promover una cultura que favorezca a los emprendimientos y genere un mayor grado de asociatividad entre las empresas y la capacidad científica, así como la formación de redes de capital de riesgo que permitan la generación de nuevos negocios. Albert Einstein afirmaba que «…todos los imperios del futuro van a ser imperios del conocimiento, y solamente serán exitosos los pueblos que entiendan cómo generar conocimientos y cómo protegerlos, cómo buscar a los jóvenes que tengan la capacidad para hacerlo y asegurarse que se queden en el país. Los otros países se quedarán con litorales hermosos, con iglesias, minas, con una historia fantástica; pero probablemente no se queden con las mismas banderas ni con las mismas fronteras ni, mucho menos, con un éxito económico».

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PARTE II Herramientas Básicas Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 25 .

Silvia .26 RADICE.

-Capítulo 1 Morfogénesis in vitro Radice. cubrió el efecto de la leche de coco como estimulante de la formación de callo sobre el cultivo de embriones de Datura stramonium. mg l-1 de Kin con una previa inducción en MS + 2 mg l-1 de 2. Los avances en cultivo de tejidos fueron muy lentos en sus inicios.Embriogénesis somática obtenida en diversos cultivares de Prunus de embriones zigóticos inmaduros cultivados en MS + 0. raíces o flores.4-D. B.(Fig. trabajando con cultivos de callo de tabaco.1 mg l-1 de ANA + 1 baco. aún desconocidos en ese entonces. no pudo demostrar su hipótesis debido a que no pudo lograr la división celular porque los medios de cultivo que empleaba no incluían reguladores del crecimiento. era regulada por el balance de auxinas/citocininas.representan 5 mm. Figura 1: A-F) Embriogénesis somática obtenida por cultivo in vitro. C y E) que posibilitó el manteni. raíces o de ambos. A. Este autor. fue posible demostrar que la diferenciación de brotes. quien propuso la teoría de que todas las células vegetales tienen la capacidad de regenerar plantas completas. raíces y/o flores (Fig. Definiciones medie la fertilización de las gametas. sin embargo. La recultivo. En 1934. Trabajos posteriores en callos de tabaco y con el agregado de cinetina . D y F) sp a partir de callos de zanahoria y ta.II. Las barras Posteriormente se des. Al mismo tiempo se identificó el ácido indol acético (AIA). Esta totipotencialidad celular había sido anunciada por Haberlandt en 1902. según las condiciones de respuesta a un determinado estímulo. 2) como po de células que. las cétras que por organogénesis pueden obtenerse tallos. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 27 . Silvia 1 Introducción La embriogénesis somática y la organogénesis son dos procesos morfogénicos muy frecuentes en el cultivo in vitro de especies vegetales.Embriogénesis somática en diferentes fases de crecimiento observada en miento indefinido in vitro Codiaeum variegatum (L) Blume cultivado en MS + 1 mg l-1 de BAP. La embriogénesis somática es el proceso por el cual se obtiene una estructura similar al embrión zigótico sin que 2 Tipos de morfogénesis. White pudo mantener en forma ilimitada el crecimiento de raíces en medios líquidos a partir de ápices de tomate. 1) o brotes. mienEn condiciones de cultivo in vitro. Skoog y Tsui en 1948. demostraron la existencia de una regulación química en la parte aérea y en la raíz. Estos órganos son lulas somáticas pueden regenerar embriones inducidos a partir de una célula o de un gru. tienen la propiedad de mantenerse en activa división. la primera citocinina descubierta.

B) Inicio de brotes (flechas) en hojas crecidas in vitro de «Crimson Gold» (Prunus persica L. En la fase de realización. fase de inducción y fase de realización. Si la forma- ción es de brotes. La denominación de morfogénesis directa o indirecta fue descripta por primera vez por Hicks en 1980. A) Callo organogénico obtenido en Abelia sp. concentración y combinación de reguladores del crecimiento agregados al medio de cultivo y el órgano a desarrollar. Las barras representan 5 mm. 2 A y Fig. 1 y Fig.) cultivadas en MS + 0. puede inducirse la formación de nuevos órganos de manera directa sin la formación de callo. La diferenciación de órganos a partir de callos o morfogénesis indirecta. Las líneas continuas expresan organogénesis o embriogénesis directa mientras que las líneas quebradas indican que la morfogénesis se obtiene por vía indirecta. (André) Rehder cultivadas en inducidas en MS + 1 mg l-1 de 2iP. raíces o flores se denomina organogénesis directa. D) Brotes florecidos in vitro de Abelia sp. 3). las células son receptivas al estímulo morfogénico y hay una relación directa entre el tipo. a partir de la siembra de un explante in vitro se observa la proliferación de células en forma desordenada y sin ninguna función predeterminada.Figura 3: Esquema de los diferentes procesos morfogénicos obtenidos a partir de la siembra in vitro de diferentes explantes. este proceso se denominará embriogénesis directa (Fig. En la segunda fase o fase de inducción. generación es un proceso que comprende diferentes fases que se suceden de manera similar para los tres tipos de morfogénesis citadas. De Klerk y colaboradores en 1997 denominaron a estas diferentes fases como fase de adquisición de la competencia.1 mg l-1 de ANA + 1 mg l-1 de Kin. C) Brotes de Gerbera jamesonii Bolus obtenidos a partir del cultivo de capítulos florales en MS 0. Si en cambio se induce la formación de embriones somáticos. A partir de la siembra in vitro de diferentes explantes relativamente grandes y en condiciones adecuadas. En la primera fase las células no responden al estímulo organogénico pero adquieren esa competencia durante una fase de desdiferenciación. estará condicionada a la previa formación de los meristemoides.1 mg l-1 de GA3. (André) Rehder cultivados en MS + 1 mg l-1 de BAP.75 mg l-1 de BAP + 0. E ) Raíces (flechas) crecidas de callo de Abelia sp . (André) Rehder cultivada en MS + 1 mg l-1 de picloran. 28 RADICE. Figura 2: A-E) Organogénesis somática obtenida por cultivo in vitro . previamente inducidas con 1 mg l-1 de picloran. 3). Si por el contrario. se iniciará la producción de callos o suspensiones celulares (Fig. la célula sufre las sucesivas divisiones para formar el órgano determinado.05 mg l-1 de IBA + 0. Silvia .

En el caso de iniciarse a partir de una célula. Su evolución determinará el crecimiento de un órgano como. el desarrollo de las mismas no está sincroniza- do. Así se pueden observar. D) Embriones somáticos en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurón 10 x. Este conjunto de células agrupadas a modo de esferas fueron denominadas meristemoides por Torrey en 1966. citoplasma denso. 20 x. pertenecientes a un explante cultivado in vitro o. disminuye el volumen de núcleo y nucléolo y desaparecen los gránulos de almidón. tienen gran cantidad de ribosomas. Seguidamente. 4 A). Las células embriogénicas desarrollan como embriones cuando las condiciones experimentales permiten que éstas expresen su potencial. se vacuolizan. Dentro de un grupo de células embriogénicas. sufre divisiones polarizadas formando un embrión globular. Las células embriogénicas son similares a las células meristemáticas debido a que no son demasiado voluminosas. como ocurre en las coníferas. a partir de una célula o grupo de células diferenciadas que promueven la proliferación celular (Fig. se suceden una serie de divisiones mitóticas.1 mg l-1 de GA3 4 x. una yema adventicia (Fig. Este tipo de meristema puede iniciarse en forma directa a partir de células diferenciadas. E) Embriogénesis secundaria en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurón 10 x. B) yemas adventicias (flechas) en ápices de Fragaria x ananassa Duch. En el caso de que los embriones somáticos se originen de un grupo de células pueFigura 4: A-E) Cortes histológicos de diferentes explantes cultivados in vitro. en particular por la gelificación de la laminilla media. a partir de una célula epidérmica o del mesófilo foliar. Las experiencias demuestran que las células embriogénicas se desarrollan sólo cuando se modifican las condiciones de cultivo. En general ocurren cuando se reducen las cantidades de auxina y citocinina o cuando se elimina la auxina. por ejemplo. C) grupo de células embriogénicas (flechas) en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurón. Estas células son capaces de dividirse o de transformarse en embriones según las condiciones del medio de cultivo. un nucléolo agrandado y pequeños granos de almidón. Sucesivamente se observa el crecimiento de uno o más cotiledones. que está rodeada por un polisacárido mucilaginoso. Estas células en general se agrupan y pueden variar en tamaño y número. ocurre que estas células embriogénicas se aíslan unas de otras por una importante modificación en su pared celular. el desarrollo de los tejidos provasculares.1 mg l-1 de IBA + 0. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 29 . en MS + 1 mg l-1 de AIA + 5 mg l-1 de BAP 10 x. es decir. indirectamente.3 Histología de la morfogénesis Después de 48 horas de realizada la siembra del explante en el medio de cultivo adecuado. Esta célula. A) Meristemoides (flechas) observados en cultivo de Silybum marianum L. lípidos y proteínas. es decir que su origen sea unicelular o pluricelular. la iniciación de los ápices radicales y de tallo y una progresiva acumulación de sustancias del tipo almidón. a través del estudio histológico. y son los responsables de la diferenciación de los nuevos órganos. pequeñas masas de células que contienen un citoplasma denso y grandes nucléolos.5 mg l-1 de BAP + 0. las células que no desarrollan proembriones comienzan el proceso de diferenciación. Pueden ocurrir dos situaciones ontogénicas diferentes. en donde pueden diferenciarse deposiciones de almidón en una etapa previa a la polarización de este proembrión. Luego ocurre la formación de la epidermis y adquiere la simetría bilateral. cultivados en Boxus + 0. 4 B).

4 C). desarrollan una epidermis. 1 A y B). no debe ser tomada como una anormalidad sino que puede ser síntoma de inmadurez debido a la rápida formación de los mismos. Sin el seguimiento histológico detallado. Se diferencian de las células embriogénicas por la falta de sustancias de reserva. causada por la pobre polarización del transporte de auxinas. de manera sucesiva. 1 C). 30 RADICE. Estas estructuras pueden ser denominadas como proembriones globulares (Fig. comparados con los embriones zigóticos de la misma es- pecie. Por esta causa. reducido o ausente de las reservas de almidón y/o proteicas. esta tarea es casi imprescindible para una correcta evaluación de las respuestas encontradas con los diversos medios de cultivo empleados. que corresponde a la individualización del ápice de la raíz y al procambium en respuesta a la elongación axial del embrión somático debido al transporte de auxinas (Fig. Sin embargo debido al bajo porcentaje de embriones que llegan a esta etapa. un tejido provascular. no es posible generalizar metodologías o protocolos de trabajo debido a que los medios de cultivo como las condiciones de cultivo seleccionados. Estas estructuras globulares producen cotiledones y se transforman en embriones somáticos con la formación de ápices de tallo y raíz. La falta del meristema apical o de una escasa deposición de sustancias lipoproteicas observada en los embriones somáticos de algunas especies. un denso citoplasma y un nucléolo voluminoso y teñido. el desarrollo del ápice radical. o la diferenciación y crecimiento de nuevos órganos. Los embriones somáticos. la formación del embrión somático sólo puede ser confirmado por la germinación (Fig. Los embriones de origen multicelular obtenidos por budding muestran la misma ontogenia que los zigóticos. Silvia . En este caso una etapa intermedia que permita la maduración de las estructuras formadas permitirá incrementar el porcentaje de embriones somáticos capaces de germinar. También se puede encontrar un contenido excesivamente alto. Los embriones somáticos se forman a partir de grupos de células epidérmicas y subepidérmicas (Fig. que el meristema apical o radical no estén desarrollados o que la embriogénesis sea repetitiva o secundaria (Fig. En dicotiledóneas. Un ejemplo de ello es el protocolo empleado por Stamp y Meredith en diferentes cultivares de Vitis vinifera. En cuatro de ellos fue posible la obtención de embriones somáticos a partir de embriones zigóticos. 4 E). 1 F). La anomalía más frecuente es la formación doble o triple del sistema vascular. frecuentemente desarrollan de manera anormal o son inmaduros. En una etapa posterior. pero estos resultados no se repitieron con el cultivar «Pinot Noir». por su delgada pared celular y su frecuente división celular. El desarrollo de un embrión somático de origen unicelular es comparable a la de un embrión zigótico. deben ser específicos para cada situación en particular.den observarse diversos patrones. El ápice de tallo se desarrolla más tarde en la etapa de cotiledonar. la etapa globular es seguida por una etapa corazón que se corresponde con la adquisición de la simetría bilateral: desarrollo de la epidermis. Estas células pequeñas tienen una alta relación núcleo/ citoplasma. acumulan material de reserva y también sufren la polarización. Para una misma especie puede ocurrir uno u otro tipo de inicio según las condiciones de cultivo. Este tipo de ontogenia de origen multicelular se llama comúnmente budding o embriogénesis adventicia . 4 Factores que afectan los procesos morfogénicos • Los cuatro factores principales que condicionan la obtención y el crecimiento de nuevos órganos en condiciones in vitro son: • el genotipo • las condiciones químicas seleccionadas para realizar el cultivo • las condiciones físicas seleccionadas para realizar el cultivo • el explante • El genotipo es un factor determinante en todos los procesos morfogénicos desde la capacidad del explante para su establecimiento en condiciones in vitro así como también para la proliferación de callo. así como también la producción de sustancias de reserva. En los embriones somáticos de algunas especies hay una etapa intermedia entre la globular y corazón llamada oblonga. de los estratos procambiales y.

Por ejemplo.• Varios son los compuestos químicos que influyen en los patrones morfogénicos in vitro dentro de los cuales podemos considerar: 1. En muchas de las especies vegetales. 4. de la especie empleada. En Cymbidium spp. una estrecha relación entre la composición hormonal del explante y la concentración de reguladores del crecimiento agregada al medio de cultivo. Antibióticos. existen otras formulaciones diseñadas para inducir determinados patrones morfogénicos. La composición salina más empleada para inducir la formación de callo. E. El genotipo y el tipo y concentración de reguladores del crecimiento empleados están estrechamente relacionados. se ha observado que el empleo de medio de cultivo líquido promueve una mayor diferenciación de protocormos respecto del mismo medio gelificado. es suficiente con el agregado de thidiazurón. Otro aspecto importante a tener en cuenta es la consistencia del medio de cultivo. la respuesta morfogénica observada varía de manera considerable.L-1 de AIA + 1 mg. En explantes de hoja de diferentes cultivares de Malus domestica se ha encontrado que 250 mg. donde se observó una respuesta morfogénica diversa según el tipo de agar seleccionado. L–1 de carbenicilina promueven la formación de callo y la kanamicina inhibe los procesos morfogénicos. para otras. Sin embargo.. 6. La composición salina del medio de cultivo. además. kanamicina y carbenicilina para la eliminación de Agrobacterium tumefaciens.L-1 de BAP. brotes o embriones somáticos en forma aislada. por ejemplo. En caso de seleccionar medios de cultivo líquidos. Las diferentes calidades existentes en el mercado modifican la expresión morfogénica debido a que pueden contener sustancias inhibitorias o promotoras del crecimiento. Tal es el caso del cultivo de hojas de Actinidia chinensis. Es un factor determinante en los procesos morfogénicos y está condicionada por el tipo y tamaño de envase seleccionado así como también el sistema de cobertura del mismo. 3. El cultivo líquido es imprescindible cuando se busca promover la morfogénesis indirecta a través de suspensiones celulares. Atmósfera gaseosa. Estos compuestos pueden promover la morfogénesis aun cuando la concentración salina no sea la adecuada. demostraron que este compuesto puede promover la embriogénesis somática debido a ciertos compuestos que se incorporan por difusión al medio de cultivo. El agente gelificante más empleado en el cultivo in vitro es el agar extraído de diversas algas marinas. es necesario el agregado de auxinas como ocurre en Tilia spp. es la de Murashige & Skoog (1962) (MS). 5. L–1 de cefotaxime aumentan significativamente la regeneración de brotes mientras que 500 mg. Carbón activado. En procesos de transformación es muy común el agregado de antibióticos del tipo cefotaxime.K. cuando el gelificante empleado fue Chubut-agar. Las tapas usadas en cultivo in vitro varían desde el tapón de algodón. El intercambio gaseoso es di- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 31 . sin embargo. Existe. A su vez. se observó una gran diferenciación de yemas adventicias. 2. Reguladores del crecimiento. Para ello es necesario cultivar los callos en medio líquido con agitación para permitir que las células se disgreguen y puedan diferenciar raíces. además. Agar. de producción nacional. cultivadas en una solución de MS con el agregado de 0. mientras que con el agregado de agar SIGMA R sólo se indujo la proliferación de callo. En general se usa para absorber compuestos tóxicos de la microatmósfera gaseosa o el exceso de reguladores del crecimiento presentes en el medio de cultivo. Puede emplearse como semisólido o líquido. película de resinite transparente o tapas rígidas de polipropileno. Pettersson y su equipo de colaboradores de la Swedish University of Agriculture. este proceso puede mantenerse durante varios subcultivos mientras que en medio de cultivo gelificado se observó que los protocormos tienden a formar tallos. papel de aluminio.1 mg. la organogénesis directa o indirecta en la mayoría de las especies vegetales. En condiciones óptimas de cultivo pueden incrementar significativamente la diferenciación de órganos. La selección del medio de cultivo líquido o sólido depende. como es el caso del crotón (Codiaeum variegatum). para la inducción de embriones somáticos. Suecia.

los procesos morfogénicos dependen del genotipo seleccionado. Por el contrario. El tratamiento de la planta madre. la humedad interior será del 100 %. Si este cierre es hermético. la humedad relativa y la luz. En cultivos de hojas de Streptocarpus x hybridus sometidos a diferentes temperaturas. mientras que por encima de los 30 ºC casi no hubo diferenciación. En trabajos realizados con Ficus lyrata se han encontrado concentraciones variables que van del 0. su acumulación tiene efectos inhibitorios. Para el cultivo de células. se observó que la regeneración mayor de brotes se obtuvo a 12 ºC. en condiciones de luz disminuye. según el tipo de sello o tapa empleados. El suministro de luz favorece la diferenciación de órganos. generalmente tóxicas para las condiciones in vivo . según la porción de la lámina que se cultive. mayor será la respuesta esperada. comunicación personal). 2. pero. es otro de los parámetros físicos a tener en cuenta. la humedad interna puede descender a niveles cercanos al 50 %. Estas concentraciones superiores a 1 %. el tipo de agar seleccionado y con la luz. En condiciones in vivo la atmósfera contiene 78 % de nitrógeno. el CO2 se incrementa mientras que.5 %. Una forma de incorporar etileno al envase de cultivo es a través de la esterilización del material de disección realizada con el material embebido en alcohol y flameado con mechero Bunsen. Es importante señalar que cuanto más se asemejen las condiciones in vitro a las óptimas de crecimiento de la especie estudiada. Silvia . En cultivos in vitro se han registrado. variando la concentración de sus compuestos hasta llegar a niveles tóxicos (Debergh. 21 % de oxígeno y 0. una tensión de oxígeno del 5 % estimula la producción de plantas a partir de anteras de tabaco. Este importante descenso del contenido de HR puede promover una pérdida veloz de agua del medio de cultivo. Tal como ya se señaló anteriormente. Para estimular la formación de callo es común que se prefiera la oscuridad. La cantidad de etileno producida in vitro varía con la especie. La luz suministrada a los cultivos debe ser evaluada en cuanto a la calidad.ferente para cada tipo de tapa.5 al 8. además. La concentración de dióxido de carbono (CO2) en la atmósfera gaseosa in vitro varía según la respiración y la actividad fotosintética de las plantas. debe sumarse el efecto del explante seleccionado. callos y anteras. Un ejemplo muy interesante es la diferente respuesta morfogénica observada sobre hojas de Camellia japonica cultivadas en un mismo medio de cultivo. Si existe la posibilidad de un intercambio gaseoso. el etileno actúa como promotor de la morfogénesis. En muchos casos. etileno y otros compuestos hidrocarbonados. La humedad relativa (HR) como medida de la cantidad de vapor de agua contenida en la atmósfera gaseosa. 32 1. El nivel de oxígeno disponible para el explante condiciona el crecimiento y los procesos morfogénicos. La temperatura de incubación de los cultivos es un factor importante a tener en cuenta. En alfalfa se puede obtener un buen incremento de material a partir de suspensiones celulares embriogénicas cuando la solución se satura con 70% de oxígeno en la solución. pero luego es inhibitorio del crecimiento de los órganos diferenciados. • Entre las condiciones físicas podemos mencionar los efectos de la temperatura. Estos resultados fueron obtenidos por Pedroso y Pais (1993) des- RADICE. La HR dependerá del sello o cobertura del envase empleado.035 % de dióxido de carbono. además. La respuesta morfogénica de un explante puede variar según se le proporcione luz o no. La presencia de etileno en condiciones in vitro promueve diversas respuestas. Si bien en las condiciones naturales de cultivo las plantas tienen diferencias térmicas durante el día y la noche. probablemente no son limitantes para la actividad fotosintética. la concentración de citocininas en el medio de cultivo. el tipo de explante. las condiciones físicas y fisiológicas en las que ésta se encuentre y el sector del cual se tome el explante determinarán a su vez la respuesta morfogénica en condiciones in vitro . En condiciones de oscuridad. la atmósfera interna también sufrirá variaciones. 3. intensidad y período de suministro. En general se necesita una buena aireación para obtener cualquier tipo de proceso morfogénico. en consecuencia. las temperaturas in vitro se mantienen casi estables.

Components of the gaseous environment and their effects on plant growth and development in vitro. Somatic embryogenic factors influencing coordinated behavior of cells as an embryogenic group. Arnholdt-Schmitt B. Figura 5: Esquema de las diferentes respuestas morfogénicas obtenidas después de seis semanas de cultivo in vitro de hojas de Camellia japonica L. regeneración directa de raíces. 2. E. embriogénesis somática directa. 1361pp. 1997. and MAHESWARAN. Plant Growth Regulation 15: 1-16. 1994. E. and WOLTERING.H.. callo organogénico.M. Regeneration of roots.C. G. Rev. Bot. Lieberei R. E.J. 3. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 33 . organogénesis indirecta. Gran Bretaña. 1. 1986. 57: 443-597. 5 Lecturas recomendadas BUDDENDORF-JOOSTEN. 46: 1-23. DE KLERK. 1993. Biologia Plantarum 39 (1): 53-66. shoots and embryos: physiological. biochemical and molecular aspects. 4.pués de seis semanas de cultivo in vitro previa inmersión del explante en una solución de IBA (1 mg l–1) durante 20 minutos (Fig. G. WILLIAMS. Butler and Tanner Ltd (ed). Ann. GEORGE.G.J. G. J. según la porción de la lámina cultivada. 5). 1980. Bot.. Plant propagation by tissue culture Part 1 The technology. Patterns of organ development in plant tissue culture and the problem of organ determination.S. HICKS. and Neumann K.

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• Obtención de plantas con sanidad controlada. La imprecisión de esta definición puede generar muchas polémicas. En este caso dependerá del sistema que se quiere utilizar. Asimismo. Es muy común la utilización del cultivo de tejidos para la obtención de plantas libres de virus (ver VIII. En este caso. entre ellos: 1. los explantes cultivados pueden ser diversos. si se pretende micropropagar mediante el empleo de semillas sintéticas (ver 35 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal .5mm de longitud) consistente del domo y de un par de primordios foliares. donde se obtienen respuestas rápidas y. Para el establecimiento de los cultivos utilizando cualquiera de los sistemas es necesario tener en cuenta algunos aspectos generales comunes relacionados con el explante. En cambio. se podría esquematizarlas en aplicaciones para: • Estudios básicos . los que a su vez pueden ser agitados (mediante el empleo de agitadores de uso continuo) o estacionarios.-Capítulo 2 Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales Mroginski. El explante que se usará estará condicionado por lo que se quiere estudiar. Objetivo del cultivo: si bien es difícil tratar de clasificar las aplicaciones que se persiguen con el cultivo de tejidos.2-0. A veces se hace uso del cultivo de tejidos porque representa un sistema experimental que simplifica la complejidad generada por los fenómenos de correlación entre las distintas partes que normalmente están presentes en una planta entera. que es de gran importancia en la mayoría de las aplicaciones del cultivo de tejidos en la agricultura.-9). También es frecuente dividir al cultivo de tejidos atendiendo a los niveles de complejidad en cultivo de órganos.II. tejidos u órganos) se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Flaschland. Luis. tejido o célula viva. Pedro. Generalmente es común dividir las técnicas del cultivo de tejidos en dos grandes grupos: a) cultivos en medios semisólidos y b) cultivos en medios líquidos. • Micropropagación . Sansberro. en general. el medio de cultivo y las condiciones de incubación. de 0. El cultivo de discos de tallos brindó una valiosa ayuda para estudiar la rizogénesis in vitro. La discusión de estos aspectos constituye el objetivo de este capítulo. Eduardo 1 Introducción El cultivo de tejidos –en su acepción amplia– puede ser definido como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explante (una parte separada del vegetal que pueden ser protoplastos –células desprovistas de pared celular– células. la asepsia. hay menores problemas de contaminación con microorganismos. Si lo único que se quiere lograr es un sistema de callos para estudiar algún proceso fisiológico. 2 Explante Varios factores deben ser tenidos en cuenta en la elección del explante apropiado para el establecimiento de los cultivos in vitro. En este caso el cultivador de tejidos debe conocer perfectamente la biología de la reproducción de la planta para aprovechar aquellos explantes que en forma natural son propágulos. cultivos celulares y cultivo de protoplastos. Un buen ejemplo lo constituye el cultivo de ovarios fecundados del tomate para estudiar los requerimientos nutricionales durante el crecimiento de los frutos. En este caso –en que lo único que se busca es la inducción de callos– lo ideal es cultivar explantes jóvenes. derivados de semillas en germinación. Si lo que se quiere explotar es la brotación de meristemas. El explante ideal para ello es el meristema (dependiendo de la especie. los ápices terminales y los segmentos uninodales de ramas jóvenes constituyen excelentes explantes. Adicionalmente se incluye el tema de la aclimatación de las plantas regeneradas in vitro. el cultivo de óvulos ha sido muy útil para estudiar aspectos relacionados con la formación de las fibras en algodón. se puede cultivar cualquier órgano. pero es actualmente aceptada.

conservación con nitrógeno líquido) y para el intercambio de material genético. 5. En este caso. En este caso. raíces). la edad del explante es un factor crítico. la micropropagación tiene mayores posibilidades de ser exitosa que con tejidos maduros. rizomas) que provienen de plantas crecidas en macetas o en el campo. En general. • Obtención de híbridos interespecíficos. se aíslan los embriones en un estado temprano de desarrollo («corazón») como en el caso de yerba mate o de algunas variedades de duraznero. los explantes utilizados deben posibilitar la regeneración de plantas enteras. En el caso de la micropropagación de plantas leñosas. Edad fisiológica. el explante cultivado es el embrión cigótico en estadios tempranos de su desarrollo. • Inducción de variación somaclonal. la utilización de embriones zigóticos inmaduros u hojas. Los meristemas son los explantes preferidos para el desarrollo de sistemas de conservación a mediano y largo plazo (crío. Para esta finalidad se recurre a la fusión de protoplastos. con ello se reduce sustancialmente las tasas de contaminación. • Establecimiento de suspensiones celulares. Tamaño. pero si la finalidad de su utilización es la aplicación en planes de mejoramiento genético de plantas. 4. FLASCHLAND. SANSBERRO. dado que en la mayoría de los casos no es posible conseguir una buena desinfección de los mismos. • Producción y/o conversión de sustancias útiles. Luis. se deben cultivar explantes de plantas dadoras que crecen en condiciones de invernadero. por debajo del cual no es fácil lograr el establecimiento de los cultivos. mejor será su respuesta in vitro . Pedro. cuanto más grande sea el explante mayores serán las posibilidades de inducir la proliferación de callos o la regeneración directa de órganos. • Obtención de híbridos somáticos . Epoca del año. Si los tejidos son jóvenes. cotiledones. Posibilidad de contaminación con microorganismos. En la mayoría de los casos se aíslan los protoplastos de mesófilos de hojas y de suspensiones celulares. Este hecho genera la necesidad de realizar tratamientos de rejuvenecimiento de las plantas dadoras de explantes. donde se produce el aborto temprano de embriones. 2. que depende de la especie y del material vegetal. Como regla general se puede decir que cuando más joven e indiferenciado se encuentre el explante a cultivar. En estos casos. Por otra parte. De ser posible.V. Para esta finalidad los explantes pueden ser semillas (por ej. suelen ser frecuentes como explantes. En este caso se pueden utilizar varios explantes. óvulos y ovarios no fertilizados. Eduardo . orquídeas) o bien. • Obtención de plantas haploides (considerando como haploide a un esporofito que contiene el complemento gamético de cromosomas). • Obtención de plantas de semillas con embriones rudimentarios. los explantes más utilizados son las anteras. Es un factor que suele tener mucha importancia en la micropropa- 36 MROGINSKI. Una de las primeras aplicaciones del cultivo de tejidos en la agricultura lo constituyó su empleo como ayuda para la obtención de híbridos derivados de cruzamientos interespecíficos. aunque también pueden emplearse microsporas aisladas. Explantes de raíces suelen ser muy utilizados. Es por ello que los meristemas apicales y axilares son ampliamente usados en numerosas especies. • Conservación e intercambio de germoplasma . Sin embargo. En este caso se recomienda iniciar los cultivos a partir de explantes extraídos de semillas en germinación (hipocótilo. Este es un aspecto de gran influencia en la morfogénesis.-2) el explante original deberá posibilitar la inducción de la embriogénesis somática. 3. a mayor tamaño de explante también son mayores las probabilidades de que los cultivos se contaminen con microorganismos. También es necesario tener en cuenta que existe un tamaño mínimo del explante. Los explantes muy pequeños suelen requerir del empleo de medios más complejos o de los denominados medios acondicionados. Se puede utilizar una gran variedad de explantes. es recomendable evitar el uso de «explantes sucios» (raíces. epicótilo. Con la misma finalidad también se utilizan ovarios u óvulos fecundados.

fitoplasmas. En lugar del hipoclorito de sodio se puede utilizar hipoclorito de calcio (6 -12 %) o el cloruro de mercurio (0. Enterobacter. Algunos procedimientos se basan en el empleo de únicamente etanol o de hipoclorito de sodio. Lactobacillus. Para evitar y/o minimizar las contaminaciones de los cultivos con microorganismos es necesario: 1) Conocer el material vegetal con que se trabaja y los posibles contaminantes específicos. 2) Realizar una adecuada preparación de la planta dadora de explantes. 3) Proceder a la desinfección superficial de los explantes mediante el uso de compuestos químicos con el objeto de eliminar los microorganismos con el menor daño posible para el explante. En este último punto hay que aconsejar que se utilice agua destilada estéril de reciente preparación. levaduras. La correcta detección de estas fuentes y del tipo de microorganismo son aspectos importantes para el éxito de los cultivos. Es conveniente ins- peccionar visualmente –con la ayuda de un microscopio estereoscópico– los cultivos en forma periódica (por lo menos semanalmente). Agrobacterium. Finalmente. durante 3 a 30 minutos. dado que es altamente tóxico y además no es removido con facilidad del explante. Es aconsejable realizar estas operaciones de desinfección superficial en una cámara de transferencia con aire estéril.gación y que generalmente está asociado al grado de dormición que presentan ciertos explantes (yemas. por lo que en la práctica. dependiendo de la naturaleza del explante. pero en promedio. cuando se refiere a cultivos asépticos.1-1. estos microorganismos no destruyen los cultivos pero compiten con el explante por los nutrientes del medio de cultivo o bien lo modifican. Bacillus. Xanthomonas. ayuda a la planificación de los procedimientos para controlarlos. Erwinia. se puede señalar que el procedimiento más popularizado consiste en una doble desinfección mediante la inmersión de los explantes en etanol (70%v/v) durante 20-60 segundos seguido de hipoclorito de sodio 1 -3%. También se pueden realizar pruebas con medios de cultivo diferenciales y «test» bioquímicos específicos. Fusarium. dado que está demostrado que el almacenaje prolongado del agua estéril puede ser la causa de contaminaciones con bacterias. Alternaria. Es difícil cuantificar el impacto de estas pérdidas. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 37 . Varios géneros de bacterias (Pseudomonas . Cladosporium y Neurospora) están frecuentemente en los cultivos . por ejemplo) y también con la posibilidad de mayor o menor proliferación de microorganismos. Es muy difícil conseguir cultivos estrictamente asépticos dado que en la mayoría de los casos es altamente probable que los mismos contengan virus y fitoplasmas. Staphylococcus. contenido en el agua de lavandina comercial. Es preciso recomendar extrema cautela con el empleo de este último compuesto. pues por un lado ayuda a determinar la fuente de contaminación y por otro lado. virus). Penicilium. Si bien no es posible recomendar un procedimiento general. En el mejor de los casos. en general se quiere significar que son cultivos donde no se produce la proliferación de hongos y bacterias. Dos son las fuentes de contaminaciones: a) microorganismos presentes en el interior o en la superficie de los explantes y b) fallas en los procedimientos de cultivo en el laboratorio. El ambiente generado por explantemedio de cultivo-condiciones físicas de incubación es altamente propicio para la proliferación de muchos de estos microorganismos que pueden provocar la destrucción de los cultivos. cultivándola preferentemente en invernaderos tratadas con productos químicos que eliminen patógenos y eventuales microorganismos endófitos. es necesario eliminar los restos de estos productos mediante varios lavados con agua destilada estéril. Mycobacterium. en laboratorios dedicados a la micropropagación se lo puede estimar en alrededor del 10%. Micrococcus. Corynebacterium) y de hongos filamentosos ( Aspergillus.5%). 3 Asepsia Uno de los principales problemas que se presentan cuando se tratan de establecer los cultivos es el de la contaminación de los mismos con diversos tipos de microorganismos (hongos. bacterias.

Los operarios constituyen frecuentemente una importante fuente primaria de contaminación. Eduardo . Uno de estos compuestos es el PPM (Plant Preservative Mixture). por lo que es recomendable que. previenen la germinación de esporas y a altas concentraciones pueden eliminar contaminaciones de microorganismos endófitos. En algunos materiales vegetales se utiliza la preincubación de los explantes mediante lo cual éstos son desinfectados suavemente y precultivados durante 24 horas en un medio conteniendo sacarosa. 5) Cultivar los explantes en una cámara de transferencia con aire estéril («gabinete de flujo laminar»). pero deben ser utilizados en casos excepcionales. químicamente: 1-(5-bromofur-2-il)-2bromo-2-nitroeteno fue desarrollado en la Universidad Central de las Villas (Cuba) y tiene efecto bactericida y fungicida de amplio espectro. Para la esterilización. La mesada de trabajo y las paredes del gabinete deben ser desinfectadas previamente con etanol al 70%. para aquellos que posean componentes termolábiles). En el caso de sustancias termolábiles. antes de comenzar a trabajar laven sus manos y antebrazos con abundante agua y jabón y se desinfecten con etanol al 70 %. el tiempo de esterilización y la naturaleza de la sustancia a esterilizar. Entre los más usados figuran Tween-20 (0. Este compuesto. es necesario desinfectar las semillas para su cultivo y germinación y luego es aconsejable desinfectar también las plántulas resultantes. cápsulas de Petri. benomil. Pedro. se pueden sustituir con cuartos esterilizados previamente con luz ultravioleta (nunca exponerse a la luz UV en forma directa). como se indicó más arriba. No es posible recomendar ningún sistema de esterilización dado que la exitosa destrucción de los microorganismos depende de múltiples factores entre los que interesan el tamaño del recipiente. un compuesto derivado de los furfurales de la caña de azúcar.En los casos en que no se utilice etanol. con lo que prácticamente se destruyen todas las formas de vida.01 – 0. • La esterilización con calor húmedo con vapor bajo presión (en autoclave o en una «olla a presión»). 2-4 horas en estufas a 180-200 ºC brindan excelentes resultados. liberados completamente de cualquier microorganismo vivo o esporas. Se pueden usar hor- nos a microondas. El agua caliente también puede ser usada.) que ingresen en el área del aire estéril. Es importante que en todos los puntos del autoclave se alcance dicha temperatura. De la misma manera deben ser desinfectados exteriormente todos los recipientes (conteniendo medios de cultivo. carbendazim) puede ser de utilidad. la esterilización se puede hacer mediante filtración a través de filtros bacteriológicos. Ultimamente han aparecido soluciones biocidas que matan bacterias y hongos. etc. Estos productos tienen el inconveniente de que alteran la composición de los medios de cultivo y además pueden ser metabolizados por los explantes. ayuda a una mejor desinfección. en la mayoría de los casos se hace uso del calor en sus diversas formas: llama directa. La inmersión de los explantes en soluciones conteniendo sustancias antibióticas y /o antimicóticas (gentamicina. ampicilina. Otro ejemplo es el denominado G-1. calor húmedo (en forma de vapor abierto o bajo presión). 4) Emplear medios e instrumentos de cultivo esterilizados. La 38 MROGINSKI. carbenicilina. FLASCHLAND. sulfato de gentamicina. pentacloronitrobenceno.1%) o unas gotas de Triton.cm-2 durante 20 minutos. rifampicina. El lavado previo de los explantes con agua corriente y detergentes. SANSBERRO. para lo cual hay disponibles cintas detectoras colorimétricas. tetraciclina. la adición de agentes tensoactivos junto con el desinfectante es una práctica recomendada. es el procedimiento más empleado para la esterilización de los medios de cultivo (salvo. y finalmente son desinfectados nuevamente y cultivados. En este caso. sulfato de estreptomicina. tubos). Luis. es decir. agua. localizada en un ambiente limpio y no expuesta a corrientes de aire. calor seco (aire caliente). En estos casos. Sin embargo. En los casos en que se utilicen plántulas crecidas in vitro como plantas dadoras de explantes.46 kg. De no disponer este equipamiento. se pueden dar algunas sugerencias: • La esterilización en estufas mediante calor seco (aire caliente) es recomendable para esterilizar recipientes de vidrios secos (pipetas. lo más común es usar una presión de 1. anfotericina B.

lo que lo hace disponible en un amplio rango de pH. se deben flamear cuidadosamente en la llama de un mechero. En casos particulares se cita el empleo de maltosa o galactosa. 2iP.20%). cápsulas de Petri) deben ser esterilizados antes de su uso. «Transfergel» (2-2. es usado en algunos casos. aunque hay que tener presente que en dosis altas pueden inhibir el Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 39 . es el azúcar más utilizado. IBA. cada una de las cuales comprende entre 6 y 40 compuestos. En lo posible se debe restringir la circulación de personas. El nitrógeno es suministrado en forma de amonio y/o nitrato.10-0. Los instrumentos de trabajo (pinzas. Sustancias vitamínicas: De todas las que comúnmente se incorporan a los medios. asparagina y cisteína.40-0. pipetas. agarosa (0. otros aminoácidos se pueden agregar a los medios.90%) y «Gelrite» (0. En general se destacan las concentraciones relativamente altas de nitrógeno y potasio. 6) Incubar los cultivos en cámaras o cuartos de cultivo. de variada composición química.000 trabajos científicos describen en dos tomos (casi 1.40%). Existen numerosas formulaciones. glutamina y caseína hidrolizada. los medios de cultivo se componen de: • ·Una fuente de carbono • ·Nutrientes minerales • ·Sustancias vitamínicas • ·Sustancias reguladoras del crecimiento • ·Agente gelificante (en el caso de medios semisólidos) • ·Otros compuestos Fuente de carbono: Prácticamente todos los cultivos son heterótrofos (comparativamente unos pocos son autótrofos) y por ende necesitan del suministro de una fuente de carbono. También pueden emplearse «Agargel» (0. 4 Medios de cultivo Un medio de cultivo puede ser definido como una formulación de sales inorgánicas y compuestos orgánicos requeridos para la nutrición y manipulación de los cultivos.000 medios de cultivo. También es necesario flamear la boca de los recipientes que contienen los medios de cultivo antes y después de cultivar el explante. estos cultivos sean esterilizados. AIA. en concentraciones de 2 al 5%. pareciera que la tiamina es la única realmente imprescindible para el buen crecimiento de los cultivos. luego de revisar más de 3. El ABA. Thidiazurón).4-D.000 páginas en total) más de 2.6 y 1%) es el compuesto más utilizado. CIN. En la Tabla 1 se presentan tres medios que son muy usados en la actualidad. También se pueden utilizar urea. Además de la glicina. Otros compuestos : Muchas sustancias. En algunos medios se la reemplaza por glucosa. También myo-inositol (100 Mg/L) suele ser incorporado a los medios resultando un mejor crecimiento de los cultivos.80-0.250. agujas. libres de corrientes de aire y bien higienizados. y los recipientes con cultivos contaminados deben ser rápidamente eliminados de este sector. suelen ser adicionadas a los medios básicos.60%). cerrados.utilización de guardapolvos. Sustancias reguladoras del crecimiento: En la mayoría de los casos los medios utilizados para el establecimiento de los cultivos contienen auxinas (ANA. listos para su utilización especialmente en la micropropagación comercial de plantas. También dos empresas multinacionales ofrecen para la venta más de 60 medios cada una. «Phytagel» (0.. Es el caso de L-tirosina. Para dar una idea de la cantidad de formulaciones disponibles. George y col. Es conveniente que antes del lavado. Muchos de estos instrumentos pueden ser colocados en etanol al 95% y. así como los gorros protectores de los cabellos. Agente gelificante (en el caso de medios semisólidos): El agar (entre 0. Nutrientes minerales: Los medios de cultivo deben suministrar los macro y micronutrientes esenciales para el crecimiento de las plantas enteras. 2. ayudan a reducir sensiblemente los niveles de contaminación. antes de ser usados. Básicamente. Dicamba. NOA.60%). Es fundamental que el hierro sea incorporado conjuntamente con un agente quelante (Na2EDTA). ZEA. Picloram) y/o citocininas ( BA. guantes y máscaras protectoras de la boca y de la nariz. Las giberelinas (especialmente GA3) son requeridas en algunas ocasiones para el cultivo de meristemas o para la elongación de brotes. tijeras. La sacarosa.

Durante el período de incubación. sumado a la ausencia de microorganismos. La preparación de los medios de cultivo puede llevarse a cabo de diferentes maneras. Este ennegrecimiento puede causar la muerte de los mismos. La estrategia a implementarse durante el mencionado ciclo deberá contemplar el control minucioso de los parámetros ambientales (humedad. dado que es probable que absorba metabolitos tóxicos para los cultivos. La incubación de los cultivos se debe lleEl retraso en el desarrollo de la cutícula y var a cabo en condiciones controladas. ácido ascórbico. al mismo tiempo. el medio de cultivo compuesto por concentraciones elevadas de azúcares (en aquellos sistemas heteró-trofos y semiautótrofos de micropropagación). A su vez. tico que presentan las hojas de la mayoría crecimiento de los cultivos. En general. en «lecturas recomendadas» se citan manuales de laboratorio donde se describe detalladamente este punto. Este período de adaptación al nuevo hábitat es llamado fase o etapa de aclimatación. una buena y uniforme circulación de aire en el interior. 6 Aclimatación de las plantas regeneradas in vitro. con ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas. Pedro. por presentar una considerable variación diurna en la concentración de CO2. calidad e intensidad de luz. los cultivos son expuestos a condiciones ambientales disímiles al ambiente externo. Tabla 1: Composición de tres medios básicos usados en el cultivo La atmósfera interna se caracteriza in vitro de tejidos. SANSBERRO. fotoperíodo. dotados de un buen sistema de alarma para interrumpir la iluminación en caso de no funcionar el aire acondicionado. FLASCHLAND. Por la escasa funcionalidad del aparato estomálo menos en lo que se refiere a temperatura. Aún hoy se siguen utilizando ciertas sustancias de composición química indefinida como el agua de coco (5 a 15%).La humedad atmosférica debe ser elevada (8090%). Luis.1 a 5%) suele ser incorporado al medio. generan anormalidades morfológicas. estimular la fotosíntesis con 5 Condiciones ambientales para la el objeto de generar un rápido crecimiento incubación. de los plantines. humedad atmosférica e higiene. temperatura y luz) de tal manera que permita disminuir la deshidratación y. Estas condiciones se logran con el empleo de cámaras climatizadas o cuartos especialmente preparados con aire acondicionado (frío-calor). jugo de tomate y puré de banana.s-1. el pirúvico y el succínico y es frecuente el empleo de Lglutamina y de caseína hidrolizada. Eduardo . polivinilpirrolidona) para prevenir el ennegrecimiento tisular causado por la oxidación de polifenoles presentes en los explantes. El carbón activado (0. La luz es generalmente provista por lámparas fluorescentes del tipo «luz día» con una irradiancia de entre 50 y 200µmol. En algunos medios se incorporan ácidos orgánicos como el málico. anatómicas y fisiológicas que las plantas deberán corregir cuando son transferidas al ambiente externo. humedad relativa elevada. los cultivos son incubados a temperatura constante de 25-28 ºC. sales y reguladores del crecimiento. 40 MROGINSKI. el cítrico.m-2. También en ocasiones es necesaria la incorporación de agentes antioxidantes (Lcisteína. temperatura constante e intensidad lumínica baja.

El sistema humidificador está compuesto por picos tipo «fog» y es alimentado por una bomba de bajo caudal y alta presión (13). es posible establecer la temperatura de la fase gaseosa entre los 25 y 30 ºC durante la estación estival. esta cámara puede ser utilizada tanto para el enraizamiento ex vitro de los brotes obtenidos en la etapa de multiplicación. en aquellas latitudes donde el nivel medio de luz natural es bajo y los días son cortos durante una parte considerable del año. ya sea a través del sustrato (fertilizantes de liberación controlada) o bien. conjunta- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 41 . se detalla un modelo de cámara de aclimatación diseñada por los autores y empleada por el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del Instituto de Botánica del Nordeste. pudiendo utilizarse desde túneles de polietileno para plantas que posean un elevado control de la transpiración (por ej. Se puede emplear: arena. o mezclas de ellos.de las especies cultivadas in vitro. para mantener la temperatura por encima de los 18-20 ºC. Mediante el empleo de extractores y/o acondicionadores de aire combinados con un sistema de niebla. Asimismo. la opción más económica es el empleo de la luz natural. El equipamiento necesario estará sujeto a la especie. está compuesta por una fase aérea construida en aluminio y policarbonato alveolar (9) y un recipiente o batea (11) que contiene gránulos de arcilla expandida a fin de facilitar el drenaje. Malus pumila o Agave tequilana) o bien. En la Figura 1.1) equipadas con sensores que permiten un descenso paulatino de la humedad relativa. a través del empleo de cámaras climatizadas (Fig. Con el propósito de evitar el goteo que pudiese ocasionar el agua remanente en las cañerías. turba. sea de agua o aire caliente a nivel del substrato. Sin lugar a dudas. teniendo la precaución de realizar una esterilización previa. Mediante el agregado de arena u otro substrato adecuado. determinan una alta tasa de transpiración que puede ocasionar la muerte por deshidratación. Es conveniente el agregado de fertilizantes. Otro aspecto importante a tener en cuenta lo constituye la elección del sustrato. El control de este proceso fisiológico es de vital importancia durante la aclimatación. como así también. la luz artificial puede ser aplicada como complemento de la luz natural. el empleo de mantas térmicas o serpentinas. teniendo en cuenta que la disminución de la transpiración será gradual y dependerá de la rehabilitación de los estomas. No obstante. las lámparas tubulares de sodio alta presión presen- tan una distribución espectral de la energía adecuada para estimular fotosíntesis y se emplean para tal fin en una amplia variedad de cultivos. el sistema consta de una válvula solenoide de descarga y desagüe (7). En este último caso deberán tomarse algunas precauciones debido a que pueden observarse reacciones de fitotoxicidad. Básicamente. mientras que en la época invernal es necesario. empleándose proporciones ricas en fósforo (N-P-K: 9-45-15) y potasio (N-P-K: 4-25-35) que favorecerán el desarrollo radicular y la rustificación de las plantas. fungicidas e insecticidas de uso universal. disminuyendo su irradiancia (20-50%) mediante el agregado de mallas de sombreado («saram»). La humedad relativa de la fase aérea es controlada por un sensor (6) ubicado por encima de la tubería de riego (4). perlita. En todo momento deberá realizarse un riguroso control fitosanitario empleándose antibióticos. Las lámparas tubulares fluorescentes del tipo «luz día» son empleadas en horticultura para prolongar el fotoperíodo. siendo el adecuado aquel que permita el normal crecimiento y desarrollo de las raíces. vermiculita. La fase gaseosa es renovada en forma intermitente mediante el empleo de extractores ubicados en ambos extremos de la cámara (3) los que. a veces. mediante el sistema de riego (fertilizantes solubles). Resulta imprescindible evitar la exposición a temperaturas extremas tanto en la fase aérea como en el substrato. En algunos casos puede resultar necesaria la aplicación exógena de ABA (hormona involucrada en el control del cierre de los estomas) o bien. así como también del desarrollo de la cutícula. el empleo de sustancias antitranspirantes que forman una capa semipermeable en la superficie de la hoja. para el enraizamiento convencional (a «raíz desnuda») de estacas de tallos u hojas.

1998.J. Brasil. y L. y dado que la mayoría de las especies estudiadas son originarias de climas tropicales y subtropicales. 1991. A su vez. Propagación y Mejora Genética de Plantas por Biotecnología. D. Biologia Plantarum 42: 481497.M. 1993 (segunda edición). GEORGE. GEORGE.A.. England. Vol. CALDAS. CALDAS y J. Eduardo . PUTTOCK y H.E. A. y MERINO. I.1) Embrapa. HAISEL. Pablo F. (Vol. 1999 Cultura de Tecidos e Transformacao Genética de Plantas. 2 (Commentary and analysis). Cultivo de tejidos en la Agricultura: Fundamentos y aplicaciones. J. 390 pág. Ed.. Instituto de Biología de Plantas.509 pág. Cultura de Tecidos e Transformacao Genética de Plantas. A la Secretaría General de Ciencia y Técnica (UNNE) y al Establecimiento La Cachuera por el aporte financiero recibido para construir la misma. Cali. Colombia. México. 1988. PÉREZ PONCE. 42 MROGINSKI. J. Brasil. A.F. MROGINSKI.. Plant Culture Media .Santa Clara. M.A. England. W. manteniendo la temperatura del substrato durante el invierno. ROCA. L.J.355 pág. PLZAKOVA.J. POSPOSILOVA.A. 1987.F.C. Figura 1: Diseño de una CÁMARA DE ACLIMATACIÓN mente. 1 (Formulations and Uses). y J.N. D. S. 8 Lecturas Recomendadas GEORGE. 420 pág. BUSO. D. Cultivo de Tejidos Vegetales. Pedro. la cámara está equipada con un acondicionador de aire (3000 frigorías) para evitar situaciones de estrés térmico en época estival. (Vol.A. PUTTOCK y H. Plant Culture Media .M. Cuba.A. P. introducen o extraen aire. FLASCHLAND. 1998. Vol. Luis. TICHA. E. Exegetics Limited.2) Embrapa. Luna por la planificación digital de la cámara de aclimatación. Exegetics Limited. Acclimatization of micropropagated plants to ex vitro conditions. HURTADO.J. En este último caso se agrega un material aislante entre la leca (10) y la malla de hierro (16) de tal manera de dirigir el calor hacia la fase aérea. GEORGE. 567 pág. generando un movimiento masal. KADLECEK. 1999. D. CIAT. TORRES.V. 970 pág.Trillas.M. E.C. 232 pág. el sistema cuenta con mantas térmicas que son colocadas por debajo de los tubetes.. BUSO.. L.7 Agradecimientos Los autores agradecen al Ing. Debido a la latitud geográfica en que se encuentra. SANSBERRO. TORRES.

II. El contacto se realiza a través del filamento o pelo sexual. Sin embargo. que es una pequeña proteína que induce la síntesis de 8 a 10 nuevas proteínas requeridas para la transformación. Viviana 1 Introducción Hasta aproximadamente 1970 el ADN era la molécula de la célula que planteaba más dificultades para su análisis bioquímico. que requiere energía. Marisa. trayendo aparejado un cambio genético. 3 La clonación molecular El desarrollo de la tecnología del ADN recombinante y la clonación molecular han Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 43 . reemplazando al genoma del fago. En ambos casos. que permite el apareamiento específico y que poseen sólo las células donadoras. • Conjugación: es un proceso de transferencia genética que requiere contacto de célula a célula y que está mediado por un plásmido. otros elementos genéticos resultan a veces movilizados durante la conjugación. ni todas las bacterias son transducibles. Pero el fenómeno está lo suficientemente extendido para suponer que desempeña un importante papel en las transferencias genéticas que se producen en la naturaleza. del ARN o por el análisis genético. algunas de las cuales son nuevas.-Capítulo 3 Herramientas básicas de ingeniería genética Gómez. que contiene un tipo particular de plásmido conjugativo. Echenique. La conjugación requiere una célula donadora. que puede proceder de cualquier porción del genoma del hospedador. Una célula que es capaz de tomar una molécula de ADN y ser transformada se dice que es competente. Consiste en la transferencia de una copia de este plásmido al nuevo hospedador. El movimiento de las moléculas de ADN a través de la membrana y dentro del citoplasma de la célula receptora es un proceso activo. como pueden ser otros plásmidos o grandes bloques del cromosoma del hospedador. Puede ocurrir de dos maneras. 2 Genética microbiana En los procariotas existen mecanismos de intercambio genético que permiten tanto la transferencia de genes como la recombinación. La recombinación genética en procariotas ocurre porque se transfieren fragmentos de ADN homólogos desde un cromosoma donador a una célula receptora por uno de estos tres procesos: • Transformación: es un proceso por cual el ADN libre del medio ambiente se incorpora en una célula receptora. tales como la determinación de la secuencia de proteínas. el ADN de una región específica del cromosoma del hospedador se integra directamente en el genoma del fago. Actualmente es posible separar regiones determinadas del ADN. reemplazando algunos de sus genes. • Transducción: es un proceso por el cual el ADN se transfiere de una célula a otra por medio de un virus (que en el caso de hospedadores bacterianos se denomina fago). y una célula receptora que carece de él. En la llamada transducción generalizada. una fracción del ADN celular. Esto ocurre sólo en algunas especies bacterianas. pero otras son adaptaciones de procesos naturales de la genética microbiana que han sido estudiados y se conocen en profundidad. que ocurre sólo en algunos fagos atemperados (aquellos que se integran en el genoma como parte de su ciclo biológico). la secuencia de nucleótidos del ADN sólo podía ser estudiada por caminos indirectos. Estos adelantos técnicos forman parte de la tecnología del ADN recombinante. No todos los fagos pueden transducir. Estas células secretan el factor de competencia. pasa a formar parte del ADN de la partícula vírica madura. Excesivamente larga y químicamente monótona. constituida por una mezcla de técnicas. Constituye un puente de conjugación a través del cual pasa el ADN. En la transducción especializada. obtener cantidades ilimitadas de esos fragmentos y determinar incluso la secuencia de esos nucleótidos. ya que los genes víricos han sido reemplazados. la partícula vírica transductora es normalmente defectiva como virus.

La finalidad de la clonación molecular es aislar gran cantidad de genes específicos. A fin de seleccionar las células que incorporaron el vector. estudio. Marisa. Si se parte de ADN genómico. El procedimiento implica esencialmente dos etapas (Fig 1): • Creación del ADN recombinante. que consta de dos pasos: 1) Aislamiento del ADN de partida. Sólo éstas sobrevivirán. A fin de separar las células que incorporaron el plásmido de las que no lo hicieron se inoculan las células en un medio sólido (agarificado) que contiene el antibiótico al cual son resistentes las células que poseen el vector.. 3) Crecimiento y amplificación de las células hospedadoras que incorporaron el ADN recombinante deseado para su aislamiento. 2) Detección y purificación del clon deseado. También se utiliza ampliamente la introducción del ADN mediante electroporación (descargas eléctricas que crean poros en la membrana celular permitiendo la introducción del ADN). Los vectores de clonación están diseñados de forma tal que permiten la recombinación de ADN foráneo en un sitio de restricción del vector. que puede ser procariota (bacterias) o eucariota (levaduras. En primer lugar el ADN a clonar y el vector (plásmido) se cortan con la misma enzima de restricción. Viviana .aportado sofisticados procedimientos que permiten el aislamiento. Involucra tres pasos: 1) Introducción y mantenimiento del ADN recombinante en un organismo hospedador. generalmente se corta con enzimas de restricción para obtener los fragmentos a clonar. Un vector es una molécula de ADN que vehiculizará al fragmento de interés. ECHENIQUE. Luego deberá buscarse específicamente aquellas células que poseen el fragmento de interés. transducción. la introducción se realiza por los procesos naturales de la genética microbiana (transformación. ADN amplificado por la reacción en cadena de la polimerasa o sintetizado in vitro . el mismo lleva genes marcadores (por ejemplo un gen de resistencia a antibióticos). 1992). en forma pura. La transferencia del ADN al hospedador a menudo genera un grupo de clones que portan el vector. en el cual el ADN recombinante es multiplicado para producir varias copias idénticas. 2) Unión de los fragmentos de ADN a un vector de clonación utilizando una ligasa de ADN. Este puede ser ADN genómico. purificación y replicación de fragmentos específicos de ADN. conjugación) o modificaciones específicas de los mismos. 44 GÓMEZ. ADN sintetizado a partir del ARNm por transcripción reversa (ADNc por «copia»). sin afectar su replicación. La molécula de ADN recombinante se introduce en el organismo hospedador. • Introducción del ADN en una célula hospedadora donde se replicará (amplificación): éste es realmente el verdadero evento de clonación. células de mamíferos cultivadas). Luego se ponen en contacto en presencia de una ligasa para obtener una molécula de ADN recombinante que se introduce en bacterias que multiplicarán el plásmido junto con el fragmento de interés (Modificado de Watson y col. Para ello puede utilizarse la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la hibridación molecular con una sonda específica. etcétera ADN foráneo a insertar Ligación Vector plasmídico Gen de resistencia a antibiótico Molécula de ADN recombinante Introducción en la célula hospedadora Selección de las células que contienen moléculas de ADN recombinante por crecimiento en presencia de antibiótico Figura 1: Pasos básicos en la clonación de un fragmento de ADN. En el caso de la utilización de sistemas bacterianos.

.. seguidas por un número que indica el orden en que han sido identificadas las enzimas correspondientes a la misma especie (Tabla 1).. cada una de las cuales reconoce y corta una de las cadenas. Las enzimas de restricción se denominan utilizando la primera letra del género y las dos primeras letras de la especie que la produce.­GGTCC. Estas colas tienden a asociarse a una cadena complementaria por apareamiento de bases..CTA­TAG. depende.. Para proteger su propio ADN.CAPu­PyTG. que cataliza la formación de nuevos puentes fosfodiésteres y las apropiadas condiciones de renaturalización. para los cuales constituyen un mecanismo de defensa contra el ataque de fagos. por eso se denominan extremos cohesivos o pegajosos («sticky ends») (Fig..3’ 3’. Cuando el ADN de un fago ingresa en la célula bacteriana.5’ 5’..GG¯CC.CTTAA­G. como HindII.5’ 5’.3’ 3’.3’ 3’..G¯AATTC. que son enzimas que cortan la molécula de ADN en sitios específicos denominados sitios de restricción. Además producen cortes en las dos cadenas .... Gracias a este mecanismo pueden destruir el ADN extraño.3’ 3’...5’ Nota Genera extremos romos Genera extremos cohesivos No palindrómica Genera extremos romos Pu: cualquier purina Py: cualquier pirimidina Tabla 1: Secuencias reconocidas y sitios de restricción de diferentes endonucleasas de restricción Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 45 .. Las diferentes endonucleasas de restricción son producidas por distintos microorganismos. Esta cohesividad permite unir fragmentos de ADN no homólogos.GTPy¯PuAC. Una interesante característica de las enzimas de restricción es que comúnOrganismo Bacillus subtilis Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Haemophilus influenzae Designación BsuRI EcoRI EcoRII EcoRV HindII mente reconocen secuencias de ADN que son palíndromes (conjunto de caracteres que se lee de igual manera de derecha a izquierda que de izquierda a derecha).. adicionando la enzima ADN ligasa. tales enzimas siempre hacen cortes en ADN bicatenarios y tales cortes no están sujetos a corrección por enzimas de reparación. las bacterias contienen enzimas ( metilasas ) que se encargan de modificar (metilar) ciertas bases en los sitios que reconocen sus propias enzimas de restricción. catalizada por metilasas producidas por el microorganismo. Estas enzimas reconocen secuencias específicas de 4 a 8 bases.GAT¯ATC. ésta lo degrada gracias a su batería de enzimas de restricción.. que cortan el ADN en el centro Secuencia 5’.CC­GG. Los extremos cohesivos pueden unirse permanentemente a secuencias complementarias de otro fragmento con colas producidas de la misma manera (corte con la misma enzima). una característica de relevancia para la creación del ADN recombinante..¯CCAGG.3’ 3’.5’ 5’. de manera que ya no pueden reconocer dichos sitios de clivaje.. Como las secuencias reconocidas son relativamente cortas y frecuentemente palindrómicas.5’ 5’. Muchas enzimas de restricción están compuestas de dos unidades idénticas. de un tipo especial de enzimas denominadas endonucleasas de restricción. Ciertas enzimas como Eco RI producen cortes escalonados que crean colas cortas de cuatro bases de cadena simple en cada extremo del fragmento. 2 A). en gran medida.4 Herramientas y procedimientos implicados.. La metilación ocurre rápidamente después de la replicación. Existe otro tipo de enzimas de restricción. • Endonucleasas de restricción La habilidad para clonar cualquier gen o secuencia de ADN de interés..

que se comportarán como extremos cohesivos (Fig. Incorporación de extremos cohesivos a un fragmento de extremos romos por la transferasa terminal. extracromosómicas. enzima EcoRI). Un vector de clonación tiene tres componentes esenciales: 1. ECHENIQUE. Un origen de replicación 2. ya que la inclusión de este interrumpe la secuencia del vector. Marisa. Esto puede solucionarse adicionando extremos cohesivos por medio de la transferasa terminal. Un gen marcador fácilmente seleccionable 3. lo cual redunda en la pérdida de funcionalidad del gen mediante inactivación por inserción. c. Corte en secuencias palindrómicas originando extremos cohesivos (ej. Incluyen un sitio múltiple de clonación o sitio de restricción múltiple («polylinker»). un vector es una molécula de ADN que vehiculizará al fragmento de interés y permitirá su amplificación. Los vectores de clonación más utilizados derivan del genoma viral o de plásmidos bacterianos. 3 A). 1992). cada uno de ellos único para el vector (Fig. de doble cadena. enzima que permite adicionar colas de «poliA» o «poliT». Corte en el centro de la secuencia de reconocimiento de la enzima. Viviana . en ambas cadenas) produciendo extremos romos («blunt-ends»). presentes en las bacterias. que es un segmento corto de ADN con muchos sitios de restricción diferentes.. Los vectores pueden clasificarse de la siguiente manera: A) Plásmidos: son moléculas de ADN circular. (Modificado de Watson y col. b. • Vectores de clonación Como se mencionara más arriba. es decir que las bases están apareadas en sus extremos. y por lo tanto no presentan tendencia para unirse con las bases complementarias (Fig. a. 2 C). 2 B). que poseen propiedades muy útiles como vectores de clonación: GÓMEZ. originando extremos romos (ej enzima Hind II). por lo que resulta sencillo confirmar si tras la restricción y ligado se ha insertado efectivamente un fragmento de ADN. de la secuencia de reconocimiento (en el mismo punto. Este sitio suele formar parte del marco abierto de lectura («ORF») de un gen responsable de alguna característica fenotípica.Figura 2: Mecanismo de corte del ADN por las enzimas de restricción. Al menos un sitio único de restricción 46 Los vectores de clonación de última generación son muy prácticos y sencillos de manejar.

1. El tamaño de los insertos que se pueden clonar puede ser considerable. la resistencia al antibiótico conferida por el gen que contiene este sitio se pierde (inactivación por inserción). cada uno de ellos único para el vector. B) Bacteriófagos o fagos: Fago λ: tiene un mapa genético complejo. Aquellas células que continúan siendo resistentes a la ampicilina pero sensibles a la tetraciclina. Plásmido pBR322 con los sitios de restricción de BamHI y Pst I dentro de los genes marcadores (genes de resistencia a la tetraciclina y ampicilina. 5. 3. o por electroporación. el plásmido se hace generalmente inestable. en el laboratorio es posible realizar la transferencia a la célula hospedadora por transformación . 1992). (Modificado de Watson y col. Existen múltiples copias en la célula. Los primeros plásmidos utilizados como vectores de clonación existían en forma natural. el sitio de restricción de BamHI está dentro del gen de resistencia a la tetraciclina.502 pares de nucleótidos y la función de sus genes. puede haber de varias a numerosas copias (por ej.. dependiendo del plásmido y de la especie hospedadora. Por tanto. contienen el plásmido con el fragmento del ADN clonado.Figura 3: Vectores de clonación. y luego se aíslan los clones transformados. En este plásmido. sin embargo. Pequeño tamaño que permite mayor facilidad de aislamiento y manipulación. los plásmidos vectores de clonación generalmente han sido modificados a fin de evitar su transferencia por conjugación y así lograr su contención biológica. Como la resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina pueden determinarse independientemente en placas con agar. Sin embargo. si son mayores de 10 kb. Se conoce la secuencia completa de sus 48. lo que hace que el ADN sea más estable durante su aislamiento químico. Las partículas Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 47 . Aunque en el ambiente natural los plásmidos conjugativos generalmente se transfieren por contacto célula a célula. utilizando choque de calor. Su replicación transcurre independientemente del ADN nuclear en la célula bacteriana. Sitio de restricción múltiple: corto segmento de ADN con varios sitios de restricción.000 copias de pBR322 por célula). 6. Esa parte central (de aproximadamente 15 kb) del cromosoma puede ser cortada con enzimas de restricción y substituida por un fragmento de ADN foráneo (Fig. cuando pBR322 es digerido con BamHI y se liga a un ADN. Si se inserta un trozo de un ADN en uno de estos sitios. y el sitio para PstI está dentro del gen de resistencia a la ampicilina. La presencia de genes de resistencia a los antibióticos que actúan como marcadores seleccionables facilita la detección y selección de los clones que los contienen. a. aquellos transformantes que posean resistencia a la tetraciclina y ampicilina no portan ningún ADN clonado.000 a 3. 2. La molécula resultante de ADN recombinante puede ser empaquetada en las cabezas del fago in vitro. El plásmido pBR322 constituye una generación posterior de vectores construidos in vitro (Fig 3 B). 4. 4 A). El tercio central del cromosoma contiene genes que son requeridos para la lisogenia (estado integrado) pero no para el ciclo lítico (ciclo productivo de nuevas partículas virales). resulta fácil aislar bacterias que contengan los clones deseados y eliminar las células que no los contengan. Son circulares. b. 1. respectivamente).

a. Dos sitios de restricción EcoRI en el ADN del fagoλ.. ARS: origen de replicación. que se replica produciendo colonias bacterianas que contienen los fragmentos a clonar. Región central no esencial del fago 3. 1992). En el inicio de este gen se ha insertado un sitio múltiple de clonación. una pequeña región llamada secuencia intergénica que puede ser utilizada como sitio de clonación. La mayor parte del genoma del tipo silvestre contiene información genética esencial para la replicación. ya que las enzimas de restricción sólo trabajan sobre ADN de doble cadena. los fragmentos de ADN clonados en el «polylinker» interrumpen el gen lacZ y anulan la actividad de la β-galactosidasa. en los cuales los sitios de restricción no deseados han sido alterados de manera tal que la correspondiente enzima no los reconozca. 48 GÓMEZ. se eligen las condiciones para que el ADN híbrido tenga la longitud adecuada para ser empaquetada dentro de la partícula del fago y 5. Las partículas del fago son mucho más eficientes en la infección de las células hospedadoras (transfección) que la transformación. el gen de E. no se producirá pigmento azul y las células formarán colonias que se verán blancas en la placa de Petri.. Cromosoma artificial de levadura (YAC). a C Figura 4: Vectores de clonación. secuencia y funcionamiento 2. ECHENIQUE. se libera un colorante azul relativamente insoluble. 2000). TEL: telómeros. Puede insertar mayor cantidad de ADN que la mayoría de los plásmidos (entre 10 y 20 kb) 3. El ADN puede ser eficientemente empaquetado in vitro dentro de las partículas del fago 4. sin embargo. que es utilizado como gen marcador. En caso contrario. Para obviar esta dificultad se han construído fagos l modificados (Charon). Modificado de Watson et al. coli. Por lo tanto. El ADN bicatenario de M13 puede obtenerse de células infectadas. donde crecerán las células hospedadoras del ADN recombinante. El ADN foráneo puede reemplazar al segmento no esencial del ADN del fago 4. sin afectar la viabilidad del fago. Se conoce bien su estructura. Cromosomas artificiales de bacterias (BAC) (Modificado de Griffith et al. El ADN monocatenario de M13 y de sus vectores derivados ha sido extremadamente útil para secuenciar ADN. Unión con ADN ligasa. URA.del fago pueden inyectar el ADN recombinante en E. c. Es un vector de clonación particularmente útil porque: 1. Existe. CEN: centrómero. donde se encuentra en forma replicativa bicatenaria. gen marcador seleccionable par el desarrollo en medio con uracilo. Es posible clonar ADN de longitudes variables (hasta 5kb). 1. las colonias de las células hospedadoras se verán de color azul. Tanto en el fago l como en M13 se ha insertado un fragmento funcional de lacZ. Si el ADN clonado se insertó en el polylinker y desactivó la β-galactosidasa. coli que codifica para la enzima βgalactosidasa (β-gal). Empaquetamiento del ADN híbrido añadiendo extractos celulares que contengan las partículas de la cabeza y cola para permitir la formación de partículas viables del fago. Utilización del fagoλ. 2. Viviana . Para poder utilizarlo como vector de clonación es necesario disponer de una forma bicatenaria. Cuando esta enzima hidroliza un compuesto químico denominado X-gal. Fago M13: es un fago filamentoso que contiene ADN monocatenario y se replica sin matar a su hospedador. El Xgal se incorpora al medio de cultivo en placa de Petri. Marisa. b. El fago l silvestre no es indicado como vector de clonación porque tiene demasiados sitios para enzimas de restricción.

el origen del fago es responsable de la replicación y se generan copias monocatenarias. transferencia de las moléculas de ADN del gel a una membrana por capilaridad (S.C) Cósmidos: Son vectores híbridos. Contienen el origen de replicación y los genes de resistencia a los antibióticos de su plásmido parental. 4 C). Cos proviene de sitio cohesivo («cohesive site»). los fásmidos pueden transportar de forma estable un fragmento de ADN clonado mayor que un vector típico derivado de M13. Los YAC son minicromosomas de levadura creados por ingeniería genética que pueden contener insertos de ADN de 200 a 500 kb (Fig. La principal ventaja de los cósmidos como vectores es su habilidad para insertar fragmentos de ADN de 35 a 45 kb. g: revelado de la autorradiografía. El sitio cos es reconocido por el sistema de empaquetamiento de ADN de λ. Normalmente la replicación depende del plásmido. P: papel de filtro y peso). las moléculas de ADN migran a través del gel dependiendo de su tamaño y forma. incorporación de la sonda e hibridación con las moléculas de ADN. Los PAC son equivalentes. pero cuando una célula que contiene un fásmido se infecta con un fago de tipo silvestre. D) Fásmidos (fagémidos): Son vectores que combinan las características de un fago filamentoso (M13) y un plásmido (pBR323) y contienen tanto el origen de replicación del fago como del plásmido. aunque el promedio es de 100 kb (Fig. A gel de agarosa.. M: mecha. 4 B) y contienen un origen de replicación y un centrómero de levadura. contacto de la membrana con el filme autorradiográfico. en referencia a las secuencias terminales de simple cadena de 12 bases complementarias en el cromosoma de λ maduro. los YAC (cromosomas artificiales de levaduras). Poseen la habilidad del plásmido para replicarse autónomamente en las células de E. coli y la capacidad de empaquetamiento in vitro del cromosoma de λ. (Modificado de Micklos et al. f: detección por autorradiografía. d. E) Cromosomas artificiales: Estos vectores se desarrollaron con el objetivo de clonar grandes segmentos de cromosomas eucarióticos. observación de las bandas hibridadas. c. Habitualmente. Este ADN monocatenario es empaquetado en viriones y puede aislarse fácilmente y ser utilizado para secuenciar. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 49 . 1990). Aunque los BAC y los PAC aceptan fragmentos menores que los YAC tienen algunas ventajas: Figura 5: Método de hibridación de Southern. N: membrana de nitrocelulosa. Inclusión del ADN en el gel de agarosa. que combinan las características ventajosas de los plásmidos bacterianos y del fago λ. coli y pueden llevar insertos de 300 kb. b. un marcador seleccionable y un sitio múltiple de clonación. Solución tampón. dos telómeros en los extremos del cromosoma. En la preparación de mapas físicos de genomas se utilizan vectores como los cósmidos. a. Los BAC se basan en el plásmido F de 7kb de E. los BAC (cromosomas artificiales de bacterias) y los PAC (cromosomas artificiales basados en el fago P1). que hace cortes escalonados que originan los extremos cohesivos complementarios en el cromosoma maduro del fago.

2. en honor al científico que desarrolló la técnica (Fig. La hibridación es la construcción artificial de un ácido nucleico bicatenario por apareamiento (emparejamiento) de bases complementarias de dos ácidos nucleicos monocatenarios. las moléculas de ARN también pueden ser separadas por electroforesis en geles de agarosa. Estos insertos híbridos pueden entorpecer los intentos de ordenar los clones Por estos motivos los BAC han reemplazado a los YAC como vectores en la construcción de mapas físicos de cromosomas enteros. ECHENIQUE. Las moléculas de ADN tienen esencialmente una carga constante por unidad de masa. Estos vectores simplifican mucho el proceso de secuenciación. Marisa. Los procedimientos utilizados. Luego de la hibridación. por lo cual el proceso se simplifica. Los geles de agarosa actúan como mejores tamices para las moléculas más grandes. transferidas a membranas y analizadas. etc.500 cósmidos para contener el genoma completo (el inserto promedio de un cósmido es de 40 kb). M. mientras que los de acrilamida separan mejor las moléculas pequeñas. La principal característica de esta técnica es la transferencia de las moléculas de ADN que han sido separadas por electroforesis en gel a una membrana de nylon o nitrocelulosa. Son menos complejos y por lo tanto más fáciles de construir. ARN y proteínas: hibridación. Contienen menor cantidad de insertos híbridos (insertos compuestos por dos o más fragmentos no contiguos en el genoma) que los YAC. utilizado para localizar determinadas secuencias de ácidos nucleicos mediante hibridación. En 1975 E. el ADN es desnaturalizado (abierto en sus dos cadenas). pero involucran algunas diferencias de técnicas debidas a las características particulares de cada clase de moléculas.1. Southern. El excedente de sonda no hibridada se elimina mediante repetidos lavados de la membrana. Una sonda de ADN conteniendo la secuencia de interés es entonces incubada con el ADN inmovilizado. en reconocimiento al hecho de que el procedimiento es la imagen de espejo de la técnica Southern blot. de acuerdo al método con el que haya sido marcada. Los geles de agarosa o acrilamida actúan como tamices moleculares. Se define formalmente como sonda («probe») a un fragmento determinado de ARN o ADN marcado química o radiactivamente. La transferencia de ARN se denomina Northern blot. sea antes o durante la transferencia. Pueden amplificarse en bacterias y manipularse con la tecnología básica de los plásmidos bacterianos. 5). • Análisis de ARN por transferencia e hibridación: Northern Blot De manera similar al tratamiento realizado con las moléculas de ADN. Ambos procedimientos son esencialmen- 50 GÓMEZ. por lo tanto se pueden separar en geles de agarosa o acrilamida. • Análisis de ADN por hibridaciones Southern Blot La electroforesis en gel es una poderosa herramienta para separar macromoléculas de diferentes tamaños y cargas. publicó un nuevo procedimiento que permitió a los investigadores ubicar los genes y otras secuencias de ADN sobre fragmentos de restricción separados por electroforesis en gel. Para realizarla. retardando el pasaje de las moléculas más grandes en relación con las más pequeñas. Viviana . la membrana se somete a diferentes procedimientos para poner en evidencia la sonda. Para que exista la formación de híbridos estables debe haber un alto grado de complementaridad. ya que aún organismos simples como el nemátodo Caenorhabditis elegans poseen enormes cantidades de ADN (100 Mb). sobre la base de su tamaño o conformación. Una vez completada la transferencia. Esta transferencia se denomina Southern Blot. 5 Análisis molecular de ADN. el ADN es inmovilizado sobre la membrana por exposición a elevada temperatura o a radiación UV. Las sondas pueden marcarse por diferentes métodos: con elementos radioactivos. ubicando el gel en una solución alcalina. casi completamente. para separar ácidos nucleicos y proteínas tienen el mismo principio. En este caso se necesitarían 2. por métodos químicos que producen color o luminiscencia. La sonda sólo va a hibridar con moléculas de ADN que contienen la secuencia de nucleótidos complementaria a su secuencia. Los YAC pueden aceptar 1Mb.

y sobre la plantilla crece una hebra nueva complementaria (4).Figura 6: Reacción en cadena de la polimerasa. se eleva la temperatura nuevamente y la Taq polimerasa comienza a copiar (3). Para terminar. actuando como límites de la región de la molécula que va a ser duplicada. y entonces se ensamblan. lo que permite que los cebadores o primers se peguen a las regiones adecuadas de la hebra de ADN (2). En primer lugar se eleva la temperatura de la reacción para separar las hebras de ADN (1) y a continuación la temperatura baja nuevamente. en la calle 3 falló la amplificación y en la calle 5 se han formado tres bandas debido a que el primer ha encontrado complementariedad en más de un sitio en el genoma. Después de varios ciclos se obtienen múltiples copias del fragmento en cuestión. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 51 . en la calles 2 y 4 fragmentos de 800 bp. a) Los tres pasos de un ciclo de PCR. c) Verificación de un producto de PCR sobre un gel de agarosa. b) La PCR es una reacción donde el número de copias del gen de interés crece exponencialmente. En primer calle se observa un producto de aproximadamente 1850 pares de bases (bp) de longitud.

sintetizados artificialmente. • Análisis de proteínas por transferencia e inmunodetección o Western Blot La electroforesis en gel de poliacrilamida es una herramienta muy importante para la separación y caracterización de proteínas. Solo se nece- 52 GÓMEZ. El resultado de la reacción es un fragmento de ADN de doble cadena. Luego la temperatura se baja rápidamente a 35-60ºC. La desnaturalización se provoca incorporando formaldehído u otro químico desnaturalizante a la solución tampón («buffer») utilizada en la electroforesis. 6): desnaturalización de la doble cadena. cuyos extremos corresponden a los extremos 5´ de los primers y su tamaño a la distancia entre los mismos. El anticuerpo está conjugado (marcado) ya sea con isótopos radioactivos. se acumulan solo a una tasa lineal y no contribuyen significativamente a la masa final de secuencia blanco.te idénticos. Además. Los polipéptidos separados por electroforesis también pueden ser transferidos del gel a una membrana de nitrocelulosa y pueden ser detectados utilizando anticuerpos específicos. iniciar el proceso con cantidades mínimas de ADN (del orden de pico o nanogramos) y terminar la reacción con grandes cantidades de una secuencia de interés. La doble cadena de ADN se desnaturaliza por elevación de la temperatura a 92-95º°C. utilizados como iniciadores o cebadores (primers) que delimitan una secuencia de ADN de doble cadena que se desea amplificar. 6 La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) La PCR es una tecnología poderosa que involucra la síntesis enzimática in vitro de millones de copias de un segmento específico de ADN. o con enzimas que producen un producto visible cuando se adiciona el sustrato correspondiente. unión de una secuencia de ADN (primer) a la hebra simple y replicación del ADN a partir del primer. las moléculas de ARN son muy sensibles a la degradación por ARNasas. los polipéptidos individuales son separados por electroforesis en presencia del detergente dodecil sulfato de sodio (SDS). bacteria que vive en fuentes termales) realice la replicación a partir de cada extremo 3´ de los primers. Después de la transferencia a la membrana apropiada. Un ciclo de PCR comprende tres etapas (Fig. Sin embargo. cada ciclo duplica la cantidad de producto del anterior. Después de la transferencia. la mayoría de las moléculas de ARN contienen estructuras secundarias (producidas por apareamiento complementario intracadenas). Debido a que muchas de las proteínas están compuestas por dos o más subunidades. se debe tener mucha precaución para evitar la contaminación de los materiales con estas enzimas. las moléculas de ARN pueden hibridar con sondas de ADN o ARN. que permiten la detección por autorradiografía . Marisa. dependiendo del tamaño y secuencia del oligonucléotido utilizado. que desnaturaliza las proteínas. Después de apenas 20 ciclos se logra más de un millón de veces la cantidad inicial de la secuencia de interés. por lo tanto. como el producto de cada polimerización sirve como molde para el siguiente. La tecnología de PCR es de suma utilidad para amplificar ADN a partir de fragmentos clonados en distintos vectores. se eleva la temperatura a 72º °C para que la Taq polimerasa (una ADN polimerasa termoresistente aislada de Thermus aquaticus . Este ciclo es repetido por algunas decenas de veces y. Esta transferencia de proteínas se denomina Western blotting y se realiza utilizando una corriente eléctrica para trasladar las proteínas del gel a la superficie de la membrana. La versatilidad de esta reacción es enorme y la combinación de la PCR y la secuenciación constituye una poderosa herramienta para el análisis de genes. por lo tanto deben mantenerse desnaturalizadas durante la electroforesis para poder separarlas sobre la base de su tamaño. Viviana . Esta escala de amplificación permite. ECHENIQUE. La reacción se basa en la hibridación y extensión de un par de oligonucleótidos. Por lo tanto. A pesar de que se forman moléculas más largas a partir del molde original en cada ciclo. la proteína de interés es identificada colocando la membrana con las proteínas inmovilizadas en una solución que contiene un anticuerpo contra esa proteína. permitiendo la hibridación ADN-ADN de cada primer con las secuencias complementarias que flanquean la región objetivo. Luego.

para estimar el nivel de su expresión y para el clonado de ADNc sin la necesidad de construir una genoteca. para mutagénesis in vitro y para mapeo y secuenciación de genomas. determinar el sexo en embriones humanos. de restos fósiles. De este modo. la enzima Taq polimerasa. La más moderna y sofisticada es la llamada PCR en tiempo real. Como se explicara más arriba. Para llevar a cabo esta detección existen varios métodos pero casi todos basados en la utilización de otro fragmento de ADN (sonda) complementario a una parte intermedia del ADN que se quiere amplificar. En la Parte IX. liberándolo del resto de la sonda y permitiendo la emisión de una señal fluorescente. de tal forma que sólo cuando la sonda es desplazada de su sitio por acción de la ADN polimerasa la molécula fluorescente se libera de la acción del «quencher» y emite fluorescencia al ser iluminada con un láser. para clonar genes. • PCR en tiempo real La PCR en tiempo real es una técnica que ha ganado mucha importancia en los últimos años debido a que ofrece la posibilidad de cuantificar el número de copias de un transgen incorporadas en un genoma. cliva al fotocromo informador. de material momificado. 7 Genotecas Una genoteca («gene library») es una colección de fragmentos de ADN clonados que representan en su conjunto el ADN to- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 53 . se basa en la detección de un informador fluorescente cuya señal aumenta en proporción directa con la cantidad de producto de PCR en la reacción. Subsecuentes ciclos de PCR nos permiten tener cantidades apropiadas del ADNc para diversas manipulaciones genéticas. La cadena complementaria se sintetiza por PCR . etc. durante la reacción de PCR. se detalla más este punto y se aplica esta técnica para la detección de organismos genéticamente modificados (OGM). el informador no emite señal. Esta técnica puede utilizarse para determinar la presencia o ausencia de un transcripto. Puede amplificarse ADN de material embebido en parafina por varios años. • PCR cuantitativa La clave en la PCR cuantitativa es la posibilidad de detectar el nivel de amplificación de una secuencia de interés. entre otras aplicaciones. Capítulo 4. También se pueden emplear sondas que tienen unidas un fotocromo informador y un fotocromo «quencher» (TaqMan ® ). Se pueden utilizar diferentes reactivos fluorescentes como agentes intercalantes (SYBR green®) que se unen a la doble cadena de ADN dando un incremento de la fluorescencia a medida que aumenta la cantidad del producto de PCR. mediante su actividad de exonucleasa.sita un par de iniciadores complementarios a los sitios del vector que flanquean el fragmento para amplificar cualquier fragmento independientemente de su secuencia. En gene- ral para que sea válida esta técnica requiere realizar en paralelo una curva patrón en las mismas condiciones para conocer la cantidad total de ADN que se está amplificando. es posible estimar la cantidad de la secuencia original expresada en número de copias por genoma o en unidad de masa. Se monitorea esta señal que se va acumulando en los sucesivos ciclos de PCR. Cuando ambos fotocromos están unidos a la sonda. Consiste en la síntesis de una cadena de ADN a partir de ARNm por medio de la transcriptasa reversa (enzima extraída de virus tumorales cuyo material genético es ARN). La fluorescencia detectada durante cada ciclo de la PCR será proporcional a la cantidad de ADN que se está amplificando. Esta sonda lleva adherida una molécula fluorescente y otra molécula que inhibe esta fluorescencia («quencher»). pero cuando ésta hibrida con la secuencia de interés. que utiliza ARN como molde para sintetizar una hebra de ADN. Se utiliza para detectar enfermedades genéticas. Existen varios tipos de PCR cuantitativa. • RT-PCR La reacción de PCR en unión con la transcripción reversa (RT-PCR) puede ser utilizada para el estudio de ARNm casi a nivel de una célula individual. con el objeto de estimar la cantidad de esa secuencia en la muestra original. Se emplea un ciclador térmico que tiene acoplado un sistema de detección capaz de captar y cuantificar la señal emitida por el informador al final de cada ciclo.

La segunda cadena de ADN tiene algunos sectores no unidos que son sellados por una ligasa de ADN. El problema que tiene esta técnica es que si el ADNc es muy largo. Una de las principales dificultades en el clonado de ADN genómico es que algunas secuencias están representadas una sola vez en el genoma y es difícil hallarlas. ECHENIQUE. perdiéndose parte de la secuencia correspondiente al extremo 5’ del mensajero. ya que el número de copias del ARNm en el tejido es más elevado. con concentraciones de 1 a 2 moléculas por célula. Estas moléculas de ADNc de doble cadena están listas ahora para ser insertadas en 54 GÓMEZ. Para obviar esta dificultad puede clonarse directamente el ADNc. a partir del cual se obtienen moléculas de ADN de doble cadena que puede clonarse en el vector apropiado. Actualmente es posible clonar un ADNc a partir de mensajeros poco abundantes en la célula. donde se encuentran sólo las secuencias expresadas. Para salvar esta dificultad existe otra técnica donde se utilizan primers al azar. muchas veces no se llega al extremo 5´. donde se encuentran todas las secuencias que se expresan y no se expresan en el organismo y en el segundo de una genoteca de ADNc. El problema se plantea cuando no se sabe en qué circunstancias o en qué tejido se expresa un gen en particular. • Genotecas de ADNc El primer paso en la construcción de una genoteca de ADNc consiste en el aislamiento del ARN del cual es posible separar el ARNm tomando ventaja de la característica cola de poliadeninas que posee en su extremo 3´. Por cualquiera de los dos métodos se obtiene un híbrido ARN-ADN. Estas colas de poliA también son utilizadas en el próximo paso de clonado. Alternativamente. con una nucleasa S1. La reacción consiste en poner en contacto el ARNm aislado con oligo(dT) de 12 a 20 desoxitiminas que actúan como cebadores o primers para la transcriptasa reversa. al comenzar en el extremo 3´. Existe una segunda técnica. Este artefacto provee un cebador adecuado para la síntesis de la segunda cadena de ADN y puede eliminarse una vez obtenida la segunda cadena. El producto de la reacción es un híbrido ARN-ADN. por lo que la reacción comienza a partir de muchos sitios diferentes. Estas genotecas carecen de un catálogo a través del cual se pueda saber cuál es el clon que contiene una secuencia de interés. El primer método desarrollado para obtener la segunda cadena tomaba ventaja de una «vuelta» o «giro» que da la hebra recién sintetizada. Para ello se empaqueta en una columna de celulosa a la cual se unen oligonucleótidos compuestos sólo por desoxitimina –oligo(dT)–. que reconoce moléculas híbridas ARN-ADN y digiere la cadena de ARN dejando trozos pequeños que permanecen unidos a la primera cadena del ADNc y sirven como primers para la ADN polimerasa I. Por ello es necesario realizar un relevamiento de todas las colonias utilizando una sonda con la secuencia de ácido nucleico que tenga que sea complementaria a la secuencia o gen buscados. a través de la cual pasa el ARN quedando el mensajero unido a la timina a través de la cola de poliA. que usa el ADNc original como molde para sintetizar la hebra complementaria de ADN. puede buscarse la proteína producida por un gen clonado usando anticuerpos contra la proteína o a través de un análisis funcional. Este es luego eluido de la columna utilizando una solución tampón adecuada. Parte de esta secuencia puede ser conocida o puede deducirse de la secuencia de aminoácidos de la proteína purificada. Se basa en la utilización de la enzima RNasaH. Viviana . Pero existen varias formas de determinarlo. En el primer caso hablamos de una genoteca genómica. Estos constan de 6 a 10 nucleótidos de longitud y están confeccionados de manera de representar muchas secuencias diferentes. que representa el conjunto de genes que se están expresando en un órgano o tejido determinado o bajo una situación particular o momento de crecimiento o desarrollo. Marisa. Una es que genera moléculas de ADNc más largas y la segunda es que contiene prácticamente toda la secuencia correspondiente al extremo 5´.tal de un organismo de interés o bien el ADNc. que presenta dos ventajas sobre la anterior. Sólo queda un pequeño segmento de ARN en el extremo 5´. como un efecto de cambio de rumbo de la transcriptasa reversa al llegar al final de la cadena de ARN. no sólo del extremo 3´.

que introducirán su ADN en el hospedador apropiado por infección de un césped de bacterias crecido sobre la superficie de una placa de agar (Fig. a fin de protegerlo de la acción de la enzima. Este ADN recombinante se empaqueta formando partículas infecciosas del fago. las genotecas construidas en los fagos poFigura 7: Clonado de ADNc de doble cadena en un fago. cortado con la misma enzima. Cada placa surge de una molécula recombinante individual. Los adaptadores se cortan con la enizma de manera de generar extremos cohesivos que puedan acoplarse con el ADN del fago. que puede ser un plásmido o un derivado del fago l. y se seleccionan por la característica del gen marcador del plásmido. que posee extremos cohesivos cortados por la misma enzima. Si bien los vectores plasmídicos son más fáciles de manipular. o se agregan adaptadores. que son sitios artificiales de reconocimiento de alguna enzima de restricción que se unen a los extremos de la secuencia. que se propaga ahora como un fago.un vector. en este caso EcoRI. que adiciona colas de poliA o poliT. Se trata de oligonucleótidos artificiales (8-12 bp) que se unen al fragmento utilizando una ligasa de ADN y son cortados con la enzima de restricción apropiada (Fig. Para ello se utiliza una ligasa. Mientras tanto se adicionan al ADNc los adaptadores que llevan sitios EcoRI. Esto se visualizará como placas o calvas. Los plásmidos son introducidos en bacterias por transformación (choque térmico o electrofusión).. a) Para ello se le deben adicionar hebras de cadena simple complementarias a los sitios de restricción del ADN del fago. el ADN se trata con una metilasa. Si se trata de fagos. 7 a). que metila los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción. Previamente. flanquedas por los sitios cos. que se utilizarán para infectar un césped de bacterias. El ADN del fago se prepara cortando con una enzima de restricción. 1992). 7 a). Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 55 . los vectores son empaquetados in vitro para formar partículas víricas. Para ello se utiliza la transferasa terminal. Se genera así una serie de moléculas recombinantes dispuestas en tandem. b) Una vez construída la genoteca puede localizarse un gen en la misma por hibridación con una sonda marcada apropiadamente (Modificado de Watson et al. y se purifican los dos brazos del fago. Ambos procedimientos sirven para generar extremos cohesivos a fin de unir el fragmento al vector.

Para esto pueden utilizarse cósmidos. temperatura elevada y concentración salina baja. Otra consideración a tener en cuenta cuando se construye la sonda es que existe más de un codón o triplete para definir la mayoría de los aminoácidos (es lo que se conoce como la «degeneración» del código genético). Si no se tiene conocimiento previo de la secuencia puede construirse una sonda a partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína. Una de ellas corresponde- rá a la secuencia correcta del gen buscado. como hibridación diferencial. Si se usa una sonda donde la homología es completa.000 pb. lo cual requiere un conocimiento previo de la secuencia de interés. colonias bacterianas. 7 B). por ejemplo el de mamíferos contiene 3x109 pb de ADN. la genoteca es replicada en membranas de nylon o nitrocelulosa. Por ello. donde parte del gen ha sido clonado. Una variante consiste en usar un menor número de oligonucleótidos o uno solo pero de mayor longitud (35-75 nucleótidos). A fin de realizar la búsqueda de un gen particular («screening»). ECHENIQUE. coli . de manera tal que el patrón de placas en la caja original se vea exactamente reproducido en la membrana de nylon o filtro (Fig. Viviana . con lavados más fuertes. se obtienen cientos de miles a un millón de placas de fagos (zonas claras o de lisis resultado de la producción de particulas víricas) o. por lo que un aminoácido puede estar especificado por hasta 6 codones diferentes. pero sucede que muchos de los genomas eucariotas son muy grandes. Generalmente se utilizan sondas de 17 a 20 nucleótidos (correspondientes a 6 aminoácidos contiguos). en el caso de vectores plasmídicos. eligiendo una región de la proteína que contenga el menor número posible de codones degenerados. Si la sonda no es completamente homóloga el «screening» deberá realizarse a menores temperaturas y utilizando concentraciones salinas más elevadas en los lavados. Si el promedio típico de inserto es de 15. Pueden utilizarse fagos como vectores. utilizando el conocimiento de los codones más probables para la especie en estudio.000 fagos para contener el genoma completo. por lo que deben ser clonados como un conjunto de fragmentos parcialmente superpuestos. que pueden contener unas 45 kb. Muchos genes eucarióticos tienen más de 1000 kb.seen fragmentos de mayor tamaño. Para asegurar que todas las secuencias estén representadas al menos una vez. se encuentran en ella no sólo secuencias expresadas y no expresadas sino también las correspondientes secuencias regulatorias. • Genotecas Genómicas Un genoteca genómica puede obtenerse de cualquier tejido. 56 GÓMEZ. cada una conteniendo un fragmento clonado. el «screening» puede realizarse en condiciones de alta rigurosidad (es decir. Para hacer una genoteca con estos vectores el ADN se corta con enzimas de restricción de manera de dejar fragmentos de tamaño apropiado. ya que todas las células de un organismo tienen la misma constitución genética. los cálculos estadísticos dicen que deberán analizarse aproximadamente de 1 a 2 millones de fagos. Una vez dentro de la célula el cósmido se replica y puede recuperarse de la célula como un plásmido. se necesitarán unos 200. el tamaño mínimo de la sonda debe ser de 15 a 16 nucleótidos (que permite encontrar secuencias únicas en genotecas de ADNc eucarióticos. En algunos casos. este se utiliza para buscar las partes faltantes. estas sondas oligonucleotídicas están constituidas por una mezcla de todas las combinaciones posibles. distribuidas sobre la placa de agar. Existen otras técnicas para localizar genes en las genotecas de ADNc. si se trata de genes expresados en diferentes tejidos o la utilización de sondas de regiones conservadas en familias de proteínas para encontrar genes relacionados o bien la utilización de vectores de expresión. Marisa. El cósmido se empaqueta in vitro en fagos que se usan para infectar E. Como se mencionara previamente. Como resultado del cultivo en placa (plaqueo) de la genoteca. El problema de esta estrategia es el elevado número de falsos positivos que pueden dar las secuencias adicionales. Cuando se utiliza esta estrategia. Búsqueda del gen clonado: Elección de la sonda La búsqueda se lleva a cabo por hibridación con una sonda de ácido nucleico. que tienden a despegar lo que se ha unido inespecíficamente).

esencialmente ADN cromosómico. Este sistema estaba basado en YAC. de 96 pocillos. El primer sistema de clonado de grandes fragmentos de ADN fue informado en 1987 por Burke y colaboradores. Sin embargo. Cuando se los utiliza para transformar plantas se los llama BIBAC . coli. el ADN se corta con enzimas de restricción o. también amplificado por PCR. como es el caso del humano o de varias especies vegetales y animales la utilización de cósmidos resulta ineficiente. Para minimizar estos problemas se desarrollaron sistemas alternativos que utilizan bacterias en lugar de levaduras: los BAC y los PAC. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 57 . Por ello en estos casos se utilizan los YAC y BAC. Utilización de la reacción en cadena de la polimerasa para buscar un gen específico en una genoteca de BACs. Todos los clones de un mismo filtro son juntados y varios de estos conjuntos de clones son agrupados para preparar agrupaciones de conjuntos. Para preparar una genoteca genómica. Estas placas se replican. A) Genotecas genómicas en cromosomas artificiales La capacidad de clonar fragmentos de más de 100 kb es crucial para la genómica estructural. funcional y comparativa de organismos complejos. como el alto nivel de quimerismo o insertos híbridos (artefacto que resulta de la unión de fragmentos no contiguos en el genoma original en un mismo clon). Un paso crítico en el proceso es el aislamiento de moléculas intactas de ADN de elevado peso molecular. se fragmenta al azar. El producto de PCR se hibrida luego con este filtro y esto nos dará la posición exacta en la placa de 96 pocillos donde se encuentra el gen de interés (Modificado de Watson et al. en filtros o membranas. para evitar la presencia de fragmentos demasiado largos o cortos. BAC y PAC pueden contener establemente fragmentos mayores de 300 kb en E. La reacción se analiza sobre un gel de agarosa. la inestabilidad de los insertos y la dificultad de purificar los insertos clonados. tienen algunos problemas que limitan su utilización. Las 180 placas de cultivo. Un resultado positivo indica la presencia del gen en el ADN genómico del vegetal y también en uno de los clones. que permitían clonar y mantener fragmentos de más de 1000 kb en levaduras. Cuando se chequean los conjuntos individuales se encuentra que el clon positivo pertenece al filtro 1. de a 4. contienen un genoma vegetal completo. El ADN de estos conjuntos se aisla y se amplifica por PCR utilizando primers específicos para el gen de interés.Cuando se trata de genomas muy grandes. 1992). que son vectores de clonación de copia simple. Debido a esta ventaja el sistema fue rápidamente adoptado para los proyectos de genómica. En este caso en el conjunto que contenía los filtros 1-3. Como control positivo se utiliza un ADN vegetal. Para ello las células se embeben en bloques de agarosa de baja temperatura de gelificación y se tratan con en-zimas y otros Figura 8: Búsqueda de imágenes en una genoteca genómica..

8 se esquematiza la búsqueda de un gen en una genoteca de BAC.reactivos para separar el ADN de las proteínas celulares y del RNA. los bloques de agarosa conteniendo el DNA digerido pueden ser directamente embebidos en la matriz del gel que se correrá. cuando se va a construir una genoteca debe elegirse cuidadosamente el genotipo de la especie utilizada como fuente de ADN. por la cual el campo eléctrico que conduce a las grandes moléculas de ADN a través del gel cambia periódicamente de orientación. · Genotecas de cromosomas específicos o de segmentos de cromosomas Cuando se busca un gen que se sabe está ubicado en un cromosoma específico simplifica mucho el trabajo hacer una genoteca de ese cromosoma solamente. Las cantidades y proporciones de colorantes varían para cada cromosoma y una computadora reconoce el patrón fluorescente típico de cada cromosoma. se eliminan los fosfatos terminales. Estas genotecas de grandes insertos son consideradas recursos de largo plazo para investigación genómica y deben ser mantenidas continuamente. Viviana . de aproximadamente 150 kb. digerido y defosforilado (cuando se corta con una sola enzima. etc. C) Preparación de una genoteca de BAC El procedimiento consiste en 4 pasos. Marisa. el tipo de inserto. aislamiento y digestión del ADN y selección de los fragmentos por tamaño. También puede microdisectarse un cromosoma. que. ya que la misma puede utilizarse para variados propósitos. Los fragmentos son seleccionados por electroforesis de campo pulsátil y se separan de la matriz de agarosa por digestión de la misma con agarasa o gelasa. Algunos cromosomas son muy similares. especialmente cuando son utilizadas para proyectos de secuenciado y mapeo a gran escala. se someten a la digestión con enzimas de restricción que realicen cortes poco frecuentes («rare cutters»). Los cromosomas teñidos fluorescerán cuando se expongan a luz UV (de longitudes de onda de 361 y 363 nm) (Hoechst 33258) o 458 nm (cromomicina A). La separación de las moléculas de este tamaño depende de su relativa facilidad o dificultad para reorientarse en respuesta a direcciones cambiantes de un campo eléctrico. Esta técnica puede utilizarse para hacer mapas físicos a gran escala. ECHENIQUE. Más detalles acerca del ensamblado de los distintos fragmentos clonados pueden encontrarse en el capítulo correspondiente a genómica. embebidas en esta matriz. Equipos automáticos pueden hacer este trabajo en unas pocas horas. De esta manera pueden separarse moléculas tan grandes como los cromosomas de levaduras (200 a 3000 kb) (ver VII. La digestión del ADN es crítica para obtener fragmentos adecuados para clonar. o por elución del ADN desde el gel . En general. que dificulta el embebido en agarosa de bajo punto de gelificación. La preparación de ADN de alta calidad en plantas es más complicada que la correspondiente para el caso de animales debido a la presencia de la pared celular. Para obviar esta dificultad se aíslan los núcleos y se trabaja con ellos directamente. Esta limitación ha sido subsanada con una técnica llamada electroforesis de campo pulsátil. para evitar la recircularización). se tiene la ventaja adicional de poder usar directamente los fragmentos para transformar plantas utilizando Agrobacterium tumefaciens En la Fig. preparación del vector. En principio se utilizó esta técnica para cromosomas 58 GÓMEZ. transformación de las bacterias y ensamblado de la genoteca El vector debe estar bien purificado. Se trata de una técnica que permite separar cromosomas metafásicos teñidos con un colorante fluorescente (Hoechst 33258) (para regiones ricas en AT) y cromomicina A (para regiones ricas en GC) y tratados de manera que el ADN no se desnaturalice.-1). por lo que no pueden ser separados. Si en lugar de una genoteca de BAC se hace una de BIBAC. Si se desea separar estos fragmentos por electroforesis. Se necesita un millón de cromosomas para hacer una genoteca. tomando un segmento del mismo que tenga la región de interés. La función del bloque de agarosa es proteger a las grandes moléculas. Esto permite construir genotecas con fragmentos de tamaños similares. B) Separación de grandes trozos de ADN: electroforesis de campo pulsátil Las técnicas estándares de separación de ADN en geles de agarosa no son adecuadas para moléculas mayores de 10 kb.

A+G. dependiendo de la distancia de la última base incorporada al extremo marcado del ADN. que pueden ser usadas como eti- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 59 . Actualmente.5) 8 Secuenciación Una vez que se ha obtenido el clon con el fragmento de interés. Primers posicionados en el vector permiten amplificar secuencias desconocidas. Actualmente se utilizan fásmidos (ver Vectores de clonación).3´didesoxinucleótidos (ddNTP) de cada una de las 4 bases.coli porque tienen un 5´trifosfato normal. C). El ADN amplificado se clona en un vector apropiado y la localización cromosó-mica de cada clon se determina utilizando hibridación in situ (ver III. se basa en el mismo principio y consiste en preparar 2´. marcando un extremo de las moléculas. en las dos orientaciones posibles. El primero consiste en la utilización de un compuesto que destruye selectivamente una o dos de las 4 bases que constituyen el ADN. Se utilizan 20 vectores plasmídicos que permiten construir 20 genotecas diferentes a partir del mismo ADN. se determina el patrón de bandas. por lo que el crecimiento de la cadena se detiene. los digitalizadores de imágenes posibilitaron la lectura directa de la película. Existen actualmente secuenciadores automáticos que realizan la electroforesis en gel y determinan automá-ticamente la secuencia utilizando un sistema de detección con láser. hace que el ADN del mismo. El método de Sanger. Para ello se utiliza un primer que se posiciona en un lugar adyacente a la región de policlonado de M13. se generan fragmentos de distinto tamaño en función de la distancia de la base destruida al extremo marcado radiactivamente del fragmento a secuenciar. donde. después de efectuada una autorradiografía para revelarlas. que refleja la secuencia del ADN. se generan una serie de fragmentos de distinta longitud. dependiendo de la base a destruir (G. De esta forma. sea replicado. La adición de un «fago ayudante» («helper phage») a las células que lo contienen. de simple cadena. La ventaja es que sólo una de las cadenas del vector es empaquetada en las cabezas del fago (ver Vectores de clonación). Al principio. Messing desarrolló una serie de vectores de clonado basados en el fago filamentoso M13. con lo cual su crecimiento cesa. la combinación con PCR posibilita la aplicación de la técnica a cualquier cromosoma. fácilmente distinguibles por microscopía de contraste de fase. pero no pueden formar un enlace fosfodiéster con el nucleótido siguiente. Con una proporción correcta ddNTP:dNTP. empaquetado y extraído de la célula. 3000 bp) que M13 permite la inserción de fragmentos de ADN más largos. que permite manejar mayor cantidad de muestras en menor tiempo. luego. Para ello se ha desarrollado una técnica llamada Multiplex. La determinación de la secuencia puede realizarse por el método químico de Maxam y Gilbert o por el método enzimático de Sanger. el paso siguiente es secuenciarlo. Se realizan 4 reacciones de síntesis de ADN.grandes. una proporción controlada de uno de los 4 ddNTP con su desoxinucleótido normal y los otros 3 dNTP. Cada vector lleva dos secuencias únicas que flanquean al sitio de clonado. Al ser de menor tamaño (aprox. Los proyectos de secuenciación genómica han requerido métodos de secuenciado más veloces y económicos. Estos son teñidos con Giemsatripsina y las bandas deseadas son cortadas con agujas de vidrio ultrafinas y clonadas. la posición de cada banda revelada en la película radiográfica se anotaba manualmente. se obtiene una o la otra hebra del ADN a secuenciar. muy útiles para el secuenciado enzimático. Cuando se agrega polimerasa la reacción comienza a partir del primero hasta que se introduce en la cadena un ddNTP. T+C. Clonando el inserto en M13. ya que se puede utilizar para secuenciar cualquier clon recombinante. Estos fragmentos son separados en un gel de poliacrilamida. Los productos de las 4 reacciones se corren lado a lado en un gel de poliacrilamida y la secuencia del fragmento se determina a través del patrón de bandas. que se llama «primer universal». previa autorradiografía. Estas moléculas pueden ser incorporadas al ADN por el ADN polimerasa de E. Este ADN de simple cadena es ideal para utilizar con el método de Sanger. En la mezcla de la reacción se incluye la cadena a secuenciar.

GRAHAM. SPANGENBERG. SOUTHERN. 1997 (Second Edition). PCR. J.. V.. ECHENIQUE.Y. Potrykus. SMITCH. . IGLESIAS. Se toma un clon de cada una de las genotecas plaqueadas (20 colonias) y se mezclan. 477.M. 2000... 1998 (Octava Edición). R. O. M.. Press. A.. negro: guanina y azul: citosina). Spangenberg. T. se despega una sonda para luego hibridar con las siguiente y así sucesivamente).).. G. WANG. verde: adenina. D.. NEUHAUS-URL. Los productos de 12 conjuntos de reacciones de secuenciación se corren en un gel y se transfieren a una membrana de nylon. que al ser exitados por láser emiten luz de diferente longitud de onda. la secuencia es mostrada como una serie de picos o cromatograma. Estos equipos utilizan nucleótidos marcados con fluorocromos. Scientific American Books.quetas («tags») para el ADN clonado y estarán presentes sobre cada fragmento a ser secuenciado. pp. An introduction to the genetic analysis. J. J. C. Y. J.F. los productos de las 4 reacciones se mezclan y se corren en una sola calle de un gel. E. 98:503-517 WATSON. Marisa. En Gene Transfer to Plants. donde cada uno de los 4 colores representa a un nucleótido diferente (rojo: timina. cada mezcla de reacción con un terminador diferente se marca con un colorante diferente. York. 1975. J. G. Recombinant DNA. D. 1992 (Second Edition). MADIGAN. SAMBROOK.. en un secuenciador automático. W. Molecular cloning: a laboratory manual. El filtro se hibrida secuencialmente (es decir. GELBART. Séptima Edición. utilizando como sonda la etiqueta de cada uno de los 20 vectores.. De esta manera. A medida que los fragmentos pasan a través del lá- ser. G. Carolina Biol. R. B.. Supply Comp. BROCK.. Standard Molecular Techniques for the Analysis of Transgenic Plants. J. W:H:Freeman.. E. GISEL. J. Actualmente existen equipos robotizados que pueden llevar a cabo dos de las reacciones más limitantes en el proceso de secuenciado: la detección de las bandas de ADN y la traducción de un patrón de bandas en uno de secuencia. D. En cada caso se van leyendo las secuencias correspondientes a cada uno de los distintos vectores. Springer Lab Manual. N:York. MANIATIS. MARTINKO.Mol. 1989 (Second Edition). Cold Spring Harbor Laboratomy Press. DNA Science. PARKER. J. KOST. MILLER. SCHROTT.. se aísla el ADN y se secuencian los plásmidos utilizando el método Maxam y Gilbert... GILMAN. Biol.. Springer. (eds. M. Z. Cold spring Harbor. A. WITKOWSKI. 9 Lecturas Recomendadas FÜTTERER. MITTELSTEN SCHEID. NEUHAUS. A. En este caso.. LEWONTIN. Cuando la reacción es completada. M. Los colorantes pueden utilizarse para marcar el primer universal de secuenciación de M13 o cada uno de los 4 terminadores de cadena didesoxi. Biología de los Microorganismos. York. Se hace crecer el cultivo. KLOTI.. ZOLLER. SHILLITO. A. N. NEWTON. Cold Sprong Harbor Lab. sus marcas fluorescentes se excitan y emiten luz que se detecta mediante un fotomultiplicador. FREYER. Se utilizan 4 colorantes diferentes. 1995. GRIFFITHS. Viviana . N. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.. una sola reacción produce datos de 20 clones a la vez... G.. 860 pp. Después de ser procesada por una computadora. 1990. SUZUKI. 60 GÓMEZ. Prentice Hall. MICKLOS. M. G.

Nelly. insensible a los efectos ambientales. es decir el número de genes que la codifican y controlan (herencia monogénica o poligénica) y las relaciones interalélicas (dominancia o aditividad). iv) varios se hallan bajo control poligénico. Para que un carácter sea considerado un marcador genético debe mostrar una variación experimentalmente detectable entre los individuos de la población y un modo de herencia predecible según las leyes de Mendel. lo cual prolonga los tiempos de evaluación en los programas de mejoramiento. espiguilla y cariopse se utilizan para inscribir e identificar variedades de trigo en la Secretaría de Agricultura Ganadería Pesca y Alimentación.. Aurora. ii) el grado de influencia ambiental que se mide normalmente a través del parámetro de heredabilidad. En relación a los vegetales son de utilidad en estudios evolutivos y de genética poblacional. v) dominancia.Capítulo 4 Marcadores Moleculares Picca. En los análisis genómicos. espiga. proteínas y marcadores basados en ADN. se han utilizado varios tipos de marcadores genéticos: morfológicos. El grado de éxito en este proceso depende de i) el control genético de la característica. tallo. vegetal. Un gran número de marcadores morfológicos ha sido mapeado en tomate y maíz. Son ampliamente utilizados en genética humana. color. los primeros híbridos se obtuvieron utilizando el «color de hipocótile» como marcador ligado al gen ms de androesterilidad. 2 Marcadores morfológicos Son características fenotípicas de fácil identificación visual tales como forma. iii) pueden producir alteraciones fenotípicas que dificultan el desarrollo de la planta. desde cambios fenotípicos heredables significativos hasta la variación de un solo nucleótido. Alicia 1 Introducción Desde sus comienzos. Por ejemplo. Salomón. Una serie de técnicas moleculares de gran desarrollo en los últimos veinte años permiten conocer la información genética que los organismos portan.II. codominante. En girasol. isoenzimas. animal y microbiana. Marcelo. de rápida identificación y simple análisis y de posible detección en los estadios tempranos del desarrollo de la planta. Permiten evidenciar variaciones (polimorfismos) en la secuencia del ADN entre dos individuos. No obstante. de herencia mendeliana no epistática (sin interacción entre genes). Esta variación puede ser considerada a diferentes niveles biológicos. vi) muchos de ellos se expresan en estadío de planta adulta. ii) bajo nivel de polimorfismo. Helguera. mapeo. alrededor de 50 caracteres de plántula. modifiquen éstas o no su fenotipo. Un marcador ideal debe ser: altamente polimórfico o variable dentro y entre especies. de este modo las plantas verdes que eran androestériles se utilizaban como líneas maternas y las plantas con antocianas que eran fértiles se eliminaban del lote de producción al comienzo de su desarrollo. los marcadores morfológicos permanecen como caracteres útiles en la identificación de materiales dado que representan un conjunto de genes que pueden ser evaluados con métodos sencillos y a bajo costo. Las principales limitaciones de los marcadores morfológicos se encuentran en: i) número reducido de marcadores disponibles en cada población. Funcionan como señaladores de diferentes regiones del genoma y se los conoce en forma genérica como marcadores moleculares . hoja. manejo de bancos de germoplasma. Carrera. selección asistida por marcadores y clonado de genes. Muchos de ellos se convierten en importantes «descriptores». tamaño o altura. Este tipo de marcadores contribuyó significativamente al desarrollo teórico del ligamiento genético y a la construcción de las primeras versiones de mapas genéticos. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 61 . identificación. el objetivo del mejoramiento vegetal ha sido seleccionar genotipos superiores a partir del reconocimiento de fenotipos superiores. protección legal de germoplasma. a la hora de inscribir nuevas variedades.

que se generan por la combinación de subunidades codificadas por los distintos alelos o loci. las variantes alélicas se denominan aloenzimas. Aurora. Estos marcadores muestran codominancia 3) Estructura cuaternaria de los productos proteicos . encontramos enzimas activas compuestas por dímeros. Adh-1b. cloroplasto o mitocondria. generalmente almidón. etc. sistemática y biología evolutiva así como en descripción de germoplasma e identificación de variedades. La presencia de varios genes codificando para una misma enzima ha sido atribuida a procesos de duplicación génica y subsecuente divergencia a través de mutaciones diferentes en cada caso. estos loci representan importantes marcas de referencia para relacionar mapas obtenidos a partir de 62 PICCA. Varios factores determinan el patrón de bandas o zimograma: 1) Número de genes que las codifican. hoja) Figura 1: Locus isoenzimático Pgd-3 en girasol. glutamato dehidrogenasa GDH). que poseen una actividad catalítica común. Cuando la estructura cuaternaria se vuelve más compleja. Por ejemplo: dehidrogenasas (alcohol dehidrogenasa ADH. Las isoenzimas han tenido un rol prominente en estudios de poblaciones vegetales para determinar variabilidad y estructura genética. No obstante. hidrolasas (fosfatasas ácidas ACP. Por otro lado. las formas enzimáticas extraídas de hoja o raíz (no así las de semilla) presentan variaciones en relación a las condiciones ambientales de crecimiento y a la edad del tejido. de acuerdo a distancias decrecientes de migración. Adh-2c. SALOMÓN. La preparación del gel es relativamente simple y el equipamiento es de bajo costo. un colorante y cofactores.3 Isoenzimas Se definen como diferentes formas moleculares de una enzima. Su aplicación en la construcción de mapas se ha visto limitada por el número de marcadores isoenzimáticos disponibles. CARRERA. Adh-2a. 2) Estados alélicos. 4) Compartimentalización subcelular. El proceso más simple de generación de nuevas formas enzimáticas es la mutación de un gen estructural. 1). Se encuentran formas enzimáticas localizadas en citoplasma. isomerasas (fosfoglucoisomerasa PGI) y transferasas (fosfoglucomutasas PGM). Ciertos cambios en el ADN que codifica estas enzimas (mutaciones) pueden resultar en cambios en la composición de aminoácidos. 2-4 alelos. Las enzimas se clasifican de acuerdo a su función y se representan con una sigla de tres letras. Alicia . Nelly. oxidasas (peroxidasas PRX). Adh-2b. P2 homocigotas y F1 heterocigota en soluciones «buffer» y se analizan mediante electroforesis en un soporte sólido. Variantes alélicas a y b. Estas diferencias determinan patrones característicos de migración electroforética de las formas iso-enzimáticas. Genotipos parentales P1. Los loci en general se representan con las tres letras señaladas en tipo cursiva y se agrega un número para designar al locus y una letra para el alelo. lo cual afecta la reproducibilidad de los zimogramas. En las formas más simples o monoméricas los individuos homocigotas presentan una banda y los heterocigotas simplemente la suma de ambas. es decir actúan sobre el mismo sustrato. raíz. en general menor a 50 y por su reducido polimorfismo. El gel puede ser cortado en capas horizontales y cada una se destina a una solución de revelado específica que consta de un sustrato. Marcelo. disueltos en un buffer apropiado. La enzima funcional puede estar compuesta por un número variable de sub-unidades. originando proteínas con la misma actividad biológica pero con diferente carga neta y por tanto con diferentes velocidades de migración en un campo eléctrico. En este caso el individuo heterocigota presenta bandas adicionales no presentes en los homocigotas. HELGUERA. tetrámeros. (Fig. Por ejemplo: Adh-1a. codificadas todas por genes nucleares pero con diferentes velocidades de migración. esterasas EST).. Las isoenzimas se obtienen por homogenización del tejido (semilla.

translocaciones.distintos marcadores de ADN. da (A-PAGE). Los genes de las fracciones a y b se ubican en el brazo corto de los cromosomas 6A. en cebada hordeína. utilizando el principio de diferencias en la carga eléctrica. Los valores más altos se dan en trigo y avena (10-17%) y los más bajos en maíz y arroz (6%). en avena avenina y en trigo gliadina. prolaminas en alcohol y glutelinas en ácidos o álcalis. Estos cambios genéticos han generado un alto nivel de polimorfismo proteico entre especies. Almidón y proteínas son las dos macromoléculas más importantes. El patrón electroforético de las gliadinas muestra cuatro grupos proteicos denominadas a. En la mayoría de los cereales las prolaminas y glutelinas están codificadas por varios genes relacionados conformando familias. Triticum aestivum. La posición relativa del locus sobre el cromosoma fue determinada por cruzamientos entre líneas con contenidos contrastantes de proteína y determinando la frecuencia de recombinación en la progenie. distantes del centrómero. Las fracciones g y w se encuentran codificadas por genes del cromosoma 1 de los tres genomas. Las gluteninas de bajo peso molecular (GBPM) son codificadas por genes ubicados en los brazos cortos de ese mismo grupo de cromosomas. El fraccionamiento de las prolaminas se realiza en electroforesis áci- Figura 2: Fraccionamiento de Gluteninas en variedades de trigo por SDS-PAGE para su correlación con variables de calidad industrial. b. En trigo pan. cercanos al centrómero. en geles continuos. Para el grupo de las prolaminas se ha asignado un nombre específico para cada uno de los cereales. así como entre variedades de la misma especie. Además. La localización cromosómica de los genes de proteínas en trigo se ha establecido principalmente utilizando materiales aneuploides tales como nulisómicos o tetrasómicos de la variedad Chinese Spring. en medio básico (SDS-PAGE) utilizando diferentes tamaños de poros (tamiz molecular) (Fig. La concentración de proteínas en los cereales es apreciablemente menor que en las leguminosas ya que en éstas los órganos de reserva o cotiledones son capaces de almacenar hasta un 40% de su peso seco en proteínas. g y w gliadinas. quién dio las bases para las clasificaciones actuales. Las proteínas del endosperma fueron estudiadas ya a comienzos del siglo pasado por Osborne.1B y 1D. inserciones de elementos móviles entre otros re-arreglos cromosómicos. En el caso específico de trigo a las glutelinas se las conoce con el nombre de gluteninas. el análisis genético de cruzamientos ha demostrado que la variación en el patrón de proteínas es debida a la existencia de variantes alélicas en cada locus. están confinados al conjunto de los cromosomas homeólogos (cromosomas parcialmente homólogos pertenecientes a los tres genomas) 1 y 6. 6B y 6D. La visualización se realiza en ambos casos mediante tinción con Coomassie Brilliant Blue R250. El contenido de proteína varía según la especie y el manejo de cultivo a campo. los genes estructurales para las dos principales proteínas. gluteninas y gliadinas. Las glutelinas se analizan en geles discontinuos de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio. 4 Proteínas de reserva El endosperma de los cereales es el principal componente de la semilla ya que representa aproximadamente el 80-90% de su peso seco. próximos al grupo de genes correspondientes a GAPM. globulinas en solución salina. Los genes para las subunidades de gluteninas de alto peso molecular (GAPM) están ubicados en el brazo largo de los cromosomas 1A. De esta manera en maíz se la denomina zeína. La misma se basa en la solubilidad relativa en diferentes solventes: albúminas solubles en agua. Durante la evolución de estos genes se han detectado duplicaciones. La posición cromosómica de estas proteínas ha sido estable a lo largo de la Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 63 . 2).

Este tipo de enzimas corta el ADN en una secuencia determinada o sitio de restricción. deleciones. Existen dos formas de detectar los VNTR ya sea por hibridación o por técnicas de PCR. Nelly. las sondas marcadas y las hibridizaciones son algunas de las técnicas que permiten obtener un número virtualmente ilimitado de marcadores moleculares y cubrir la totalidad del genoma de un organismo (para más detalles ver II. que puede o no corresponder a un gen. difíciles de automatizar. codominantes y multialélicos. las sondas son homólogas a secuencias únicas del genoma. Estos fragmentos con diferentes longitudes son detectados utilizando sondas diseñadas a partir de las secuencias de ADN que flanquean las repeticiones o a partir de las repeticiones mismas.3) Los marcadores moleculares pueden ser clasificados en tres grupos: A) Marcadores basados en la hibridación del ADN: los más utilizados en plantas son los RFLP «restriction fragment length polymorphisms» o polimorfismos en la longitud de fragmentos de restricción de ADN. Cuando la enzima de restricción corta las secuencias adyacentes a un locus hipervariable. De esta manera. SALOMÓN. Marcelo. El ADN genómico es digerido con enzimas de restricción que reconocen los sitios de restricción que flanquean las repeticiones en tandem. para minisatélites se obtiene un perfil complejo de bandas múltiples. utilizan también el polimorfismo en el número y distribución de estos loci a lo largo del genoma. La variabilidad genética presente en el marcador molecular se observa como diferencias en la secuencia del ADN genómico debidas a duplicaciones. el ADN en estudio es digerido por medio de una enzima de restricción. 5 ADN y marcadores moleculares Un marcador de ADN es simplemente un punto de referencia en un cromosoma. A su vez cuentan con la desventaja de ser muy laboriosos. las enzimas de restricción. Los fragmentos clivados por la enzima de restricción se separan por su tamaño mediante electroforesis y se transfieren a una membrana donde son hibridados con la sonda. la sonda hibrida solamente con fragmentos de ADN inmovilizados en la membrana que presenten la secuencia complementaria a la misma. lo que los hace relativamente caros. Diversas técnicas de biología molecular se encuentran disponibles para detectar variabilidad en la secuencia de ADN. La diferencia básica entre RFLP y VNTR reside en el tipo de sonda utilizada. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR). la longitud de los fragmentos de restricción producidos en diferentes individuos varía con el número de repeticiones de minisatélites. HELGUERA. Para visualizar los polimorfismos se expone la membrana a una placa radiográfica La ventaja de los RFLPs radica en que son altamente reproducibles. en el autoradiograma al contrario del patrón simple de bandas obtenido por RFLP (una banda para genotipos homocigotas o dos bandas para genotipos heterocigotas). CARRERA. inserciones. Estos fragmentos pueden ser considerados como un tipo específico de RFLP. trabajar con radiactivos. En el proceso. es que además de explorar el polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción en cada locus hipervariable. Los minisatélites o VNTR «variable number of tandem repeats» son repeticiones en tandem de secuencias del genoma que contienen de 9 a 100 pares de bases. requieren de infraestructura adecuada para mantener las sondas. separado electroforéticamente e inmovilizado en una membrana.. Este tipo de estudio involucra la detección de un segmento específico (marcador molecular) en el ADN de estudio por hibridación con un fragmento marcado radiactivamente de secuencia complementaria al marcador (sonda). etc. por lo tanto todos los locus hipervariables son detectados simultáneamente. El número de repeticiones es variable pero en general es menor a 1000. mientras que en RFLP. Alicia . que modifican la distancia entre pares de sitios de restricción y generan fragmentos polimórficos (de diferentes tamaños). posibilitando así 64 PICCA. Una ventaja de los VNRT. En la técnica de VNRT las sondas están constituidas por secuencias homólogas a las secuencias repetidas de los minisatélites. En el proceso. Aurora. detectando así uno o pocos loci cada vez. la separación electroforética de los fragmentos de ADN.evolución y han sido usadas como marcadores para el estudio de la homeología cromosómica de la Tribu Triticeae.

20 pares de bases). Los minisatélites también pueden ser detectados mediante la amplificación por PCR de los segmentos conteniendo diferente número de repeticiones. Para que se genere o dos copias de la secuencia amplificada). automatizables y no radioDNAs» o fragmentos polimórficos de ADN activas. es que es un marcador dose basa en la utilización de un único minante (al observar un fragmento es impooligonucleótido de 10bp que hibrida al azar sible determinar si el mismo se originó de una con el ADN en estudio. Esto reduce la especificidad del apareamiento con el ADN molde y resulta en un perfil más complejo de bandas. la secuencia de uno de los oligonucleótidos hibrida en uno de los extremos del segmento y es complementaria a la hebra a. La presencia de mutaciones en el sitio de hibridación de cualquiera de los oligonucleótidos impide la amplificación del fragmento. Para que exista amplificación del fragmento es imprescindible que ambos oligonucleótidos hibriden en secuencias complementarias presentes en las hebras del ADN en estudio. La necesidad de disponer de información previa acerca de la secuencia del ADN a amplificar para diseñar oligonucleótidos. PCR en plantas. Esta técnica se basa en la síntesis enzimática de millones de copias de un segmento específico de ADN en presencia de una polimerasa de ADN termoestable. un fragmento RAPD es necesario que las dos La disminución en los costos de secuen- hebras del ADN en estudio presenten sitios de hibridación con el oligonucleótido en orientaciones opuestas suficientemente cercanas (menos de 3000bp) como para permitir la amplificación. Las limitaciones para esta técnica. además de su baja amplificados aleatoriamente. El segmento de ADN a amplificar esta compuesto por dos hebras (a y b). de bajo costo de los RAPDs «random amplified polymorphic implementación. La secuencia del oligonucleótido es aleatoria al igual que los sitios de hibridación.la visualización simultánea de diversas regiones del mismo. DAF involucra el uso de primers arbitrarios de longitud tan corta como 5 pares de bases. Para ello se utilizan dos oligonucleótidos llamados «cebadores» o «primers». La primera solución a este problema vino de la mano de que son rápidas y sencillas. AP-PCR utiliza primers ligeramente más largos que la técnica anterior (aprox. La visualización se lleva a cabo por medio de geles de poliacrilamida teñidos con plata. son las mismas descriptas oportunamente para RFLP. basados en la reacción de Genotipos parentales K y D y progenie F7. utilizando «primers» o cebadores. el segundo oligonucleótido hibrida en el otro extremo del segmento y es complementario a la hebra b. 3). limitó inicialmente el desarrollo de marcadores Figura 3: RAPDs en DNA genómico de trigo candeal. El polimorfismo que se observa entre distintos individuos consiste en la presencia o ausencia de fragmentos de ADN amplificado (Fig. por lo que la secuencia amplificada es desconocida. DAF «DNA amplification fingerprinting» y AP-PCR «arbitrary primer PCR» son técnicas similares a RAPDs. que flanqueen dichos segmentos. Los productos de amplificación son marcados radiactivamente y también pueden ser resueltos por electroforésis en geles de poliacrilamida La ventaja de estas técnicas consiste en Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 65 . Esta técnica reproducibilidad. La desventaja. B) Marcadores basados en la amplificación del ADN: mediante la reacción de PCR «polymerase chain reaction» o reacción en cadena de la polimerasa de ADN.

no es posible distinguir individuos heterocigotas por lo que se trata de un marcador dominante. La base genética del polimorfismo detectado en microsatélites se basa en la variabilidad del número de repeticiones en tandem y consecuentemente del tamaño del microsatélite amplificado en individuos de una especie. el sitio de la enzima de restricción. 66 PICCA. 3) una fracción de los fragmentos obtenidos es amplificada selectivamente por la acción de primers específicos que fueron diseñados para reconocer la secuencia de los adaptadores ligados en el segundo paso. Marcelo. Es un marcador mucho más robusto Figura 4: AFLPs en trigo candeal. Por el alto polimorfismo que presentan por locus (multialelismo) se los considera los marcadores ideales para el mejoramiento en especies autógamas como el trigo. junto a la creciente información sobre genomas animales y vegetales han permitido el desarrollo de marcadores basados en PCR con diferentes características. 2) adaptadores de ADN de doble cadena se adhieren en forma específica a los extremos de los fragmentos obtenidos en el paso anterior. Estos marcadores son codominantes. El microsatélite amplificado por PCR es sometido a electroforesis en geles de alta resolución que permiten detectar diferencias de 2. Aurora. 4). ya que se explora simultáneamente el polimorfismo de ausencia/presencia de sitios de restricción (como los RFLP) y la ocurrencia o no de amplificación a partir de secuencias arbitrarias (como los RAPDs). entre ellos los más frecuentemente utilizados en plantas son: SSR «simple sequence repeats» o microsatélites y AFLPs «amplified fragment length polymorphisms». El uso de bases selectivas al azar permite la amplificación de sólo un grupo de fragmentos de restricción (aquellos en que coincide la secuencia del adaptador + sitio de restricción + bases selectivas). Su implementación en un laboratorio requiere de mayor infraestructura y presupuesto que los RAPDs. Su implementación en laboratorio requiere de una infraestructura y presupuesto similar a los microsatélites. Nelly. más una a tres bases selectivas al azar agregadas en el extremo 3’. Esta técnica consiste en esencia de cuatro etapas: 1) el ADN genómico es cortado con enzimas de restricción (generalmente una de corte raro y otra de corte frecuente). SALOMÓN.ciación y PCR. son regiones genómicas hipervariables constituidas por repeticiones en tandem de unos pocos pares de bases (1 a 4) flanqueadas por secuencias de copia única. Los microsatélites (SSR). Estos marcadores presentan un alto poder de detección de la variabilidad genética. C) Marcadores mixtos: AFLP (polimorfismo en la longitud de fragmentos amplificados de ADN) puede considerarse como una combinación de RFLP y RAPDs. Cinco combinaciones de primers para las enzimas de restricción Pst I y Mse I en las variedades K y D. 3 o 4 nucleótidos que corresponden al mínimo polimorfismo de longitud en un microsatélite. 4) análisis de la subpoblación de fragmentos amplificados mediante su desnaturalización por electroforesis en geles de alta resolución (poliacrilamida) y visualización por autoradiografía o por tinción con nitrato de plata (Fig. generando así el molde para la amplificación del ADN. HELGUERA. Alicia . La base del polimorfismo es la ausencia o presencia de fragmentos amplificados de un tamaño determinado y al igual que en los RAPDs. genoma-específicos y altamente polimórficos en comparación con los RFLPs y RAPDs. CARRERA.

4 y 5 homocigotas 2NS (285 pb). resistencia a roya Lr37. Calles 8 y 9 plantas heterocigotas asociado a la resistencia a un pa. representan genes funcionales y son por lo Otra ventaja de los AFLPs es el número de tanto más útiles como marcadores fragmentos (marcadores) resueltos por moleculares que las secuencias anónimas. Recientemente meen marcadores PCR alelo-específicos. 6 y 7 plantas homocigotas para el alelo 2AS (275 pb = 166 + 109).2NS. proviente de una translocación de tagged sites». que au. RAPDs y AFLPs genómicos o de cDNA.ma transcriptasa reversa). La ventaja de los mentan significativamente la especificidad de ESTs. El problema que enfrentan Existen técnicas de alta resolución que estas estrategias suele ser el bajo nivel de permiten detectar mutaciones a nivel de un polimorfismo entre variedades de una espe. soja. «cleavage amplified polymorphic Para una utilización más eficiente en pro. De todos polymorphism» tienen la capacidad de demodos.solo nucleótido conocidas como SNPs «sincie (trigo. RAPDs y AFLPs existe la posibilidad de enzima de restricción. Calles superior. Entre ellas. por lo pecíficos.que los RAPDs. por ejemplo un alelo 2. 3.50 contra En una variante conocida como CAPs los 4 – 10 de RAPDs.gle nucleotide polymorphisms». El paso siguiente es detectar el alelo de valor agronómico Figura 5: CAPS en trigo.identificar individuos heterocigotas. 5). se clona.que generalmente se ven libres de intrones plificación de secuencias al azar (no requiere y de ADN repetitivo. etc). en ge.nante. Calle 1 planta control (sin amplificación). Las cadenas simples de ADN propósitos pero derivan de clones de cDNA tienen tendencia a formar apareamientos Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 67 .Triticum ventricosum que contiene genes de mento de ADN polimórfico del gel. robustos y de que se comporta como marcador codomisencilla implementación en cualquier labora. sibilidades de encontrar mutaciones útiles los SSCPs «single-strand conformational para desarrollar estos marcadores. que son económicos. los productos de amplificación de gramas de mejoramiento de marcadores secuencias específicas se digieren con una RFLPs. existen antecedentes exitosos de tectar cambios de un solo nucleótido en fragdesarrollo de marcadores de PCR alelo-espe.tas de trigo hexaploide portadoras del alelo nómico.sequence». al ser derivados de ARNm maduro es la reacción sin perder las ventajas de la am. se secuencia y se diseñan oligonucleótidos específicos de alrededor de 20 pb. Yr 17 (Fig.nir de un banco de genes o de clones versión de marcadores RFLP. Este método permite transformarlos en marcadores PCR alelo-es. moviliLos ESTs «expressed sequence tags» son dad que depende tanto de su tamaño como similares a los STSs y sirven para los mismos de su secuencia. La información para la secuencia de torio. poliacrilamida no desnaturalizantes.Calles 2AS/2NS. La cíficos en trigo para locus altamente técnica de SSCPs se basa en la movilidad de polimórficos como pueden ser alelos de las cadenas simples del ADN en geles de gluteninas. lo que disminuye las po.mentos de más de 1000 pares de bases.diante CAPS ha sido posible seleccionar planneral ligados a un caracter de interés agro. tógeno y el marcador entonces se hace evidente con una simple reacción de PCR. los primers utilizados en CAPs puede proveExisten distintas estrategias para la con. Esto implica que los ESTs información previa de secuencia de ADN). Cuando se parte de un fragmento RAPD. para ser utilizados como cebadores. ya que en la amplificación se (ARNm transcripto a ADN utilizando la enziutilizan oligonucleótidos más largos. Se conocen como STS «sequence. el marcador derivado mediante este proceso es conocido como SCAR «región amplificada de secuencia caracterizada». Sr38. En estos casos se aisla el frag. electroforesis que oscila entre 30 .

64(4): pp. Wheat Cultivar Identification by Gliadins Electrophoregram I: Apparatus. Introduçao ao uso de marcadores moleculares em análise genética. Vol. Isozymes in Plant Biology . Its application in crosses with cultivated sunflower. D. FERREIRA. SALOMÓN. R. ZILLMAN. Portland.R. causan modificaciones en la conformación y consecuentemente en la movilidad electroforética. RODRÍGUEZ. W. R.. De la descripción realizada. IV Congreso Nacional de Trigo y II Simposio Nacional de Cereales de Siembra OtoñoInvernal. R. RK. 294. P.. 220 pp. VARSHNEY. CARRERA. MIRANDA. D. el modo de herencia. Alicia . Por lo tanto cambios en la secuencia del ADN. CSHL press. 1996. I-21. La tabla 1 resume algunos aspectos importantes a considerar a la hora de elegir el tipo de marcador a utilizar. 369-390.intramoleculares de bases que resultan en una conformación dependiente de la secuencia y con una movilidad específica en geles de acrilamida. Advances in Plant Sciences Series... N. CW. A. 2001. GRATTAPAGLIA.. SHARMA. 1996. RAMESH. DUBCOVSKY 2003.. POVERENE.. PCR assays for the Lr37-Yr17-Sr38 cluster of rust resistance genes and their use to develop isogenic hard red spring wheat lines. M. aunque sea de un solo par de bases. Oregon.. Crop Science. pp. R. Canadian Journal of Plant Science. 68 PICCA. en prensa. P. Glutenin of Marquis Wheat as a Reference for Estimating Molecular Weights of Glutenin Subunits by Sodium Dodecyl SulfatePolyacryilamide Gel Electrophoresis. 505-515. NG. 118: pp.. 1999. DIEFFENBACH. de gran importancia cuando los objetivos del estudio incluyen el análisis de un número elevado de individuos. DVEKSLER. Mar del Plata. POVERENE. POVERENE. Breed. M. 714 pp. 6 Lecturas recomendadas BUSHUK W. HELGUERA.. 1989. EMBRAPA-CENARGEN. Helia 19 (25): pp. Uruguay. MIRANDA. PK. V. 1987. Otra metodología para obtener SSCPs consiste en la amplificación de un fragmento específico por PCR y posterior corrida electroforética en geles de alta resolución. Molecular markers and their applications in wheat breeding. PCR primer: A laboratory manual. GS... N. Los SSCPs pueden detectarse clivando el ADN con enzimas de restricción. M. M. methods and nomenclature. 268 p. Publicado en Estrategias metodológicas utilizadas en el mejoramiento de trigo: Un enfoque multidisciplinario. 1998 Variación de la calidad panadera en trigos de diferentes orígenes a través de la escala Glu-1. SALOMÓN. (Eds. Aceptado para publicar en Advances In Plant Physiology. 1978. HELGUERA. Biotechnology in wheat breeding. Isozyme variability in Helianthus argophyllus. Tabla 1: Comparación entre algunos sistemas de marcadores moleculares. CARRERA. el nivel de polimorfismo y en los factores costo y tiempo. PC.. ECHENIQUE. SOLTIS. 4.. 1995. Posteriormente se realiza una hibridación de Southern a partir del gel con fragmentos específicos como sondas para la hibridación. M. Pl. Marcelo. separando los distintos fragmentos según su conformación por corrida en un gel. Cereal Chemistry. Estudio de los descriptores de trigo en Argentina. BUSHUK. A.. Colonia. 2 ed. CARRERA. 58: pp.). B. SALOMÓN.. se desprende que los marcadores varían ampliamente en el grado de complejidad del método. 2003. pp.K. GUPTA. Nelly. vol 7. SOLTIS. 19-28. 324-327. Aurora..

-Capítulo 5 Citogenética Poggio. Aun sin alterar la morfología de los cromosomas. Varios parámetros del cariotipo pueden ser alterados por rearreglos estructurales. retama es el más asimétrico ya que Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 69 . la morfología cromosómica es constante entre las distintas especies que lo componen. existen ejemplos en los que mutaciones génicas que afectan el apareamiento han sido determinantes en la evolución de distintos grupos. 1 Introducción Los estudios citogenéticos han permitido realizar valiosos aportes al conocimiento de los mecanismos de aislamiento reproductivo y modos de especiación en plantas. a través del análisis genómico. GISH). y caracterizar citoquímicamente distintos tipos de heterocromatina utilizando fluorocromos. Por otro lado. y en algunos casos. exponiendo como ejemplos. 2 Análisis del cariotipo Las características estructurales y cuantitativas de los cromosomas (cariotipo) son importantes en investigaciones básicas (taxonómicas y evolutivas) y aplicadas. Además. Es frecuente y normal la existencia de variación cariotípica interespecífica. a veces. Un ejemplo de este caso lo constituyen las fusiones céntricas entre cromosomas con centrómero subterminal produciendo cromosomas metacéntricos de mayor tamaño. deben localizarse las regiones organizadoras del nucleolo (NOR). también puede existir variabilidad cariotípica intraespecífica manifestada como polimorfismos o politipismos cromosómicos. análisis meiótico en híbridos y poliploides. identificar ADN satélite y relacionarlo con bandas heterocromáticas. En otros casos no se encuentra variación en el número cromosómico ya que en muchos géneros el número y. En algunos casos puede variar el número cromosómico y la simetría del cariotipo. con o sin eliminación de regiones centroméricas. ha contribuido a la resolución del origen y evolución de distintos grupos taxonómicos. simetría del cariotipo y tamaño del genoma. En estos casos la citogenética. aunque menos frecuente. Sin embargo es importante señalar que trabajar en biología o genética de eucariontes. con el análisis del cariotipo. Esta variación se expresa en características fácilmente analizables como el número.II. Naranjo. Carlos A. pero desconociendo las características y el comportamiento de sus cromosomas puede llevar a errores en la interpretación de causa y efecto de muchos fenómenos. evolutivos y aplicados. Sin embargo existen diferencias importantes interespecíficas en cuanto a la morfología cromosómica. En Bulnesia (Zygophylaceae) siete de las nueve especies que lo componen son diploides (2n=26). algunos aportes realizados por nuestro grupo de trabajo. Esta disciplina tiene grandes ventajas pero también limitaciones y sus aportes deben ser complementados con estudios provenientes de otros campos. estudio de la variación intra e interespecifica en el tamaño del genoma y con la citogenética molecular (hibridación in situ . Los taxónomos y evolucionistas están familiarizados con el hecho de que los cromosomas son parte de un sistema dinámico que está moldeando el proceso de evolución. FISH. Es importante analizar también. la cantidad y localización de heterocromatina (ADN repetitivo no codificante) mediante distintas técnicas de bandeo. El cariotipo de B. El fragmento con centrómero puede persistir como un cromosoma supernumerario o cromosoma B. usando técnicas clásicas o moleculares. Lidia. forma y tamaño de los cromosomas y no está relacionada con complejidad genética u organísmica. Mutaciones cromosómicas que alteran la morfología de los cromosomas jugarían un papel importante en la determinación de los mecanismos de aislamiento reproductivo y distintos modos de especiación. en especial la especiación por poliploidía. La citogenética brinda valiosos aportes para la resolución de problemas taxonómicos. En esta contribución se explicará brevemente la información que la citogenética puede brindar. La especiación híbrida es muy común en el reino vegetal.

secundaria de bivalentes. micas que las mantendrían aisladas reproductivamente. E = metafases mitóticas. El bandeo C es activos podría tener importancia en eventos el que se utiliza de rutina y revela heterocro. I = dos grupos de 5 bivalentes y un cromosoma B.I. B = cos. 1991.Ver explicación extensa de las figuras en: Poggio et al. Tito et al.. Variaciones en el cariotipo pueden ocurrir sin cambios notorios en el exofenotipo. la flecha señala un bivalente heteromorfo..muchos grupos.G. Lidia. variación intra e te repetidas ricas en AT o GC. C.interespecífica.heterocromatina constitutiva es un componicas de bandeo que revelan marcadores nente aditivo del genoma y presenta. mays. a la exis. A.. en paiveana ssp. El número cromosómico también puede variar por poliploidía. J = Zea mays ssp mays. regiones orga. 1999. H = Anafase I. en el desarrollo y en la organi- 70 POGGIO. H = Zea luxurians x Z. D = Zea mays ssp. C. A-E = Bandeo C. borealis. D = interfases. . 2 puentes (flechas) y 2 fragmentos (cabeza de flecha). las flechas muestran ejemplos de asociación algunos casos. diploperennis . Las barras representan 10 micrones. Carlos A. n = 10. Nuevos números básicos que no tengan relación directa con los ancestrales pueden surgir si ocurren nuevas reestructuraciones o hibridación entre poliploides con distintos números básicos.regulatorios. 8 bivalentes y 4 univalentes. G = tencia de especies Metafase I. J = con pocas diferencias a Asincronía meiótica. crípticas o hermanas. Sin embargo rearreglos en condición heterocigota pueden ocasionar disturbios en el apareamiento meiótico e iniciar aislamiento reproductivo.. NARANJO. 1986a y b.F = Metafase I. Si se dan las condiciones adecuadas para la fijación de estos rearreglos pueden iniciarse eventos especiogénicos que involucren rearreglos cromosómi. A. Estos procesos Zea luxurians. matina constitutiva compuesta por secuenUn análisis más preciso de la variación cias cortas repetidas en tandem. 5 bivalentes en Metafase I y 10 cromosomas en Anafase I. n = 10. en cromosómicos (secuencias de ADN altamen. Eulophia pueden conducir. 5 bivalentes y 5 morfológico pero con univalentes. diferencias cromosó. 5 trivalentes. E = Bulnesia retama. 2n=30. perennis. La cariotípica puede obtenerse empleando téc.posee un cariotipo bimodal por adición de heterocromatina en 24 de los 26 cromosomas del complemento.K = nivel bioquímico o Zea luxurians x Z. diacinesis. etc. A-D y F-K poseen el mismo aumento. n = 42..). B. metafase I.. Aunque no contiene genes nizadoras del nucleolo.FIGURA 1. las flechas señalan el único par de cromosomas metacéntricos eucromáticos.

. En algunos casos la formación de univalentes en los híbridos se debería a divergencia cuantitativa en el número de copias de secuencias de ADN altamente repetidas. pueden deberse a heterocigosis para distintos tipo de rearreglos estructurales. Bennett (1983. el poliploide artificial debería poseer meiosis regular y fertilidad elevada. Este fenómeno es muy común en híbridos entre distintas especies de Amaranthus. etc. Cuatro líneas aloplásmicas fueron obtenidas por el Ing. Esto es cierto cuando son normales los genes que regulan fisiológicamente todas las etapas y procesos de la división meiótica. 3 Análisis meiótico en híbridos y poliploides Una especie diploide con reproducción sexual para ser fértil debe poseer un comportamiento meiótico normal. pero elevada esterilidad. En general el grado de apareamiento meiótico es una medida de la homología que existe entre los cromosomas. cuando éstos han sido posibles de obtener artificialmente o se los ha encontrado en poblaciones naturales. 1988) crea el término «cariotipo natural» para referirse al ordenamiento de los cromosomas de acuerdo a la posición real que los mismos ocupan en el núcleo interfásico.citoplasmáticas». con formación de univalentes en su meiosis. Configuraciones meióticas anormales como univalentes. Stebbins (1971) ha denominado a este fenómeno «hibridez estructural críptica» y ocurriría cuando las especies progenitoras se diferencian en pequeños rearreglos estructurales. los híbridos fueran estériles. La formación de univalentes podría significar falta de homología entre los cromosomas de los progenitores y. Prosopis y Bromus entre otros. En estos casos se pueden formar bivalentes pero se segregan combinaciones génicas inviables a las gametas. Ello determina que exista buena segregación y formación de gametos balanceados y fértiles. Otro caso frecuente en la naturaleza es la existencia de híbridos diploides con formación regular de bivalentes y desarrollo normal de los estados II de la meiosis. L. Mazoti utilizando maíz ( Zea mays ssp mays) como progenitor masculino recurrente durante al menos 10 retrocruzas so- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 71 . En los híbridos el citoplasma puede ejercer una acción diferencial sobre la condensación cromosómica de los genomas parentales o en el ritmo de contracción cromosómica durante la meiosis (alociclia genómica). es indudable que la información genética no está contenida caoticamen-te en el núcleo sino que está ordenada de acuerdo a patrones que actualmente no conocemos. Estos principios han permitido realizar rápidas evaluaciones de la homología genómica entre dos entidades por medio del estudio meiótico de su híbrido F1. bivalentes heteromórficos o multivalentes en Profase-Metafase I y. Se han postulado varios modelos que explican la organización supracromosómica en los núcleos eucariontes estableciendo que si bien ésta no es universal. Sin embargo podría ocurrir que aunque las especies parentales tuvieran una elevada homología en cuanto a las secuencias de ADN. en estos casos. fragmentos.zación tridimensional de los cromosomas en el núcleo. Si el híbrido analizado es fértil y posee formación de bivalentes se puede concluir que hay afinidad (homología) entre los genomas parentales. o sea que debe poseer buen apareamiento entre cromosomas homólogos y consecuentemente formación de bivalentes. El grado de irregularidades meióticas es una estimación de diferencias génicas y estructurales de las entidades en estudio. Si el híbrido es estéril habrá que analizar si el aislamiento reproductivo postcigótico obedece a causas génicas o cromosómicas. husos multipolares. Agr.). Este mecanismo disminuye el valor adaptativo del heterocigota por provocar disturbios en la alineación estructural de los cromosomas. El comportamiento meiótico puede también verse alterado por interacciones particulares «núcleo . ocurrencia y/o posición de sobrecruzamientos) o alteran la disposición espacial de los genomas en el núcleo provocando asinapsis. cromosomas con cromátidas desiguales. en estadíos posteriores (puentes. Esto último podría deberse a la acción de genes que interfieren con el proceso normal de apareamiento (formación del complejo sinaptonémico.

Nuestro grupo de trabajo ha encontrado. 13 II y 13 I en un gran porcentaje de las células analizadas. Estas líneas presentaron comportamiento meiótico regular con formación de bivalentes. por ejemplo. divaricata (2n=26) y L. indicando que L. El maíz tratado mostró en Diplotene-MI de 1 a 5 IV mientras que el maíz testigo sólo formó bivalentes. diploperennis x Z. Tratamientos premeióticos con soluciones diluidas de colchicina (0. En estos casos la formación de multivalentes es decisiva para establecer las relaciones entre genomas. sugiriendo la existencia de homeología entre los genomas ancestrales A y B postulados. Todas las líneas aloplásmicas presentaron características citológicas en común.bre teosinte como progenitor femenino. Carlos A. Otra característica observada en las líneas aloplásmicas es que. en aproximadamente 20-40% de los meiocitos en Profase I. perennis) la configuración meiótica más frecuente fue 5 III + 5 II + 5I. en alrededor del 50 % de las células observadas en algunas líneas de maíz e híbridos interespecíficos se observó «asociación secundaria» de bivalentes. los 10 bivalentes se distribuyeron en dos grupos de cinco bivalentes cada uno. En híbridos con 2n=30 cromosomas (Z. divaricata o una especie muy afín sería un progenitor de L. El análisis de las asociaciones meióticas en especies e híbridos del género Zea nos reveló la naturaleza alotetraploide del maíz y especies relacionadas con 2n=20 cromosomas. Hemos realizado tratamientos con soluciones diluidas de colchicina en maíz y Z. con 2n=40 cromosomas presentó. cuneifolia. permitiendo recombinación entre genomas que normalmente no recombinarían. perennis con la finalidad de detectar recombinación entre los genomas A y B postulados anteriormente. Estos resultados sugirieron que en maíz existen genomas homeólogos (Am y Bm) con 5 cromosomas cada uno. los dos grupos de 5 II presentan una leve asincronía en su comportamiento meiótico (es decir que. en mas del 50 % de las células analizadas en Diplotene Metafase I. perennis y Z. formación frecuente de dos grupos de 5 II cada uno en MI. NARANJO. La drástica separación en dos grupos de 5 II en la mayoría de las células sugiere que la interacción «citoplasma de teosinte-nucleo de maíz « influencia la distribución espacial de los cromosomas en el núcleo. con frecuencia elevada. Si bien este comportamiento meiótico fue descripto en híbridos y en razas nativas de maíz. El estudio meiótico de poliploides e híbridos entre taxones con distinto nivel de ploidía aporta mayor información que el realizado en híbridos diploides puesto que se puede analizar la afinidad relativa de distintos genomas en el mismo fondo genético. Evidencias citogenéticas de la naturaleza poliploide del maíz y especies afines se discutirán con mayor detalle en la próxima sección. aunque tienen origen poliploide. La presencia de dos grupos de 5 II y la asincronía de los mismos en líneas aloplásmicas de maíz sugiere que el citoplasma de teosinte promueve la separación y asincronía de dos genomas diferentes con 10 cromosomas cada uno (x=5). El tratamiento con colchicina 72 POGGIO. Este tratamiento produce el mismo efecto que alelos mutantes de genes que controlan el apareamiento. en MI. respectivamente. cuneifolia (2n=52) hemos encontrado. Lidia. El tratamiento en Zea perennis dió como resultado un incremento en la frecuencia de IV señalando también manifestación de homeología dentro de los genomas A y B. Metafase I y Anafase I. Zea perennis .5 x 10 -4) en el género Helianthus indujeron apareamiento homeólogo y formación de multivalentes en especies que. Una de estas características es que. Este «doble huso» observado sería una evidencia de la existencia de genomas ancestrales con 10 cromosomas cada uno. 5 IV + 10 II. mays ssp mays x Z. Los resultados obtenidos sugirieron que estos tratamientos pueden inducir apareamiento intergenómico. . en las líneas aloplásmicas se observa con mayor claridad y frecuencia. un grupo de 5 II inicia la Anafase I mientras que el resto de los bivalentes permanecen en Metafase I). En el género Larrea el híbrido estéril entre la especie diploide L. poseían meiosis regular con formación de bivalentes. Además. siendo AmAm BmBm y ApAp A’pA’p Bp1Bp1 Bp2Bp2 las fórmulas genómicas postuladas para maíz y Zea perennis . Estas configuraciones sólo pueden ser claramente explicadas proponiendo dos genomas (A y B) de 5 cromosomas cada uno. en especies e híbridos con 2n=20 cromosomas. Citogenética de poliploides.

cuando se demostró que en Angiospermas la variación del tamaño del genoma involucra cambios en la cantidad y proporción de secuencias de ADN repetidas. mays ssp. EL número n=16 sería un número básico derivado y n=17 habría surgido por trisomía primaria. oscilando entre 0.2 pg en Arabidopsis thaliana a 127. 4 Variación intra e interespecifica en el tamaño del genoma: evolución y significado adaptativo Durante el proceso evolutivo ocurren cambios cuantitativos y cualitativos en el contenido de ADN total. Estos resultados permitieron concluir que si se comparan los genomas Am-Bm Ad-Bd y Ap-Bp. ni era explicable por la existencia de mayor número de genes funcionales (el contenido de ADN de un alga unicelular. Además de la utilidad en estudios taxonómicos y evolutivos el conocimiento de la meiosis es de importancia fundamental en estudios aplicados. En Angiospermas el tamaño del genoma es muy variable entre grupos. Z. El análisis conjunto de los datos obtenidos en nuestro laboratorio no sólo confirma la naturaleza alopoliploide del maíz y especies afines con 2n=20 cromosomas. Como ya se ha discutido. el apareamiento puede estar bajo control genético (por ejemplo genes tipo Ph) y a menudo estos genes pueden constituir un sistema mucho mas simple que los que controlan caracteres diagnósticos de especies y géneros. En cambio el híbrido Z. Si se descarta la variación en el nivel de ploidía. contenido de ADN. El contenido de ADN (valor C) se evalúa mediante microdensitometría o citometría de flujo. diploperennis x Z. mays ssp mays dieron resultados diferentes. conjuntamente con la asociación secundaria de bivalentes observada en especies e híbridos con meiosis regular apoyaron la hipótesis de que las especies actuales de Amaranthus con 2n=32 cromosomas son poliploides con x=8. perennis y Z. perennis el tratamiento con colchicina provocó un aumento en la frecuencia de trivalentes. En Z. sino que sugiere que en estas especies existen genes (semejantes al Ph descripto en trigo) que impiden el apareamiento entre genomas homeólogos. polimorfismo numérico para cromosomas accesorios o supernumerarios. Los estudios moleculares han reve- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 73 . Aunque no siempre la esterilidad es de origen cromosómico. sólo son homeólogos los genomas Am y Bm. etc. éste es un parámetro que debe ser controlado. puede ser igual al de una angiosperma leñosa). perennis x Z. en parte. por ejemplo. perennis x Z. Se han dado varios ejemplos en los cuales el análisis meiótico ha permitido dilucidar el origen y postular modos de especiación en varios grupos. reordenamientos cromosómicos con perdida o duplicación de material genético y variación en el número de copias de secuencias no codificantes. Esta paradoja o enigma del valor C (C: contenido de ADN del genoma haploide no replicado) fue explicada. no sólo mostró un aumento en el porcentaje de III sino que el 43% de las células analizadas en Diacinesis -MI mostraron IV y VI. Sin embargo en organismos superiores se encontró que el aumento en el valor C no estaba relacionado con complejidad organísmica.de los híbridos con 2n=30 cromosomas. bandeo C y fluorescente. a grandes rasgos. no observándose nunca IV ó VI. El establecimiento de sistemas taxonómicos basados en relaciones genómicas deben en lo posible estar apoyados por estudios citogenéticos completos (cariotipo. En la producción de híbridos o poliploides de importancia agronómica se debe lograr un máximo de fertilidad y esto está relacionado con el comportamiento cromosómico. spinosus (2n=34).). En Amaranthus la configuración cromosómica de 8 II + 17 I observada en el híbrido A.4 pg en Fritillaria assyriaca no estando esta variación relacionada necesariamente con nivel de ploidia. La variación del tamaño del genoma se encuentra. diploperennis x Z. hybridus (2n=32) x A. morfológicos. las principales causas de variación (intra o interespecífica) del contenido de ADN serian: aneuploidía. bioquímicos y moleculares. relacionada con diferencias en la complejidad organísmica pues los virus tienen genomas mas pequeños que las bacterias y éstas a su vez menores que el de eucariotas. mays tratado con colchicina.

parásito o ignorante». Estos cambios rápidos pueden ser potentes mecanismos evolutivos ya que concomitantemente con el aislamiento reproductivo que implica la diferencia en rearreglos estructurales. limitando el rango de expresión fenotípica que puede ser alcanzado por acción génica. no génico» disminuye con el aumento del tamaño del genoma y en angiospermas con elevado contenido de ADN las secuencias repetidas pueden representar hasta el 90% del ADN total. factores fenológicos. cromosómicas o citoplasmáticas. En algunos organismos se ha demostrado que la transposición de elementos móviles retrovirales pueden alterar la dinámica del genoma provocando una inestabilidad que se puede traducir en una súbita explosión de variabilidad. longitud del complejo sinaptonémico. área y volumen celular. Otros experimentos han mostrado que la interacción entre el genoma y el medio resulta en una rápida generación de variación. distribución y extensión de estos cambios en distintos grupos vegetales?. diversificación y adaptación a distintos ambientes. tiempo mínimo de generación. duración del ciclo mitótico. y elementos transponibles. 74 POGGIO. organísmicas y geográficas. además. un factor que desencadena mecanismos de aumento de ADN repetido. los mismos pueden involucrar efectos de posición que. . ambientales. función y/o significado de esta variación? ¿cuál es el papel del ADN repetido. En varios grupos de plantas se vio que las variaciones en el contenido de ADN total están correlacionadas positivamente con: volumen o longitud cromosómicas. ha sido. La hibridación. microsatélites. En líneas aloplasmicas de maíz hemos encontrado que el citoplasma de teosinte provocaba activación de elementos transponibles concomitantemente con aumento de secuencias de ADN repetido correspondientes a las zonas heterocromáticas. típicamente no codificante?. minisatélites. por ejemplo. ¿qué relación poseen estos cambios con la fluidez y plasticidad del genoma en plantas? y ¿cual es la dirección. En general. la relación «ADN génico. producir reestructuraciones cromosómicas alterando el orden y posición de los genes. secuencias repetidas que no codifican tales como ADN satélite. en algunos casos. Se conocen procesos de escisióninserción de elementos móviles produciendo por ejemplo. Lidia. El análisis del contenido de ADN ha permitido evaluar rápidamente fenómenos de aneuploidía y poliploidía generados por estrés durante prácticas de cultivo de tejidos. En lino. en forma oportunista. Estos factores físicos. además del ADN codificante. Estos procesos pueden. en la naturaleza o en prácticas de mejoramiento. poseen valor adaptativo. NARANJO. Carlos A. bioquímicos o genéticos inducen mecanismos de inestabilidad insercional o modifican el numero de copias de secuencias de ADN no codificante. latitud y altitud. Estos resultados explican la naturaleza de la variación pero plantean interrogantes acerca del significado evolutivo de esta arquitectura repetida del genoma: ¿cuál es el origen.lando gran complejidad dentro de los genomas existiendo. Por otro lado. Bennett (1987) crea el término «nucleotipo» para referirse a los aspectos del ADN nuclear que afectan al fenotipo independientemente del ADN codificante. Un enfoque para comprender el significado del tamaño del genoma fue analizar las relaciones que existían entre el contenido de ADN y características celulares. Todos estos procesos tienen. En la literatura existen muchos datos que sugieren que el tamaño del genoma posee significado adaptativo y que los parámetros nucleotípicos juegan un papel importante en la evolución. se encontraron diferencias en el número de copias de ADN repetido entre líneas que crecían en medios con diferentes nutrientes. duración de la meiosis. además relevancia en aspectos aplicados más inmediatos ya que un cambio en la posición de un gen puede cambiar la expresión o la función bioquímica del mismo. en algunos casos. Otros investigadores señalan que no puede descartarse la existencia de mecanismos moleculares que generen ADN repetido no codificante que. actúe como mutágeno y /o agente regulador. porcentaje de heterocromatina. plantas variegadas. varios autores opinan que las secuencias de ADN no génico que pueden variar en el genoma no poseen significado adaptativo constituyendo ADN «egoísta. Se ha demostrado que el genoma de las plantas es inestable y responde al estrés provocado por alteraciones genómicas.

fluorescente) permiten revelar zonas de ADN altamente repetido (heterocromatina constitutiva). reamplificación y deleción de secuencias de ADN repetido. en plantas se comenzó a aplicar a fines de la década del 80 debido a la gran disponibilidad de secuencias clonadas para utilizar como sonda. genéticos ó fisiológicos. En ausencia de bandas marcadoras no es posible identificar cromosomas con morfología similar. Las técnicas de bandeo (C. Estos procesos han llevado a grandes diferencias en el tamaño del genoma. no codificantes sin funciones vitales para el organismo). 5 Citogenética molecular: resolución de problemas básicos y aplicados El hallazgo de técnicas para identificar genomas y cromosomas en preparaciones de rutina ha representado un gran progreso en la citogenética vegetal. complementando los resultados obtenidos por metodologías más clásicas. El gran potencial de las técnicas de hibridación in situ resulta de combinar información acerca de la morfología nuclear o cromosómica con la información molecular de la estructura de las secuencias. ya que disponer de marcadores cromosómicos permite estudiar la organización del genoma y la arquitectura nuclear. La presencia de cromosomas accesorios (heterocromáticos. El particular modo de herencia de estos cromosomas accesorios (con mecanismos de impulso que hacen que se hereden con mayor frecuencia que la esperada por herencia mendeliana) abre un nuevo campo de investigación en lo que se refiere a su utilidad como portadores de genes útiles en programas de mejora. la posibilidad de utilizar ADN genómico total como sonda ( GISH) y modernos sistemas de marcación y detección no radioactivos han impulsado el uso de esta técnica en forma rutinaria. En veintiuna razas nativas de maíz del noroeste argentino ubicadas a lo largo de un gradiente altitudinal encontramos una correlación lineal negativa significativa entre el contenido de ADN de los cromosomas normales (A) y la altitud de cultivo. Además en especies alógamas suele existir polimorfismo para número y posición de zonas heterocromáticas. El maíz y especies silvestres relacionadas constituyen un ejemplo de variación intraespecífica donde está bien demostrada la variación en el contenido de ADN debida a variación en porcentaje de heterocromatina (ADN repetido) y en el número de cromosomas supernumerarios. esto significa que el contenido de ADN de los cromosomas del maíz es menor en lugares de cultivo elevado. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 75 .cromosomas B). pero no diferencian la composición molecular del ADN. Es interesante señalar que esta disminución del contenido de ADN de los cromosomas A se correlaciona con un aumento en la frecuencia de cromosomas accesorios no codificantes (B). la evolución del genoma eucariota ha involucrado casos de amplificación. la frecuencia con que ocurren estos eventos y la relación de los mismos con factores ambientales. Un notable ejemplo de polimorfismo y politipismo para bandas heterocromáticas lo constituye el estudio de líneas y razas nativas de maíz. en razas nativas de plantas cultivadas tales como maíz y centeno. En resumen. quedando aun muchas cuestiones por resolver en lo que se refiere a los mecanismos moleculares involucrados. Aunque estas técnicas se conocen desde 1969 utilizando marcación radioactiva. es una de las incógnitas actuales de la biología evolutiva y aun no se comprende el papel que pueden jugar los mismos en futuros planes de mejoramiento. lo que dificulta la caracterización cromosómica y la detección de regiones introgresadas. sugiriendo que las diferencias no pueden ser al azar y obedecen a procesos selectivos. Los marcadores moleculares combinados con la citogenética resultaron ser de gran utilidad para entender la organización cromosómica y la distribución física de las secuencias repetidas. divergencia. Aunque se desconocen las causas de este cline discordante entre dos tipos de ADN supernumerario no codificante (ADN repetido. su repetibilidad en distintos ambientes sugiere que existen fuerzas selectivas involucradas en su mantenimiento. Además.La variabilidad intraespecífica en el contenido de ADN fue informada y probada en varios grupos taxonómicos. Resolver estas cuestiones permitirá comprender el papel de la variación del tamaño del genoma en la evolución y analizar la relevancia de la variación del contenido de ADN con relación a características de importancia agronómica.

Mediante la aplicación de estas técnicas se obtienen datos que podrán ser utilizados en estudios de sistemática, filogenia, biodiversidad, evolución, mejoramiento y biotecnología. La hibridación in situ (ISH) de sondas de ácidos nucleicos en preparaciones cromosómicas involucra cuatro pasos fundamentales que son: 1) Obtener una sonda marcando secuencias de ADN; 2) reacción de hibridación entre la sonda y el ADN blanco (cromosomas), ambos desnaturalizados previamente. Las secuencias complementarias de la sonda y del ADN de los cromosomas hibridarán, en relación a su homología, en un «sitio citológico»; 3) remoción de la sonda que no se unió o que se hibridó en forma inespecífica; 4) Detección de la hibridación y visualización de la hibridación a través de fluorocromos. Una de las aplicaciones de esta técnica (FISH o «fluorescent in situ hybridization») es la obtención de un mapa físico, funcional y estructural del genoma utilizando secuencias de distinto origen como sondas. El análisis de la organización física de secuencias repetidas, genes, secuencias clonadas (BACs, ESTs, ver II_3), rDNA, transgenes, retrovirus, etc., permite identificar cromosomas, analizar la arquitectura nuclear del genoma y verificar hipótesis acerca de la relación entre posición y función de determinadas secuencias. Otras aplicaciones de esta técnica consisten en determinar la distribución y posición de material cromosómico extraespecífico, la existencia de apareamiento y recombinación intergenó-mica, la existencia de segregación preferencial (responsables de herencia no mendeliana de algunos tipos cromosómicos), la presencia y tipo de rearreglos cromosómicos y analizar la segregación de determinados cromo-somas en estudios evolutivos y planes de mejora. Estos son relevantes para comprender la relación entre estos fenómenos y variaciones en la expresión génica. La hibridación in situ utilizando ADN genómico total como sonda (GISH o Genomic ISH) revela homologías específicas del ADN, principalmente en lo que respecta a secuencias repetidas y ha permitido realizar aportes relevantes en estudios evolutivos, biosistemáticos y en mejoramiento vegetal.

Esta técnica ha facilitado, por ejemplo, el reconocimiento de especies parentales en híbridos y poliploides, analizar afinidades genómicas interespecíficas, detectar reestructuraciones cromosómicas, corroborar que en el núcleo existen dominios espaciales de genomas o secuencias particulares, detectar la existencia de apareamiento intergenómico y recombinación. Además, permite analizar la organización nuclear y desarrollo cromosómico en especies e híbridos; detectar la presencia de cromosomas o segmentos cromosómicos introgresantes en planes de mejoramiento; analizar afinidades genómicas interespecíficas en cuanto a variación en secuencias de ADN repetitivo disperso y determinar la naturaleza del apareamiento meiótico en generaciones segregantes de híbridos y poliploides. Es importante señalar que las relaciones obtenidas mediante GISH no son afectadas por genes que producen disturbios en el apareamiento meiótico (asinapsis, desinapsis, apareamiento homeólogo o heterólogo). Como ya fue mencionado, el ADN repetido es el mayor componente del genoma en la mayoría de los eucariontes. En maíz, por ejemplo, el genoma está dominado por elementos repetidos, siendo la mayoría de éstos del tipo disperso (como, por ejemplo, retroelementos), los que ocuparían el 33- 62% del genoma. En el género Zea, por ejemplo, existen variaciones intra e interespecíficas en el tamaño del genoma. Su valor (2C) en especies con 2n = 20 oscila, en líneas y razas argentinas de maíz, entre 4,9 y 6,9 pg (5700 Mpb) y es de 9,2 pg (8878 Mpb) en Z. luxurians . Estas variaciones, tanto intercomo intraespecíficas se deberían principalmente a diferencias en la heterocromatina, reveladas por bandeo C y DAPI, que corresponderían a secuencias repetidas «en tandem». Sin embargo, tanto este tipo de ADN repetido «en tandem», como así también el «disperso» correspondiente a los retrotransposones, pudieron haber experimentado amplificaciones y diversificaciones durante la evolución de las especies del género Zea. La técnica GISH es, en la actualidad, la herramienta adecuada para revelar tales amplificaciones y divergencias. Esta técnica puede discriminar en forma directa aquellos genomas que presentan secuencias tan divergentes que no existe hibridación cruza-

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FIGURA 2. A-B, FISH: Zea luxurians (2n=20, A = las zonas amarillas brillantes muestran hibridación con la sonda «Knobs» de maíz marcada don digoxigenina y revelada con FITC; B = contratinción con DAPI, las zonas intensamente hibridadas en A coinciden con las zonas DAPI (+) de B.- C y D = Zea mays ssp. parviglumis , núcleo interfásico; la mayoría de las zonas DAPI (+) observadas en D muestran fuerte señal de hibridación en C; se utilizó sonda «Knob» de maíz marcada con dioxigenina y revelada con FITC. E = Zea mays ssp. mays (2n=20 + 5 cromosomas B), hibridación con sonda rDNA pta71 de trigo, marcada con biotina y revelada con Cy3, se señalan (puntas de flechas) los organizadores nucleolares en cromosomas y núcleo interfásico. F = Prometafase I meiótica de la F1 Zea mays ssp. mays x Zea perennis (2n=30); se observan III, II y I; la señal de hibridación se encuentra en un trivalente (señalado con flecha), se utilizó como sonda rDNA (pta71) como fue indicado en E. G-I = célula de Tricepiro; G = hibridada con sonda de ADN genómico total de centeno marcado con dioxigenina y revelada con FITC (GISH), se observan 14 cromosomas con fuerte señal de hibridación indicando que Tricepiro posee 14 cromosomas de centeno. H = igual célula rehibridada con la sonda pSc119.2 marcada con biotina y que da fuerte señal con Cy3 (en rojo), permitió reconocer los genomas de trigo presentes en Tricepiro. I = contratinción con DAPI. La barra representa 10 micrones, todas con igual aumento. Ver explicación extensa de las figuras en: Ferrari et al., 2001, 2004; Poggio, et al.,1999a,b y 2000.

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da entre ellas. El uso de ADN genómico total como sonda especie-específica tiene algunas ventajas sobre sondas clonadas pues el ADN genómico total incluye un rango muy amplio de secuencias múltiple copia y es por lo tanto improbable que exista sólo un lugar afín a la sonda. Esto es una ventaja cuando se necesita una amplia especificidad, ya que una sonda clonada sería homóloga de algunos pocos cromosomas o segmentos de cromosomas. En los casos en que la divergencia sea leve, puede modificarse el nivel de exigencia en la hibridación y utilizar DNA no marcado como bloqueante. Esta modificación consiste en agregar a la mezcla de hibridación ADN no marcado en alta concentración. Este bloqueo no sólo aumenta la diferenciación entre la especie que se usa como sonda y la que se usa como bloqueante, sino que reduce la hibridación cruzada con otras especies, ya que muchas plantas de la misma familia comparten muchas secuencias. Para diferenciar especies y cuando la resolución es importante se requiere bloqueo y estricto control de exigencia. Estudios de hibridación in situ (FISH, GISH) mostraron que el cereal sintético Tricepiro (2n=6x=42) está compuesto por 28 cromosomas de trigo, 14 de centeno y pequeñas zonas de introgresión de Thynopyrum. Mediante el uso de sondas repetidas particulares se logró identificar la totalidad de los cromosomas de Tricepiro. Experimentos con GISH han demostrado que Bromus setifolius (2n=28), es uno de los progenitores de B. pictus (2n=70), gramínea patagónica de potencial importancia forrajera. En el genero Zea la técnica GISH nos ha permitido: analizar la afinidad genómica entre subespecies de la sección Zea, y entre maíz, teosinte y géneros relacionados. Mediante GISH hemos demostrado que existen zonas de alta homología entre Tripsacum dactyloides (una de las especies que pudieron haber estado involucradas en el origen del maíz) y Zea mays spp. mays. Estas zonas coinciden con regiones controladoras de la apomixis y secuencias neocentroméricas. Estos resultados apoyan hipótesis planteadas previamente sobre la existencia de zonas de homología entre ambas especies que favorecerían el intercambio

genético y la transferencia de genes de importancia para el mejoramiento del maíz. Estudios realizados en especies de la sección Luxuriantes permitió determinar, mediante técnicas de FISH, que Zea luxurians presentaría secuencias teloméricas de ADN altamente repetitivo. El análisis de estas secuencias marcadoras en meiosis nos permitió resolver la constitución cromosómica de las complejas configuraciones meióticas que se observan en híbridos intra e interseccionales. Estos resultados permitieron corroborar las fórmulas genómicas planteadas para las distintas especies, avalando la hipótesis propuesta sobre el origen poliploide del maíz y especies afines. Las mismas técnicas, aplicadas en razas de maíz que presentan polimorfismo numérico para cromosomas B, permitieron postular hipótesis acerca del origen de los mismos. 6 Lecturas recomendada
APPELS R., MORRIS R., BIKRAM S. & CEDRIC M. 1998. Chromosome Biology. Kluger Academic Publish. London BENNETT M. D. 1982. Nucleotype basic of spatial ordening of chromosomes in eukaryotes and the implications of the order for genome evolution and phenotypic variation. In Genome Evolution, Academic Press, London, pp. 230-261. BENNETT M. D. 1983. The spatial distribution of chromosomes, Kew Chrom. Conf. II. George Allen & Unwin. P. Brandham & M. D. Bennett (eds.). pp. 71-79. BENNETT M. D. 1984. The genome, the natural karyotype and biosystematics. In: Plant biosistematics (Grant, W.F., ed.). Academic Press, New York, pp 41-66. BENNETT, M. D. 1995. The development and use of genomic in situ hibridization (GISH) as a new tool in plant biosystematics. In: Kew Chromosome Conference IV (Brandham, P.E. and Bennett, M.D. eds.). Royal Botanic Gardens, Kew, pp 167-183. CUADRADO, A. & JOUVE, N. 1995. Fluorescent in situ hybridization and C-banding analysis of highly repetitive DNA sequence in the heterochromatin of rye (Secale montanum Guss.) and wheat incorporating S.montanum chromosome segments. Genome 38: 795-802. FELDMAN, M. & AVIVI, L. 1988. Genetic control of bivalent pairing in common wheat. The mode of Ph 1 action. In: Kew Chromosome Conference III (Brandham, P.E. ed.). Royal Botanic Gardens, Kew, pp 269-279. FERRARI, M.R., GREIZERSTEIN, H.E., PACAPELO, A., NARANJO, C.A. & L. POGGIO. 2001. Identificación cromosómica de Tricepiro, mediante técnicas de bandeo e hibridación in situ (GISH). XXX Congreso Argentino

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de Genética y IV Jornadas Argentino-Uruguayas de Genética, Mar del Plata, 16-19 de Septiembre de 2001, pág. 80. FERRARI, M.R., GREIZERSTEIN, H.E., PACAPELO, A., NARANJO, C.A., CUADRADO, A., JOUVE, N. & L. POGGIO. 2004. The genomic composition of Tricepiro, a synthetic forage crop. Genome (Canadá), en prensa. FUTUYMA, D.J. 1998. Evolutionary biology. (Third Edition). Sinauer Associates Inc. GRANT, V. 1981. Plant Speciation. Columbia Univ. Press. New York. 435 pp. GRANT, V. 1985. The Evolutionary Process. W.H. Freeeman and Co. San Francisco, 499 pag. GREIZERSTEIN, E. & POGGIO L. 1995. Meiotic studies of sponta-neus hybrids of Amaranthus: genome analysis. Plant Breeding (Alemania) 114: 448-450. GRIPYA & T. TSUCHIYA (eds) 1991. Chromosome engineering in plants: genetics, breeding, evolution. Part A. Elsvier. HARRISON, G. R. 1993. Hybrid zones and the Evolutionary Process. Oxford University Press. New York. JACKSON, R.C. & MURRAY, B.G. 1983. Colchicine-induced quadrivalent formation in Helianthus : evidence of ancient polyploidy. Theor. Appl. Genet. 64: 219-222. KING, MAX. 1993. Species Evolution. The role of chromosome change .Cambridge Univ. Press LACADENA J. R. 1996. Citogenetica. Editorial Complutense. 991 pags. LEWIN B. 2000. GENES VII. Oxford University Press, NY. NARANJO, C. A., MOLINA, M. C. & POGGIO, L. 1990. Evidencias de un número básico X=5 en el género Zea y su importancia en estudios del origen del maíz. Acad Nac Cs Ex Fis Nat, Buenos Aires, Monografía 5: 43-53. NARANJO, C. A., POGGIO, L., MOLINA, M. & BERNATENÉ, E. 1994. Increase in multivalent frequency in F1 hybrids of Zea diploperennis x Z. perennis by colchicine treatment. Hereditas 120: 241-244. PAGE & HOLMES. 1998. Molecular Evolution. Blackwell Science. POGGIO, L., CONFALONIERI, V., COMAS, C., CUADRADO, A., JOUVE, N. & NARANJO, C. A. 1999a. Genomic « in situ» hybridization (GISH) of Tripsacum dactyloides and Zea mays ssp. mays with B-chromosomes. Genome 42: 687691. POGGIO, L., CONFALONIERI, V., COMAS, C., GONZALEZ, G. & NARANJO, C. A. 1999b. Genomic affinities of Zea luxurians, Z. diploperennis and Z. perennis: meiotic behaviour of their F1 hybrids and genomic « in situ » hybridization (GISH). Genome 42: 993-1000. POGGIO, L., CONFALONIERI, V., COMAS, C., GONZALEZ, G. & NARANJO, C. A. 2000. Evolutionary relationships in

the genus Zea: analysis of repetitive sequences used as cytological FISH and GISH markers. Genetics and Molecular Biology (Brasil) 23,4,1021-1027. POGGIO, L., NARANJO, C. A. & JONES, K. 1986. The chromosomes of Orchids IX. Eulophia. Kew Bulletin 41:45-49. POGGIO, L., ROSATO, M. & NARANJO, C. A. 1997. Meiotic behavior in alloplasmic lines of Zea mays ssp. mays. Genome 40: 723-729. POGGIO, L., ROSATO, M., CHIAVARINO, A. M. & NARANJO, C. A. 1998. Genome size and environmental correlations in maize (Zea mays ssp. mays). Annals of Botany (UK) 82 Suppl.A:107-115. POGGIO L., ROSATO. M., MAZOTI L. B. & NARANJO, C. A. 1997. Variable meiotic behaviour among plants of an alloplasmic line of maize. Cytologia (Japón) 62:271-274, POGGIO, L.., WULFF, A.F. & HUNZIKER, J.H. 1986b. Chromosome size, nuclear volume and DNA content in Bulnesia (Zygophyllaceae). Darwiniana 27:25-38. SHARMA, A.K. & SHARMA, A. (eds.) 2001. Chomosome Painting. Principles, Strategies and Scope. Kluwer Academic Publishers, 179 pp. (Reprinted from Methods in Cell Science 23: (1-3), 2001). SOLTIS D. E., SOLTIS P. S. & DOYLE J. 1998. Molecular Systematics of Plants II. DNA Sequencing. Kluwer Academic Publishers. 574pp. STEBBINS, G.L. 1971. Chromosomal Evolution in Higher Plants. Addison Wesley Publ. Reading. Massachusetts. 216 pags. SUMNER, A.T. 1990. Chromosome banding. London Unwin Hyman.434 pp. SWANSON, C.P., T. MERZ & W.J. YOUNG. 1981. Cytogenetics. Englewood Cliffs., New Jersey. Prentice Hall, Inc. SYBENGA, J. 1975. Meiotic Configurations. Springer Verlag. 251 pp TITO, C.M., POGGIO, L. & NARANJO, C.A. 1991. Cytogenetic studies in the genus Zea. 3. DNA content and heterochromatin in species and hybrids. Theor. Appl. Genet. 83:58-64.

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PARTE III Métodos para generar variabilidad

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CARDONE, Susana; OLMOS, Sofía; ECHENIQUE, Viviana

III.-Capítulo 1
Variación somaclonal
Cardone, Susana; Olmos, Sofía; Echenique, Viviana 1 Introducción El comportamiento celular normal es el resultado de una compleja cascada de programas genéticos que son sensibles a la disrupción por estreses bióticos y abióticos. El cultivo in vitro per se puede ser muy estresante para las células vegetales e involucra procesos mutagénicos durante el establecimiento del explanto, la inducción de callo, la formación de embriones y la regeneración de plantas. Por esta vía es posible obtener variación, de origen nuclear y/o citoplasmática, que podría ser utilizada para el mejoramiento vegetal. Este proceso, denominado variación somaclonal por Larkin y Scowcroft (1981), involucra cambios en las plantas regeneradas que son transmitidos a la progenie. Asimismo cabe citar la ocurrencia in vitro de interacciones no específicas que no generan variación estable y transmisible, pero que conducen a cambios en la expresión génica. Dichos cambios, denominados «epigenéticos», son también considerados por algunos autores como variación somaclonal mientras que otros sólo incluyen en la misma los cambios estables. Los mecanismos por los cuales ocurre la variación somaclonal no han sido completamente dilucidados, pero entre sus causas se mencionan alteraciones en el cariotipo, mutaciones puntuales, recombinación somática e intercambio de cromátidas hermanas, rearreglos génicos somáticos, elementos genéticos transponibles, amplificación y/o metilación del ADN y cambios en el ADN de las organelas. Por ello, aunque los caracteres morfológicos (como por ejemplo el hábito de crecimiento, la morfología floral, etc.) son fáciles de evaluar, muchos aspectos de la variación suceden sin manifestarse en cambios morfológicos evidentes. Una diferencia estructural en un producto génico puede no alterar su actividad biológica lo suficiente como para producir un fenotipo modificado.

Por ello, la variación debe analizarse a varios niveles. Esta variación depende del genotipo, de la fuente de explanto, del tiempo en que el material ha estado sometido al cultivo in vitro, de las condiciones y composición del medio de cultivo y de la vía de regeneración, donde la embriogénesis somática generaría menores alteraciones que la organogénesis. Los cambios producidos son generalmente indeseables, pero la aparición ocasional de caracteres no encontrados en las poblaciones naturales y que representan una ventaja desde el punto de vista agronómico permite utilizar este fenómeno en programas de mejora vegetal. Se ha utilizado en algunos casos para conferir caracteres deseables a cultivares de importancia económica, entre los que se incluyen resistencia a enfermedades, tolerancia a suelos ácidos y a salinidad. El desarrollo de nuevos cultivares por esta técnica involucra un balance entre la cantidad de variación inducida y el mantenimiento de los caracteres agronómicos del cultivar. Como ejemplo puede citarse el caso de somaclones de pasto bermuda, Cynodon dactylon, donde se encontró resistencia a la oruga militar en un cultivar que reunía otras buenas características, dando origen al cultivar Brazos-R3. Si bien desde el punto de vista práctico no resulta una técnica muy eficiente en todos los casos, debido a que no es posible predecir ni dirigir el tipo de variación y se hace menester trabajar con grandes poblaciones de plantas, es necesaria la compresión del mecanismo para evitarlo en casos donde se quiere fidelidad genética, como en la micropropagación, la conservación de germoplasma y la transformación de plantas. También, en algunos casos, puede representar una fuente rápida y fácilmente accesible de variación para ser utilizada en programas de mejoramiento, especialmente para especies con sistemas genéticos limitados y/o de base genética estrecha, como en el caso de la apomixis, donde la variabilidad dentro de las poblaciones naturales o cultivadas es limitada. Los primeros casos de variación somaclonal fueron registrados en plantas de reproducción agámica como la caña de azúcar y la papa, pero el fenómeno ha sido ob-

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servado en monocotiledóneas como trigo, maíz, avena, arroz, pasto miel (Paspalum dilatatum) y pasto llorón (Eragrostis curvula) y en dicotiledóneas como tabaco, tomate, zanahoria y col, entre muchas otras especies. 2 Factores relacionados con la aparición de variación somaclonal La aparición de la variación somaclonal depende de varios factores, entre los que se han citado: el genotipo, el tipo de explanto, la vía de regeneración, la composición del medio de cultivo utilizado, los reguladores de crecimiento y la duración del período de cultivo. Genotipo. En general se asume que la frecuencia de cambios dependerá de variaciones preexistentes en el genotipo y de las interacciones que surgen entre el genotipo y el proceso de cultivo. En arroz, ciertas variedades estables muestran niveles de variación que oscilan entre el 0 y el 1%, mientras que en otras, consideradas inestables, oscilan entre el 10 y el 27%. En Kalanchoe, especie ornamental, la variación somaclonal es genotipo dependiente y se la utiliza como una herramienta para la obtención de variedades. El nivel de ploidía es otro factor a tener en cuenta. Por ejemplo en raigrás (Lolium multiflorum) y en papa se observó que las variedades diploides muestran estabilidad, mientras que las tetraploides tienden a generar aneuploidías durante el cultivo de tejidos. La explicación más razonable es que los poliploides, con más de dos juegos completos de cromosomas, están «tamponados», y por lo tanto toleran la ganancia o pérdida de cromosomas, pudiendo así cumplir con los requisitos impuestos por la regeneración. En los diploides, la pérdida o la alteración de cromosomas que llevan genes vitales impedirá la regeneración de las plantas, llegando con éxito a esta etapa sólo aquellos explantos que tengan su complemento cromosómico completo. Existen evidencias de una mayor inestabilidad en híbridos interespecíficos cultivados in vitro, si se los compara con las especies parentales. Como ejemplo puede citarse el caso de los híbridos obtenidos de la cruza de Hordeum vulgare x Hordeum jubatum ,

donde el cultivo in vitro generó entre un 5% y un 10% de regenerantes haploides que contenían sólo el genoma de Hordeum vulgare. Por esta causa ciertos cruzamientos interespecíficos suelen utilizarse como metodología para la obtención de haploides. Explanto. La variación también puede ser una consecuencia de quimerismo en el explanto original. Las quimeras son mosaicos genéticos. Esto significa que dentro de una misma planta existen células con diferente constitución genética, lo cual se debe a una serie de cambios producidos durante el desarrollo en el ADN nuclear de ciertos tipos celulares. Si estos tejidos se utilizan como explantos y sus células son inducidas a dividirse y rediferenciarse, las diferentes líneas celulares podrían entonces dar origen a plantas genéticamente diferentes. Por lo tanto, la utilización de explantos con tejidos quiméricos preexistentes puede resultar en una fuente extra de variación. Sin embargo, la recuperación de quimeras a partir de explantos no quiméricos es un fenómeno frecuente que puede ocurrir a partir de procesos organogénicos. La utilización de explantos con tejidos organizados como esquejes radicales o caulinares sería una buena opción si es necesario mantener estabilidad genética durante el cultivo in vitro. Sin embargo, diferentes genotipos reaccionan de manera distinta, aún con explantos «seguros». Parecería que el cultivo de meristemas aislados sería la mejor opción para minimizar el riesgo de variación somaclonal. Sin embargo, esto no debería tomarse como regla. Utilizando técnicas moleculares fue posible detectar la ocurrencia de variación en plantas de frutilla y paraíso obtenidas a partir de meristemas. El cultivo de protoplastos parecería inducir, en ocasiones, inestabilidad genética, como fue observado en papa y Nicotiana. Esto, en ocasiones, ha sido asociado a los mayores tiempos en cultivo involucrados en la regeneración de plantas a partir de explantos tan pequeños. La vía de regeneración también tiene un rol importante en la ocurrencia de alteraciones en plantas obtenidas in vitro. En especies de los géneros Pennisetum, Panicum, y Lolium la variación observada en cultivos embriogénicos es relativamente menor que

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CARDONE, Susana; OLMOS, Sofía; ECHENIQUE, Viviana

que puede inducir inestabilidad cariotípica o puede incrementar el número de plantas albinas. lo cual probablemente genera considerable variación. apio y caña de azúcar regeneradas a través de embriogénesis somática. En varias monocotiledóneas. Otro factor importante es la temperatura. ya que la desaminación de una 5-metil citocina resulta en un cambio de la base de citocina a timina. como se ha observado en espárrago. El estado físico del medio de cultivo también influye en el nivel de variación obtenida. las citocininas no tienen efecto en este sentido. donde la citosina se encuentra metilada en posición 5 son considerados puntos calientes de mutación. En un estudio realizado en Cymbopogon se observó que muchas de las plantas regeneradas a partir de callos de semilla fueron anormales. Si bien el modo de acción herbicida del 2. principalmente el 2. Este tipo de callo mantiene un alto grado de estabilidad genética. siendo utilizado en gramíneas como inductor de aneuploidías. se incrementa el riesgo de inestabilidad cromosómica. En estos casos se observó que algunos fenotipos anormales de embriones somáticos se asemejan a los mutantes del desarrollo embrionario obtenidos en Arabidopsis y maíz. el callo representa. Ejercen profundos efectos sobre la respiración celular. Se postula que el gran número de genes requeridos para la iniciación y maduración de embriones cigóticos y somáticos impediría la acumulación de mutaciones deletéreas. El 2. La mayor parte de la variación obtenida in vitro parece provenir de la fase de callo.4 diclorofenoxiacético) han sido señalados como inductores de inestabilidad. el consumo de azúcares y en el control de la división celular. La naturaleza del callo también puede afectar el nivel de variación obtenida. sin que medie un proceso previo de desdiferenciación celular y formación de callo.la que aparece en cultivos organogénicos. Sin embargo. Un callo verdadero es una masa de células desdiferenciadas que proliferan desorganizadamente.4-D (ácido 2. se observaron variantes en plantas de café. es decir. La variación que ocurre en los números cromosómicos en la primera fase de la inducción del callo sería el resultado de fragmentación nuclear seguida por mitosis de los fragmentos nucleares.4-D. Lo que algunos autores sugieren es que el 2. mayor que la requerida en la formación de vástagos. aparentemente involucra un incremento sustancial en la transcripción que puede alterar la estructura de la cromatina. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 85 . Cuando comienza la división celular a partir de tejidos diferenciados. En ocasiones también fue posible observar variación en plantas obtenidas por regeneración directa. mientras que las obtenidas por callos de inflorescencias fueron muy semejantes a las plantas de las cuales provenían los explantos. Por ello se especula acerca de su rol indirecto en la inducción de cambios en el metabolismo celular y tisular de plantas creciendo in vitro. combinada con la mitosis normal de los núcleos intactos (núcleos euploides). Los sectores en el ADN. Un mismo explanto puede tener diferente comportamiento si se lo cultiva en medio sólido o en medio líquido. La fragmentación nuclear amitótica citada anteriormente observada en algunas plantas regeneradas también se reconoce como causa de aneuploidía.4-D induce desdiferenciación y este proceso sería el generador de los cambios. Medio de cultivo. Este fenómeno es causado por una relación especial auxina:citocinina. que se sabe que activan elementos transponibles y estimulan la inducción de enzimas y productos específicos que se inducen también en situaciones de estrés. La iniciación de un callo puede ser análoga a la respuesta de las plantas a heridas.4-D no es totalmente comprendido. Los reguladores de crecimiento. que dará origen a un callo. a menudo. una masa de órganos suprimidos o proembriones más que un tejido completamente desorganizado. Las auxinas naturales y sintéticas tienen una elevada correlación con el porcentaje de 5metil citocina. el AIA (ácido indolacético) y el ANA (ácido naftalenacético) han sido señalados como los responsables de los incrementos en la metilación de la citosina que tiene lugar durante el cultivo in vitro. Esto probablemente se debe a la gran presión de selección impuesta en la formación de los embriones.

calcio y magnesio pueden resultar en cambios genómicos. tabaco.Estudios tendientes a analizar los efectos de los reguladores de crecimiento sobre la regeneración de plantas a partir de protoplastos. de ADN repetitivo y diferencias a nivel del ADN ribosomal. dependiendo de la intensidad del estrés y del estado de diferenciación de las células en el momento de experimentarlo. Estos cambios ocurren probablemente debido a un mecanismo de respuesta al estrés que comprende la pérdida del control del ciclo celular. El número óptimo de subcultivos podría estimarse empíricamente luego de realizar pruebas de fidelidad genética en las plantas regeneradas a través de subcultivos subsecuentes. Esto se ha observado en ajo. Sin embargo. Una observación común es que en los períodos prolongados de cultivo hay una pérdida de totipotencia y que esto sucedería debido a la acumulación de mutaciones y a la alteración de los genes que son responsables de la regeneración. demostró que las variaciones se producen al azar en los diferentes subcultivos. necesariamente. avena. en la literatura se menciona la posibilidad de ocurrencia de alteraciones a nivel del ADN a consecuencia de diferentes estreses ambientales. ECHENIQUE. Se ha observado que las deficiencias o excesos de azufre. Susana. fundamentalmente una llamada «L» y otra llamada «S». aumentando la proporción de variantes en cultivos envejecidos y también en plantas obtenidas a través de varios subcultivos. pero en algún momento esa capacidad de amortiguación se vuelve deficiente y los organismos caen en un estado de crecimiento subóptimo que podría inducir a mecanismos generadores de cambios genómicos. fósforo. La tensión de oxígeno de las células en la superficie del callo es diferente a la de aquellas células que se encuentran situadas profundamente en la masa del mismo. También existen especies de plantas que producen compuestos mutagénicos durante el cultivo. la desdiferenciación que se produce durante la inducción del mis- 86 CARDONE. 3 Cambios genómicos producidos durante el cultivo de tejidos Las plantas poseen una amplia capacidad de acomodarse a las situaciones cambiantes de su entorno. 2002). Sin embargo. Varias líneas estables obtenidas. de manera que las hormonas inducirían la inestabilidad genética sin ser. La edad del cultivo es otro factor que afecta el nivel de variación. maíz. La deficiencia o exceso de minerales también podría afectar la estabilidad genética in vitro. no habiendo una relación lineal entre el número de subcultivos y la cantidad de variación obtenida en plantas micropropagadas de paraíso gigante. denominadas genotrofos. La variación en este caso se detectó mediante la ténica de RAPD a lo largo de de 10 subcultivos (Olmos y col. un estudio realizado por nuestro grupo de trabajo en la UNS. se generan elevados niveles de variación genética. el origen de la misma. el cual podría comportarse como un mutágeno. Sin embargo. En el caso de un callo. Las bases metabólicas de la interacción entre el estrés y estos cambios son desconocidas. se caracterizaron por poseer diferentes contenidos de ADN nuclear. indicaron que la variación en el tipo y concentración de reguladores de crecimiento en los estadios iniciales de cultivo no generaría variación genética. La anaerobiosis resultaría en la producción de etanol. Sofía. Un efecto similar podría tener la acumulación de metabolitos producidos por las propias células durante el proceso. si el cambio en la composición de los reguladores ocurre en el estadio que va desde el crecimiento del callo a la iniciación de los vástagos. En la variedad de lino «Stortmont Cyrrus» se detectaron cambios genéticos estables y heredables inducidos por una alta fertilización del suelo con fósforo o con nitrógeno. Se ha mencionado que las condiciones de cultivo in vitro podrían afectar los niveles de resistencia celular al efecto de los metabolitos que normalmente se encuentran presentes en los tejidos en bajas concentraciones. Otro factor a considerar es la deficiencia de oxígeno que se genera durante el curso del cultivo. triticale y raigrás triploide.. OLMOS. realizados en papa. Estos datos sugieren que la fase de callo sería un período sensible en el cual la manipulación hormonal afecta la estabilidad de las plantas regeneradas. Viviana . nitrógeno. en colaboración con el IBONE. La variación puede minimizarse realizando subcultivos frecuentes de explantos no envejecidos.

Los cambios pueden ocurrir también en el genoma de los plástidos y las mitocondrias. En este sentido. Kaeppler y Phillips (1993) indican que plantas bajo estrés severo de nutrientes o de agua no presentan estos cambios de metilación encontrados en los regenerantes de cultivo in vitro. las aberraciones estructurales y numéricas. un tipo muy particular de estrés que podría inducir una respuesta única y un perfil particular de mutación. Los puntos de ruptura de muchas de las alteraciones estructurales presentes en las plantas regeneradas se hallan en zonas heterocromáticas. de manera que parecería que la variación somaclonal no es al azar y que habría loci específicos que tendrían mayor tendencia a la mutación. Kaeppler y Phillips (1993) han propuesto una base molecular común para todos estos eventos mutagénicos. seguida de mitosis. provoca alteraciones en los patrones de metilación del ADN. El 2. Los cambios en la metilación del ADN podrían estar relacionados con la replicación tardía de la heterocromatina. por lo tanto.mo provoca en las células una serie de procesos metabólicos que resultan en reordenamientos genómicos que podrían dar lugar a fenotipos alterados. en definitiva resulta en eventos de ruptura cromosómica. Tal mecanismo podría afectar la expresión génica y la estructura de la cromatina. Varias hipótesis han intentado explicar y relacionar la serie de eventos que tienen lugar durante el cultivo in vitro. Por otra parte ocurren también cambios genómicos que involucran alteraciones en el número de cromosomas. El mecanismo por el cual se producen los cambios en metilación no ha sido totalmente dilucidado. como el intercambio entre cromátidas hermanas o el «crossing over» somático. sin embargo. Se cree. La poliploidía es el más común de estos fenómenos y estaría relacionada con fallas en la mitosis. los cambios en la metilación y las mutaciones génicas. Estas alteraciones podrían afectar la expresión de genes específicos. Esto podría indicar que la variación en metilación no es una respuesta general a todos los estreses. por lo tanto. se observaron fenotipos aberrantes por aneuploidía o por duplicación cromosómica. no todos los regenerantes aneuploides o poliploides pudieron detectarse a nivel fenotípico. pero pueden causar infertilidad. Esta hipótesis establece que el estrés inducido por el proceso de cultivo in vitro. a un gran número de genes.4-D provoca cambios en la estructura de la cromatina en ápices de raíz de echalote y también en cultivos de células humanas. como aneuploidías y poliploidías. Como ejemplo puede mencionarse la restauración parcial de la fertilidad en plantas de sorgo androestériles obteni- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 87 . cambios cromosómicos que involucren la estructura o el número de los cromosomas y activación de elementos genéticos transponibles. En papa. incluyendo elementos transponibles y/ o podrían afectar la estructura de la cromatina de una manera más global. que pueden alterar su frecuencia de aparición en plantas regeneradas respecto de plantas que no pasaron por cultivo in vitro. Las auxinas podrían ejercer el mismo efecto durante el cultivo de tejidos vegetales. Un posible efector de esta variación en la metilación sería la alta concentración de reguladores de crecimiento utilizada para inducir a las células a crecer en cultivo. A veces estos cambios en el número cromosómico pueden afectar el fenotipo a través de dosajes génicos alterados. al involucrar efectos hormonales y desbalance en el conjunto de nucleótidos. en raigrás se ha propuesto la existencia de puntos calientes de inestabilidad en el ADN genómico. Un posible mecanismo involucra alteración en los patrones de metilación. Los cambios estructurales que no están asociados a cambios en el dosaje génico o a cambios en la regulación suelen pasar desapercibidos fenotípicamente. mientras que la aneuploidía puede surgir por segregación desigual en la mitosis o por fragmentación nuclear. Entre las alteraciones genéticas registradas durante el cultivo in vitro pueden citarse mutaciones génicas. por ejemplo. El cultivo de tejidos podría representar. También existen anomalías. involucrando. que. que los cambios en los modelos de metilación causados por el cultivo de tejidos no serían aleatorios. además. como por ejemplo las perturbaciones del ciclo celular.

De esta manera podrían detectarse translocaciones. Si bien parecería que los tejidos somáticos son menos sensibles a la variación. ECHENIQUE. Como se mencionara anteriormente existen. tolerancia a herbicidas. resultó en un 67% de variación en el color de las flores de las plantas regeneradas. variedad «Crimson Frost». La ocurrencia de variación somaclonal puede detectarse con marcadores fenotípicos. y probablemente actúan simultáneamente. Los cambios cariotípicos constituyen una fuente importante de variación que muchas veces es subestimada cuando se realizan recuentos cromosómicos. 4 Niveles de detección de la variación somaclonal Es evidente que los mecanismos que operan para inducir variación son numerosos y diversos. desde un punto de vista teórico. además. Plantas de (maní) presentaron variaciones epigenéticas en altura. Viviana .das in vitro. El cultivo in vitro de yemas de ananá dio como resultado plantas que exhibían cambios estables en el tamaño de frutos. OLMOS. tanto para cereales como para plantas frutales. Susana. número y peso de semillas. herbicidas. Se citan a continuación algunos ejemplos de la utilización de marcadores de varios tipos en la evaluación de la variación somaclonal. ya que posibilitarían realizar estudios básicos acerca de la variación y el posible control de la misma. Por esto 88 CARDONE. entre otros. También puede citarse el caso del cultivo in vitro de plantas androestériles de maíz con citoplasma «T» (susceptibles a Helminthosporium maydis). tamaño de hojas. La utilización de marcadores morfológicos para detectar variantes somaclonales ha sido exitosa y citada en varios trabajos de investigación. que condujo a la reversión de la androesterilidad y de la susceptibilidad. el cultivo de tejidos de violeta africana. El examen visual y la utilización de un analizador de imágenes posibilitaron la diferenciación entre fenotipos normales y aberrantes de plantas regeneradas de Pelargonium x hortorum ¨Río¨. tasa de proliferación de vástagos y color y textura de las hojas. La correlación de dichos marcadores con caracteres agronómicos es un requisito relevante para su implementación en los programas de mejoramiento. provocados por las condiciones microambientales del cultivo de tejidos. La comprensión de los mecanismos por los cuales ocurre la variación somaclonal ayudaría a comprender y definir los procesos celulares de respuesta al estrés y permitiría definir cómo los mismos actúan en los procesos de evolución (Kaeppler et al. Detectar y analizar los distintos niveles de modificaciones genómicas generadas por cultivo in vitro reviste interés desde un punto de vista práctico. bioquímicos y moleculares. tales como inóculos. inversiones. El análisis de los genomas de cloroplastos de plantas albinas de trigo obtenidas a partir del cultivo de anteras reveló la presencia de deleciones y rearreglos. La mayoría de estos estudios se basaron en la implementación de una alta presión de selección durante la etapa de regeneración celular mediante la adición de agentes selectivos en el medio de establecimiento y regeneración. también se ha observado albinismo en plantas regeneradas a partir de los mismos. A nivel fisiológico. 2000).. sales. problema que se presenta frecuentemente en el cultivo de anteras en las Gramíneas. toxinas. deleciones y duplicaciones. El estudio del cariotipo permite detectar cambios en el número y estructura de los cromosomas. diferencias de crecimiento en condiciones de pHs variables.. Sofía. se detectaron y seleccionaron variaciones en cultivo de células y tejidos por presentar resistencia a enfermedades. variaciones epigenéticas. condiciones de pH extremas o concentraciones salinas elevadas. Estos cambios se corresponderían con mutaciones en el ADN mitocondrial. Otro caso de variación debida al cultivo in vitro es el albinismo. conduciendo a cambios en caracteres cuali y cuantitativos. Características tales como el acostumbramiento a la citocinina y la resistencia a heladas pueden citarse como ejemplos de este tipo de variación. ya que las mismas podrían ser potentes fuentes de material para seleccionar caracteres de interés y. Como puede apreciarse a través de los casos mencionados. que no son estables y que son el resultado de cambios en los patrones de metilación del ADN y de amplificaciones génicas. son varios los mecanismos que conducen a la variación somaclonal.

Esta técnica fue aplicada a suspensiones celulares de Brachycome dichromosomatica (2n = 4). Por ello. Esto indicaría que la variación molecular no siempre se expresa a nivel fenotípico y viceversa. sólo se transcribe y traduce una pequeña proporción del genoma. En este mismo género. los métodos de análisis a nivel molecular pueden proporcionar mucha información. Los patrones isoenzimáticos de líneas isogénicas de Trifolium pratense L. tal es el caso de la palmera datilera (Elaeis guineensis Jacq. independientemente del estado fisiológico o de desarrollo de las mismas. Esta variación fue detectada mediante electroforesis en geles de almidón utilizando los sistemas isocitrato deshidrogenasa (IDH) shiquimato deshidrogenasa (SKDH). donde a través de la utilización de microsatélites se detectaron polimorfismos en plantas Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 89 . Entre los marcadores bioquímicos utilizados para analizar progenies de plantas regeneradas pueden mencionarse las isoenzimas. fosfogluco. Picea abies .deshidrogenasa (6-PGD). En Phalaenopsis se ha encontrado correspondencia entre variaciones morfológicas y moleculares. Existen otros ejemplos que corroborarían esta afirmación. como por ejemplo el bandeo cromosómico.y Panax notoginseng. Los RAPD para diagnosticar fidelidad genética en plantas regeneradas por cultivo in vitro han sido utilizados en Pinus mariana (Mill). Sin embargo.. la técnica permitió detectar polimorfismos en plantas micropropagadas de fenotipo normal. se están analizando los productos de genes expresados. Por otro lado. En otros casos el análisis isoenzimático no permitió detectar variación. donde no se detectaron polimorfismos en plantas regeneradas que habían presentado fenotipos florales anormales o el de plántulas micropropagadas de Populus deltoides. Utilizando RAPD pudo detectarse la existencia de polimorfismos en plantas de Triticum tauschii obtenidas mediante callogénesis. La hibridación in situ es otra de las técnicas que podría aportar información útil para detectar cambios genéticos estructurales. Festuca pratensis Huds. ya que las secuencias de ADN son esencialmente las mismas en todas las células vivas de la planta. Los patrones electroforéticos permitieron caracterizar a las plantas fenotípicamente normales y anormales. alcohol deshidrogenasas y esterasas. pudiéndose discriminar plantas normales de variantes morfológicas mediante la combinación de perfiles RAPD generados por 38 cebadores. En Pelargonium x hortorum «Río» el empleo de un conjunto de 13 cebadores permitieron la detección de polimorfismos en solamente el 50% de las plantas con fenotipos aberrantes.mismo existen otras técnicas que estiman cambios cariotípicos con mayor eficiencia. resultaron idénticos para los sistemas de peroxidasas. malato deshidrogenasa (MDH). las plantas albinas obtenidas en este estudio no presentaron polimorfismos en los loci estudiados. En otro estudio se observó que no todas las plantas de Musa de fenotipo anormal (enanas) obtenidas presentaban el mismo patrón de bandas. El estudio de líneas de callos derivadas de embriones cigóticos y de embriones somáticos de abeto (Picea glauca x engelmannii) utilizando 15 sistemas isoenzimáticos no evidenció la presencia de variación somaclonal en 25 loci analizados. donde permitió detectar rearreglos importantes en individuos donde el número cromosómico permaneció estable. que diferían en su capacidad de regeneración. pueden proveer información útil acerca de la variación generada in vitro. Los marcadores moleculares presentan varias ventajas a la hora de detectar inestabilidad genética debido a su amplia cobertura del genoma y a que no son influenciados por el ambiente ni por los estados fenológicos de las plantas.).isomerasa (PGI) y 6-fosfogluconato . cuya regulación puede estar en cierta medida afectada por factores ambientales o fisiológicos. Quercus suber L. En otros casos no ha sido posible realizar esta asociación. Las isoenzimas. probablemente debido a la necesidad del empleo de un mayor número de cebadores. que permitieron detectar entre un 24 a 35% de variación en plantas de Populus tremuloides regeneradas a través de callos. Sin embargo. glutamato deshidrogenasas. por lo tanto. En Mentha arvensis se obtuvieron perfiles RAPD polimórficos con 12 cebadores en las 6 plantas fenotípicamente diferentes obtenidas por micropropagación.

Esto fue debido a que producía menores niveles de un estimulante para la alimentación del insecto. en contraste con la tasa esperada de mutación espontánea de 10-7 – 10-9 mutaciones por par de nucleótidos por generación. etc. La variación somaclonal ocurre con una frecuencia de 1 mutación cada 100 plantas regeneradas. √ Es exitosa para eliminar uno o pocos defectos en cultivares bien adaptados. ECHENIQUE. particularmente para cultivos con base genética estrecha y √ En algunos casos. pero además era resistente a dicho insecto. Desde el punto de vista productivo y comercial. invernáculo y a campo para resistencia a la oruga militar. la mayoría de los cambios deletéreos producidos son eliminados por el filtro que representa la regeneración de plantas. √ La regeneración está limitada a genotipos específicos que pueden no ser de mucho interés para los mejoradores. que se encuentra normalmente en las poblaciones de individuos. 5 La variación somaclonal y su aplicación en el mejoramiento genético de las plantas La base del mejoramiento genético es la optimización de interacciones génicas. 1994). Sofía. hibridación somática y transformación genética. las variantes somaclonales no han avanzado de la etapa de laboratorio o invernáculo. puede provenir de cruzamientos sexuales.. la conservación de germoplasma y la transformación genética. como en la micropropagación. √ Algunos presentan alteraciones no deseables como aneuploidía. una variante somaclonal debería cumplir los siguientes requerimientos: 90 CARDONE. √ Algunos somaclones son inestables (originados por variación epigenética). Para lograr combinaciones génicas óptimas o superiores se requiere de diversidad genética. mutaciones inducidas (físicas o químicas o producidas por ADN-T o por elementos transponibles o retrotrasposones). √ Las tasas de mutación son relativamente altas si se comparan con las tasas de mutaciones espontáneas. A veces. ya que. Otros marcadores moleculares utilizados con éxito para la evaluación de variación somaclonal.fenotípicamente normales. probablemente debido a que el material seleccionado tiene poca importancia práctica. como los AFLP. √ Puede utilizarse para mejorar especies de propagación sexual y vegetativa. tenía un rendimiento a campo equivalente al del cultivar madre. Entre las desventajas cabe mencionar: √ Es relativamente poco costoso generarla: requiere de un laboratorio de rutina y facilidades de campo. en el caso de la variación somaclonal. Generalmente en estos casos existe pérdida de la capacidad morfogénica. √ El conocimiento de las condiciones que generan inestabilidad genética durante el cultivo in vitro permitiría utilizar el fenómeno como estrategia de mejoramiento y permitiría eludirlo en aquellos casos en que se requiera estabilidad genética. pero tenía un cambio en la producción de un metabolito secundario que confería resistencia a la oruga. Viviana . Esta diversidad. permitieron detectar en banana la existencia de diferencias a nivel molecular entre plantas regeneradas de fenotipo normal y aberrantes. el Brazos-R3 (Croughan y col. Algunas de las ventajas que presenta la variación somaclonal pueden resumirse de la siguiente manera: que son difíciles de mejorar a través de técnicas tradicionales. se evaluaron somaclones de Cynodon dactylon en laboratorio. Es decir que mantenía los caracteres agronómicos positivos del cultivar parental. √ Constituye una forma rápida de generar variabilidad genética. Por ejemplo. para detectar un cambio es necesario realizar pruebas específicas. esterilidad. √ La escasa regeneración de plantas en cultivos de largo término. √ El nivel de cambios no deseados es menor que cuando se utilizan mutágenos químicos o físicos. Susana. La variación somaclonal proveería una fuente adicional de variabilidad genética. Un somaclon. utilizable en programas convencionales de mejoramiento. OLMOS.

que se hace con el objetivo de obcarácter mejorado.de los que pudieran surgir in vitro. sobre las cuales recuperar caracteres recombinantes además se vuelve a realizar la selección para el carác. de manera de carácter hasta la generación R4. mediante el análisis de segregación.diante la exposición al alcaloide colchicina. La Figura 1 resume los pasos a seguir para la obtención de un cultivar por variación somaclonal. √ El carácter mejorado debe estar combinado con todos los otros caracteres agronómicos de la variedad que son importantes para el cultivo. Posteriormente viene la tener resistencia a estreses bióticos o Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 91 . derivados del cultivo de anteras. ya que resulta más sencillo mejorar selectivamente una variedad corriente que crear una nueva. Las planter agronómico buscado. selección parentales a fin de determinar. 1). evaluaciones a campo se realizan en forma como trigo. para evaluar los efectos del componente ambiental en la expresión del carácter. que permitirá realizar pruebas agronómicas en diferentes ambientes. En general. arroz y cebada. A partir de aumentar las replicas bajo diferentes condieste momento pueden realizarse cruzamien. Si se utilizan células haploides como fuente de tejido. que luego son analizadas para el carácter deseado. √ La variación debe ser heredable (o bien estable) en las generaciones subsiguientes. La estrategia es utilizar cultivares altamente adaptados para modificar unos pocos caracteres. En plantas autógamas. tratando de man. se considera conjunta a medida que los nuevos materiaaceptable la evaluación de la estabilidad del les van siendo multiplicados.√ Involucrar caracteres agronómicamente útiles. la base genética del in vitro. las variantes obtenidas se denominan variantes gametoclonales. Esta progenies sexuales (en el caso de plantas con metodología tendría la ventaja de permitir este tipo de reproducción).1 Estrategias para la selección de variantes útiles Las estrategias que se han utilizado para obtener variación somaclonal comprenden: etapa de multiplicación de semillas. √ El nivel de expresión del carácter debe superar al de sus progenitores. tos de las plantas R4 selectas con las líneas b) La selección a nivel celular. Para este fin se cultiva la mejor variedad Figura 1: Estrategia para la producción comercial de variantes disponible y se seleccionan. Una modificación para la producción de nuevas variedades está basada en el empleo de variantes gametoclonales (Fig. Los gametoclones a) La obtención de plantas por cultivo de células o tejidos.tas haploides obtenidas son duplicadas metener a la vez todas las características favora. aquellas que expresen el carácter de interés. los mejoradores buscan en los somaclones caracteres de importancia práctica. entre las somaclonales (izquierda) y gametoclonales (derecha) en arroz. plantas regeneradas.se refieren a regenerantes haploides duplitas (generación R0) se emplean para generar cados. 5.ciones ambientales. El programa finaliza con la etapa de multiplicación de semillas para el lanzamiento de la variedad nueva al mercado. al menos en dos años distintos. Las bles de la variedad. Estas plan.

a fin de corroborar la torirían. Mediante esta estrategia pueden cultivarse explantos de distintos genotipos y observarse el comportamiento de los callos frente al agente selectivo. ECHENIQUE.mantenidos en medio de cultivo desprovislerancia al aluminio.to de aluminio.Selección en varios pasos. con un mayor se combinó la selección in vitro con la subsinivel de diferenciación tisular hubiesen sido guiente regeneración de plantas: capaces de regenerar plantas tolerantes. Sin embargo. El primero es un método simple y efecti. Viviana 92 . se subletales del agente selectivo.se ha adicionado aluminio es indicadora de centración del agente selectivo es gradual.minio. La selección efectuada sobre cultivos celulares in vitro puede llevarse a cabo mediante dos modalidades: . OLMOS. en condiciones de laboratorio. que son analizadas para ver si expresan la resistencia a campo y luego son introducidas en el programa de mejoramiento.abióticos y se utiliza generalmente para caracteres tales como resistencia a toxinas fúngicas. A continuación se citan ejemplos donde estrés serían deletéreos a nivel celular.campo. Sofía. concentraciones salinas elevadas y temperaturas extremas. La inducción y la prolife. en suelos con concentraciones elevo. elevados niveles de les. donde la con. Por otro lado.concentraciones de aluminio nima que produce un 100 % ración de callo en el medio de cultivo al que de inhibición). La . En la Figura 2 se representan las etapas observó la aparición de plantas resistentes a de la selección in vitro. Estos estudios indicarían que CARDONE. donde el agente de selección es utilizado en concentraciones dobles o triples Figura 2: Selección in vitro de plantas de arroz tolerantes a altas de la MIC (concentración mí. herbicidas. permitiéndo el crecimiento de las tole. Una vez que se han regenerado las plantas se requieren posteriores evaluaciones a frecuentes. Susana. ya que las células sensibles al agente mo. Una vez seleccionados los genotipos resistentes se procede a la regeneración de las plantas. .la tolerancia del genotipo al metal en cuesmente incrementada en cultivos sucesivos y tión.lerancia evidenciada in vitro por los materiarantes. En el ejemplo dife. Se obtuvieron plantas resistentes utido vegetal a las concentraciones letales y lizando distintas concentraciones de aluminio en el medio de cultivo. eliminando materiales que tal vez.partir de callos de variedades susceptibles rentes líneas de arroz son evaluadas para to.Selección directa en un solo paso.vadas de aluminio.Producción in vitro de plantas de arroz elección de un método u otro dependerá de un monitoreo preliminar que proporciona resistentes a concentraciones tóxicas de aluuna indicación acerca de la reacción del teji.

respectivamente (DNA Plant technology of New Jersey. espacio y dinero y ha sido extensamente utilizada en diferentes cultivos. el cultivo de protoplastos obtenidos de suspensiones celulares cromosómicamente variables produjo gran cantidad de variantes somaclonales del cultivar «Russet Burbano». Sin embargo. que presenta resistencia al downy mildew. A continuación se enumera.Obtención de resistencia a Fusarium oxysporum en clavel. luego de dos ciclos de selección. USA).. El 32% de las plantas regeneradas a partir estos callos evidenció considerable resistencia al patógeno en experimentos de campo. la longitud del tallo y otras características en alfalfa. En el caso de cultivares comerciales de banana Cavendish en Taiwán se obtu- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 93 . número de macollos. Paralelamente.sp. Pueden mencionarse además otros ejemplos de variación somaclonal en cultivos agrícolas de interés. USA). Se encontró también tolerancia a glifosato en somaclones de cebada regenerados en medios conteniendo el herbicida. aquitectura florar (Purdue Univ. donde se obtuvieron somaclones provenientes del cultivar Pindar resistentes a una virosis transmitida por áfidos. en mostaza: rendimiento (ICAR. La búsqueda de variantes a nivel celular permitiría verificar y seleccionar fenotipos adecuados entre millones de células. en tomate y apio: contenido de materia seca y rendimiento. no existe total garantía de que la resistencia manifestada in vitro se expresará a nivel de la planta entera. en batata: calidad de raíces y arquitectura de la canopia (North Carolina Research Service. Las primeras observaciones de variación en caracteres morfológicos fueron realizadas en arroz y otras especies a partir de 1968. dianthi permitió. Japan y Univ. En arroz. También se encontraron alteraciones en la altura de la planta. India). Hungary). 6 Variantes somaclonales liberadas comercialmente La variación somaclonal fue utilizada para la producción de variedades comerciales con caracteres agronómicos superiores en diferentes especies. para cada especie.el cultivo in vitro per se puede originar modificaciones útiles en el genoma de arroz. USA). el carácter agronómico seleccionado y el centro de investigación responsable de dicho logro: en geranio. en maíz: contenido de triptófano (Molecular Genetic. como por ejemplo caña de azúcar . caracteres agronómicos y tolerancia a estreses bióticos y abióticos. causado por Sclerospora sacchari. a la naturaleza quimérica del material. a la complejidad del carácter a ser seleccionado (como por ejemplo la resistencia a salinidad o sequía) o a la falla de las células para expresar el carácter cuando se diferencian. al uso de toxinas no específicas (en el caso de resistencia a enfermedades). la variación somaclonal resultó en el mejoramiento de varios caracteres cuantitativos. La incidencia de variación somaclonal en banana se encuentra extensamente documentada. que presentaron resistencia a Phytophthora infestans. En ambos casos (a y b) la obtención de resistencia sólo será posible si ésta existe en la población original (entonces el cultivo serviría sólo para recuperar los genotipos útiles) o bien si surge por variación somaclonal durante el proceso de cultivo. Fiji). USA). en caña de azúcar: resistencia a estrés y a enfermedades (Sugarcane Research Cen- tre. En papa. . En sorgo se encontró variación somaclonal estable para altura. Hay diferentes explicaciones para este fenómeno. la obtención de callos resistentes que se utilizaron para regenerar plantas. Diez años más tarde se informó en detalle la variación obtenida en la progenie de plantas de arroz cultivadas in vitro y autopolinizadas. a Alternaria solana y a la colonización por áfidos que transmitían el virus Y de la papa (PVY) y el virus del enrrollamiento de la hoja (PLRV). con una inversión menor en tiempo. mayor producción de granos y mayor número de semillas y tolerancia a suelos ácidos y a sequía. El cultivo de segmentos internodales de dos cultivares de clavel susceptibles a Fusarium oxysporum f. en arroz: resistencia a enfermedades (Plantech Research Institute. incluyendo parámetros morfológicos. también por variación somaclonal. como por ejemplo que la resistencia o tolerancia observada se deba a cambios epigenéticos. se seleccionó el cultivar Ono. Agricultural Sciences.

OLMOS. pero malato deshidrogenasas. disturbios reproductivos y resistencia al moteado de hoja en pasto bermuda (Cynodon dactylon). E) En el mismo callo se observaron embriones bipolares y también F) organogénesis. trigo (resistente a Helminthosporium sativum) y alfalfa (resistente a Fusarium oxysporum). En el laboratorio de Genética del Dpto.) Nees a partir del cultivo de inflorescencias A) Formación de callos. En gramíneas forrajeras puede citarse variación cromosómica en Festuca arundinacea y pasto llorón ( Eragrostis curvula). Cubense. sexual L) Isoenzimas de peroxidasas de las descendientes de la planta R0. sp. B) Masa de callo a partir de la cual comienza a evidenciarse morfogénesis. Estos cultivares no habían podido ser mejorados por métodos tradicionales. 94 CARDONE. cambios en la morfología de planta. y supervivencia en somaclones de Lolium y Festuca arundinacea . Susana. ECHENIQUE. variación isoenzimática en Festuca arundinacea. clavel y crisantemo. J) Cromosomas en el ápice radical de la planta donadora de explanto. Figura 3: Obtención de variantes somaclonales de pasto llorón. que permitieron combinar ambas características en un somaclon. M) Idem anterior. Viviana . Sofía. lo cual indica la presencia de sexualidad. H) Las plantas llevadas al campo fueron fértiles (I). C) Estudio histológico de los mismos callos mostrando células embriogénicas y D) embriones somáticos. desarrollo floral. G) Plántula completa en el momento de salir del tubo de ensayo. forma y tamaño de hoja y espiga.vo resistencia a la Raza 4 de Fusarium oxysporum f. Otros ejemplos donde se han obtenido cultivares por variación somaclonal son tabaco (tolerante a aluminio y resistente a herbicida). Se han detectado también caracteres interesantes modificados por esta técnica para su explotación comercial en ornamentales. No obstante. Eragrostis curvula (Schrad. para lograr una variedad con rendimiento equiparable a las variedades no resistentes se necesitaron varios ciclos de micropropagación adicionales. 2n=4x=40 apomíctica. vigor. albinismo en Lolium perenne y Festuca pratense. K) Cromosomas de una regenerante primaria (R0) obtenida a partir de la anterior 2n=2x=20. mostrando variación. como por ejemplo variación en el color de las flores en gerbera.

Se trabajó con varios cultivares de esta gramínea apomíctica y luego de la evaluación de gran número de plantas se seleccionaron los siguientes materiales: . detectándose sólo una translocación no descripta previamente y un patrón diferente de gliadinas como consecuencia del cultivo in vitro. 1996. Eds.. 44 (3-4) : 217-224. 29: 125-130. 1991. LINACERO R. 1991. dureza. tipo de aristas. color de las glumas.a novel source of variability from cells cultures from plant improvement. P. L. Angew. Crop Science. 1983.1997. F. Somaclonal variation in the progeny of transgenic barley. 1991. CROUGHAN. MARTÍNEZ. QUISENBERRY. 43: 179–188. TORIBIO. En plantas regeneradas de triticale y trigo se informaron variaciones a nivel del ADN mitocondrial y de proteínas de la semilla. M. 1994. color del grano. y está siendo utilizado en estudios de apomixis. 71: 125-130.. CIAT. DUNCAN.3). entre otros caracteres morfológicos. peso de 100 granos. EASTMAN.. I. 115: 89-93. KAEPPLER S. WEBSTER. que están en proceso de registro. GALLEGO. KAEPPLER. y Mroginsky L. se han informado cambios estables en longitud de la espiga. FAVRET A. GEIER.. Bot. La variación in vitro en trigo y en otros cereales como cebada es altamente dependiente del genotipo.. VASQUEZ A.de Agronomía de la UNS se llevó a cabo un proyecto para obtener somaclones de pasto llorón (Fig. Chromosome. DOYLE. SUAREZ Y. CROKE. mayor contenido de proteína en grano sin reducción del rendimiento. 1993 In Vitro Cell Dev. Roca W. RÍOS R. Single gene mutations in tomato plants regenerated from tissue culture. altura de la planta. Registration of BrazosR3 bermudagrass germplasm. C. SHARP. 2000. and RAPD Analysis for the Assessment of Somaclonal Variation and Induced Mutation in Tissue Culture-Derived Pelargonium Plants. El único antecedente en nuestro país de búsqueda de variación somaclonal en trigo es un estudio acerca de la estabilidad in vitro de tres cultivares de trigo con elevados niveles de inestabilidad cariotípica espontánea. RHEE. Plant Cell Reports 10: 425-430. D.. 2000. Las mutaciones observadas han sido de dominantes a recesivas y viceversa. . Hot spots of DNA instability revealed through the study of Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 95 . Biol. color del grano y de las glumas. sensibilidad al ácido abcísico. DÍAZ PALEO A. Evaluation of Image Analysis. and Y. Somaclonal variation in three Argentinean varieties of Triticum aestivum with different karyotypic instability. Dicho material está en proceso de registración. eds. 197-214. S. 96: 421-425. T. P. Theor... J. aristas. 1997. KAEPPLER H.. Flow Cytometry. A. P. 34: 542.Una planta diploide sexual. JR. R. 1996). Harding & Mol. LEMAUX. Int. fertilidad. S. M. HALBERT. J. Dichas plantas dieron origen a dos nuevos cultivares de Eragrostis curvula .. F. KRIKORIAN. 1991.. Appl. In Genetics and Breeding of Ornamental Species. LARKIN. CELESTINO. Se evaluaron caracteres tales como estructura cromosómica. Epigenetic aspects of somaclonal variation in plants. R. densidad y biomasa de la espiga. S.C.. Theor. COLYER AND T. A.T. Advances in Agronomy 58: 201-240. Genet. Caryologia. tiempo de espigazón. niveles de clorofila y morfología de la planta. Tissue Culture-Induced variation and crop improvement. P. somatic embryos. 1981. Plant Sci. obtenida a partir de un cultivar tetraploide apomíctico. P.. 221: 949-951. como las gliadinas. CASSELS. FREITAS ALVES E. EVANS. 7 Lecturas recomendadas BREGITZER. 79-106.. W. Appl. SOLARI R. Genet. D’AMATO. ROBERTS..M. BROWN. muy promisorios por sus características forrajeras. sugiriendo que esta técnica no es efectiva para inducir variación que pueda ser utilizada en programas de mejoramiento (Franzone y col. 158 (5): 563-567. Plant Molecular Biology. PITEL. Science. 1998. & PHILLIPS. EICHHORN.Dos plantas hexaploides apomícticas a partir de un cultivar tetraploide apomíctico. B. S. Nuclear changes in cultured plant cells. 1997. número de macollos. patrón de gliadinas. número de granos por espiga. SCOWCROFT. D. A nivel fenotípico. 60. M.. Testing somaclonal variation using RAPDs in Quercus suber L. FRANZONE P. Estabilidad genotípica en células. tejidos y plantas derivados del cultivo in vitro. F. variability in callus produced plants. Plant Breed. Somaclonal variation . W. J. Evaluation of somaclonal variation during somatic embryogenesis of interior spruce ( Picea glauca engelmannii complex) using culture morphology and isozyme analysis. En Cultivos de tejidos en la Agricultura..

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el sistema de protoplastos no sólo se emplea para la obtención de híbridos somáticos. Asimismo. Es relevante destacar que. La hibridación somática en plantas comenzó a desarrollarse a principios de 1970 con la aplicación de métodos químicos de fusión. cuando se quiere transferir resistencia a enfermedades o tolerancia a estreses. La hibridación asimétrica y cibridización sirve como puente para la transferencia de genes individuales La técnica de fusión de protoplastos se desarrolló en la década de 1950-60. Friedrich. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 97 . Sin embargo. Se utiliza. Para ello. de genes provenientes de plantas silvestres emparentadas. Por ello. es decir. recién en la década de 1980-90 tuvo un mayor auge debido a la aparición de métodos químicos y eléctricos más apropiados para la fusión de células vegetales. como por ejemplo los cereales. principalmente por permitir la introgresión limitada de genes de especies silvestres en los cultivos. para luego proceder a la fusión de protoplastos de distintos tipos parentales (distintos genotipos) y posterior regeneración de plantas a partir de los productos de fusión. De esta manera la hibridación entre especies diferentes permitió aumentar de modo significativo la productividad de diversos cultivos. a partir de la observación de que ciertos virus pueden inducir la fusión de células animales. es de gran utilidad en estudios de biología celular así como para otras aplicaciones biotecnológicas. y se extendió en los ´80 con el empleo de métodos de electrofusión. También permite la obtención de citoplasmas híbridos (cíbridos). es decir. Tal limitación no existe en la fusión de protoplastos. como una elevada esterilidad o imposibilidad de regenerar plantas en algunos casos. demostró ser útil en la mejora genética de plantas. 2 Hibridación somática vs. Pablo 1 Introducción La mejora genética de las plantas cultivadas en procura de incrementar la producción viene siendo practicada por el ser humano desde hace miles de años. Esta técnica. existen diferencias importantes entre la fusión de protoplastos somáticos y el cruzamiento sexual: • La hibridación sexual entre organismos de diferentes especies está limitada por barreras de incompatibilidad. Pablo. en los cultivos. a los fines del mejoramiento genético. la producción de anticuerpos monoclonales. Ello no significa que pueda regenerarse un organismo viable y fértil a partir de cualquier tipo de combinación entre células. la obtención de plantas híbridas somáticas requiere del previo aislamiento de protoplastos mediante la digestión enzimática de las paredes celulares. por ejemplo. La pared presente en estas células representa una barrera que normalmente impide la fusión entre ellas. células animales y vegetales). la fusión de protoplastos tiene un uso mucho más amplio que el estrictamente de interés agronómico. la obtención de plantas híbridas a partir de la fusión de células o de protoplastos derivados de células somáticas. En algunos casos estas barreras son precigóticas. permitiendo la fusión de células de orígenes muy diversos. seguramente desde el inicio mismo de la agricultura. incluso de organismos muy distanciados filogenéticamente (por ejemplo. el hombre ha empleado los cruzamientos con el fin de incrementar la variabilidad genética. Sin embargo. la búsqueda de híbridos de interés agronómico ha demostrado que el principal aporte de esta metodología es la introgresión. si bien presenta algunas limitaciones. dado que este proceso es noespecífico. por ejemplo. hibridación sexual Con relación a su potencialidad para producir híbridos. sino que también constituye un material apropiado para la incorporación de ADN exógeno.III. no permiten que se produzca la fecundación. en tal sentido. De hecho. en otros cultivos esta estrategia no resultó exitosa a causa de esterilidad sexual o incompatibilidad genética. surgió hace unos 30 años como una herramienta muy promisoria para sortear problemas de incompatibilidad precigótica.-Capítulo 2 Hibridación somática Polci. La hibridación somática. paso inicial en el proceso de mejoramiento.

de protoplastos. Sin embargo. tolerancia a ciertos tipos de estrés. Híbrido simétrico . Comparando ambas metodologías. • ·Otra diferencia está dada por la herencia de los genes extranucleares. A partir de una célula híbrida. en la actualidad. según cual haya sido el destino del material genético nuclear durante las divisiones celulares que siguen a la fusión. transformación genética bridación somática pero no por transformación genética. Estos podrían ser transferidos en conjunto vía transgénesis. que contiene dos genomas completos. puede ser de tres tipos: 1. se puede regenerar una planta que. por lo que su Fig. La preponderancia que han tomado las técnicas de transformación genética ha relegado a la hibridación somática a un papel de menor significación como herramienta biotecnológica aplicada al mejoramiento de los cultivos. 2. FRIEDRICH. Híbrido asimétrico . y si proceden del mismo tipo parental se originan «homocariones». 1. plastídicos y mitocondriales. en la hibridación somática se combinan organelas de ambos progenitores. que tiene el genoma nuclear completo de cada tipo parental. resistencia horizontal a enfermedades y otros son poligénicos. 3 Hibridación somática vs.• ·La hibridación sexual ocurre normalmente por fusión de células haploides (n + n). 98 POLCI. Pablo .1. • Caracteres tales como productividad. que tiene el genoma nuclear completo de uno de los parentales y sólo una parte del genoma nuclear del otro parental. Destino del material genético nuclear y extranuclear en la fusión transferencia es factible por hi. Mientras que en la reproducción sexual el genoma citoplasmático es aportado casi exclusivamente por la gameta femenina. mientras que en la hibridación somática el número de genes introducidos es mayor dado que se transfieren cromosomas de una especie a otra o se combinan dos genomas completos. 4 Tipos de híbridos somáticos Cuando se realiza la fusión de protoplastos se obtienen células con el aporte de cromosomas de dos o más núcleos (Fig. podemos destacar las siguientes diferencias: • En la transformación genética se incorporan uno o pocos genes exógenos en una planta. esto es. con las nuevas herramientas aportadas por la genómica se está avanzando en el conocimiento de todos los genes involucrados en diversas vías metabólicas. Cuando en el heterocarión ocurre la fusión de los núcleos (cariogamia). produciendo nuevas combinaciones de genes citoplasmáticos.) Si los protoplastos involucrados en la fusión proceden de distintos tipos parentales se originan «heterocariones». la transformación genética requiere la previa identificación y aislamiento de los genes que determinan la expresión del carácter de interés. se forma una «célula híbrida». Pablo. Por el contrario. mientras que en la hibridación somática se fusionan dos protoplastos con sus genomas completos (2n + 2n) o con uno de ellos conteniendo sólo parte de su genoma. • La hibridación somática permite transferir caracteres sin necesidad de contar con un conocimiento detallado de los mecanismos moleculares que determinan la expresión de dichos caracteres.

Es frecuente que ocurran recombinaciones de los genomas mitocondriales de ambos tipos parentales. las cuales son tratadas a continuación. Célula híbrida asimétrica. teniendo en cuenta el material de partida empleado para la fusión. por complementación metabólica. 2.3. Los protoplastos enucleados o citoplastos pueden obtenerse centrifugando los mismos a alta velocidad en un gradiente de densidad isosmótico. En este caso sólo pueden sobrevivir. por fusión de un protoplasto conteniendo su genoma completo con otro conteniendo su núcleo inviable o sólo una parte de su genoma nuclear. pueden producirse tres tipos de células híbridas: 1. Dado que las organelas segregan independientemente unas de otras. Es usual que en el proceso de regeneración de plantas híbridas ocurra una eliminación gradual de cromosomas de uno de los tipos parentales. pero ello es poco común entre plástidos. probablemente debido a que cada célula posee varias copias de ellas. alterando el genoma de uno de los protoplastos parentales. que contiene el genoma nuclear completo de uno de los parentales. Así. los heterocariones conteniendo el núcleo del receptor y el citoplasma del donante enucleado. a partir de una población de células híbridas similares. 5 Aislamiento de protoplastos El desarrollo de métodos enzimáticos de aislamiento a partir de 1960 brindó la posibilidad de obtener grandes cantidades de protoplastos vegetales. Por lo tanto. lo que provoca la fragmentación de los cromosomas. plastídicos y mitocondriales. la regla es que al cabo de pocas divisiones mitóticas las células formadas contengan plástidos provenientes de uno u otro tipo parental. pueden ser tratados previamente con inhibidores metabólicos. Los protoplastos donantes son irradiados con rayos X o Gamma. pero algunos de ellos pueden integrarse con el genoma del receptor produciendo un híbrido asimétrico. La segregación de los plástidos y mitocondrias de los dos tipos parentales también constituye una fuente importante de variabilidad en la regeneración de plantas híbridas. conteniendo uno o pocos cromosomas. Asimismo. Ello tuvo gran influen- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 99 . Los protoplastos que poseen su genoma nuclear completo (receptores). Cíbridos. La práctica de la hibridación somática en plantas demostró que. Células híbridas simétricas. por fusión de dos protoplastos con sus genomas completos. La Figura 2 muestra un esquema de las etapas involucradas en la hibridación somática. También puede producirse una célula híbrida asimétrica fusionando protoplastos receptores con microprotoplastos. Por esta razón se han desarrollado métodos para inducir la hibridación asimétrica o cibridación. El destino que sufre el material genético nuclear y extranuclear durante las divisiones celulares determina que. En este caso se dice que se transfiere parte del genoma de un protoplasto donante a uno receptor. los híbridos asimétricos y cíbridos son más valiosos que los simétricos producidos entre plantas alejadas filogenéticamente. reteniendo sólo material genético extranuclear del otro parental. una célula híbrida origina una colonia de células que exhiben diferentes combinaciones de genes citoplasmáticos. pero con una mayor frecuencia de células que poseen mitocondrias recombinantes y plástidos de uno u otro tipo parental. Los microprotoplastos se obtienen induciendo la formación de micronúcleos por tratamientos con agentes antimicrotúbulos. en general. se puedan regenerar plantas con diferentes combinaciones de genes nucleares. El tratamiento de irradiación parece no tener efectos deletéreos o mutagénicos sobre los genomas de organelas. Una vez producida la fusión. dichos fragmentos tienden a eliminarse en las sucesivas mitosis. Cíbrido. el método de irradiación con rayos X o Gamma puede generar cíbridos en casos en que se produzca la eliminación total de los fragmentos cromosómicos. 3. produciéndose de este modo híbridos asimétricos o cíbridos. por fusión de un protoplasto conteniendo su genoma nuclear completo con un protoplasto enucleado o con su núcleo inviable.

Tratamiento enzimático. siempre que el mismo no esté suelen agregar inhibidores de proteasas y lignificado. Generalmente se emplean hojas y células en cultivo líquido o sólido.den dañar los protoplastos. Cuando se emplean hojas. Algunas veces se extrae la epidermis inferior antes de colocar la hoja en la solución Figura 2: Materiales y procesos involucrados en la hibridación enzimática.3 a 0. Se obtienen mejores resultados con hojas jóvenes totalmente expandidas que con hojas viejas. Se ha podido aislar protoplastos antioxidantes tales como el Polivinilpirrolide una gran cantidad de especies vegetales dona-10.activos. osmótico a la solución enzimática es esencial permitiendo el uso de este sistema para la para evitar la ruptura de los protoplastos a propagación clonal y la modificación genética medida que son liberados. Cuando se emplean cia en diferentes áreas de la biología y la células en suspensión. las hojas suelen cortarse en trozos pequeños. Para facilitar el contacto de las enzimas con las células.establecerse en forma empírica las condiciones óptimas para un sistema determinado. por lo que se jido vegetal. Pablo .7 a 6. Influye en el resultado del aislamiento así como en el proceso de regeneración posterior. y la temperatura enel agregado de hemicelulasas. (Fig. dada la utilidad de resultados si se encuentran en la fase los protoplastos como sistema experimental exponencial de crecimiento. Las celulasas y tre 25 y 30º C. debiendo concentraciones que varían entre 0. El agregado de un estabilizador y regenerar plantas a partir de los mismos. Selección del material de partida. El uso de enzimas disponibles comer. Las etapas del aislamiento y los factores a considerar en cada una de ellas se describen a continuación: 1. la edad y las condiciones de cultivo de la planta afectan el rendimiento. que liberan enzimas cialmente posibilitó el aislamiento de hidrolíticas y compuestos oxidantes que pueprotoplastos de prácticamente cualquier te. para estudios fisiológicos.de algunas células. en nida dependen de varios factores. FRIEDRICH. bles si la solución es ligeramente hipertónica. su Para ello se utilizan solutos osmóticamente viabilidad y la pureza de la suspensión obte. siendo más estade plantas. en enzimático y la relación volumen de solución/ tanto que las pectinasas digieren la matriz cantidad de tejido influyen en el rendimiende pectina que mantiene adheridas a las cé.8 100 POLCI.to. siendo necesario en algunos casos en un rango de 4. dicotiledoneas. muy finos en el caso de las monocotiledóneas. bioquímicos y 2. Durante el aislamiento se produce la lisis lulas. comúnmente manitol o sorbitol. así como para su aplicación al ción de la enzima y el tiempo de incubación mejoramiento genético. requeridos para lograr la liberación de los Los protocolos de aislamiento emplean protoplastos dependen del producto comerenzimas fúngicas con actividad celulasa y cial utilizado. Pablo. El número de protoplastos aislados. El pH generalmente se ajusta pectinasa. se obtienen mejores biotecnología de plantas.). La duración del tratamiento hemicelulasas degradan la pared celular. 3A. como sucede con las somática. La concentramoleculares.

Para ello. en la práctica. En la fusión de los protoplastos ocurren. se procede a la remoción de las enzimas y de los restos de tejido y de células rotas. una combinación del método original del PEG y el de CA++ y pH elevados. el fusógeno que alcanzó mayor aceptación es el polietilenglicol (PEG) debido a que. 3C). Centrifugación y obtención de protoplastos libres de restos de tejidos vegetales. Posteriormente. se lograron mejores resultados fusionando protoplastos de células del mesófilo de Nicotiana en un medio conteniendo alta concentración de Ca++ (50 mM) y pH elevado (10. empleando nitrato de sodio como agente fusógeno. Para el recuento de protoplastos se emplea un hemocitómetro. Limpieza y purificación de los protoplastos. Digestión enzimática de las paredes celulares. 3B). produce mayor proporción de heterocariones y. C. durante 15 a 30 minutos. Además. el tratamiento con PEG genera una mayor proporción de heterocariones binucleados. M según el tipo de protoplasto. A. La remoción del PEG se lleva a cabo en forma gradual. que incrementan la estabilidad de la membrana (Fig. se efectúan 3 ó 4 lavados centrifugando la suspensión por 5 minutos a baja velocidad (50-100 g). El procedimiento de fusión con PEG más ampliamente utilizada es. La densidad de protoplastos adecuada para la formación de heterocariones es de 4 a 5 % (volumen de protoplastos/volumen de suspensión). disminuyendo progresivamente la concentración de PEG con cada lavado. La solución enzimática es por lo general suplementada con sales. con menor ocurrencia de fusiones entre más de dos protoplastos. diacetato de fluoresceína) o excluidos (azul de Vean) por las células viables. La frecuencia de formación de heterocariones en tales casos era muy baja. en comparación con los otros agentes químicos. La suspensión se pasa por un filtro de nylon o metálico con un diámetro de poro (30-100 mm) que permita el paso de los protoplastos y retenga los restos de tejido y grupos de células no digeridas. resulta menos tóxico. siendo esto fundamental para asegurar una elevada frecuencia de heterocariones. los protoplastos sedimentados se resuspenden en una solución salina que contenga un estabilizador osmótico. Los protoplastos de dos tipos parentales se mezclan en una solución conteniendo 15 a 45 % de PEG (peso molecular de 1500 a 6000). Sin embargo.5). Posteriormente. en forma sucesiva.1 Métodos químicos Los primeros casos informados de fusión controlada y reproducible de protoplastos vegetales y de regeneración de híbridos somáticos se produjeron a principios de la década de 1970.6 Métodos de fusión 6. (2) se producen alteraciones en sitios localizados Figura 3: Aislamiento de protoplastos de tabaco. B. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 101 . La viabilidad se determina generalmente empleando colorantes que son incorporados (rojo neutro. Eliminación de las nervaduras centrales y seccionado de la hoja en trozos pequeños. también pueden evaluarse la actividad fotosintética (emisión de fluorescencia) y la respiratoria (consumo de O2). Finalmente. Para lograr una mayor pureza de la suspensión es conveniente centrifugarla en un gradiente de densidad (Fig. la suspensión se somete a sucesivos lavados con una solución alcalina (pH 9-11) de CaCl2 10-50 mM. suele ajustarse a 24º C. para muchos tipos celulares. 3. Una vez lograda la liberación de los protoplastos. La temperatura de incubación óptima para inducir la fusión es de 35 a 37º C pero. en lo esencial. De este modo se eliminan las enzimas y restos celulares. los siguientes eventos: (1) las membranas plasmáticas de protoplastos adyacentes entran en íntimo contacto. comúnmente CaCl2.

y (3) las interconexiones citoplasmáticas se expanden. experimentalmente controlable. formándose puentes citoplasmáticos entre protoplastos vecinos. La polaridad de la célula incrementa el campo local no uniforme. el tratamiento con Ca++ y pH elevados neutraliza las cargas superficiales. favoreciendo el contacto entre protoplastos.de las mismas. Pablo. (3) del volumen del protoplasto y (4) de la diferencia entre las constantes dieléctricas de la célula y su ambiente (así como la correspondiente diferencia entre sus conductividades). con continuidad citoplasmática entre las dos células. dando origen a una fuerza neta que la empuja a una región de mayor intensidad de campo (hacia uno de los electrodos). (2) del gradiente del campo. El PEG actuaría como un puente molecular causando alteraciones en las membranas plasmáticas que promueven la adhesión y formación de puentes citoplasmáticos entre protoplastos vecinos. por lo tanto. 3B y C). suficiente para causar la ruptura reversible de la membrana. un potencial de membrana. las membranas no se vuelven a sellar separadamente en la zona de contacto. colocados en un medio de baja conductividad entre dos electrodos. Ocurre entonces la fusión de las dos células cuyas membranas están en estrecho contacto (1 a 2 nanómetros de distancia). El segundo paso consiste en la aplicación de uno o más pulsos cortos de corriente directa de 15 a 100 µseg. 4A). Este proceso se denomina dielectroforesis. Los protoplastos. los protoplastos se aproximan unos a otros y forman cadenas paralelas a las líneas de campo aplicadas (Fig. Las cargas se separan dentro de las células formando un dipolo y generando. Este fenómeno de ruptura reversible también es aplicado en la técnica de electroporación. rompen áreas mayores de membrana y pueden producir la destrucción total de la célula La frecuencia de fusión depende de varios factores: • ·El genotipo. La fuerza ejercida sobre la célula bajo condiciones dielectroforéticas depende (1) de la intensidad de campo eléctrico. así como también largos períodos de exposición. Fuerzas de campo supra críticas. Los puentes formados de esta manera. Diferentes poblaciones de protoplastos exhiben frecuen- 102 POLCI. El proceso de resellado es principalmente atribuido a las moléculas lipídicas debido a que su coeficiente de difusión es dos órdenes de magnitud mayor que el de las proteínas. Este efecto se denominó ruptura eléctrica reversible para enfatizar la habilidad de la membrana para reparar tales perturbaciones. La ruptura es reversible si el número y el tamaño de los poros son pequeños en relación con el total de la superficie de la membrana. conducen a un radio de curvatura muy pequeño y a altas tensiones superficiales. En otras palabras. La fuerza del campo a ambos lados de una célula es diferente (campo no uniforme). 6. ya que el proceso es favorecido energéticamente (Fig.5 a 1. provocando la fusión.2 Electrofusión En 1973 se descubrió que pulsos de elevado potencial eléctrico en un rango muy estrecho de intensidad y duración conducen a un incremento reversible. Para que esto ocurra es necesario que el voltaje crítico de membrana sea alcanzado en cuestión de nanosegundos a microsegundos. • ·La procedencia de los protoplastos dentro del mismo genotipo. se ponen en contacto al aplicar corriente alterna de alta frecuencia (0. 2. El método de electrofusión en esencia involucra dos pasos: 1.5 MHz) en un campo eléctrico no uniforme. Pablo . El voltaje mínimo para un protoplasto (umbral) con el cual se produce la formación de poros disminuye a mayor duración del pulso eléctrico. con una intensidad de campo elevada (1 a 3 Kv/cm). atra- yendo a las células vecinas. La carga negativa neta de la superficie de las membranas produce la repulsión entre ellas. de la permeabilidad de la membrana celular.. Como consecuencia se forma una nueva célula esférica. Luego. con la que se pueden introducir en las células construcciones de ADN y otras moléculas de alto peso molecular. produciéndose finalmente la fusión. Durante este proceso pueden formarse puentes lipídicos entre las membranas de las dos células. FRIEDRICH.

• ·El tamaño de los protoplastos. Valores bajos de presión osmótica en el medio de suspensión de los protoplastos pueden favorecer el proceso de fusión. La inclusión de iones en el medio puede incrementar el porcentaje de fusión. Pulsos de corriente más largos y de mayor voltaje producen un aumento de los eventos de fusión múltiple. fuerza del campo eléctrico y tiempo durante el cual es aplicado. La duración del pulso eléctrico es de 15 a 50 µseg. A. influyendo en consecuencia en el proceso de fusión. El tiempo requerido para la fusión que sigue a la aplicación de un pulso varía desde pocos segundos a varios minutos. C. En general. que además depende de factores como la densidad de protoplastos. y éstos a su vez esta- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 103 . Cadenas más largas darán mayor frecuencia de fusión que las cadenas cortas. hay mucho flujo de corriente en la solución y se producen calentamientos y turbulencias que impiden la formación de cadenas. los protoplastos más fusionables estarán mayoritariamente en contacto con los menos fusionables. Las condiciones experimentales deben ajustarse de modo de obtener la mayor frecuencia de fusión posible (número de protoplastos fusionados sobre el total de protoplastos). Esto probablemente esté relacionado a la diferencia de fluidez de la membrana en los distintos tipos celulares y a las propiedades del citoesqueleto dentro de la célula. El tipo de protoplasto con mayor tendencia a fusionar se mezcla con el de menor tendencia a fusionar en una relación de 1:5 a 1:10. aun cuando provengan del mismo genotipo. la duración y la fuerza de los pulsos de corriente directa. Los más grandes se fusionan más fácilmente. pulsos muy largos y voltajes muy elevados pueden matar a los protoplastos. Un factor de limitación en la agregación dielectroforética de las células es la conductividad eléctrica del medio. • ·La composición y propiedades de la membrana plasmática pueden ser afectadas por la actividad metabólica de los protoplastos y por el tipo de enzimas empleadas en el proceso de aislamiento. intentando maximizar la proporción de heterocariones (productos de la fusión de protoplastos diferentes) formados por sobre la de homocariones (productos de la fusión de protoplastos del mismo tipo parental).Figura 4: Electrofusión de protoplastos de mesófilo de pasto llorón. La proporción de cada uno de los dos tipos de protoplastos en la suspensión puede fijarse a fin de incrementar la formación de heterocariones por sobre la de homocariones. el medio de fusión usualmente consiste en manitol (cuya concentración se ajusta según los protoplastos empleados) y CaCl2 1 mM. si ésta es muy alta. • ·El número. obviamente. • ·La longitud de las cadenas de protoplastos formadas durante la dielectroforesis. Las altas tensiones superficiales generadas en ese sector conducen a la formación de una nueva célula esférica. Las diferencias en intensidad de campo eléctrico hacen que las células se muevan hacia la zona cercana al electrodo. y minimizando la ocurrencia de eventos de fusión múltiple (fusión de más de dos protoplastos). existe la limitación de que la dielectroforesis debe realizarse en un medio de baja conductividad. • ·La densidad de los protoplastos. • ·El medio de fusión. Dielectroforesis de células. los protoplastos obtenidos a partir de hojas se fusionan más fácilmente que los provenientes de raíz o de cultivos celulares. Los puentes con continuidad citoplasmática poseen un radio de curvatura muy pequeño. Aplicación de pulsos cortos de corriente directa. Así. durante la formación de cadenas. B. Sin embargo. que inducen la formación de poros en la membrana. cias de fusión diferentes. generando puentes entre las membranas de las células adyacentes. • ·El potencial osmótico del medio de fu- sión.

aunque demanda mayor manipulación. 5. Esta técnica se basa en los mismos principios que la electrofusión a gran escala pero está diseñada para inducir la fusión en pares seleccionados de protoplastos. homocariones y heterocariones. Ventajas de la electrofusión: 1. 7 Selección de heterocariones La fusión de protoplastos a gran escala produce una mezcla de tipos parentales y productos de fusión. recubiertas por aceite mineral. 4. la fusión de protoplastos a gran escala (macrofusión). La viabilidad de las células fusionadas es muy buena. Pablo . La selección de células híbridas puede llevarse a cabo empleando los siguientes métodos: • Selección sobre la base de caracteres morfofisiológicos. Sin embargo.100 %) y cariogamia. 6. Este sistema emplea microelectrodos de platino fijados a un soporte montado debajo del condensador de un microscopio invertido. Cualquiera que sea el caso. Cuando se produce un cruzamiento entre un parental con capacidad para regene- 104 POLCI. En cada evento de fusión. Seleccionando las condiciones –duración y voltaje de los pulsos– que promuevan sólo la fusión de los protoplastos más fusionables. Una técnica alternativa que ofrece la ventaja de no requerir una posterior selección de heterocariones. El proceso de fusión es sincrónico. la condición de híbrido debe verificarse en la planta regenerada mediante diferentes análisis que se explican más adelante. Si no se efectúa una previa selección de las células híbridas. la regeneración de plantas y la posterior identificación de los híbridos demandará mucho trabajo y recursos. 2. Por el contrario. en algunos cruzamientos. ya que el pulso provoca la fusión de todas las células expuestas al campo. en el caso de la microfusión. Para obtener productos de multifusión deben emplearse elevadas densidades. El proceso entero puede ser seguido bajo microscopio por lo que los híbridos pueden ser fácilmente identificados y transferidos a un medio nutritivo o selectivo. Esto conlleva la necesidad de emplear métodos de selección de los híbridos somáticos obtenidos. que: -requiere condiciones no fisiológicas -las frecuencias de formación de heterocariones binucleados son bajas y variables -resultan tóxicos para diversos tipos celulares. que producen una baja proporción (<10%) de células híbridas. Este método ofrece ventajas sobre otros como el del PEG. FRIEDRICH. Se obtienen elevadas plasmogamia (80 . los microelectrodos se posicionan a cada lado de una microgota conteniendo un par de protoplastos. los métodos eléctricos no requieren necesariamente del posterior proceso de selección dado que normalmente producen frecuencias de fusión muy elevadas o porque. Por ejemplo. Puede preseleccionarse el número de células a ser fusionadas. En ciertos casos es posible diferenciar los callos híbridos de los parentales. los heterocariones resultantes son transferidos a gotas con medio de cultivo para la posterior regeneración de plantas híbridas. los callos híbridos poseen un color intermedio al de los parentales. pudiendo alcanzarse frecuencias de fusión cercanas al 50 %. y se aplican los pulsos eléctricos. Después de la fusión. Dicha selección es particularmente necesaria cuando se emplean métodos químicos. no se generan mezclas heterogéneas de protoplastos debido a que se fusionan dos células por vez.el fusógeno debe ser removido antes del cultivo de los protoplastos y tiene bajo rendimiento de células fusionadas. Las formaciones de dos células son favorecidas por bajas densidades en la acanaladura entre los electrodos. es la microfusión o electrofusión de pares de protoplastos. tanto por métodos químicos como eléctricos. aun cuando las condiciones de fusión puedan fijarse de modo de incrementar la frecuencia de fusión y la proporción de heterocariones formados. 3. La tasa de fusión es de aproximadamente 30 pares de protoplastos fusionados y transferidos a medio de cultivo por hora. resultará en una mezcla de protoplastos parentales.rán ligados entre ellos mismos. Pablo. los productos serán mayormente heterocariones. Los pares de protoplastos seleccionados se colocan en microgotas de medio de fusión sobre un soporte.

AAbb (albina) x aaBB (albina) AAaaBBbb (verde) Asimismo. Los protoplastos parentales se marcan con diferentes colorantes fluorescentes.) no sobrevivirán. suplementado con reguladores del crecimiento. como el rojo neutro y azul brillante de cresilo. pudiendo separar los protoplastos marcados con un solo fluorocromo (parentales) de aquéllos doblemente marcados (híbridos).2% de agar. • Selección por complementación. Suelen ser cultivados en cajas de Petri con medio agarificado. b) Citometría de flujo. atrapados en el medio semisólido y. que no permite el crecimiento de los parentales. Si dichos caracteres son recesivos. a partir de dos líneas mutantes no alélicas de tabaco deficientes en nitrato reductasa. al fusionar protoplastos del mesófilo (verdes) con protoplastos de suspensiones celulares (incoloros). efectuándose la selección de las células híbridas en un medio conteniendo ambas drogas a concentraciones que resultan letales para las líneas parentales. Los protoplastos se cultivan en cajas de Petri en medio líquido o semisólido. rodamina (rojo) y fluoresceína (verde amarillento). los híbridos somáticos normalmente regeneran plantas. • Selección por aislamiento de los ↓ heterocariones o células híbridas. dietilpirocarbamato. Los híbridos producidos por el cruzamiento de estos parentales con cualquier genotipo silvestre pueden ser seleccionados en medio mínimo suplementado con el antibiótico o herbicida. se obtuvieron colonias capaces de crecer en un medio conteniendo nitrato como única fuente de nitrógeno. rico en compuestos orgánicos e inorgánicos. Por ejemplo. ya que este carácter se comporta como dominante. La complementación puede lograrse por las siguientes vías: a) Empleando dos parentales con defectos metabólicos o genéticos no alélicos. 5AyB). la fusión de dos variedades albinas no alélicas (nucleares) de tabaco. y solamente podrán regenerarse los híbridos. La selección se produce porque el medio de cultivo resulta restrictivo para el crecimiento de los parentales. Es el sistema más confiable y de más amplio espectro de aplicación. permitiendo reconocer las células híbridas. deficiencia a nitrato reductasa) y un carácter dominante (por ejemplo. se ven las colonias formadas (Fig. 5C). b) Fusionando parentales que expresan caracteres dominantes tales como resistencia a antibióticos o herbicidas. Para ello se emplea una línea resistente a cierta droga. Los protoplastos quedan. Sin em- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 105 . fluorescenceactivated cell sorter). luego de varios días. que es preciso y muy rápido. El aislamiento puede realizarse de dos maneras: a) Selección mecánica directa utilizando técnicas de micromanipulación con micropipeta.rar planta con uno recalcitrante. pero no para el de los híbridos. etc. El equipo posee fotocélulas que detectan fluorescencia. y en presencia de un estabilizador osmótico. donde se mezcla la solución de protoplastos con un medio de cultivo líquido a 40º°C conteniendo 1. particularmente las gramíneas. perferen-temente agarosa (Fig. permitió obtener plantas verdes. Por ejemplo. c) Una línea que presente una mutación autotrófica (por ejemplo: albinismo. la fusión produce una célula híbrida en la que los defectos se anulan por complementación. 8 Cultivo de protoplastos La habilidad para regenerar plantas a partir de células y tejidos en cultivo es un componente esencial en la biotecnología para la manipulación genética y el mejoramiento vegetal. pero ha sido bastante difícil para las monocotiledóneas. por ejemplo. Esto resulta relativamente fácil para las dicotiledóneas herbáceas. El aislamiento de los heterocariones marcados con ambos colorantes se realiza utilizando un citómetro de flujo (FACS. así. Si los protoplastos del genotipo respondedor son tratados con inhibidores metabólicos irreversibles (iodoacetamida. resistencia a antibióticos o herbicidas) es de gran utilidad para la selección. y otra resistente a una segunda droga. Puede realizarse cuando los protoplastos parentales presentan rasgos que los distinguen al microscopio. También pueden colorearse las células de ambos progenitores con diferentes colorantes vitales.

extracto de levadura. (c) la densidad celular puede ser modificada agregando medio de cultivo o las células con especial interés pueden ser aisladas y cultivadas a alta densidad. Estos callos son transferidos a un medio de cultivo y a condiciones apropiadas para regenerar plantas (Fig. azúcares. Luego de dos a tres semanas. etcétera. donde se cultivan en continua agitación. E. Planta regenerada. · El potencial osmótico del medio de cultivo: los protoplastos requieren de protección osmótica antes de regenerar la pared celular. Una técnica muy eficiente que combina medio sólido y líquido es la de cultivo en perlas de agarosa.25 . Estas células se plaquean en un medio agarificado. C. de los cuales se formarán las colonias. los mantiene en oscuridad o bajo luz F. · La densidad celular: la densidad inicial de protoplastos varía de 104 – 105 protoplastos/ml de medio de cultivo.25 µl de medio de cultivo. donde se puede cultivar hasta un solo protoplasto. Pablo. cuya concentración alrededor de las células será menor en el medio líquido.dos con vitaminas. logrando densidades de 2 – 4 x 103 proto-plastos/ml. (d) la degradación de algunos componentes del medio por la población de protoplastos puede producir algunas sustancias citotóxicas. se forman microcolonias derivadas cada una de una célula. 5). A. Hay protoplastos de varias especies y tipos que no logran dividirse a bajas densidades de cultivo. Normalmente se ajusta con el agregado al medio de cultivo de manitol o sorbitol. Detalle de la formación de la luz. Con ayuda de un micromani-pulador se coloca la célula y se la cubre con aceite mineral para evitar la deshidratación del medio. Callo en medio de regeneración. Los principales factores a tener en cuenta para el cultivo de protoplastos son: · Los requerimientos nutricionales: se han utilizado en muchos casos los mismos medios de cultivo que se utilizan en el cultivo de células y tejidos. la densidad inicial debe ser baja. el medio líquido da mejores resultados por varias razones: (a) los protoplastos de varias especies sólo pueden dividirse en medio líquido. Pablo . reguladores de crecimiento y también con aditivos inespecíficos como leche de coco. de 100 – 500 protoplastos/ml. · Las condiciones de cultivo: en geFigura 5: Cultivo de protoplastos de tabaco. a partir de cada protoplasto. Cultivo de los protoplastos en perlas de agarosa suspendidas en medio líquido. muy tenue. por lo cual durante el cultivo se callo a partir de protoplastos. Los cultivos con altas densidades producirán. G. Protoplastos de neral los protoplastos son sensibles a mesófilo. pero que quedan metabólicamente activas. Para estos casos se desarrolló la técnica de cultivo con células nodrizas o alimentadoras. pero en general son enriqueci- 106 POLCI. Cada microgota contiene entre 0. Otra técnica utilizada es el cultivo en microgota. producto de mitosis sucesivas. y luego se colocan por sobre éstas los protoplastos sin irradiar. Los protoplastos regeneran la pared celular luego de uno a cuatro días en cultivo. Si deseamos colonias bien separadas para asegurar que provengan de un solo protoplasto. hidrolizado de caseína. donde los bloquecitos con los protoplastos inmovi-lizados en agarosa son cortados en cuatro mitades y colocados en medio líquido. colonias que deberán separarse tempranamente para evitar quimeras. Desarrollo de plantas a partir de callos de protoplastos. que dos semanas después se pueden ver a simple vista. · Los tratamientos físicos: tratamientos de choque eléctrico y térmico estimulan la división de los protoplastos. (b) la presión osmótica del medio puede ser fácilmente reducida a los pocos días en cultivo. Esta técnica consiste en exponer una suspensión de 106 protoplastos/ml a rayos X a dosis que inhiben la división celular. La presencia de pared es esencial para lograr una división regular. · El origen de los protoplastos: el bargo. B y D. aminoácidos. FRIEDRICH. También suele utilizarse papel de filtro para separarlas de las células nodrizas.

pudiendo haber otras bandas que resultan de nuevas combinaciones de las subunidades enzimáticas. por lo que para el análisis se deben emplear los mismos tejidos u órganos. 3. El análisis de ADN es independiente del tejido empleado y de la edad de la planta. se buscó producir plantas que desarrollaran tomates en la parte aérea y tubérculos en la raíz (pomato). 2. Las isoenzimas son extremadamente variables entre tejidos vegetales. incrementando así el flujo de genes en los cultivos. u otros completamente nuevos. Puede llevarse a cabo por RFLP (polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción). debiéndose más bien dirigir la técnica hacia la introgresión de pocos genes silvestres en las especies cultivadas mediante hibridación asimétrica o cibridación. siguen existiendo barreras genómicas que resultan en la eliminación espontánea de cromosomas durante las divisiones celulares. Morfológicos. 10 Logros y tendencias de la hibridación somática La hibridación somática ha permitido producir híbridos que no se habían podido obtener por cruzamientos sexuales. 4. Los híbridos somáticos pueden presentar rasgos morfológicos característicos. algunos esperaban que la hibridación somática permitiera producir nuevas especies que expresaran las características deseadas de ambos progenitores. cuando se fusionan células en fase de crecimiento activo con células del mesófilo. Comúnmente se llevan a cabo los siguientes estudios: 1. si se han fusionado más de dos protoplastos. por hibridación entre tomate y papa. Isoenzimáticos. fosfoglucoisomerasas. glutamato oxalacetato transaminasas. esterasas. La experiencia mostró que difícilmente puedan lograrse estos híbridos espectaculares. La tabla 1 muestra algunos ejemplos de híbridos somáticos que presentan algunas ventajas agronómicas. A tal fin es conveniente efectuar diferentes evaluaciones. RAPD (polimorfismos en el ADN amplificado al azar) o Southern blot. El patrón de bandas isoenzimáticas del híbrido debe mostrar bandas de ambos parentales. Si bien la fusión de protoplastos permite sortear las barreras precigóticas. 9 Identificación de las plantas híbridas La condición de híbrido debe verificarse en la planta regenerada aun cuando se haya efectuado algún tipo de selección para el cultivo de las células híbridas. Por ejemplo. Habitualmente se analizan los patrones de glucosa-6-fosfato deshidrogenasas.estado fisiológico del tejido del cual provienen y la calidad de los protoplastos son muy importantes para obtener una elevada eficiencia en la respuesta al cultivo. peroxidasas y fosfatasas ácidas. Mediante hibridación in situ empleando sondas de ADN repetitivo específico de especie puede evaluarse con más profundidad la contribución de los genomas parentales y reestructuraciones cromosómicas en el híbrido. la suma de ellos. manteniendo las características generales del cultivo. Uno de los factores que puede producir incompatibilidad genómica es el estado de diferenciación de los tipos celulares involucrados en la fusión. empleando sondas de ADN repetitivo específico de especie o de genes de ARN ribosomal. y en el mismo estadío fenológico. pero generalmente se retienen los cromosomas del parental que tiene el ciclo celular más corto. Citológicos. lo que permite una mejor caracterización del híbrido. que no se dividen. El mecanismo que determina la eliminación de cromosomas no está bien comprendido. el grado de aneuploidía y posibles translocaciones intergenómicas. En el ámbito del ADN. generalmente se pierden los cromosomas de estas últimas. El análisis del complemento cromosómico permite revelar si el híbrido posee el total de cromosomas de cada parental. Por ejemplo. La demostración de la presencia de ADN de ambos parentales es la prueba más directa de la hibridación. Uno de los factores que dificulta la obtención de híbridos simétricos es la progresiva pérdida de cromosomas de uno de los parentales. En sus inicios. Los híbridos somáticos o sexuales entre especies silvestres y cultivadas contienen Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 107 . Los mismos pueden ser intermedios a los de los parentales. que normalmente ocurre durante la regeneración.

Capítulo 6. 108 POLCI.. Sin embargo son una excelente herramienta para estudiar las interacciones núcleo-citoplasmáticas entre genomas. Bhojwani y M.K. tales como la androesterilidad citoplasmática y ciertos tipos de resistencia a enfermedades y a herbicidas. pp. La hibridación asimétrica y la cibridación tienen la ventaja de incorporar sólo uno o pocos caracteres provenientes del parental silvestre en la especie cultivada. LINDSEY Y JONES. 1986). Pablo. K. 337-406.A. MATSUMOTO. pero ello no siempre es posible debido a que los híbridos suelen ser estériles. Para estos casos es de particular utilidad la cibridación. Biología celular de la ingeniería genética.S. Los métodos actuales de transferencia de genes aislados han desplazado el interés en la hibridación somática. Híbridos somáticos.S. S. Zaragoza. Editorial ACRIBIA. Pablo . FRIEDRICH. El primer caso de regeneración de plantas maduras de híbridos intergenéricos (simétricos y asimétricos) en gramíneas fue el Festulolium. En: Plant Tissue Culture: Theory and Practice. El retrocruzamiento con la especie cultivada es requerido para remover los genes no deseados del parental silvestre. Somatic hybridization and cybridization. fundamentalmente debido a problemas de baja o nula fertilidad. Saccharum officinalis (+) Pennisteum americanum. pp. Algunos caracteres deseables están codificados por el genoma extranuclear... U. Razdan (eds. S. Protoplast isolation and culture. ZIMMERMANN. 1992.5: pp. 1. Biotecnología Ciencia & Desenvolvimiento. dado que es un método simple para transferir estos genes. Trends in Biotechnology. RAZDAN. 11 Algunos ejemplos Se han obtenido híbridos intergenéricos de Panicum maximum (+) Pennisetum americanum (Ozias-Atkins et al . 20. Electrofusion of cells: principles and industrial potential. y producir plantas con mayor fertilidad. la aplicación de esta estrategia no ha conducido a la obtención de nuevos híbridos de especies importantes. S. además de aquéllas deseadas.mayo / junio: pp. En: Biotecnología vegetal agrícola. A pesar de los esfuerzos realizados. 149-156. Festuca arundinacea (+) Lolium multiflorum. 1983. M. 26-28. Capitulos 12 y 13. 12 Lecturas recomendadas BHOJWANI. Triticum monococcum (+) Pennisetum americanum . Amsterdam. 2001.) Elsevier. Oriza sativa (+) Echinochloa oryzicola.K. 1996.Tabla 1: Ejemplos de híbridos somáticos que exhiben algún carácter de interés agronómico muchas características no deseadas de la primera.105-142.

Este último aspecto es de gran importancia ya que la creación de cultivares es un proceso acumulativo. Este hecho hace que el aprovechamiento de la variabilidad esté restringido por barreras de cruzabilidad. Por lo tanto. abriendo nuevas perspectivas en el mejoramiento de las plantas. entre otros. virus. es decir que se desea incorporar características favorables sin perder las mejoras logradas anteriormente. hongos y bacterias. Asimismo. El reciente desarrollo de métodos no sexuales para transferir genes. técnica conocida como del ADN recombinante.. Las plantas transgénicas obtenidas hasta la fecha se desarrollaron por diversos métodos. aspecto particularmente relevante en la era genómica (ver VII. los avances de la genética y de la estadística experimental. a través de experimentos de campo y laboratorio se estudia el comportamiento de los individuos transgénicos y su descendencia. El germoplasma transgénico es posteriormente incorporado al proceso de mejoramiento.-Capítulo 3 Transformación genética Díaz. se desarrollaron los métodos de mejoramiento actualmente utilizados.-1). permite superar esta limitación. Finalmente. El mejoramiento genético se basa en la existencia de variabilidad genética para los caracteres que se desea mejorar y la reproducción sexual para la incorporación de los mismos. el cual dependerá de la especie y del tipo de cultivar a obtener. En 1983 se informaron los primeros experimentos de expresión de un transgen (gen introducido) en células vegetales y al año siguiente se obtuvieron las primeras plantas transgénicas (tabaco y petunia). insectos. Una vez introducido el gen de interés en la célula. Ríos. los que han sido modificados para cada especie en particular. 2 Requerimientos para la obtención de plantas transgénicas Para todas las técnicas de transformación desarrolladas hasta el momento es necesario disponer del transgen (secuencias regulatorias y codificante clonadas en un vector de transformación) y de una metodología eficiente para la transferencia al genoma vegetal. Un sistema de cultivo de tejidos que permita regenerar plantas completas y fértiles.. Zappacosta. Diego C. 2. 1 Introducción El mejoramiento genético vegetal se originó hace aproximadamente 10. a través del uso de transgenes es posible modificar la expresión de genes presentes en el genoma de la planta. bacterias y animales. que permitan el Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 109 . Desde entonces se ha extendido la aplicación de esta tecnología a unas 120 especies. Pascual M. Se procede luego al análisis molecular de las plantas regeneradas in vitro para identificar aquellas que porten y expresen el o los transgenes en los niveles deseados. con la incorporación de los cruzamientos sexuales.. se induce el desarrollo de plantas mediante distintas técnicas de cultivo de tejidos. aumentándose de esta forma la eficacia de los mismos. Marina L. Franzone. En el siglo XX. Vectores apropiados. Conviene destacar que la transformación de plantas es una tecnología que aporta variabilidad genética conocida sin alterar el fondo genético.III. Raúl D. tolerancia a herbicidas y a estreses abióticos y modificación de la calidad nutritiva de los cultivos entre otras. La transformación genética también constituye una herramienta útil para estudios básicos que permiten conocer y/o profundizar acerca de la estructura y función de genes específicos. Entre sus aplicaciones se encuentran la obtención de plantas con resistencia a virus. permite introducir en plantas genes provenientes no sólo de otras especies vegetales muy alejadas desde el punto de vista evolutivo sino incluso de hongos.000 años. el conocimiento de la biología floral de las especies. como la transformación genética. cuando el hombre se hizo agricultor y comenzó la domesticación de las plantas. La ingeniería genética o transformación genética. los elementos básicos que se requieren en trabajos de transformación genética en plantas son: 1.

Los fragmentos de restricción así obtenidos pueden ser ligados enzimáticamente a vectores de clonado. Muchas veces los genes utilizados provienen de bacterias y usualmente no pueden expresarse eficientemente en células eucariotas. sitio del ADN al cual se une la enzima ARN-polimerasa para iniciar el proceso de transcripción (Fig. resulta importante destacar que para lograr una planta transgénica deben ocurrir tres procesos en la misma célula: a) El transgen debe ser transferido al interior de la célula. En este contexto. Un protocolo de transformación (sistema de transferencia de genes y de selección del material transformado).-3) Figura 1: Estructura molecular del transgen Un transgen está compuesto por una secuencia codificante (región comprendida entre los codones de iniciación y terminación de la traducción) y por secuencias regulatorias que determinan el tejido. en la elección del pro- 110 DÍAZ. Asimismo.2 Construcción del vector Para introducir un transgen es necesario que el mismo sea incorporado previamente en un vector (por ejemplo un plásmido). la secuencia más importante es el promotor.1 Cultivo de tejidos vegetales Los métodos de transformación más utilizados actualmente se basan en la obtención de células transgénicas y posterior recuperación de plantas completas y fértiles a partir de las mismas a través del cultivo y selección in vitro. para optimizar la expresión del transgen es necesario reemplazar las secuencias regulatorias bacterianas por otras aptas para su expresión en células vegetales. cualquiera que sea su origen. el momento del desarrollo y el nivel de expresión del transgen en la planta. clones de ADN recombinante (ver II. Cabe destacar que la expresión génica es controlada por las secuencias regulatorias y no depende de la secuencia codificante. 2.clonado del gen de interés y/o su transferencia al tejido blanco de transformación. . cuando se usa esta tecnología con fines de mejoramiento genético es muy importante conocer la respuesta morfogenética de distintos genotipos con adaptación local.M. P.. Herramientas de análisis para detectar la presencia del transgen y los productos del mismo en la planta.C.D. ya que es conveniente introducir sólo las modificaciones que se desean y en forma controlada (ver III. Esto es posible gracias a la propiedad de totipotencia expresada por las células vegetales (ver II. b) El transgen debe integrarse al ADN celular y c) Se debe regenerar una planta completa a partir de la célula transgénica en la que se verificaron los procesos a y b.. 4. obteniéndose. ZAPPACOSTA. R.-1). La adecuada expresión de los transgenes es un aspecto importante en la obtención del fenotipo deseado en la planta transgénica. 3. Dado que las células tienen diferente competencia o capacidad de respuesta para cada uno de estos procesos. Por ello. 1).-1). la puesta a punto de un protocolo de transformación eficiente requiere maximizar la cantidad de células competentes para todos ellos de manera simultánea. Estas endonucleasas tienen la capacidad de reconocer en el ADN secuencias específicas compuestas por pocos nucleótidos y posteriormente producir cortes en las mismas. de este modo. RÍOs. FRANZONE.. M. un prolongado período de subcultivos puede inducir la aparición de variación somaclonal no deseable. 2. Por lo tanto. En el cultivo in vitro. se expresará de acuerdo con el patrón de expresión de dicho promotor. D. Para ello se digiere el ADN extraído de un organismo. una secuencia codificante aislada de un gen A. Por ello. con enzimas de restricción. puesta bajo el control de un promotor aislado de un gen B. En la mayoría de las especies se observa una importante influencia del genotipo en la respuesta al cultivo in vitro. Antes de iniciar la descripción de los ítem anteriores.L.

La capacidad patogénica de estas bacterias esta asociada a la presencia de megaplásmidos (150-200 kilo pares de bases o Kb) llamados Ti (por Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 111 . Ambas especies son capaces de infectar una amplia variedad de especies de dicotiledóneas y tienen como blanco de infección a las heridas. elegidos por su patrón de expresión adecuado y estable. Estos métodos pueden dividirTabla 1: Promotores usados en transformación genética de plantas se en: nos (nopalina sintetasa de Agrobacterium) 35 S (virus del mosaico del coliflor) Ubi (ubiquitina de maíz) Act 1 (actina de arroz) Constitutivos Promotores TA 29 (tapete de la antera de tabaco) faseolina (cotiledones de poroto) Específicos de tejido TobRB 7 (raíz de tabaco) patatina (tubérculo de papa) glutenina (endosperma de trigo) subunidad pequeña de Rubisco inducible por luz alcohol deshidrogenasa-1 inducible por Inducibles anaerobiosis proteína de shock térmico inducible por calor a) Transformación mediada por Agrobacterium. por distintos mecanismos. Esto puede deberse a la presencia de otras secuencias regulatorias cercanas. al patrón de metilación. Esto se puede lograr usando sistemas de recombinación heteróloga sitio-específicos o mediante reemplazo génico por recombinación homóloga. enfermedad que se conoce como «agalla de la corona» y A. etc. vector biológico que participa del proceso de transferencia.3 Métodos de transformación La pared celular impide la entrada del ADN en la célula. 2. mediante los cuales. necesaria para el correcto procesamiento del transcripto correspondiente. dos de ellas ampliamente estudiadas ( A. Por otra parte el nivel y patrón de expresión del gen también puede estar afectado por la posición del mismo en el genoma de la planta transformada (efecto de posición). Los promotores pueden ser modificados con el fin de aumentar la expresión de los genes que regulan. es necesario que el transgen disponga de una región no traducida en el extremo 3’ del mismo. por otra parte el de ubiquitina 1 (ubi1) de maíz es uno de los más efectivos en gramíneas. rhizogenes). rhizogenes induce la proliferación de raíces dando lugar a la enfermedad denominada « raíz en cabellera ».motor a utilizar en la construcción del transgen. adicionárseles un intrón o unírseles secuen- nidos en el mismo experimento. Al momento de elegir el promotor debe tenerse en cuenta también la planta a transformar ya que algunos de ellos son menos activos en monocotiledóneas. Además. pueden truncarse. cias de otros promotores. constituyendo un obstáculo que todos los métodos de transformación genética tienen que superar de algún modo. a la estructura de la cromatina. que incluya la señal de corte y poliadenilación (terminador). tumefaciens y A. se introduce el ADN en la célula.3. b) Métodos de transformación genética directa. que permiten la expresión del gen en toda la planta en forma continua. La solución para evitar los «efectos de posición» es dirigir la secuencia de interés a sitios específicos del genoma vegetal. tumefaciens causa tumores. A. Ellas son capaces de desarrollar un crecimiento saprofítico o parasítico. los inducibles que responden a factores ambientales y finalmente los específicos de tejido que permitirán la transcripción en determinados órganos y tejidos (Tabla 1). ya que su nivel y patrón de expresión pueden variar al ser utilizados en especies distintas a la de origen del mismo. Dentro de los promotores se distinguen aquellos constitutivos. La cantidad de proteína producida por el transgen comúnmente varía más de 100 veces entre individuos transformantes obte- 2. como el 35S. atacando células individuales y provocando su proliferación.1 Transformación mediada por Agrobacterium Las especies del género Agrobacterium son bacterias Gram-negativas aeróbicas obligadas que viven en el suelo. también llamados físicos. hay que considerar la especie vegetal a transformar. El género comprende cuatro especies fitopatogénicas.

vir B. produgenes que se expresan eficientemente en la cidos por células vegetales heridas. ZAPPACOSTA. La región de virución anormal del tejido) y genes que provo.lencia (de alrededor de 30 Kb) está organizacan la síntesis de opinas (fuente de carbono da en operones esenciales para la transferencia del T-DNA (vir A. presentes en algunas de las agrobacterias. cel. causa proliferación de células de la planta a mediados por los genes vir (por virulencia) través de la síntesis y alteración de la respues. rrollan si hay A. FRANZONE. en de esta bacteria es que usa la respuesta de la él se produce la transferencia del T-DNA que planta a las heridas (cicatrización y defensa) contiene un gen marcador seleccionable y el como quimioatractivo y activador del proce. como la acetosiringona. Se demostró que durante la patogénesis un fragmento de estos plásmidos llamado Figura 2: Estructura del T-DNA T-DNA (por «transfer-DNA»). 2). llamadas bordes interacción de esta bacteria con las plantas. son res y señales de poliadenilación) típicamente reemplazados por un marcador seleccionable y el gen a transferir (Fig. P. Estos bordes son los únicos elementos en cis necesarios para tas por Agrobacterium representa una situadirigir el procesamiento del T-DNA. donde se integra al ADN A. El desarrollo de la patogénesis de planderecho e izquierdo (Fig. es transferido a la célula están involucrados genes cromosómicos (chv vegetal.«tumor-inducing» o inductor de tumores) o Ri (por «root-inducing» o inductor de raíces).que son inducidos por azúcares y compuesta a hormonas vegetales. M. Luego de la adhesión de se transfieren los explantes a un medio de la bacteria a la célula vegetal.M. para lo cual. R. ganismo procariota a un organismo eucariota Contrariamente a lo que sucede con otros superior.siste en inocular un explante con A. Este no codifica los productos que median su mecanismo de ingeniería genética natural es transferencia.. RÍOs. El T-DNA es una región relati.C. Desde la década de 1950-60 se sabe que do «del explante» (Horsch y col. el T-DNA expresión en el genoma hospedador.. Cualquier ción única en la naturaleza: la transferencia fragmento de ADN ubicado entre estos bor. etapa en la que cultivo que contiene un antibiótico que ac- 112 DÍAZ. vir G) o y nitrógeno para la bacteria).. psc A y att). .aprovechado para la transferencia de genes vamente grande (ca. D. chv E.D.rá avanzar en el conocimiento de la ses (bp) que lo flanquean.Agrobacterium en la era genómica permitines directas imperfectas de 25 pares de ba.oncogenes y genes de síntesis de opinas. Se conocélula vegetal infectada y producen síntesis ce con mucho detalle la etapa de la de hormonas vegetales (llamados oncogenes patogénesis que ocurre en la bacteria (ver porque son los responsables de la prolifera. chv B.revisión de Gelvin. Un aspecto destacable con el explante durante un cierto tiempo. transformación (vir C. 1984) conlos tumores de la agalla de la corona se desa. tumefaciens es el caso más estudiado que permiten incrementar la eficiencia de la y utilizado en la transformación de plantas.L. 20 Kb) que contiene de interés a las plantas. El método llamaeucarióticas. 2). vir D. tumefaciens patogénicas en tumefaciens..de un elemento genético (T-DNA) de un ordes puede ser transferido a la célula vegetal. El T-DNA contiene tos fenólicos. los genes con secuencias regulatorias (promoto. vir E). con su subsiguiente integración y tipos de secuencias móviles de ADN. 2000). A. El ingreso de El T-DNA está delimitado por dos repeticio.o los transgenes de interés. se produce cromosómico de la planta y cuya expresión el procesado y la transferencia del T-DNA. Posteriormente so de patogénesis. dejar la bacteria en contacto presencia de heridas.

El uso de estos vectores permite clonar fragmentos de ADN de gran tamaño y posteriormente transferirlos al genoma vegetal vía A. y por otra parte representa una valiosa herramienta para la estimulación de la rizogénesis en especies recalcitrantes. tumefaciens a especies que no son susceptibles en condiciones naturales a este patógeno. Esta tecnología es de gran utilidad para el clonado posicional de genes. con un origen de replicación de amplio espectro de hospedantes. que deben formar estructuras cointegradas para replicarse en A. aditivos alimentarios y cosméticos.3. la inducción de los genes de virulencia y el control del estrés durante todo el proceso. movilizando el T-DNA presente en otro plásmido. preferencialmente en regiones con actividad transcripcional y con la participación de proteínas de la bacteria y de la planta. Si bien ambos tipos de vectores son herramientas eficientes para la transformación. se construyen vectores denominados binarios que contienen un T-DNA no oncogénico en un plásmido pequeño. la inserción del ADN que contiene los transgenes dentro del T-DNA de un plásmido Ti desarmado se logra por recombinación homóloga.túa como bacteriostático y el agente selectivo correspondiente al gen marcador seleccionable utilizado. La integración del T-DNA en el ADN cromosómico de la planta se produce al azar. maíz. tumefaciens. hay que considerar aspectos tales como el genotipo vegetal. Los plásmidos Ti sin oncogenes se denominan «desarmados». leñosas. En los vectores cointegrados. Una vez completado el protocolo de cultivo y selección in vitro se recuperan las plantas transgénicas (Fig. tumefaciens como vector de transformación en gramíneas y se han desarrollado protocolos en varias especies de este grupo (arroz. rhizogenes tiene fundamentalmente dos aplicaciones: la producción de raíces con alta tasa de crecimiento capaces de sintetizar metabolitos secundarios como productos farmacéuticos. características que permiten su fácil manipulación genética usando E. se ha puesto énfasis en la utilización de A. por recombinación ilegítima. El interés en el desarrollo de este tipo de tecnología hizo que se expandiera el rango de hospedantes de A. Por esta razón se han desarrollado dos sistemas de vectores para introducir genes en Agrobacterium: los vectores cointegrados. se aprecia una notable preferencia por el uso de vectores binarios. son de gran tamaño y resulta difícil introducir genes en su T-DNA usando técnicas habituales de ADN recombinante. 3). por ejemplo. la cepa bacteriana. coli como huésped. Para ello se utilizan vectores especiales que tienen características tanto de cromosomas artificiales de bacterias (BACs) como de vectores binarios. Más de 600 especies vegetales son hospedantes naturales de A. 2. trigo y gramíneas forrajeras). La introducción de este plásmido a una cepa de Agrobacterium que contenga un plásmido llamado «helper» de virulencia (con la región vir intacta y sin TDNA) la hace apta para la transferencia del T-DNA a las células vegetales. Para muchas de ellas se han puesto a punto protocolos de transformación genética basados en este vector.2 Transformación directa o por métodos físicos La primer metodología de transformación genética de plantas desarrollada fue la de A. Cabe notar que su aplicación es actualmente una rutina en arroz y maíz. que son capaces de replicarse en forma autónoma en esta bacteria. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 113 . Análisis por hibridación del T-DNA en plantas transgénicas y su progenie han demostrado que el T-DNA se incorpora al ADN cromosómico y se hereda en forma estable. el tejido blanco de transformación. Sobre la base de la capacidad de los genes de virulencia de actuar en trans. La puesta a punto de un protocolo eficiente y reproducible de transformación mediada por Agrobacterium es un proceso complejo en el que además de tener muy buen conocimiento de la respuesta al cultivo in vitro de la especie a transformar. Este sistema de transformación permite transferir fragmentos de ADN de hasta 150 Kb. La transformación con A. Estas pertenecen en su mayoría a dicotiledóneas y gimnospermas y más raramente a monocotiledóneas. Esto fue posible debido al amplio conocimiento que se tiene de esta patogénesis. Así. tumefaciens y los vectores binarios. tumefaciens. cebada.

Tanto el PEG como la electroporación producen poros en la membrana plasmática por alteración de la polaridad de la misma y por ellos penetra el ADN foráneo. microinyección o liposomas.. debido a que no son hospedantes naturales de esta bacteria.. Se basa en el hecho de que la pared celular es la principal barrera para la introducción de ADN en las células vegetales por lo que ésta es temporariamente removida. Cabe notar que el cultivo de protoplastos es la metodología más sofisticada de cultivo in vitro de plantas por lo cual representa gran complejidad experimental y no está disponible más que para algunas especies y dentro de ellas particularmente en genotipos modelo. electroporación. RÍOs. Por ello se desarrollaron metodologías alternativas de transformación directa como la electroporación de tejidos. FRANZONE. En ellos el transgen es introducido en la célula vegetal mediante distintas técnicas que se detallan a continuación.D. ZAPPACOSTA.Figura 3: Comparación de técnicas de transformación directa e indirecta tumefaciens. M. La microinyección es un método difícil y laborioso que consiste en la introducción de ADN dentro de protoplastos individuales mediante el uso de capilares de inyección y micro-manipulador y aunque con esta metodología es necesario manipular las células individualmente.Transformación de protoplastos La introducción y expresión de ADN forá- neo en protoplastos fue el primer método de transferencia directa claramente demostrado en plantas y esto se debió a que se disponía. . En el último caso se someten los protoplastos a un campo eléctrico..M. de procedimientos eficientes para la regeneración a partir de protoplastos. Inicialmente esta tecnología no resultó de utilidad para abordar la transformación de especies de gran importancia económica como los cereales. Los protoplastos pueden ser transformados utilizando polietilenglicol (PEG). R. el uso de fibras 114 DÍAZ. D.L. P. Este hecho condujo al desarrollo de los métodos físicos de transformación. La transformación de protoplastos mediada por PEG es el método más comúnmente usado. Los protoplastos pueden ser aislados en forma mecánica o por un proceso enzimático que digiere la pared. Ambas técnicas permiten el tratamiento de un gran número de protoplastos al mismo tiempo. es posible lograr un alto grado de integración del ADN foráneo.C. para algunas especies. Así se obtiene una suspensión conteniendo millones de células individuales lo que favorece la transformación de células aisladas. .

Sin embargo.precisa .multicopia en tandem yectiles de oro o tungsteno independientes . indirecta plántulas completas. tumefaciens posee paredes celulares lignificadas o superficies un mecanismo natural muy eficiente para vellosas.Tipo de integración en el .sin limitaciones monocotiledóneas de microproyectiles y mayor Eficiencia de transformación . igualmente.3. A pesar de la desdeo con microproyectiles o micropartículas. sorgo. sin embargo. coli. Uno de los procesos necesarios para obEsta técnica. 1987). Se utilizan micropro. la fuerza impulsora de las partículas tes al cultivo y regeneración de protoplastos. Inicial.de carburo de silicio para facilitar la entrada corporar de manera permanente la informadel ADN en las células en cultivo y el bombar. tiene manifies. desde células o protoplastos hasta 2. papaya.imprecisa (químicamente inertes) cuyos Construcción de vectores . Para el bombardeo go. se puede emplear cualquier tipo de explante vegetal. como son el rango de huéspedes métodos de transformación directa. pasando por tejidos organizados en embriones y meristemas. al núcleo celular. A. ventaja que representa el bajo número de .Bombardeo de micropartículas transformantes producido por un solo epiEs un proceso por el cual micropartículas sodio de bombardeo.vías de transformación presentan ventajas y culas dañen las células (Fig.tividad transcripcional. En la Tacedimiento sólo requieren un origen de bla 2 se presenta una comparación entre la replicación que permita un alto número de transformación del genoma nuclear mediacopias de los mismos en E. distribución Especies a transformar .transgénicas de soja. estaba dada por pólvora. 3).aleatoria en regiones con .menor vegetal mm. en la actualidad.dicotiledóneas y algunas . pero luego fue reemplazada por el Tabla 2: Comparación entre métodos de transformación del genoma sistema de helio comprimido nuclear Método biolístico Agrobacterium que brinda una mejor regulación de la fuerza. ambas que el impacto y la penetración de las partí.aleatoria transcripción genoma vegetal deos.5 a 3 Dependencia del genotipo . Algunas especies oponen del transgen al ADN cromosómico. tumefaciens y el método biolístico facilita en la práctica la preparación del ADN como representante de los métodos de necesario en grandes cantidades para la transformación directa.3 Transformación directa vs.alta .venientes para los distintos fines.tener plantas transgénicas es la integración tas limitaciones.. caña de azúcar y trigo.transgenes ha superado muchas de las batales. Los vectores desventajas que las hacen más o menos conplasmídicos que se usan en este tipo de pro.baja reproducibilidad entre bombar.de Agrobacterium y las dificultades inherenmente.mayor . evitando tales.simple tamaños van desde 0. tre ambos métodos. transformación genética por este método.aleatoria en regiones cromosómicas con acbardeo y el número de células que logran in.bajo número de copias . el T-DNA que condel método continúa siendo la baja relación tiene el transgen y producir una integración entre el total de células sometidas al bom. dada por cutículas endurecidas. los Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 115 .compleja . que al ser disparados a grandes velocidades pueden La biolística ha demostrado ser la mejor opatravesar pared y membranas de la célula ción para la producción de plantas vegetal bombardeada sin causarle daños le. la principal limitación transferir.ción genética transferida. Generalmente. la versatilidad de la cubiertas con ADN son aceleradas por un gas aceleración de partículas para introducir comprimido e introducidas en células vege. transformación para muchas especies vegeque produce plasmó-lisis celular. Con reuna resistencia natural a la penetración de lación a este proceso existen diferencias enlas partículas. Esta técnica se ha ido perfeccionando rreras asociadas a otros métodos de transy actualmente es la más difundida entre los formación. El Con el transcurso de las investigaciones explante es generalmente sometido a un tra.se ha logrado optimizar los protocolos de tamiento osmótico pre y posbom-bardeo. aspecto que da por A. espárratales (Klein y col.

tanto el genotipo de la planta como el de la bacteria. el mecanismo involucrado hace que se transfiera un segmento de ADN definido: el T-DNA. Es conveniente destacar que en ambos métodos la integración del transgen en el genoma se produce al azar. Así.C. por lo que es importante evaluar este aspecto cuando se elige el gen de selección a utilizar. las células que lo expresen podrán crecer y desarrollarse en medio de cultivo que contenga dichos agentes selectivos mientras que las células no transgénicas no lo harán (selección negativa). RÍOs. Así. si el gen marcador codifica para una proteína que confiere resistencia a agentes fitotóxicos como antibióticos o herbicidas. en gran medida. P. Como consecuencia de ello. Es necesario tener en cuenta que algunas especies pueden poseer una resistencia natural a los agentes selectivos antes mencionados. ZAPPACOSTA. Así.patrones de inserción de transgenes son más sencillos en comparación a los producidos por el método biolístico. la dependencia del genotipo es mucho más acentuada. con baja eficiencia. Por otra parte. sino que es de longitud variable. el gen man A de E. la expre- sión fenotípica de un transgen será diferente en distintas plantas que contienen el mismo transgen. En otros casos.D. cabe mencionar que en el caso de A. generalmente de origen bacteriano. Esto es particularmente relevante cuando se tiene por objetivo el desarrollo de productos comerciales.M. acompañado de proteínas que lo protejen de la acción de nucleasas. de la disponibilidad de genotipos con muy buena respuesta al cultivo in vitro. ya que influyen también en la eficiencia de transformación.4 Genes de selección e informadores En el proceso de obtención de plantas transgénicas. El gen marcador seleccionable otorga a las células transgénicas que lo expresan una importante ventaja. 2. como en el caso de T-DNA. En este método es común que se produzcan inserciones de varias copias del transgen en un mismo sitio del genoma con distinto grado de reordenamiento de la secuencia del transgen. con respecto a las células no transgénicas. sea para poner a punto un protocolo de transformación o como acompañantes de genes de interés que se desean introducir. el número de copias que se incorpora es bajo y cuando hay más de una copia. presentan inserciones en distintos sitios del genoma receptor. Así.. lo cual no es posible para las células no transgénicas (selección positiva). los genes marcadores seleccionables (Tabla 3). cumplen un rol de relevancia. Este último aspecto es considerado como una desventaja ya que tanto desde el punto de vista de la percepción pública como el de la optimización de la expresión de los transgenes. Finalmente. así como 116 DÍAZ.. sólo parte del mismo llega al núcleo donde se produce. el segmento de ADN plasmídico que se integra al ADN cromosómico no está definido. por lo cual. Por otra parte. la ventaja estará dada por la posibilidad de utilizar diferencialmente un sustrato. cuando se utiliza el método biolístico. D. la integración al azar en el ADN cromosómico. para clarificar la situación se considera a cada una de ellas como eventos de transformación distintos. el fenómeno de silenciamiento de transgenes (pérdida de su expresión). FRANZONE. tumefaciens.. La construcción de vectores es mucho más sencilla en el caso del método biolístico. puede resultar de la presencia de varias copias del transgen. . Este aspecto puede resultar importante en el contexto del desarrollo de proyectos de investigación. por lo que al ser parcialmente degradado. La aplicación de cualquiera de estos métodos de transformación al mejoramiento vegetal depende. M. debido a que se trata de una interacción biológica entre una planta y una bacteria. al permitirles crecer en un medio de cultivo que contiene el agente selectivo correspondiente. Entonces. Por el contrario. lo que facilita la posterior eliminación de las copias no deseadas por segregación. observado en algunos casos. en el método biolístico el ADN transferido no está asociado a proteínas. es deseable disponer de inserciones simples y bien definidas molecularmente. coli permite a las células vegetales que lo expresan utilizar la manosa como fuente de carbono. en los cuales muchas veces se requiere utilizar un número considerable de vectores diferentes.3.L. R. diferentes plantas transgénicas provenientes de un mismo experimento. suelen distribuirse en loci independientes.

un resultado positivo indica solamente que en la muestra existe una secuencia que amplifica con los «primers» utilizados pero no indica si el transgen se encuentra incorporado al genoma de la planta. se observa un brillo verde fluorescente. Una variación de esta técnica. Para ello se puede construir un vector con la secuencia codificante de gus A y con una secuencia de terminación de transcripción.4 Técnicas de detección del transgen y sus productos Seleccionables (Agente selectivo) npt II (kanamicina. Para maximizar la robustez de esta prueba es necesario utilizar temperaturas de ‘annealing’ o apareamiento de primers altas (más de 60 °C) y «primers» relativamente largos (más de 20 nucleótidos). y estudiar en plantas transgénicas el patrón de expresión espacio-temporal del promotor (en qué tipo de células y cuándo se expresa) por tinción histoquímica y su nivel de expresión por fluorometría.glucuronidasa.Tabla 3: Genes marcadores utilizados comúnmente en transformación de plantas Marcadores 2. Si se utiliza como sonda el T-DNA completo y la digestión del ADN genómico se realiza con enzimas de restricción que no cortan dentro del T-DNA. coli codifica para la enzima ß. Esta técnica permite hacer un «screening» rápido de las plantas regeneradas. 4 se representa el análisis de un caso hipotético de transformación mediante Agrobacterium. En la Fig. bialaphos) CP 4 (glifosato) man A (manosa 6 fosfato) Visualizables (Fenotipos asociados) gus A (color azul índigo) luciferasa (luminiscencia) gfp (fluorescencia verde) el agente selectivo y las concentraciones del mismo. El esquema 4-a representa parte del vector que contiene el gen de interés y el gen marcador. paromomicina. Este marcador también puede ser detectado cuantitativamente usando técnicas fluorométricas. el gen de la proteína fluorescente verde. se ha convertido en un gen marcador visualizable in vivo muy utilizado. es decir que permite conservar vivo el material en estudio. el gen gus A proveniente de E. Para ello se emplean técnicas como: . Recientemente. resulta de utilidad para evaluar el número de copias del transgen incorporadas al genoma de la célula vegetal. por la producción de un precipitado azul-índigo de fácil visualización. da información acerca de la integración de la misma en el genoma de la célula huésped (número de copias integradas y número de loci en los cuales se produjo la integración). Estos genes codifican para proteínas que no están presentes en las células vegetales y producen un fenotipo característico de fácil y rápida observación. Así. . tejidos que contienen células que expresan este gen. Al ser éste un ensayo no destructivo. aislado de una medusa. Además de indicar la presencia o no de la secuencia de interés. las plantas regeneradas deben ser analizadas por métodos moleculares para identificar aquellas que porten y expresen los transgenes en los niveles deseados. G418) hph (higromicina) pat o bar p ( hosphinotricina. PCR en tiempo real.Hibridación southern o «Southern blotting»: es una de las herramientas moleculares más poderosas para caracterizar las plantas transgénicas.Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): con el uso de «primers» homólogos a la secuencia del transgen se puede determinar la presencia del mismo. Cuando se ilumina con luz ultravioleta o luz azul. Esta proteína puede ser detectada cualitativamente por tinción histoquímica. gfp («green fluorescent protein»). representa una herramienta de utilidad para visualizar diferentes etapas del proceso de transformación. el número de bandas del patrón representa el número de si- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 117 . En la puesta a punto de las metodologías de transferencia de genes son asimismo de gran utilidad los genes marcadores visualizables o informadores que posibilitan la observación directa de las células que los expresan (Tabla 3). Como ejemplo de la aplicación de estos métodos de detección podemos mencionar el estudio de la expresión de un promotor en una especie vegetal. aunque éste es aplicable también a plantas obtenidas por métodos directos. en presencia de un sustrato específico. aunque tiene algunas limitaciones. Luego de la selección in vitro.

Plantas transgénicas obtenidas en forma independiente tendrán patrones de hibridación diferentes (4-b).. ocurrieron rearreglos o se produjo el truncado del TDNA. P.L. ésta dará dos señales de hibridación para cada sitio de inserción independiente del TDNA (4-c). El tamaño de las bandas será mayor que el T-DNA ya que se están utilizando enzimas que cortan por fuera de éste.Hind III) > 5 kb Uno interno (Eco RI) Un sitio (EcoRI) entre el marcador y el transgen T-DNA (frag. RÍOs. D.Hind III Eco RI Sal I Sal I Hind III BI Gen Marcador 2 kb b) Gen de Interés 3 kb c) 1 2 3 4 5 d) 1 2 3 BD 1 2 3 4 5 4 5 Sitio de corte: Sonda: Frag: tamaño Ausente dentro del T -DNA T-DNA (frag.M. utilizando la sonda antes mencionada. .Hind III) > 2 kb Gen marcador > 2 kb e) 1 2 3 4 5 f) 1 2 3 4 5 Sitio de corte: Un sitio (Eco RI) entre el marcador y el transgen Sonda: Frag: ta maño cantidad Transgen > 3 kb Igual que en d) Dos sitios (Sal I) dentro del transgen Fragmento (Sal I) del transgen 1 kb Uno Figura 4: Patrones de Hidridación de Southern (Modificado de Bhat y Srinivasan. La aparición de un número impar de bandas indica que en un mismo sitio se insertaron múltiples copias. si la enzima tiene un sitio de corte único dentro del T-DNA.D. M. Por otra parte. R. Si se digiere la muestra con una enzima de restricción que posee un sitio único de corte entre el gen marcador y el gen de interés y utilizando como sonda el gen marca- 118 DÍAZ. 2002) tios de inserción.C. ZAPPACOSTA.. FRANZONE..

Si la membrana se hibrida con el gen de interés (4-e) aparecerá un patrón que tendrá el mismo número de bandas que el anterior. Para realizar la comparación es necesario utilizar simultáneamente estándares conteniendo un número conocido de copias del transgen. posee una alta sensibilidad y la muestra es de fácil preparación.-3). La actividad de la proteína debe ser medida. En lo que respecta a la cuantificación. Este involucra la degradación del ARN mensajero producido Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 119 . ofrece información sobre el tamaño del transcripto y permite su cuantificación. antisentido y la denominada interferencia del ARN. b)La expresión de nuevas formas alélicas de genes que ya están presentes en el genoma (ejemplo: tolerancia al glifosato en soja). Además.ELISA y «Western blotting»: aquellas plantas que poseen la secuencia de interés y la expresan como transcripto. Por otra parte. este puede consistir en: a) La expresión de secuencias codificantes no existentes en la especie (ejemplo: proteínas insecticidas de origen bacteriano). se obtendrá una sola banda por cada inserción independiente (4-d). la hibridación del ARN utiliza como sonda el transgen.Análisis de ARN: Las técnicas de RTPCR (transcripción reversa seguida de PCR) con la hidridación de ARN o «Northern blotting» pueden resultar valiosas herramientas para detectar los transcriptos de interés presentes en la muestra. Analizando con más detalle este concepto podemos considerar que este aporte puede ser realizado de diferentes maneras.3 y su aplicación para el análisis de plantas transgénicas en Register (1997) y en Bhat y Srinivasan (2002). La aparición de una banda del tamaño del T-DNA puede indicar la presencia de repeticiones en tandem. la transformación genética permite introducir variabilidad genética novedosa en las diferentes especies vegetales. Estas técnicas se encuentran descriptas detalladamente en la sección II. antes mencionada. dado que esta última resulta menos costosa en reactivos y tiempo y requiere menos cantidad de material vegetal para realizar el análisis. por la PCR en tiempo real o «real time PCR». Finalmente. Cabe aclarar que para realizar experimentos de invernáculo y de campo es necesario contar con autorización de la Comisión Nacional Asesora de Biotecnología Agropecuaria (CONABIA) (ver IX. es conveniente confirmar la estabilidad meiótica de los transgenes estudiando su transmisión sexual a la generación siguiente. Todas ellas se basan en un proceso denominado silenciamiento génico post-transcripcional. . La ausencia de una banda es indicativo de la inserción de una copia truncada de uno de los genes por lo que se pierde el sitio de corte. la intensidad de la señal variará entre las distintas plantas analizadas de acuerdo con el número de copias del mismo (4-f). 3 Aporte de la transformación genética a la variabilidad genética Como ya se mencionó. Para lograr la inhibición de la expresión génica se pueden usar diferentes técnicas: cosupresión. esta técnica ha sido reemplazada en gran medida. se deben utilizar enzimas de restricción con sitios flanqueantes del transgen y como sonda. en los últimos años.dor. el comportamiento de los individuos transgénicos se estudia en laboratorio. c) La expresión de secuencias codificantes presentes en el genoma pero bajo el control de nuevas secuencias regulatorias que modifican su nivel o patrón de expresión (ejemplo: proteínas relacionadas a la patogénesis). Para estimar el número de copias del transgen en un locus transgénico. d)La inhibición de la expresión de genes residentes en el genoma . sea por ensayos bioquímicos o por bioensayos. el transgen. sin embargo. Se observará una sola banda del tamaño del transgen. Así. pueden ser analizadas con estas técnicas inmunológicas a fin de determinar la presencia de la proteína codificada por el transgen. Esta determinación no es del todo precisa ya que existe mucha variabilidad en los resultados debido a diferencias en la digestión de las muestras y a la degradación que sufre el ADN. La RT-PCR presenta algunas ventajas frente al Northern blotting: se requiere poca cantidad de material. a fin de interpretar correctamente el fenotipo de la planta obtenida. . invernáculo y campo.

Además. para silenciar genes en plantas.M. Los métodos presentados en las secciones precedentes tienen como blanco de transformación al genoma nuclear. se observó que el uso de un intrón como secuencia espaciadora. No se observa efecto de posición debido a que la integración del transgen está dirigida a un sitio particular del plastoma. cuando esta secuencia se transcribe genera ARN que hibrida con el ARNm formando una hebra doble que bloquea la traducción. 2003).. La cosupresión consiste en la obtención de plantas transgénicas que expresan un transgen homólogo del gen residente que se desea silenciar. M. 4 Obtención de plantas transplastómicas Las células vegetales contienen tres genomas: el nuclear. Así. R. ZAPPACOSTA. Como resultado de este mecanismo las células transformadas producirán poco o ningún producto proteico. Para las especies que tienen transmisión materna de los plástidos (la mayoría)... 2004). se ha demostrado que estas organelas pueden procesar proteínas eucariotas permitiendo su correcto plegamiento y la formación de puentes disulfuro gracias a la presencia de proteínas 120 DÍAZ. Es posible expresar un transgen ‘operón’ con varias secuencias codificantes bajo el control de un mismo promotor. El transgen consta de la secuencia codificante del gen cuya expresión se desea alterar pero con la orientación invertida. La técnica del ARN antisentido involucra la síntesis de moléculas de ARN que son complementarias al ARNm producido por la transcripción del gen que se quiere silenciar. A pesar de la naturaleza eminentemente procariota del sistema genético de los plástidos. RÍOs.L. y por ello la más utilizada. No se observa silenciamiento de transgenes. La interferencia del ARN es parte de un mecanismo regulatorio natural de la expresión génica que es actualmente muy estudiado y es la metodología más eficiente.por un gen determinado. P. D. Este tipo de construcciones se denominan ARN «hairpin». FRANZONE. Otra posibilidad es utilizarla para la obtención de plantas transgénicas mejoradas mediante la inactivación de genes endógenos cuya expre- sión es indeseada (Kusaba. La técnica se basa en la construcción de transgenes cuyo producto final es un ARN. Sin embargo. Se minimiza la dispersión de los transgenes por el polen debido a la ausencia de transmisión de los plástidos por el mismo. Esta técnica ha sido utilizada para obtener variedad de tomates (FlavrSavrä) la que mantiene su firmeza durante mas tiempo luego de la cosecha debido a que la enzima responsable de la rotura de la pared celular. Una interesante aplicación de interés agronómico de esta tecnología fue la obtención de plantas transgénicas de café que no contienen cafeína. cuando este tipo de transgen se transcribe en la planta se genera un ARN de doble cadena que dispara el mecanismo de degradación dependiente de la secuencia antes mencionado (Agrawal et al. 5. 2. 4. . en los últimos años la obtención de plantas transplastómicas ha recibido notable atención (Maliga. el plastídico y el mitocondrial. se expresa en un 10% del nivel normal. Cabe notar que el nivel de acumulación observado a partir de transgenes nucleares es generalmente inferior al 1%. Esto hace que no sea necesario obtener una gran población de transformantes. la polygalacturonidasa. 2002).. 6. El uso de una secuencia espaciadora entre las repeticiones confiere a las construcciones mayor estabilidad durante las manipulaciones en bacterias.C. Este contiene parte de la secuencia transcripta del gen a silenciar en forma de repetición invertida. Esta metodología es una herramienta muy valiosa para los proyectos de genómica funcional para poner en evidencia la función de genes clonados mediante su inactivación. el genoma de los plástidos (plastoma) se ha convertido en un blanco atractivo para la ingeniería genética ya que esta tecnología ofrece una serie de ventajas sobre la transformación del genoma nuclear: 1. Como consecuencia de esta estructura . produce un silenciamiento más eficiente en la planta. Se pueden obtener altos niveles de expresión de los transgenes y elevados niveles de acumulación de las proteínas codificadas por ellos (hasta el 47% de las proteínas solubles totales). a diferencia de lo que actualmente ocurre con las plantas transgénicas nucleares.D. 3.

la eliminación de alergenos. La disponibilidad de esta tecnología permitió importantes avances en el área del conocimiento de la biología vegetal. un eficiente proceso de cultivo y selección in vitro. y sistemas enzimáticos Los protocolos existentes para la obtención de plantas transplastómicas se basan en la transferencia de genes por el método biolístico. tolerancia a glifosato). la integración dirigida de los transgenes en el plastoma se realiza mediante recombinación homóloga. Los caracteres modificados que presentaron estos cultivos fueron resistencia a herbicidas (75%). Es destacable la rápida adopción que tuvieron estos productos. de los primeros cultivares transgénicos. maíz (resistencia a lepidópteros. la existencia de secuencias altamente conservadas en el plastoma de varias especies es explotada para el diseño de vectores universales. Esta aplicación se conoce como «molecular farming» (producción de moléculas en la granja) y presenta numerosas ventajas para la producción en gran escala de estas proteínas en particular en lo que respecta a costos. Pesca y Alimentos. los vectores contienen los transgenes de interés flanqueados por secuencias con alta homología al ADN plastídico. a partir de 1995. vitaminas y minerales). cuya transcripción tiene características típicamente procarióticas. el agua y la energía. anticuerpos y otras proteínas de uso terapéutico o industrial. http:// www. resistencia a insectos (17%) o una combinación de ambos (8%). En este contexto. Los cultivos transgénicos actuales corresponden a lo que se denomina «la primera generación» que tiene por objetivo el aumento de la productividad de los cultivos. 5 Importancia y aplicaciones de las plantas transgénicas Las primeras plantas transgénicas experimentales fueron obtenidas a mediados de los años 80. República Argentina. La CONABIA (ver en la página de la Secretaría de Agricultura. Así en el 2002 se cultivaron en el mundo 58. potencialmente útiles en la transformación de los cloroplastos de numerosas especies. En los últimos 10 años.ar/). ha autorizado desde el año 1991. Para lograr esto. 520 solicitudes para liberaciones a campo. en distintas especies y con diferentes eventos de transformación. 1997) y el gran esfuerzo realizado en este sentido tuvo como consecuencia la llegada al mercado. Se considera que ‘la segunda generación’ de cultivos transgénicos tendrá más beneficios directos para los consumidores. la fitoremediación (es decir la recuperación de ambientes contaminados mediante el uso de plantas) y la utilización de plantas como bioreactores para la expresión de proteínas recombinantes con fines tales como la producción de vacunas comestibles. la reducción de la contaminación del ambiente y los beneficios para la salud humana derivados de estos aspectos. la reducción en el uso de agroquímicos.7 millones de hectáreas con plantas transgénicas. aceite. A diferencia de lo que ocurre en la transformación del genoma nuclear. la conservación de la tierra arable. Canadá y China) mientras que el 1% restante se distribuyó en 12 países. Por otra parte. Esta superficie estuvo ocupada prácticamente por 4 cultivos: soja (62%). algodón (12%) y canola (5%). El 99% de este área global se cultivó en 4 países (USA. La expresión exclusivamente plastídica de los transgenes queda asegurada a través de la utilización de promotores específicos del cloroplasto. Argentina.mecon. se han desarrollado varios sistemas de expresión basados en plantas y en la ac- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 121 . y la utilización de vectores con secuencias homólogas al genoma del cloroplasto. Sin embargo aún quedan algunos aspectos que limitan su potencial como biorreactores como son la calidad y homogeneidad del producto final.sagpya. tolerancia a glufosinato de amonio) y algodón (resistencia a lepidópteros. practicidad y seguridad. En la Argentina los eventos con autorización de comercialización son los siguientes: soja (tolerancia a glifosato).gov. se constituyó en una herramienta disponible para el mejoramiento genético vegetal (ver aspectos para esta aplicación en Birch. Estos comprenden el mejoramiento de la calidad nutricional (proteínas. La homología entre el ADN del vector y del ADN del cloroplasto determina la potencialidad del plásmido para ser utilizado en la transformación genética del plastoma. maíz (21%). Ganadería.chaperonas endógenos.

6 Perspectivas La continuidad en el desarrollo de tecnología de transferencia de genes en plantas es importante tanto para ampliar el rango de especies a transformar como el de genotipos dentro de cada especie. transporte y estabilidad de los transcriptos y su traducibilidad. el uso de genes de resistencia a herbicidas puede ser inconveniente... continúa el interés en extender el uso de la transformación mediada por A. Por ello.C. 2003). La expresión de los genes nucleares eucarióticos está controlada en varios niveles que involucran la transcripción propiamente dicha. se desarrolló un método eficiente y reproducible de transformación in planta para Arabidopsis thaliana. Del análisis comparativo de métodos presentado cabe destacar dos aspectos actualmente en desarrollo. En los últimos años se nota un creciente interés en el control del nivel de expresión de transgenes así como de su regulación espacial y temporal. D. los métodos de transformación genética actualmente en uso re- quieren de genotipos con una excelente respuesta al cultivo in vitro.M. ZAPPACOSTA. modificación y compartimentalización del producto proteico final. Un ejemplo destacable es el ‘arroz dorado’. el procesamiento. se está tratando de reducir y si es posible evitar la fase de cultivo in vitro durante el proceso de transformación. M. tumefaciens de modo que los tejidos y órganos reproductivos sean invadidos por la bacteria. requiere de la integración de múltiples transgenes y de la expresión coordinada de los mismos en la planta transgénica. Por otro lado. de modo de diseñar protocolos de transferencia que minimicen las posibilidades de silenciamiento génico. Por un lado. En este contexto. etc. los que generalmente no poseen esta característica. la manipulación de la floración. el mejoramiento de la eficiencia fotosintética. tumefaciens a especies que no son hospedantes naturales de la bacteria. son hemicigotas y se demostró que esta metodología produce la transformación de la gameta femenina. Las plantas transgénicas que se obtienen por autofecundación de las plantas así transformadas. Por otra parte. así como la estabilidad.L. P. 2002). Así. generándose un estrecho vínculo entre la agricultura y muchas ramas de la industria. Posteriormente se propuso una simplificación de este método que consiste en reemplazar el tratamiento de vacío y sumergir la inflorescencia en una suspensión bacteriana que incluye un surfactante. llamado así por la pigmentación amarilla que tienen sus granos debido a que acumula altos niveles de provitamina A en el endosperma. Este tema está recibiendo notable atención (ver revisión de François y col. Este consiste en infiltrar con vacío plantas adultas de esta especie.D. como fuera anteriormente mencionado. ‘La tercera generación’ de cultivos transgénicos se basará en la información producida por los proyectos genómicos y tendrá por objeto aspectos tales como la modificación de la arquitectura de la planta. lo que permitirá ampliar el rango de genotipos a los cuales se podrá aplicar esta moderna tecnología.. El logro de determinados objetivos como puede ser el redireccionamiento de una ruta metabólica o la modificación de un carácter complejo de interés agronómico como por ejemplo la resistencia durable a enfermedades fúngicas. es necesario aprovechar la experiencia acumulada en cuanto a la expresión de transgenes. está recibiendo notable atención el estudio de la recombinación homóloga como mecanismo para la transformación del genoma nuclear (ver revisión de Hanin y Paszkowski.. Los métodos de transformación que hemos descripto se basan en la utilización de genes marcadores seleccionables. Por otra parte. desde un punto de vista experimental puede ser necesario transformar una misma planta varias veces con distintos trans- 122 DÍAZ. con una suspensión de A. lo cual resulta en una clara limitación cuando se desea aplicar esta tecnología a los materiales usados por los mejoradores. Sin embargo. Hay un manifiesto rechazo por parte del público con respecto a la utilización de genes de resistencia antibióticos y en determinadas situaciones. R.tualidad se producen más de 100 proteínas recombinantes en diferentes especies vegetales. RÍOs. hay razones por las cuales la presencia del marcador no es deseable en plantas transgénicas que se liberan al ambiente. la manipulación de la heterosis y la apomixis. FRANZONE. .

en su mayoría resistentes a herbicidas nos permiten ganar experiencia y acumular el conocimiento necesario para desarrollar nuevas y mejores generaciones de productos. R. A. R. Plant Physiol. «Plant transformation: Problems and strategies for practical applications». FRALEY. BHATNAGAR.genes y con la metodología convencional no hay más que un número limitado de genes marcadores disponibles. FRANÇOIS. TiBTech. «Marker-free transgenic plants». Plant Cell. Una posibilidad para ello es cotransformar. Annu. Approaches to evaluating the transgenic status of transformed plants.. KLEIN. I. La estrategia que ha recibido más esfuerzo hasta ahora. las plantas transgénicas actualmente cultivadas comercialmente. Rev. Otra opción dentro de esta línea es la utilización del sistema de recombinación sitio-específica de origen viral Cre/lox. 51: 223-256. Annu.. 2002. HOFFMAN. DASARADHI.»High velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells».. ROGERS... B. Microbiology and Molecular Biology Reviews Dec. 2000. BROEKAERT. 7 Lecturas recomendadas AGRAWAL... S. «Inheritance of functional foreign genes in plants». P. SANDERS. 1997. La idea subyacente es incrementar la frecuencia de transformación a través del uso de genes que promuevan la regeneración.. Science 223: 496-498. Biol. N. Por ello se consideran estrategias alternativas para la obtención de plantas transgénicas libres de marcadores (Puchta... W. Nature 327: 70-73. J. 1987. Mechanism . . 2004. «Different approaches for multi-transgene-stacking in plants». «RNA interference in crop plants» Current Opinion in Biotechnology 15: 1-5. GELVIN S. Finalmente. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 123 . P. Tissue and Organ Culture 74: 123-134. 2003). LLOYD. 1997. Sin embargo. BIRCH R. and Applications». Más recientemente se ha propuesto como estrategia alternativa el desarrollo de métodos de transformación que no usen marcadores seleccionables. V. REGISTER J. y MUKHERJEE. R.Biol. J. SANFORD. T. plantea la remoción vía cruzamiento sexual del marcador seleccionable luego de haber obtenido la planta transgénica. 2002. esta puede ser una alternativa poco atractiva en circunstancias particulares como cuando no se dispone de un protocolo eficiente de cotransfor-mación o cuando no se desea reproducir sexualmente la planta transgénica. «Engineering the plastid genome of higher plants».. KUSABA. 15:141-6.Plant Physiol. MALHOTRA. H. 657-685. Plant Science 63: 281-295. PUCHTA. N. Rev. p. esto implica que el transgen de interés y el marcador seleccionable estén presentes en vectores distintos y que posteriormente se separen los genes por segregación luego de la reproducción sexual. 2003 «RNA Interference: Biology. HORSCH. M. P. S.. 2003. WU. «Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA transfer and integration». 48: 297-326. Plant Mol.. WOLF. «Plant genome modification by homologous recombination». MALIGA. M. HANIN. 1984. CAMMUE. PASZKOWSKI. 2003. Plant Mol. Current Opinion in Plant Biology 5: 164172. MOHAMMED. R.. E.. A. 2003. Current Opinion in Plant Biology 6: 157-162.

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Esto ocurre en el saco embrionario. Otras veces. rustica. difieren en otros. pero el embrión no puede alcanzar la madurez debido a una ruptura del equilibrio entre el mismo y el endosperma o por anomalías en el desarrollo embrionario que impiden una nutrición normal. que pueden contrarrestarse con el rescate de los embriones y su posterior crecimiento en un medio nutritivo adecuado. refiriéndose a la unión de las gametas masculina y femenina para originar un nuevo individuo. Aurora. En ocasiones. Esto se debió a que la fertilización in vitro de las gametas aisladas de plantas superiores es un proceso muy diferente al que ocurre in vivo. generan menos semillas que el número de óvulos disponibles para la fecundación. A veces la fertilización ocurre normalmente. En todos los casos la gameta femenina es fecundada por células espermáticas liberadas por el tubo polínico. y los frutos. la misma se desorganiza y uno de los núcleos espermáticos se fusiona con la oósfera para dar el cigoto. se vuelcan en una de las sinérgidas. y también lo es de los sistemas animales y de las plantas inferiores. Esta técnica desarrollada en Papaver somniferum. Considerando que la producción de polen no es el factor limitante. la «polinización placental in vitro » y la «polinización estigmática in vitro». donde las gametas son de vida libre. que se halla profusamente cubierto por el tejido materno. en 1962. Bajo el nombre de «polinización in vitro» se suele englobar a varias técnicas que si bien poseen puntos en común. Nicotiana tabacum. que luego producirá el embrión. Cardone. las técnicas de cultivo in vitro y manipulación de células aisladas son apropiadas para lograr el proceso completo de desarrollo del embrión y del endosperma y la obtención de semillas normales. Durante la fertilización. En cualquiera de estas circunstancias. Petunia violacea.III. a su vez. N. Sin embargo. el tubo polínico llega hasta el aparato ovular. Los núcleos espermáticos se encuentran dentro de los granos de polen o tubos polínicos. que es un proceso muy complejo en comparación con lo que acontece en todos los demás seres vivos. El término «fertilización in vitro» se utiliza para aquellos casos donde la fusión de las gametas aisladas se logra por distintos métodos como electrofusión. estos métodos no pudieron ser aplicados a las plantas superiores hasta comienzos de la década de los noventa. quienes demostraron que en algunas especies de papaveráceas los granos de polen tenían la capacidad de germinar in vitro directamente sobre los óvulos en cultivo. ha sido luego empleada en varias especies de plantas como Dianthus caryophyllus. alta concentración de calcio o elevado pH. la fecundación no puede llevarse a cabo. existen diferentes razones que explican esta situación. Las dos células espermáticas contenidas en el tubo. Eschechlozia californica. Picca. en forma «casi» idéntica a la vía natural. Esto es lo que se conoce como barreras posfertilización o poscigóticas .-Capítulo 4 Polinización y fertilización in vitro. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 125 . 2 Fertilización in vitro Durante años. con la consiguiente formación de semilla normal en el mismo medio de cultivo. Antirrhinum majus y Dicranostigma franchetianum. La técnica de fertilización o polinización ovular in vitro fue desarrollada por Kanta et al. los científicos utilizaron técnicas de fertilización in vitro de gametas aisladas tanto en animales como en plantas inferiores. desorganizándose entonces el núcleo vegetativo. Entre ellas se pueden citar la «polinización in vitro de óvulos». Argemone mexicana. la fecundación ocurre normalmente pero el embrión aborta en forma precoz. El hecho más notable de la fertilización in vivo de las angiospermas es el de la «doble fecundación». En estas condiciones el tubo polínico alcanzaba el saco embrionario para concretar la fertilización. a pesar de la ocurrencia de la polinización. Susana 1 Introducción Muchas plantas con flores producen menos frutos maduros que flores. En este capítulo se utilizarán indistintamente los términos «fecundación» y «fertilización» como sinónimos.

trigo ( Triticum cas posibilitaron la fertilización in vitro. Aurora. dando como resultado un cigoto. tiles en cultivo. CARDONE.ellas maíz ( Zea mays ). los gametos La fusión del núcleo de la célula espermática puede ocurrir con uno de los dos núNúcleos polares cleos polares o con los núSaco embrionario recibiendo al segundo cleos secundarios y se comSaco embrionario gameto pleta aproximadamente dos horas después de la fusión in Sinérgida que vitro de las células. que induce a la expansión del ova- 126 PICCA. cebada ( Hordeum vulgare ).2.1 Aislamiento y selección de las las asociadas. un embrión y finalmente una planta madura.1999) posibilitaron el desarrollo de endosperma in vitro de maíz a partir de la fusión por pares de células espermáticas y núOósfera en fusión con uno de cleos secundarios aislados. b)Aislar las gametas masculinas a partir de la polinización in vivo desarrollan embriones normales y posteriormente plantas fér. Actualmente puede reproducirse in el proceso de manipulación es muy delicado. independientemente del gía floral de la especie a utilizar con el objetitejido materno. Estudios posteriores (1998.amplia variedad de especies vegetales entre nicas con métodos de cultivo de células úni. comenzando con la electrofusión de con 2. meninas y masculinas sino que deben ser inducidas a fusionarse en ausencia de las célu. La combinación de estas téc.4-D. Se aestivum ).den obtenerse pocas gametas femeninas y mente. vía embriogénesis cigótica. Los esturecibió el extremo dios in vitro sobre los primedel tubo polínico ros eventos después de la fusión de las células y núcleos indicaron que las primeras células del endosperma resultante desarrollan un tejiTubo polínico polínico Tubo do característico capaz de autoorganizarse en forma Figura 1: Corte longitudinal de un óvulo mostrando la doble fecundación en angiospermas.brasicáceas. Para que la fertilización tenga lugar in vitro no sólo deben aislarse las gametas fe- la célula espermática con la ovocélula. Susana . lo cual demuestra que cigotos a) Conocer exhaustivamente la morfoloy endosperma son capaces de autoorganizarse en cultivo. femeninas mediante microdisección individual Llevó tres años más regenerar plantas en asociación con maceración enzimática. separada del tejido materno. Los pasos a seguir son los siguientes: vidual in vitro. pudo concretar de esta manera el desarrollo raygrass ( Lolium perenne ) y algunas de cigotos y de endospermas en forma indi. c) Aislar el saco embrionario y las gametas En 1989 se fusionaron por primera vez gametas aisladas de maíz in vitro (Zea mays). vitro el ciclo completo de vida de una planta El tratamiento de las espigas no polinizadas superior. Tanto los cigotos obtenidos vo de ubicar el saco embrionario y sus células in vitro como los que son aislados después constituyentes.de los granos de polen mediante choque osmótico y/o de pH. a Este paso es crítico y limitante ya que puepartir de esos cigotos cultivados individual. híbridas fértiles. 1). Las técnicas de micromani.El otro núcleo masculino se reunirá con dos núcleos femeninos secundarios para dar la célula madre del endosperma triploide (Fig.gametas pulación desarrolladas durante los años 80 Se han desarrollado métodos de aislapermitieron el aislamiento y la fusión in vitro de gametas femeninas y masculinas de miento y selección de gametas para una angiospermas.

La adhesión y posterior fusión de las gametas es rápida (aproximadamente 10 segundos). fueron realizados en maíz. Las gametas femeninas y masculinas aisladas se colocan de a pares. de manera similar a lo que se observa in vivo. En promedio. algunos de los cuales datan de 1994. señales intracelulares. donde las gametas masculinas se obtienen a partir de granos de polen fresco sometidos a un shock de pH en una solución 0. El uso de microagujas de vidrio permite poner en contacto las gametas femeninas y masculinas a fin de facilitar y dirigir la fusión.Figura 2: Fertilización in vitro mediante electrofusión. Los productos de fusión pueden ser entonces cultivados en una solución con células nodrizas y algunos de ellos desarrollarán en proembriones.) obteniendo como resultado estructuras multicelulares y en algunos casos del tipo de microcallos. Algunas de estas barreras de prefertilización o precigóticas se deben a: Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 127 . Fertilización in vitro propiamente dicha. bajo condiciones de esterilidad. Los recientes progresos relacionados a los sistemas de fertilización in vitro así como los proyectos de genómica posibilitarán una mejor comprensión de los procesos de reconocimiento gamético. 2. resultando en ovarios más grandes y óvulos más blandos. eventos tempranos de activación del huevo y formación del cigoto. En este último caso las gametas se ponen en contacto en una cámara de electrofusión por alineación dielectroforética y se fusionan mediante pulsos eléctricos. A los 20 minutos de realizada la fusión. fusión. la frecuencia de fusión suele ser del 30%. Las ovocélulas y los protoplastos de las células centrales se aislan de óvulos por tratamiento con enzimas celulolíticas y microdisección manual. Esta puede ser realizada mediante la microinyección de células espermáticas o núcleos espermáticos aislados en células individuales obtenidas de los sacos embrionarios o por electrofusión (Fig. 2).2 Fusión de las gametas Muchos de estos estudios. incrementando la eficiencia en el aislamiento de las ovocélulas. Pese a que se ha tomado al maíz (Zea mays L) como sistema vegetal modelo en el cual estudiar los procesos de fusión de gametas y posterior embriogénesis. también se han realizado trabajos exitosos de fusión de gametas en trigo (Triticum aestivum L. deja de visualizarse el núcleo masculino y 20 horas después es posible visualizar mediante contraste de fases la presencia de dos núcleos.5 M de manitol. facilita el proceso. pero bajo condiciones óptimas es posible alcanzar frecuencias superiores al 55%. En 1995 se logró la fertilización exitosa de trigo a través de la electrofusión de ovocélulas con células espermáticas. en un medio de fusión simple compuesto por manitol y cloruro de calcio (CaCl2). rio. 3 Polinización in vitro En muchos casos el polen no puede germinar sobre el estigma de la propia flor aunque éste se halle receptivo. Este hecho puede deberse a barreras genéticas o fisiológicas. Dos días después de la fusión eléctrica aproximadamente el 60% de los productos de fusión comenzó a dividirse y cerca del 90% de ellos formó estructuras multicelulares y en unos pocos casos microcallos.

las posibilidades de un rápido desarrollo embrionario. altamente hidratada.La polinización estigmática. dehiscencia de las anteras y polinización. Entre estas técnicas se encuentran: . . b)Precisar el momento en que el estigma esté receptivo c) Especificar el momento adecuado para la polinización. en algunos cruzamientos interespecíficos como los realizados en papa. fijados tres días después de la polinización con polen de Pinus wallihiana. .La polinización placental. Este estudio consiste en: a) Determinar los tiempos de antesis. Aurora. Para que las técnicas sean exitosas es crucial realizar el aislamiento de los óvulos y del polen en el estado fisiológico adecuado. en el cual los granos de polen germinan en un estilo compatible y luego se los une al ovario de la planta madre que se desea fertilizar. tenga lugar la fertilización. muy pequeña. reveló la presencia de remanentes de tubos polínicos y embriones de 2-células en los sacos embrionarios. El rescate de embriones consiste en aislar los embriones de los óvulos de una planta y cultivarlos en un medio estéril que contenga los nutrientes esenciales que les permita concluir su desarrollo normal y germinar. por lo que es indispensable realizar un estudio de la duración de los distintos estadios del desarrollo de ambos. se comprobó que el cultivo de óvulos completos es más exitoso para el rescate de embriones que el cultivo de los embriones aislados. el ovario aborta antes de que el tubo polínico alcance la base del estilo o sin que la alcance en absoluto c) el hecho que el tubo polínico se deshaga en el estilo. El cultivo de óvulos aislados (separados de su placenta) es un procedimiento mucho más complicado y que ha sido empleado con éxito sólo en pocas especies de plantas. . En estos casos. En la polinización placental in vitro los porcentajes de supervivencia son muy buenos. Esta técnica es relativamente fácil de llevar a cabo en embriones maduros y sus posibilidades de éxito son muy buenas. 4 Cultivo de óvulos y embriones in vitro El cultivo de óvulos es un procedimiento muy complejo debido a que la manipulación del material es difícil. Las dificultades incrementan cuanto más inmaduro sea el 128 PICCA. donde los óvulos se ponen en contacto con el polen a través de un corte en la parte superior del ovario o quedan directamente expuestos por remoción de la pared del ovario. No obstante.La polinización de óvulos aislados que se cultivan directamente sobre el medio de cultivo. ya que los óvulos no resultan dañados durante las manipulaciones involucradas en su aislamiento. que puede ser dañada con suma facilidad. en general.a) la incapacidad del polen de germinar en estigmas extraños b)la incapacidad del tubo polínico para alcanzar el óvulo debido a una lenta velocidad de crecimiento o a una excesiva longitud del estilo. El cultivo junto con la placenta incrementa.El injerto del estilo. Pese a las dificultades de la técnica. CARDONE. El análisis embriológico de los óvulos de Melandrium album. con el tiempo se desarrollaron varias técnicas de polinización in vitro más sofisticadas ampliando con esto las posibilidades de aplicación. Susana . d)Establecer el tiempo adecuado para recoger el polen. resultando más adecuada su aplicación en aquellas especies que poseen ovarios grandes y que contienen muchos óvulos. La polinización in vitro de óvulos con el desarrollo posterior de embriones ha sido exitosa en 14 familias de Angiospermas. que consiste en cultivar el pistilo in vitro y colocar el polen sobre el estigma. El óvulo es una estructura delicada. y que después de la polinización. algodón y Hevea brasiliensis. Es de esperar que en todos estos casos el polen germine en pocas horas. Es imprescindible realizar la microcirugía con rapidez para evitar que los tejidos sufran desecación durante el proceso. Experimentalmente se intentó la polinización in vitro de óvulos de varias especies de angiospermas con polen proveniente de varias especies de gimnospermas.

y la fase autotrófica. Aunque algunos estudios indican Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 129 . Entre los medios de cultivo más difundidos podemos citar el de Murashige & Skoog.superar problemas de abscisión precoz del fruto .recuperar embriones de cruzas interespecíficas que conducen a la obtención de haploides . los embriones necesitan ser transferidos a medios con progresivas disminuciones en los niveles de sacarosa. etcétera. El cultivo de óvulos y de embriones vegetales se emplea en mejoramiento vegetal cuando se desea: ..rescatar embriones abortivos derivados de la hibridación interespecífica o intergenérica . dependiendo del estado de madurez de los mismos. evitando así la ocurrencia de malformaciones estructurales. que varían con el estadio de desarrollo del mismo y que es necesario identificar para cada especie en particular. fuera de su rol en la ruptura de la dormición. No existe demasiada evidencia acerca de la absoluta necesidad de los reguladores de crecimiento para el desarrollo de los embriones extraídos. 4. Randolph & Cox. El óvulo presenta una gran cantidad de requerimientos nutricionales. en el endosperma o en la cubierta de la misma. Está demostrado que una presión osmótica elevada previene la germinación precoz de los embriones inmaduros. Este cambio de requerimientos nutricionales hace que. Un aspecto fundamental a tener en cuen- ta en el rescate de embriones es la selección correcta de un medio de cultivo que pueda soportar los cambios progresivos de requerimientos durante las distintas etapas del desarrollo embrionario. Liu y col. A medida que van creciendo.sortear algunas de las barreras de autoincompatibilidad . Es importante además obtener un medio de cultivo adecuado para favorecer la germinación de los granos de polen y permitir el desarrollo de los óvulos fertilizados hasta semillas maduras. La concentración osmótica es un factor importante en el desarrollo de óvulos y embriones. sea imprescindible la transferencia de los embriones de un medio de cultivo a otro para garantizar un óptimo crecimiento. activando el crecimiento y desarrollo de los embriones en el cultivo de óvulos de algunas especies vegetales. la osmolaridad y los reguladores de crecimiento. La etapa crítica de pasaje de una fase a otra varía con las especies. en la cual el embrión es capaz de sintetizar las sustancias requeridas para su crecimiento a partir de sales minerales y azúcares. Monnier. ya que los requerimientos nutricionales son más específicos en las etapas tempranas de desarrollo del embrión. Se pueden reconocer dos fases en el desarrollo embrionario con respecto a la nutrición: la fase heterotrófica en la que el embrión es dependiente del endosperma y demás tejidos maternos que lo rodean. Gamborg.acortar el período de latencia que ocurre en algunas semillas por presentarse inhibidores del desarrollo del embrión. El cultivo de embriones ha ayudado también al mejoramiento genético de especies leñosas que tienen dificultad en la germinación de sus semillas como en Taxus mairei o con escasa producción de semillas como es el caso de Pseudotsuga macrolepis y constituye una herramienta interesante en estudios básicos de biología reproductiva ya que permite analizar la embriogénesis in vitro. En general. Los embriones de la mayoría de las especies presentan un buen crecimiento en un rango de temperaturas que va de los 25ºC a los 30ºC. todos los medios de cultivo para germinación de los granos de polen poseen altas concentraciones de sacarosa y de ácido bórico. cuando crecen in vitro. La sacarosa presente en los medios de cultivo no sólo provee la fuente de carbono necesaria para el crecimiento sino que además mantiene la osmolaridad requerida para cada etapa del desarrollo.embrión a rescatar. sean inmaduros o maduros. El agua de coco y los extractos de endospermas han sido muy útiles.1 Factores externos que condicionan el cultivo de óvulos y de embriones Entre los factores externos más importantes que afectan el cultivo de óvulos y de embriones se citan el medio de cultivo.

es necesario rescatar los óvulos recién fecundados. con un alto grado de fertilidad. la selección de polen a baja temperatura tuvo un efecto positivo en el crecimiento de la progenie en condiciones de frío. acelerando así la obtención de plantas resistentes. desarrollado entre CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical. cruzando el centeno con trigos duros y harineros. lamarckiana. M. hybridum. trigo y tabaco. donde se cultivan embriones que se forman por partenogénesis o por eliminación de cromosomas luego de la hibridación interespecífica o intergenérica. También se emplea el cultivo de embriones en casos en que el endosperma no se desarrolla normalmente. mexicana . 5 Aplicaciones La polinización placental in vitro puede ser empleada para superar las barreras de autoincompatibilidad e incompatibilidad cruzada. con sede en Colombia) y IITA (Instituto Internacional de Agricultura Tropical. biennis x O. En algunas combinaciones de cruzamientos. CARDONE. como en Oenothera biennis x O. Otras veces es necesario esperar a obtener las plantas para determinar el nivel de ploidía. Los granos de polen de plantas autoincompatibles son capaces de germinar directamente sobre los óvulos y llevar a cabo el proceso completo de la reproducción sexual. para superar el alto grado de incompatibilidad del cruzamiento inicial y la marcada esterilidad que poseía la F1. muricata o O. En Brassica rapa. En un proyecto de mapeo de genes con resistencia al virus del mosaico en yuca. Aurora. obteniéndose embriones híbridos y aun plantas híbridas imposibles de obtener mediante técnicas convencionales. Album x Silene schafta. en este caso térmico. Los embriones haploides en algunos casos se distinguen morfológicamente de los normales. como en la producción artificial del triticale. Esta técnica también es de utilidad para sortear barreras de dormición o en casos donde la viabilidad de la semilla es baja. Se podría entonces seleccionar para la fecundación aquellos granos de polen que hayan sido capaces de germinar bajo condiciones de estreses ambientales. Esta técnica se ha utilizado con éxito en cebada. como sucede en los cruzamientos de cultivares diploides y tetraploides de Citrus. Susana . Dentro de las aplicaciones del cultivo de embriones está la del rescate de embriones para la producción de plantas haploides. ya que permite seleccionar para la fecundación aquellos granos de polen que tuvieron capacidad de germinar bajo diferentes condiciones de estrés. Nicotiana tabacum x N.-1). como en yuca y otras especies del género Manihot. El cultivo in vitro de embriones es una alternativa para el intercambio de semilla a través de fronteras internacionales. o cuando el mismo se desintegra después de la fecundación. La polinización in vitro con polen obtenido de plantas de maíz creciendo a temperaturas elevadas condujo a la obtención de plantas tolerantes a estrés por calor. Precisamente fue en este caso donde la técnica de cultivo de embriones junto con la aplicación de colchicina fueron de fundamental importancia en la transformación del triticale en cultivo comercial. como es el caso de Zea mays x Z. respectivamente. con sede en Nigeria) donde fue necesario trasladar «stocks» de semillas desde 130 PICCA. se demostró que en el caso de la cebada la luz disminuye las probabilidades de germinación precoz en los embriones inmaduros. etc. En aquellos cruzamientos en los que la barrera de incompatibilidad se encuentra a nivel del ovario como en Trifolium repens x T. la polinización directa de los óvulos permite que se superen las barreras de incompatibilidad precigótica. logrando acumular más peso seco que en progenies normales. El cultivo de embriones se utiliza también en el caso de plantas que sufren el aborto de los mismos en estadios tempranos del desarrollo debido a la incompatibilidad con el endosperma. de manera que se extraen y se los cultiva in vitro en medios y condiciones de cultivo adecuados (ver IV. El perfeccionamiento de estas dos metodologías fue decisiva para la producción de un gran número de triticales hexaploides y octoploides. Melandrium album x Viscaria vulgaris. amplexicaulis. La polinización placental in vitro también se emplea como vía para la obtención de plantas resistentes a estreses ambientales.que la luz no es crítica para el crecimiento de los embriones.

Los embriones somáticos constituyen una excelente herramienta para estudiar los procesos de desarrollo en plantas. el cultivo de embriones resultó ser un excelente método para transferir germoplasma con mínimos riesgos fitosanitarios.000 ARN. Malus domesticus . en contraestación. se acelera el proceso. Bajo esas condiciones el embrión no se diferencia de los embriones obtenidos in vivo. como aquellos de las proteínas de reserva de la semilla. El cultivo de embriones inmaduros ahorraría además el tiempo de maduración de la semilla. constituyendo excelentes herramientas para la transformación de plantas. etc. por ejemplo. sin embargo. Existen pocos explantos que poseen la capacidad de producir callos embriogénicos. anteras. Las inflorescencias y los embriones inmaduros se utilizan para este fin en los pastos y en los cereales. ya que facilitan el acceso a gran cantidad de embriones libres. se ha recurrido al uso de mutantes. que es una planta de genoma pequeño y ci- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 131 . en los embriones vegetales se encontraron unos 20. se ha inducido entonces con éxito la embriogénesis somática a partir de nucelas de óvulos jóvenes. En maíz también es posible cultivar los cigotos fertilizados in vivo dentro de sacos embrionarios parcialmente aislados. En su medio natural los embriones cigóticos ofrecen dificultades debido a su pequeño tamaño y al hecho de estar inmersos en el tejido materno. a un gran número de genes. Cultivo de nucelas. flores. Este es el caso de Citrus sp . entre las estrategias utilizadas para disminuir el tiempo necesario en la obtención de un nuevo cultivar. Los embriones vegetales son morfológicamente simples pero molecularmente complejos. 5. Si se consiguen realizar varias generaciones por año. como el gen inhibidor de la tripsina de Kunitz. el 10% de los ARN presentes en embriones en la fase media de maduración son únicos de aquel estadio. A diferencia de lo que ocurre en los embriones animales. Por ejemplo en soja se requieren unos diez años para este fin. Otro sistema que puede utilizarse en algunos experimentos básicos es la obtención de un embrión a partir de cigotos transgénicos o micromanipulados. pero en general se trata de genes expresados mayoritariamente. Estos ADNc resultaron ser marcadores útiles de la diferenciación celular. El organismo modelo en este caso es Arabidopsis thaliana. al igual que en el caso de animales. representando. En estas especies también permiten acortar el período de siembra a floración. donde los patrones de expresión génica se hacen más complejos a medida que progresa el desarrollo. La embriogénesis cigótica se dispara por la fertilización mientras que la somática lo hace a través del cultivo de tejidos. El estudio de los eventos moleculares que tienen lugar durante la embriogénesis temprana es actualmente uno de los campos principales de la biología vegetal. La expresión de este gen es uno de los primeros indicadores moleculares de polaridad en la transición del embrión globular a uno de simetría bilateral con forma de corazón. Vitis vinifera .. Muchos de estos genes específicos de estadio han sido clonados como ADNc. Para estudiar el desarrollo en plantas. En algodón. El cultivo de embriones inmaduros también puede ser aplicado como complemento del mejoramiento convencional. donde los ARN que son específicos de un estadio determinado constituyen una modesta fracción del total. raíces. número similar al encontrado en órganos más complejos como hojas. En las plantas leñosas los explantos de tejidos maduros pierden la capacidad de regeneración. Psidium guajava y Pyrus serotina.Sudamérica al continente africano. Para ello son importantes la fertilización in vitro de gametas aisladas y el cultivo de los productos de fusión hasta la obtención de una planta.1 El cultivo de óvulos y embriones y la embriogénesis somática para dilucidar aspectos básicos del desarrollo en plantas Las plantas parecen poseer un programa embriogénico específico preestablecido que puede dispararse en respuesta a condiciones específicas. cuyo ARN se acumula en el polo micropilar del embrión globular (por donde penetra el núcleo espermático al saco embrionario) antes de que sea evidente la diferenciación celular.

algunos investigadores han concluido que existen unos 4. Un gen embrionario muy importante es GN/EMB30. Embriones con ese genotipo en madres normales tienen un desarrollo normal (Fig. Calculando el número de mutantes letales embrionarios que se encontraron. Entre las mutaciones estudiadas se encuentran bio1 .4-diclorofenoxiacético (2. La disponibilidad de gran cantidad de embriones creciendo sincrónicamente en un medio líquido representa un buen sistema para estudiar los eventos genéticos involucrados en el desarrollo embrionario.000 genes expresándose durante la embriogénesis. Sin embargo. uno a lo largo del eje apical-basal y el otro a lo largo del eje radial. Otra mutación es raspberry. mente se requiere para la embriogénesis o si los defectos observados se deben a las limitaciones impuestas por los defectos en el tejido materno. la remoción del ácido 2. donde la primera división celular es asimétrica. No se sabe si real- Preglobular Globular Embrión maduro Corazón Torpedo Figura 3: Estadíos de la embriogénesis de Arabidopsis thaliana. sólo el embrión. como ocurre en embriones normales. En el punto superior de esta compleja vía se encuentran genes reguladores principales («master regulators») y sólo de 40 a 50 genes que afectan el patrón embriogénico. Aurora. CARDONE. 3). que es letal y detiene la embriogénesis en el estadio de corazón temprano. Un gen materno encontrado en Arabidopsis es sin1 (short integument 1). Susana . No es un gen regulador principal y sus efectos se ven revertidos en presencia de biotina. En los mutantes las dos células resultantes no son diferentes. No se sabe si es un regulador principal y actúa muy temprano en el desarrollo. se han identificado pocos genes maternos que afecten el desarrollo en plantas y el hecho de que se puedan formar los embriones somáticos o que se puedan desarrollar embriones producto de la fertilización in vitro induciría a sospechar que los genes maternos no juegan un rol primordial. Los primeros estudios tendientes a identificar patrones de expresión génica relacionados con la embriogénesis somática fueron realizados en 1981. Este gen afecta la formación de óvulos.clo de vida muy corto. Ninguno de los mutantes encontrados fueron mutantes tempranos. Utilizando electroforesis bidimensional se encontra- 132 PICCA. Estos mutantes quedan bloqueados en el estado globular y poseen protuberancias en las células externas lo que le da el aspecto de una frutilla. En algunos se encuentran inhibidos el desarrollo del embrión y el endosperma. durante la primera división celular del cigoto.4-D) genera un respuesta embriogénica por la cual los agregados celulares forman embriones que crecen de a millares en un medio líquido. letales embrionarios y con alteraciones en el patrón de desarrollo. el tiempo de floración y el desarrollo embrionario. Una importante conclusión a la que permitieron arribar estos mutantes es que el embrión de Arabidopsis está constituido por el ensamblaje de dos patrones superpuestos. Los embriones provenientes de madres sin1/sin 1 tienen grandes defectos morfogenéticos. Se han detectado dos tipos de mutantes. El sistema mejor estudiado en relación con la embriogénesis somática es el de suspensiones celulares de zanahoria (Daucus carota). El bloqueo se presenta en un estadio anterior a la formación de órganos. En maíz también se han encontrado mutantes letales embrionarios. lo cual sugeriría un control de los primeros estadios del desarrollo embrionario por parte de genes maternos. como sucede en animales. En otros. En este sistema. lo cual la hace apta para estudios genéticos. momento en el que ya existe diferenciación celular.

E. V. Otra es que las constelaciones génicas involucradas en la embriogénesis somática podrían estar ya activadas en las células proliferando en cultivo. Molecular Genetics of Plant Development. Habría varias explicaciones para esta inconsistencia. 2: 5 – 9. Cambridge University Press. B.. DIGONNET. P. Protoplasma. Science. 1993. S. 6 Lecturas recomendadas BARNABAS. Vol 193. C. KRANZ. Iss 1-4. DRESSELHAUS. RAZDAN. FAURE... S. Elsevier. OSPINA. BARNABAS. Este efecto es revertido al colocar las células en un medio condicionado proveniente de suspensiones celulares normales. 15: 178-180.. pp 295-312.4-D. Otra es que la sincronización fuera sólo aparente. En Cultivo de tejidos en la Agricultura.) gametes develop into multicellular structures. 142. L.. que puede rescatar a estas líneas celulares mutantes a fin de que prosigan los procesos de embriogénesis somática.. Emerging data on pollen tube growth and fertilization in flowering plants. 3. 1995. Plant Science. C. H. particularmente en estadios tardíos y que estas diferencias enmascararan las diferencias entre estadios. MORGENSEN. DUMAS. In vitro fertilization with isolated higher plant gametes. Plant Cell Rep. DUMAS. Test-tube Plants as Tools for Crop Improvement. 1. Algunos estudios indicarían que muchos de los genes expresados en los embriones somáticos ya estarían haciéndolo en las masas proembriogénicas. E.. esta enzima puede hidrolizar un sustrato que se encuentra en las paredes celulares vegetales y liberar un compuesto indispensable para disparar la embriogénesis somática. C. FAURE. 1991. MAHESHWARI. S. DUMAS. K. El programa de eventos que tiene lugar durante la embriogénesis somática es muy elaborado como para estar regulado solamente por el 2. Zygotic embryo culture of Manihot esculenta Crantz : a practical approach for the safe internacional movement of cassava seed stocks. S. Hasta el momento no se ha encontrado cuál es la sustancia en células vegetales que produce este efecto. C18:4). KOVACS. aunque. M. La expresión de este gen está correlacionada con la aparición de células competentes en cultivos primarios derivados de explantos de hipocótilos. El compuesto responsable de la reversión resultó ser una endoquitinasa acídica.. 1998. PONYA. T. 1999. embryo and endosperm development in vitro. Plant Cell. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 133 . Fundamentos y Aplicaciones. pp 1598-1600. Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT). E. Roca y Mroginsky editores. 1996. La expresión continúa en las masas proembriogénicas y persiste hasta el estadio de embrión globular. Se encontró una línea celular (ts11) sensible a la temperatura (letal condicional) que en la temperatura restrictiva detiene su desarrollo en el estadio de corazón. 1998. Una es que los productos de genes individuales involucrados en el desarrollo embrionario no fueran muy abundantes como para ser detectados en las genotecas de ADNc. E. en virtud de lo expresado anteriormente. Test tube fertilization in a flowering plant. LITZ.. G. Uno de estos genes es el SERK que se expresa en células competentes. Nature 194:1214-1217. 1996. RANGASWAMY.. 1990-1995. Z. pp 183-197. Vol. Se conoce la secuencia de su ADNc y codificaría para una proteína receptora con repeticiones ricas en leucina del tipo proteína quinasa... KRANZ. VERDIER.. «Cultivo de embriones y óvulos». K. R. M. E. pp 132-143. Electrofused isolated wheat (Triticum aestivum L. Hungarian Agriculture Research.ron pocas diferencias entre patrones proteicos de embriones somáticos y células en proliferación. J. Vol 263. NodRlv-R (Ac. Aparentemente. GUEVARA. C. Nro. Gametes and fertilization: Maize as a model system for experimental embryogenesis in flowering plants. W.. J. BHOJWANI. Trends in plant science reviews. 1962. Tal sustrato no pudo ser identificado pero se encontró un lipoligosacárido de Rhizobium. Iss 2. B. ROUGIER. HOWELL. se esperaría un patrón más complejo. KANTA.. La perturbación causada por la deprivación de este regulador del crecimiento debe disparar una serie de eventos clave que involucran la acción de factores de crecimiento más específicos y fuerzas biofísicas que confieren información posicional y de desarrollo. D. pp 82-89. 1994. M. Vol. J. E. Plant Tissue Culture: Theory and Practice. a Revised Edition.. 1999. J. KUMLEHN. 1996. Plnat Genetic Resources Newsletter 115:33-38. C. Angiosperm fertilization. ALDON. 5: 13371348. An in Vitro System for Adhesion and Fusion of Maize Gametes. KRANZ. MAFLA.

L. 11: 357–359. Aurora. Plant Cell Reports.MOL. Z. New lights in early steps of in vitro fertilization in plants. Vol. pp 31-38. aestivum L. Susana . C. C. PONYA. pp 324329. F.. Embryogenesis and plant regeneration from maize zygotes by in vitro culture of fertilized embryo sacs. ANTOINE. 14: 743-747.. A. CARDONE. 41. Sex Plant Reprod. R.. Iss 6.. 1999. D. I. Sexual Plant Reproduction. 1996. M.. Morphological characterisation of wheat (T. SZABO. KRISTOF. 1999. M. ZENKTELER. 1995.. 134 PICCA. ALDON.. ROUGIER. E. Vol 9. DUMAS. DUMAS.. In vitro pollination of excised ovaries.) egg cell protoplast isolated from immature and overaged caryopses. TIMAR. Z. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica. MATTHYS-ROCHON.

PARTE IV Métodos para acelerar programas de mejoramiento e identificación varietal Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 135 .

CONTI.136 POLCI. Rubén . Pablo. Verónica. MIRANDA.

que por tener dos juegos cromosómicos (AA) no podrían ser incluidos en la definición. . Entre los casos de haploidía espontánea es común la poliembrionía.001 a 0. Algunos de ellos son: . con fenotipo dominante. De aquí en adelante. Llamaríamos de esta manera monoploides y polihaploides a los individuos provenientes de plantas diploides (2n= 2x) y poliploides (2n> 2x) respectivamente. Sin embargo. Actualmente son más de cien las especies vegetales capaces de producirlos in vivo. Verónica. un autopoliploide AAAA (2n = 4x) daría lugar a individuos «haploides» AA (n = 2x). • Comentarios generales sobre los haploides Para referirnos al término haploide es necesario conocer previamente el origen de dicha denominación.Poliembrionía : La presencia de poliembrionía facilita la detección de embriones haploides.01 %.-Capítulo 1 Obtención de plantas doblehaploides Polci. Esto se debe principalmente a la disminución en el tamaño de sus células. Rubén 1 Introducción • Identificación de Haploides Varios procedimientos facilitan la búsqueda de haploides en muestras grandes en número de individuos. a los fines prácticos y en concordancia con la segunda definición. nos referiremos al término haploide indistintamente del nivel de ploidía de la especie en cuestión. La mayor parte de la descendencia será heterocigota (diploide). Si consideramos haploide al individuo que posee un solo juego de cromosomas de la especie. obtenidos por partenogénesis o androgénesis.Morfología: Las plantas haploides son. más pequeñas que las diploides.Genes marcadores: Con este fin puede utilizarse cualquier par de alelos cuyos fenotipos dominante y recesivo sean fácilmente distinguibles. aunque sucede en pocas especies. la frecuencia con la cual se producen es muy baja. • Antecedentes El valor de los haploides es conocido desde 1922. . Pablo. Por ejemplo. debe realizarse el control citológico correspondiente.IV. con valores que van de 0. comprendiendo en éste a todos los individuos que posean una constitución cromosómica igual a la de los gametos normales de la especie (n = 2n/2). ocurre en una amplia gama de especies. una solución sería denominar como haploides a los individuos originados a partir de especies diploides. géneros y familias. según sea el fenotipo recesivo materno o paterno. conviene utilizar marcadores que posean manifestaciones fenotípicas claras en semilla o en plántula y de esta manera hacer una selección más económica en tiempo y esfuerzo. que tengan dos o más juegos cromosómicos (n > x). cuya constitución genética es igual a la de los gametos normales de dicha especie. Por lo tanto. respectivamente. cuando se descubrió la producción espontánea de los mismos. llamando polihaploides a aquellos individuos con una composición cromosómica igual que la gamética normal de la especie. Otra posibilidad sería considerar el término haploide en un sentido más amplio. sería muy fácil realizar una selección mecánica. en general. no estaríamos incluyendo en esta clasificación a aquellos individuos derivados de especies poliploides. que. Conti. Si esta disminución de tamaño fuera notable en las semillas. se realizan cruzamientos con otra variedad que sea homocigota para el alelo alternativo. Es lógico pensar que el fenotipo más pequeño de las plantas puede ser una primera aproximación en la búsqueda de haploides. no obstante ello. tanto en sus partes vegetativas como florales. Los individuos que aparezcan con el fenotipo recesivo serían haploides. Miranda. El porcentaje de embriones gemelos observados varía con la especie y el genotipo. En la práctica. como a aquellos individuos que poseen la mitad del número cromosómico normal contenido en las células somáticas de la especie. En estos casos es frecuente 137 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal . con una gran variación entre los distintos genotipos. y definir algunos conceptos básicos sobre el tema. Para identificar haploides en una variedad que se supone homocigota. que posean un solo juego de cromosomas (n = x).

2). Es decir que se ha detectado especial facilidad para regene. Guha y Maheshwari descubrieron que las anteras de Datura innoxia Mill. puesto que se ha comprobado en muchas especies que las células antípodas degeneran antes de la fecundación. especialmente en el caso de caracteres recesivos. arroz y trigo. 1).Debe producir líneas DH eficientemente Los métodos tradicionales para el mejo. . aunque resulta común resulte más eficiente (Fig. No se ha logrado. la dominancia. CONTI.distinguirse las mutaciones recesivas de fortrado resultados sorprendentes en numero. no persisten demasiado. se ha utilizado para producir haploides en numerosas especies. incluso dentro de un mismo género. Pablo.análisis genético. las frecuencias de inducción son casi del 100% y el rendimiento es de más de mil plántulas o callos por antera en condiciones óptimas (Fig. En algunos casos. das mundiales de producción. Los objetivos de mejoramiento a largo plazo no podrán ser alcanzados a menos que se genere mucha variabilidad genética que pueda ser utilizada con estos fines y que existan métodos que acorten el tiempo necesario para la obtención de variedades. las poblaciones haploides o doblehaploides (DH) carecen de genotipos heterocigotas y sirven para encontrar genotipos raros.al azar del conjunto de gametos parentales. entre ellos cebada.eliminan las complejidades del estado rar haploides a partir de anteras aisladas o heterocigota y se facilita enormemente el de granos de polen en miembros de la fami. el mismo éxito en especies ha resultado exitosa en varios cultivos. haciendo que el proceso de sos géneros de las crucíferas. Este proceso. siendo un buen complemento para los programas de mejoramiento tradicionales. si se las compara En estudios de androgénesis in vitro se con poblaciones segregantes. MIRANDA. En 1966. ya que éstos no quedan enmascarados por los alelos dominantes. generaban plantas haploides al ser cultivadas in vitro. La producción de haploides es una alterobservar diferencias significativas. la producción de haploides y doblehaploides es una herramienta interesante ya que permite acortar el tiempo requerido para la obtención de nuevas variedades. confirmado posteriormente por Nitsch y Nitsch (1969) en tabaco.Los DH obtenidos deben ser normales ramiento vegetal han sido practicados por cientos de años. Rubén . El advenimiento de las técnicas biotecnológicas y los avances en biología molecular han permitido el desarrollo de nuevas herramientas de gran utilidad en el mejoramiento vegetal. A pesar de que cada año se liberan al mercado numerosas variedades. En el caso de Datura innoxia. 138 POLCI. gramíneas y de selección sobre una población de haploides las ranunculáceas. Un sistema de producción de DH debe cumplir con tres requisitos básicos para su 2 Importancia de los haploides y utilización en programas de mejoramiento: aplicaciones en el mejoramiento vegetal .ma inmediata.a partir de todos los genotipos. arbóreas y arbustivas. Entre éstas. nativa biotecnológica de gran importancia y sin embargo.la aparición de haploides procedentes de una sinérgida del saco embrionario. Verónica. Estos deberían representar una muestra a una etapa en donde estos métodos son insuficientes para hacer frente a las deman. Actualmente se ha llegado y estables. Estas poblaciones presentan mayor variación genética aditiva y ausencia de varianza genética debida a Figura 1: Obtención de plantas haploides por cultivo de anteras. De esta manera pueden lia de las solanáceas También se han encon.

es posible llegar a Figura 2: Ventaja del uso de haploides en el mejoramiento cuando los homocigosis completa en una gecultivares parentales difieren. teóricamente. por inducción de mutaciones. 3). Al trabajar con especies de polinización Entre las aplicaciones más importantes de cruzada se favorece naturalmente la heterolos doblehaploides en el mejoramiento ve. Así. • ·Acortamiento de los programas de En plantas bulbosas. (b) Recuperación de progenies homocigotas a través de generaciones repetidas de F 1 autofecundación o retrocruzamiento. en dos pares de genes. por ejemplo. la autofecundación convencional. Genotipos posibles después del Genotipos posibles después de un Ciclo En las plantas autógamas . o por transformación genética. AaBb Generación F La biotecnología se presenta híbrido intervarietal como una alternativa atractiva no AB Ab aB ab Gametos F sólo para reducir el tiempo de obtención de los genotipos deseados.trigo de ciclo invernal es de aproximadamente diez años. sino también para lograr una economía de mano de obra y espacio en el campo experiCultivo de anteras Autofecundación mental. la homocigosis AB AABB AABb AaBB AaBb práctica se logra recién luego de Ab AABb AAbb AabB Aabb seis a ocho generaciones de aB AaBb AaBb aaBB aaBb Duplicación con colchicina ab AaBb Aabb aaBb aabb autofecun-dación. por neración. y. de ser posible la autofecungetal podemos citar: dación. ta de gran importancia.requeridos para la obtención de líneas puras en un do para la obtención de un nuevo cultivar de programa de mejoramiento tradicional. la obtención de homocigotas se ve dificultada por la endogamia. Debido al prolontres etapas fundamentales: gado tiempo requerido para alcanzar la fase (a) Generación de variabilidad genética. una probabilidad de 1/16 de encontrarlo. el tiempo requeri. pudiendo existir otras etapas en función del modo reproductivo de la Figura 3: Representación esquemática de los pasos especie. Líneas puras Estos pasos son básicos en un programa (homocigosis práctica: F7-8) de mejoramiento. Autofecundación (c) Evaluación del comportamiento de los @ nuevos materiales en ensayos comparativos a campo. Si el genotipo buscado es. AAbb X aaBB Generación parental 1 1 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 139 . el doble recesivo aabb. a través Gametos Ab aB del mejoramiento tradicional (Fig. por ejemplo. árboles frutales y mejoramiento forestales la homocigosis juega un rol muy El desarrollo de nuevos cultivares por los importante en el aceleramiento de los prométodos tradicionales actuales comprende gramas de mejoramiento. sea por medio de hibridaciones sexuales intra Progenitor A x Progenitor B e interespecífica. cultivo de anteras: de autofecundación de la F1: Plantas haploides AB Ab aB ab con los métodos convencionales Ab aB ab AB de mejoramiento. selec6-7 ciclos cionando a favor de los caracteres de inteSelección De @ rés. se tiene. el mismo genotipo tendrá una probabilidad de producción de homocigotas resulocurrencia de ¼ porque no se producirán los genotipos heterocigotas.cigosidad. En las plantas alógamas. mientras que Plantas doblehaploides * La probabilidad de ocurrencia de los recuadros AABB AAbb aaBB aabb con una técnica de producción de internos es de 1/16 (1/4 x 1/4) 1/4 1/4 1/4 1/4 haploides. seguida de duplicación cromosómica. Si se induce haploidía.

Frutos de tomate con mayor contenido de sólidos . Rubén . • Estudio de especies poliploides La inducción de haploides en plantas poliploides facilita el trabajo de investigación y mejoramiento. ya que permite manejar niveles de ploidía menores para los estudios de herencia y la combinación de caracteres de interés. aun siendo posible la autopolinización. . Las poblaciones de mapeo con el mayor contenido de información son aquellas obtenidas a partir del cruzamiento entre dos indivíduos homocigotos contrastantes. Entre los agentes mutagénicos más frecuentemente utilizados se encuentra la N-metil-N-nitrosurea (20 mM). derivadas de retrocruzas y doblehaploides. lográndose la homocigosis del mutado rápidamente luego de la duplicación con colchicina. el proceso de mejoramiento resulta extremadamente largo.adulta. Verónica. Esto permite analizar la misma población en diferentes años y localidades. Las variantes gametoclonales expresan el carácter recesivo en la R 0. En las plantas F 1 obtenidas. microinyección o utilizando Agrobacterium tumefaciens. a diferencia de las somaclonales. La elección del tipo de población se realiza en función de los objetivos de la investigación y del tiempo y recursos disponibles. que requieren de autofecundación y análisis de progenie. a nivel esporofítico. para obtener una población de plantas deben cruzarse ambos tipos. siendo esto una ventaja importante cuando se trabaja en hibridación somática. • Transformación genética Rige el mismo principio que para mutagénesis. dioca. De esta manera.Plantas de Datura innoxia con contenidos más elevados de alcaloides en las hojas. los rayos γ (0. el desequilibrio de ligamiento es máximo. ya que al obtenerse genotipos 100 % homocigotas se dispone de poblaciones estables o «inmortales» de mapeo. en la cual las plantas femeninas son XX y las masculinas son XY. Puede realizarse con PEG. La transformación de haploides permite la obtención del transgen en homocigosis luego de la duplicación con colchicina. Sin embargo. desde el punto de vista del productor.Plantas de tabaco con mayor resistencia a bajas temperaturas. Para especies de autofecundación o que toleran la autofecundación pueden utilizarse poblaciones F2. y las poblaciones derivadas a partir de estas plantas F1 procuran explorar este desequilibrio. • Producción de plantas homogaméticas Asparagus officinalis es una especie cultivada. Algunos logros de esta técnica: . • Generación de poblaciones de mapeo Diversos tipos de poblaciones pueden ser utilizadas para el mapeo genético de plantas.Plantas enanas de arroz con granos más largos y con elevados niveles de proteínas de reserva y más macolladoras. debido a la constante disponibilidad de semilla. MIRANDA. RILs (Recombinant Imbreed Lines). es deseable la obtención de una población cons- POLCI. Fn. Pablo. . CONTI. la variación debida a recombinación y segregación meiótica. • Fusión de protoplastos Al fusionar dos protoplastos haploides se origina uno diploide que puede duplicarse y llevar a la obtención de un híbrido interespecífico o intergenérico. • Mutagenesis Si se aplica mutagénesis a un sistema de haploides.5 krad) y el etil metil sulfonato. Las poblaciones de doblehaploides representan la variabilidad genética entre los progenitores luego de ocurrida una meiosis (F1). . Este aceite se usa como lubricante en la industria. • Variación gametoclonal 140 La androgénesis in vitro provee un excelente sistema para analizar. y son especialmente indicadas cuando se realizan estudios con QTL («quantitative trait loci»). se obtienen mutantes sólidos. obteniéndose estimaciones mas precisas de los parámetros de los caracteres cuantitativos a ser mapeados. lo que dará una progenie constituida por 50 % de plantas XX y 50 % de plantas XY.Plantas de Brassica napus con mayor contenido de aceite del ácido erúcico en las hojas.

puede servir de estímulo Duplicación para inducir haploidía. la producción artificial de haploides de las flores. por lo cual la fertilización doble no logra producirse. XX YY en el cruzamiento entre Solanum hembra y supermacho tuberosum x S. Cultivo de anteras incapaz de fecundar a la especie en X Y cuestión. llamadas supermachos. Se logra por: 1) Castración y aislamiento de las flores. La ventaja de estas plantas es II. se obtuvieron haploides de 3 Obtención de Haploides arroz. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 141 . trigo. Androgénesis: desarrollo de un gameque. proFormación de ducto de una gametogénesis anorGametos X Y gametos mal.Por este tratamiento se han obtenido haploides de Triticum monococcum. pero se forman XY embriones haploides por partenogéHíbrido nesis. siendo necesaria la de Nicotiana terbium y Datura inoxia a parposterior ocurrencia de duplicación tir de cultivos en suspensión de micrósporas. Ha sido más difícil en los cereales. Para conseguir diferenciar tituida solamente por plantas XY. como se muestra en el esquema: 1) Cultivo de anteras: se ha inducido Con este sistema.que. preferidas por los consumidores. no obstante ello. Es una técnica simple obtenido como se mencionara anteriormen. El polen de la papa silvestre contiene sólo un núcleo generativo. Para solucionar este problema y obtener 100 4) Cultivo de ovarios: puede ser eficaz % de plantas masculinas se ideó un sistema para obtener haploides a partir de cruzaque consiste en el cultivo de anteras y mientos interespecíficos. dependiendo del genotipo y de las conte). de alto rendimiento y de excelente cali. ca célula inicial. b) Utilizando polen previamente irradiado. y de permitir la aplicación de diferentes trata• Origen de los haploides mientos a las micrósporas como transformaI. al ser cruzadas con plantas XX darán to masculino. Este método tiene la ventaja de producir haploides masivamente (más de resulta siempre más efectiva. en 1990 fue liberada haploidía en mono y dicotiledóneas. Andrea es una variedad muy homogé. cromosómica para la obtención de semillas. que tienen un menor contenido de fibra y son. siendo una variedad llamada Andrea (es un híbrido más fácil en las últimas. cebada con diferentes grados de dificultad. Como se mencionara anteriormente. 100 % de plantas XY. Ginogénesis: desarrollo de un gameto ción o mutagénesis para luego obtener plantas por embriogénesis partiendo de una únifemenino no fecundado.diciones de cultivo permite obtener elevados nea. previo choque térmico a baja temperatura Por ello. diploidización de plantas YY. te cortos.números de plantas en tiempos relativamendad. 2) Polinización retrasada: la castración de las flores y la posterior polinización Progenitor masculino en el límite de la madurez receptiva XY del estigma permiten obtener hasta Formación de gametos un 30 % de haploides en trigo. las 2) Cultivo de micrósporas: en 1974 Nitsch plantas haploides aparecen en muy baja fre. 3) Polinización con polen inviable: X Y a) Utilizando polen extraño (típiPlantas haploides co de cruzamientos interespecíficos).indujo la regeneración de plantas haploides cuencia en la naturaleza. phureja (papa silvestre). 7000 plantas por botón floral en tabaco). como sucede cromosómica Homocigotos. por lo tanto.

Cruzamientos interespecíficos o intergenéricos con eliminación cromosómica: se produce la fertilización de manera de que se forme un cigoto diploide. IV. Plántula de trigo regenerada a partir de callo.1% y del 52. y su eficiencia es altamente dependiente de: a) El genotipo: es quizás el factor más importante que afecta al cultivo de anteras. denominada capacidad androgénica. Existe suficiente evidencia que sugiere que la androgénesis in vitro también está bajo control génico y que este carácter puede ser transferido desde clones con alta respuesta a otros no respondedores. A partir de alguna célula haploide del saco embrionario distinta del gameto femenino (sinérgidas o antípodas). Planta haploide completa finalizando la etapa de rusticación. puede ser evaluada a través de la producción de callos y de plantas verdes. la haploidía es controlada por el gen hap. Semigamia: el núcleo del gameto masculino penetra en la ovocélula pero sin fusionarse con el núcleo femenino. Esto se debe a que ciertas interacciones entre un citoplasma y un núcleo extraño inducen haploidía. Detalle del callo señalado en (A). En la naturaleza. Figura 4. bulbosum. MIRANDA. Se ha hallado variabilidad en la respuesta entre especies y aun dentro de ellas. Rubén . D. VI. Pablo. produciendo un individuo haploide con tejidos de origen materno y paterno. Por lo tanto. y ha sido sugerido que ambos caracteres estarían controlados por muchos genes. como sucede en los cruzamientos entre Hordeum vulgare y H. va perdiendo el genoma del individuo que aportó el gameto masculino. los más utilizados son la hibridación interespecífica e intergenérica y la androgénesis. En cebada y trigo los caracteres de inducción de callos y regeneración de plantas son altamente heredables. CONTI. 4). Sin embargo. B.plantas a partir de micrósporas es necesario quebrar el mecanismo responsable de la asimetría en la primera mitosis del polen. que. el mejoramiento de la capacidad androgénica no parece difícil. sien- 142 POLCI. V. Producción de callos y plantas a partir del cultivo de anteras de Triticum aestivum. donde las micrósporas competentes originarán callos. . que serán luego transferidos a un medio apropiado para la regeneración de plantas (Fig. Verónica. En cambio en las gramíneas la técnica no ha sido tan exitosa. Callo transferido a medio de cultivo para regenerar planta. C. creciendo sobre sustrato inerte (Perlita). La capacidad de respuesta al cultivo de anteras. • Métodos más utilizados para la obtención de plantas haploides: Entre los métodos disponibles actualmente para la obtención de doblehaploides. a lo largo de las sucesivas divisiones mitóticas. con sistema radicular en formación. 1). llamado gen inhibidor de la haploidía. A. aun en aquellas consideradas recalcitrantes. los progresos en los métodos de cultivo in vitro durante las últimas décadas han permitido obtener buenos resultados con gramíneas (Fig.Cultivo de Anteras: Consiste en el cultivo de anteras inmaduras en un medio de inducción. III.9% respectivamente. Callo blanco y compacto sobre una antera(flecha). E. Interacción núcleo-citoplasma: utilizando líneas de sustitución y restauración nuclear se encontró que los individuos con citoplasma de Aegilops caudata y núcleo de Triticum aestivum o Triticale mostraban una frecuencia de haploidía del 3. Ambos núcleos comienzan a dividirse independientemente. En algunas especies de dicotiledóneas el número de plantas obtenidas por cada cien anteras cultivadas es muy elevado.

la irradiación. la intensidad de luz. lo cual conduciría a la producción de fenotipos albinos. generando una menor cantidad de embrioides. más grande y con un núcleo difuso. ambas células resultantes contribuyen al desarrollo del haploide. el desarrollo de un sistema fotosintético funcional es promovido por el tratamiento con bajas temperaturas. y la vegetativa. e) Los pretratamientos: distintos tipos de estrés aplicados durante el estadío adecuado pueden enmascarar el programa gametofítico e inducir la expresión de genes específicos del desarrollo esporofítico. las micrósporas sufren inicialmente una división mitótica asimétrica que da origen a dos células de distintos tamaños: la generativa. La incidencia depende no solo de la especie sino también de la variedad. Cuando la primer división mitótica es simétrica. pero esta reversión no es posible luego de iniciada la deposición de almidón. también otros pueden estimular la androgénesis. el crecimiento de las plantas a bajas temperaturas mejora la producción de embrioides obtenidos a partir de anteras. es altamente dependiente de la calidad del callo y está asociado fuertemente a toda la historia previa del cultivo. En general. mientras que las colectadas al final de la estación muestran una menor respuesta al cultivo. el núcleo generativo se divide nuevamente originando dos núcleos espermáticos. más pequeña y con un núcleo altamente condensado. Esto se Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 143 . Si bien las bajas temperaturas son consideradas como el mejor pretratamiento. aunque no siempre un pretratamiento con frío reduce incidencia de albinismo. la reducción en la presión atmosférica. El estadío más apropiado para los cereales es el de micróspora uninucleada media y tardía. Uno generará el endosperma triploide al fusionarse con los dos núcleos polares del saco embrionario. la centrifugación de las anteras o hasta una incisión en la parte superior de la inflorescencia donante. De acuerdo con este autor. de la generativa o de ambas. sobre las yemas florales jóvenes o sobre las anteras. el tratamiento en una atmósfera saturada de agua y la aplicación de gametocidas. En Brassica napus. la pulverización con etrel. los haploides se originan por repetidas divisiones de la célula vegetativa. En general. Las bajas temperaturas aplicadas sobre la planta madre. También se citan la poda. la anaerobiosis. Bernard (1980) ha sugerido que las altas temperaturas incrementan la diferencia entre la velocidad de replicación del material nuclear y el de las organelas. Este último paso es crítico dentro de todo el proceso. 70 y 100 % para tres variedades diferentes de arroz (Wang y col. la nutrición y la concentración de CO2. c) Las condiciones de crecimiento de las plantas donantes: la edad y las condiciones ambientales en que crecen las plantas afectan considerablemente la capacidad androgénica de las mismas. Cuando la primer división mitótica de la micróspora es asimétrica. Por lo tanto. Los embrioides haploides se originan in vitro a partir de una de las vías que se enuncian a continuación. la temperatura. b) El % de albinismo: La ocurrencia de plantas albinas representa un serio problema para la aplicación del cultivo de anteras en programas de mejoramiento de cereales. citándose valores de 50. resultando en un desarrollo retardado o incompleto de los plástidos. una célula gamética masculina puede revertir su desarrollo gametofítico hacia el grano de polen y dar origen directamente a un nuevo individuo. las micrósporas que se encuentran en la primera división mitótica son las que mejor responden. el choque osmótico. Los factores ambientales más críticos son el fotoperíodo. se ha informado que la utilización de anteras de las primeras floraciones favorece la respuesta androgénica. que constituirá el primer paso de la nueva fase esporofítica. Esto varía levemente con la especie vegetal. como el calor.. Estos factores incidirían en la capacidad de producir las divisiones celulares morfogénicas que conducen al desarrollo de embrioides y la regeneración de plantas. 1978). El frío estimula la división mitótica simétrica de las micrósporas. que comienza luego de la meiosis. d) El estado de desarrollo de las microsporas: en la fase gametofítica de las plantas. generalmente estimulan la embriogénesis.do la identificación de genotipos con gran capacidad de respuesta un paso indispensable para su incorporación en los bloques de cruzamiento. En las gramíneas. mientras que el segundo fertilizará a la oosfera produciendo el cigoto diploide.

el cultivo de las anteras en un medio carente de sacarosa durante los primeros 6 días de la etapa de inducción permitió una máxima respuesta androgénica. las anteras y callos flotan sobre el medio líquido y se desarrollan en condiciones 144 • Medios de regeneración: la variedad de medios de regeneración citada es menor cuando se la compara con la de los medios de inducción. CONTI. como la glutamina y el inositol. avena y algunos genotipos de trigo se ha logrado éxito con un choque con alta temperatura.4 diclorofenoxiacético) en concentraciones de 1. la mayoría de los cereales requiere de la presencia de auxinas y de citocininas en el medio de cultivo y las respuestas parecen depender de los niveles endógenos de tales reguladores. con concentraciones de carbohidratos similares a las utilizadas en los medios de cultivo de tejidos tradicionales (30gr/l de sacarosa).debería a una alteración en la orientación del huso que conduciría a una primera mitosis anormal del grano de polen.6 %) como gelificante. Estas afectan particularmente la tasa de absorción final de nutrientes y la regeneración de plantas verdes.4-D (ácido 2. Los más utilizados son modificaciones derivadas del medio MS. Por ejemplo. y aun para cada genotipo dentro de una misma especie. ayudan en la estimulación de la androgénesis. tales como Capsicum annun. aeróbicas. se ha mencionado que las bajas temperaturas retardan el envejecimiento de la pared de la antera. si el medio se suple con leche de coco. De esta manera. de trigo germinado y de endospermas de arroz y de maíz. Verónica. g)Las condiciones de incubación: las características ideales de cultivo son específicas para cada especie. aun para variedades dentro de la misma especie. inerte. Temperaturas de 30 . utilizando agar (0. osmótico y nutricional. POLCI.5 a 2 mg/l. Rubén . • Medios de inducción : dos tipos de estrés. En cuanto a los reguladores de crecimiento. no iónico y de alto peso molecular) incrementa la tensión superficial y la viscosidad del medio. En tabaco. Pablo. Existen otras sustancias que. las temperaturas citadas varían entre 2 y 10 ºC y la duración del tratamiento de 2 a 30 días. la temperatura y la orientación de las anteras sobre el medio de cultivo pueden tener un efecto considerable en algunas especies. y Cultivo de Micrósporas: comprende la obtención de individuos haploides a partir de micrósporas aisladas. Es importante determinar la temperatura adecuada para cada especie vegetal. permitiendo elevadas tasas de embriogénesis y de producción de plantas verdes. Por otra parte.35ºC durante los primeros 1 a 4 días del cultivo ayudaron a inducir la androgénesis en varias especies de género Brassica. y un balance hormonal a favor de las citocininas. En ocasiones. En general. Pero en 1973 se detectó una mejor respuesta androgénica en tabaco cuando las anteras fueron cultivadas en un medio solidificado con agar y suplementado con carbón activado. MIRANDA. No existe una recomendación general y las variaciones dependen de la especie a cultivar. Tradicionalmente se utilizó agar como gelificante de los medios de cultivo. para lograr la inducción en trigo es indispensable el uso de 2. En algunas especies. La duración e intensidad lumínica. que serán luego transferidos a un medio de regeneración para originar plántulas (Fig. Los carbohidratos cumplen dos roles fundamentales en los medios de inducción ya que actúan como osmolito y como nutriente. auxinas menos poderosas. adicionadas al medio de cultivo. f) La composición del medio de cultivo: es otro de los factores importantes para el éxito en el cultivo de anteras. de batata. También se citan otros compuestos inespecíficos como extracto de papa. En medios líquidos la adición de Ficoll (polímero sintético de sacarosa. 5). Las espigas son pretratadas y las micrósporas liberadas son colocadas en un medio de cultivo donde desarrollarán embriones haploides. debido a su disponibilidad y bajo costo. de mandioca. Los agentes gelificantes representan otro aspecto importante en la evolución de los medios de inducción. han sido identificados como causas disparadoras de la inducción de embriogénesis en las micrósporas de mono y dicotiledóneas. lo cual aumentaría la supervivencia y la viabilidad del polen. los granos de polen desarrollan directamente en embrioides.

Cuando las plantas crecen estresadas. 1g) diferenciación de callo. Entre los factores determinantes de la eficiencia del método podemos citar: (a) Genotipo: se han citado cultivares de cebada con una alta respuesta al cultivo de micrósporas. fotoperíodo de 16 hs. La optimización de los diferentes pasos críticos para el éxito de esta técnica puede llevar a la obtención de una alta cantidad de plantas verdes con menores costos y esfuerzos. (b) Albinismo: al igual que en el cultivo de anteras el número de plantas albinas depende del genotipo. 3d) estado multinucleado. El diagrama muestra las diferentes etapas del cultivo de anteras y de micrósporas aisladas. h) planta haploide. Para el cultivo de anteras. Existe una concentración mínima para el desarrollo de las micrósporas. en contraste con otros menos respondedores. (e) Pretratamientos: los pretratamientos más utilizados consisten en el uso de frío. 1d) y 1e) proliferación de las anteras. y una densidad óptima para una mayor regeneración. es imprescindible el chequeo del estadio correcto para que conserven su capacidad androgé-nica. 1b) anteras.Figura 5. con alta humedad relativa (60-80%). Las condiciones más favorables deben ser ajustadas en cada caso y para cada genotipo en particular. o la aplicación de algún plaguicida. 3c) cultivo de micrósporas. La ausencia de la pared de la antera podría mejorar la nutrición y eliminar las restricciones físicas para la androgénesis. y adecuado régimen de fertilización y riego. Se han citado resultados en cebada cuando las plantas son cultivadas en ambientes libres de patógenos. debido a que induce a los miles de micrósporas que contiene una flor a dividirse y producir embriones. y la adición de diferentes auxinas al medio. de luz. enfermedades. 1c) anteras en cultivo. presencia o ausencia de determinados nutrientes. (c) Condiciones de crecimiento de la planta donadora: el mantenimiento de las (d) Estadío: Como se citara anteriormente para el cultivo de anteras. 1f) callo haploide. sea por riego excesivo. 3e) y 3f) embrión en desarrollo. 3b) micrósporas aisladas de una antera. sequía. la respuesta al cultivo de micrósporas es menor. las etapas requeridas a partir de anteras hasta la obtención de las plantas haploides pueden describirse como sigue: a) yema floral previo a la antesis. En general se sugiere la sustitución de sacarosa por maltosa como fuente de carbohidratos. (g) Medio de inducción: Se han estudiado diferentes concentraciones de azúcares. y también se ve influido por la densidad de cultivo de las micrósporas. (f) Densidad de cultivo: La densidad de las micrósporas en cultivo afecta el desarrollo de las mismas y el número que entrarán en división. la disminución de la concentración de nitra- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 145 . estrés osmótico. El cultivo de micrósporas tiene la ventaja de originar embriones de similar tamaño y etapa fisiológica debido a que pueden separarse las micrósporas de tamaños semejantes por centrifugación diferencial. etc. Para el cultivo de micrósporas aisladas: a) yema floral previo a la antesis. Este sistema es considerado el de mayor potencial para la producción de doblehaploides. distintas fuentes de nitrógeno orgánico. Se ha demostrado que los nutrientes disponibles durante el pretratamiento constituyen un factor decisivo que determina la calidad de los embriones originados. plantas en condiciones controladas de fotoperíodo y temperatura es esencial y debe ser ajustado en función de la especie.

el agregado de glutamina. los cromosomas del maíz son eliminados.to de amonio. Plantas con 3-5 macollos con sus raíces sumergidas en solución de colchicina para la duplicación cromosómica. la selección y la transformación. y al desconocimiento del estado de estos genes en los genotipos de trigo y de H. inicialmente descubierto y empleado con éxito en cebada. 2001). utilizando maíz como polinizador (Fig. que constituyen excelentes blancos para la mutagénesis. B. Luego de la fertilización del óvulo de trigo por el polen de maíz. A. D. ha sido considerado superior al cultivo de anteras por tres razones: (a) La producción de haploides es más fácil. C. G y H. Pablo. Verónica. . . Grano con dos embriones haploides (poliembrionía). Esto se debe a una incompatibilidad entre los cinetocoros de estos cromosomas y las fibras de los husos acromáticos que hace que en las primeras anafases los cromosomas de maíz vayan quedando rezagados en el citoplasma. MIRANDA. A esto se le suma la ventaja de contar con una elevada cantidad de micrósporas haploides en un estado fisiológico uniforme.Hibridación interespecífica e intergenérica : en este caso los haploides se originan a través de la eliminación del genoma del polinizador. I. Embriones inmaduros rescatados y creciendo in vitro. durante las primeras mitosis del cigoto. Desgrane de espigas para realizar la desinfección de los granos y posterior rescate de embriones. Para sortear estos inconvenientes se ha sugerido como alternativa realizar los cruzamientos. (h) Medio de regeneración: la composición del medio de regeneración puede afectar el vigor y supervivencia de las plántulas. Figura 6. bulbosum debido a la presencia de los genes de incompatibilidad. Plantas de maíz (donantes de polen) crecidas en invernáculo. El sistema de hibridación de trigo x Hordeum bulbosum. (b) El tiempo requerido para la regeneración de plantas es menor. La gran limitante de este sistema lo constituye el hecho de que la mayoría de los cultivares de trigo no pueden cruzarse con H. E. Kr1 y Kr2. (c) La eficiencia en la regeneración de plantas parece ser mayor. Espigas de trigo cortadas en el campo y castradas en el laboratorio. Producción de haploides de Triticum aestivum por cruzamientos de trigo x maíz (Zea mayz). Planta rusticada. CONTI. encontraron en este método una manera eficiente de producción de DH. El resultado de este proceso es un em- 146 POLCI. Kasha et al. Rubén . 6). en el caso de trigo. F. donde finalmente son degradados. bulbosum involucrados en los cruzamientos. bulbosum. con una mejor respuesta y una menor dependencia del genotipo que en el caso del cultivo de anteras. (2001). trabajando con cebada. Plantas tratadas con colchicina y llevadas a macetas con tierra en cámara de crecimiento. y el empleo de APA (ácido fenil acético) como auxina para favorecer la inducción (Kasha y col. debido a que los genotipos se seleccionan sobre la base de criterios agronómicos y no a un sistema de compatibilidad de cruzamientos con H.

Ganar tiempo en estos casos puede significar una reducción de costos muy importante y una más temprana entrada en el mercado de la nueva variedad. los residuos de este agente resultan menos tóxicos para la planta que otros que se aplican en forma líquida. la segregación anafásica de las cromátides. 5 Consideraciones finales La elección de los progenitores y la selección son etapas decisivas en un programa de mejoramiento que avanzará luego generación tras generación. se logra la homocigosis y se restaura la fertilidad. es estéril por lo que no podría producir semillas. hidrato de cloral. A través de las cruzas con maíz se han obtenido haploides de trigo de cultivares tanto compatibles como incompatibles con H. (b) Regeneración de plantas doblehaploides a partir de callos de médula de plantas haploides de tabaco (Kasperbauer y Collins. o por absorción de la solución a través de los tallitos decapitados. se ve reducida la aparición de quimeras. Tritordeum y arroz. ya sea espontánea o inducida. si bien en Oryza sativa y Brassica la puede incrementar. para micrósporas y anteras. La planta haploide. La aplicación del óxido nitroso bajo presión (2-6 atmósferas) resulta de especial interés por su fácil penetración en los tejidos y la rápida desaparición de los mismos cuando cesa la presión. Entre las técnicas que han sido utilizadas para la duplicación de haploides cabe mencionar: (a) Duplicación espontánea durante la etapa de callo o de rescate de embriones. Este último método permite la obtención de gran número de doblehaploides. La ventaja que presenta este tratamiento es que. La duración del tratamiento y la concentración de la solución varían para cada especie. es la adición del agente duplicador directamente en el medio de inducción. los embriones inmaduros deben ser rescatados en un medio de cultivo apropiado. inhibiendo así la formación de los microtúbulos del huso y. bulbosum. Otra alternativa. Esto. Por otro lado. antes de la primer mitosis. un macollo o sólo una yema floral. Puede utilizarse en flores recién polinizadas. especialmente en aquellos cultivares de corto ciclo vegetativo. Afecta por lo tanto sólo a las células que se encuentran en división. Puede aplicarse a plántulas. maíz. micrósporas y anteras.. plantas adultas. por lo que sería menos dependiente del genotipo. (c) Sustancias químicas: aunque se conocen casos mediante agentes químicos tales como acenafteno. lo importante es lograr que las semillas que éstas produzcan sean viables. 4 Duplicación cromosómica Después de la duplicación cromosómica. etc. en consecuencia. semillas. hacia una homocigosis que permita entrar en las etapas de evaluación. al poder ser aplicado durante la primera división mitótica del óvulo fecundado. pero presenta la desventaja de que la mayoría de las plantas así obtenidas son mosaicos cromosómicos. En el caso de una especie autógama como el trigo es posible ganar generaciones haciendo dos cosechas en un año. dejando fuera la parte aérea. · La acción de la colchicina fue descubierta en 1937 y desde entonces ha pasado a ser prácticamente el agente diploidizante más importante Esta droga actúa impidiendo el autoensamblaje de la tubulina. Cualquiera que sea el método con que se duplique la planta. Seguidamente. El tratamiento puede realizarse utilizando una solución acuosa donde se sumergen las raíces. sobre los que se vierte. sulfanilamida. Otra forma de hacerlo es tratar los callos con colchicina antes de trasladarlos al medio de regeneración. También se puede hacer llegar la solución al interior de la planta utilizando una jeringa con la dosis deseada (microinyección). El problema de la suplementación del medio de inducción con colchicina es que reduce la embriogénesis en trigo. La diploidización en este momento requiere menos tiempo y esfuerzo y ha sido utilizada en programas de mejoramiento de trigo. 1972). sin duplicar. lo cual sugiere que el sistema de incompatibilidad no afecta al método de trigo x maíz. la mayor eficacia se ha logrado con la colchicina y el óxido nitroso.brión haploide de trigo. sin Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 147 . aunque la frecuencia de aneuploides puede ser muy elevada.

pp. W. Si eligiéramos individuos F3. Proc. SUN... YAO. S. la aplicación de esta metodología al mejoramiento vegetal se vislumbra más bien como una herramienta complementaria al mejoramiento tradicional.. KASPERBAUER. pp. Plant Tissue Culture. 2001. Muchos interrogantes. pp149-160.(ed. 1995. 1988. W. comparable al logrado con el método convencional de selección a campo? ¿Cómo superar la escasa cantidad de semilla producida? ¿Es una técnica alternativa. atentando contra una selección eficiente. P. 148 POLCI.A. SIMION. Haploid Production. In vitro androgenesis in hexaploid triticale: determination of physical conditions increasing embryoid and green plant production. 1996. Int. En general. Si bien el costo de producción de los DH depende directamente del método elegido y la eficiencia lograda. que permita un aprovechamiento integral. En: Genética. Symp. DJILIANOV. World Journal of Microbiology & Biotechnology 11. Z. R. 683-719. pp. Razdan (eds. Pflazenzucht 85: 308-321. En: Plant Tissue Culture: Theory and Practice. T. J. MIRANDA.. Euphytica 120:379385.S. G.S. O. Capítulo 15. sin embargo... y que en ningún modo intentaría reemplazarlo. RAZDAN. Jensen.G. K. Symp. J. Horn. con ligeros requerimientos de vernalización. La producción de individuos doblehaploides que puedan participar anticipadamente en la etapa de evaluación agronómica se plantea como una solución promisoria a este problema. Reconstitution of diploids from leaf tissue of anther derived haploid in tobacco. que no pueden ser observadas en los genotipos en esas condiciones. ZAGORSKA. 1972.. Variaciones cromosómicas numericas. o complementaria del mejoramiento tradicional? ¿La eficiencia en la producción de doblehaploides justifica su alto costo dentro de un plan de mejoramiento? De acuerdo con Mujeb-Kazi (1998). En: Proc. In vitro production of haploid plants. W.. KASHA. A. 6 Lecturas Recomendadas ATANASSOV. ORO.A.. Para los trigos de tipo invernal y facultativos.. Lacadena. E. An improved in vitro technique for isolated microspore culture of barley.. E.167-213.. 217-229. debemos considerar que serían necesarios varios cientos de individuos DH para que el proceso tenga posibilidades de éxito agronómico. FOROUGHI-WHER. Verónica. J. esta ganancia de generaciones no es posible o es difícil. Amsterdam. Odenbach. dificulta la observación de algunas características agronómicas importantes. Criteria for the selection and use of doubled haploid systems in cereal breeding programmes.S. Bhojwani y M. WU. por lo cual en la mayoría de los programas sólo genotipos élite son sometidos a este sistema. SIMPSON. Studies on the albino pollen plantlets of rice. la producción de doblehaploides resulta en un gasto excesivo en com- paración a los métodos tradicionales de mejoramiento. 1986. PARKER. las generaciones segregantes adecuadas para producir doblehaploides son la F2 y F3. SNAPE. CONTI. limitando la aplicación extensiva de esta tecnología a algunos modernos programas de mejoramiento vegetal. BERNARD. CHI.) Elsevier. 1978. A. M. Capitulo 7. 12: 98-101. COLLINS. No obstante. B. C. S.E. C.R.estaríamos evitando producir un gran número de plantas doblehaploides que no serán agronómicamente promisorias. D. W. CARLSON. M.K.. BHOJWANI. representativo de la variabilidad gamética creada en la cruza. BOYADJIEV. W. De Gruyter. quedan aún sin resolver. Schieder (eds).. C. Eucarpia W. WANG.C..K.. HU. Algunas preguntas a las que debemos encontrar respuestas son: ¿En que generación segregante se aplica el método de doblehaploides? ¿Cuál es el número de individuos doblehaploides derivados de un cruzamiento. LACADENA. que ya cuentan con un año de selección a campo durante la F2 generación que ha mostrado la mayor varianza genética entre los dos padres.J.. Pekin Press. CHU.. Z.R. S. En: Genetic manipulation in plant breeding.embargo. Berlin. FRIEDT. B.R.. C. reduciendo los tiempos y presupuestos. Madrid. Crop Sci. 400408. Pablo.) A. P. Rubén . 1980.

1998). Por otro lado. Gabriela. registradas) requieren de una adecuada identificación de los materiales. Marcelo Las herramientas descriptas en II. pueden aceptarse ciertos niveles de variación molecular sin expresión fenotípica evidente. influencia ambiental y dependencia del estadio de desarrollo de planta. A continuación se describen algunas de esas aplicaciones. Se utilizan localmente como datos complementarios de los descriptores morfológicos y fisiológicos para el registro de los cultivares. los polimorfismos moleculares de proteínas y ADN resultan de utilidad en la determinación de los criterios DUS (distinción. Como alternativa para resolver estos problemas. polinización cruzada espontánea o mezcla de semillas durante la cosecha o embolsado. la ocurrencia de polimorfismos moleculares Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 149 . Se ha observado que aún después de 5-6 generaciones de autofecundación. En la mayoría de los cultivos. fisiológica y de caracteres agronómicos. para el que se desarrolló una matriz de identificación varietal sobre la base de marcadores microsatélites de ADN. Como ejemplo podemos mencionar al trigo pan (Triticum aestivum L. El mejorador considerará en cada caso los niveles máximos de variación admisibles.).-4 se utilizan en numerosas áreas relacionadas con el mejoramiento vegetal y el análisis de la biodiversidad. que permite la individualización de variedades argentinas. La pureza varietal es uno de los principales requisitos de la semilla comercial. el presente capítulo debe ser considerado como una introducción a los temas considerados.IV. Los individuos fuera de tipo pueden identificarse mediante el patrón molecular. 1 Identificación de genotipos – Pureza varietal El control de la pureza varietal y la discriminación de variedades protegidas (es decir. Helguera. Sin embargo. A partir de datos moleculares es posible obtener distintos índices de distancia genética y generar esquemas ramificados o dendrogramas. De este modo. la utilización de recursos genéticos similares en diferentes programas de mejoramiento ha reducido la eficiencia de discriminación por marcadores fenotípicos. ISTA (International Seed Testing Association) y UPOV (Union Pour La Protection Des Obtenions Vegétales) son entidades internacionales que han desarrollado protocolos para estandarizar los análisis de laboratorio para identificación de cultivares y reglamentar la utilización de diferencias moleculares en el control de la pureza varietal. En la actualidad se dispone de patrones moleculares varietales para una extensa lista de especies. Del mismo modo pueden establecerse las relaciones de descendencia entre una serie de líneas parentales y sus híbridos. Cuando la evaluación de estos lotes muestra uniformidad morfológica. una línea puede no haber alcanzado completa uniformidad para ciertos marcadores moleculares. En la producción de semilla híbrida la heterogeneidad intralote puede originarse por falta de uniformidad en las líneas parentales.-Capítulo 2 Aplicaciones de los marcadores moleculares Carrera. varios de los caracteres usados como descriptores presentan limitaciones en cuanto al número restringido de variantes. Esto puede interpretarse como una porción residual del genoma que permanece segregando. Esta identificación se basa tradicionalmente en el uso de descriptores morfológicos y fisiológicos. en aquellos casos en que las diferencias entre materiales no son conspicuas..1). Con el objeto de evitar el registro de variedades esencialmente equivalentes. UPOV ha establecido umbrales mínimos de diferencias moleculares sobre la base de distancias genéticas obtenidas a partir de caracteres tradicionales. Cada uno de estos campos posee una base teórica en ocasiones compleja y muchos de ellos requieren del uso de programas de estadística avanzada. (Manifesto y col. Tranquilli. que ponen en evidencia la similitud genética de los materiales (Ver VI. la discriminación de variedades protegidas y en el otorgamiento de nuevas patentes. Alicia. uniformidad y estabilidad).

el análisis de diversidad molecular ha demostrado que el proceso de domesticación ha reducido considerablemente la base genética de los materiales cultivados con relación a las poblaciones silvestres. riqueza alélica. conocidos como centros de domesticación. podrían. limitaciones en cuanto a espacio físico y presupuesto. TRANQUILLI. La comparación entre los materiales silvestres y cultivados de una especie permite además identificar los lugares de origen del cultivo. establecer relaciones filogenéticas y colaborar en la elección de las estrategias de conservación. distribución). respectivamente. pedigrí y datos históricos de obtención. monitoreo de los cambios en la composición genética que puedan ocurrir durante la multiplicación o conservación de los materiales). Las colecciones pueden mantenerse como bancos de semilla. En contraste. La erosión genética puede tener graves consecuencias para el cultivo. siendo la deriva génica el proceso más importante para el cambio de frecuencia en las poblaciones. Una gran parte de ellos se encuentran en regiones no codificantes del genoma. El reemplazo paulatino de las variedades primitivas por los cultivares híbridos de indudables ventajas económicas ha producido una reducción en el número de genotipos que se cultivan. La información reunida a partir de datos moleculares y morfológicos puede contribuir a establecer una colección núcleo o representativa de la variabilidad total. principalmente en relación a su vulnerabilidad sanitaria. El procedimiento consiste básicamente en analizar los materiales mediante marcadores proteicos o de ADN y calcular medidas de diversidad (nivel de polimorfismo. es posible decidir cuáles serían los cruzamientos que más contribuirían a la expansión de la base genética. Marcelo . Frecuentemente. hacen que los centros nacionales e internacionales de recursos genéticos deban restringir el número de entradas a conservar en el banco de germoplasma. 2 Uso en bancos de germoplasma Las prácticas de la agricultura moderna han generado una pérdida de diversidad en la mayoría de las especies cultivadas. Gabriela. Esta colección central debería incluir los caracteres que están presentes en numerosas accesiones o comunes. que constituyen un componente vital de los programas de mejora. estudiar el proceso de domesticación. conservación (identificación de duplicados en las colecciones.intravarietales puede representar una limitante para el uso de marcadores como descriptores complementarios en la inscripción de nuevos cultivares. pero también los denominados componentes raros y aquellos presentes en pocas accesiones de manera bastante frecuente. Esta información luego se complementa con datos geográficos (procedencia de las accesiones. Este proceso puede ser atenuado mediante la creación de bancos de germoplasma. los genes que codifican los rasgos morfológicos poseen un fuerte efecto fenotípico y han estado sometidos a intensas presiones de selección en las distintas etapas del mejoramiento. HELGUERA. Por el contrario. Estos caracteres representan grupos de genes sometidos a diferentes fuer- 150 CARRERA. Los recursos genéticos de una especie cultivada comprenden i) cultivares antiguos y de reciente obtención ii) poblaciones locales mantenidas por los productores. Los marcadores moleculares permiten caracterizar las accesiones o muestras a ser incluidas en las colecciones. a campo o in vitro. por lo tanto. Una vez que los recursos genéticos disponibles han sido caracterizados. En casos como el girasol (Helianthus annuus). constituir una muestra de genes atípica con respecto a la mayoría de genes de una especie. qué intercambios realizar). Veamos algunos ejemplos. en poroto (Phaseolus vulgaris) y olivo (Olea europea). caracterización (diversidad genética de la co- lección) y distribución eficiente de los recursos genéticos hacia los usuarios. La mayor parte de los polimorfismos moleculares carecen de expresión fenotípica y son selectivamente neutros. presencia de alelos únicos) y de similitud genética. las formas cultivadas conservan gran parte de la variabilidad presente en las poblaciones de los centros de origen en América y Europa. Alicia. La información generada por los marcadores resulta de inmediata aplicación en los procesos de acopio (dónde colectar. «landraces» iii) poblaciones silvestres de la misma especie o formas maleza y iv) especies relacionadas.

la selección de este marcador resulta en la selección indirecta del gen de interés. No obstante. Las proporciones en que estos genes segregan en una población se apartan de las esperadas bajo la ley de Mendel de segregación independiente. agronómicos y de origen. las fracciones de recombinación entre los tres se relacionan a través de la siguiente expresión: rAC = rAB + rBC – 2C rAB rBC donde 2rAB rBC representa la frecuencia esperada de entrecruzamientos dobles y C. La fracción de recombinación no es aditiva a lo largo del cromosoma y la desviación respecto de la aditividad aumenta con la distancia entre los loci. La mayor parte de los gametos contendrán las mismas combinaciones alélicas que los padres. una medida de la independencia con la que ocurren quiasmas (entrecruzamientos) en regiones cercanas. ligados en ese orden. r = nr / n Para tres loci. siendo la unidad de mapeo equivalente a una frecuencia de recombinación del 1%. es la proporción de gametos recombinantes. las diferencias entre organismos. sólo aquellos meiocitos que experimenten un intercambio entre cromátides no hermanas o crossover generarán gametos con combinaciones alélicas diferentes de las parentales (recombinantes). cuanto más próximos estén el marcador y el gen en cuestión. Función de Haldane : m = . ABC. Recordemos que el grado de recombinación genética (r). más eficiente será la selección. sus alelos se heredan usualmente juntos a través de la meiosis. El fundamento del mapeo genético reside en la relación directa entre la frecuencia de recombinación y la distancia física entre los loci. el coeficiente de coincidencia. Usualmente esta distancia se expresa en centimorgan (cM). aplicado en el mejoramiento genético vegetal y animal (ver sección correspondiente en este capítulo). Este mapa esta basado en el concepto clásico de ligamiento: si dos o más genes o marcadores están físicamente cercanos sobre el mismo cromosoma. De este modo se han desarrollado «funciones» de mapa tales como Haldane o Kosambi que tornan aditiva la fracción de recombinación. uno puede estimar la distancia de mapa entre los mismos. por lo tanto. la presencia de «hot spots» o sitios de alta frecuencia de recombinación y la evidencia de control genético de la recombinación. Los marcadores moleculares combinados con datos morfológicos. donde m representa unidades de mapa genético. el uso de la intensidad de ligamiento como estimador de la distancia genética genera un modelo de la disposición linear de genes y marcadores de gran utilidad en múltiples áreas del estudio genómico.zas de selección a lo largo del proceso de domesticación. La diferencia entre un carácter cuantitativo y uno cualitativo se basa en la magnificación del Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 151 . también conocido como fracción de recombinación. La relación entre frecuencia de recombinación y distancia física es distorsionada por factores tales como la distribución no al azar de los entrecruzamientos. es una función de distancia.5ln (1-2r). expresada como la probabilidad de recombinación genética entre el marcador y el gen. Si un marcador resulta estar genéticamente ligado a un gen que controla un carácter de interés agronómico. Este análisis puede aplicarse tanto en caracteres cualitativos como cuantitativos. 3 Mapeo genético Un mapa genético de una especie animal o vegetal muestra la distribución linear de un grupo de genes y marcadores en cada uno de los cromosomas que constituyen el genoma de un organismo. conforman una base de datos integral que permite describir la variación genética en colecciones de germoplasma. Este hecho constituye el fundamento del proceso denominado selección asistida por marcadores moleculares. Es así como determinando la frecuencia de recombinación entre dos genes. La eficiencia del proceso de selección indirecta basado en la cosegregación del marcador y del gen. nr sobre el total de gametos.0.

Cuanto mayor sea el número de marcadores incorporados al mapa. Para incorporar un carácter de interés agronómico en un mapa genético es necesario cumplir con una serie de premisas: 1. la mayoría de los caracteres de importancia económica y/o agronómica. el carácter es cualitativo (genes de herencia simple). Por otro lado un mapa genético constituye el punto de partida para proyectos de clonado posicional de genes (ver sección 6 de este capítulo). 1988).efecto de sustitución de un alelo por otro en un determinado locus (Falconer. Cuanto mayor sea la distancia genética entre los parentales que darán origen a la población de mapeo. que es un punto crítico para identificar marcadores ligados al carácter en estudio. 4. mayor será su resolución y la probabilidad de identificar algún marcador ligado al carácter agronómico de interés.Desarrollar una población segregante para el carácter agronómico en cuestión. se considera el carácter como cuantitativo o QTL (quantitative trait loci). ya que si la evaluación del carácter en la población de mapeo no es clara. Gabriela. poseen herencia cuantitativa o fenotipos complejos. Estas características permiten identificar rápidamente genotipos únicos en poblaciones segregantes e incorporar varios genes de interés en un fondo genético.Caracterizar la población segregante utilizando marcadores moleculares polimórficos (con diferencias en la secuencia de ADN entre los parentales). En el contexto del mejoramiento vegetal los mapas genéticos posibilitan: ~ La cobertura y análisis de genomas completos ~ La descomposición de caracteres genéticos complejos (QTL) en componentes mendelianos ~ La localización de regiones genómicas que controlan caracteres de importancia agronómica ~ La cuantificación del efecto de estas regiones en la característica estudiada ~ La canalización de esta información en programas de mejoramiento La construcción de un mapa genético genera información básica sobre la estructura y organización de un genoma tal como reordenamientos cromosómicos (inversiones. Genemap. Alicia. HELGUERA. Marcelo . al igual que para la construcción del mapa genético. Si el efecto de la sustitución alélica sobre la variación fenotípica total del carácter es pequeño. es imposible incorporarlo al mapa genético. sobre los individuos de la población segregante. Si bien esto es correcto. Los ejemplos más claros para ilustrar la utilidad de la selección asistida por marcadores moleculares en la piramidización de genes se observan en los casos en que interacciones 152 CARRERA. Para construir un mapa mínimo es deseable disponer de al menos cuatro marcadores moleculares por cada cromosoma del genoma en estudio. translocaciones. Un argumento frecuentemente utilizado en contra de la selección asistida por marcadores es que el mejoramiento de caracteres de herencia simple no necesita de marcadores para selección si los fenotipos son fácilmente identificables. En general.Evaluar fenotípicamente el carácter agronómico. se pueden utilizar herramientas informáticas específicas tales como los programas Mapmaker. Este punto es crucial. 2. TRANQUILLI. principalmente aquellos relacionados con la productividad. Para esta instancia.Identificar marcadores ligados al carácter agronómico (cosegregación entre fenotipo del carácter y fenotipo del marcador). 3. etcétera. proceso también denominado « piramidización» o «apilamiento» de genes. en estos casos. 4 Selección asistida por marcadores El advenimiento de nuevas técnicas moleculares ha facilitado el análisis genético de caracteres de interés agronómico y la selección asistida por marcadores moleculares. la utilización de marcadores en un programa de mejoramiento puede aportar una ventaja muy importante basada en su naturaleza molecular y es que la selección se independiza del fenotipo y el ambiente. Si el efecto de la sustitución de un alelo por otro es grande en relación con la variación fenotípica total. duplicaciones) e identificación de regiones con alta densidad de genes. mayor será la probabilidad de detectar marcadores polimórficos. MapmakerQTL.

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 153 . PI Gaucho: variedad susceptible recurrente. ya que al independizarse la selección del ambiente y de la expresión del fenotipo. es decir. Dentro de los primeros. Con la selección asistida. Sin embargo. a pesar de ello. se logra adelantar el número de generaciones por año. También es posible incrementar la velocidad de un programa de mejoramiento. Diversos son los factores que determinan esta situación. Otro impacto de la selección asistida por marcadores moleculares es el menor tamaño de las progenies mantenidas en un programa. aumentando la ganancia genética. asistido por un marcador específico para el gen de resistencia a roya de la hoja del trigo Lr47. con alta resolución y de una población segregante. cuando se desea sumar en un genotipo resistente a una determinada enfermedad otros genes de resistencia al mismo patógeno. Pavon: variedad donora de la fuente de resistencia. Esquema de un programa de retrocruzas. además de lo mencionado en párrafos anteriores respecto de la necesidad de contar con el mapa genético. En la Figura 1 se representa un programa de retrocruzas asistida por marcadores moleculares como ejemplo de la utilización de esta herramienta en el mejoramiento vegetal. la confirmación de determinados marcadores como herramien- Figura 1. debemos tener en cuenta el paso siguiente que es la validación de los marcadores que se identifiquen como promisorios para el seguimiento de caracteres de interés. Esta situación se presenta con los genes de resistencia a enfermedades. el uso actual de estas herramientas en algunos casos es limitado.génicas como la epistasis (efectos de ciertos genes sobre la función de otros) «enmascaran» la presencia de un gen. dificultando su seguimiento mediante el fenotipo. Por un lado podríamos considerar los de orden técnico y por otro los de índole económico. BC: generación de retrocruza. el número de generaciones necesarias para la estabilización de los genotipos es menor. La utilidad potencial que los marcadores moleculares presentan en el proceso de mejoramiento genético resulta clara. como estrategia de resistencia durable. ya que la heredabilidad de los caracteres es próxima a 100%.

es necesario confirmar en los materiales de mejoramiento que el carácter deseado está determinado por gen/es presentes en el locus marcado. son neutras y en que la asociación con caracteres de interés está determinada por ligamiento genético en la población evaluada. Desde este punto de vista. HELGUERA. en general. sin correr el riesgo de que la información de interés se pierda por recombinación. Esto se ha observado. se ha desarrollado un marcador cuyo polimorfismo esta dado por dicha mutación. Para este gen. la disponibilidad de marcadores diagnóstico aumentará progresivamente a partir de nuevos conocimientos que surjan de los proyectos genómicos emprendidos en diversos cultivos de interés económico. Sin dudas. Gabriela. el orden 154 CARRERA. Dado que ese ligamiento puede no mantenerse en otro germoplasma. maíz y sorgo. como ya fuera indicado. por ejemplo. centeno) así como entre especies pertenecientes a distintas subfamilias taxonómicas. En los programas de mejoramien- to de aquellas especies donde el material de cultivo es híbrido. a pesar de esa gran variación en el tamaño del genoma. Es decir. Estudios en diversos grupos taxonómicos han revelado una estrecha relación entre los genomas de las especies comprendidas dentro de cada grupo. y su importancia reside en que la mayoría de los marcadores disponibles hasta el momento derivan de regiones del genoma que. Como ejemplo podemos mencionar al marcador desarrollado para el gen denominado Pinb-D1. Estos marcadores. en general se observa mayor uso de selección asistida por marcadores moleculares. por ejemplo. Si un grupo de marcadores moleculares mantiene el orden y sus relaciones de ligamiento entre dos especies se dice que son colineares o que muestran sintenia. pueden ser usados en forma confiable en poblaciones en los que no se hayan mapeado previamente. son significativamente diferentes. y dentro de las gramíneas entre especies pertenecientes a la tribu Triticeas (trigo. el mejor marcador es aquel que reconoce sitios polimórficos que estando dentro del gen son los determinantes de la variación fenotípica observada. Este gen codifica para una de las proteínas relacionada con textura de grano en trigo y se ha observado que la mutación de una base específica dentro de su secuencia implica el cambio de un aminoácido (de glicina a serina) en la proteína codificada y que esto es suficiente para determinar un mayor grado de dureza de grano. entre especies pertenecientes a las Solanáceas (tomate. Dentro de los factores de índole económico. por ejemplo) por marcadores basados en amplificación (RAPD. a partir de los RFLP fue posible identificar sitios comunes en distintas especies que servían como puntos de referencia para la comparación de sus genomas. cebada. TRANQUILLI. 2003). Sin embargo. reduciendo costos y también aumentando la eficiencia en el proceso de selección. la limitante en la adopción de esta tecnología ha sido la relación entre el costo de la misma y el valor comercial de la semilla mejorada. tal el caso de arroz. también llamados diagnóstico o funcionales. (Andersen y Lübberstedt. pimiento). sustituyendo marcadores basados en hibridación (RFLP. y esto asegura que su uso sea válido para identificar la presencia de esta característica.ta efectiva de seguimiento o selección de un gen particular. papa. Es importante señalar que los tamaños de los genomas de las especies comparadas. La validación es un aspecto fundamental previo a la implementación de estas herramientas en programas de mejoramiento. Los mapas comparativos en vegetales comenzaron a realizarse a partir del desarrollo de los marcadores RFLP y de la posibilidad de obtener hibridación entre las secuencias de ADN utilizadas como sondas con genomas distintos a los utilizados para la obtención de las mismas. entre Arabidopsis y cultivos del género Brassica. Marcelo . Alicia. AFLP). Es así que los mapas comparativos dieron las primeras evidencias de que el ligamiento de grupos de genes podría haberse conservado a través de largos períodos evolutivos. 5 Mapeo comparativo La comparación de mapas de ligamiento entre diferentes especies se denomina mapeo comparativo. Es esperable que esta tendencia se modifique con el tiempo. ya que el permanente avance tecnológico ha permitido simplificar las metodologías a aplicar. sea en poblaciones de mejoramiento como en la caracterización de germoplasma.

2000). Sobre la base de estudios citogenéticos. deleciones) durante el proceso evolutivo que lleva a la diferenciación de especies a partir de un antecesor común. Una vez reducido al mínimo el intervalo de genoma portador del gen de interés. Por ejemplo. Asimismo. AFLP. la idea de llegar a la identificación. para desarrollar una población de mapeo segregante para el gen de resistencia (Stein y col. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 155 . arroz. por ejemplo. se identificarán marcadores ligados genéticamente al carácter en una región específica del genoma. por ejemplo en plantas. Sin embargo. el maíz posee un comportamiento meiótico que corresponde al de una especie diploide típica. con la ayuda de programas específicos de computación (por ejemplo. Posteriormente. Una forma de hacerlo es mediante una caminata cromosómica. cebada y avena. como arroz o Arabidopsis. el paso siguiente es obtener la secuencia nucleotídica del mismo.linear de los genes se encuentra altamente conservado. tales como Arabidopsis y arroz. De este modo la información generada podría hacerse extensiva a una amplia gama de especies. Por otro lado. partiendo del supuesto de que los genes que gobiernan aspectos fundamentales de la biología vegetal muy probablemente están conservados entre distintas especies. Este ha sido tal vez el objetivo principal para impulsar el desarrollo de estos mapas. 6 Clonado posicional El clonado posicional de un gen es un claro ejemplo de la utilización de información genética (disposición espacial de genes). la más sencilla es una F2. ciertas especies consideradas inicialmente diploides han modificado su estatus. El siguiente paso es determinar el fenotipo de los individuos que constituyen la población de mapeo (en este caso plantas resistentes o susceptibles a roya de la hoja). así como también permiten evaluar niveles de ploidía. a partir de la comparación de mapas moleculares. Una vez identificada la región cromosómica portadora del gen responsable del carácter. El primer paso para lograr esto es seleccionar parentales que sean contrastantes para el gen en cuestión. clonado y estudio de genes en las especies modelo se vio fortalecida. los mapas comparativos posibilitan la transferencia de información entre especies con genomas simples y bien caracterizados. aportan información muy valiosa para conocer los cambios producidos en la estructura cromosómica (inversiones. identificando las regiones cromosómicas colineares de las especies más estudiadas. se satura dicha región con nuevos marcadores moleculares. RFLP. Arabidopsis. y el hecho de que la variación en el tamaño de los genomas de especies relacionadas se debe fundamentalmente a variación en la cantidad de ADN no codificante y no a una variación en el número de genes. a partir de las cuales estudiar y avanzar en el conocimiento de genomas más complejos. Mapmaker QTL). Una vez obtenida la información fenotípica y molecular de la población de mapeo. a especies con genomas más complejos tales como trigo. molecular (secuencia nucleotídica de genes) y del funcionamiento ( expresión de los genes) de un genoma (conjunto de genes) para identificar al gen responsable de un carácter particular. facilitando así el estudio en estos organismos. translocaciones. Una vez seleccionados los parentales se desarrolla una población segregante para el carácter. se caracteriza esta población utilizando marcadores moleculares (microsatélites. sorgo. etcétera. La utilidad de los mapas comparativos puede apreciarse desde distintos puntos de vista.. Las notables similitudes observadas entre genomas fue la base sobre la que se postuló el uso de especies modelos. duplicaciones. El objetivo es delimitar el intervalo del genoma al fragmento mínimo posible que contenga al gen de interés. RAPD) que cubran todo el genoma del organismo en estudio (en este caso trigo). incluyendo las cultivadas. tabaco. maíz. una variedad de trigo susceptible y otra resistente a la roya de la hoja. Muchos de estos marcadores pueden obtenerse del mapeo comparativo. Por un lado. numerosos loci RFLP de arroz están representados dos veces en el genoma de maíz por lo que actualmente se considera que el maíz desciende de un poliploide ancestral.

el tipo de polinización (gravedad-anemófila-entomófila). En algunos genomas (por ejemplo.-3) con los marcadores que flanquean al intervalo portador del gen. Este contig contiene la secuencia del gen en estudio. HELGUERA. Estos extremos se utilizan como nuevos marcadores para extender la caminata cromosómica en ambos sentidos. ya que si bien posee aproximadamente el mismo número de genes que arroz. fi : frecuencia alélica) Ho: heterocigocidad observada También se calculan coeficientes de endogamia (F) a partir de la heterocigocidad observada y esperada. A partir de esta información. Marcelo .Σfi2. que posee un genoma extremadamente grande (16000Mb/ genoma haploide) es crítico obtener un intervalo genómico lo más pequeño posible. El estudio de los componentes de la variación dentro y entre poblaciones colaboran en la definición de las unidades a conservar y se convierten en elementos importantes para la toma de decisiones relacionadas con la protección de la biodiversidad. la región cromosómica colinear a trigo puede estar secuenciada. 7 Distribución de la variabilidad genética en poblaciones naturales Las especies están constituidas por unidades o demos más o menos aislados denominados poblaciones. en cada grupo los BAC seleccionados deben tener en común al menos un fragmento de digestión (el fragmento que posee la secuencia del marcador). El paso siguiente consiste en la secuenciación del contig. y la diferencia está constituida principalmente por ADN repetitivo no codificante que dificulta el clonado posicional. En general adopta una distribución en parches. su genoma haploide es diez veces mayor. Es deseable que las poblaciones seleccionadas para formar parte de las áreas protegidas. y a partir de esta información se puede tener una primera estimación del número de genes candidatos para la resistencia al patógeno en la región cromosómica homóloga a trigo en arroz.La caminata se inicia seleccionando clones de una genoteca de trigo («BAC library». arroz). las distancias inter-demos. Se estima que. Alicia. y por análisis de secuencia. A: número promedio de alelos por locus He: heterocigocidad esperada promedio (1. Gabriela. A partir de marcadores codominantes como las isoenzimas pueden ser obtenidos parámetros de diversidad: P: número de loci polimórficos/número total de loci analizados. la acción del hombre en la fragmentación del hábitat y el origen histórico (especies nativas-especies introducidas) determinan en conjunto una distribución de la variación genética propia de cada especie. posibles candidatos del carácter en estudio. La prueba definitiva para establecer el hallazgo del gen en cuestión es la prueba de complementación. Ver Capítulo II. el modo reproductivo (autogamia-alogamia).03 cM que contenía dos genes candidatos para Vrn-1 (Yan et al. Una especie vegetal raramente se extiende en forma continua e ininterrumpida. contengan la mayor diversidad genética posible de modo de asegurar el mayor potencial evolutivo. Esto consiste en transformar una planta que carece del carácter en estudio (por ejemplo es susceptible a un patógeno) con cada uno de los genes candidatos y determinar cuál de ellos le confiere el carácter (en este caso resistencia al patógeno). TRANQUILLI. la mitad del valor promedio de fragmentos contenidos en un BAC. para el clonado posicional del gen Vrn-1 que controla el momento de floración del trigo se utilizó una población de trigo diploide (Triticum monococcum) de 3095 individuos F2. El número de individuos en cada población. Este proceso se hace simultáneamente con ambos grupos de BAC hasta que se superpongan y se forme un continuo o «contig» de BAC. Los fragmentos no compartidos corresponden a los extremos de estos BAC parcialmente solapados entre sí. Como ejemplo. e índices de simili- 156 CARRERA. Los dos grupos de BAC (uno para cada marcador) son digeridos con enzimas de restricción para identificar en cada grupo fragmentos compartidos y no compartidos. Esta región presentó una densidad de genes de uno cada 70000 pares de bases. para llegar a delimitar un intervalo de 0. 2003). En el caso del trigo pan. se determinan los genes presentes. Los programas de conservación utilizan a menudo información acerca de la distribución de la variación genética para establecer prioridades y estrategias de manejo.

la introducción de individuos en áreas en proceso de declinación. etc. una especie compuesta de poblaciones con niveles bajos de variabilidad en cada unidad pero con alto grado de diferenciación entre poblaciones. virus. Mediante diferentes marcadores moleculares puede establecerse si las poblaciones actuales provienen de un solo evento de introducción. de modo de evitar los efectos indeseables de la depresión por exogamia. son normalmente ingresadas a la categoría de especies en peligro de extinción. con unos pocos individuos iniciales o por el contrario. es posible seleccionar la ó las poblaciones donadoras sobre la base de la similitud genética con la receptora. y en este caso rastrear «enemigos naturales» que pudieran ser útiles como control biológico de la especie invasora. con porcentajes variables de cada uno de ellos. libre de presiones selectivas tales como especies competidoras o patógenos características del ecosistema de origen. que en una especie nativa de interés forestal todas las poblaciones presentan altos niveles de variabilidad genética y son bastante similares entre sí. hacen que la contribución de estas dos vías al flujo total varíe de acuerdo a la especie. En realidad existen combinaciones de estos tipos básicos. Los mecanismos reproductivos pueden clasificarse en los tres tipos básicos: alogamia. En este punto. Del mismo modo puede ser analizada la variabilidad genética de patógenos o parásitos vegetales tales como razas de royas. Las malezas de mayor impacto en la agri- cultura mundial son en general especies introducidas. En este caso la decisión de cuáles poblaciones formarán parte del programa de conservación podría basarse en consideraciones exclusivamente prácticas ya que las poblaciones son genéticamente equivalentes. la especie introducida es capaces de establecerse y colonizar todos los territorios que reúnan determinadas condiciones ambientales. es decir se encuentran sometidos a la acción de fuerzas evolutivas no selectivas tales como deriva o flujo génico. En el nuevo territorio. con formas obligadas o facultativas. los mecanismos de dispersión. y aun dentro de las poblaciones.-1 ). Los marcadores moleculares Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 157 . el tipo de polinización. El tipo de reproducción de una especie vegetal determina en gran parte la distribución de variabilidad genética entre poblaciones. determinados marcadores informativos pueden establecer con bastante precisión cuál es el lugar de origen de las poblaciones introducidas. El estudio de marcadores moleculares en diferentes plantas de una población y su progenie ha contribuido a determinar el tipo de reproducción de numerosas especies vegetales. con niveles de diversidad genética extremadamente bajos y un reducido número de individuos. ocurrieron múltiples eventos de introducción. La morfología de semilla y polen. Por el contrario.tud (I) o distancia genética (D) que cuantifican la semejanza o diferencia genética entre poblaciones a partir de las frecuencias alélicas (Ver VI. según las especies.-3). Las decisiones finales de un programa de conservación deberían por lo tanto combinar los datos obtenidos a partir de marcadores moleculares junto con la evaluación de ciertos rasgos morfológicos. fisiológicos o reproductivos. es importante recordar que los marcadores moleculares representan variación genética esencialmente neutra. es decir. que son críticos en el proceso de adaptación y supervivencia de las poblaciones en su hábitat. etc. y a partir de esta información diseñar programas de control más eficaces. Además. Poblaciones de especies endémicas. autofecundación y apomixis (ver Capítulo VIII. 8 Estimación del flujo génico El flujo génico entre poblaciones vegetales ocurre mediante el movimiento de polen o de semillas. La caracterización genética de las poblaciones de malezas puede aportar información de utilidad en los programas de control.. De acuerdo a la información obtenida por la caracterización molecular. nematodos. La diversidad genética cuantificada por marcadores moleculares puede mostrar por ejemplo. ya que cada una de ellas posee una identidad genética diferente. requerirá que los esfuerzos de protección sean dirigidos hacia tantas poblaciones como sea posible. El conocimiento de los componentes de variación entre y dentro de las poblaciones naturales puede utilizarse además en situaciones de repoblamiento.

los procesos de hibridación de formas cultivadas de base genética estrecha con silvestres alteran los niveles de diversidad genética de las poblaciones naturales. produciendo una erosión de los recursos genéticos vegetales. se está realizando un estudio que comprende el relevamiento de las especies silvestres del género Helianthus. con potencial uso en el mejoramiento genético mediante cruzamientos. y cuando esta información se complementa con datos de compatibilidad sexual. En este caso. producto de una polinización libre. A modo de ejemplo. Los alelos que no estaban presentes en la población materna son atribuidos al ingreso externo de polen del cultivo. su distribución y el grado de intercambio genético en las zonas de contacto cultivo-silvestre (Ver IX. Por un lado la posibilidad de que poblaciones silvestres cercanas a las formas cultivadas. Cultivos importantes como trigo. Nuevamente la estimación del flujo génico y la determinación de la variabilidad genética mediante marcadores pueden contribuir a atenuar los procesos de «homogenización» genética y dar tiempo a la evaluación de las poblaciones naturales en cuanto a rasgos como resistencia a enfermedades o parámetros de calidad. Gabriela. La estimación del flujo génico ha cobrado especial relevancia en los estudios tendientes a evaluar el efecto sobre el ambiente de los materiales genéticamente modificados. Marcelo . como por ejemplo cloroplastos. Dicho efecto comprende diferentes facetas. Los individuos de una determinada población pueden ser analizados y comparados con su progenie. etc. con potencial aplicación en mejora. poroto.2). adquieran el transgen mediante fecundación cruzada. competitividad o relación con otro miembros de la comunidad biótica tales como polinizadores. Los marcadores RFLP son particularmente útiles dado que están basados en reacciones de hibridización. el flujo génico puede ser cuantificado. Alicia. por un lado se obtiene información acerca de la distancia de transporte de polen y además constituye un test de «paternidad». arroz cuentan con numerosas especies y géneros silvestres relacionados. Si el flujo génico se produce básicamente a través de polen. En este escenario los marcadores moleculares de ADN o isoenzimas constituyen herramientas muy útiles. tomate. en especies arbóreas. polinizadores y clima se arriba a una serie de conclusiones que pueden aplicarse al cultivo en gran escala de variedades transgénicas. Se trate de variedades transgénicas o no. El conocimiento de la filogenia y diversidad genética de los recursos silvestres permite optimizar los procesos de hibridación con los materiales cultivados.permiten cuantificar cada uno de estos procesos. El procedimiento consiste básicamente en calcular un índice de distancia genética sobre la base del número de bandas en común y luego realizar un análisis de agrupa- 158 CARRERA. no serán transferidos de una población a otra porque este tipo de información es sólo heredada por vía materna. generando cambios en la dinámica poblacional. los marcadores de ADN de organelas. En contraste. girasol. Mediante el uso de marcadores altamente polimórficos como los microsatélites es posible determinar cuál ha sido la planta donadora del polen de cada semilla por ejemplo. Evaluando poblaciones a distancias crecientes desde una determinada fuente de polen. con el objeto de estable- cer el riesgo ambiental de la liberación de girasol genéticamente modificado en la Argentina. tanto los marcadores de herencia materna como los de herencia biparental o nuclear. serán transmitidos entre poblaciones. si el flujo génico se realiza principalmente a través de semillas. 9 Filogenia La filogenia intenta reconstruir las relaciones jerárquicas de descendencia entre especies o grupos de especies y utiliza esta información como criterio de clasificación biológica. patógenos. lo que garantiza la homología de los segmentos que se comparan entre los diferentes taxa.. TRANQUILLI. HELGUERA. RAPD no requiere un conocimiento previo del genoma en estudio y puede ser aplicado a diferentes especies pero la interpretación de los datos parte de asumir que los productos de amplificación de iguales tamaños son homólogos. Esta potencial transferencia de genes se torna preocupante cuando se trata de flujo génico hacia poblaciones silvestres catalogadas como malezas.

Allozyme diversity in the grasses. Las relaciones establecidas de este modo se comparan luego con vías filogenéticas propuestas a partir de datos citogenéticos. como técnicas de re-muestreo. respectivamente. LEÓN. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 159 . (eds.miento (UPGMA) o árbol filogenético (Neighbour Joining). Basta con examinar las variantes moleculares de las especies candidatas diploides y compararlas con las de la especie poliploide derivada.E. etcétera. limones. G. ecológicos.) ISBN 0-7167-3118-5 http:// w w w . AND DUBCOVSKY J.H: Freeman & Co. morfológicos. Cuando se compara el orden de los marcadores moleculares del girasol. originadas estas últimas en cambios estructurales como inversiones y translocaciones. n i h . FEINGOLD.View. GELBART. R. g o v / b o o k s / bv. 1988. pasándose a denominar Solanum lycopersicon. S. Esta información resulta de gran aplicación en el mejoramiento de estos cultivos así como en la comprensión de la evolución de los genomas.. Mediante marcadores isoenzimáticos es posible dilucidar las especies parentales ancestrales de una especie alopoliploide.690. Variability among inbred lines and RFLP mapping of sunflower isozymes. BERRY. Marcadores de ADN han permitido esclarecer las relaciones de este polimórfico grupo que incluye naranjas. ANGIOLILLO. Helianthus annuus. El mapeo comparativo ha permitido conocer el tipo de reorganización genómica que ha operado durante el proceso de especiación.. BALDONI. J. HAMRICK J. SCHLATTER A. limas y mandarinas. Trends in Genetics 17: 536-540. cruzamientos. n l m . A. M. Para los niveles de especie e infraespecíficos es conveniente complementar con marcadores de origen nuclear. En: Population biology of grasses.M. Cheplick (ed). JEFFREY H. MANIFESTO M. que refleje las relaciones entre los taxa. J.. que conserva el mismo número cromosómico de las especies parentales. 2001. El modo de herencia de un locus isoenzimático. permite además caracterizar una especie en cuanto a su origen alo. En la evolución del género Citrus ha operado la hibridación natural a través de reproducción sexual pero también están presentes mecanismos apomícticos que constituyen barreras al intercambio de genes. 2001. New York. Quantitative evaluation of genetic diversity in wheat germplasm using molecular markers. Cambridge University Press. entre los cuales las sondas para ARN ribosómico 45S y ADNc son frecuentemente usadas. WILLIAM.. 98: 411-421.R. T.F.Y. Establecer cuál es el árbol correcto entre todos los posibles es una tarea difícil que en parte es resuelta mediante el uso de métodos estadísticos... A. 1998. RICHARD C. anomalus se observa que las especies poseen zonas colineares y zonas no colineares. L. Genetics and Molecular Biology 25: 65-72. G. que generan índices de consistencia o confiabilidad para cada árbol. SUÁREZ E. Genet. Modern Genetic Analysis. Crop Science 41: 682.1999.. 1999. Los estudios sobre ADN de cloroplasto y la similitud de los mapas de ligamiento constituyen evidencias de que el tomate y la papa comparten un antecesor común muy reciente.. HOPP H. M. Trends in Plant Science 8: 554-560. POVERENE. previamente denominado Lycopersicon esculentum. LÜBBERSTEDT. Introduction to quantitative genetics. es decir. S.. PIZARRO. La taxonomía de este grupo resulta particularmente compleja ya que no puede ser aplicado el concepto biológico de especie....ShowSection&rid=mga GODT M. LEWONTIN. polisómico.. MENCUCCINI. FALCONER.. disómico vs. Oranges and lemons: clues to the taxonomy of Citrus from molecular markers. 2003 Functional markers in plants. anomalus es una especie resultante de la hibridación entre las dos especies mencionadas. Longman. ANTHONY. A. M. 10 Lecturas recomendadas ANDERSEN. GRIFFITH.. Los polimorfismos en los fragmentos de restricción de ADN de cloroplasto resultan útiles para establecer relaciones filogenéticas en el ámbito de familias y géneros debido a su tasa de evolución más lenta y a su modo de herencia uniparental. DS. Theor.fcgi?call=bv. como ocurrió con el tabaco y el algodón. S.. New York: W. Olive genetic diversity assessed using amplified fragment polymorphisms. P. dentro del género Solanum. MOORE G. petiolaris y H. Además se ha comprobado que H. 2002. Appl. y especies relacionadas como H.o autopoliploide. Los estudios moleculares más recientes han colocado al tomate. n c b i . CARRERA. MILLER. 399 pp..

36: 1375-1384.). 1996. 46: 39-90. 2000.. 1995. M. Subgenome chromosome walking in wheat: A 450-kb physical contig in Triticum monococcum L. D. Natl. Contribution of plant molecular systematics to studies of molecular evolution. KELLER. Natl. and B. TRANQUILLI. TRANQUILLI. A. Asteraceae). USA. J. GONZALEZ. DESROCHERS A. DNA markers in plant improvment.. VAN FOSSEN CH. SEILER G. 1990. N. L. Proc. AFLP alalysis of gene pools of a wild bean core collection. T. SOLTIS. RIESEBERG L.. HELGUERA. Plant Molecular Biology 42: 45-75. DUQUE. 2000. Acad Sci. LOUKOIANOV.. and J. TANKSLEY S.PATERSON A. SORRELLS M. Sci. Economic Botany 44: 79-91. Advances in Agronomy. YAN... RIESEBERG. FAHIMA. STEIN. DUBCOVSKY 2003. TOHME. Nature 375: 313-316. WICKER. Hybrid speciation accompanied by genomic reorganization in wild sunflowers. E. P.. L. Acad.. M.. HELGUERA. T. spans the Lr10 resistance locus in hexaploid wheat (Triticum aestivum L. G. USA 100:6263-6268. 97 (24): 13436–13441. Positional cloning of wheat vernalization gene VRN1. 160 CARRERA. E. BEEBE. S. SOLTIS. 1991. Gabriela. FEUILLET. Marcelo . SCHLAGENHAUF. Molecular evidence and the origin and development of the domesticated sunflower (Helianthus annuus. Alicia. Proc. C. Crop Sci.

PARTE V Métodos de propagación y conservación de germoplasma Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 161 .

GALDEANO. Ernestina . Sofía.162 OLMOS. LUCIANI. Gabriela.

A fin de lograr explantos de óptima calidad es conveniente hacer crecer las plantas donantes por un tiempo mínimo en condiciones de invernáculo. por una disminución de la concentración hormonal en el medio de cultivo. Esto es posible gracias a la propiedad de totipotencia que tienen las células vegetales. por lo cual la optimización de los protocolos de regeneración debe realizarse teniendo en cuenta los requerimientos intrínsecos de cada genotipo en cada fase del cultivo. a partir de un genotipo selecto y con una tasa de multiplicación ilimitada. 3) enraizamiento y 4) aclimatación de las plántulas. 3) la estación en la cual se colecta el material vegetal.-Capítulo 1 Micropropagación Olmos. 2 Etapas de la micropropagación La regeneración de plantas in vitro presenta cuatro etapas principales: 1) estableci- miento del cultivo. Para especies ornamentales tropicales y subtropicales se recomienda mantener las plantas donantes en condiciones de alta temperatura (25ºC) y baja humedad relativa (75%). 163 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal . Esta regeneración ocurre en fases consecutivas: la fase de desdiferenciación. Se recomienda colectar explantos primarios a campo durante la estación primaveral y estival.V. Generalmente. que es la etapa de preparación de los explantos para el establecimiento. En algunos casos tiene importancia considerar una etapa previa (Etapa 0). en general. donde las células se determinan para formar un órgano o embrión. los órganos jóvenes o bien rejuvenecidos son los que tienen mejor respuesta en el establecimiento que los obtenidos a partir de materiales adultos. ya que tiene el potencial de producir plantas de calidad uniforme a escala comercial. donde las células se vuelven competentes para responder ante cualquier estímulo organogénico o embriogénico. cuando existe una brotación activa de las yemas. Gabriela. las etapas de enraizamiento y aclimatación pueden combinarse en condiciones ex vitro. La planta donante debe elegirse sobre la base de una selección masal positiva para las características agronómicas deseables. Ernestina 1 Introducción La micropropagación consiste en la propagación de un genotipo a gran escala a través del empleo de técnicas de cultivo de tejidos. Una vez seleccionados los individuos. la fase de inducción por un balance hormonal específico del órgano o embrión a formarse y la fase de realización. Galdeano. Así. Sofía. Así. y la fase de realización. • Etapa 0: Preparación del material vegetal El empleo de explantos que se encuentran expuestos a bajos niveles de patógenos puede resolver el problema de la contaminación por hongos y bacterias durante el establecimiento del cultivo in vitro. En general. Estas fases están directamente afectadas por el balance hormonal del medio de cultivo. 2) la edad ontogénica y fisiológica del mismo. es preciso definir el tipo de explanto a establecer en condiciones in vitro. El cultivo es así una herramienta muy útil en los programas de mejoramiento. Los factores que influyen sobre la calidad del explanto son: 1) El tipo de órgano que sirve como explanto. la fase de inducción. esto es la capacidad de regenerar una planta completa cuando están sujetas a los estímulos adecuados. De esta forma es posible incidir directamente sobre el estado sanitario y la calidad de los explantos mediante el control de la intensidad lumínica. ya que el empleo de yemas en estado de dormición ocasiona serios problemas de contaminación. puede decirse que el proceso de desdiferenciación generalmente es promovido por una auxina. Luciani. a fin de reducir la proliferación de patógenos. 2) desarrollo y multiplicación de vástagos. 4) el tamaño y 5) el estado sanitario general de la planta donante. las células somáticas de cualquier tejido podrían formar tallos. temperatura y reguladores de crecimiento. raíces o embriones somáticos de acuerdo con la competencia que posean y al estímulo que reciban. donde se forma el órgano o embrión propiamente dicho.

• Etapa 1: Establecimiento del cultivo El objetivo de esta etapa es establecer cultivos viables y axénicos. Los materiales que demuestran tener mayor capacidad regenerativa son los obtenidos de tejidos meristemáticos jóvenes. Esto puede realizarse mediante análisis específicos para las enfermedades del cultivo.5 a 1. es conveniente evitar la formación de callo para disminuir el riesgo de variación somaclonal. embriones o semillas en plantas herbáceas y aquellos tejidos meristemáticos que determinan el crecimiento en grosor. el empleo de etanol al 70% por 1 minuto. antivirales y el cultivo de meristemas. así como también a los explantos mismos. resultado de una esterilización inefectiva de los explantos. En especies leñosas suele utilizarse como pretratamiento la inmersión de los explantos primarios en soluciones con citocininas a fin de inducir la brotación de yemas. citocininas y ácido giberélico y las • Etapa 2: Multiplicación OLMOS. Por otro lado. La desinfección superficial incluye varios pasos: el lavado de los explantos con agua corriente. etc.). tales como DAS-ELISA o PCR. Es importante señalar que en esta etapa. Pueden aplicarse además pretratamientos con reguladores de crecimiento a las plantas donantes. los medios de cultivo. previo establecimiento. el empleo de tejidos maduros permite visualizar los síntomas más marcados de la enfermedad. es importante señalar que el empleo de yemas adventicias (también llamadas yemas formadas de novo) está asociado con una mayor probabilidad de ocurrencia de variantes somaclonales respecto de los sistemas de propagación. Ernestina . Sofía. las plantas enfermas pueden tratarse con técnicas adecuadas para la eliminación de patógenos como la termoterapia. seguido de concentraciones variables de hipoclorito de sodio (0. los reguladores de crecimiento como auxinas. El éxito está determinado por la edad de la planta donante. Gabriela. La obtención de cultivos axénicos puede lograrse trabajando tanto sobre aspectos preventivos como curativos. viroides y bacterias. GALDEANO. En esta etapa. la carga de patógenos es mayor y por lo tanto la precisión del sistema de detección aumenta. como el cambium en las plantas leñosas. los explantos deben ser enjuagados al menos tres veces con agua destilada estéril. En primer lugar.5% de cloro activo) con unas gotas de tensoactivos para favorecer su penetración y actividad. El objetivo de esta etapa es mantener y aumentar la cantidad de brotes para los nuevos ciclos de multiplicación sucesivos y poder destinar parte de ellos a la siguiente etapa de producción (enraizamiento. en segundo lugar. En este sentido. cualquiera que sea la vía de regeneración empleada. En general. los patógenos endógenos y los patógenos propios del manejo en laboratorio. bulbificación. Controlando estos factores también es posible obtener plantas donantes y explantos más homogéneos durante todo el año. Algunos patógenos permanecen latentes y se expresan cuando son transferidos a un medio de cultivo nuevo. estos patógenos incluyen los patógenos superficiales del material vegetal. dormición y bulbificación son controlados por el fotoperíodo y la temperatura. la edad fisiológica. LUCIANI. Estos patógenos latentes podrían manejarse mediante el empleo de bacteriostáticos o antibióticos en el medio de cultivo. La realización de estos 164 análisis directamente sobre las plantas donantes. el aislamiento y la esterilización de los explantos. En esta etapa los principales procesos a controlar son la selección. presenta dos ventajas. la quimioterapia a través de la aplicación de antibióticos. sean yemas axilares o adventicias. Posteriormente. En la Etapa 1 también pueden observarse infecciones por bacterias y hongos asociados a trips que sobreviven a los tratamientos de esterilización y por patógenos endógenos latentes dentro del sistema vascular. Una acción preventiva la constituye el empleo de métodos de verificación de patógenos en los explantos.Los procesos morfogénicos de floración. análisis generales para patógenos cultivables como el empleo de medios de cultivo para el crecimiento de bacterias y hongos y métodos específicos para la detección e identificación de patógenos intracelulares como virus. basados en la regeneración a partir de yemas axilares o embriones somáticos. desinfectantes. el estado de desarrollo y el tamaño del explanto.

Figura 1: Embriogénesis somática en zanahoria. el tipo de explanto disponibilidad de protocolos para la obten. La principal desventaja del primer método es que el número de yemas En primer lugar. La inducción de yemas axilares comprende la multiplicación de yemas preformadas.subcultivado y el método del repique. esto último generalmente en au.somaclonal y segundo.vo líquido estéril y donde los embriones nesis y embriogénesis.condiciones de crecimiento juegan un papel implementación a escala comercial. Miguel Pedro Guerra) organogénesis. A su vez. disminuyendo además un mismo medio de cultivo cambia con el el riesgo de variación somaclonal. Comúnmente se Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 165 . En general.somáticos pueden regenerar y madurar a ma directa o indirecta. Esta última implica la partir de suspensiones celulares. forman embriones bipolares a través de etapas ontogénicas similares a la embriogénesis cigótica. A partir de células del floema sencia del regulador de creci. explanto o material vegetal.1). Hoy en día. ción de yemas adventicias ofrece mayor poLas condiciones culturales en las cuales tencial para la producción de vástagos. biorreactores para la micropropagación a gran mientras que por embriogénesis somática se escala está limitado por dos motivos críticos. sustentados formación de callo. pueden darse en for. La inducción de yemas adventicias comprende la inducción de tejido meristemático localizado mediante un tratamiento con reguladores de crecimiento.de cultivo y el ambiente externo o condiciopas de formación de yemas y enraizamiento nes de crecimiento del cuarto de cultivo. ya crece el explanto son el resultado de la que la inducción de vástagos ocurre en sitios interacción de tres factores: el estado del distintos al de los meristemas. conduciendo a la diferenciación del primordio y desarrollo del vástago.se obtienen los embriones somáticos que son un excelente sistema de miento que indujo la propagación clonal. La regenerando plantas en una forma mucho capacidad de respuesta de los explantos a más rápida y eficiente. la organo. por los altos costos go. aproximadamente 2 litros de medio de cultiAmbas vías de regeneración. la número de subcultivos. La forma. el recipiente conveniente porque permite saltar las eta. el empleo de unipolares que enraízan en etapas sucesivas. sin embar. La organogénesis puede darse por inducción de yemas axilares o adventicias.nes somáticos en plántulas. organogé.asociados con la conversión de estos embrioción con los sucesivos subcultivos. el declinamiento de las líneas axilares por explanto limita la cantidad de celulares (clones) por efecto de la variación vástagos.por la circulación permanente de nutrientes génesis conduce a la producción de vástagos y de aire (Fig. Los biorreactores permiten el cultivo a gran escala de los mismos. determinado en La embriogénesis somática es una vía más parte por el medio de cultivo.(Gentileza Dr. Los crítico sobre la multiplicación clonal de los biorreactores son equipos que contienen explantos. Esto se ve compensado. usualmente sin formación de callo. Por ción de embriones somáticos es clave para la esto mismo. por un aumento en la tasa de multiplica. el medio de cultivo debe automatización de la micropropagación y la optimizarse a fin de lograr la mayor tasa de consecuente reducción de costos para su multiplicación vegetativa.

A este medio se le adicionan además reguladores de crecimiento. como ocurre en la formación de embriones somáticos. cuyo fin es lograr la germinación de los embriones obtenidos. La presencia de compuestos fenólicos oxidados se encuentra asociada con tejidos vegetales sometidos a situaciones de estrés. el sellado del recipiente es importante. y afecta a dos procesos fisiológicos fundamentales: la fotosíntesis y la transpiración. tanto del tipo de auxinas como de citocininas. Los tipos de reguladores. 2ip (isopentiladenina): 1-5 µ M .4diclorofenoxiacético): 4-35 µM. AIA (ácido 3indolacético): 0. Debido a la disfunción metabólica asociada. picloram: 1-10 µM. 2). y. Gabriela. La principal consecuencia de la vitrificación es la baja supervivencia de las plántulas obtenida du- 166 OLMOS. GALDEANO. Estos compuestos se encuentran en ge- neral en las plantas en estado reducido y el ataque de patógenos produciría su oxidación y liberación.1-2 µM. b) BA (N6-benciladenina): 1-20 µM. Los cultivos se incuban en luz a 27±2º C con 14 horas de fotoperíodo e intensidad lumínica moderada (100 µmol m-2 s-1). dañando. La utilización de una tapa perforada con tapón de gomaespuma es altamente recomendable (Fig. Los tipos de auxinas (a) y citocininas (b) y los rangos de concentración más empleados se mencionan a continuación: a) IBA (ácido 3-indolbutírico): 0.01-1 µM. La segunda etapa requiere del empleo de un balance hormonal adecuado para favorecer los procesos de diferenciación y multiplicación celular. Esto inhibiría el crecimiento de los mismos. ZEA (zeatina): 1-10 µM. sus combinaciones y rangos de concentraciones deben ser optimizados para cada especie. CIN (cinetina): 0. se requiere de una tercera y cuarta etapa.1-1 micromolar. la inactivación de las fenoloxidasas con agentes quelantes o la reducción de su actividad o afinidad por el sustrato utilizando un bajo pH. La primera implica. Para ello se emplean agentes absorbentes de fenoles en el medio de cultivo. Los principales problemas que pueden presentarse durante los sucesivos subcultivos in vitro son la vitrificación y la producción de compuestos fenólicos por los explantos. generalmente. En este sentido. el empleo de concentraciones elevadas de reguladores de crecimiento (generalmente de auxinas más que citocininas) para favorecer la desdiferenciación. las plantas se vuelven heterótrofas y transpiran excesivamente debido a un mal funcionamiento estomático y a cambios estructurales en las paredes celulares. En este caso.emplea como medio basal el medio MS completo sugerido por Murashige & Skoog (1962) suplementado con 3% de sacarosa como fuente de carbono. Para la etapa de maduración se adiciona ABA (ácido abscícico) al medio basal en rangos de 5 a 20 micromolar. La vitrificación consiste en un proceso de morfogénesis anormal con cambios anatómicos. tales como el carbón activado y la polivinilpirrolidona o antioxidantes como el ácido ascórbico. la modificación del potencial redox con agentes reductores. genotipo y etapa de multiplicación determinada. Este fenómeno está regulado por dos factores clave que son la humedad relativa y el potencial agua. En algunos casos. evitándose la acumulación de CO 2 y de etileno. indirectamente. y. Es recomendable además lograr que la tasa de intercambio gaseoso entre los ambientes del recipiente y externo sea óptima.1-1 µM. Estas sustancias (quinonas. a los explantos. La etapa de multiplicación generalmente comprende dos períodos. Ernestina . fitoalexinas y protectores de auxinas) son muy lábiles y fácilmente oxidables. denominadas de maduración y de germinación respectivamente. el intercambio gaseoso es más limitado con el empleo de una tapa de plástico que con un film de polietileno extensible. Por esto mismo. morfológicos y fisiológicos que producen hojas de una apariencia vidriosa. el sistema es más dependiente de reguladores del tipo de las citocininas. ANA (ácido naftalenacético): 1-5 µM.1-2 µ M . cuya duración varía entre 1 a 2 semanas. Sofía. TDZ (tidizuron): 0. LUCIANI. 2. la fase de inducción y la fase de multiplicación propiamente dicha. durante el establecimiento y multiplicación in vitro es necesario emplear estrategias tendientes a disminuir el estrés de las plantas y limitar al mínimo la producción y oxidación de los compuestos fenólicos. seguido del subcultivo a un medio basal conteniendo AG (ácido giberélico) en concentraciones de 0.4-D (ácido 2. tales como aquel provocado por el daño mecánico producido durante el aislamiento del explanto de la planta madre. o bien cultivando in vitro en condiciones de oscuridad.

a fin de proceder a su enraizamiento. Otras estrategias para lograr un óptimo crecimiento implican el empleo de retardantes del crecimiento para estimular la formación de hojas nuevas después del transplante. los componentes orgánicos e inorgánicos del medio. En esta etapa se produce la formación de raíces adventicias. el empleo de agar está asociado con la formación de callo en la base de las estacas. En un medio solidificado con agar. Medios con baja concentración salina. los nutrientes se reducen de 1/2 a 1/4 de la composición original. 1972). rante la aclimatación ex vitro. El enraizamiento puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro. 1980) y GD (Gresshoff & Doy. el empleo de altos niveles de CO2 (antagonista del etileno) para estabilizar la vía de lignificación y prevenir la vitrificación a través de la inhibición de la hiperhidratación.Figura 2: Plantas de tabaco creciendo in vitro en un recipiente de vidrio con tapa metálica perforada y tapón de gomaespuma. las raíces producidas por este método son usualmente delgadas y no se forman raíces cabellera. El empleo de agar presenta ventajas y desventajas sobre la rizogénesis. es fundamental conocer el rol de los distintos factores que inciden negativamente sobre el desarrollo morfogénico normal (autótrofo) in vitro. elevada irradiación. que conduce al establecimiento de conexiones vasculares interrumpidas entre raíces y vástagos.1 a 1µM ). Por ello. que puede utilizarse a concentraciones de 1-10 µM durante pocas horas. se colocan durante períodos cortos en soluciones con concentraciones elevadas de auxinas. Estos factores son el ambiente de cultivo. En el primer caso pueden emplearse varios tipos de sustratos y reguladores de crecimiento (auxinas) para promover la rizogénesis. perlita y/o vermiculita humedecidas con medio nutritivo o agua. como el WPM (Lloyd & Mccown. la remoción de la fuente de carbohidratos del medio de cultivo y la defoliación de las plantas para estimular la formación de hojas nuevas estimulan la fotosíntesis y otras actividades metabólicas de las hojas en forma normal. etileno y excesiva humedad en el ambiente de cultivo. Los sustratos incluyen: medio solidificado con agar. La auxina más utilizada es el IBA (ácido 3indolbutírico). los vástagos de buen tamaño provenientes de la etapa de multiplicación y provistos de al menos 4-5 yemas. Luego los vástagos se transfieren a un medio de cultivo basal desprovisto de reguladores de crecimiento para permitir el desarrollo de las raíces. Una baja humedad relativa. los reguladores de crecimiento. Sin embargo. Adicionalmente. O bien. Por un lado. Aproximadamente 20 días después del tratamiento de inducción es posible la obtención de una adecuada cantidad de raíces funcionales que permitan continuar hacia la etapa de aclimatación. y la sacarosa se reduce a una concentración final de 1-2%. el enraizamiento de especies forestales en agar se favorecería al producirse una rizogénesis más sincrónica como resultado del contacto íntimo de las estacas con el medio de cultivo. Comúnmente. Alternativamente se pueden emplear niveles más bajos de auxinas (0. pero manteniendo la inducción por un período más prolongado (3 a 7 días). la luz y la temperatura. Es importante acentuar que el uso de Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 167 . incrementan el porcentaje de enraizamiento de vástagos axilares en plantas latifoliadas. En las especies herbáceas es relativamente fácil mientras que en las • Etapa 3: Enraizamiento y aclimatación especies leñosas es complicado por su limitada capacidad rizogénica. que evita la acumulación de CO2. la hipolignificación y la formación de aerénquima.

Luego del año 1975 la micropropagación de especies latifoliadas se realizó a través de la regeneración indirecta. La propagación por estacas de Cryptomeria japonica (kiri). por otro lado. El enraizamiento ex vitro permite que el enraizamiento y aclimatación se logren simultáneamente y que raramente se forme callo en la base de las estacas. Los vástagos se colectan en primavera y a principios del verano a fin de obtener material con reducido nivel de contaminación. GALDEANO. Por ello. 2) producción de yemas adventicias y 3) embriogénesis somática. para la mayoría de los árboles propagados por estacas se observa una rápida pérdida de capacidad de rizogénesis al aumentar la edad de la planta donante de las estacas. el estrés asociado a la evapotranspiración acelerada de las plantas durante las etapas iniciales del trasplante puede reducir considerablemente la tasa de supervivencia.auxinas a elevadas concentraciones es contraproducente porque induce la formación de callo en la base de las estacas. En este sentido. Ernestina . así como también por injertos. Sin embargo. Alternativamente. pasando por una etapa de callo. la multiplicación in vitro de coníferas y latifoliadas se logra a través de tres vías. asegurando así una conexión vascular continua entre el vástago y la raíz. La reproducción sexual es importante para la introducción de genes nuevos. de braquiblastos en coníferas. Sofía. Sin embargo. Por ello. Es el principal método utilizado para especies latifoliadas. yemas laterales y microestacas. 168 OLMOS. Durante la década del 40 se publicaron logros adicionales en al producción separada de vástagos y raíces en especies latifoliadas. En la década 1970-80 se obtuvieron las primeras plantas de álamo (Populus tremuloides) y Pinus palustris. Bajo condiciones ex vitro se utilizan diferentes sustratos. Sin embargo. mezclas de tierra y arena y/o abonos. que exhiben una significativa ganancia genética debida a efectos no aditivos de genes. la elongación de las yemas axilares a partir de braquiblastos de plantas adultas no ha sido muy exitosa. Tradicionalmente. 1) brotación de yemas adventicias. con la formación de vástagos a partir de callos de Sequoia sempervirens. Populus (álamo) y Salix (sauce) ha sido llevada a cabo duran- te siglos en Asia y Europa. que permitan lograr la rusticación de las plantas en forma progresiva. 3 Propagación de especies leñosas El empleo de clones en programas de reforestación genera al menos un 10 % de incremento en ganancia genética en relación con el empleo de plantas regeneradas por semillas de árboles selectos. prevenir los efectos de la endogamia y el mejoramiento de características controladas por efectos aditivos de genes. En latifoliadas de clima templado los mejores explantos los constituyen las yemas y vástagos en activo crecimiento más que las yemas en estado de dormición. LUCIANI. Gabriela. las especies forestales fueron propagadas vegetativamente mediante el enraizamiento de estacas. las yemas en dormición pueden ser colectadas y brotadas en condiciones ambientales controladas. los cuales conviene que estén debidamente esterilizados. a la formación de yemas adventicias en Ulmus campestris. En 1950 se publicó por primera vez la obtención de organogénesis en coníferas. En las coníferas. para cada cultivo es necesario optimizar un protocolo de rizogénesis que minimice la formación de callo y maximice la tasa de rizogénesis y supervivencia de las plantas. La reproducción asexual.1 Métodos de Micropropagación Los trabajos pioneros en el cultivo de tejidos cambiales de especies forestales condujeron. La brotación de yemas adventicias emplea ápices de vástagos. permite la multiplicación de individuos o grupos de individuos seleccionados de una población élite. En ambos casos la formación de plántulas se logró vía organogénesis. en el año 1940. 3. la máxima ganancia genética puede ser obtenida mediante el empleo conjunto de propagación sexual y agámica. Actualmente. es conveniente contar con instalaciones de invernadero o cámaras de crecimiento adecuadas para brindar temperatura y humedad relativa moderadas. una de las principales ventajas de la micropropagación es la capacidad potencial de desarrollar protocolos de multiplicación optimizados para multiplicar árboles adultos que han demostrado ser fenotípicamente superiores.

las yemas axilares obtenidas por rejuvenecimiento de plantas adultas.4-D (ácido 2. Por ello se recomienda el empleo de explantos primarios juveniles. En algunos casos es necesario además el empleo de alguna citocinina. los medios de cultivo más efectivos para estos fines contienen elevados niveles de sales y suministran nitrógeno tanto como NH4+ y NO3-. Las más usadas son la N6-benciladenina (BA) y el tidiazurón (TDZ). En la mayoría de los casos los embriones se originan en forma indirecta a partir de callos embriogénicos o bien. adicionados en la solución de lavandina. En algunos casos. desde el explanto. La desinfección de los mismos se logra mediante inmersión en etanol al 70 % (1 a 2 minutos) seguido de una solución de lavandina comercial conteniendo de 0.4-diclorofenoxiacético) y el ANA (ácido naftalenacético). tanto mayor es la respuesta a los tratamientos que conducen a la organogénesis de novo. Los medios basales más empleados son el MS. la formación de yemas adventicias se logra a partir de un callo originado a partir de tejido cambial. El método llamado multiplicación mediante nódulos meristemáticos es un método también utilizado para pino radiata y álamo. previa formación de callo que conduce a una alta tasa de multiplicación inicial. las yemas se inducen directamente sobre el explanto en general sin previo pasaje por una etapa de callo. una gimnosperma.. 3.4 % de hipoclorito de sodio durante 5-30 minutos. Generalmente se utiliza BA a concentraciones mayores o iguales a 5 ppm como única fuente de inducción o en combinación con otras citocininas.8 a 2. En la mayoría de los casos se emplean agentes tensoactivos. Se observa también que en los explantos de árboles adultos el problema se acentúa. La inducción de yemas adventicias es el método más empleado para gimnospermas y angiospermas. Para el caso de gimnospermas. Como medios de Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 169 . en concentraciones mayores de 2 µM. diluído a la mitad o a un cuarto de su formulación original o el WPM. formulado por Murashige & Skoog (1962). tanto en gimnospermas como en angiospermas. formulado por Lloyd & McCown (1981). como en Populus spp. En las coníferas puede ocurrir un proceso de poliembrionía. En este caso. cuanto más joven es el tejido. En las angiospermas los primeros embriones somáticos se obtuvieron de Santalum album. En este caso se obtiene básicamente un tejido meristemático (no un verdadero callo) usando relaciones altas de auxina/citocinina para luego inducir la producción de vástagos. Los tipos de explantos más utilizados para el establecimiento in vitro son los segmentos nodales de explantos juveniles. y los embriones cigóticos y plántulas obtenidas de semillas de origen sexual. a menudo secretan al medio de cultivo polifenoles oxidados. generalmente en concentraciones mayores a 1 µM si se trata de BA y entre 0.Para la inducción de vástagos. En todos los casos los explantos son lavados finalmente varias veces con agua destilada estéril. Las auxinas más comúnmente empleadas en el medio de inducción son el 2.1-1 µM en el caso del TDZ. Veinte años después pudieron lograrse plantas completas de abeto (Picea abies ). Los medios basales más usados para angiospermas son el MS (Murashige & Skoog. seguidos de cotiledones y epicótilos de plántulas. En las gimnospermas los mayores éxitos se lograron empleando como explantos embriones cigóticos maduros e inmaduros. donde sin embargo no fue posible la obtención de plantas completas. particularmente angiospermas. tales como Tritón®Ò y Tween20®Ò . se requiere el empleo de citocininas. La disponibilidad de protocolos vía embriogénesis somática para especies forestales es aún limitada. aunque en coníferas se ha encontrado que promueve la formación de callo y reduce el proceso de organogénesis. Los explantos más frecuentes son embriones cigóticos maduros. 1962) o el WPM (Lloyd & Mccown. En general. En general. directamente. La adición de auxinas puede ser beneficiosa.2 Condiciones de cultivo Los explantos jóvenes de especies leñosas. el empleo de medios reducidos en sales minerales y baja cantidad de nitrógeno resulta mucho mejor que el empleo de un medio altamente salino y nitrogenado como el MS. visibles como pigmentos marrones y/o negros. 1980).

89 µM IBA durante 2 días.4-D) y citocininas como la 2. También han sido efectivas auxinas como el ácido indol-butírico (IBA) y el ácido 2. 1983) y el medio de Périnet y Lalonde (1983). En la Fig. F) Vástago enraizado en medio de MS con la concentración salina reducida a la mitad. 3 se muestran las etapas de la micropropagación de plantas de paraíso gigante. Ernestina . (Olmos et al. aún en estos casos es posible 170 OLMOS. Sofía. los cultivos se incuban a 27±2º C con 14 horas de fotoperíodo e intensida- des lumí-nicas moderadas. gigantea L.3 Problemas asociados a la micropropagación de especie leñosas Es mucho más difícil propagar material adulto que juvenil ya que los primeros son recalcitrantes. multiplicación se emplean además el BTM (broadleaved tree medium. provincia de Misiones. Chalupa. suplementado con 9.22 µM BAP. E) Explantos provenientes de la etapa de multiplicación con problemas de vitrificación y presencia de callo. LUCIANI.29 µM ácido giberélico (GA3) + 0... el medio de multiplicación para los cultivos subsiguientes fue modificado reduciendo la concentración de BAP a 0.4-diclorofenoxiacético (2. estos vástagos fueron empleados como explantos para los subcultivos siguientes o para pasar a la etapa de enraizamiento.blanco y negro Figura 3: Etapas de la micropropagación en plantas de paraíso gigante.44 µM.isopentil amino purina (2iP). Los reguladores de crecimiento más utilizados son el ácido naftale-nacético (ANA) y la benciladenina (BA). Sin embargo. En estos casos. es decir. 3. En general. zeatina (Z) y tidiazurón (TDZ). cinetina (CIN). difíciles de regenerar. GALDEANO. 2002).22 µM 6-bencil amino-purina (BAP) + 0. Danzer Forestación S. Preparación del material vegetal: plantas de origen sexual de 6 meses de edad crecidas en condiciones de invernadero y utilizadas como donantes de meristemas. C) Etapa 1: Establecimiento del cultivo: vástagos desarrollados a partir de meristemas luego de 30 días sobre medio de establecimiento (Medio basal de Murashige y Skoog. Melia azedarach var. Las semillas de los genotipos seleccionados fueron empleadas para generar una población de plantas donantes de explantos. 2002): A) Huerto semillero de paraíso gigante con ejemplares de seis años de edad. gigantea L. Melia azedarach var. (Olmos et al. D) Etapa de Multiplicación: vástagos luego de 30 días sobre medio de multiplicación (medio MS suplementado con 2. 1962 (MS) suplementado con 2.25 µM ácido 3-indolbutírico (IBA). B) Etapa 0. Gabriela. seguido por el subcultivo en medio basal durante 30 días hasta estar listo para pasar a la etapa de aclimatación.A.

maíz. de tratamientos con reguladores de crecimiento (como citocininas como el BA). las formas de propagación son las mismas. las plantas regeneradas de Pinus elliotti suelen tener una raíz principal no ramificada y gruesa.extraer ex-plantos de mayor capacidad regenerativa mediante dos formas: 1) seleccionando los tejidos más juveniles dentro de un árbol o 2) induciendo el rejuvenecimiento del árbol donante antes de aislar los explantos. 4 Propagación de especies herbáceas La micropropagación de especies herbáceas está orientada a proveer material libre de patógenos. se recomienda emplear tejidos juveniles y un tamaño de explanto muy pequeño. yemas adventicias y embriogénesis somática. protocolos generales para dicotiledóneas que incluyen especies hortícolas (tomate. mediante el empleo de órganos juveniles separados de plantas adultas. propagar material seleccionado por su mayor rendimiento o por su mayor resistencia a enfermedades y estreses ambientales. Para seleccionar el material más juvenil en una planta adulta hay que considerar el fenómeno de topófisis. papa. Existe una gran variedad de protocolos. como la tasa de crecimiento. mediante el rejuvenecimiento de partes adultas. En segundo lugar. cebada. La juvenilidad puede lograrse por dos métodos. En general. arroz). pimiento y zanahoria) y leguminosas forrajeras (alfalfa. En los dos primeros casos. Esto es ocasionado por efecto del envejecimiento fisiológico e implica que los explantos más reactivos in vitro se encuentran en las yemas de las áreas basales del tronco y raíces. obtener material para estudios fisiológicos y genéticos y sentar las bases para la aplicación de técnicas de ingeniería genética. raigrás. avena. pasturas (pasto bermuda. bro- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 171 . pasto llorón) y hortícolas (cebolla. desarrollados en función de la especie y de los objetivos de la propagación. Este es un proceso por el cual el tipo de crecimiento de un nuevo individuo está determinado por la posición que ocupaba en la planta adulta. puerro). La embriogénesis u organogénesis indirecta. tienen una correlación directa con la calidad de los vástagos durante el cultivo in vitro. con formación de callo. A su vez. la utilización de estacas enraizadas o bien de brotes epicórmicos. Se emplean vías de regeneración por formación de yemas axilares. En cambio. En todos los casos. la iniciación de yemas adventicias y embriones (en este caso se logra un rejuvenecimiento total por el inicio de un nuevo ciclo ontogénico). ajo. el rejuvenecimiento es un proceso de reversión temporaria de las características adultas que permite lograr material vegetal en estado de juvenilidad. las etapas de la micropropagación incluyen tanto la multiplicación de yemas axilares por el cultivo de meristemas. las plantas obtenidas a través de semillas tienen raíces más delgadas y de mayor crecimiento lateral que permiten comparativamente un mejor anclaje y una mayor resistencia a los vientos. se emplea en cambio para generar variabilidad en programas de mejoramiento. la formación directa de yemas adventicias en explantos obtenidos a partir de placas basales o umbelas inmaduras y la formación indirecta de yemas adventicias y/o embriones somáticos obtenidos a partir de callos que provienen de distintos tipos de explantos (meristemas. el sistema de propagación a través de la organogénesis directa asegura la estabilidad genética de las plantas regeneradas y se emplean cuando el objetivo es la propagación clonal a gran escala. festuca alta. del injerto de yemas adultas sobre pies juveniles. por la poda severa (recepado de árboles adultos) y a través del cultivo in vitro de meristemas. Un problema crucial a resolver en cada sistema de propagación es la calidad diferencial de las raíces de las plantas regeneradas en relación con aquellas obtenidas por semillas. por ejemplo. trébol blanco) y protocolos para especies modelo como Arabidopsis y tabaco. En primer lugar. Por ejemplo. a fin de contrarrestar los efectos debidos a la topófisis. Tanto los atributos de supervivencia a campo. maní. el plagiotropismo y la susceptibilidad a enfermedades de las plantas. Existen protocolos generales para monocotiledóneas como en el caso ciertos cereales (trigo. conservar la diversidad específica en bancos de germoplasma. En el caso de ajo y cebolla.

Vitrification: morphological and physiological disorders of in vitro plants. 1995. THORPE. P. J. 5 Lecturas Recomendadas CASO. Kluwer Academic Publishers. A. H.A. KERL. ZIV M. by use of shoot tip culture. SCHENK. 1972. Micropropagation of conifer and brodleaved forest trees. KUMAR. rejuvenecimiento y propagación vegetativa de las especies leñosas. Communicationes Instituti Forestalis Cechosloveniae 13: 7-39. Plant Science Letters 29: 9-17. V. LALONDE. Kluwer Academic Publishers. 1993. The Netherlands: 1-13. Kluwer Academic Publishers. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol.) Gaertn. R. The Netherlands: 45-92. Dordrecht. LLOYD. Commercially feasible micropropagation of mountain laurel. Micropropagation. donde los embriones se obtienen utilizando tejidos juveniles (embriones. The potential of biotechnology in temperate agroforestry practices. GALDEANO.S. In: Agroforestry systems 32. SKOOG. Application of micropropagation to forestry. P. BRAVO. Can J Bot 50:199-204.B.G. 1991. 1984. MURASHIGE. Agriscientia 9 (1): 5-16.A. Handbook of Plant Cell Culture 2: 47-68. Dordrecht. 1992.. Combined Proceedings International Plant Propagator Society 30: 421-427. 1983.P. la micropropagación es llevada a cabo por la vía de la embriogénesis somática.. Netherlands: 29-44. SHARP. HILDEBRANDT. Sofía.. O. En Micropropagation. D. placa basal ó raíces). 172 OLMOS.tes.. CHALUPA. En Micropropagation. PE READ. Gabriela. Plant. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. cotiledones y pecíolos) como explantos. The Netherlands: 311-336. Kolmia latifolia. DEBERGH PC. organogénesis y regeneración directa a partir de los explantos.. I. HARRY.. B. W. KLOPFENSTEIN. 1983. 1981. Debergh PC y Zimmerman RH eds. In vitro propagation and nodulation of the actinorhizal host plant Alnus glutinosa (L. Ernestina . T.R. G. En el caso de alfalfa y otras leguminosas como soja y maní. Dordrecht.U. 15: 473-497. Debergh PC y Zimmerman RH eds. M. N. En algunos casos como pasto llorón (Eragrostis curvula) es posible la regeneración de plantas mediante embriogénesis. MCCOWN.. 1962. PÉRINET. F. LUCIANI. 1993. Kluwer Academic Publishers. T.E. Debergh PC y Zimmerman RH eds. Juvenilidad. J. En Micropropagation.. Cell culture methods for crop improvement..C. EVANS.

C.V.1 c) y se convierte en una planta (Fig. germina (Fig. Entre ellos se deben destacar el grupo liderado por Keith Walker de la Compañía Monsanto.. donde. Esta semilla. quien a partir de mediados de la década que va de 1970 a 1980 trabajó especialmente con alfalfa. b.Steward y colaboradores. puesta en condiciones adecuadas. 2). Mroginski.1 d). éstos son artificiales (Fig. Básicamente pueden utilizarse embriones hidratados. tal como resultan del proceso de embriogénesis somática. c y d) Obtención de plantas de Arachis pintoi (2n=3x=30) mediante semillas sintéticas (las barras verticales indican 3 mm). y que si tiene endosperma y cubierta. 2 Tipos de semillas sintéticas Las semillas sintéticas pueden fabricarse de diferentes maneras (Fig. entendiendo como tal a un simple embrión somático encapsulado. Sin embargo.-Capítulo 2 Semilla sintética Rey. fue muy importante. gar de encapsular embriones somáticos se encapsulan yemas. un gran propulsor de su utilización para la propagación a gran escala de plantas fue Toshio Murashige. También hay que mencionar la labor de Robert Lawrence de la Union Carbide. Kitto y Janick realizaron sus trabajos con zanahoria. Luis A. Otros investigadores como Drew. 1 Concepto Resulta difícil determinar como se originó la idea de producir semillas sintéticas o artificiales. En algunos casos estos embriones están protegidos por cubiertas protectoras. 2). o bien pueden ser desecados. De esta manera se pueden distinguir 5 tipos básicos de semillas sintéticas: 1) Semillas sintéticas con embriones desecados sin cubierta (Tipo 1. en lu- Figura 1: a) Partes de una semilla sintética. Muchos grupos de investigación han contribuido al desarrollo de tales semillas. Esta semilla se diferencia de la semilla verdadera en que el embrión es somático (producido por el fenómeno conocido como embriogénesis somática) y no cigótico. Hebe Y. Se Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 173 .1 a y b). quienes comenzaron los trabajos con especies forestales. quien en un simposio realizado en 1977 en Ghent (Bélgica) presentó formalmente la idea de la producción de las semillas sintéticas. Este tipo de «semillas sintéticas» –de una utilización muy restringida– no será tratado en este capítulo. El aporte del grupo liderado por Keith Redenbaugh de la Plant Genetic Inc. Existe otro tipo de semilla sintética. lechuga y apio. Fig. descripto por primera vez en 1958 por Jakob Reinert y F. especialmente por su descubrimiento de que hidrogeles como el alginato de sodio podían utilizarse para producir semillas artificiales que podían germinar en condiciones de invernadero. Estas son el resultado de la aplicación en agricultura del fenómeno de embriogénesis somática. diferente del definido más arriba.

de los embriones somáticos tal como resultan del proceso de embriogénesis somática.nes somáticos (agar. 3). zanahoria. la conversión en plantas es realmente la técnicas más utilizadas consiste en lograr la formación de una cubierta protectora de baja. Figura 2: Tipos de semillas sintéticas.en plantas. Pinus radiata . Por esta razón. Hebe Y. consiste en la utilización encapsulación. Tieta protectora (Tipo 2. Los resul. En el caso de alfalfa. donde los sujetos a la desecación. gomas). El proceso es muy simple y consiste básicamente en sumergir a los embriones somáticos en una solución de Explante alginato de sodio al 2%. . Santalum album y Pseudotsuga trata de un sistema muy simple donde los embriones son desecados hasta alcanzar porcentajes de humedad del 8 al 20% y no están provistos de ningún tipo de cubierta protectora. 2). 2) Semillas sintéticas con embriones de aquí en adelante. Luis A. Encapsulado Este procedimiento ha posibilitado la obtención de semillas sintéticas de nu1 2 3 4 5 merosas especies de interés económico. Esta técnica ha ne la ventaja de que los embriones no están sido utilizada en zanahoria y apio. en condiciones de labo. entre las que pueden mencionarse alfalSiembra en el suelo fa. 4) Semillas sintéticas con embriones somáticos hidratados suspendidos en un gel viscoso («fluid drilling»)(Tipo 4. Fig. ratorio. 100 mM de Ca (NO3)2 (Fig. sin ningún tipo de cubierta protectora. 3) Semillas sintéticas con embriones alginato de calcio. por Cultivo e inducción de la ejemplo. embriones somáticos hidratados y provisaproximadamente.«semilla sintética» se referirá a este tipo. 5) Semillas sintéticas con dad de este tipo de embriones por un año. Es el sistema más usado. Es el co para el embrión y permite una rápida sistema más simple. 2). 2). do en zanahoria y más recientemente en batata.. cuando se mencione somáticos desecados y provistos de cubier. que sirve para mantener una adecuada Gel Viscoso Encapsula do hidratación de las cápsulas y embriones.tos de una cubierta protectora (Tipo 5. gelrite. pasándolos luego a una solución acomplejante de. apio y especies forestales como Picea abies. Eventualmente esDesecados tas cápsulas pueden ser recubiertas por Hidratados sustancias tales como polioxieti-lenglicol. una de go.1 a y b). sin embar. MROGINSKI. consiste en la Especie % humedad en la semilla % conversión en plantas inclusión de varios embriones en Apium graveolens 10-13 35-85 una especie de tubo que contieDactylis glomerata 13 5-30 Medicago sativa 8-20 33-95 ne un gel viscoso. Inicialmente fue desarrollaembriones sin cubierta protectora. Fig. 2). Este sistema ha sido desechado en la práctica por la escasa conversión de embriones en plantas. Fig. Es posible mantener la viabili- 174 REY. que constituye la prinembriones fueron recubiertos con cipal causa de los bajos valores de conversión polyoxietileno y luego desecados. embriogénesis somática Con esta técnica se genera una semilla sintética consistente en un embrión somático recubierto con una cubierta Embriones somáticos seminal y provisto de un endosperma artificial (Fig. embriones sometidos a la desecación mostraron porcentajes de conversión en plantas de hasta el 95% (Tabla 1). Tabla 1: Ejemplos de semillas sintéticas basadas en la desecación de Fig. Si bien se han ensayado numetados han mostrado que es factible lograr rosas sustancias para encapsular a los embriouna buena supervivencia de éstos. compuesto que no es tóxihidratados sin cubierta (Tipo 3.

el lavado. la producción de embriones sin la necesidad de la fusión de gametas. en muchos casos. la base A B C D genética de este fenómeno no está completamente dilucidado. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 175 . En los últimos años se han hecho notables avances en el conocimiento de los facInducción de la embriogénesis somática Producción sincronizada y en gran escala de los embriones somáticos Maduración de los embriones somáticos Encapsulamiento mecanizado Almacenamiento de las semillas sintéticas Siembra en invernadero o a campo Figura 4: Etapas en la producción de las semillas sintéticas.tores que regulan la embriogénesis somática. en muchos casos no es de utilidad para iniciar la producción de semillas sintéticas debido a la baja tasa de producción de embriones aptos para la encapsulación. En primera instancia es necesario contar con un sistema eficiente de inducción de embriogénesis somática in vitro. 3 Producción de semillas sintéticas En la Fig. Estos embriones deben ser estructuras bipolares perfectas (con un polo que genere el vástago y el otro la raíz) capaces de convertirse («germinar») en plantas enteras (ver II. Sin embargo. I) semilla sintética (i) segundo menziesii. Una vez inducida la ) selección de embriones somáticos.E) inmersión de los embriones en alginato de sodio. es decir. En alI E falfa es un carácter hereF H G dable.-2). H) somática.4 se esquematizan 6 aspectos que deben tenerse en cuenta para la producción y manipulación de las semillas sintéticas. F) embriogénesis Figura 3: A-D) Inducción de la embriogénesis somática. Si bien la existencia de embriogénesis somática ha sido informada en centenares de especies de angiospermas y gimnospermas. codificado por dos genes dominantes de segregación independiente.G) acomplejamiento con nitrato de calcio.

El endosperma sintético generalmente está compuesto de los mismos medios de cultivo que se usan para inducir la germinación in vitro de los embriones. Lo ideal sería que las semillas sintéticas tuvieran un comportamiento similar al de la mayoría de las semillas verdaderas y permanecieran viables por mucho tiempo. de los embriones. maltosa y de pretratamientos con temperaturas bajas (4ºC). y pueden ser sembrados mecánicamente. Este aspecto se ve afectado por varios factores. que es un factor esencial para la obtención de altos valores de conversión en el suelo.3) podría resolver este punto. En general. Generalmente. por lo que también se incorporan compuestos de acción fungicida y bactericida. además de no generar variantes somaclonales. rindiendo elevados porcentajes de conversión en plantas. que no se fusionen entre sí y que no generen embriones secundarios. en la mayoría de los casos. Luis A. por acción mecánica o por dificultar la respiración. A fin de seccionarlos se han desarrollado diferentes procedimientos basados en filtros y equipos clasificadores automáticos. . Es además altamente deseable que conserven su viabilidad por largo tiempo en condiciones de laboratorio o preservados en refrigeradores comerciales. existen muchas plantas que no se propagan median- 176 REY. si bien muchos factores inciden negativamente para que ello ocurra. en estado cotiledonar. 4 Calidad de la semilla sintética Otro aspecto de gran importancia tecnológica es el contar con semillas sintéticas que. La criopreservación con nitrógeno líquido (ver V. las semillas sintéticas son sembradas primeramente en cámaras climatizadas o en invernaderos para luego ser llevadas al campo. En alfalfa se ha demostrado la necesidad del empleo de tratamientos con ácido abscísico. MROGINSKI. y puede obtenerse mediante una adecuada manipulación de la concentración de alginato y de los tiempos de la reacción de acomplejamiento.paso consiste en lograr una producción sincronizada. a gran escala.. entre los que figuran el tipo de embrión. La dureza de la cápsula puede afectar. 5 Ventajas del empleo de semillas sintéticas La mayoría de las plantas de interés económico son propagadas mediante semillas verdaderas. Los resultados obtenidos con semillas sintéticas de muchas especies muestran que aún hay que trabajar arduamente para que ello ocurra. El endosperma sintético tiene que proteger y nutrir al embrión hasta que germine y pueda crecer autotróficamente. Estas constituyen excelentes propágulos que pueden ser producidos a bajo costo. la dureza de la cápsula y la protección contra agentes patógenos. Por último. Sin embargo. en grandes cantidades. Es fundamental contar con embriones simples. Es común el agregado de 1-5 mg/ L de benomyl y de algunos antibióticos como cefotaxina o ampicilina. Hebe Y. Los mismos deben poder generarse rápidamente. la conversión de los embriones en plantas. lo ideal sería que la semilla sintética fuera sembrada directamente en el suelo. la calidad del endosperma sintético. Gran parte de la investigación se halla centrada en lograr una adecuada maduración de los embriones. sin fusionarse entre sí ni formar callos. vitaminas. en forma rápida. carecen de las sustancias de reserva necesarias para su conversión en plántulas. Estos medios contienen macro y micronutrientes. El almacenamiento de las semillas sintéticas es otro aspecto importante a tener en cuenta. Además. Deben desarrollarse de manera sincronizada y convertirse rápidamente en plantas. Actualmente. Para la producción a gran escala se han diseñado biorreactores y sistemas mecanizados de encapsulamiento adaptados a las particularidades de cada especie. la mayoría de ellas pueden ser conservadas fácilmente por mucho tiempo. la carencia de embriones de calidad es el factor limitante para la producción de semillas sintéticas. sacarosa y sustancias reguladoras de crecimiento. la dureza debe ser del orden de 0. En este punto es preciso recordar que si bien los embriones somáticos son muy similares a los embriones cigóticos.2 y 2 Kg/cm2 de presión. La composición de este endosperma lo hace susceptible al ataque de patógenos. tengan un alto porcentaje de conversión en plantas cuando éstas son sembradas en el suelo.

papa. paraíso). XX regular. En otras un alto grado de heterocigosis hace que las poblaciones derivadas de semillas sean muy heterogéneas (té.) Quebracho (Schinopsis balansae) Té (Camellia sinensis) Toona (Toona ciliata) Yerba mate (Ilex paraguariensis) XXX XXX XX XXX XX XXX XXX XX XX --XXX X X XX XX --- ----X ----X X --- XXX XXX XXX XXX --X ------- Ref. microorganismos y pesticidas que se quieran incorporar durante la siembra.: * depende de la especie --. La falta de una difusión masiva de esta tecnología en la actualidad obedece a razones técnicas. Adicionalmente las semillas sintéticas podrán actuar como transportadoras de reguladores de crecimiento. XXX elevado Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 177 . Necesidad de contar con semillas sintéticas en algunas plantas leñosas subtropicales de interés para la Argentina y estado actual de su desarrollo. yerba mate. También es el caso de muchos híbridos y de plantas que no producen semillas verdaderas o bien el caso de ciertas plantas transgénicas.) Mango (Mangifera indica) Paraíso (Melia azedarach) Pinos* (Pinus spp. varios árboles y plantas ornamentales. De esta manera. Las plantas podrán ser clonadas y sembradas en el campo utilizando sembradoras similares a las que hoy se emplean con las semillas verdaderas. y económicas. las poblaciones serán genéticamente uniformes y podrán ser comercializados ciertos híbridos resultantes de costosas manipulaciones manuales. entre otras. frutilla. lo que hace muy recomendable su propagación asexual. En todas estas situaciones el uso de semillas sintéticas resultaría ventajoso. Los cálculos realizados en rela- Tabla 2.) Algarrobo (Prosopis spp) Cítricos * (Citrus spp. batata. como es el caso. Otras especies tienen semillas de baja calidad (muchas coníferas) o presentan dificultades para la germinación (como. por ejemplo.te semillas verdaderas y lo hacen a través de sus partes vegetativas. X escaso. mandioca. los costos de los transplantes se verán reducidos. la yerba mate).Nulo. ya que en muchas especies aún no se ha logrado inducir eficientes sistemas que permitan la generación de grandes cantidades de embriones somáticos de calidad. de la caña de azúcar. Especie Estado de desarrollo Estado de Interés en contar con de la inducción de la desarrollo de la semillas sintéticas Embriogénesis producción de la Somática semilla sintétic a XXX X --- Aguaí (Chrysophyllum gonocarpum ) Araucarias (Araucaria spp.) Eucaliptos* (Eucalyptus spp. ajo. En la Tabla 2 se señalan algunas especies para las cuales sería necesario contar con un sistema de semilla sintética.

Tissue and Organ Culture. Kluwer Acad. V. (ed. Proceedings of the Fourth International Symposium on In Vitro Culture and Horticultural Breeding. CARLSON. D. las perspectivas para esta tecnología son altamente promisorias. 6 Conclusiones Si bien el uso de semilla sintética en la agricultura es aún incipiente y sólo es utilizada en ciertos grupos de árboles forestales. P. pp. En la Argentina. Semillas artificiales para la propagacion de plantas. 1998.E. «Somatic embryogenesis and development of synthetic seed technology. en el principal método de propagación de plantas. A. 2001. 560: 345-351. 1996. W. existe aún la necesidad de realizar estudios básicos sobre embriogénesis somática para luego abordar los aspectos «industriales» de la producción a gran escala de semillas sintéticas. A.A. J.Torres..C. In :Pérez Ponce. T. donde el desarrollo de esta tecnología es aún incipiente (Tabla 2). In S..D. 7 Lecturas recomendadas CANTLIFFE.Caldas. Acta Horticulturae. Si bien los progresos logrados en los últimos 20 años han sido notables. JIMÉNEZ GONZÁLEZ.M. Jain . Cuba. A.A.. 1991. 1995..J. 1 : 253-263.N. J. Embrapa. este costo es casi similar o incluso inferior al de la producción de semillas verdaderas para algunos híbridos de alcaucil. J. GRAY..E.W. CBAB. 1999. In: A..Santa Clara. . Instituto de Biología de Plantas. Hebe Y. MROGINSKI. pudiendo llegar a convertirse. la mayor demanda proviene del sector de productores de plantas leñosas. 2001. Bioreactor technology in plant cloning. Sin embargo.» Critical Reviews in Plant Sciences 10: 33-61..) Somatic embryogenesis in woody plants. OLMOS. Biotechnol..B.Buso (eds.) Cultura de Tecidos e Transformacao Genética de Plantas. IBARAKI. S. K. Plant Cell. M. L. E.Gupta.) Propagación y Mejora Genética de Plantas por Biotecnología. MROGINSKI. geranio y gerbera. GUERRA.R.. McKERSIE. Existe. Paradigmas 1: 5-9. Automation of somatic embryo production. K. P. Progress 14: 156-166.Q. 65: 179199. P K.225-240. 1998. BROWN D. TEIXEIRA.ción a alfalfa indican que su costo de producción supera en casi cien veces el costo de producción de la semilla verdadera. REY. sin embargo. Somatic embryogenesis and artificial seeds in forage legumes. la capacidad técnica y humana para encarar este desafío. L. 2: 533-568. Press. H. Bioprocessing for tree production in the forest industry: Conifer somatic embryogenesis. J.. D. tanto de angiospermas como de gimnospermas. Y.S. Manufactured seeds of woody plants. HARTLE J. Seed Science Research 6: 109-126. 178 REY. C. 1995. en un futuro cercano. London..C. GONZALEZ.R. Embriogenese somática e sementes sintéticas. Brasilia .C. MENDOZA . TIMMIS.J.B. Luis A. Newton (eds.

2 Métodos empleados para la conservación de germoplasma La estrategia a seguir para la conservación de germoplasma depende de la naturaleza del material vegetal. han provocado la reducción de la variabilidad genética de las especies cultivadas. Los primeros se basan en la conservación de las plantas en sus hábitat naturales e incluyen la conservación en parques nacionales y en reservas ecológicas. A estas semillas se las denominan «semillas recalcitrantes». las que se deben preservar adecuadamente. el hombre ha dependido básicamente de los vegetales como fuente de energía. Las semillas de numerosas especies que viven en zonas tropicales o subtropicales se incluyen en esta categoría. lo cual requiere de un considerable espacio físico e implica altos costos.V. a la par que las plantas están expuestas a las inclemencias del clima y de los incendios. que fueron el producto de siglos de evolución. viveros o jardines botánicos). los bancos de semillas constituyen uno de los métodos más convenientes para la conservación de germoplasma ex situ. control permanente de enfermedades y malezas. en la práctica. siendo muy elevados los riesgos de pérdidas por manipulación o desastres naturales. frutales tropicales perennes y diversas palmeras. como por ejemplo las de coco. Hebe 1 Introducción Desde sus inicios. Cuando se habla de preservación de germoplasma hay que subrayar que el objetivo es conservar. Para la conservación de semillas el International Plant Genetic Resouces Institute (IPGRI) recomienda su desecación hasta un 3-7% de humedad y su almacenamiento a bajas temperaturas (-18ºC). como por ejemplo las semillas de arroz. con la mayor integridad posible. la variabilidad genética de las poblaciones seleccionadas. colecciones de plantas (en campo. Rey. Por ello se ha buscado implantar nuevas estrategias para conservar los recursos genéticos en una forma más eficiente. plátanos y bananos). Este protocolo de conservación es. se han ido implementando técnicas de explotación. ocasionando una verdadera «erosión genética». El descubrimiento de la Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 179 . Por otra parte. De acuerdo con estas características se han intentado diversas alternativas de conservación. tomate y lechuga. cacao. avena. en ciertos casos este método de conservación no es aplicable porque la especie se propaga. Por otro lado. el más recomendado para la mayoría de las especies que se propagan por semillas y cuyas semillas resisten la desecación sin que ello implique pérdida de viabilidad. asociados a la necesidad de mano de obra especializada. En general. Sin embargo. en general. Otro método de conservación de germoplasma ex situ. Es en este contexto en que se recurre a las fuentes genéticas originales de variabilidad. bancos de cultivo in vitro. Al aumentar rápidamente el tamaño de la población. los métodos de conservación ex situ se basan en el mantenimiento del material biológico en bancos de semillas. papa. altamente homogéneas. trigo. o bien porque sus semillas pierden rápidamente la viabilidad cuando son sometidas a procesos de desecación. (como la mandioca. en muchos casos el mantenimiento no es posible y en otros resulta sumamente costoso. porque permiten almacenar una gran variabilidad genética en forma económica y práctica. Los métodos de conservación de germoplasma pueden dividirse en métodos in situ y métodos ex situ. y está definida por la duración de su ciclo de vida. Adriana.-Capítulo 3 Conservación de germoplasma in vitro Scocchi. el modo de reproducción y el tamaño de sus individuos. en particular agropecuarias. es mediante el cultivo in vitro de tejidos. las técnicas modernas de producción de variedades mejoradas. vegetativamente. que han contribuido a la destrucción de las poblaciones vegetales pioneras. caña de azúcar. tabaco. Sin embargo. A las semillas que presentan estas características se las denominan «semillas ortodoxas». que van desde el tradicional banco de semillas hasta el mantenimiento de áreas de reserva.

totipotencialidad de las células vegetales y la posibilidad de desarrollar plantas normales y completas a partir de diferentes explantes ha permitido pensar en el establecimiento de bancos de germoplasma utilizando el cultivo de tejidos vegetales. Canadá. embriones cigóticos. en un medio de cultivo artificial definido. con bajos costos de mantenimiento. Saccharum . de sus usos y aplicaciones. yemas. Este método cubre un amplio espectro de técnicas que implican el cultivo. Ipomoea. El objetivo es aumentar al máximo el período de transferencia del cultivo. de vástagos de especies de Fragaria . para lo cual se requiere: reducir la temperatura. embriones somáticos. semillas. Ananas . Rubus . polen. Luego del informe. La modificación de uno o más de estos factores es usada para la conservación de numerosas especies. En estos casos. Hebe . REY. es decir. en la Facultad de Ciencias Agrarias de la UNNE. Dioscorea y de microtubérculos de Solanum. 1). raíces. sin que ello afecte la viabilidad de los cultivos. Musa . en 1985 se iniciaron algunas investigaciones colaborativas entre el CIAT y el IPGRI para desarrollar esta técnica para meristemas de mandioca. bajo condiciones de asepsia. tallos. 180 SCOCCHI. Adriana. fácil manipulación de las muestras y no dependen del suministro eléctrico. El uso de la crioconservación para el almacenamiento de germoplasma ofrecen varias ventajas en relación con las técnicas tradicionales. anteras. En 1980 se reconoció el potencial de los métodos del cultivo in vitro para la conservación de especies de plantas consideradas «difíciles» (este término se refiere a las especies propagadas vegetativamente en forma obligada o que tienen semillas recalcitrantes). con lo cual se consigue la supresión del crecimiento hasta llegar a un estado de «suspensión animada». 1). Utilizando como explantes meristemas de clones selectos de paraíso mantenidos durante 12 meses a tasas de crecimiento reducidas (medios de cultivo subóptimos o empobrecidos y en condiciones de oscuridad) se logró mantener con éxito y regenerar plantas de paraíso que actualmente se encuentran en la etapa de evaluación a campo (Fig. Estas técnicas de almacenamiento se realizan a mediano plazo. modificar el medio de cultivo. Coffea. adicionar al mismo inhibidores osmóticos o retardantes del crecimiento. En el IBONE también se realizan experimentos tendientes a optimizar las técnicas de conservación in vitro a largo plazo. se basan en reducir el metabolismo celular y con ello reducir el crecimiento y el número de subcultivos durante meses hasta un año. que consisten en el almacenamiento a la temperatura del nitrógeno líquido (-196ºC) – crioconservación–. en 1968. de órganos o fragmentos de órganos (meristemas. Zingiber . A partir de estos estudios numerosos trabajos han dado muestras de la importancia de esta técnica. Es esta necesidad la que estimuló algunos de los primeros estudios sobre el mantenimiento in vitro del germoplasma de diversas especies. como por ejemplo para la conservación de microestacas de Manihot esculenta . la conservación de los genotipos se realiza mediante el mantenimiento de plantas vivas o mediante el cultivo in vitro de ápices caulinares o de nudos. El mantenimiento de los recursos fitogenéticos mediante los métodos de cultivo in vitro se logra generando cambios en el ambiente de cultivo que permiten desacelerar el crecimiento de las células y de los tejidos. Algunos de los primeros estudios sobre el mantenimiento in vitro del germoplasma fueron realizados en mandioca en el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) y en papa en el Centro Internacional de la Papa (CIP). reducir las condiciones de luminosidad. acerca de la crioconservación de células de lino y de los resultados satisfactorios que se obtuvieron con la crioconservación de meristemas de frutilla en el Instituto de Biotecnología de Plantas en Saskatoon. Desde hace varios años en el Laboratorio de Cultivo in vitro del Instituto de Botánica del Nordeste (IBONE). bajo condiciones ambientales controladas. pues permiten la conservación a largo plazo (años). se llevan a cabo experimentos referidos a la conservación de germoplasma de paraíso (Melia azedarach). En el mencionado Instituto se ha logrado la crioconservación de meristemas de paraíso mediante la técnica de encapsulación-deshidratación (Fig. callos o protoplastos). hojas. Esta técnica ha sido utilizada para mantener colecciones en crecimiento mínimo. deshidratadores de tejido o modificar la fase gaseosa del recipiente de cultivo.

20%). especie que se propaga principalmente por vía asexual (mediante estacas). leccionado dependerá del objetivo de conservación y está estrechamente relacionado • Aclimatación Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 181 . minimizanFacultad de Ciencias Agrarias.téril.cias higroscópicas como silica gel o glicerol (5 rial a crioconservar se debe tener la absoluta . ya que es necesario eliminar toda el agua libre presenFigura 1: Estrategias para la conservación de germoplasma de paraíso (Melia azedarach te en el tejido veL. o sometiendo al explante a una coseguridad de que a partir del mismo se ob. La deshidratación del tejido puede realizarse en una cámara a 0ºC o en cámaras • Selección del material a crioconservar herméticamente cerradas utilizando sustanCuando se realiza la selección del mate. getal. • Deshidratación La deshidratación del explante es un paso crucial para el éxito de la crio-conservación. Actualmente se están realizando estudios tendientes a desarrollar protocolos para la crio-conservación de meristemas. do así posibles daños debidos a conLa crioconservación consta de seis pasos: gelación. El explante se. con lo cual paralelamente a la conservación se consigue el saneamiento de los cultivares. Por ejemplo. IBONE.). en el caso de la mandioca.con el tipo de propagación de la especie. en el CIAT se conserva su germoplasma in vitro mediante el cultivo de microestacas y también de meristemas. desarrolladas en el Laboratorio de Cultivo in vitro de Tejidos Vegetales.rriente de aire en un flujo laminar de aire estendrán plantas completas. UNNE.

aumentando la viscosidad del tejido vegetal y reduciendo la permeabilidad de las células. necesitan de una me- 182 SCOCCHI. REY.Gotita congelada.Precultivo . las cuales no están adaptadas para soportar temperaturas inferiores a 0ºC. • Descongelamiento y rehidratación Cuando se desea recuperar el explante mantenido en nitrógeno líquido se puede realizar un descongelamiento rápido en baño de agua (generalmente 1-2 min. alcoholes (glicerol. La aclimatación lenta se realiza bajando gradualmente la temperatura (0. pues una deshidratación excesiva de las células puede exponerlas a una alta concentración interna de solutos. Adriana. a 30-40 ºC) o en forma lenta. las cuales básicamente pueden resumirse en técnicas de: . Luego se lleva directamente a la temperatura del nitrógeno líquido (-196 ºC). a una velocidad adecuada. La aclimatación rápida consiste en colocar el explante directamente en nitrógeno líquido.5–TrifenilTetrazolio) que colorea el tejido que ha sobrevivido a la crioconservación o midiendo la conductividad eléctrica. Por esta razón. La evaluación de la viabilidad puede llevarse a cabo en forma visual. que son una combinación de varios crioprotectores tales como el PVS2. por tratarse de tejidos más resistentes. Los sistemas secos.1-3ºC/min.Sistemas secos: comprenden todos aquellos tejidos vegetales endógenamente resistentes y tolerantes a las bajas temperaturas y a la deshidratación.3. Tanto los crioprotectores como las soluciones de vitrificación actúan fundamentalmente como agentes anticongelantes.Desecación . utilizando TTC (cloruro de 2.Vitrificación .Encapsulación-vitrificación . nor preparación para el almacenamiento y comprenden aquellas especies que habitan zonas frías y/o templadas.04M de sacarosa. 15% de etilenglicol. También pueden utilizarse soluciones de vitrificación. etileglicol. Esta protección puede lograrse a través del uso de crioprotectores o bien por la utilización de soluciones de vitrificación. dimetilsulfóxido (DMSO) y polivinilpirrolidona (PVP). hasta alcanzar una temperatura próxima a los -40 ºC. Hebe . En cambio. • Técnicas de almacenamiento del material a preservar En la última década han surgido numerosas técnicas que combinan el uso de crioprotectores y de soluciones de vitrificación con técnicas de deshidratación y encapsulación. glucosa).Precultivo-desecación . con o sin la adición exógena de crioprotectores. que permite estimar el daño producido en las membranas celulares. A fin de preparar (aclimatar) el explante para enfrentar las bajas temperaturas a las que será sometido. . 15% de DMSO y 0. los sistemas hidratados son más susceptibles a las bajas temperaturas y están representados por todas aquellas especies que habitan zonas tropicales y subtropicales. Este punto debe ser manejado cuidadosamente. el material generalmente se congela lentamente. manitol y sorbitol). se utilizan sustancias crioprotectoras como azúcares (sacarosa. • Tests de viabilidad Los tests de viabilidad nos permiten comprobar la/s zona/s del tejido que ha/n muerto y cuál/es ha/n sobrevivido al frío.Sistemas hidratados: son todos aquellos tejidos vegetales no tolerantes a las bajas temperaturas y a la deshidratación.Encapsulación-deshidratación . por lo cual se requiere de una protección exógena.La aclimatación puede realizarse en forma rápida o lenta. En la Tabla 1 se detallan las especies y • Almacenamiento De acuerdo al material vegetal que se utilice. Por este motivo estos tejidos deben ser protegidos exógenamente mediante el uso de crioprotectores.). sometiendo al explante a la temperatura del laboratorio o a una corriente de aire en el flujo laminar de aire estéril. se presentan dos grandes sistemas: . realizando el re-cultivo y determinando la capacidad de regeneración. que está compuesto por 30% de glicerol.

anteras y suspensiones celulares de Triticum spp. Ipomoea batata.adventicias de Guazuma crinita. Saccharum spp. Phaseolus vulgaris y Oryza spp. Técnica Empleada Explante y Especie Suspensiones celulares de Catharanthus roseus . Malus spp. Embriones somáticos de Phoenix dactylifera. embriones cigóticos.Tabla 1: Utilización de técnicas de crioconservación en diferentes explantes de algunas especies de interés agronómico. Meristemas de Pyrus communis. Manihot esculenta (15 genotipos). Colocasia esculenta .. Células nucelares de Citrus sinensis . PrecultivoPyrus spp. polen. Suspensiones celulares embriogénicas de Oryza sativa . -Encapsulación-Deshidratación La técnica de encapsulación-deshidratación se basa en la metodología aplicada a las semillas sintéticas. Semillas de Bletilla striata Semillas y protocormos de Dendrobium candidum. Cucurbita spp. los explantes son pretratados. Prunus spp. Malus domestica. Malus spp y de Pyrus spp. y de Elaeis Desecación guineensis (aplicada como rutina a 80 clones).. explantes en los cuales cada una de estas técnicas ha sido empleada con resultados satisfactorios. segmentos de raíz y yemas Encapsulación. en la cual un explante es recubierto por una matriz de alginato de sodio y polimerizado en una solución de cloruro de calcio.. Citrus spp. y Morus spp. Embriones somáticos de Cucumis melo. Meristemas de Dioscorea alata. Armoracia rusticana. y de Saccharum spp. Yemas adventicias de Guazuma crinita Mart. Una vez encapsulados. Ejes embriogénicos y semillas de Gossypium hirsutum. y de Fragaria x ananassa . Meristemas de Musa spp. Gotita Congelada Apices de 150 variedades de Solanum tuberosum. Coffea racemosa x Coffea sessiliflora.. EncapsulaciónApices de Pyrus spp. Líneas celulares embriogénicas de Pinus silvestris . y de Wasabia japonica Meristemas de Morus spp.3 has- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 183 . Desecación Ejes embriogénicos de Junglans cinerea . segmentos nodales. Precultivo Polen y anteras de Oryza spp Líneas celulares y callos de Oryza sativa . Vitrificación Apices de Dyanthus cariophyllus. Embriones somáticos de Elaeis guineensis . polen y anteras de Arachis hypogaea. Embriones somáticos de Abies cephalonica Semillas. formando un gel de alginato de calcio alrededor del explante. Lilium spp. Meristemas. Vitrificación Ápices de Ananas comosus. y de Apium graveolens . Meristemas. Embriones cigóticos de Triticum aestivum. Cocos nucifera. y de Elaeis guineensis Embriones somáticos y ejes embriogénicos de Camellia japonica . Pyrus spp. y Solanum Deshidratación tuberosum Apices caulinares de Camellia japonica. Suspensiones celulares y callos embriogénicos de Gossypium hirsutum. Semillas de Pinus silvestris .... Populus alba. y de Solanum spp. Meristemas de 125 variedades de Solanum spp. generalmente con sacarosa (desde 0.. Coffea spp.

Hebe . . Luego de la exposición a las soluciones de vitrificación (generalmente a una temperatura de 0ºC. polen y anteras de Oryza spp. embriones cigóticos.. previo a la criopreservación. como en el caso de la conservación de embriones maduros de Cocos nucifera. En especies tolerantes al frío la exposición de las plantas madres a bajas temperaturas durante varias semanas. las muestras pueden ser sumergidas directamente en nitrógeno líquido o a través de un descenso lento de la temperatura. Las soluciones crioprotectoras recomendadas en los protocolos de vitrificación son generalmente tóxicas para las células. la utilización de sacarosa y DMSO o glicerol en semillas.Precultivo La técnica del precultivo involucra la incorporación de crioprotectores (durante distintos tiempos que dependen del explante) antes del congelamiento. como en el caso de embriones somáticos de Elaeis guineensis. compuesta por 40% de etilenglicol. Generalmente en el precultivo se emplean azúcares como sacarosa o glucosa.Vitrificación Esta técnica involucra el pretratamiento de las muestras con soluciones de vitrificación. . . Las muestras son encapsuladas en alginato de calcio y sometidas a vitrificación durante el enfriamiento. Este procedimiento es una adaptación de la técnica clásica desarrollada para meristemas de mandioca. Las cápsulas.. Esta técnica consiste en someter al explante a una corriente de aire en un flujo laminar o en cámaras herméticamente cerradas. parcialmente desecadas y luego sometidas a enfriamiento rápido o lento. con un porcentaje de supervivencia del 40%. en medio líquido y formar una microgota (2. Esta técnica ha sido satisfactoriamente aplicada en 150 variedades de Solanum tuberosum. El tiempo de exposición a la solución debe estar relacionado con el tamaño del explante y la misma debe ser removida rápidamente luego del descongelado. ya mencionado. Como ejemplos pueden citarse la adición de altas dosis de sacarosa para la crioconservación de meristemas de Musa spp.. 15% de sorbitol y 6% de albúmina sérica bovina.Desecación La técnica de desecación es un proceso muy simple que sólo requiere la deshidratación del material vegetal. La deshidratación puede llevarse a cabo sometiendo las cápsulas de alginato (conteniendo a los explantes) a una corriente de aire en el flujo laminar o exponiéndolas en cámaras herméticamente cerradas con silica gel. o bien otra. Las muestras son tratadas con crioprotectores.Gotita congelada Esta técnica ha sido aplicada con éxito en ápices de Solanum tuberosum. a fin de disminuir los riesgos de fitotoxicidad).Precultivo-Desecación Esta técnica es una combinación de dos de las técnicas descriptas anteriormente.Encapsulación-Vitrificación La técnica de encapsulación-vitrificación es una combinación de las técnicas de encapsulación-deshidratación y vitrificación. y la utilización de ácido abscísico para la conservación de líneas celulares y de callos de Oryza sativa. así deshidratadas.ta 1. donde el cultivo dura 11-20 hs. Esto puede explicarse debido a que las cápsulas de alginato de calcio reducen la toxicidad de las soluciones de vitrificación. como el PVS2. desde horas. REY. luego de lo cual se realiza un enfriado rápido sumergiendo el material directamente en nitrógeno líquido.5M). Adriana. Consiste en pretratar el material con DMSO por 2-3 hs. incrementa la supervivencia. . que actúa como crioprotector. la utilización de polietilenglicol (PEG) y DMSO en el caso de embriones cigóticos de Triticum aestivum y Phaseolus vulgaris. . 184 SCOCCHI. la cual se suspende sobre papel de aluminio y luego se sumerge directamente en nitrógeno líquido. que dura 7 días.5 ml). pueden sumergirse directamente en nitrógeno líquido o bien pueden ser llevadas a un descenso lento de temperatura. La duración del tratamiento es variable. . hasta días. La supervivencia del material vegetal cuando se utiliza esta técnica es un 30% mejor que cuando se usa la de encapsulación-deshidratación. que contienen silica gel. la cual es crucial para el éxito de la crioconservación.

F.3 Conclusiones Los recursos fitogenéticos constituyen un reservorio de información genética imprescindible para la solución de muchos de los problemas a los que se enfrenta la agricultura. como parte esencial de una estrategia global para la conservación de la biodiversidad. para lograr el objetivo común de preservar los recursos fitogenéticos. Mroginski (eds. A. Roca.M.A. 4 Lecturas recomendadas ENGELMANN. Por ello.M. Engelmann. La disponibilidad de bancos de germoplasma in vitro. Solamun spp. En la última década se han producido avances significativos en el desarrollo de técnicas in vitro de conservación. Fundamentos y aplicaciones. W. Colombia). Engelmann. Cryopreservation of tropical plant germoplasm.) CIAT (32) :715-730. Criopreservación del Germoplasma. ROCA.. . 2000. Mroginski (eds. Roca W. TAKAGI. M. and H. se considera que el conjunto de técnicas de conservación in situ y ex situ son métodos complementarios.) JIRCAS-IPGRI pp 496. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. KARTHA. F.I.M. D. no excluyentes.) IPGRI :1-63. Status report on the development and application of in vitro techniques for the conservation and use of plant genetic resources. 1997. Las ténicas de crecimiento lento son utilizadas como rutina en centros internacionales tales como el CIAT (Cali. Los métodos para asegurar su conservación son diversos y cada uno de ellos posee sus ventajas e inconvenientes. y L. Pyrus spp. ROCA. and H. Perú). F. 1991. han contribuido a dicho avance. tanto en condiciones de crecimiento lento como la conservación a temperaturas ultrabajas (crioconservación). Las técnicas de crioconservación ofrecen una alternativa muy valiosa cuando se piensa en conservar los recursos fitogenéticos por tiempo ilimitado (años). ENGELMANN. Current research progress and application. 1991. K. y L. W. Takagi (eds. (ed. Métodos de conservación in vitro de germoplasma. W. si bien hasta el momento sólo se aplica como rutina para la conservación de líneas celulares en laboratorios de investigación y para la conservación de algunos genotipos pertenecientes a los géneros Rubus spp. F.) CIAT (31) :697-714. MROGINSKI.. ARIAS y R. L.A. . CHÁVEZ. En: Cultivo de tejidos en la agricultura.K. Fundamentos y aplicaciones. y Elaeis guineensis. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 185 . donde se aplican a la conservación de germoplasma de mandioca y para la conservación de germoplasma de papa en el CIP (Centro Internacional de la Papa.

PARTE VI Métodos de análisis de la variabilidad Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 187 .

Sofía y DI RENZO. Miguel .188 OLMOS.

con innumerables marcadores moleculares a lo largo de los cromosomas. Marker Assisted Selection). poniendo a prueba las mismas mediante una confrontación con la experiencia. que tiene como objetivo la explicación y la predicción de los hechos. sino de todo el genoma. El ensayo . La biotecnología ha colaborado mediante la construcción de mapas genéticos saturados. Di Renzo. que están determinados por poligenes y por efectos ambientales. 2 Experimento científico La ciencia. Por otra parte. se basa en la reproducción de ciertos fenómenos bajo condiciones controladas con el objeto de medir el efecto que produce la modificación de uno o varios factores en estudio (tratamientos) sobre la variable dependiente. evitando los errores tendenciosos y sistemáticos (biass=sesgo) de manera tal que los datos recavados provean conclusiones con un amplio rango de validez. como los marcadores moleculares. De esta manera. La variación que presentan los individuos de una población puede ser discontinua o continua. ya que estos caracteres están regidos por uno o por pocos genes y el ambiente no tiene efecto en su manifestación fenotípica. deberá ser lo más simple posible.-Capítulo 1 Consideraciones estadísticas y biológicas para estimar variabilidad genética Olmos. cuenta con el método científico como un procedimiento que contempla un proceso en flujo desde los hechos observados hasta la proposición de hipótesis explicatorias. para magnificar el efecto de los tratamientos y disminuir el error experimental. Sofía. En cambio. Los QTL representan un nuevo sistema de enfocar el estudio básico y el manejo práctico de los sistemas poligénicos y de la genética cuantitativa. De esta manera. que no miden el efecto de genes individuales o de segmentos cromosómicos específicos. se procura minimizar el efecto de otros factores no controlados que ejercen influencia en las observaciones. Los caracteres cualitativos de variación discontinua. cuidadosamente diseñado. El experimento científico. representados por la mayoría de los caracteres de interés agronómico. los caracteres cuantitativos. Un requisito fundamental en toda ciencia fáctica es la contrastación de las hipótesis planteadas. El diseño experimental crea artificialmente las condiciones para la contrastación de la hipótesis y brinda la metodología estadística correspondiente para el análisis de los datos. Miguel 1 La variación biológica La variabilidad genética es un hecho universal en las poblaciones reproductivas y una condición preliminar necesaria para el cambio evolutivo y para la respuesta al mejoramiento genético mediante selección o hibridación. Por otra parte son conocidos los peligros que implica la uniformidad y la falta de diversidad en las especies cultivadas y en los animales domésticos. presentan variación continua y los fenotipos. esto es.VI. que como queda dicho es un ensayo destinado a probar la validez de una hipótesis. como consecuencia de la erosión genética. son difíciles de clasificar en categorías discretas. las variaciones observadas se deberán casi exclusivamente a los tratamientos. Para conocer el efecto de los factores controlados y el de los factores no controlados (error experimental) sobre el material Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 189 . Para su análisis deben emplearse métodos biométricos. que permiten ubicar regiones de actividad cuantitativa (QTL. un carácter de variación contínua puede ser manejado como si se tratara de un carácter de herencia mendeliana mediante la introgresión de un fragmento de cromosoma conteniendo un QTL por retrocruzamientos sucesivos en las variedades comerciales. permiten clasificar a los individuos sin ambigüedades. Durante los últimos años ha surgido un consenso entre los mejoradores y genetistas moleculares sobre la conveniencia del uso de marcadores moleculares para asistir a la selección de caracteres cuantitativos (MAS. Quantitative Trait Loci). Esto se logra utilizando materiales y condiciones experimentales lo más homogéneas posibles.

190 OLMOS. competencia. Cuando se estudian dos (o más) factores simultáneamente. el experimento científico es un ensayo destinado a probar la validez de una hipótesis. dosis de un fertilizante. si se estudia el efecto de fertilizante y competencia. cada dosis (o nivel) es un tratamiento distinto. Frente a la Ho se plantea una hipótesis alternativa (Ha). Si la probabilidad calculada es igual o mayor que un nivel de significancia preestablecido (de 0. densidades de siembra. Se concluye que los tratamientos no tienen efecto significati- Terminología . ( variables continuas). Si se estudia el factor fertilizante. . grado de respuesta a un patógeno (tolerante.: distintas dosis de fertilizante = causa). pH de los medios de cultivo). Las hipótesis estadísticas plantean supuestos referentes a algún parámetro poblacional. o sea que al menos uno de los niveles del factor probado tiene efecto sobre la variable de interés. Es decir que P es la probabilidad que la Ho sea verdadera./ha). los distintos tratamientos resultan de la combinación de cada nivel de un factor con cada nivel del otro factor. número de colonias (número). como por ejemplo la igualdad entre varianzas o entre coeficientes de regresión. tamaño de camada. Ej. Miguel . la Ho no se rechaza y se infiere que no hay diferencias significativas entre las medias de los tratamientos. rendimiento = efecto): . Por lo general se utiliza la hipótesis nula (Ho).Tratamiento: Es cada nivel del factor en estudio. (variables discretas). tiempo a panojamiento (días). Si se prueba el efecto de concentraciones crecientes de un fertilizante los tratamientos tendrían un orden natural ( discreto ordinal).experimental es necesario formular claramente una hipótesis. cada tratamiento resulta de la combinación de una dosis de fertilizante y una densidad de siembra determinada. producen variaciones sobre una característica de interés (ej.05 por ejemplo). La Ha plantea que al menos una de las medias difiere significativamente del resto. utilizar un diseño experimental apropiado y analizar e interpretar los resultados obtenidos. Las hipótesis estadísticas también prueban otras características poblacionales. la aplicación de distintos tratamientos (ej. fertilizante. Por ejemplo.Factor: es la causa cuyo efecto se quiere medir (ej. . intermedio. pero si se prueban distintas combinaciones de fertilizantes (NPK). Por ejemplo.Nivel: es cada una de las categorías o alternativas del factor en estudio (ej. Sofía y DI RENZO. Para determinar si un tratamiento tuvo algún efecto. diámetro de colonia (mm). La variación de estos datos permite cuantificar el efecto del factor al que está sometido el material. medio de cultivo) . 3 Hipótesis estadística Como se indicara previamente. El ensayo y las pruebas de significancia permiten calcular la probabilidad a favor de la hipótesis nula. rendimiento (kg. no habría un orden entre los tratamientos ( discreto categórica).Variable dependiente: variable respuesta o simplemente «variable» es el rasgo o carácter de interés cuyas mediciones constituyen los datos u observaciones del experimento.Variable independiente: es la causa que afecta los resultados del experimento y está representada por los distintos niveles del factor cuyo efecto se quiere medir (tratamientos) o que se quiere controlar (bloques). que se refiere a la igualdad entre los parámetros probados. lo que equivale probar la igualdad entre las medias de los tratamientos. se considera a la Ho como la ausencia de efectos. susceptible).

que se calcula sobre la base de las diferencias entre las observaciones de cada tratamiento. tanto cualitativos como cuantitativos. En cambio si la probabilidad calculada es pequeña (P≤0. generalmente designado por α. estamos dispuestos a aceptar un error de tipo I. señaladas por los promedios de éstos y otra debida a la diferencia dentro de los tratamientos. Los programas de computación calculan directamente el P (la probabilidad) del test. Varianza entre tratamientos Para aislar la variación entre los grupos necesitamos suprimir la variación dentro de los tratamientos. 4 Análisis univariado Los análisis univariados emplean una variable dependiente. Si se fija α = 0. en términos de probabilidad. rechazar una Ho que sea verdadera. que es un cociente de varianzas. se utiliza la prueba F para verificar la igualdad de medias. el cual se compara con un F de tabla (Ft) para un determinado nivel de significación (por ejemplo α = 0. Esto conlleva a que aceptemos una Ho como verdadera con una probabilidad 1-α. En el análisis de la varianza (ANOVA). es una generalización de la prueba t. El cociente entre las varianzas permite obtener un valor de F calculado (Fc).05) y los grados de libertad de los tratamientos y del error. que hay diferencias significativas entre los tratamientos. Podemos obtener este resultado haciendo a todos los individuos de un mismo grupo iguales entre sí e iguales a la media del grupo. por ejemplo. Mediante esta operación. Si P≤0. mientras que los análisis multivariados comparan muestras sobre la base de dos o más variables que están relacionadas. La variación dentro de un tratamiento se debe a las desviaciones que presentan los valores individuales en ese grupo en relación con la media de ese grupo.vo en la variabilidad del carácter estudiado y las diferencias observadas no son mayores que las que se producirían por azar.05 estamos dispuestos a aceptar el error tipo I aproximadamente una de cada 20 veces. Varianza total Se puede considerar a la variación total como la resultante de dos fuentes de variación: una fuente de variación debida a las diferencias entre grupos o tratamientos. La prueba F. 5 Análisis multivariado El análisis multivariado brinda los métodos estadísticos para el análisis conjunto de dos o más variables que pueden estar interrelacionadas. Ambas son equivalentes. obtenidos a par- El nivel de significancia. Esta rama de la estadística comprende procedimientos y técnicas para la síntesis. t2 = F. Prueba F Una prueba F consiste en un cociente entre dos varianzas: F = s2entre / s2dentro Para realizar la prueba F resulta necesario descomponer la varianza total (s2total) en dos componentes: s2entre y s2dentro Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 191 .01 se dice que las diferencias son altamente significativas. representa hasta qué punto. es decir. la presentación y el análisis multidimensional de caracteres.05) se rechaza la Ho y se infiere. Varianza dentro de tratamientos Para obtener la varianza dentro de los grupos debemos tener en cuenta solamente la variación entre las observaciones de un mismo tratamiento. La significancia estadística de una diferencia entre dos medias puede verificarse mediante una prueba t o mediante una prueba F. la variación entre los grupos no se modifica mientras que toda la variación dentro del grupo queda anulada. especialmente útil cuando se comparan más de dos tratamientos. de acuerdo con la Ha. El análisis de la varianza es un procedimiento aritmético que permite la descomposición de la varianza total en varianzas parciales.

donde la significación estadística de los resultados pierde importancia. realizar un análisis exploratorio. Hay algunas razones que justifican el análisis conjunto de diferentes variables en lugar de analizar cada variable separadamente por métodos univariados. generar hipótesis interesantes que promuevan estudios más avanzados. toda investigación llevada a cabo especialmente en áreas nuevas. en orden decreciente. en este capítulo se brindará un panorama simplificado y algunos comentarios sobre las técnicas más usuales con la finalidad de poder discernir y elegir la metodología más apropiada para analizar la información que se disponga. Es aquí donde son necesarias las pruebas de significación estadística. el que. la aplicación del análisis univariado a cada una de las variables aumenta el error Tipo I mientras que la aplicación del análisis multivariado preserva el valor de α y aumenta en muchos casos el poder del test (1-β). no existe una división muy estricta entre técnicas exploratorias y confirmatorias. es confirmado mediante una prueba de bondad de ajuste. comienza con una exploración de los datos con el objeto de reconocer cualquier estructura o patrón no aleatorio que requiera una explicación. es posible desarrollar un análisis confirmatorio y así plantear un modelo descriptivo de causalidad. En el capítulo siguiente (VI. objetos o tratamientos. En este caso. Síntesis de métodos: objetivos y limitaciones Los análisis multivariados más comúnmente adoptados. Sin embargo. en primer lugar. El análisis multivariado utiliza las relaciones (correlaciones) entre las variables o entre los objetos que el método univariado directamente no considera. Sofía y DI RENZO. donde existen pocos antecedentes. La aplicación de los análisis confirmatorios se vuelve más apropiada cuando el investigador tiene en mente hipótesis bien definidas. son: 192 OLMOS. a su vez. seleccionandose aquellas que se utilizan con mucha frecuencia y que no requieren demasiados conocimientos previos. En cambio resultarían apropiados aquellos métodos que puedan detectar un patrón de comportamiento no previsto en los datos y que. Posteriormente. lo cual es a menudo más interesante que buscar la respuesta subsiguiente. mediante las inferencias realizadas a partir de este análisis y con la información que se pueda disponer acerca de los mecanismos que originan el proceso biológico. Análisis exploratorio y confirmatorio Con los datos provenientes de observaciones realizadas sobre un hecho en particular es necesario. Debido a que las variables se consideran en forma simultánea. Por ejemplo. El análisis multivariado aprovecha estas relaciones para buscar en los datos patrones o estructuras enriqueciendo así la descripción de los mismos.tir de un número de individuos.2) se desarrollarán en más detalle algunas metodologías multivariadas. El uso estadístico de términos como «efectos» o « variable independiente» no implica causalidad. una OTU «Operational Taxonomic Unit». En este caso. Se plantea como causa probable de esta tendencia generalizada el mal uso semántico entre las terminologías estadísticas y las biológicas. los métodos que están diseñados para responder a preguntas específicas no serían necesarios. ya que el objetivo primordial es. además. En una segunda etapa. Miguel . en primer lugar. Por ello sería importante que el investigador tenga una perspectiva flexible y pragmática para analizar sus datos y una experiencia suficiente que le permita elegir la herramienta analítica adecuada. Estas técnicas generalmente se caracterizan por el énfasis puesto en la utilización de representaciones visuales y gráficas y por la carencia de modelos estocásticos. El error más grave que se podría realizar en este sentido sería arribar a conclusiones que expliquen causas a partir de datos exploratorios y descriptivos sin haber realizado ningún tipo de diseño experimental para probarlos. estas técnicas permiten realizar interpretaciones más complejas a las que surgen mediante la utilización de métodos univariados. En otras palabras. por tal motivo. cuando se trata de probar hipótesis mediante procedimientos de inferencia estadística. es posible que surja la necesidad de formular la pregunta. El análisis multivariado colabora en la comprensión más adecuada y completa de las ciencias biológicas. abran un amplio campo de posibles explicaciones del proceso.

Estas relaciones no lineales en el MANOVA aparecen en los términos de las interacciones y pueden revelar efectos no lineales importantes en el análisis de datos experimentales. Cuando se utilizan combinaciones de de funciones discriminantes. Para examinar con mayor eficiencia datos binarios (presencia/ausencia) y datos en rangos. análisis de variables hay que considerar que el coeficienagrupamientos o clusters.análisis de componentes principales. No se modelos logarítmicos lineales. básicatos enumerados del 1 al 7 utilizan combina. comprenden métodos no lineales y son más apropiados cuando se cuenta con datos binarios. Objetivos y limitaciones de los 12 tipos de análisis multivariados más comúnmente utilizados. del rango o fuera de tipo) y cuando el análimientras que aquellos métodos enumerados del 8 al Tabla 1. Los métodos lineales son apropiados cuando se quiere interpretar combinaciones óptimas de variables (por ejemplo. Quienes aplican métodos lineales. correlación canónica.ción lineal y que este valor depende de las les. análisis factorial. El examen inicial. Los procedimien. estos méto. componentes principales en ACP (análisis de componentes principales). dichas correlaciones. análisis lineales.faltantes. regresión múltiple. análisis contribución de esta variable a la combinade correspondencia.cientes individuales para la interpretación de tiple. funciones discriminantes en AD (análisis discriminante). En la Tabla 1 se mencionan los objetivos Antes de aplicar cualquier técnica de anágenerales de los métodos de análisis lisis resulta imprescindible realizar un examen multivariado más utilizados. y la regresión logística múl. consiste en la evaluación de datos ciones lineales de las variables.mente. factores en AF (análisis factorial. usualmente asumen que los valores de las variables incrementan o decrecen regularmente y que entre ellas no hay interacciones. identificación de «outliers» (fuera dos son más eficientes con datos continuos.inicial de los datos. te que afecta a una variable representa la análisis multivariado de la varianza. coordenadas principa. se pueden usar otros modelos donde las variables se combinan acordes con funciones no Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 193 . 12. otras variables incluidas en el análisis. escalamiento considera correcto el empleo de estos coefimultidimensional.

Por otro lado. Miguel . De la misma manera resulta poco aconsejable elaborar generalizaciones demasiado amplias cuando los estudios se realizan sobre casos particulares o específicos que no son representativos. los valores de probabilidad directamente no se deberían informar y las conclusiones a las que se arriba sólo deberían limitarse a los datos utilizados y a las condiciones en las que se desarrolló el experimento. independencia de error y linealidad. de las subsiguientes inferencias es- tadísticas y de las conclusiones a que se arriba luego del análisis. la consideración conjunta de las variables. y al igual que en el análisis univariado. mediante la aplicación del análisis multivariado. Sin embargo. Sofía y DI RENZO. Las inferencias sólo están justificadas cuando los datos son tomados de una muestra grande y bien definida.sis multivariado a emplear así lo requiera. hay que tener precauciones con el uso del nivel de significancia (α) que se adopte. verificar si se cumplen los supuestos básicos de normalidad. homogeneidad de varianzas. cuando sea posible. En estos casos sería más apropiado utilizar métodos univariados. Si se tiene cuidado durante el proceso de in- 194 OLMOS. puede brindar conclusiones más fuertes que las logradas a través de un grupo de comparaciones simples. más que en la técnica de análisis en sí misma. Las conclusiones confirmatorias solamente se justifican si los estudios estuvieron basados en un muestro apropiado. con el complemento de pruebas de Bonferroni ajustadas. A menudo sucede que el investigador prefiere o necesita interpretar las variables en forma separada cuando maneja un grupo de variables correlacionadas. Esto significa que la inferencia está justificada en relación a la forma en que los datos fueron tomados y en que el experimento fue realizado. Cuando esto no ocurre.

Pueden existir casos donde no se conoce a priori si los grupos están ya formados. para que los clusters de objetos exhiban la mayor homogeneidad interna y la mayor diferenciación entre clusters sólo se requiere que la muestra sea representativa y que las variables no sean multicolineales. mientras que con el AF se enfatiza el estudio en las relaciones entre las variables explicadas con las covarianzas o correlaciones. la diferencia es que éste agrupa a variables. El uso tradicional de clusters ha sido para propósitos exploratorios. El uso racional de la estadística multivariada. Como dijimos anteriormente. cuántos son.terpretación de resultados. En este análisis. en esta etapa se podrían usar métodos como los de ordenamiento de objetos (donde se logra la reducción de dimensiones entre las variables o entre objetos a una o pocas dimensiones). las combinaciones de variables (componentes. es allí donde habría que ver qué tipo de análisis es más apropiado. y postular que esas similitudes provienen del hecho de que éstas son variables «latentes o factores» que actúan en forma particular sobre el proceso estudiado.) podrían ser de significativa importancia para estudiar un proceso. El AF resulta apropiado cuando el objetivo consiste en encontrar un grupo de variables similares. que es un ejemplo de análisis por ordenamiento. el modelamiento y el conocimiento biológico pueden ayudar al investigador a diseñar con criterio un experimento crucial y a llegar a conclusiones consistentes. El escalamiento multidimensional (EMD). Es especialmente utilizado en ciencias del comportamiento. podría encontrarse un origen de patrones cuando se realizan mediciones sobre grupos de objetos similares. En el primer caso. Este análisis es similar al AF. Dado que no es una técnica de inferencia estadística. Por otra parte mediante el ACP se busca explicar una gran parte de la varianza total. las que fi- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 195 . además. etc. mientras que el análisis de clusters agrupa a objetos. los objetos son representados en un espacio gráfico en los cuales los ejes constituyen gradientes de combinaciones de variables. Otra posibilidad es hacer análisis de agrupamientos donde los objetos se clasifican en categorías jerárquicas sobre la base de matrices de similitud entre los mismos. Se basa en evaluaciones comparativas de objetos cuando las bases de comparación son desconocidas o indefinibles. factores. En el AF las variables están expresadas como una combi- nación de factores. En este sentido. En general. utiliza para tal fin las estructuras de los autovectores (también llamados eigens ó raíces latentes) de la matriz de correlación o bien de una matriz de varianza-covarianza entre las variables originales. Cuando el investigador está interesado en definir grupos homogéneos de objetos y estudiar la estructura natural de las observaciones puede aplicar el análisis de clusters. El ACP y el análisis factorial (AF) tienen como objetivo encontrar una estructura más simple reduciendo la dimensionalidad de las variables sin perder información. involucra una serie de técnicas que ayudan al analista a identificar dimensiones subyacentes en la evaluación de objetos. o cuáles objetos pertenecen a cada grupo. Algunas diferencias entre estas dos técnicas son que las componentes principales están definidas como una combinación lineal de la variables originales y no están basadas en un modelo estadístico particular y por lo tanto no se requiere el cumplimiento de supuestos previos. Se transforma el comportamiento de quienes perciben los objetos en distancias. Se recomienda que un análisis de clusters sea posteriormente complementado con un análisis de funciones discriminantes (AD) sobre los grupos previamente identificados. El objetivo consiste en descomponer un conjunto de objetos en dos o más grupos basados en la similitud de los objetos debido a una serie de características especificadas. ya que permite identificar dimensiones no conocidas que afectan el comportamiento. altamente correlacionadas. El método de análisis de componentes principales (ACP). sólo se deben incluir aquellas variables que contribuyan a caracterizar los objetos y que se encuentren relacionadas con los objetivos del análisis. el análisis multivariado aprovecha las relaciones entre las variables para buscar patrones o estructuras en los datos. Para simplificar el análisis de los datos se reduce el número de variables a un pequeño número de índices o factores. está basado en un modelo especial y requiere el cumplimiento de distintos supuestos.

nalmente se representan en un espacio multidimensional. Las correlaciones canónicas (CC) reducen las dimensiones de dos grupos de variables provenientes de un mismo conjunto de objetos o individuos de manera que se puedan estudiar las relaciones conjuntas entre los grupos. Esta técnica. definidos a priori. Es una extensión del ANOVA. Por ejemplo. hembras o genotipos resistentes vs. La selección de las variables con mayor poder de predicción se realiza mediante aproximaciones secuenciales. el parecido entre parientes. Posibilita además la identificación de cuál o cuáles de las variables independientes contribuye más a la diferenciación entre grupos. Cuando los objetos o individuos se reúnen en dos o más grupos. Así. Esta técnica mide la correlación o covarianza de los estímulos derivados de las características de los objetos a ser evaluados. frecuentemente se plantea el problema de cómo describir las diferencias entre grupos sobre la base de un conjunto de variables. que se hallan delimitados sobre la base de las distintas variables independientes discretas o tratamientos. El análisis multivariado de la varianza (MANOVA) es un procedimiento de inferencia estadística usado para evaluar la significancia de la diferencia entre los grupos. tiene como objetivo predecir los cambios en una variable dependiente cuantitativa en respuesta a los cambios en las distintas variables independientes o predictoras. En este caso. La ecuación de regresión es una combinación lineal de las variables independientes que mejor predicen la variable dependiente. que representan diferentes genotipos. Sofía y DI RENZO. por lo que el interés se centra sobre las relaciones entre los grupos de variables. Las variables in- 196 OLMOS. Como característica. Lo mismo que en el caso de ACP y AF. aunque en éste la única variable dependiente es categórica y las variables independientes son cuantitativas. Mediante los coeficientes de regresión estandarizados es posible determinar la importancia relativa de cada variable predictora. Es similar al AD sólo que en las CC las variables (no los objetos o individuos) son divididas en grupos. la distinción entre objeto y variable es menos relevante porque éstos son ordenados en forma simultánea. Son ejemplos de su aplicación la descomposición del valor genotípico en el efecto medio de cada alelo y las interacciones debidas a dominancia y epistasis. sólo que las diferencias se establecen teniendo en cuenta simultáneamente dos o más variables dependientes cuantitativas de distribución normal. mientras que el MANOVA involucra un grupo de variables dependientes cuantitativas y las variables independientes son cualitativas. las CC se pueden utilizar cuando interesa conocer la relación existente entre los patrones de marcadores moleculares. También pude ser considerado como una extensión del AD. y algunas características ambientales donde viven los individuos muestreados. el AD se basa en la posibilidad de encontrar una combinación lineal de las variables originales. que explora todo tipo de relaciones dependientes. El propósito básico del AD es estimar la relación que existe entre una variable dependiente cualitativa (machos vs. el cálculo de la estabilidad de los genotipos mediante la descomposición de la interacción genotipo ambiente. el AD permite identificar aquellos grupos ya formados a los cuales pueden ser asignados nuevos objetos en estudio (individuos. Por ello este análisis es particularmente útil cuando los datos provienen de diseños experimentales. en cómo éstos son percibidos. La regresión múltiple (RM) se considera el método apropiado cuando se presume que los valores de una variable continua dependen de los valores que tomen las otras variables. llamadas estimaciones «stepwise» (pasos inteligentes). Los modelos de RM constituyen la base para la estimación de parámetros en genética cuantitativa. las representaciones gráficas enfatizan las relaciones entre los estímulos que se estudian. con el EMD no se enfoca el interés en los objetos en sí sino más bien. la ubicación y la utilización de QTL mediante marcadores moleculares. genotipos susceptibles) y entre un grupo de variables independientes cuantitativas con distribución normal. Si bien mediante el análisis de clusters los objetos se agrupan de acuerdo con sus características. El análisis de correspondencia (AC) es un procedimiento de ordenación apropiado para datos de frecuencias (tablas de contingencia). genotipos). Miguel .

Si se cumplen los supuestos básicos. RENCHER. este último resulta el más apropiado.. G.dependiente y dependiente deben ser cuantitativas si bien. E. no hay mayores diferencias entre la RL y el AD. 1991. La aplicación del análisis de RL permite predecir una variable dependiente binaria (0.L. Arnold. Prentice Hall ..1)... 1995. A Primer. Es importante tener en cuenta que para asignar causalidad en forma justificada es necesario disponer de una cantidad adecuada de datos biológicos experimentales. Los modelos logarítmicos lineales (LOGL) comprenden a otros análisis que permiten mostrar las relaciones que existen entre variables categóricas. 1986. B. MANLY. Multivariate Statistical Methods. ANDERSON. mediante transformaciones previas. R. DUNN. TATHAM. New York. Methods Of Multivariate Analysis. W. HAIR. Multivariate Data Analysis. Lecturas recomendadas EVERITT. es posible incluir variables independientes no métricas. BLACK. Chapman and Hall. 4ta.C. London. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 197 . Ed. 1995. B.F.F.E. A.C. J. Wiley & Sons. J. R. Inc. New Jersery.Upper Saddle River. Applied Multivariate Data Analysis. London.S. en especial la normalidad de las variables. sólo que en el caso que sea posible formar más de dos grupos.

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His. frecuencia relativa de un alelo. El carácter tiene sólo dos estados posibles y la asignación del «0» ó el «1» es indistinta. Macho = 0. etc. Ejemplos: Biomasa de plantas. La distinción entre uno u otro tipo de dato binario es importante al momento de seleccionar la medida de asociación. del análisis de una sola variable o de varias variables evaluadas en cada individuo o muestra. A efectos de unificar el lenguaje se considerará que cada fila de la matriz representará un individuo. Tyr. Lys. Sólo se registra la presencia ó ausencia del carácter. DATOS MULTIESTADO CUANTITATIVOS DISCRETOS: están asociados a valores de conteo. acorazonado. En este capítulo se desarrollarán en más detalle algunas metodologías multivariadas. DATOS MULTIESTADO CUANTITATIVOS CONTÍNUOS: Representan propiedades que se pueden expresar en una escala contínua. Las columnas representarán los caracteres o variables que se observan en cada OTU. Ile. cotiledonar. Clases de embriones somáticos: globular. torpedo. 3 Medidas de asociación y distancia Un objetivo frecuente suele ser la descripción del grado de parecido que hay entre las Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 199 . Clasificación de hojas: paripinadas ó imparipinadas. número de inflorescencias. Gln.C. Se han seleccionado aquellas que se utilizan con mucha frecuencia y que no requieren demasiados conocimientos previos. Estos datos se presentan cuando el carácter puede tomar sólo dos estados posibles. Phe. concentración de proteína del grano. Ejemplos: Número de hileras por espiga. Pro. Color de la flor: blanca. Asn. roja o rosada. longitud de partes verdes. tipo de datos y número de variables. una especie. lobulado.VI. subopuestos. análisis de la varianza. pruebas chi-cuadrado. Miguel. Olmos. además. Thr. Arg.-Capítulo 2 Métodos para estimar variabilidad genética Winzer. DATOS MULTIESTADO CUALITATIVOS: El carácter puede tomar un conjunto finito de estados. de qué objetivo se haya planteado el investigador. Disposición de folíolos en el raquis: alternos. Identificación de los aminoácidos esenciales presentes en una proteína: Gly. Ser. opuestos. y. Val. ó Hembra = 1. G. Asp. Macho = 1. Nélida. entero. Ala. o bien alguna de sus generalizaciones. Trp. 2 Tipo de datos DATOS DOBLE ESTAD: Son los también llamados datos binarios o dicotómicos. Met. b) Datos doble estado excluyentes. Sofía 1 Introducción La información procesada a partir de las técnicas que se desarrollan en este libro pueden ser de diversos tipos y puede tratarse. Si se trata de una sola variable se podrán aplicar las técnicas aprendidas en un curso básico de estadística (comparación de dos medias. Tipo de Fruto: dehiscente ó indehiscente. Los análisis estadísticos a utilizar dependen de estos dos aspectos. Ejemplos: Margen de la hoja: aserrado. T. Habitualmente se codifican como «0» ó «1». una muestra. Identificación de los nucleótidos presentes en una determinada secuencia de ADN: A. Cys. Los datos multivariados se ordenan en una matriz. a) Datos de presencia o ausencia. Ejemplo: Presencia o no de una banda en una corrida electroforética de isoenzimas o marcadores moleculares. Glu. número de macollos por planta. análisis de regresión. una OTU (Operational Taxonomic Unit). peso de semillas. Ejemplos: Carácter: Sexo. Codificación: Hembra = 0. por otro lado. en definitiva. Hay que reconocer dos tipos de situaciones donde pueden aparecer datos binarios.). Di Renzo. Leu.

La suma de estos 4 valores dará el total de caracteres medidos.333 0 0.6 0. cuando se usa ligamiento simple o completo. se calcularon 2a a = + + (a + c) (a b) 2a + b + c 2 OTU 2 1 0 OTU 1 1 0 a b c d A B 1 2 3 4 5 6 7 8 C D E F 1 2 3 4 5 6 7 8 Si los datos son de presencia/ausencia.2 0 0.571 0. Miguel y Sofía OLMOS . Más aún.333 1 0. Dos de los índices que comparten este criterio son Jaccard y Dice. Las segundas miden el grado de disimilitud: cuanto más parecidas son 2 muestras menor será su distancia.333 0. La coincidencia de «ceros» no aporta a la similitud porque puede estar generado por falta de información (la no amplificación de un fragmento RAPD no informa si esto es producido por la carencia del sitio de hibridación del cebador o bien como consecuencia de una mutación de punto en dicho sitio.5 1 1 0.25 0.167 0.286 0.2 1 0.333 1 0. Nélida. b = Nº de caracteres donde la primera muestra tiene un «1» y la otra un «0». den los mismos grupos. Para datos binarios es usual trabajar con medidas de asociación.5 1 0. Entonces.727 0. entre otras.OTUs. para caracterizar a dos OTUS existen 4 valores a considerar: a = Nº de caracteres donde ambas muestras coinciden en el «1».6 0.5 0.25 1 0.5 0. mayor será su asociación. ambos están relacionados mediante la ecuación J = D/ (2-D) ó D = 2J/(1+J). salvo cuando toman el valor 0 ó 1.167 1 0.286 1 0. respecto al total de caracteres presentes en las 2 OTUs.333 0.571 0. sólo que con distintos valores de asociación. DICE D12 = Es la proporción de caracteres copresentes respecto al promedio de los caracteres presentes en cada OTU. Para ello será necesario medir ese grado de similitud.5 0 0. Se describirán a continuación algunas de las medidas que aparecen con mayor frecuencia en la literatura.667 0.667 0. por ejemplo).667 1 0.5 0. Ejemplo: Como resultado de la aplicación de la técnica RAPD sobre 6 muestras se registró la siguiente información sobre la presencia o ausencia de 8 bandas generadas por un cebador: Este es un proceso típico en el análisis de la información a partir de bandas.5 0.4 0.. caso en que siempre coinciden.4 1 0.667 0 0.5 0.429 0.667 0 0.667 1 200 WINZER.5 0 0. JACCARD Codificación A 1 1 0 1 1 0 1 0 B 0 1 1 1 1 0 0 0 C 0 0 1 0 0 1 0 1 D 1 1 1 0 0 0 0 0 E 1 1 0 1 1 0 1 0 F 0 1 1 1 1 1 1 1 Matriz de Datos 1 1 0 0 1 1 0 2 1 1 0 1 1 1 3 0 1 1 1 0 1 Bandas 4 1 1 0 0 1 1 5 1 1 0 0 1 1 6 0 0 1 0 0 1 7 1 0 0 0 1 1 8 0 0 1 0 0 1 A B C D E F Asociación de Jaccard A A B C D E F B C D E F A A B C D E F Asociación de Dice B C D E F 1 0.571 0. en este caso.667 0. c = Nº de caracteres donde la primera muestra tiene un «0» y la otra un «1».429 0. J12 = a a+b+c Es la proporción de caracteres presentes que comparten. se construye la matriz de datos y. DI RENZO.727 0 0. Hay dos tipos de medidas: los índices de asociación y las distancias.5 0.4 0. d = Nº de caracteres donde ambas muestras coinciden en el «0». Primero se codifica la información.5 1 0.4 0.667 0. Esta relación tiene como consecuencia. Se puede probar que Jaccard siempre dará un valor de asociación menor que Dice. Los primeros miden el grado de similitud: Cuanto más parecidas sean 2 muestras.571 0 0. un criterio válido es considerar que dos muestras son más parecidas cuantos más «unos» compartan. que en un Análisis de Cluster.5 1 0.333 1 0.

Para n poblaciones.667.250 0... se ve en el gráfico la distancia cuerda entre los puntos P = (0. La distancia Cuerda es.. 2 muestran deberán considerarse más asociadas tanto cuando comparten «unos» como «ceros».5. precisamente. 0. ambas matrices son simétricas: la asociación entre A y E es la misma que la que se da entre E y A. Por eso... Además de las que se han definido hasta ahora.5324 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 201 . p m ) y Q*= ( q1 . por lo tanto tienen la máxima asociación. c = 2.. la longitud de la cuerda que une esos 2 puntos. 0. A y E comparten la presencia de las mismas bandas: a = 5.5 0.. También se pueden definir medidas de distancia o asociación para distintos tipos de datos multiestado. c = 0. . q2. q m ) están sobre una esfera de radio 1.las matrices de asociación de Jaccard y Dice a efectos de observar las características mencionadas más arriba.7) y Q = (0. p 2 .375 1 0. El promedio de estos totales da 4. su asociación es 0. 4 Distancias genéticas Se pueden clasificar en 2 grupos: las basadas en un modelo geométrico (Cavalli-Sforza y Rogers) y las basadas en modelos consideraciones biológicas (Nei).5) = 2/3 = 0. Así Jaccard vale 0. de las 6 bandas presentes en una u otra muestra comparten 3.å pi q i ) ÷ è i =1 ø Simplemente es la proporción de caracteres que comparten las dos muestras. . b = 0. éstas pueden expresarse de la siguiente manera: Pob. Un índice recomendable por su simplicidad es el de Simple Matching o de Concordancia Simple: SIMPLE MATCHING Se observa que A y E comparten todos los caracteres.5 0. Tanto Jaccard como Dice dan 1. Se observa también que.5 1 Los puntos P* = ( p1 . lo que significa que coinciden en la mitad de los caracteres evaluados. y también sus frecuencias correspondientes.8.... y si en cada una de ellas se tiene la información sobre los loci para m alelos.5 0. basta mostrar la mitad de la matriz de asociación. Para el caso m = 2. Entre B y E: a = 3. salvo los 0 y los 1. q 2 . 2: q1. por lo tanto a = 0 y tanto Jaccard como Dice dan 0.. Si se piensa que la matriz de datos anterior corresponde a 8 caracteres binarios de estados equivalentes la matriz de asociación con el índice de Simple Matching dará: A A B C D E F B C D E F 1 0.5. Por otro lado. ya que la codificación que se les asigna es indistinta. Esta observación será válida para todas las medidas que se presenten en este capítulo.625 0. todos los valores de Jaccard son menores que los de Dice. .625 1 0 0. Si los datos son binarios pero de estados equivalentes..5 1 0.3. b = 1. Además. p2.2).5 1 1 0. pm Pob.5 por lo que la asociación de Dice da (3/4.625 0 0. Los puntos originales son llevados a la esfera (círculo) de radio 1 y luego se calcula la distancia entre esos 2 puntos: d = 0. .625 0. hay n(n-1)/2 pares. Entre las muestras A y C no se observaron bandas en común. existen muchas otras medidas para datos binarios. qm Distancia Cuerda de CAVALLI-SFORZA y EDWARDS (1967) SM12 = a+d a+b+c+d m æ ö d12 = 2 ç1 . Para no extender en demasía esta sección se presentarán algunas distancias definidas específicamente para frecuencias alélicas. La asociación entre C y D y entre D y E es 0. En cambio C y E no coinciden en ninguno. Por lo tanto.. 1: p1. El total de bandas de B es 4 y el total de bandas detectadas en E es 5.

mediante mutaciones y deriva genética. ∑ pi q i se puede interpretar como la probabilidad que 2 alelos sean iguales si uno ha sido elegido al azar de la población 1 y el otro de la población 2. Sean. ∑ En las poblaciones naturales una de las formas de realizar el agrupamiento jerárquico de las mismas en razas. Si se consideran simultáneamente varios loci la distancia Cuerda se calcula así: r æ d12 = 2 ç1 . se tiene: I = 0. Aquí. Nei define primero la Identidad normalizada (varía entre 0 y 1) : Q* 0.6 0.4 0. por lo tanto. como antes.1 P* 0.8 1 1 y luego la Distancia Estándar: D12 = . las poblaciones 1 y 2 y las frecuencias alélicas de un solo locus: Ejemplo: Para la información de la tabla. las llamadas distancias genéticas tienen su mayor aplicación. Distancia Estándar de NEI (1972): Esta distancia tiene una base biológica.ln I.q ij ) 2 En el gráfico. es mediante el empleo de medidas de divergencia genética. sería la probabilidad que 2 alelos elegidos al azar de la población 1 sean iguales. respectivamente. D = 0.4 I= Q åp q i =1 m i =1 m i i m 0. Las medidas de distancias genéticas basadas en modelos biológicos son las más empleadas en estudio de genética poblacional. Expresa la probabilidad de que dos alelos tomados al azar de dos poblaciones diferentes sean idénticos (con respecto a la probabilidad de que lo sean dos alelos tomados al azar de la misma población). sería la probabilidad que 2 alelos elegidos al azar de la población 2 sean iguales.15317. La medida de distancia genética estándar de Nei es más confiable cuando se utilizan 202 WINZER. Miguel y Sofía OLMOS . Nélida.ln åå p q i =1 j=1 2 ij r mi r i =1 j=1 r mi ij ij mi åå p åå q i =1 j=1 2 ij 1 r R 12 = å r i =1 å (p j=1 mi ij . ésta es la distancia habitual entre los puntos P y Q.2 å pi2 å qi2 i =1 0 0 0.2 0.8 P 0.å è i =1 å j=1 mi ö pijq ij ) ÷ ø Si se usan varios loci se trabaja con el promedio aritmético de las probabilidades definidas anteriormente resultando: Distancia de ROGERS (1972) D12 = . DI RENZO. debido a que resumen los conocimientos obtenidos de las fuerzas evolutivas que conllevan a los cambios genéticos es decir.6 Los dos últimos términos equivalen a un estado de homocigosis en la población 1 y 2.857986 y. en el caso de las frecuencias de cinco alelos provenientes de dos loci.

444. 0. no hay manera de ubicar un punto P3 que esté a 0.444 . B) = (1. se espera que la Distancia de Nei incremente linealmente con el tiempo. B y C: 1 . por el contrario.3 C 0.5 -1.3 -0.707 ÷ ç . 0.119).447 .5 0.3 -0. (0.447 ö æ 0 ç ÷ D=ç 1 0 .3 de P2.94).0 0. asume que las diferencias entre las poblaciones no provienen de mutaciones sino solamente como consecuencia de la deriva genética.1 -0.4 0.0 0. constante. Así en estos casos.0 A B I C A 0.555. 5 Análisis de coordenadas principales Si se tiene una matriz de distancias entre N muestras ¿será posible representar cada muestra mediante un punto de manera tal que las distancias resultantes reproduzcan las de la matriz? Veamos dos ejemplos: (i) Si se tiene la siguiente matriz D de distancias entre las muestras A.5 1.0 1.94) 2 = 1 en el gráfico I.444.3 0 ÷ è ø se podrían hacer algunos de los siguientes gráficos: Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 203 . 1. en cada una.111.1 C -0. (1.datos provenientes de muchos alelos.179) III: (0.9.111.881 .179) II:(0.0 0.2 1. æ 0 0.06). (0.881).5 2. Además.8 0. B y C: I:(1.5 0.119). La distancia de Cavalli-Sforza y Edwards.5 1.9 0 0. 0. -0.5 0. Por ejemplo: d E (A.5 -1.0 0. (-0. (ii) Si se tuviera la matriz de distancias entre las muestras P1.5 0.111.0 III -0.445) 2 + (0.555.3 ÷ ç 0. siendo el tamaño efectivo de la población.0 B 0.179) Si se calcula la distancia euclídea entre los puntos en uno cualquiera de estos gráficos se ve que se han reproducido exactamente los valores de la matriz D. P2 y P3: Es fácil ver que es imposible representar en un plano puntos separados por estas distancias porque si P1 y P2 se ubican como extremos de un segmento de longitud 0.0 II B A -0. Considera que el tamaño de la población cambia en forma lineal pero no con el tiempo sino con 1/N.1 -0.3 0. (1978) y Hillis.445. los conocimientos básicos de genética poblacional brindarán las herramientas necesarias en el momento de la elección del método más apropiado para el análisis de nuestros datos. -0.5 1. y de que todos los loci sean equivalentes entre sí.06).9 0. Si las frecuencias alélicas en cada población han sido estimadas con pocas muestras se pueden utilizar en cambio algunas modificaciones a la Distancia Estándar de Nei como las propuestas por Nei. 0.0 Coordenadas de A.0. con la misma probabilidad para todos los alelos a una tasa de mutación neutral.5 0.6 0.0.444. (-0.-0. (1984).5 de P1 y a 0. Basándose en estos supuestos. La distancia de Nei está formulada para un modelo donde se asume que las mutaciones ocurren en forma infinita. no asume que el tamaño poblacional ha permanecido constante en todas las poblaciones.707 0 ÷ è ø 1.4 1. donde N es el tamaño efectivo de la población. y que la variabilidad genética inicial en la población está en equilibrio entre la variabilidad producida por mutaciones y por deriva genética.0.1 -0. (0.5 ö ç ÷ # D = ç 0.

P1 P1 P 3? P 3?

P2 P2

donde Sij es la asociación entre la muestra i y la j. Si la asociación de una muestra consigo misma es 1, es decir Sii = 1, como ocurre con la mayoría de los índices, la ecuación se reduce a: d2(i, j) = 2(1- Sij ). (2)

Se van a considerar, por ahora, distancias como las del ejemplo i). Esto es, distancias para las que se puedan encontrar puntos que reproduzcan esas distancias. Otro aspecto a considerar es el número de coordenadas necesarias para esos puntos. Es intuitivo que si sólo hay 2 muestras a una distancia dada se pueden graficar en una recta (dimensión =1); si hay 3 muestras ya se vió que se pueden graficar en un plano (dimensión = 2); si se tuvieran 4 muestras ya son necesarias 3 coordenadas (dimensión = 3); ... y si se tienen N muestras se necesitarán, en general, N-1 coordenadas. Con lo cual si se quieren graficar 40 muestras serán necesarias 39 coordenadas!!! Es evidente que esto no es cómodo si el objetivo es obtener una representación gráfica de los puntos o muestras. Lo ideal sería obtener dos coordenadas pues se podrían graficar en un plano, o bien tres para graficar en 3 dimensiones. El problema, entonces, es encontrar las 2 mejores coordenadas (ó las 3 mejores) para obtener esta representación. Ese es el objetivo del Análisis de Coordenadas Principales (ACOOP): encontrar las k mejores coordenadas para las muestras de manera tal que si se calculan las distancias euclídeas entre ellas reproduzcan lo mejor posible una matriz de distancias dada. Habitualmente k = 2 ó 3, a éstas, se las llama Coordenadas Principales. Naturalmente se perderá la información de las restantes coordenadas. Como se vió en el ejemplo (i) hay muchas representaciones posibles. Ahí se han dado 3 pero se podrían haber dado muchas más. Una manera de reducir las opciones es obtener coordenadas de manera tal que los puntos estén centrados en el origen, como en II ó III. Se explicará el método de obtención de las Coordenadas Principales partiendo de una matriz de Asociación S. En este caso las distancias que se van a reproducir son las definidas por: d2(i, j) = Sii+ Sjj- 2 Sij (1)

Se detallarán los pasos que se deberían realizar para hacer este análisis al simple efecto de poder manejar con idoneidad los programas estadísticos de que se dispongan. Los pasos 1) a 3) son responsabilidad de esos programas. El usuario deberá, fundamentalmente, indicarle qué asociación o distancia desea calcular y cuántas coordenadas quiere. PASO 1) Centrar doblemente la matriz S→ S0 . P A S O 2) Calcular los autovalores y autovectores de S0. PASO 3) Calcular las coordenadas de los puntos representativos de las muestras. PASO 4) Graficarlos. El PASO 1 tiene como fin hacer que los puntos resultantes estén centrados. Cada elemento de la matriz de asociación S se centra por filas y por columnas: (3) donde Si• es el promedio de la fila i de S, S• j es el promedio de la columna j y S•• es el promedio de todos los elementos de S. En el PASO 2 se encuentran: a) una matriz NxN donde cada columna es un vector de longitud uno. Son los autovectores. b) N números ordenados en forma decreciente: los autovalores. Estos elementos son característicos de cada matriz S0. Por eso también se los conoce como vectores y valores característicos. Cada autovector está asociado a un autovalor. Si la matriz de distancias es «representable» (como la del ejemplo (i)) los autovalores serán positivos o ceros (el más chico es siempre cero para estas matrices «representables»).

0 Sij

204

WINZER, Nélida; DI RENZO, Miguel y Sofía OLMOS

En el PASO 3 , si se desean k coordenadas, se toman los k primeros autovectores y se multiplican por la raiz del autovalor respectivo. El primer autovector da la primera coordenada de todas las muestras, el segundo la segunda coordenada y así siguiendo hasta la k-ésima. Si sólo se desean 2 coordenadas para graficar los puntos en un plano se toman los 2 primeros autovectores (k=2). Veamos un ejemplo sencillo:
0.5 0.9 ö æ 1 ç ÷ S = ç 0.5 1 0.75 ÷ ç 0.9 0.75 1 ÷ è ø
Autovalores de S0 :

de las distancias. Hay 2 tipos de porcentajes que se pueden calcular: Porcentaje de Dispersión:

a1=

l1 + l2 x 100% l1 +l2 +...+ln

si sólo se usan 2 coordenadas. Este porcentaje se interpreta teniendo en 2 d ij cuenta que: 2N (λ1 + ...+ λN) = , sumando sobre todos los pares de muestras. En cambio, la suma del cuadrado æ 0.21110.2390.028 ö de las distancias reconstruidas ç ÷ Doble centrado S0 = -0.239 0.3111 -0.072 con las dos coordenadas es igual ç ÷ ç 0.0280.0720.0444 ÷ è ø a 2N (λ1 + λ2). Por lo tanto, este l1 = 0.5167 l2 = 0.05 l3 = 0 porcentaje mide cuánto se rev1 v2 v3 construye del cuadrado de todas æ 0.6173 - 0.5344 0.57735 ö las distancias.

∑∑

Autovectores de S0 : Columnas de V = ç -0.7716

ç

ç 0.1543 è

- 0.2674 0.8019
l 22 v

÷ 0.57735 ÷ 0.57735 ÷ ø

Primeras 2 Coordenadas: Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3

l11 v
0.4437 -0.5546 0.1109

-0.1195 -0.0598 0.1793

Si se usan más de 2 coordenadas se van sumando los autovalores correspondientes en el numerador. En nuestro ejemplo: α1 = 100% .

0 sij

Gráfico: Es el Gráfico II que se vió más arriba donde A es la muestra 1, B la 2 y C la muestra 3. Las distancias ( 2 ) calculadas a partir de la matriz de asociación S dan la matriz de Distancias D. Por esa razón ambas matrices tienen la misma representación.
2 d12 = 2(1 - S12 ) = 2(1 - 0.5) = 1
2 d13 = 2(1 - S13 ) = 2(1 - 0.9) = 0.2

Porcentaje de Distorsión:

l1+l2 a1= 2 x 100% l 1 +l22 +...+l2n
Este valor mide cuánto se acercan los valores de la matriz de asociación reconstruída respecto de la matriz de asociación original S0. Más exactamente:
a2= 1- S - 0S2 S
0 0* 2

2

2

Þ d12 = 1
Þ d13 = 0.447

d2 d 23 = 0.707 23 = 2(1 - S23 ) = 2(1 - 0.75) = 0.5 Þ

x 100%= 1-

å (S - S å (S )
0 ij

0* 2 ij

)

0 2 ij

x 100%

OBSERVACIÓN 1: Como en el ejemplo sólo hay 3 muestras los autovectores tienen 3 componentes. Si se trabajara con una matriz de asociación entre 40 muestras, los autovectores tendrían 40 componentes, una por cada muestra. OBSERVACIÓN 2: Para la matriz S se han reconstruído totalmente las distancias porque sólo son 3 muestras. Si hubiera más (N=40, por ejemplo) sólo se reconstruirían totalmente las distancias si se usan 39 coordenadas. Si se usan sólo las dos primeras se reconstruye, en general, sólo un porcentaje

En este algoritmo se ve que lo que se está comparando son las asociaciones originales, 0* ,con las reconstruidas, sij , una a una. Para el cálculo de α2 se usa la primera fórmula por lo que el lector no debe traumatizarse con la segunda. OBSERVACIÓN 3: Si se hubieran obtenido autovalores negativos la primera medida no es recomendable. Hasta podría darse el caso que α1 fuera mayor al 100%. La segunda, en cambio, sigue teniendo sentido. Por

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal

205

otro lado, no se podrían calcular coordenadas asociadas a ese autovalor porque no se puede calcular λ i . La aparición de autovalores negativos no es necesariamente un problema grave para la representación siempre que los autovalores negativos sean pocos y pequeños. Por ejemplo, si se trabaja con 50 muestras, en el PASO 2 se obtendrán 50 autovalores, de los cuales uno, seguramente, es cero. Para la representación en el plano se usan sólo los 2 primeros. Si los últimos 10 son negativos no se verán afectados los cálculos de las coordenadas. Hay asociaciones y distancias que nunca dan autovalores negativos, entre ellos se encuentran Jaccard, Ochiai, Russell y Rao, Simple Matching, y distancia euclídea. Si en lugar de tener una matriz de asociaciones se tiene una matriz de distancias el procedimiento consiste en calcular una matriz S cuyos elementos son: (4) 2

No debe causar sorpresa, entonces, que con un programa se obtenga un gráfico y con otro el mismo gráfico pero con una reflexión sobre uno u otro eje, o sobre los dos. Por otro lado, también es lícito cambiar, por alguna razón, el signo de una coordenada. Por ejemplo, esto puede ser útil cuando se quieren comparar Análisis de Coordenadas Principales realizados con distintas asociaciones o distancias sobre el mismo conjunto de muestras. Ejemplo: Presentamos la caracterización de 8 cultivares comerciales y 35 cultivares en experimentación mediante análisis isoenzimático de semillas de Amaranthus. Estas accesiones pertenecen a siete especies: A. caudatus, A. cruentus , A. hypochondriacus , A. mantegazzianus, A. dubius, A. tricolor, y A. hybridus. Del total de 43 cultivares, 31 fueron polimórficas con 7 sistemas isoenzimáticos. Se aplicó análisis de coordenadas principales el cual, estuvo basado en la presencia o ausencia de las 23 bandas polimórficas. En la figura puede observarse el nivel de diversidad genética dentro de este germoplasma representado por las coordenadas 1 y 2. Este análisis agrupó la mayoría de los cultivares de acuerdo a su clasificación taxonómica así como mostró que existen relaciones entre diferentes accesiones. Se concluye que el análisis isoenzimático de semillas fue efectivo para caracterizar los cultivares destinados a los programas de mejoramiento de Amaranthus.
A.hypoch A.caudat. A.manteg. A.dubius A.tricolor A.hybrid.

sij = -

d ij 2

y luego seguir los PASOS 1, 2, 3 y 4 anteriores. OBSERVACIÓN 4: Cada autovector de S0 es un vector de longitud 1 en una cierta dirección. Pero por cada dirección podemos tener 2 vectores: v y -v. Por ejemplo:
æ -0.5344 ö ç ÷ v 2 = ç -0.2674 ÷ ç ÷ è 0.8019 ø æ 0.5344 ö ç ÷ - v 2 = ç 0.2674 ÷ ç -0.8019 ÷ è ø
0.6

y

A.cruen.

Cualquiera de estos dos vectores pueden usarse como segundo autovector y, más aún, algunos programas pueden dar como resultado el primero y otros el segundo. Como consecuencia de esta selección se obtendrá el gráfico II ó el III. Se ve que el único efecto de usar uno u otro vector es una reflexión del gráfico respecto del primer eje. Si se cambia el signo de v1 se obtendrá una reflexión respecto del segundo eje. Ninguno de estos cambios modifica la distancia entre los puntos.

38-39 40-43 0.4 6-9-10-11 2 0.2 14 5 0.0 12 15 7 8 29-30 -0.4 31 3 28 1 35 20 16 25 26 21 23 24 -0.6 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 13 36 34 27 4 17 41 42 37

-0.2

19

18-22 32-33

206

WINZER, Nélida; DI RENZO, Miguel y Sofía OLMOS

Matriz de datos

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43

1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

2 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1

3 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0

4 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1

6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0

7 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1

8 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

9 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

10 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1

11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

16 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0

17 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

18 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0

19 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

20 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

21 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0

22 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0

23 0 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal

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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

V1 -0.12709 -0.10710 -0.12311 -0.00462 -0.22005 -0.23182 -0.12459 -0.12472 -0.23182 -0.23182 ...

V2 0.03060 0.13683 0.09085 0.07441 0.07043 0.16179 -0.11226 -0.09717 0.16179 0.16179 ...

CP1 -0.27881 -0.23496 -0.27007 -0.01014 -0.48274 -0.50856 -0.27331 -0.27360 -0.50856 -0.50856 ...

CP2 0.05495 0.24570 0.16313 0.13362 0.12647 0.29052 -0.20157 -0.17448 0.29052 0.29052 ...

Autovalores: 4.81258 3.22431 α1 = 46.85 α2 = 78.2

Al sólo efecto de que el lector pueda repasar algunos cálculos se dan los primeros 10 elementos de los 2 primeros autovectores y las 2 primeras coordenadas Principales. 6 Análisis de agrupamientos (cluster) Esta técnica tiene como objetivo formar grupos de muestras, poblaciones, individuos u OTUs que sean similares entre sí y diferentes a los elementos de los otros grupos. El primer problema es fijar el criterio para decidir cuándo dos elementos son similares. Si se tuviera un mazo de cartas, ¿cómo formar grupos? ¿por el valor de la carta?, ¿porque comparten el palo?. Según el criterio que se aplique los grupos que se formen serán distintos. En la sección anterior hemos visto distintas maneras de definir la similitud o disimilitud entre OTUs. Cada una de ellas, u otras que no se han presentado aquí, plantean distintas formas de medir la similitud entre los elementos a agrupar. Existen, además, muchos métodos para formar los grupos. Uno de los más usados son los agrupamientos jerárquicos que pueden, a su vez, ser divisivos o aglomerativos. Los primeros comienzan con todos los elementos en un solo grupo y en sucesivas divisiones se van formando grupos cada vez más pequeños. Los aglomerativos, por el contrario, empiezan considerando tantos grupos como elementos se tienen y se van agrupando según su grado de parecido. Los sucesivos pasos de uno y otro método se pueden representar en un gráfico denominado dendrograma.

En esta sección se tratarán solamente los métodos jerárquicos divisivos. Aquí se plantea un segundo problema: ¿Qué tipo de ligamiento se va a utilizar? Esto es, una vez realizado el primer agrupamiento, cómo se define la distancia entre ese grupo y los restantes elementos? Supongamos que en un primer paso se han agrupado los elementos A y B porque son los que presentan la menor distancia entre sí. La distancia entre el nuevo grupo AB y otro elemento C se puede definir según el criterio empleado para incorporar al nuevo elemento: LIGAMIENTO SIMPLE: d(AB,C) = mín {d(A, C), d(B, C)}, LIGAMIENTO d(B, C)},
COMPLETO:

d(AB,C) = máx {d(A, C),

LIGAMIENTO PROMEDIO: d({A,B},C) =

En el caso del ligamiento simple, la incorporación del nuevo elemento está basada en la extracción de los menores valores de distancias entre el nuevo elemento y el grupo preformado, y entre el nuevo elemento y las restantes OTUs que se consideren. En cambio, el ligamiento completo lo que hace es extraer los mayores valores de distancia, respectivamente. Si A, B y C son grupos formados en pasos anteriores, se usan los mismos algoritmos en el caso del ligamiento simple o completo. Para el ligamiento promedio hay que promediar todas las distancias entre ele-

d(A, C) + d(B, C) 2

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mentos de AB y de C:

d(AB, C) =

åd
i, j

ij

A B C D E F

A 0 1 1.41 1.15 0 1.1

B 1 0 1.29 1.10 1 0.93

C 1.41 1.29 0 1.26 1.41 1.07

D 1.15 1.10 1.26 0 1.15 1.22

E 0 1 1.41 1.15 0 1

F 1.1 0.93 1.07 1.22 1 0

n AB n C

AE B C D F

AE 0 1 1.41 1.15 1.1

B 1 0 1.29 1.10 0.93

C 1.41 1.29 0 1.26 1.07

D 1.15 1.10 1.26 0 1.22

F 1.1 0.93 1.07 1.22 0

donde dij es la distancia entre el elemento i del grupo AB y el j de C; nAB y nC son los números de elementos en el grupo AB y C, respectivamente. Este ligamiento promedio se conoce también por las siglas UPGMA (Unweighted Pair Groups Method with Arithmetic AE BF C D Averages). AE 0 1.1 1.41 1.15 0 1.29 1.22 Consideremos la matriz de dis- BF 1.1 1.41 1.29 0 1.26 tancias de la tabla. Se realizará un C D 1.15 1.22 1.26 0 agrupamiento aplicando ligamiento simple. AEBF C D En primer lugar se agrupan los AEBF 0 1.41 1.22 C 1.41 0 1.26 elementos A y E porque están a D 1.22 1.26 0 menor distancia (son iguales). ForAEBFD C mado ese primer grupo habría que AEBFD 0 1.41 calcular las nuevas distancias del C 1.41 0 grupo AE a los restantes elementos pero como d(A, U) = d(E, U) para todos los restantes elementos U se AE BF C D mantienen esas distancias. AE 0 1.05 1.41 1.15 En el segundo paso se observa BF 1.05 0 1.18 1.16 1.41 1.18 0 1.26 que la menor distancia es la de B a C D 1.15 1.16 1.26 0 F; se forma ese grupo y se recalculan las distancias del nuevo AEBF C D grupo a los restantes. Y así hasta AEBF 0 1.295 1.155 C 1.295 0 1.26 que se han agrupado todos. TamD 1.155 1.26 0 bién se puede detener el proceso AEBFD C fijando algún otro criterio para ello. AEBFD 0 1.277 Por ejemplo, cuando se ha alcanC 1.277 0 zado una distancia máxima fijada previamente. A continuación se aplica el ligamiento mados inicialmente se van acoplando los rescompleto. Los 2 primeros agrupamientos co- tantes elementos. En cambio, el ligamiento inciden en este ejemplo, por lo que sólo se completo tiende a generar muchos grupos muestran los tres últimos pasos. chicos que se reunirán en los últimos pasos. El ligamiento promedio conduce a las siEl análisis de Agrupamientos sólo debe guientes agrupaciones: tomarse como un método exploratorio. Si Los mismos métodos se pueden aplicar originalmente los datos forman grupos bien sobre matrices de asociación cambiando los separados cualquier método de agrupamienconceptos de «menor distancia» por el de to dará, aproximadamente, los mismos re«menor asociación». sultados. Pero si las muestras forman un En general, el ligamiento simple produce contínuo, cada método y cada medida de agrupamientos en cadena: a los grupos for- distancia pueden conducir a resultados muy
AE BF C D AE 0 1 1.41 1.15 BF 1 0 1.07 1.10 C 1.41 1.07 0 1.26 D 1.15 1.10 1.26 0
AEBFC D AEBFC 0 1.10 D 1.10 0

AEBF C D

AEBF 0 1.07 1.10

C 1.07 0 1.26

D 1.10 1.26 0

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dispares. En este caso las conclusiones deben realizarse con cautela. A veces es conveniente realizar un Análisis de Coordenadas Principales para determinar si existen grupos claramente definidos o no. 7 Lecturas recomendadas
CAVALLI-SFORZA, L.L. y A.W.F. EDWARDS. 1967. Phylogenetic analysis: models and estimation procedures. Am. J. Hum. Gen. 19: 233-257. DI RENZO, M.; BONAMICO, N.; GESUMARIA, J. 2001. Characterisation of amaranth accessions by isozymic patterns. Seed Science And Technology, v.29 (1): 227238. EVERITT, B.S.; DUNN, G. 1991. Applied Multivariate Data Analysis. E. Arnold, London. HAIR, J.F.; ANDERSON, R.E.; TATHAM, R.L.; BLACK,

W.C. 1995. Multivariate Data Analysis. 4ta. Ed. Prentice Hall - Upper Saddle River, New Jersery. HILLIS D, 1984. Misuse and modification of Nei’s genetic distance. Syst Zool 33:238-240. MANLY, B.F. 1986. Multivariate Statistical Methods. A Primer. Chapman and Hall, London. NEI, M. 1972. Genetic distances between populatios. Am. Nat. 106: 283-292. NEI, M. 1978. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from small number of individuals. Genetics 76: 379-390. RENCHER, A.C. 1995. Methods Of Multivariate Analysis. J. Wiley & Sons, Inc. New York

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PARTE VII Genómica

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal

211

Viviana. SELVA. Gustavo. Juan P.212 ECHENIQUE. SCHRAUF. .

que se ocupa de la caracterización física de genomas enteros.VII. Estas servirán para el estudio de enfermedades humanas complejas y para comprender fenómenos tales como la fisiología celular. El objetivo de la genómica es la dilucidación completa y exacta de la secuencia de ADN de un genoma haploide representativo de una especie. proteínas y metabolitos que constituyen un organismo. Juan P. la evolución. estudiando en conjunto los miles de genes. Para ello. la conducta. La conjunción entre tecnología génica. dos áreas de la ciencia que han tenido un desarrollo tecnólogico enorme. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 213 . Cuando esta secuencia se conoce.Genómica funcional. También aportarán información acerca de todos los aspectos del crecimiento y desarrollo vegetal. El término fue acuñado en 1986 por Thomas Roderick para referirse a la subdisciplina de la genética que se ocupa del mapeo.-Capítulo 1 Genómica Echenique. producidos por un organismo. Gracias al potencial de relacionar fenotipos biológica y económicamente importantes con los genes responsables de los mismos será posible identificar genes de interés que puedan ser transferidos a otros organismos por medio de tecnología génica. genómica y bioinformática revolucionará el mejoramiento genético vegetal. En pocos años estarán disponibles las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de todos los genes y productos génicos codificados por los genomas de varios organismos complejos. el desarrollo. como la salud. diferenciación y respuesta a estreses bióticos y abióticos. La información generada es enorme y es clave para la identificación y el aislamiento de genes de interés y permitirá interpretar.Genómica estructural. Gustavo. las herramientas que se utilizan para el análisis individual de genes o pequeñas regiones cromosómicas. que caracteriza el transcriptoma. el conocimiento de la secuencia de los genes posibilitará el desarrollo de marcadores perfectos. abre la puerta a numerosas posibilidades.Comparar secuencias similares presentes en diferentes entidades biológicas y comprender el papel de dichas secuencias. la alimentación y el medio ambiente. dando origen a lo que se denomina mejoramiento molecular y conducirá al desarrollo de nuevos y promisorios cultivares (Fig. Las aplicaciones de la genómica alcanzan a todos los ámbitos de la actividad humana relacionados con la biología. Consiste en la caracterización molecular de genomas enteros y aporta información acerca de la secuencia y de la función de cada sector del genoma en diferentes situaciones de desarrollo y bajo diferentes condiciones ambientales. Genomics . Por otro lado. consecuencia de la función de los RNA y proteínas. generando una revolución en el conocimiento y en la comprensión de los procesos biológicos. 1). basados en la secuencia del mismo gen. así como de los mecanismos implicados en la regulación de la expresión e interacción génica. etc. el proteoma o conjunto de proteínas codificadas por un genoma. Para ayudar en este proceso han surgido poderosas herramientas bioinformáticas que permiten almacenar e interpretar esta información. los procesos biológicos. que está constituído por el conjunto completo de transcriptos. La genómica se divide en dos grandes áreas: . Selva. secuenciación y análisis de las funciones de genomas completos y sirvió de nombre para una revista especializada en la publicación de los mencionados temas. marcadores moleculares. Por análisis computacional de la misma y utilizando principios conocidos de genética y el análisis molecular de los transcriptos y proteínas es posible: . lo cual facilitará la selección y la transferencia de los mismos a variedades de interés.Viviana. así como las complicadas redes de interacciones que operan entre ellos. y el metaboloma o conjunto total de metabolitos de una célula. se aplican al análisis global de genomas completos. 1 Introducción La «genómica» se desarrolló en los últimos 10 años como consecuencia de los avances realizados en biología molecular e Informática. Schrauf. . en términos moleculares.

SCHRAUF. 2). . el nematodo Caenorhabitis entre distintas poblaciones de una misma especie. cuentran la levadura.Esto ha dado origen a la genómica comparativa y ha demostrado que existe considerable sintenia es decir una localización conservada de genes en posiciones equivalentes en especies relacionadas (Fig.Realizar predicciones acerca de todas y de varios eucariotas. Figura 2: Sintenia entre los genomas de varias gramíneas. marcadores moleculares. SELVA. También ha sido una excelente herramienta para identificar motivos de secuencia altamente conservados y. por lo tanto. Juan P. entre los que se enlas proteínas codificadas por una especie. En Febrero de 2001. Gentileza de G. coincidiendo con el cincuenta aniversario de la puFigura 1: La conjunción entre tecnología génica. por lo cual dichos genomas pueden sintetizarse básicamente como compuestos por «bloques de ligamiento de arroz». Saccharomyces . marcadores perfectos y realizar secuenciado completamente. investigar nuevas terapias y establecer la resistencia o susceptibilidad a diferentes factores. así como bién se han secuenciado el fenotipeado molecular. Tamselección asistida por marcadores moleculares (MAS). Viviana. conduciendo al desarrollo de nuevos DNA por Watson y Crick. la revista cultivares. . funcionalmente importantes en regiones codificantes y no codificantes del genoma. Gustavo. exitosamente en los últimos años los genomas completos de más de 30 bacterias . Los nuevos genes hallados serán introducidos en Nature publicó el primer borrador del plantas por tecnología génica. Esto a su vez permitirá establecer genoma humano. El genoma del maíz tiene dos copias semejantes de cada bloque de genes por lo que está representado por dos anillos del círculo.Establecer las variaciones genéticas cerevisiae . genómica y bioinformática revolucionarán el blicación del modelo estructural del mejoramiento vegetal. (2003) 214 ECHENIQUE. El conocimiento de la secuencia permitirá la obtención de mapas. El genoma de arroz contiene grupos de marcadores que se hallan altamente conservados en muchos cereales. Las líneas externas punteadas conectan sectores adyacentes de los cromosomas de trigo. Spangenberg. que ha sido la funcionalidad de los mismos. En la figura se muestra el alineamiento de los cromosomas y segmentos de cromosomas (identificados con letras mayúsculas) de varias gramíneas con los del arroz (centro).Comparar secuencias de diferentes especies y entender procesos evolutivos. Modificado de Gale y Devos (1998) y de Snustad et al. Catalogar las variaciones genéticas entre individuos ayudará a identificar aquellos cambios que conducen a enfermedades genéticas.

gato. La genómica estructural procede a través de niveles incrementales de resolución analítica. y vegetales como arroz. A continuación se brinda un panorama global acerca de la forma en que se articulan los proyectos de genómica. basado en marcadores moleculares hasta la realización de un mapa físico. maíz. cerdo. etc. basado en el análisis de recombinación meiótica. comenzando con la asignación de genes y marcadores a cromosomas individuales. basado en la secuencia de fragmentos clonados parcialmente solapantes (Fig. colza. llegando a la realización de un mapa físico. 3). basado en marcadores moleculares. Las distancias genéticas se basan en frecuencias de entrecruzamientos («crossing overs») y son medidas como porcentaje de recombinación en centiMorgans (cM). finalizando con la preparación de un mapa físico a través de la secuenciación. mapeando estos genes y marcadores dentro de los cromosomas. ratón. etc. basado en la secuencia de fragmentos clonados solapantes. perro. hacia uno de alta resolución. (2000). Los pasos serían: Mapeo cromosómico de baja resolución (ubicación de genes que producen fenotipos mutantes conocidos y algunos marcadores). soja. algunos resultados relevantes. la mosca del vinagre Drosophila melanogaster y una planta. las aplicaciones en agricultura y el estado de la investigación en Sudamérica.Mapeo genético de alta resolución de cada cromosoma (con marcadores moleculares ubicados muy próximos entre sí). . Modificada de Griffths et al. basado en el análisis de recombinación meiótica.elegans. Arabidopsis thaliana. a uno de alta resolución. El análisis comparativo de diferentes genomas posibilitará deducir reglas generales que gobiernan la estructura de todos los genomas. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 215 . Actualmente se encuentran en marcha proyectos de secuenciación de los genomas de diferentes modelos animales como rata. La genómica estructural procede desde un mapeo genético de baja resolución. Es decir. el objetivo de la misma es caracterizar la estructura del genoma. Conocer la estructura de un genoma individual puede ser de utilidad para manipular genes y segmentos de ADN en una especie particular. que se procede desde un mapeo genético de baja resolución. 2 Genómica estructural Como su nombre lo indica. raigrás. Figura 3: Niveles de complejidad de la genómica estructural. trébol.

. por ejemplo humano-ratón.Mapeo físico . Sin embargo. . Siempre incluye un cromosoma humano que lleva un alelo salvaje defectivo para una función bioquímica determinada en el genoma del ratón. . Las distancias físicas generalmente no se correlacionan directamente con las distancias genéticas porque las frecuencias de recombinación no son siempre proporcionales a las distancias moleculares. SCHRAUF. SELVA. Si sobreviven en un cultivo deficiente para el factor que no sintetizan es porque llevan el alelo humano equivalente. etc. siendo el fragmento más pequeño que lleva ambos marcadores una estimación de la distancia entre ellos.Hibridación in situ: cuando se dispone 216 ECHENIQUE.Anclado del mapa genético y del mapa físico en el de secuencia. Primero.1 Asignación de loci a cromosomas específicos Se utilizan los siguientes métodos: . .Secuenciación de ADN a gran escala. . en humanos. la mosca de la fruta.Mapeo por recombinación: en los casos en que ha sido factible hacerlo -organismos experimentales como levaduras.Híbridos celulares interespecíficos. La distancia entre dos marcadores puede ser medida determinando el tamaño de los fragmentos de restricción que los contienen. Las bandas en el gel corresponderían a cromosomas individuales y pueden utilizarse para localizar nuevos genes por hibridación. que son marcadores basados en el polimorfismo de un solo nucleótido. un centimorgan representa.2 Ubicación de los genes a lo largo del cromosoma El próximo nivel de resolución consiste en determinar la posición de un gen o marcador molecular sobre el cromosoma.Electroforesis de campo pulsátil: se usa en el caso de especies que poseen cromosomas pequeños.-4 y IV.Anclado del mapa genético en el mapa físico. a menudo las dos correlacionan razonablemente bien en las regiones eucromáticas de los cromosomas (aquellas menos condensadas. 2. Estos intervalos o «gaps» no pueden ser completados utilizando análisis de ligamiento debido a la ausencia de marcadores en esas regiones. un cM es equivalente. los intervalos recombinacionales entre genes conocidos contienen cantidades muy grandes de ADN. que se colorean de manera más difusa ). Para llenarlos y construir mapas de alta resolución surgieron los marcadores moleculares. Se utiliza exclusivamente en mapeo del genoma humano o de especies animales. . como sucede con los de levaduras. Aunque tal resolución es un logro muy importante. En humanos. Sin embargo. Este paso es importante porque los mapas genéticos pueden alinearse con los mapas físicos y utilizarse para validar los mismos. a aproximadamente 1 Mb de ADN. Juan P. que brinda un mapa completo de cada cromosoma..ha posibilitado la construcción de mapas que a lo largo de los años aparecen repletos de genes con efectos fenotípicos determinados. Las distancias físicas se miden en kilobases (Kb) o megabases (Mb). resultantes de mapas de fragmentos de restricción parcialmente superpuestos.-2). basado en distancias moleculares. una megabase. Para lograr mayor resolución actualmente existen los SNP. Viviana. Se establecen bancos de líneas celulares que contengan todos los cromosomas del roedor y un cromosoma humano particular. ratón. Estos marcadores permiten la construcción de mapas genéticos con una densidad de un marcador /centimorgan (cM). que complementa la función faltante . entre los que se encuentran los RFLP y los SSLP (mini y microsatélites) (ver II. .Ligamiento a loci conocidos: análisis tradicional basado en cruzamientos. utilizando sondas de localización conocida se establece que banda corresponde a cada cromosoma. separables por esta técnica. Gustavo. . 2. Arabidopsis. un nuevo gen clonado de ubicación desconocida se utiliza como sonda para asignarle una posi- ción en un cromosoma determinado. Luego. lo que equivale a un millón de pares de bases o 1000 kb. en especies en las que es factible hacerlo. en promedio. Utilizando combinaciones de sondas y enzimas de restricción puede construirse un mapa físico determinando qué fragmentos poseen marcadores en común.

Cuando se han obtenido los clones contiguos. los BAC y los PAC. no abordar el estudio del genoma completo. Estas secuencias de entre 300-500 pb suelen ser suficientes para la identificación de los genes mediante comparación con las secuencias existentes en las bases de datos públicas (ej. que puede estudiarse en detalle y secuenciarse (ver II. aquellos genes que se están expresando en un momento determinado de la vida del organismo. 3. al menos. Puede. . Para obtener esta información debe secuenciarse el genoma completo. El contenido de estos clones se caracteriza y se ordenan. determinar si son secuencias específicas de un cromosoma y determinar la posición del gen en el mismo. habría que determinar la estructura del ADNc completo para estudiar su función por otros métodos. correlacionar fenotipos mutantes con disrupciones en regiones moleculares específicas. de ese modo. Para ello se obtienen poblaciones de ADNc (que reflejan sólo secuencias expresadas) que se secuencian de forma masiva para generar miles de secuencias parciales conocidas como ESTs (ver VII. A fin de distinguir las regiones codificantes para genes.Generación de bancos de EST (etiquetas de secuencias expresadas) La complejidad de los genomas eucariotas hace aconsejable. utilizando para ello programas de análisis informático. los YAC. que aceptan insertos de gran tamaño (ver II. Es preferible estudiar sólo una fracción del mismo. Un conjunto de clones solapantes se llama contiguo (contig). la técnica se denomina FISH («fluorescence in situ hybridization»). Se trata de identificar un conjunto de fragmentos de ADN clonados superpuestos que juntos representen un cromosoma o un genoma completo. En el caso de fluorescencia. Si la información contenida en la secuencia parcial no es suficiente. Genbank. En la preparación de mapas físicos de genomas se utilizan vectores como los cósmidos. Los mapas así obtenidos se llaman mapas físicos. las secuencias se comparan con las secuencias de ESTs y ADNc previamente estudiadas.3 Secuenciación a gran escala del genoma .2).-3).-5).de un gen clonado éste puede ser utilizado como sonda para hibridar con los cromosomas in situ . de las no codificantes. Para ello. . 2. identificarse a los cromosomas portadores de la secuencia. buscando los puntos de solapamiento o superposición.-3). que en muchos organismos representan un porcentaje bastante pequeño del genoma.. a) Secuenciación de los clones y ensamblado de los fragmentos El clonado comienza obteniendo un número elevado de fragmentos al azar que se clonan en un vector apropiado.Estos clones constituyen la materia prima para secuenciar en proyectos genómicos a gran escala. el ADN genómico total se digiere con enzimas de restricción apropiadas o se fragmenta mecánicamente para generar fragmentos de gran tamaño (100-300 kb). ellos representan una genoteca ordenada de secuencias de DNA que puede utilizarse para futuros análisis genéticos. es decir. para lo cual se lo marca radiactivamente o por fluorescencia. como. El mapa físico es útil en tres aspectos: 1. 2.Secuenciación genómica La aproximación anterior no permite identificar genes que se expresan a bajo nivel o en situaciones fisiológicas no consideradas o regiones no representadas en el ARNm. EMBL). como primera aproximación. porque el ADN es el material físico del genoma. una representación completa del genoma. Para establecer el solapamiento de clones al azar se secuencian regiones cortas del inserto proximales al sitio de clonado utilizando primers posicionados en el vector. La localización del fragmento en el cromosoma se visualiza como un punto brillante (ver II.Mapeo físico de los cromosomas: aporta un nivel de resolución mayor.Los marcadores genéticos ubicados en los clones pueden ordenarse y contribuir al proceso general de mapeo. para construir genotecas que contienen. por ejemplo. Los vacíos (gaps) se completan utilizando el final de un Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 217 . que se clonan en vectores apropiados.

FISH: para localizar las posiciones aproximadas de insertos grandes. Para ello se diseñan primers junto de contiguos que equivale al núme. los contiguos se cortan en fragmentos más pequeños que se alargan y van convergiendo unos con otros. el aislamien. Esta se usa para análisis genético genomas grandes. incluyendo el shotgun sequencing). Juan P. aislamiento de genes y genómica funcional.que amplifican una secuencia corta de ADN ro de cromosomas de la especie en estu. («shotgun library»).(STS).nes de cada uno. En la Fig. llamada secuenciación de son un importante punto de partida para vagenomas completos ( whole genome rios tipos de análisis genético. Viviana. dio. A medida que se van Se reúne un conjunto de clones al azar y se caracterizando los clones. Entre ellas: . en este caso de BACs.Aislamiento de genes por clonado to de ADN. clonan en λ y se secuencian pequeñas regioEl proyecto termina cuando se tiene un con.Fenotipificación (fingerprinting): se corta el clon con enzimas de restricción que generan un grupo de bandas que representan un «fingerprint» o «huella digital» del clon. SELVA. Para genomas más pequeLos mapas genéticos y los mapas físicos ños se utiliza otra. Gustavo. cador conocido que esté estrechamente lib) Ordenamiento de los clones gado al mismo.Se utilizan varias técnicas para ordenar los clones en contiguos.STS («sequenpara reconstruir la secuencia del genoma. Modificada de la publicación ce tag sites» o sidel International Human Genome Sequencing Consortium. Todos los estadíos del análisis genómico Por ejemplo: como la preparación de clones. 2001. . 4 se resume una estrategia de secuenciación jerárquica ( hierarchical 3 Utilización de mapas genómicos para el shotgun sequencing ). tios de secuencia marcada) : son sefragmento clonado para llegar al siguien. SCHRAUF. te (primer walking). automatizando el trabajo. . Los programa de comfragmentos de ADN representados en la misma son organizados en putación para deun mapa físico y los clones individuales son seleccionados y secuenciados terminar si se superpara lo cual se hace una nueva genoteca de trozos más pequeños ponen o solapan. Este marcador actúa como 218 ECHENIQUE.cuencias cortas de insertos grandes clonados. Las bandas generadas por vaFigura 4: Estrategia de secuenciado jerárquico («hierarchical shotgun rios clones pueden sequencing strategy»). La secuencia de los clones se ensambla finalmente .cia se desconoce se puede partir de un marquinas o robots. la electroforesis y la secuenciación posicional: para ubicar un gen cuya secuenhan sido bien adaptados a diferentes má. El primer paso consiste en construir una alinearse visualgenoteca por fragmentación del ADN e introducción del mismo en mente o por un vectores que aceptan grandes insertos.

.2) En el futuro. por el cual los fragmentos finales del marcador ligado son utilizados como sondas para seleccionar otros clones de la genoteca. Allí comienza la búsqueda de genes utilizando programas de predicción y se seleccionan las secuencias candidatas. O sea que a través de las uniones se va avanzando hacia el punto donde se encuentra el locus. Se realizan cruzas y retrocuzas y se obtienen líneas endocriadas recombinantes (RIL). se clonan en fagos. de manera que esas dos regiones que estaban distantes en el genoma ahora esten unidas en un fragmento. Esta técnica consiste en crear fragmentos grandes (entre 80-150 kb) por restricción del ADN en la región que se cree contiene al gen de interés. Una sonda del sector de comienzo de la región que contiene al gen de interés puede utilizarse como punta de partida para comenzar a «saltar» por el genoma. El círculo se corta con una nueva enzima de restricción y los fragmentos obtenidos. Existe otra técnica relacionada llamada salto cromosómico. Estas regiones se van secuenciando. ampliamente espaciadas a lo largo de la secuencia. Este tipo de variación se debe a la interacción acumulativa entre alelos + y – de varios genes y el ambiente. Un salto puede. tendremos la prueba irrefutable de que estamos frente al gen buscado. El experimento ideal para confirmar esto. como peso o altura. o para la más probable de acuerdo al análisis de secuencia. Cada fragmento de ADN es luego circularizado. Del segundo grupo de clones (los que solapan con el inicial) se hacen mapas de restricción y los fragmentos obtenidos son utilizados para hacer una nueva ronda de selección de clones superpuestos. el análisis de SNP (polimorfismos de un nucleótido simple) promete ace- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 219 . que permite saltar a través de áreas distantes y potencialmente no clonables del ADN y genera «marcas».punto de partida para el procedimiento de caminado cromosómico ( chromosome walking). sería la transformación de un individuo mutante para esta función con el gen normal. Puede suceder que: .La variación fenotípica sea cuantitativa. Así el proceso de «caminado» se mueve hacia ambos lados a partir del sitio inicial. avanzar unos 50 kb hacia el locus de interés. se buscan dos tipos de líneas que muestren fenotipos contrastantes para un carácter cuantitativo y se cruzan para generar descendencia homocigota que contenga solo un segmento o un pequeño número de segmentos de una de las líneas. Para abordar este problema. estas secuencias pasan a ser «candidatas». dispuestos a lo largo del cromosoma. el otro extremo de la unión del fragmento inicial se corta y se usa para buscar el siguiente punto de salto en la genoteca.Estrategia del gen candidato: la caracterización de una región cromosómica hace que aparezcan varios genes de función desconocida. por ejemplo. etc. La disponibilidad de miles de marcadores moleculares como los SSLP. Cada posición de salto es un punto de partida para una caminata cromosómica. poniendo en contacto los extremos libres. Se trata de generar en esa unión un sitio que no sea cortado en una posterior restricción. Si se produce la reversión del fenotipo mutante (complementación). Una vez allí. entre los que se encuentran los sitios de unión. que culmina cuando se llega al gen de interés. ha posibilitado el mapeo de algunos de estos genes que contribuyen a la variación cuantitativa cuyos loci son llamados QTL (quantitative trait loci). (ver IV. .. se diseñan experimentos tendientes a determinar en cuales tejidos se expresa. Estos individuos pueden caracterizarse por su fenotipo y puede estimarse la contribución de los segmentos específicos a la variación observada. Si el patrón de expresión encontrado coincide con el patrón esperado es altamente probable que hayamos encontrado el gen de interés. Si un gen de interés es mapeado en esa región. que es una enfermedad humana que resulta fatal y es causada por mutaciones en gen de gran tamaño localizado en el cromosoma 7. que pueden utilizarse como puntos de inicio para múltiples caminatas cromosómicas bidireccionales.Genes con patrones complejos de herencia: no todos los genes muestran patrones simples de herencia. Este procedimiento acerca puntos relativamente distantes de la región de genoma en estudio. en qué condiciones. Para cada una de ellas. Esta estrategia de saltos se utilizó para clonar el gen de la fibrosis quística. utilizando Northern blot o RT-PCR. Esto es lo que se llama una «genoteca de saltos».

taumatina.La bioinformática intenta dar sentido 220 ECHENIQUE. para identificar pasos metabólicos limitantes. que permite separar con gran resolución. . como por ejemplo antraquinonas. De esta manera se pueden identificar. El concepto emergente es la posibilidad de explorar directamente la variación dentro de genes y no a través de marcadores anónimos.) produce una enorme variedad de compuestos diferentes de los que se han identificado 40. pudiéndose disponer 5000-6000 genes (ESTs. . que permite analizar simultáneamente la expresión de miles de genes. oligonucleótidos) sobre un portaobjetos utilizando un sistema robotizado. El método más utilizado es el de micromatrices de ADN.000.000 y se estima que aún quedan por descubrir alrededor de 100. los perfiles de masa molecular o secuencias de aminoácidos obtenidos se comparan con las bases de datos de proteínas existentes. SELVA. el metabolismo secundario (conjunto de reacciones que no son vitales para el individuo y que conducen a la produción de compuestos que no tienen una función reconocida en el manteniento de los procesos fisiológicos fundamentales de los organismos que los sintetizan pero que a veces ayudan a la supervivencia.3). la mayoría de los polipéptidos celulares combinando de forma secuencial diferencias en carga y en masa molecular. . para el análisis de mutantes y hasta para realizar la evaluación de manejos agronómicos. Restaría entonces determinar cuál es la función de cada uno de ellos y cómo interaccionan para definir un fenotipo determinado. SCHRAUF. un fenotipo concreto. El método más utilizado para estudiar la abundancia relativa de cientos de proteínas es la electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida (2DPAGE). Sobre este chip de ADN se realizan experimentos de hibridación con muestras marcadas radioactivamente o con fluoróforos apropiados. digoxina. La metabolómica puede ser aplicada al monitoreo de estreses inducidos. en términos moleculares. los patrones de expresión de miles de genes en un momento del desarrollo o en respuesta a diferentes estímulos ambientales. etc. cromatrografía líquida o gaseosa y resonancia magnética nuclear) para analizar los cambios metabólicos provocados por mutaciones génicas o por la expresión de transgenes. ver (VII. etc. Viviana. y los resultados se cuantifican mediante análisis con phosphorimager o microscopía confocal (ver VII. Los investigadores que trabajan en este nuevo campo de la química aplicada a la biología (metabolómica) consideran que sólo de esta forma se podría definir. Gustavo. puesto que estas macromoléculas están al final de la ruta de expresión génica. incluyendo las modificadas después de la traducción.El transcriptoma: se refiere al estudio de los perfiles de expresión de todos los genes presentes en el genoma. Nuevos enfoques de mapeo de QTL y QTN (quantitative trait nucleotide) están disponibles. tales como el efecto de fertilizantes sobre el metabolismo. En metabolómica se emplean herramientas analíticas muy sensibles (tales como espectrometría de masa. ADNc. 4 Análisis funcional de los genes Una vez secuenciado el genoma completo pueden identificarse la mayoría de los genes de una especie. Utilizando sistemas computarizados de análisis de imagen se seleccionan las proteínas cuya abundancia relativa cambia durante el desarrollo o en respuesta a diferentes estímulos ambientales. Los polipéptidos se purifican y digieren con proteasas para generar una colección de péptidos que se analizan por espectrometría de masas o se secuencian a partir del extremo amino. . El estudio del transcriptoma debe ser complementado con el análisis de expresión de las proteínas codificadas por los transcriptos. El análisis bioinformático de estos datos permite asociar grupos de genes que se expresan de forma coordinada y proporciona información importante sobre la función de los mismos.lerar el mapeo de caracteres complejos. de forma simultánea.El metaboloma: comprende el conjunto total de metabolitos de una célula. vainillina. En plantas.-2).El proteoma: comprende el conjunto total de proteínas expresadas por un genoma completo. alcaloides. Para identificar la proteína. menta. Juan P. La genómica funcional intenta resolver esta cuestión a través del estudio de: .

org. Las nuevas proteínas surgen a través de cortes y empalmes alternativos de un mismo ARN (alternative splicing). La mosca de la fruta tiene unos 13000 genes.498 genes que codifican para 11. Los humanos tenemos 30 genes para factores de crecimiento del fribroblasto. 6 Algunas generalizaciones acerca de los genomas Los estudios en especies modelo han permitido arribar a varias generalizaciones.4 megabases secuenciadas (de un total de 125). Carece de importancia económica pero resulta ser un excelente organismo para la investigación puesto que es fácil de transformar y su ciclo de vida tarda sólo 7 semanas. Arabidopsis 26000 y los humanos 31000. ¿cuál es la base de la mayor complejidad en los humanos? La explicación estaría en el proteoma.a la información derivada de las técnicas anteriormente descritas. representativas de un genoma vegetal. En un artículo publicado en Nature (2000) se analiza el genoma de esta planta a partir de las 115. En el caso de Arabidopsis. más que en el genoma.-3). Arabidopsis thaliana. seguida por una subsecuente pérdida y duplicación de genes. entre las brasicaceas cultivadas y Arabidopsis. el arroz. Caenorhabitis elegans 18000. aunque el número de miembros por familia es mayor en humanos. Las predicciones indican que el 60 % de los genes humanos tiene dos o más alternativas de splicing. cerca del 9 % de los genes son factores de transcripción Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 221 . conformando el más avanzado sistema de experimentos en biología de plantas del mundo. indicando que los conjuntos de proteínas en común han experimentado una expansión y contracción en estos tres grupos eucariotas. Esto es particularmente evidente en aquellos genes involucrados en el desarrollo . cuyo genoma es seis veces menor que el del maíz y 37 veces menor que el del trigo. La importancia de esta ciencia resulta obvia cuando se considera que los genomas poseen miles de millones de pares de bases (ver VII. 5 Modelos El mapeo comparativo ha demostrado que la organización de los genes dentro de los genomas ha permanecido muy conservada a través de la evolución. Por ello. El estudio de estas dos especies permitirá arribar a conocimientos clave para el mejoramiento vegetal. Pudo establecerse que la evolución de Arabidopsis involucró una duplicación completa del genoma.000 familias de proteínas. lo que permite aumentar considerablemente la diversidad proteica a partir de los mismos mensajes. Una de ellas es que el número de genes no es la base de la complejidad. con una diversidad funcional similar a la encontrada en Drosophila y Caenorhabditis elegans. enriquecido por una transferencia lateral de genes de cianobacterias. lo cual dio origen a un genoma dinámico. de semilla a semilla. entre los pinos. entre las solanáceas. El genoma contiene 25. Alrededor de 12. Un elevado número de factores de transcripción y modificaciones postraduccionales también conducen a una mayor complejidad. teniendo en cuenta la envergadura de un proyecto de secuenciado de un organismo. Arabidopsis posee varias familias de proteínas nuevas pero carece de otras comunes. los emprendimientos genómicos tomaron especies modelo. El primer modelo vegetal fue una dicotiledónea. Si el número de genes nos es muy diferente entre estas especies. así como también las experiencias biotecnológicas que se están o se han realizado con esta planta. Arabidopsis thaliana es una dicotiledónea que posee uno de los genomas vegetales más pequeños. Las proteínas codificadas por los genes pueden agruparse en familias en base a su similitud y muchas de estas familias proteicas son compartidas por todos los grupos mencionados. rosáceas y varias leguminosas. existiendo estrechas relaciones de colinearidad entre los genomas de casi todas las gramíneas cultivadas. Su secuencia genética es de libre acceso en el sitio Web www.000 científicos trabajan coordinadamente en Arabidopsis.arabidopsis. mientras que Drosophila y Caenorhabitis elegans tienen 2. Le siguió una monocotiledónea. En Caenorhabitis el 22%.

por lo que se ha sugerido que. VRN2 es un represor dominante de la floración en cereales de invierno.5% codifica para proteínas. está involucrado en la transición de los ápices desde un estado de crecimiento vegetativo a uno reproductivo. Ejemplo aplicado al mapeo y caracterización de los genes de vernalización de los cereales Un ejemplo interesante para aplicar varios de estos conceptos ha sido la investigación que llevó al mapeo y caracterización de los genes de vernalización de trigo (Yang y col. siendo la mayoría de ellas secuencias «parásitas» de elementos transponibles que se propagan replicándose e insertando una copia de sí mismos en otras regiones del genoma. A partir de aquí se realizó el clonado posicional del mismo. . podrían afectar positivamente su expresión y evolución. Este gen es similar a uno hallado en Arabidopsis llamado APETALA1. Los genomas vegetales también están plagados de estas secuencias repetitivas. En la mosca. 222 ECHENIQUE. Haciendo uso de las herramientas de la genómica comparativa se determinó que uno de estos genes. Viviana. Los genes no están distribuídos en forma pareja. Algunos se encuentran agrupados en ciertas regiones del genoma mientras que otros se encuentran aislados. Son secuencias sin función aparente que han contribuído a lo largo de la evolución a la expansión de los genomas de plantas y animales superiores). Esto significa que a partir de marcadores conocidos ubicados en el genoma se comenzó una caminata cromosómica. Esto parece reflejar el hecho de que las plantas deben adaptarse a una amplia variedad de condiciones medioambientales. De esta manera se construyó un mapa físico o de secuencia de la región que contenía el gen.. El otro gen involucrado en el proceso. y sólo el 1.15 % de las EST similares a retrotransposones (elementos genéticos transponibles. mientras que los genes se encuentran en áreas con elevado contenido de G y C. sino que la proporción de FT es más alta que en cualquier clase de organismo estudiado. Para ello se utilizaron marcadores moleculares distruibuídos en la región. cebada y centeno. arroz y sorgo. que no está involucrado en la respuesta a la vernalización. Gustavo. En humanos. En la actualidad solo dos tipos de elementos son activos. Haciendo uso de la posibilidad que nos brindan las bases de datos de llevar a cabo «Northerns electrónicos» fue posible encontrar elementos repetitivos en las bases de EST de trigo. genotecas de BAC y genotecas de ADNc. VRN1. el nematodo y Arabidopsis la disposición de los genes es mucho más regular. Aproximadamente la mitad del genoma humano consiste de secuencias repetitivas. Fragmentos de estos elementos también se encontraron en las secuencias regulatorias que controlan la expresión de varios genes. uno primaveral y el otro invernal. Las secuencias correspondientes a los exones (secuencias del mensajero que se encuentran representadas en la proteína. SELVA. a diferencia de los animales. de alguna manera. se determinó que este gen se encuentra ubicado en el brazo largo del cromosoma 5A. La comparación de la secuencia de esta región con regiones equivalentes de cebada y de arroz permitió establecer que esta región contenía ocho genes. SCHRAUF. El descubrimiento de estos genes es un buen ejemplo de cómo se encaran algunos proyectos de genómica. Se utilizó trigo diploide (2n=2x=14 AA) debido a la menor complejidad de su genoma que los del trigo pan y candeal y se confeccionaron detallados mapas genéticos y físicos para la región cromosómica que los contenía en trigo.(FT). es decir que pueden movilizarse de un sector del genoma a otro y cuyo movimiento depende de la transcripción reversa . Juan P. se observa que Arabidopsis no sólo tiene más genes que algunos animales pequeños. Si se compara la proporción con los genomas de otras especies. Alu y LINE1. La mayoría de los mismos se encuentran en regiones ricas en A y T. utilizando una población de trigo diploide obtenida de cruzar progenitores con hábitos contrastantes de crecimiento. siendo 0. mientras que los intrones comprenden el 24%. Por mapeo genético de alta densidad. los genes ocupan una cuarta parte del genoma. que pueden movilizarse y cambiar de lugar si este no les resulta propicio. las secuencias correspondientes a los intrones no lo están) comprenden un porcentaje bajo del genoma. 2004).

no obstante ello. lo cual resultaba coherente con la interacción epistática entre los dos genes y con el hecho de que VRN2 actúe como un represor de la floración. Por ello. Para validar la hipótesis de que ZCCT1 era VRN2 se transformó trigo pan invernal con una construcción que inactivaba los mensajeros del mismo.Figura 5: La inhibición de la expresióndel gen VRN2 por transgénesis acelera la floración en aproximadamente un mes en comparación con la misma variedad de trigo no modificada. gentileza Dr.3). denominados ZCCT1 y ZCCT2. En una accesión de hábito primaveral se encontró una mutación de punto que redundaba en un cambio de un aminoácido arginina por un triptofano en una región crítica del gen. Los transcriptos de este gen son muy poco abundantes en las hojas y desapare- cen durante el proceso de vernalización. El análisis de este sitio en variedades cultivadas de trigo diploide permitió verificar que la mutación está ausente en todas las variedades de trigo invernal. esencial para la adaptación a clima frío. La arginina se encuentra en todas las proteínas del tipo ZCCT de Arabidopsis. Dos de los genes allí ubicados. codificaban para proteínas muy similares. este gen era un candidato atractivo para ser el represor de floración. Lo mismo ocurrió en cebada. Esta mutación de punto sería la causante del hábito primaveral.5). La región también contenía elementos repetitivos o retrotransposones. lo cual afectaría su función. donde estaba inhibida la expresión del gen (efecto que semejaba la inhibición del mismo por frío) mostraron una aceleración en el tiempo de floración (23 días) en relación a los controles no transformados (Fig. Esto confirmó que la disminución en los niveles de los transcriptos de VRN2 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 223 . El hábito ancestral de crecimiento invernal. cinco de los cuales se encontraron en el mismo orden y orientación que en la cebada y tres como en el arroz. arroz y cebada. La función de algunos de estos genes es aún desconocida. Estas plantas transformadas. Estas proteínas resultaron ser similares a una proteína de Arabidopsis y de arroz que está involucrada en la regulación del tiempo de floración. (2004). que directa o indirectamente reprime la transcripción de VRN1. Jorge Dubcovsky. Todas las pruebas de localización de los transcriptos y niveles de expresión condujeron a concluir que ZCCT1 era VRN2. es decir VRN2. De Yan et al. poseería el potencial para generar formas primaverales por mutaciones de pérdida de función en los dos principales loci de vernalización. lo cual permitió inferir que los mismos provienen de un evento de duplicación que ocurrió millones de años atrás. También se estableció que las diferencias entre variedades invernales y primaverales de trigo estarían dadas por diferencias en la región codificante de este gen (es decir en aquella región que está representada en el ARN mensajero). el análisis de su expresión permitió determinar que junto con la desaparición de los transcriptos de VRN2 se produce un incremento de los transcriptos de VRN1 . técnica denominada de ARN de interferencia (ver III. Todo esto llevó a sugerir que la gran adaptabilidad de los cereales de clima templado fue favorecida por un sistema muy flexible de regulación de la iniciación de la floración.

Este sería entonces un nuevo tipo de gen involucrado en la regulación de otros 224 ECHENIQUE.economía y la calidad de vida que en el ámbito de la salud humana. Gustavo. Gracias al aporte de grupos de investigación de todo el mundo se dispone de bases de datos públicas con información genómica de utilidad para los mejoradores. la actividad del mismo esta manera se acelerará significativamente disminuye y permite que la planta florezca. tales como los modelos son importantes. Dado que estos tres cereales representan más de la mitad de la producción alimentaria mundial y que el arroz es el alimento básico de más de la mitad de la población del planeta. SCHRAUF. tolerante a genómica será mayor en lo que se refiere a la aluminio y Deschampsia antarctica. VRN2 evita la floración.El análisis de especies tolerantes a situamación para aplicarla a la comprensión de los ciones extremas permitirá localizar genes involucrados en los mecanismos que las hafenómenos biológicos. Cuando la cia a la sequía.el aporte de nuevas variedades al mercado. Viviana. De rante la vernalización.adamsonii y Agrostis robusta. VRN2 es dife. tenderán a funcionar Figura 6: Categorización funcional de ESTs de Deschampsia bien y en la misma forma con una antarctica . que análisis de ESTs de diferentes plantas toleincluyen genes similares y genes muy diferenrantes a estreses abióticos. En variedades invernales con caracteres como rendimiento. SELVA. no siempre se adaptan a todos los casos y hay que analizar salinidad. calidad de los alimentos. todos los detalles antes de extrapolar infor. 7 Genómica y Agricultura Como ejemplos pueden citarse Agrostis Especialistas en varias disciplinas han lle. La secuencia de los genomas de Arabidopsis y de arroz proporcionarán información relevante acerca de otros cultivos. . cos y privados podrán identificarSpangenberg. la trascendencia de la genómica en la agricultura es indiscutible. que esta tecnología puede ser utilizada para manipular el tiempo de floración del trigo y confirmó que VRN2. Gentileza de G. como el maíz y el trigo. permitirá la identes. tificación de redes de genes comunes asoDe ello también se concluye que si bien ciados con estreses ambientales. se conjuntos de genes asociados genes de floración. juega un rol central en la regulación de la floración. La similitud entre las especies de cereales también implica que cuando se trasladan genes de una especie de cereales a otra. un factor de transcripción. Arabidopsis y los cereales y lizando criterios de selección a partir de la pastos de clima templado desarrollaron di. resistende trigo. a especies de cultivo. involucrados en la resistencia a bajas temperaturas para ser transferidos. tolerantes a gado a la conclusión de que el alcance de la salinidad. sequía. A diferencia del gen VRN1. A través de esfuerzos públipor tecnología génica. Microlaena stipoides. El conocimiento de cómo actúan los genes en una especie puede ayudar a los mejoradores a perfeccionar su función en otra especie. basada en el ferentes mecanismos de vernalización. rente de un gen de Arabidopsis que tiene ya sea por modificación genética o por seuna función similar. toleran- (ZCCT1) está directamente relacionada con la aceleración del tiempo de floración. Dichos genes podrán entonces ser transferidos a especies de cultivo. bajas y altas temperaturas. Juan P. La genómica comparativa. cen tolerantes. Esto permitió sugerir que lección con marcadores moleculares o utien su evolución. resisplanta se expone a un período de frío dutencia a insectos y tolerancia a herbicidas. además. El objetivo de este proyecto es encontrar genes mínima manipulación genética.información molecular. Este experimento demostró.

Durante los últimos años se ha obtenido una gran colección de FT de plantas. abeto. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 225 .te a bajas temperaturas (la única gramínea que crece en la Antártida) (Fig. tolerancia al estrés hídrico) y los genes involucrados se expresan en cascadas de forma tal que genes primarios activan a genes secundarios que a su vez activan a genes terciarios. desarrollo.. Se han identificado 1052 citocromos P450 y el objetivo actual es. Esta asociación no es específica de especie como el caso de Rhizobium y las leguminosas. protección contra las heladas y sequía. Recientemente se logró la identificación. las micorrizas (asociación de un hongo con la raíz de una planta superior. o tratar de identificar el FT que regula el consumo de nitrógeno (N). 6). determinar su función bioquímica precisa. Otro objetivo en este campo es la búsqueda de estrategias para inducir floración temprana. producción de químicos. los llamados factores NOD. El N es uno de los insumos más costosos para la agricultura. resistencia a las enfermedades. de un receptor requerido para el reconocimiento de señales bacterianas de nodulación. obteniéndose largas cascadas de expresión de genes por la manipulación de un solo gen. por lo que identificar los genes que controlan y modifican la respuesta al N sería de gran valor. incluyendo rendimiento. La herramienta primaria que se utiliza para conocer la función de los FT consiste en sobre-expresarlos y/o detener la expresión de algunos de ellos por disrupción génica o knock out. fitoesteroides. desde el punto de vista agrícola. En el caso de M. funcionalmente caracterizados. donde el objetivo sería la eliminación de los glicósidos cianogénicos que le confieren sabor amargo. Se puede. También se ha mencionado que los factores de transcripción serían las llaves para desbloquear funciones génicas que aprovechen la diversidad de la naturaleza para producir mejores cultivos. La mayoría de los caracteres vegetales a los que interesa aplicar la ingeniería genética son multigénicos (ej. truncatula no sólo se han disectado los pasos que controlan las señales entre la bacteria fijadora y la planta sino también entre la planta y otro simbionte. alcaloides. a través de la dilucidación de sus efectos en el desarrollo vegetal y la resistencia a las enfermedades. interacción con herbívoros. En total hay cerca de 1900 FT en Arabidopsis pero en el contexto de la genómica funcional el interés recae en unas 60 familias que tienen funciones reconocidas. Otro de los objetivos de la metabolómica es el estudio de la síntesis de las esencias que confieren perfume a las flores y el mejoramiento del sabor de algunas plantas utilizadas en alimentación humana. Lotus corniculatus y soja. La devastación de los bosques es motivo suficiente para invertir en proyectos de genómica tendientes a la identificación de genes involucrados en perennidad.). antioxidantes y antimicrobianos. En este sentido también existen proyectos genómicos sobre leguminosas y sus simbiontes fijadores de nitrógeno. no sólo en Arabidopsis. El álamo se utiliza como sistema modelo para el análisis de los genes involucrados en la formación de madera. estudiar procesos básicos. pino y eucaliptus. Estos son genes que virtualmente controlan todo carácter importante. Los factores de transcripción serían los responsables de hacer funcionar a los genes primarios . sino también en especies como tomate. Las plantas medicinales aportan el 25% de los compuestos activos utilizados actualmente por la industria farmacéutica. Recientemente se han secuenciado los genomas de las especies de Mesorhizobium y Sinorhizobium y se han producido cientos de miles de EST de Medicago truncatula. etc. en alfalfa. También tienen un rol muy importante en la detoxificación de xenobióticos (herbicidas y pesticidas). etc. de esteroides. Entre estos compuestos se encuentran los citocromos P450 . medir el efecto de cada FT en la composición de los lípidos en las semillas aceiteras y la composición de lípidos en las hojas. en las plantas. la composición de azúcares. El hongo puede ser de varios géneros y aportan fósforo a la planta. Se han comenzado a colectar EST de álamo. proteínas usadas en farmacéutica. como por ejemplo Cassava. que participan en la biosíntesis de muchos compuestos anticancerígenos. maíz y soja. respuesta a estrés y síntesis de metabolitos secundarios como lignina y celulosa. utilizando herramientas de metabolómica. por ejemplo. abedul.

diferente composición de gluteninas y gliadinas en función del uso industrial. Actualmente el acceso a los principales genes que afectan la calidad ha abierto nuevas vías para el desarrollo comercial de diferentes productos derivados del trigo.que es un factor crítico en el mejoramiento de forestales. arroz. en trigo y cebada. es de naturaleza hexaploide. dormición. con tres genomas homeólogos denominados A. sorgo) a plantas de genomas más complejos como el trigo. 8 Aportes de la genómica al mejoramiento de trigo El trigo pan (Triticum aestivum L 2n= 6x= 42. vernalización. . generados a partir de la información de la secuencia del gen a seleccionar. En trabajos posteriores pudo comprobarse que largos segmentos de los cromosomas de maíz. las secuencias de los genes en general son conservadas. El restante 20% está compuesto por ADN de bajo número de copias o copia única. etc. que aportan 7 pares de cromosomas cada uno. Es posible obtener variedades con diferente calidad de almidón. controlar la floración en cultivos de gran importancia económica. Esta fue la primera prueba de colinearidad en gramíneas y posibilita el desarrollo de la genética comparativa en cereales. Esta característica permite el uso de sondas heterólogas (de otros genomas) en experimentos de hibridación de tipo RFLP (ver II. Para ello. prebrotado. AABBDD) es uno de los principales cultivos alimenticios ya que provee cerca del 55% de los carbohidratos consumidos por el hombre. sorgo. el genoma de trigo pan es el de mayor tamaño (17000 Mb trigo. 2800 Mb maíz. con sets homoalélicos triplicados en la mayoría de ellos. trigo y cebada conservan la presencia y el orden de marcadores y genes. Dentro de los cereales. Este conocimiento es clave en agricultura. donde se encuentran la mayoría de los genes. La complejidad del genoma del trigo ha hecho aconsejable abordar los estudios genómicos a través del transcriptoma. vitaminas. como pueden ser limitantes debido a estreses bióticos y abiótico o desarrollar nuevas generaciones de transgénicos en función de las necesidades del consumidor con mayor contenido de aminoácidos esenciales como la lisina. SELVA. Gustavo. como los cereales y los forrajes. La secuenciación de los genes y la dilucidación de las vías que controlan la floración en los cereales. los genes VRN1 y VRN2. que difiere en varios aspectos con los corresponientes en Arabidospsis. Esto facilita la ubicación más precisa de genes para tolerancia a estrés biótico y abiótico. 450 Mb arroz).4) para identificar secuencias conservadas en especies diferentes dentro de una misma familia taxonómica (Devos y Gale. Juan P. etc. 2000). Viviana. La información generada a partir de los proyectos genómicos de Arabidopsis. En 1989 se publicó el primer mapa genético molecular de trigo correspondiente a los cromosomas homeólogos del grupo 7. recientemente se localizaron y caracterizaron. La genética de este cultivo resulta compleja. SCHRAUF. ya que permitiría. potencialmente. y el desarrollo de marcadores útiles para el mejoramiento. diferente textura de grano. En la actualidad se ha logrado consensuar un mapa unificado de gramíneas en el que se detallan secuencias y genes conservados en diferentes genomas (Fig. arroz y maíz con el descubrimiento de nuevos genes y QTLs permitirá el desarrollo de marcadores perfectos. que son los genes centrales en la vía de vernalización en trigo. inversiones o translocaciones . Más del 80% del genoma de trigo lo constituyen secuencias de ADN altamente repetitivo. 800 Mb sorgo. cebada y otros cereales invernales. ha sido otro de los logros de la genómica. Como se mencionara anteriormente en este capítulo. se han establecido consorcios interna- 226 ECHENIQUE. 2). Por otro lado. Si bien las secuencias del ADN altamente repetitivo varían de especie en especie. en lugar de marcadores genéticamente ligados. Los genes redundantes son una norma. A partir de esta herramienta es posible transferir información proveniente de plantas de genomas pequeños (arroz. B y D. aunque en algunos casos la correspondencia cromosómica ha sido modificada por duplicaciones. el descubrimiento de nuevos genes valiosos de otros genomas y la posibilidad de incorporarlos al trigo a través de la transformación permitirá resolver problemas del cultivo. observándose que en gran parte de los tres genomas de trigo hexaploide se conservaba el orden de los genes y marcadores.

Las bases de datos de EST han crecido exponencialmente en la última década. pan de molde. pasta. que son Hordeum vulgare L. existen en la región serias carencias. También incursionó en el estudio de genómica funcional de células cancerosas y de secuenciación del genoma de caña de azúcar. Investigadores argentinos participan también en proyectos de genómica en cooperaciones internacionales. y viroides (Argentina. Chile. En Brasil se estableció una red de cooperación que secuenció completamente el genoma de Xylella fastidiosa. Thalassiosira pseudonana: se trata de una diatomea marina que es la principal participante en el bombeado biológico de carbono hacia las profundidades de los océanos. entre otros. como el consorcio involucrado en la secuenciación del genoma de Trypanosoma cruzzi. En Argentina se ha trabajado en la secuenciación de Brucella abortus. Frente al estado del desarrollo de estas áreas en el mundo. destinado a enfrentar problemas de postcosecha y enfermedades en plantas de interés agrícola. galletitas dulces. el proyecto que llevó a la clonación y caracterización de los genes de vernalización en trigo o el proyecto de búsqueda de genes de tolerancia a frío en Deschampsia antarctica. almidones. Secale cereale L. tanto de recursos humanos entrenados como de infraestructura y equipamiento. desarrollando capacidades para identificar genes Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 227 . de mayor valor agregado. por lo que posee un elevado potencial para mitigar los cambios climáticos del planeta 10 Proyectos de Genómica en Sudamérica En Sudamérica se han desarrollado y se encuentran en ejecución algunos proyectos genómicos. vides (INIA-Chile como parte de un consorcio internacional). etc. especies diploides y tetraploides de Triticum. Actualmente se está desarrollando en Chile un programa de genómica funcional coordinado por diversos ministerios. como girasol (colaboración de INTA-Argentina con empresas semilleras locales). 9 Genomas trabajadores La genómica aplicada a dilucidar los mecanismos por los cuales funcionan los microorganismos puede conducir al aislamiento de sus componentes para desarrollar nanoestructuras que lleven a cabo complejas funciones. plásticos biodegradables. y Aegilops speltoides Tausch. En varios países se han secuenciado fragmentos de genomas de virus. Los objetivos para programas de genómica sudamericanos deberían enfocarse hacia el aumento de la productividad y la mejora de la calidad de los productos. patógeno intracelular de salmones que causa importantes pérdidas en esta industria. Saccharum oficinalis.ncbi. Toda esta información permite inferir que la biotecnología puede cambiar el escenario del trigo en dos áreas principales: (1) protegiendo al cultivo de estreses bióticos y abióticos y (2) modificando el concepto de producción de «commodities» por el de producción de «specialities» derivadas de trigo. Contiene enzimas que soportan temperaturas y presiones elevadas por lo que son potencialmente útiles para fines industriales . Como ejemplos pueden citarse: Methanococcus jannaschii: es una bacteria que produce metano.gov/dbEST) en Marzo de 2004 había 20 millones de ESTs. alpacas y otros camélidos sudamericanos (INIA-Chile). En Chile se ha completado recientemente la secuenciación de Piscirickettsia salmonis.4) de diversas especies. como noodles (tipo de fideo muy utilizado por los asiáticos). Otros ejemplos son el desarrollo de marcadores de microsatélites (ver II.Deinococcus radiodurans: soporta niveles de radiación extremadamente elevados por lo cual tiene un alto potencial para limpiar desechos radiactivos.. Esto incluye cerca de 1 millon de ESTs de trigo hexaploide y sus parientes más cercanos de la tribu Triticeae.cionales. una importante fuente de energía. bacteria que ataca a los cítricos causando importantes pérdidas económicas.nih. masa congelada.nlm. de manera que en el National Center for Biotechnology Information dbEST database (http://www. Uruguay). crackers (un tipo de galletita que se rompe fácilmente). agente causal de la brucelosis bovina .

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Sus ventajas incluyen la habilidad de aislar genes de función relacionada sin tener conocimientos previos de su secuencia o identidad y el uso de técnicas comunes de biología molecular que no requieren equipos especializados de detección y análisis. Dos limitaciones importantes del protocolo original son: i) el requerimiento de grandes cantidades de ARNm y ii) la tendencia a una menor eficiencia en la identificación de transcriptos poco abundantes. la secuenciación de etiquetas expresadas o EST. Los ADNc expresados diferencialmente pueden entonces ser recuperados y clonados o usados directamente como sondas para analizar una biblioteca. el análisis serial de la expresión de genes o SAGE y la hibridación de microarreglos). posibilitando la identificación inicial y el agrupamiento en clases funcionales de secuencias nuevas con una actividad asociada. Para contribuir con ese objetivo se han diseñado técnicas que permiten estudiar la expresión génica global en un determinado tejido y en un momento particular del desarrollo. A fin de mejorar el protocolo original se realizaron modificaciones que incluyen la producción de ADNc con marcas de biotina u oligo(dT)30-látex de manera de refinar la separación de las moléculas de cadena simple y doble. La hibridación substractiva es aplicable sólo a comparaciones de pares de muestras y debe ser realizada por duplicado con el tester y el driver invertidos para detectar tanto aumentos como disminuciones en los niveles de expresión. 1 Introducción La capacidad de secuenciar genomas completos desarrollada en la última década ha impulsado a la investigación científica en la dirección de definir la función de cada uno de los genes identificados. el ADNc-AFLP ®. Silvina C. Fueron los primeros que se utilizaron de manera amplia con el propósito de identificar genes regulados positiva o negativamente en una escala global.VII.-Capítulo 2 Métodos para el estudio de la expresión de genes Pessino. 2 Hibridación substractiva Los métodos de hibridación substractiva fueron creados a principios de la década que comenzó en 1980 con el propósito de construir bibliotecas de ADNc para obtener sondas de genes expresados diferencialmente. Los transcriptos expresados en ambas muestras (tester y driver) forman moléculas de ARNm/ADNc híbridas. Martelotto. Las moléculas de hebras simples y dobles se separan usando cromatografía en hidroxilapatita. Además no genera una medida cuantitativa y aunque es eficiente en la identificación de genes que están completamente ausentes en el driver no revela fácilmente a aquellos que están presentes en ambas muestras en distinta proporción. el display diferencial. la RT-PCR semicuantitativa y cuantitativa y los ensayos de protección de nucleasas) hacia otros enfocados en la identificación de múltiples transcriptos que difieren en su representación entre las diversas muestras experimentales (como la hibridación substractiva. La organización de las secuencias dentro de grupos funcionales basada en los datos de expresión y de homología proporciona un marco básico para conducir nuevos estudios dirigidos a definir la actividad precisa de cada producto génico. El procedimiento general consiste en la hibridación de ADNc provenientes de una muestra prueba (tester) con un exceso de ARNm proveniente de una muestra control (driver). En la actualidad se utiliza más comúnmente un protocolo ingenioso conocido como hibridación substractiva de supresión (SSH) que fue diseñado para favorecer la detección de Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 229 . También se incorporó la amplificación de ADNc selectos por PCR para disminuir la cantidad inicial de mARN requerido y aumentar la eficiencia de clonado de los transcriptos seleccionados. Luciano G.. Los procedimientos para esta evaluación han progresado desde los métodos desarrollados para el análisis de genes únicos específicos (como el Northern slot y dot blotting. mientras que las secuencias de ADNc que están presentes únicamente en la muestra tester permanecen como hebras simples.

El enriquecimiento en las moléculas e se logra durante la amplificación por PCR ya que: i) a y c pueden unir un solo cebador por lo que se amplifican linealmente. la RAP-PCR utiliza oligonucleótidos de secuencia arbitraria para la transcripción reversa. . impidiendo que el poliT «resbale» sobre distintas zonas del poli A. Los productos de PCR resultantes provendrán de transcriptos presentes esencialmente en el tester y ausentes en el driver y además su representación estará normalizada ya que los fragmentos diferenciales abundantes tendrán mayores posibilidades de formar moléculas de tipo b. Silvina C. 3 Display diferencial y RAP-PCR Las técnicas conocidas en general como «huellas digitales genéticas de ARN» (ARN fingerprinting) incluyen al display diferencial (DD) y al fingerprinting de ARN con una PCR cebada arbitrariamente (RAP-PCR).1). 230 PESSINO. Los extremos de las hebras dobles se rellenan y los fragmentos se amplifican por PCR utilizando cebadores complementarios a los adaptadores. c y d que se indican en la figura. Este incluye una normalización en la representación de los transcriptos diferenciales basada en la inhibición de la amplificación de aquellos que son más abundantes.transcriptos raros expresados diferencialmente. lo que conduce a la formación de los productos de tipo a. El ADNc prueba (tester) se divide en dos porciones iguales que se ligan a dos adaptadores diferentes y son hibridizadas por separado con un exceso de ADNc de la muestra control (driver). Luciano G. Estos cebadores tienen normalmente 10 bases de largo y se unen a sus secuencias com- Figura 1: Esquema general que describe el procedimiento de hibridización substractiva de supresión (SSH). eliminando también la necesidad de separar moléculas de cadena doble y simple (Fig. ii) la amplificación de b está suprimida debido a la complementariedad de unas terminaciones largas repetidas invertidas presentes en la secuencia del adaptador que promueven la formación de estructuras secundarias internas en las hebras simples. d y e. Luego ambas muestras se mezclan y se rehibridizan en presencia de un exceso adicional del driver desnaturalizado. La primera etapa de ambos procedimientos es común y consiste en generar ADNc haciendo una transcripción reversa de una fracción de las moléculas de ARNm de una muestra.. MARTELOTTO. Ambos métodos están basados en una amplificación por PCR de subgrupos al azar de transcriptos a partir de dos o más muestras. b. El único grupo de ARNm que es transcripto en forma reversa es el integrado por las moléculas que llevan las bases complementarias a las bases adicionales del poliT en el extremo del mensajero adyacente al poliA. Este esquema fue adaptado de Diatchenko et al. lo que origina los productos a. En contraste. 1996. En el display diferencial esto se logra utilizando como cebador de la transcripción reversa a un poliT anclado con una o más bases adicionales al extremo 3´ del ARN mensajero (por ejemplo (T)12AC). iii) d no contiene sitios de unión a los adaptadores. Estos oligonucleótidos se fijan al ARN mensajero a través de la unión de las bases adicionales. c. b.

Los productos de PCR pueden ser marcados por incorporación de un nucleótido radiactivo o de una molécula que pueda ser detectada a través de su interacción con un anticuerpo conjugado a un sistema de detección (por ejemplo digoxigenina).transcripto representado por el producto de mentos de los transcriptos usando pares múl.PCR duplicadas para cada muestra (Fig.escindiendo la sección del gel de trario de 10 pares de bases.PCR y la confirmación de que este realmente tiples de cebadores de PCR. Típicamenreversa estará integrado por aquellas molé.3´ (donde 10 Í n Í 12) que se fija en forma estable al extremo 3´de transcriptos a través de la unión de las bases adicionales de nes. El cebador infe. Distintas combinaciones de poliTs y decámeros muestras experimentales. Los fragmentos que están presen. luego de la electroforesis en geles de Las muestras de ARN son transcriptas en forma reversa usando poliacrilamida seguida de la apropia.generan numerosos perfiles de amplificación a partir de diversas subpoblaciones de ARN mensajeros. El patrón de bandas de las tes en una muestra y ausentes en la muestras experimentales se compara en busca de diferencias de otra o aquellos que están presentes tipo presencia-ausencia o alteraciones en la intensidad de las con diferentes intensidades relativas bandas. Se ha estimado que los productos de PCR de 240 combinaciones particulares de pares de cebadores de display diferencial (por ejemplo todas las combinaciones de 20 oligonucleótidos arbitrarios y 12 oligonucleótidos anclados) representan estadísticamente a todos los ARNm originalmente presentes en la muestra.can en forma consistente en reacciones de taria a la del cebador orientada en el senti. las bandas son evaluadas sólo si amplificulas que presenten la secuencia complemen. La fase final del display diferencial consisLuego de haberse realizado la síntesis de te en la identificación de la secuencia del la primer hebra del ADNc. 2).te.como cebador un oligonucleótido poliT de secuencia 5´T(T)nTXY da generación y detección de imáge. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 231 . el pas se logran localizando físicamente y cebador superior es un oligonucleótido arbi.poliacrilamida que contiene al producto de rior es el mismo oligonucleótido poliT anclado (para el caso del display diferencial) o el decámero arbitrario (para el caso de RAP-PCR) que se usaron alternativamente para hacer la transcripción reversa. se amplifican seg. que son evaluadas comparando los secuencia arbitraria X e Y. En este caso el les representan potenciales transcriptos de subgrupo de ARNms que sufre transcripción ARNm de expresión diferencial. La visualización de los productos de PCR se logra Figura 2: Representación gráfica del método de display diferencial. También puede usarse un cebador unido a un fluoróforo u optarse por no marcar los fragmentos amplificados y usar luego una tinción con nitrato de plata para revelar los geles. Una vez sintetizada la primer hebra del la intensidad relativa de las bandas ADNc. do adecuado. Tanto para el se expresa en forma contrastante. Estas etadisplay diferencial como para la RAP-PCR.plementarias permitiendo formar una hebra en los distintos tratamientos experimentade ADNc desde este sitio. ésta se usa como molde para una reacción de PCR que producidas a partir de diferentes utiliza como cebadores el mismo poliT anclado y un decámero de secuencia arbitraria.

fragmentos de genes que parecen estar diferencialmente expresados pero son artefactos de PCR. las secuencias de los fragmentos de los genes expresados diferencialmente se requieren siempre para comenzar a entender la función del gen. 4 Polimorfismos en la longitud de los fragmentos de ADNc amplificados (ADNc-AFLP®) La tecnología de AFLPÒ .. Cuando se comparan los perfiles de ARNm de individuos diferentes genéticamente.7). ii) restricción del ADNc con dos endonucleasas específicas. 3. Sin embargo. La técnica de ADNc-AFLPÒ detecta fragmentos de restricción de ADN por medio de amplificación por PCR. Ese problema puede ser evitado utilizando estrategias de análisis de segregantes en grupo (BSA) aplicadas al estudio de perfiles de ARN. la siembra de los fragmentos en membranas para someterlos a análisis de Northern inverso y el clonado y secuenciación de los productos para diseñar cebadores específicos que permitan realizar PCR semicuantitativas. los métodos de fingerprinting de ARN comparten con el SSH la limitación de que no son cuantitativos. Además suelen aparecer numerosos falsos positivos. Finalmente. Las mayores ventaja del uso de la tecnología de ADNc-AFLPÒ son: i) no se requiere información previa de secuencia. iv) los fragmentos son extraídos fácilmente de los geles 232 PESSINO. vi) visualización de las huellas digitales genéticas mediante el uso de autorradiografías. Independientemente de cuál sea la táctica usada para confirmar la expresión diferencial. que incluyen el uso de los fragmentos como sondas de Northern. por lo cual la recuperación de la banda es mucho más eficiente.interés. preferiblemente una que reconoce sitios de 6 bases y otra que reconoce sitios de 4 bases. Luciano G. En la mayoría de los casos debe realizarse un alineamiento de las imágenes de los fragmentos de amplificación con el gel de poliacrilamida seco. . Los patrones obtenidos por esta técnica son una herramienta confiable y eficiente para la identificación de los ARNm expresados diferencialmente. Los productos de PCR son purificados del gel y reamplificados. generalmente utilizada para producir huellas genéticas de ADN genómico. iii) ligación de adaptadores de cadena doble a los extremos de los fragmentos de restricción. puede ser aplicada también a preparaciones de ADNc de doble hebra para obtener un perfil del transcriptoma. la investigación de todos los genes que potencialmente se expresan en forma diferencial requiere el uso de equipamiento de última generación y una inversión extensiva de tiempo y trabajo para detectar y confirmar la expresión diferencial de cada uno de los genes individuales. El aislamiento de la secuencia completa de los genes involucrados puede lograrse usando los clones diferenciales en estudios de bibliotecas de ADNc o realizando experimentos de 5´RACE. iii) es una técnica muy sensible que permite la detección de transcriptos de baja abundancia. ver pág. En los casos en que se utiliza tinción con nitrato de plata no es necesario realizar este paso. MARTELOTTO. pueden aparecer falsos positivos que son resultado de una amplificación diferencial debida a una variación en la secuencia de los transcriptos más que a diferencias en su representación. Comprende las siguientes etapas: i) generación de ADNc. Otro problema es que estas técnicas deben aplicarse en general a muestras provenientes del mismo individuo sometido a distintas condiciones o sobre individuos genéticamente idénticos (por ejemplo. iv) amplificación de un subgrupo de los fragmentos de restricción usando dos cebadores complementarios al adaptador que llevan bases selectivas adicionales en el extremo 3´ v) electroforesis de los fragmentos de restricción amplificados en geles de poliacrilamida. fosfoimágenes y otros métodos (Fig. isolíneas). Dos ventajas importantes de los métodos de fingerprinting de ARN con respecto a los de hibridización substractiva son la capacidad de comparar muestras experimentales múltiples en forma simultánea y la de identificar genes que están regulados tanto positiva como negativamente en una muestra respecto de las otras. Silvina C. Se han utilizado varias estrategias para confirmar la expresión diferencial de los transcriptos. ii) se puede estudiar una fracción muy grande de todos los genes expresados. es decir.

Esto puede resultar de errores de secuenciación y de la identificación fallida de la región que corresponde al SAGE en la base de datos de secuencia. Por supuesto. Las diferencias en la expresión de genes entre muestras experimentales pueden entonces ser identificadas comparando la abundancia relativa de etiquetas SAGE específicas en diferentes bibliotecas. siempre y cuando esté ubicada en una posición definida dentro de la secuencia del mensajero. Además. Los EST secuenciados a partir de estas últimas pueden ser comparados para identificar transcriptos que se expresan en una biblioteca y están completamente ausentes en otra. EST») Los avances tecnológicos que facilitan la secuenciación masiva condujeron a principios de los años 90 a idear el concepto de las bibliotecas de etiquetas de secuencia expresadas (bibliotecas de ESTs). esto constituye una instancia inicial en la identificación de la función de cada gen. pero si se pretende obtener datos cuantitativos exactos que describan abundancia relativa se debe recurrir indefectiblemente a bibliotecas de ADNc no normalizadas. La combinación de la información generada por los EST (nivel y localización espacio/ temporal de la expresión génica) y la de los proyectos de secuenciación de genomas (secuencias completas de los genes y sus promotores) permite realizar asociaciones de expresión y homología estructural que en muchos casos facilitan la inferencia de la posible función de los genes identificados. Las secuencias EST son generadas tomando clones al azar de una biblioteca de ADNc y realizando una sola reacción de secuenciación que abarca 300-500 pb del clon. Este proceso está en primer lugar restringido a secuencias que estén accesibles en las bases de datos. Para determinar su actividad precisa deben hacerse estudios particulares en general dirigidos a bloquear o aumentar su expresión por ingeniería genética y a modificar estructuralmente la molécula de manera de alterar la actividad de los diferentes dominios de la proteína que codifica. Sin embargo. Otros ARNm por el contrario Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 233 .7). Una limitación del SAGE es la identificación de los genes representados por las secuencias de etiquetas. dependiendo de cuál sea la enzima específica usada para generar la biblioteca de SAGE. ciertos transcriptos pueden estar ausentes en la muestra. Los genes o las secuencias EST representados por las etiquetas SAGE son localizados en las bases de datos detectando aquellos transcriptos que tengan la etiqueta SAGE en la posición adecuada. Las diferencias en la expresión de genes pueden ser identificadas considerando el número de veces en que aparece representada una secuencia en particular. 4. Está basada en el concepto de que una etiqueta corta de unas pocas bases es suficiente para identificar inequívocamente a un transcripto. La posibilidad de detectar diferencias en la expresión de genes a través de la comparación de la abundancia de secuencias en las bases de datos de EST se incrementa con el crecimiento de estas bases. 5 Etiquetas de secuencia expresadas («Expressed sequence tags. es posible obtener una visión general de todos los genes expresados en la muestra original. Sin embargo. esta limitación se tornará menos problemática a medida que se generen más secuencias EST y que a las secuencias existentes se les asignen asociaciones y función.y las secuencias correspondientes pueden determinarse sin necesidad de clonados previos. Una etiqueta SAGE consiste típicamente en 9 bases de secuencia ubicadas por debajo del último sitio de reconocimiento de una endonucleasa específica en el transcripto blanco. 6 Análisis serial de la expresión de genes El análisis serial de la expresión de genes (SAGE) consiste esencialmente en una versión acelerada de la secuenciación de EST. ver pág. Como cada etiqueta SAGE representa un único transcripto de ARNm. Múltiples etiquetas SAGE se ligan juntas en un vector de clonado de manera que una reacción de secuencia de 300 a 500 pb genera las secuencias de 20 a 30 etiquetas al mismo tiempo (Fig. Otra limitación potencial es la identificación errónea de las etiquetas. las secuencias EST a menudo se generan a partir de bibliotecas de ADNc que han sido normalizadas para ecualizar la abundancia de clones que corresponden a los diferentes transcriptos.

ii) arreglos de oligonucleótidos. Se espera que muchos de esos problemas afecten a una porción relativamente pequeña de los genes representados. Silvina C. es esencial saber con seguridad la secuencia de cada sonda que está siendo ubicada sobre la matriz para asegurar una interpretación exacta de los datos resultantes. Los tres tipos generales de micromatrices incluyen: i) «chips» de oligonucleótidos. puede ser necesario secuenciar por duplicado todos o una porción de los fragmentos organizados (Fig. Típicamente. Las opciones varían desde la construcción de un arreglo por raspado hasta la compra del sistema completo. . Existe una base de datos pública de expresión génica que ha sido creada para el almacenamiento y análisis de secuencias de SAGE cuyo poder continuará creciendo a medida que se contribuya con más información.pueden estar representados por múltiples etiquetas SAGE a causa de la existencia de polimorfismos en un sólo nucleótido o el procesamiento alternativo de los transcriptos. Después de que los clones han sido seleccionados deben ser ensamblados y organizados para generar el arreglo de ADNc junto con los controles apropiados. iii) arreglos de ADNc. Se pueden adquirir clones de fuentes comerciales u otras fuentes y/o clonar secuencias específicas usando técnicas estándar de biología molecular. que describen la abundancia de todos los genes expresados en una célula o tejido. Luciano G. obtenidos depositando insertos amplificados por PCR a partir de una biblioteca sobre placas de vidrio o membranas de nylon. Otra característica de los datos de SAGE es que pueden complementar datos de ESTs generados a partir de bibliotecas de ADNc normalizadas o substraídas. Aún cuando el número de genes representado suele ser grande (3000 a 10000). pero no deberían ser dejados de lado en la interpretación de los resultados. 5. ver pág. MARTELOTTO. perfiles de distribución de tejidos.8). pero esto depende de los clones seleccionados. clasificación funcional o cambio de expresión conocidos. Por la tanto. dos ventajas importantes del SAGE sobre la hibridación substractiva y el display diferencial es que los datos obtenidos son cuantitativos y acumulativos. puede ser más efectivo enfocar los experimentos en un grupo pequeño de genes seleccionados por criterios más específicos como. por ejemplo. Las moléculas 234 PESSINO. La selección de la biblioteca más adecuada para una aplicación en particular y la elección de los clones son factores críticos que determinan el éxito de estos experimentos. a pesar de que el SAGE requiere capacidad de secuenciación de última generación. el largo de los insertos será mayor a 500 bases. 7 Hibridación de microarreglos o micromatrices La evaluación de la expresión de genes usando la tecnología de micromatrices ha demostrado ser un procedimiento muy efectivo para una variedad de aplicaciones. la cantidad de datos que aporta puede ser 20 veces mayor que el que posibilita la misma cantidad de secuenciación EST.. pueden faltar algunos que sean importantes para una cuestión experimental particular. En algunas situaciones. Finalmente. Por otra parte. Los productos de PCR son purificados y luego depositados (o «impresos») en lugares precisos sobre una placa de vidrio o una membrana de nylon. El ARNm que representa las muestras experimentales se prepara para la hibridación con las micromatrices de ADNc por transcripción reversa y marcado con nucleótidos fluorescentes (Cye3 y Cye5 dUTP) o radiactivos ([ 33 P] dCTP). construídos depositando oligonucleótidos sobre placas de vidrio o membranas de nylon. Uno de los aspectos más importantes de la experimentación con micromatrices es la selección de los fragmentos de ADN que contendrá. construídos realizando la reacción de síntesis de cebadores cortos directamente sobre una matriz de vidrio. Los instrumentos usados para la producción de micromatrices han mejorado en los últimos años. Independientemente de cuál sea el origen de los clones. Si se genera la suficiente cantidad de información de secuencia se obtienen perfiles exactos de la expresión de los transcriptos. Los EST brindan información de secuencia mientras que el SAGE provee datos cuantitativos describiendo la abundancia de los transcriptos.

Figura 3: Generación de una huella digital de ARN por la técnica de ADNc-AFLP. Ambas muestras se mezclan. El ARN mensajero es transcripto en forma reversa utilizando un poliT biotinilado como cebador. 1995. Los amplicones se digieren nuevamente con la enzima ancla y los fragmentos se ligan como concatémeros y se clonan. La combinación de diferentes cebadores anclados genera perfiles provenientes de distintos subgrupos de ARNms. El RNA mensajero se transcribe en forma reversa utilizando un poliT como cebador. Este diagrama fue adaptado a partir del presentado por Velculescu et al. La muestra se divide en dos partes iguales que se ligan alternativamente a dos adaptadores diferentes (A y B). Los fragmentos que contienen adaptadores diferentes en los extremos son amplificados preferentemente a causa de que en general tienen un tamaño intermedio. A continuación son digeridas con una segunda enzima de restricción (enzima de etiquetado) que reconoce un sitio dentro de la secuencia del adaptador pero corta al transcripto unos 20 pares de base más abajo generando un extremo romo. Las hebras de ADNc se digieren con dos enzimas de restricción. Es probable que la mayoría de los mensajeros sean digeridos por esta enzima en algún sector de su secuencia. Luego es digerido con una enzima de restricción ancla que reconoce sitios de 4 bases frecuentes en la secuencia de los mensajeros. Luego se realiza una segunda amplificación utilizando cebadores anclados con una o dos bases adicionales en el extremo 3´que amplifican una subpoblación de fragmentos. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 235 . se ligan y amplifican con dos oligonucleótidos A y B complementarios a los respectivos adaptadores. una de corte raro y otra de corte frecuente. Se ligan adaptadores complementarios a ambos extremos y se preamplifican por PCR los fragmentos utilizando cebadores que reconocen la secuencia de los adaptadores. Los extremos 3´de las moléculas son recuperados por unión a esferas de estreptavidina. Figura 4: Procedimiento general para la obtención de etiquetas de secuencia SAGE. El cebador correspondiente al adaptador para la enzima de corte raro está marcado radiactivamente.

Un detector permite medir por separado la emisión de cada fluoróforo. Los clones amplificados por PCR se imprimen sobre un soporte sólido. .Figura 5: Expresión de genes controlada a través del uso de microarreglos de ADNc. Silvina C. 236 PESSINO.. MARTELOTTO. La intensidad de la señal de hibridización será proporcional al contenido de cada molécula particular de ARN en la muestra. Los patrones de emisión de ambas muestras son comparados para detectar expresión diferencial. Las muestras a analizar se marcan con diferentes fluoróforos y se hibridizan con la matriz. Luciano G.

Proc. PAUL. Complementary DNA sequencing: expressed se-quence tags and human genome project. M. G. el agrupamiento de datos de microarreglos se convierte en un método poderoso para asignar posibles clasificaciones funcionales a genes nuevos. XIAO. POLY-MEROPOULOS. A. Sci. J. N. DAVIS. Finalmente. SIEBERT.. B. CHENCHIK. la cuantificación de las intensidades de hibridación y la salida de los datos en una forma utilizable. Anim. DUBNICK. HOOD. L. L. ERMOLAEVA. D. C. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 237 . WU. 1996. PARDEE. KELLEY. Science (Wash DC) 252:1651–1666. CHENCHIK. Y. H. A. El análisis de la información obtenida puede ser dividido en tres componentes: i) identificación y cuantificación de las intensidades de hibridación. hibridadas juntas en una reacción única competitiva y luego evaluadas en forma separada con un detector de fluorescencia. J. D. GURSKAYA. LUKYANOV. R. A. K. E. Sci. la normalización según el fondo. Anal. Acad. I. P. J. GURSKAYA. P. G. Biochem. mientras que las radiactivas se incorporan a sondas que se usarán sobre membranas de nylon. 79 (E. N. D. K. MOQA-DAM. iii) técnicas de agrupamiento. el análisis de micromatrices se basa en la premisa de que la intensidad de la señal de hibridación resultante para una secuencia es proporcional a la cantidad de ARNm que corresponde a esa secuencia en la muestra original. E. C. OLDE. D. Suppl. 2001. Natl. L. O. DIATCHENKO. E. Suppression subtractive hybridization: A method for generating differentially regulated or tissue-specific ADNc probes and libraries. Ninguno de estos procedimientos per se es óptimo para todas las aplicaciones y la mejor estrategia para situaciones específicas puede ser crear combinaciones de varios de ellos. A. Differential display of eukaryotic messenger ARN by means of the polymerase chain reaction. La expresión relativa de cada secuencia representada en el microarreglo es evaluada comparando las señales de intensidad de hibridación generadas por las diferentes muestras experimentales. Equalizing ADNc subtraction based on selective suppression of polymerase chain reaction: cloning of Jurkat cell transcripts induced by phytohemaglutinin and phorbol 12-myristate 13-acetate. 1992. 240:90–97. D. Por el contrario. LAU. LIANG. L. VAGNER. Proc. B. H. LUKYANOV. Acad. las muestras radiactivas deben ser hibridadas individualmente en reacciones seriales y pueden ser detectadas usando un sistema de fosfoimágenes. L. GOCAYNE. W. HUANG. MORENO. 1984. M.. 1991. En base a la presunción de que la expresión de los genes con funciones relacionadas están regulada en forma coordinada. Natl. F. SIEBERT. La visualización de los datos incluye su clasificación y presentación en una forma lógica y su organización en diferentes formatos para apuntar a la resolución de cuestiones múltiples. El primer componente incluye la identificación exacta de los puntos de la imagen. KHASPEKOV.. Cell-typespecific ADNc probes and the murine 1 region: the localization and orientation of Ad. S.. MOODY D. USA 93:6025–6030. A. NIELSEN. ii) visualización de los datos. los algoritmos de agrupamiento permiten identificar conjuntos de genes con patrones de expresión similar a través de distintas muestras experimentales. Science (Wash DC) 257:967–971. D. 8 Conclusión Los métodos descriptos en este capítulo son tecnologías eficaces que expanden los estudios de expresión desde los genes únicos hasta el nivel genómico. A. F. COHEN. 1996.. M. SVERDLOV. Genomics techniques: an overview of methods for the study of gene expression.-F. USA 81:2194–2198.fluorescentes generalmente se usan para marcar sondas con las que se hibridarán placas de vidrio. DIATCHENKO. El continuo refinamiento de las técnicas genómicas y de la bioinformática relacionada proporcionará a los investigadores nuevas herramientas para estudiar la expresión de la información hereditaria y lograr un mejor entendimiento sobre el control genético de los procesos fisiológicos. CAMPBELL. M. Independientemente del diseño experimental. L. R. E. P. E. STEINMETZ. Cada experimento de micromatrices genera una gran cantidad de datos y es crítico realizar un procesamiento apropiado de los mismos. PUKYANOV. A. MERRIL. Sci. D. A. M. LUKYANOV. SVERDLOV. M.): E128-E135. D. B. Los fluoróforos Cye3 y Cye5 presentan diferentes espectros de emisión. 9 Lecuras Recomendadas ADAMS. por lo tanto dos muestras experimentales pueden ser marcadas alternativamente con cada uno de ellos. P. M. S.

SARGENT. Differential Gene expression in the gastrula of Xenopus laevis. DAWID. W. V. B. MARTELOTTO. KOJIMA. 1995. K. J.OKUBO. B. MATOBA. 1983. ZHANG. P. T. A. SCHENA. 1995. WELSH. DAVIS. HORI. D. M. K. R. Luciano G. Serial analysis of gene expression. . L. DALAL. R. Silvina C.. VOGELSTEIN. Science (Wash DC) 270:467–470. Acids Res. SHALON. Science (Wash DC) 222: 135-139. McCLELLAND. CHADA. M. 1992. MATSUBARA.. NIYAMA. K. 1992. KINZLER. Genet. R. S. BROWN. Nat. 20:4965–4970. D. E. S. Y. T. K. D. O. FUKUSHIMA. Science (Wash DC)270:484–487. VELCULESCU. 2:173– 179. N. Nucl.. CHENG... W. Arbitrarily primed PCR fingerprinting of ARN.. 238 PESSINO. RALPH. Large scale ADNc sequencing for analysis of quantitative and qualitative aspects of gene expression. I. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray.

las bases de datos moleculares se alimentan constantemente y contienen una enorme y heterogénea cantidad de datos que incluyen secuencias de ácidos nucleicos. Otro punto de interés es que la calidad de las secuencias varía notablemente: desde secuencias obtenidas a partir de un pasa- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 239 . la actualización. De ninguna manera este material pretende cubrir la totalidad de los recursos existentes para la materia. Ruth. Fernández. European Bioinformatics Institute (EBI. EU) y DNA Data Bank of Japan (DDBJ. Tanto el análisis genómico como sus disciplinas relacionadas pueden ser abordados desde una perspectiva diferente a partir de la enorme disponibilidad de secuencias moleculares acumuladas en las bases de datos internacionales como GenBank [1]. el envío. o el componente DATABANK de la plataforma SRS (Sequence Retrieval System [7]) de integración de datos del European Molecular Biology Laboratory (EMBL). 2 Bases de datos moleculares Un proyecto típico de análisis genómico genera secuencias nucleotídicas las cuales se hacen públicas enviándolas a las bases de datos internacionales. Existen varios cientos de bases de datos accesibles desde la Web. No sólo lo hacen los proyectos dedicados a la secuenciación a gran escala. taxonómico y sinténico) de las especies. El propósito de este capítulo es introducir los conceptos y las herramientas básicas de la Bioinformática a los estudiantes de un curso de biotecnología vegetal o de biología molecular de plantas. Paula. EMBL [2]. y la extracción de datos. Posteriormente. Otra fuente de actualización exhaustiva la constituye el primer número de cada año de la revista Nucleic Acid Research [8] de acceso libre a través de Internet. Hopp. Así. y por el otro la gran diversidad de datos biológicos acumulados. proteínas.VII. Japón) y bases de datos más específicas. pero la dinámica enunciada no asegura tener el máximo provecho sustentable de las mismas. en primer lugar describiremos las bases de datos generales para secuencias de ADN y proteínas y las bases de datos específicas de plantas remitiendo en cada caso al estudiante a visitar las paginas principales de los sitios mencionados para ampliar el conocimiento de los mismos. Esteban 1 Introducción La Bioinformática es el área de las ciencias de la computación que aborda la búsqueda de soluciones a los problemas biológicos con herramientas computacionales. Esto. por el contrario el objetivo es guiar el interés de los estudiantes en la exploración y el uso de métodos computacionales decisivos para el desarrollo de su actividad científica o profesional futura. El impacto de los proyectos genómicos durante los últimos 10 años. Norma. se pueden revisar catálogos como DBCAT [6].Capítulo 3 Análisis informático de secuencias moleculares Paniego. empezando por mantener una actualización constante. USA). con la misma orientación abordaremos aspectos relacionados a la búsqueda. el análisis de macromoléculas. ha sido por un lado la creciente disponibilidad de secuencias. Sergio. etc. que presenta una colección actualizada de artículos de los sitios más importantes como son las bases de datos generales National Center for Biotechnology Information (NCBI.. También lo hacen los investigadores involucrados en proyectos más específicos de biología molecular. Por lo cual. el análisis y la interpretación de secuencias biológicas. la ingeniería y diseño de estructuras proteicas. dado que el depósito de la secuencia es una condición frecuentemente exigida por las revistas internacionales que publican estos trabajos.. el análisis comparativo (filogenético. Heinz. Con este fin. ha permitido el desarrollo de aspectos fundamentales para el avance de los conocimientos sobre los sistemas biológicos. entre otros [5]. Lew. junto con el desarrollo de las tecnologías informáticas y el arribo de Internet transformando la estructura de almacenamiento y acceso de los datos. como lo son la búsqueda de similitud en secuencias moleculares. DDBJ [3] y SwissProt [4]. estructuras macromoleculares. asociados a recursos informáticos que asisten el acceso.

DBGET es un sistema simple de acceso de datos a un grupo diverso de bases de datos moleculares (Fig. taxonomía. E. cada entrada en la base de datos se identifica con un código único que es una cadena de números y letras. vectores. EBI). A este identificador se le suma otro código que da cuenta de la versión de la secuencia depositada (seq. las bases de datos archivan la información a partir de una organización o estructura lógica. lo más común es que los usuarios frecuenten las tres bases de datos generales de acceso público. Las bases de datos de proteínas incluyen aquellas que derivan de las bases de datos de nucleótidos como Swissprot. por lo cual recomendamos explorar estos recursos visitando la página «About NCBI» [12] y «2CAN» [13] del EBI. EMBL Nucleotide Sequence Database (EMBL-Bank. . es decir. mientras que los proyectos genómicos generan secuencias anónimas cuya funcionalidad es primero hipotética. GI). El NCBI. Las proteínas también poseen identificadores o números de acceso (protein_ids) (Fig. etc.. TrEMBL [4] y PIR [9]. SRS [7] y DBGET [15]. mientras que el GI toma un valor diferente en cada actualización. LEW. polimorfismos de un solo nucleótido (dbSNP). 2.1 Sistemas de búsqueda de las bases de datos: ENTREZ. 2). geninfo identifier..versión. con posibles artefactos técnicos y sin rechequeos) hasta secuencias obtenidas de clones independientes y que han sido secuenciadas en ambas hebras. Lo mismo pasa con la función hipotética de los genes representados. y DDBJ [8]. Estos grupos coleccionan una porción del total de las secuencias producidas y reportadas en el mundo. genes que se activan a partir de una aplicación hormonal) hasta evolucionistas interesados en redefinir la taxonomía tradicionalmente basada en características fenotípicas. HOPP.je por amplificación por PCR por secuenciación única (es decir. e intercambian diariamente todas las secuencias nuevas o actualizadas. 1).. En general. literatura. genomas completos. más abajo) y debe ser corroborada funcionalmente. sitios de secuencia específica (dbSTS). La interfase SRS reúne unas 400 bases de datos (Fig. FERNÁNDEZ. Estos sitios colaboran desde 1982 manteniendo las bases de datos de nucleótidos de Genbank (NCBI). 4). por ejemplo. La más usada probablemente sea el sistema ENTREZ del NCBI. 3). R. mediante experimentos de complementación genética. A pesar de esta heterogeneidad de intereses y de recursos disponibles. una de las características únicas del mismo es que fue el primero en incorporar relaciones lógicas o nexos entre las entradas individuales de datos en distintas bases de datos públicas (Fig. Incluso los perfiles de usuarios que atienden estas bases de datos pueden ser bastante heterogéneos: desde el típico biólogo molecular que clonó y secuenció un gen involucrado en su tema de estudio (por ejemplo. SRS y DBGET Las bases de datos no solo proveen la información molecular. HEINZ. el número de acceso incorpora un punto seguido de un valor incremental que corresponde a la versión actualizada. Típicamente los proyectos de biología molecular básica generan datos muy bien caracterizados en cuando a la función de los genes estudiados.1. A medida que la secuencia se va actualizando. en el último año se desarrolló como un sistema integrado de búsqueda y recuperación de datos asociados y aplicaciones para análisis de secuencias [16]. P.1 Uso avanzado de ENTREZ y SRS NCBI desarrolló Entrez como una herramienta para permitir a los usuarios interac- 240 PANIEGO. N. sino también los medios adecuados para acceder fácilmente a esa información. Las interfases de búsqueda principales son ENTREZ [14]. Este identificador o número de acceso de la secuencia nunca cambia y es la forma en que se cita la secuencia en las publicaciones. el EBI y el DDBJ disponen de otros recursos como bases de datos de transcriptos (dbEST). y las bases de datos estructurales como PDB (Protein Data Bank [10]) que contiene mas de 21.. deducida a partir de su similitud con otros genes de función conocida (ver predicción de genes. 2.000 estructuras resueltas por cristalografía o resonancia magnética nuclear y Macromolecular Structure Database (MSD) [11] que es una base de datos de EBI derivada en parte de PDB. S.

en la cual se agregan SRS es un paquete de manejo de constantemente nuevos componentes o cambian de manera dinámica bases de datos desarrollado por las vínculos establecidas entre los elementos.Figura 1: La Figura muestra los códigos asignados por las bases de datos a cada secuencia ingresada. EBI y accesible desde distintos si- cionar o consultar estas bases de datos. Entrez es una plataforma dinámica. dado que los formularios de búsquedas avanzados son un tanto más exFigura 2: Representación gráfica de las relaciones del sistema Entrez plícitos que en el caso de Entrez. Esto le permite al usuario realizar consultas simples y obtener resultados. una interfase de usuario. B) Número de acceso y gi de la secuencia de aminoácidos correspondiente. y saber como restringir las búsquedas a ciertas áreas de la base de datos. Entrez es Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 241 . desde el punto de vista de la facilidad de uso. para realizar consultas más poderosas (en selectividad y eficiencia). Desde el punto de vista informático. A) Número de acceso y gi de una secuencia nucleotídica. para la búsqueda y la recuperación de datos depositados en el sitio NCBI. constituye el nexo entre el usuario y las bases de datos subyacentes. es necesario conocer dicha arquitectura u ordenamiento de la estructura de la base de datos. Sin embargo. al menos en parte. Para profundizar en los alcances y la operabilidad de Entrez se recomienda visitar el documento de ayuda en la página del NCBI [17]. aún desconociendo la arquitectura de las bases de datos. Es decir. tal vez SRS sea una mejor opción. Sin embargo.

usualmente utilizado para el relevamiento bibliográfico por la mayoría de los científicos. 2. FERNÁNDEZ.. Este proceso utiliza las siguientes listas MeSH (Medical Subject Headings): vocabulario controlado utilizado para indexar artículos en PubMed. Índice de autores: apellido e iniciales.1. es ineficiente utilizar el término «Cell» como palabra clave.. S. tios. Lista de frases: cientos de miles de frases generadas a partir de MeSH y otros vocabularios controlados similares. P. y la palabra «Cell» se encuentre presente en varios títulos o resúmenes.Figura 3: Algunas de las Bases de Datos accesibles desde el servidor SRS. el término será utilizado para buscar sobre todos los campos de la base de datos. Journals: nombre completo de la revista. R. o una revista. HEINZ.. puede ser operado de manera local. ya que muy probablemente exista algún autor llamado así.. abreviaturas usadas en MedLine y números ISSN.2 Uso de PubMed (ENTREZ) Otra forma muy popular de acceso es a través del PubMed . En caso contrario. Es evidente que si uno sólo está interesado en buscar publicaciones en determinada revista (por ejemplo «Cell»). . Se basa en el mapeo automático de términos (automatic term mapping): cuando se ingresa un término para realizar una búsqueda en PubMed. o un área de conocimiento? Entonces el servidor filtra los términos de búsqueda a través de listas sucesivas para intentar responder dicha pregunta y usar los términos en forma eficiente. la búsqueda se limitará a ese campo de la base de datos. el servidor que recibe el requerimiento intenta identificar el tipo de búsqueda que se está intentando hacer: ¿está el usuario intentando buscar un autor. HOPP. N. LEW. 242 PANIEGO. que a diferencia de Entrez. Si el término ingresado está presente en alguna de estas listas. E.

Es posible cambiar el orden de evaluación de los ope- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 243 . Entrez permite combinar términos utilizando operadores lógicos ( AND. Los operadores lógicos. deben ser ingresados en mayúsculas para ser reconocidos como tales por Entrez (por ejemplo: vitamin C OR zinc. La búsqueda con términos truncados desactiva el mapeo automático. una búsqueda con el término enzym* retornará citas conteniendo la palabra enzyme. Esto evitará el filtrado a través de listas. esto fuerza la búsqueda usando la frase tal como fue ingresada (con las palabras en ese orden). DNA AND Crick AND 1993). pero también enzymes. adverbios. proposiciones. utilizando un asterisco (*). OR. lo cual puede resultar útil en algunos casos. etc. Los términos de una búsqueda pueden proporcionarse truncados (truncation). en caso de una búsqueda con una frase (más de una palabra). NOT). presentes en la gran mayoría de las citas de la base de datos: artículos. también llamados operadores voléanos ( boolean operators).Figura 4: Representación gráfica de las relaciones del sistema DBGET para la búsqueda y la recuperación de datos El mapeo automático de términos puede evitarse en primer lugar encerrando el término o frase entre comillas. Además. Entrez lee los operadores lógicos de izquierda a derecha. La lista de stopwords se encuentra en la documentación de PubMed. Por ejemplo. realizando una búsqueda sobre todos los campos de la base de datos en forma directa. PubMed ignora ciertas palabras en las búsquedas. enzymology. por lo cual las búsquedas utilizando este método van a diferir de las que no lo usan. enzymatic. estas son llamadas stopwords y corresponden a palabras muy comunes. etc.

que aportan información para sustentar el análisis comparativo de regiones de interés entre genomas ampliando los conocimientos sobre la estructuración de genes y genomas de las plantas. S. esto permite acceder a un formulario para ver los índices y eventualmente agregar un término a la búsqueda.. o por fecha. bases de datos derivadas del análisis de las bases de datos generales (bases de datos de motivos funcionales y estructurales) y bases de datos de interacciones.. Es muy poco intuitivo el criterio de uso de estos calificadores. Pueden hacerse búsquedas extendidas para lo cual hay que ingresar al sitio seleccionando sobre el botón Extended. Correr una aplicación. La página de inicio de este servidor presenta distintas opciones: Comenzar un proyecto temporario o permanente. P.radores usando paréntesis. japonica [20]. Para focalizar las búsquedas es recomendable utilizar códigos de calificación de términos (search field qualification). Number of entries to display per page permite definir el número máximo de registros listados en cada página. por lo que se recomienda leer el manual como fue sugerido al inicio del capítulo. pero a su vez contiene una lista de áreas de datos (que varían de acuerdo con el tipo de base de datos utilizada) sobre la cual pueden realizarse búsquedas. 3 Otras bases de datos moleculares Aparte de las bases de datos generales existe un gran número de bases de datos especializadas de gran importancia para focalizar proyectos y obtener información adicional generalmente no accesible desde las bases generales como son fenotipos. datos experimentales.. número de registros por página. E. Acceder a la documentación en línea. están en marcha muchos proyectos de secuenciación parcial de genomas en gramíneas. indica [19] y Oryza sativa var. Sin embargo. etc. Aquí las iniciativas centrales la constituyen la secuenciación completa de especies modelo como Arabidopsis thaliana [18] y el arroz. Cuando se realiza una búsqueda. Dentro de las opciones de búsqueda. de una revista. OR y BUTNOT.3 Uso de SRS El SRS ofrece a los usuarios la posibilidad de buscar datos y analizarlos a través de distintos paquetes de software en el mismo sitio. etc. y es posible acceder a los índices para evaluar la eficacia de nuestra estrategia de búsqueda.. etc. compuestas. habiendo seleccionado primero una base de datos. LEW. La identificación de regiones sinténicas (conservación de las posiciones cromosómi- 244 PANIEGO.). describir qué tipo de término se está usando: si se busca por nombre de un autor. crucíferas. solanáceas. se selecciona en Preview/Index. Luego se accede a la solapa de búsqueda estándar (denominada QUERY) donde se definen las opciones de búsqueda y se ingresan las palabras clave.1. Un área de estas bases especializadas por especies la constituye el área de proyectos genómicos de plantas. Una vez elegido el campo sobre el cual se quiere buscar. con lo que se abre una página que muestra las bases de datos disponibles en el sitio. Entrez realiza las búsquedas sobre cierto tipo de campos de la base de datos. La calificación de términos se realiza agregando una etiqueta entre corchetes al lado del término a calificar. Es posible seleccionar todas las bases de datos seleccionando sobre el botón all. 2. HEINZ. Esto es. En este formulario se pueden definir los mismos parámetros que en el formulario estándar (wildcards... Oryza sativa var. Acceder a información disponible sobre las bases de datos. Combine searches with permite relacionar los términos de la búsqueda mediante los conectores & AND. simplemente hay que ingresar la(s) palabra(s) clave en el cuadro de texto de la derecha. si seleccionamos Append wildcards to words la búsqueda se realizará sobre las palabras claves ingresadas y también sobre todas aquellas posibles termina- ciones de dichas palabras. . etc. R. HOPP. FERNÁNDEZ. Para realizar una búsqueda hay que seleccionar sobre Start a Temporary Project. Estos campos se encuentran indexados. Una vez allí deberá seleccionarse la(s) base(s) de datos sobre la cual(es) buscar. datos de mapeo. N.

fhcrc. URL http://blocks. dominios y motivos [25].huji.uk/Software/Pfam/ http://pir.ncbi.ac.cas relativas de secuencias marcadoras homólogas en especies relacionadas.georgetown.edu/ http://pir. Usando perfiles es posible encontrar miembros muy divergentes de familias de proteínas que presenten muy baja identidad de secuencia [23. Desde lo académico.ch/prosite/ http://www.icgeb. entender las bases de la especiación y la diversidad. no dan cuenta del resto de la secuencia adyacente y son muy poco sensibles al momento de encontrar secuencias relacionadas que presenten una divergencia mínima en la región definida por el patrón [23.inra. 24.embl-heidelberg.uk/clustr/ http://www.infobiogen.1 Bases de datos de motivos Existe otro conjunto de bases de datos denominadas secundarias porque derivan Base de Datos Blocks CDD CluSTr DOMO InterPro IproClass MetaFam Pfam PIR PIR-ALN PRINTS-S ProClass ProDom PROSITE ProtoMap SBASE SMART Descripción de las bases de datos generales.georgetown.org/TIGRFAMs/ Database of protein alignment blocks Conserved domain database Clusters of SWISS-PROT and TrEMBL proteins Protein-domain database based on sequence alignments Integrated documentation resource for protein families.protomap.fr/services/domo/ http://www. En otras palabras.trieste. conservación de mapas genéticos a escala evolutiva) hará posible el aislamiento de genes en especies con genoma complejo. 25]. son las llamadas de motivos estructurales y funcionales. Los patrones definen secuencias cortas de aminoácidos conservados que corresponden a sitios activos.ac.man.ebi.edu/ http://www. 25].de/ http://www.georgetown.edu/iproclass/ http://metafam.edu/gfserver/proclass.expasy.sanger.georgetown.gov/Structure/cdd/cdd.umn.molgen.fr/prodom/doc/prodom.ebi.nih.org/sprot/ http://systers. frecuentemente de una familia de proteínas. es decir.shtml http://www.ac.ac.toulouse.html http://prodes.ahc. los mecanismos básicos de la adaptación y la enorme diversidad química [22].de/ http://www.ac.org/ http://www. 24. Los perfiles compensan esta debilidad dado que cubren áreas más largas de la secuencia a través de la representación numérica de las posiciones conservadas en un alineamiento múltiple.a collection of protein families and domains SWISSPROT Protein sequence databases and TrEMBL Systematic re-searching method for sequence searching and SYSTERS clustering TIGRFAMs Protein families based on hidden Markov models Tabla 1: Bases de datos y recursos para el análisis de datos de familias de proteínas. Estas bases de datos introducen el concepto de patrones y perfiles de secuencias.ac. etc.nlm.uk/dbbrowser/PRINTS/ http://pir.html http://www.uk/swissprot/ or http://www.it/~sbasesrv/ http://smart.edu/pirwww/dbinfo/piraln. su desarrollo y metabolismo. el análisis comparativo de los genomas usando una estrategia bioinformática persigue entender cuales son los mecanismos esenciales para el funcionamiento mínimo de una planta.html http://www.il/ http://www3. su crecimiento normal. los perfiles representan las posiciones comunes y características de aminoácidos de una colección particular de secuencias.mpg. Al ser regiones acotadas. usando la información de genes homólogos en especies con genomas más pequeños y más profusamente estudiados (los así llamados clonados posicionales en base a mapas) [21].bioinf.expasy.ebi. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 245 . domains and functional sites Integrated protein classification database Database of protein family information Collection of multiple sequence alignments and hidden Markov models Protein Information Resource Curated database of protein sequence alignments Compendium of protein fingerprints Non-redundant protein database organized by family relationships Automatic compilation of homologous domains Database of patterns and profiles describing protein families and domains Automatic hierarchical classification of SWISS -PROT proteins Curated protein domain library based on sequence clustering Simple Modular Architecture Research Tool .uk/interpro/ http://pir. 3.cs. sitios de unión.tigr.

La manera más común de asignar este valor es. mientras que PAM250 es más apropiada para comparar secuencias más distantes [26. a partir del cual miden la frecuencia de todas las sustituciones a través de métodos diferentes [26].. N. las más populares son las matrices de bloques de sustitución BLOSUM [32] y las matrices de mutaciones puntuales aceptables PAM [33. la descripción del resultado del mismo trae aparejado el uso (o mal uso) de los términos: identidad. que usa secuencias estrechamente relacionadas). y de letras con caracteres nulos (que representan deleciones o inserciones). TIGRfam y Blocks entre otras listadas en la Tabla 1. los eventos de mutación no sólo incluyen sustituciones sino también inserciones y deleciones. R. La matriz PAM120 es considerada una buena matriz de sustitución para analizar secuencias evolutivamente más cercanas. Multiplicando PAM1 por sí mismo se obtiene una familia de matrices de sustitución arbitrarias que representan distintos grados de parentesco.. así PAM1 define una unidad de cambio evolutivo y representa la probabilidad de que 1 aminoácido en 100 haya experimentado una sustitución. similitud y homología. E. Los bloques representan alineamientos múltiples de secuencias relacionadas (a diferencia de PAM. Los números asociados a estas matrices indican el valor de corte del porcentaje de identidad que define el grupo. Una vez definido el score para un alineamiento arbitrario. sino que también comparten una historia evolutiva [26.Dentro de este grupo de bases de datos que proveen información para la búsqueda de secuencias homólogas remotas y para la predicción de función se incluyen Prosite. por lo cual también se asigna un score a los intervalos vacíos o gaps observables en los alineamientos. La identidad significa que existe exactamente el mismo nucleótido o aminoácido en la misma posición de las secuencias alineadas.. P. a través de una suma simple de scores especificados para cada alineamiento de pares de letras (que representan igualdades o sustituciones). 27]. Por lo tanto. surge la necesidad de encontrar el alineamiento óptimo entre los muchos alineamientos posibles. 4 Alineamiento de Secuencias: Fundamentos 4. Similitud expresa una medida observable que considera por un lado las identidades y por otro lado. La construcción de estas matrices se basa en el modelo de Dayhoff [33]. No obstante. 27]. 34]. le da valor a las sustituciones favoreciendo aquellas que sean conservativas respecto de las que no lo son. S.. HEINZ. Las matrices PAM fueron calculadas sobre la base de un modelo de distancia evolutiva sobre alineamientos de secuencias muy relacionadas. SMART. BLOSUM62) admiten una mayor diversidad de secuencias en los grupos y son óptimas para comparar secuencias más distantes. Uno de los métodos comparativos más comunes es el alineamiento de pares de secuencias. 32]. que establece que relaciones lejanas entre secuencias pueden modelarse con suficiente precisión usando la información de secuencias estrechamente relacionadas. La forma que estos algoritmos emplean para darle significado a cada uno de los alineamientos posibles es asignándole un valor (score) a cada uno de ellos. FASTA [29] y SSEARCH [30. HOPP. homología significa que las secuencias no sólo se parecen mucho entre sí. 31] miden similitud o identidad entre secuencias pero no miden homología. el score más alto corresponde al mejor alineamiento. es mediante la búsqueda comparativa utilizando la información depositada en distintas bases de datos. FERNÁNDEZ. Los algoritmos de comparación de secuencias más comunes tales como BLAST [28]. . Pfam. Finalmente. El conjunto de estos scores mencionados representa una matriz de scores. Dado que lo más común entre secuencias de ADN o proteínas es que sean similares en algunos seg- 246 PANIEGO.1 Alineamiento de pares de secuencias Una de las maneras mas frecuentes de obtener información sobre una o un grupo de secuencias incógnitas. LEW. Las matrices BLOSUM son calculadas de manera similar pero usando una estrategia diferente para estimar las frecuencias de sustitución [27. PRINT-S. las matrices con valores de corte más bajo (ej. Ambas matrices se basan en grupos de alineamientos altamente confiables de proteínas homólogas.

mentos y no en toda la extensión de las secuencias involucradas, lo más frecuente es usar en esta instancia programas basados en el algoritmo de Smith-Waterman que busca óptimos en alineamientos locales de pares de secuencias [35]. No obstante, tratán-

dose de métodos de programación dinámica, para los cuales el tiempo de cálculo es proporcional al cuadrado del tamaño de las secuencias que se comparan [23], son extremadamente lentos para realizar búsquedas exhaustivas en las bases de datos de mayor

Figura 5: Resultado de una búsqueda en BLAST. A) el encabezado muestra el nombre de la secuencia incógnita y el nombre de la base de datos analizada. Como el programa usado fue BLASYx, la secuencia fue traducida en las seis marcos de lectura correspondientes y comparada con la base de datos nr («non redundant»}de proteínas mantenida por NCBI. B) muestra una representación gráfica de los alineamientos. C) muestra un resumen de los alineamientos mas significativos junto con el score normalizado y el valor E. D) muestra los lineamientos detallando las propiedades

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referencia (GenBank, Swissprot, etc.). En cambio, tanto FASTA como BLAST emplean otro tipo de desarrollo llamado heurístico, que favorecen la velocidad a cambio de la sensibilidad y la selectividad [26]. Ambos programas operan de manera similar pero usando distintas estrategias para localizar las posiciones donde es más probable que ocurra el mejor alineamiento. FASTA busca cadenas de letras exactamente iguales de un tamaño fijo establecido (words). BLAST, en cambio, usa matrices de sustitución (tomando de base BLOSUM62 para secuencias de aminoácidos) para encontrar words que sin ser exactamente iguales muestren el score más alto, en este nivel de búsqueda ambos algoritmos no admiten gaps. BLAST realiza algunas otras operaciones como filtrar las regiones de baja complejidad (regiones repetitivas), y elimina words con baja probabilidad de producir un score alto. Una vez que se identifican estas regiones de alto score, se aplican algoritmos más sofisticados de programación dinámica, ahora sí permitiendo la existencia de gaps. En esta segunda etapa BLAST busca segmentos similares a la lista de words establecidos en toda la base de datos y cuando encuentra un alineamiento posible trata de extenderlo hacia ambas direcciones, hasta tanto el score continúe incrementándose. Luego BLAST evalúa si el valor E de los alineamientos obtenidos satisface el umbral seleccionado por el usuario (normalmente entre 0,1-0,001) para finalmente informar la lista de los seleccionados. La Figura 5 muestra un resultado obtenido a partir de BLAST. El encabezado cita la versión del algoritmo empleado y su referencia, el nombre y la longitud de la secuencia analizada y la base de datos que se usó como blanco. La segunda parte del informe presenta un resumen de todas las secuencias que produjeron alineamientos significativos junto con un valor de score normalizado y el valor E . La tercera parte muestra los alineamientos detallando los valores de los scores, identidad y valor E obtenidos y la última parte del informe muestra los parámetros utilizados en la búsqueda. Para interpretar los resultados obtenidos de la búsqueda de similitud en bases de datos moleculares usando cualquiera de los algoritmos (FASTA, BLAST o SSEARCH), el valor más representativo es el valor E [26, 35].

Este depende del valor de score, del largo de la secuencia incógnita y del tamaño de la base de datos analizada y mide las chances de que el alineamiento obtenido sea solamente causa del azar. Así un valor E de 0.001 (que es el valor de corte más usado par las búsquedas con BLAST) significa que hasta 1 de cada 1000 alineamientos puede haberse dado por azar. Un valor cercano o menor a 1 e-50 es menos frecuente de encontrar, y resulta muy confiable en cuanto a que las secuencias alineadas estén evolutivamente relacionadas, no obstante esta apreciación exige una confirmación mediada por un análisis filogenético. 4.2 Alineamiento múltiple de secuencias Como se mencionó más arriba, el advenimiento de proyectos genómicos a gran escala ha llevado a la acumulación de un enorme y heterogéneo número de secuencias depositadas en bases de datos públicas. El alineamiento múltiple de secuencias juega un papel importante en la biología molecular actual. Tanto la anotación (edición por corrección e interpretación de hipotéticas funciones por homología) de dichas secuencias como las herramientas de análisis dependen de alineamientos múltiples adecuados. El objetivo de la aplicación ha pasado de una simple transferencia de anotación funcional de una secuencia a otra, a un enfoque genómico más amplio. El análisis de familias proteicas, la predicción de su estructura secundaria, la estimación de los diferentes tipos de plegamientos así como la detección de homólogos entre especies distantes como pasos intermedios en la construcción de árboles filogenéticos, se han constituido en los principales objetivos de este tipo de alineamiento [37, 23]. El alineamiento múltiple de secuencias puede ser visto como una generalización del alineamiento de pares de secuencias, donde la complejidad de esta aproximación crece exponencialmente con el número de secuencias que intervienen. La posibilidad de resolver el problema por métodos manuales [38] debe quedar descartada por la enorme complejidad del problema, limitándose su uso a casos con pequeños grupos. Por analogía con la comparación de pares de secuencias, es

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PANIEGO, N.; HEINZ, R.; FERNÁNDEZ, P.; LEW, S.; HOPP, E.

posible aplicar la misma técnica de programación dinámica al caso exhaustivo multidimensional, pero el crecimiento exponencial de la complejidad de método limitó su aplicación práctica [39, 40, 41]. Introdujeron un esquema de acotamiento que utiliza alineamientos de parejas de secuencias para limitar el volumen del espacio N dimensional que se necesita para el alineamiento exhaustivo, resultando en importantes mejoras en la velocidad, que posibilitaron su implementación en el programa MSA [42] y la aplicación del método a pequeños grupos de secuencias. Por lo general tampoco es posible alinear más de 10 secuencias usando el riguroso modelo del programa MSA. De esta forma es fácilmente entendible la proliferación de métodos aproximados para conjuntos más grandes de secuencias. Los programas desarrollados abarcan una amplia gama, desde aquellos que utilizan métodos progresivos tradicionales [43, 44, 45] a aquellos iterativos y con mayores requerimientos computacionales [40, 46, 47, 48]. Los métodos iterativos tienden a una optimización de la función de puntajes. El objetivo buscado es que la función de puntaje refleje una función biológica tal que su optimización lleve a un alineamiento biológicamente correcto. El alineamiento múltiple puede dividirse en dos categorías principales: aquellos métodos de alineamiento de secuencias en toda su extensión (globales) y aquellos métodos que alinean regiones con alta similitud. Tradicionalmente se ha focalizado en los métodos globales tales como el método CLUSTAL W, que son aplicables a casos en los que las secuencias comparadas tienen extensiones similares. Sin embargo más recientemente se ha puesto mayor interés en los métodos de alineamiento múltiple local para el alineamiento de secuencias derivadas de proyectos genómicos que sólo alinean parcialmente [37]. En los métodos de alineamiento global, la solución clásica se basa en la formación de agrupamientos (clusters) de secuencias, los cuales se resuelven progresivamente [48]. Para ello, dada una medida del parecido o semejanza entre dos secuencias, se elige aquel par correspondiente al valor más alto y se alinean y agrupan entre sí para formar

un único grupo o cluster de secuencias. A partir de este momento este cluster será tratado como una sola secuencia, y el proceso se repetirá hasta tener un solo cluster con todas las secuencias que intervenían en el alineamiento múltiple. Posiblemente, los programas más difundidos de este tipo sean CLUSTAL V [45] o CLUSTAL W en su última versión [49], y PILEUP, el cual utiliza el método heurístico para el cálculo de los niveles de semejanza entre las secuencias [50]. La aplicación de esta estrategia no garantiza resultados óptimos (en una primera etapa evalúa por coincidencias de residuos, por lo que sí utilizará esquemas de puntuación, aunque podrían existir otras soluciones posibles con puntuación mayor). Sin embargo, la calidad de los alineamientos es bastante aceptable, y permiten alinear algunos pocos cientos de secuencias [51, 52]. Otro algoritmo de comparación múltiple global progresivo es el POA que no generaliza perfiles sino que emplea gráficos parcialmente ordenados partiendo de las secuencias más similares y va adicionando otras secuencias progresivamente. Este programa permite comparar no sólo secuencias relacionadas originadas por mecanismos de deleción, inserción o mutación sino secuencias más distantes [53]. Los algoritmos de comparación múltiple local, como el DIALIGN, alinean segmentos completos en vez de residuos simples. Inicialmente realiza alineamientos de pares, seleccionando luego las regiones sin intervalos no apareados que aparecen como diagonales de una matriz, para progresar en una comparación iterativa [46]. Otros programas como el T-Coffee combinan alineamientos múltiples globales y locales, realizando primero una comparación de a pares global utilizando el algoritmo CLUSTAL W y luego una comparación local utilizando FASTA [47]. Tanto el DIALIGN como el T-Coffee arrojan mejores resultados con grupos de secuencias más diversas pero tienen altos requerimientos computacionales. Con la idea de mejorar la sensibilidad de estos resultados, también se han propuesto numerosas posibilidades híbridas, tales como la representada por el programa MACAW [54] basado tanto en información estadística sobre alineamientos de segmentos de las secuencias como en la posibilidad de interacción con el usuario. Así mismo, se ha

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propuesto la utilización de matrices de consenso [55] para describir la preferencia de cada aminoácido, o de cada deleción, para situarse en el alineamiento. También se ha recurrido a información sobre las estructuras secundarias [56, 57], o a la localización de motivos y/o dominios conservados en las secuencias [58], o a la utilización de las características físico-químicas de los aminoácidos en cada posición [59]. 5 Búsqueda por perfiles para localizar homólogos remotos Existe una tercera generación de métodos más elaborados para realizar búsquedas de similitud con mayor sensibilidad [60]. Los más exitosos son PSI-BLAST y los métodos basados en los modelos ocultos de Markov (HMM, [61]). El primero es un método extremadamente sensible para detectar similitudes débiles basándose en un proceso iterativo mediante el cual el algoritmo de BLAST puede ser generalizado para utilizar un perfil en vez de una secuencia [5], se recomienda usar este algoritmo cuando no se encuentran resultados significativos a partir de una búsqueda estándar a través de BLASTP. El proceso de PSI-BLAST comienza con una secuencia provista por el usuario, la cual es alineada mediante el algoritmo BLASTP contra una base de datos seleccionada. A partir de los alineamientos más significativos, el programa usa de base aquellos alineamientos que presentan un valor E menor que 0.005 , construye una matriz de scores específicos de posición o perfil (position-specific scoring matrix, PSSM o profile). En la segunda ronda, la versión adaptada del algoritmo BLAST usa la matriz como entrada para realizar una búsqueda más refinada. De una manera similar, HMMs genera perfiles a partir de alineamientos múltiples de secuencias, tales como los obtenidos usando Clustal W o X [49, 62] y calcula scores específicos de posición que guarda en un archivo de formato compatible que luego se usa para analizar una base de datos. Tanto PSI-BLAST como HMMs facilitan el desarrollo de bases de datos secundarias como las bases de datos de dominios de proteínas [63, 64] que permiten el análisis de la

arquitectura modular de las proteínas y sus unidades funcionales. Hoy en día se prefiere usar estas bases de datos para predecir o confirmar la función de genes o proteínas, dado que resultan más confiables que las bases de datos primarias que reciben grandes cantidades de información regularmente lo cual hace difícil controlar que las anotaciones de los datos sean correctas. 6 Predicción de Genes La expansión de los proyectos genómicos en los últimos años ha sido tal que al día de hoy existen 717 iniciativas de este tipo en el mundo, 140 de los cuales corresponden a genomas completos, entre ellos el genoma humano, el genoma de Arabidopsis thaliana [18], Oryza sativa variedad indica [19] y Oryza sativa variedad japonica [20], 235 corresponden a organismos eucariotas, 38 de los cuales son genomas vegetales y 342 corresponden a organismos procariotas (GOLD [65]). La gran cantidad de datos generados por estos, y otros proyectos de análisis genómico parcial fuerzan las necesidades de disponer de las herramientas adecuadas para darle interpretación biológica a estos datos. Una de las etapas más críticas de este proceso es la de identificar todos lo genes y sus proteínas asociadas. La manera más directa de abordar esta tarea es mediante métodos comparativos como los descriptos anteriormente basados en encontrar una secuencia altamente similar a la secuencia incógnita en otro organismo usando generalmente bases de datos de proteínas. Sin embargo, sólo un 50-70% de los genes nuevos suelen encontrar homología con genes o proteínas conocidas [66]. La caracterización del resto de las secuencias requiere la aplicación de métodos predictivos, los mismos tratan de identificar secuencias codificantes a partir de patrones característicos, usualmente secuencias cortas sobre el ADN genómico que representan sitios claves para procesos como la transcripción (sitios de unión a factores de transcripción, cajas TATA), el procesamiento postranscripcional del ARN (sitios de splicing) y la traducción (codones de iniciación y terminación) [67]. Existen muchos programas para predecir genes, la mayoría de los cuales son accesibles desde la Web, el

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sitio Computational Gene Recognition mantenido por W Li [68] ofrece una lista completa y actualizada de publicaciones y software dedicado a este tema. Sin embargo, aunque los recursos son vastos y los algoritmos de predicción han ido avanzando junto con los desarrollos en informática y el avance de los conocimientos, cimentados en una mayor disponibilidad de información biológica caracterizada, actualmente no existen métodos precisos para identificar estas señales en las secuencias moleculares. Este problema se acentúa cuando se trata de predecir genes eucarióticos que tienen una organización y una estructura más compleja que la de los genes de organismos procarióticos. En genomas complejos los genes no están dispuestos en forma continua, están separados por distancias intergénicas enormes y a su vez están estructurados en fragmentos codificantes (exones) separados por regiones no codificantes (intrones), los cuales además varían en tamaño y número dentro y, más aún, entre especies. Algunos programas, además de reconocer y modelar las señales de patrones específicos, tratan de incorporar un modelo estadístico de las propiedades que definen de manera más global exones, intrones y regiones intergénicas, aprovechando los sesgos de composición de bases (en regiones codificantes es más alto el porcentaje de G+C) [69], el uso de codones, la frecuencia de hexámeros o dicodones [70, 71, 72, 73], la periodicidad de aparición de bases [74], etc. Sin embargo, todas estas consideraciones no son suficientes para reconocer con exactitud exones e intrones cuando éstos son cortos. En la mayoría de los casos, los programas más promisorios para reconocer genes en la especie bajo estudio deben ser analizados particularmente, a partir de lo cual muchos son redefinidos o diseñados específicamente [67]. Dado que los algoritmos usan distintas medidas y scores para predecir regiones codificantes, lo recomendable es combinar el resultado de algunos o varios de ellos para construir el mejor modelo, en este sentido existen distintas herramientas de acceso libre como RiceGAAS [75, 76], y GenMachine [77, 78], GenMark [79], entre muchos otros.

7 Conclusiones La biología moderna ha generado una explosión de información en el área de secuenciación de genomas completos, la proteómica, la transcriptómica, la genómica funcional, la interactómica, la metabolómica, etc. Todo esto genera la necesidad constante de actualizar esta información y aplicarla en beneficio de los proyectos particulares. Para ello, es necesario entender cómo se genera esa información, cuán confiable es, cómo se maneja y cómo se analiza. En este proceso juega un papel clave el desarrollo de la bioinformática, que se define como un área de fusión entre la biología, la matemática avanzada y la computación cuyo objetivo discurre en observar la biología en términos de macromoléculas, con el fin de ordenar y entender la información contenida en las mismas a partir de recursos de la informática. En este sentido, la bioinformática enfoca tres áreas básicas, la primera tiene que ver con el desarrollo de un sistema simple de organización de los datos biológicos de manera de favorecer el acceso y el ingreso de nuevas entradas a las bases de datos compartidas. La segunda área tiene que ver con el desarrollo de recursos y herramientas para analizar la información coleccionada en las bases de datos, lo cual implica conocimientos sólidos en las teorías computacionales y biológicas.El tercer área, implica el uso de estas herramientas para analizar los datos e interpretar los resultados de manera biológicamente significativa. En este capítulo hemos intentado dar una visión amplia de la bioinformática focalizando dos elementos fundamentales como son las secuencias y los alineamientos, familiarizando a los lectores con los recursos básicos disponibles para el acceso a la información y su análisis, e instalando el concepto de que existen diferentes caminos para resolver un problema. Sin dejar de tener en cuenta que la mayoría de los métodos computacionales se basan en conocimientos limitados sobre genes, proteínas y caminos biosintéticos por lo cual todos los resultados obtenidos a través de estos medios exigen una verificación experimental. En su defecto, es recomendable explorar dis-

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tintos programas que aborden el problema desde perspectivas diferentes. En este sentido, también es aconsejable no confiar en los parámetros de base (defaults) de los programas sino experimentar valores diferentes (tales como valor E, enmascarado de regiones de baja complejidad, matriz de score, etc.) para lo cual es crucial leer la documentación asociada a los programas o bases de datos usadas. 8 Lecturas Recomendadas
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W, Xu Z, Zhang J, He S, Zhang J, Xu J, Zhang K, Zheng X, Dong J, Zeng W, Tao L, Ye J, Tan J, Ren X, Chen X, He J, Liu D, Tian W, Tian C, Xia H, Bao Q, Li G, Gao H, Cao T, Wang J, Zhao W, Li P, Chen W, Wang X, Zhang Y, Hu J, Wang J, Liu S, Yang J, Zhang G, Xiong Y, Li Z, Mao L, Zhou C, Zhu Z, Chen R, Hao B, Zheng W, Chen S, Guo W, Li G, Liu S, Tao M, Wang J, Zhu L, Yuan L, Yang H 2002. A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. indica). Science 296 :79-92. 20. Goff SA, Ricke D, Lan TH, Presting G, Wang R, Dunn M, Glazebrook J, Sessions A, Oeller P, Varma H, Hadley D, Hutchison D, Martin C, Katagiri F, Lange BM, Moughamer T, Xia Y, Budworth P, Zhong J, Miguel T, Paszkowski U, Zhang S, Colbert M, Sun WL, Chen L, Cooper B, Park S, Wood TC, Mao L, Quail P, Wing R, Dean R, Yu Y, Zharkikh A, Shen R, Sahasrabudhe S, Thomas A, Cannings R, Gutin A, Pruss D, Reid J, Tavtigian S, Mitchell J, Eldredge G, Scholl T, Miller RM, Bhatnagar S, Adey N, Rubano T, Tusneem N, Robinson R, Feldhaus J, Macalma T, Oliphant A, Briggs S 2002. A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. japonica). Science 296: 92100 21. Bal, AA, Katsumi S, y Sasaki T 2000. Rice at the forefront of plant genome informatics Genome Informatics 11: 3-11. 22. Sasaki T, Sederoff RR 2003. Genome studies and molecular genetics: The rice genome and comparative genomics of higher plants. Current Opinion in Plant Biol 6: 97-100 23. Dopazo J. y Valencia A 2001. La bioinformática y la genómica. bioinfo.cnio.es/docus/courses/ leon2002/ BioinfoGenomica.pdf 24. Banerjee-Basu S y Baxevanis AD Predictive methods using protein sequences. In: Bioinformatics: A practical guide to the analysis of genes and proteins Editado por: Baxevanis AD y Oullette BFF .USA. Wiley-Liss, Inc. 2001 pp 253-279 25. Mudler NJ, y Apweiler R 2001. Tools and resources for identifying protein families, domains and motifs. Genome Biology 3: 2001.1-2001-8 26. Perstsemlidis A y Fondon III JW 2001. Having a BLAST with bioinformatic (and avoiding BASTphemy). Genome Biology 2: 2002.1-2002-10. 27. Schuler GD. Sequence alignment and database searching. In: Bioinformatics: A practical guide to the analysis of genes and proteins. Editado por: Baxevanis AD y Oullette BFF USA. Wiley-Liss, Inc. 2001 pp187-212 28. Altschul, SF, Gish, W, Miller, W, Myers, EW, y Lipman, DJ 1990. Basic local alignment search tool. J.Mol.Biol, 215: 403-410 29. Pearson WR y Lipman DJ 1988. Improved tools for biological sequence comparison, Proc. Natl, Acad. Sci. 85: 2444-2448 30. Altschul SF, Boguski MS, Gish W, Wootton JC 1994. Issues in searching molecular sequence databases. Nat Genet 6:119-129.

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PARTE VIII Aplicaciones Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 255 .

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1) es una excelente herramienta que ha sido am- 1 Introducción La industria florícola es de una importancia más que relevante a escala mundial. No se profundi. que brotes subsidiarios cultivados en forma aislada. El presente capítulo tiene como objetivo brindar un panorama sobre la situación actual de la Biotecnología en relación al cultivo de plantas ornamentales. Dependiendo del objetivo planteado es posible clonar individuos utilizando cultivo de ápices o meristemas. enfermedades.-Capítulo 1 Biotecnología en el Cultivo de Especies Ornamentales Escandón. F: Plantas ex vitro floreciendo en condiciones de invernáculo. los restantes son técnicas involucradas. lumen.000 millones de dólares. Tradicionalmente se ha empleado el mejoramiento clásico para obtener variedades exitosas que satisfagan las demandas de un mercado ávido de novedades.Figura 1. sino que también posibilita el estudio y caracterización de la biología del desarrollo de las mismas. D: Estadío previo a la transferencia ya han sido tratadas en de los brotes al medio de enraizamiento. las tendencias actuales hacia la mejora ecológica de los cultivos y la necesidad de incorporar caracteres tales como resistencia a herbicidas. La técnica de micropropagación (Fig. que busca nuevas características en cuanto a colores. mayor vida en postcosecha. ha conducido a la industria de la floricultura a adoptar las nuevas biotécnicas. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 257 .. etc. B: Brotes subsidiarios aislados. A: Desarrollo de la yema principal y de zará en los detalles de las brotes subsidiarios en la base de la misma que serán cultivados in vitro. Modificado de Escandón et al. 2 El cultivo de tejidos en ornamentales Una de las técnicas biotecnológicas que se emplean en ornamentales es el cultivo de tejidos. o bien buscar aumentar la variabilidad genética por medio del cultivo de callos. modificar la arquitectura de las flores. Cultivo de tejidos de Santa Rita. ya que representa un negocio de alrededor de 30. Sin embargo.VIII. aromas. C: La flecha señala la yema principal. formas. RIA 32 (1):11-122. E: Plantas ex vitro enraizando en otros capítulos de este vo. insectos. suspensiones celulares o protoplastos. etc. Esta técnica no sólo permite la producción masal de plantas. Alejandro S.sustrado artificial. Abril 2003.

Mammillaria sp.Yemas o segmentos nodales: Dianthus. .pliamente utilizada para la propagación a gran escala de especies ornamentales.. Gardenia. ya que no sólo permite la obtención de miles de individuos a partir de un genotipo «elite» seleccionado. Iris sp. Dracaena sp.. Bignoniaceae.Protoplastos: Chrysantemum. Daphne L.. .Cultivo de meristemas: Ghypsophyla. como tal. Gerbera sp. Gladiolus. 258 ESCANDÓN. .Callos: Chrysantemum. Bromeliaceas.Apices: Diphaenbachia . Bromeliaceas.. La lista precedente es apenas una muestra de la gran diversidad de explantos que se utilizan para la multiplicación in vitro de plantas y. Narcissus . la posibilidad de obtener plantas libres de virus por medio del cultivo de meristemas también ha sido explotada en ornamentales. Gerbera sp. .. más aún si se lo combina con termoterapia y/o métodos químicos.. Chrysantemum. . El cultivo de meristemas es uno de los métodos más eficaces para la eliminación de virus.Semillas: Cattleya sp. Saintpaulia spp..Segmentos de inflorescencia: Chrysantemum. Como la mayoría de los cultivos ornamentales se multiplican asexualmente. Orchidea..Anteras: Saintpaulia spp. es de gran aplicación en el campo de los cultivos intensivos tanto ornamentales como hortícolas.Secciones de flores: Iris sp.Capítulos: Gerbera sp. . Mammillaria sp. Iris sp. Zinnia elegans. Hace más de 50 años Morel y Martín informaron la regeneración de plantas de dalia libres de virus por escisión y cultivo del domo meristemático de ápices de plantas infectadas. Iris sp.A partir de plántulas in vitro : Bromeliaceae. Gardenia. Gladiolus.. La elección errónea de un material. Bougainvillea. .Embriones maduros: Alstroemeria sp. Orchidea. . Además de la micropropagación. por medio de la multiplicación de yemas apicales in vitro es posible obtener una tasa de multiplicación de hasta 300 yemas por ápice cultivado en 90 días.. . sino que también permite la multiplicación de plantas raras o en peligro de extinción. Cyclamen persicum. . Mediocactus coccineus. Gerbera sp. Maranta sp... Zinnia elegans. .. Saintpaulia spp.. entre ellos el del mosaico del coliflor (CMV). Mammillaria sp. En general.Lámina: Saintpaulia spp. . está muy lejos de abarcar el total de las especies ornamentales que se multiplican por este método. resguardando la estabilidad genética de las mismas. .. . Algunos géneros y especies de plantas que se pueden cultivar in vitro a partir de diferentes explantos son: .. Con el método convencional (semillas o división de la corona sobre sustrato artificial e inerte) se logra una tasa de multiplicación de 30 plantas por año. Daphne L. Saintpaulia spp. .Cotiledones: Zinnia elegans. Orchidea spp..Escamas: Lilium . Blandfordia sp.Embriones inmaduros: Alstroemeria sp.. Chrysantemum. libres de virus.. con todos los genotipos. Si bien existe una dependencia del genotipo. . se hace necesario eliminar de los cultivos de esta especie los virus que los afectan normalmente. Anthurium sp.Bulbos o Segmentos de bulbos: Sego lily. Saintpaulia spp. . Rosa L. Scoparia sp. En Europa la demanda anual del mercado de plantas de este género oscila entre 15 y 20 millones de unidades. con las consecuentes pérdidas económicas Gerbera representa un claro ejemplo de la necesidad de la aplicación de estas técnicas en la industria florícola.Segmentos de médula: Chrysantemum. Campanula sp. Anthurium sp. Saintpaulia spp. Por otro lado... Nierembergia. provocaría la diseminación de estas enfermedades. Gerbera sp. . Maranata sp. .Pecíolos: Rhododendron sp. Impatiens... Iris sp..Ovulos: Impatiens ..Segmentos de pétalos: Chrysantemum. Rosa L. Alejandro S. Saintpaulia spp. estas enfermedades virales suelen ser un problema importante. Jacaranda mimosifolia. Impatiens . Iris sp.Rizomas: Cymbidium . Chrysantemum. . .Discos de hojas: Rhododendron sp. Este descubrimiento dio un gran impulso al cultivo de tipo intensivo en general. Chrysantemum. Dracaena sp. Begonia sp. por error o desconocimiento. Gardenia. Pelargonium.

con rayos X. 3 Marcadores moleculares para el mejoramiento y la selección de ornamentales Los marcadores moleculares como herramienta para la caracterización y diferenciación entre genotipos fueron rápidamente utilizados por genetistas y mejoradores de plantas. El cultivo in vitro también puede ser fuente de variabilidad genética. seleccionándose las variantes prometedoras y estables e incorporándolas a los programas de mejoramiento. Su neutralidad en relación al proceso de selección. plantas con diferentes tamaños. La obtención de plantas completas y fértiles a partir de estos materiales hace a esta estrategia muy promisoria para incorporar nuevos caracteres. se duplican los cromosomas del híbrido a fin de que sea fértil. Esta técnica se está utilizando en el Centro Tecnológico en Flori. puede dar origen a individuos que presentan algún rasgo diferente respecto de la planta madre. color de pétalos y. los AFLPs y los microsatélites son los más frecuentemente utilizados por su alta reproducibilidad y la gran cantidad de información que brindan. A partir de este tratamiento se recuperó una gran cantidad de variantes. por lo que fueron adoptadas como método de rutina para la multiplicación comercial de este género. como la colchicina y los herbicidas orizalina y trifluralina. Este fue un avance importante para la especie Z. lo mismo que la fusión de protoplastos.estas técnicas de producción superaron largamente los rendimientos del método convencional. el color y el tamaño de la flor (en Chrysantemum. hábitos de floración. Las plantas de Calibrachoa que sobrevivieron al tratamiento demostraron ser quimeras diploides/tetraploides. Geranium y Saintpaulia). Para ello. en algunos casos se restauró la fertilidad. En este caso se obtuvieron yemas a partir de callos originados de protoplastos interespecíficos fusionados que habían sido pretratados con antimetabolitos como iodoacetato o rodamina-6G o. Las plantas regeneradas luego de estos tratamientos pueden mostrar características que difícilmente se puedan obtener por otra vía. que es un híbrido estéril. Se multiplicaron las tetraploides y se espera la floración a fin de establecer la posibilidad de cruzarlos con otras especies del género. En Chrysantemum. suspensiones celulares o protoplastos. Se han obtenido individuos con diferencias en la forma. que ha sido aplicada en Rhododendron y Lilium. Asimismo. Una técnica tradicional para la obtención de mutantes in vitro que también se utiliza en especies ornamentales es la aplicación de inductores de poliploidía. La producción de plántulas por regeneración a partir de callos. toxinas y baja temperatura. Estos marcadores moleculares aplicados a la diferenciación de genotipos son un arma muy poderosa para la protección de los derechos de los mejoradores y productores. una vez efectuado el cruzamiento. La inducción de variantes somaclonales tiene especial significado en la floricultura debido a la constante búsqueda de nuevas variedades. lo que es más interesante. Aquellas variantes cuyos nuevos caracteres mostraron ser heredables se seleccionaron para incorporar en el programa de mejoramiento. marylindica. Para detectar la Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 259 . Fruti y Horticultura (CETEFFHO) con el objetivo de obtener cruzamientos interespecíficos viables en especies de los géneros Calibrachoa y Scoparia. Los somaclones en este género se obtuvieron a través del desarrollo de yemas adventicias a partir de cotiledones cultivados con diferentes concentraciones de tidiazuron (TDZ). se han obtenido individuos con resistencia al estrés salino y con cambios interesantes en la forma de las hojas. Zinnia. su poder de resolución y la celeridad con que se obtiene la información. la variación somaclonal también se ha utilizado a fin de seleccionar genotipos resistentes a enfermedades fúngicas en el género Rosa. alternativamente. En la actualidad se conoce un importante número de variantes en ornamentales. salinidad. Otro ejemplo de variación somaclonal es el caso de Zinnia. son algunas de las ventajas que ofrece esta herramienta. A pesar de que diferentes clases de marcadores moleculares fueron probados en ornamentales. Esto también puede lograrse utilizando mutágenos durante el cultivo in vitro asociados con una presión de selección conferida por factores tales como pH.

Alejandro S. estabilidad y uniformidad de las nuevas variedades que año a año ingresan al mercado. X X X X X X X X X X X X D. X que estos están adquiriendo en la verificación de los criterios de distinguibilidad. X A. entre los que se encuentran los AFLPs. número de pétalos (5 vs. pérdida del vigor de la planta. La enfermedad se controla con aplicaciones de fungicidas. . la de marcadores moleculares está siendo intensamente aplicada en especies ornamentales. En la Tabla 1 se mencionan los cultivos ornamentales en los cuales se han aplicado marcadores moleculares. se inició un proyecto conjunto entre las Universidades de Clemson y Texas a fin de obtener el mapa genético de esta especie.G). que como flor de corte es uno de los cultivos ornamentales más importantes del mundo. floración una vez al año o siempre florecida. Una vez construído este mapa. identificación varietal (I. Esta estrategia tiene la desventaja de que requiere mucho tiempo y depende de factores ambientales. G.propagación fraudulenta de un cultivar el método tradicional se basa en el análisis y la comparación de los caracteres fenotípicos de plantas crecidas y en período de floración. causada por el hongo Diplocarpon rosae. Con este fin los investigadores texanos están analizando la F2 de un cruzamiento seleccionado entre una variedad susceptible y una resistente. A mediados de la década de 1990. 10 o más). es un ejemplo interesante.V) y análisis genético (A. Esta enfermedad es la de mayor incidencia en el producción de rosas. Un hecho de importancia es que se han detectado variedades de rosas que manifiestan resistencia a la enfermedad y se están buscando los genes que la confieren. y disminución en la producción de flores. a largo plazo. sobre todo por la relevancia Tabla 1: Aplicación de marcadores moleculares para determinar la distancia genética (DG). A partir del análisis de esta F2 se está construyendo un mapa de alta densidad con distintos marcadores moleculares. se procederá al análisis de los perfiles detectados a fin de establecer la asociación entre los marcadores utilizados y los caracteres de interés. Esto permitiría llevar a cabo en el género Rosa un programa de mejoramiento asistido por marca- dores moleculares. La genómica también está realizando aportes en el área de las plantas ornamentales. El mismo tiene como objetivos. 4 Mejorando la ecología de los cultivos y modificando las formas y los colores de las flores La tecnología génica es otra de las estra- 260 ESCANDÓN. Se caracteriza por la presencia en las hojas de manchas negras de contorno irregular. V. ubicar los genes involucrados en la producción de la fragancia y los de la resistencia a la enfermedad de la mancha negra. defoliación. donde la progenie segregó además para varios caracteres de interés para la industria florícola. G. La rosa. Como el resto de las técnicas biotecnológicas. Género Alstroemeria Calladium Cephalotaxus Cymbidium Dahlia Dedrathema Dianthus Euphorbia Geranium Gerbera Heliconia Jacaranda Junipers Lilium Osteospermum Ozothamnus Pelargonium Petunia Rhododendron Rosa Scaevola Syringa Viola X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X I. Esto se soluciona utilizando marcadores moleculares de manera más rápida y precisa. en algunos géneros ornamentales. presencia o ausencia de espinas en el tallo. como color de la flor (rosa vs blanco).

el control de la floración y el mejoramiento de la eficiencia de enraizamiento. lo que derivó en la obtención de flores amarillas en el género por acumulación de pigmentos como chalconas. la flavonoide 3'. no generan el mismo tenor de controversias que provocan los OGMs ligados al consumo alimentario humano como los cereales y las oleaginosas.5’hidroxiantocianina). se encontró que los genotipos transgénicos que tenían reprimida la expresión de Fht resultaron tener mucho más fragancia que los controles. etc.). flavonoides. el Blue Gene. por lo que a partir de la alteración de la expresión de un transgen. La obtención de flores dentro de la gama del azul se constituyó un desafío para las semilleros. para bloquear la vía metabólica de las antocianinas. además de las ventajas adicionales que se pueden lograr en la incorporación de un caracter determinado (por ejemplo: ahorro de insumos. Asimismo. a enfermedades fúngicas y virales. y desde un punto de vista totalmente ligado el mercado. la modificación de la fragancia. Sólo en petunia el azul tiene la intensidad que los mejoradores pretenden. Este gen codifica para un citocromo del tipo b5. De los colores amarillo y naranja son responsables los carotenoides. como son la modificación del color y la forma de las flores. crisantemos y rosas de color azul (las tres especies abarcan el 50% del mercado mundial de flores de corte). En el tema donde más se ha avanzado es en la modificación de los pigmentos de los pétalos. Alemania. La expresión Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 261 . A estas se suman los caracteres específicos para la floricultura. la compañía Florigene cuyo principal objetivo era el desarrollo de claveles. auronas y algunos flavonoles en los pétalos. tolerancia a herbicidas. Una idea de la relevancia de este tema lo indica el hecho que en el año 1986 se fundó en Melbourne. entre los que se puede considerar un profundo conocimiento de la bioquímica de las plantas (sobre todo en lo que hace a la síntesis de pigmentos). Para el mejoramiento de ornamentales por transgénesis existe un considerable interés en la incorporación de características tales como: resistencia a insectos. A mediados de la década que comenzó en 1990 se obtuvieron claveles azules. el alto valor agregado que implica la aplicación de la técnica. El color de las flores se debe a tres tipos de pigmentos. se logró la modificación de dos caracteres. Varios factores han contribuído a este importante desarrollo.tegias que se ha aplicado exitosamente en el mejoramiento y se ha difundido en forma sostenida entre los principales cultivos ornamentales. El color azul no es muy frecuente en las flores. En clavel se utilizó la secuencia antisentido de la flavonona 3-hidroxilasa (Fht). Este color depende de tres factores: la síntesis de un pigmento denominado delfinidina (3’. De esta manera se logró la modificación del color original y se obtuvieron nuevos genotipos de la variedad utilizada en el ensayo. un notable manejo del cultivo de tejidos en las especies de interés. Australia.5'-hidroxilasa. Asimismo. El primer informe acerca de la modificación de los colores de flores por ingeniería genética lo efectuó en 1987 el Instituto Max Planck de Colonia. el incremento de la vida post cosecha. se encuentran en las flores rosas y rojas respectivamente). El color azul se debe a un pigmento denominado delfinidina. la presencia de copigmentos como flavonas y un pH alcalino en las vacuolas de las células de los pétalos. Desde mediados de la década que comenzó en 1990 se sucedieron una serie de publicaciones acerca de la alteración de la pigmentación de flores de crisantemo por aplicación de la tecnología antisentido para el gen de la chalcona sintetasa (chs). androesterilidad. etc.. Del rojo y del rosa son responsables los flavonoides (cianidina y pelargonidina. incremento en el rendimiento. Otro gen involucrado en la producción de delfinidina fue identificado en 1999. La modificación del color de las flores se planteó como objetivo por los grupos de mejoradores de ornamentales. que son los de aplicación en la mayoría de los cultivos. La introducción de la secuencia en sentido del gen de la chalcona sintetasa en petunia permitió redireccionar la vía metabólica de los flavonoides hacia la producción de chalconas. los organismos genéticamente modificados (OGMs) ornamentales. Estudios de cromatografía gaseosa mostraron incrementos de 10 a 100 veces en los niveles de los derivados del ácido benzoico. Esta empresa aisló el gen que codifica para la enzima clave para la biosíntesis de delfidina.

un inconveniente a resolver es que la vía metabólica de producción de pigmentos en estas plantas es muy diferentes a la petunia. convierte a la Sadenosilmetionina en ACC que. En la actualidad Florigene está probando el citocromo P450 (responsable de la detoxificación hepática en mamíferos). retrasando su envejecimiento. mayor capacidad de enraizamiento. Otro importante avance tecnológico. muy contaminantes. que se encuentran normalmente presentes en los vegetales. Alejandro S. La vía metabólica de producción de esta hormona es bien conocida. Si bien presenta la ventaja de que se trata de una vía metabólica directa (de un solo paso). obteniéndose plantas de menor tamaño. Los datos indican que el microambiente de las células del pétalo de la rosa no sería el más propicio para la producción de pigmentos azules vía flavonoides. por acción de la ACC oxidasa se transforma en etileno. ya que los productores podrán abandonar el uso de las sales de plata. LVL) por bloqueo de la síntesis de etileno. Todavía no se han obtenido resultados concluyentes con la aplicación de esta estrategia para la obtención de rosas azules. por lo que esta estrategia no sería la más adecuada para la producción de una rosa de color azul. El silenciamiento de este gen en plantas de petunia redunda en un 60% menos de acumulación de delfinidina en relación a plantas no tratadas.5’ sustituída. En clavel la incorporación de este transgén produjo una serie de modificaciones morfológicas muy ventajosas como ser disminución de la dominancia apical. para prevenir la producción de etileno en el período post-cosecha. Experimentos efectuados en la Universidad de Queensland demostraron que bacterias transformadas con el gen que codifica para el P450 son capaces de generar un color azul intenso usando como sustrato compuestos con grupos indólicos. ya que la rosa es deficiente en la enzima flavonoide 3'. es la producción de claveles «larga vida» («long vessel life». . Otro inconveniente es el pH vacuolar. por lo que se bloqueó la producción de etileno en los claveles transgénicos.del mismo incrementa la producción de la antocianina 3’. La tecnología ofrece una importante ventaja tanto en lo comercial como en lo ecológico. En la actualidad existen en el mercado siete variedades de claveles cuya pigmentación fue modificada por ingeniería genética por incorporación del Blue Gene. En otros laboratorios se ha modificado la forma de las flores de crisantemo por la introducción del gen rol C de Agrobacterium rhizogenes. habría que determinar si los productos de la conversión de grupos indol no presentan fitotoxicidad.5' hidroxilasa. desarrollado y patentado por la misma empresa. como alternativa para la obtención de rosas de color azul. Aplicando tecnología antisentido se logró suprimir la expresión de ambas enzimas. el enrollamiento de los pétalos). En consecuencia no puede sintetizar los pigmentos adecuados. La falta de producción de etileno impide el deterioro prematuro de las flores una vez cortadas (principalmente. En cuanto a la obtención de rosas azules. que en las rosas es ácido y bajo estas condiciones la delfidina se torna de color rosa. flores de menor diámetro y pétalos y hojas modificados. la enzima ACC (ácido 1 amino ciclo propano-1carboxílico) sintetasa. mejor incorporación de metabolitos y mayor producción de varas (se incrementó tres veces Tabla 2: Algunos avances logrados en el mejoramiento de ornamentales por ingeniería genética 262 ESCANDÓN.

). Lilium. En términos prácticos estas modificaciones implican una sensible mejora en el rendimiento del cultivo. Ghypsophylla. entre otras. de Agronomía de la UniversiC D dad Nacional del Sur estudia la variabilidad genética Figura 2. 5 La situación en la Argentina La revisión de los libros de resúmenes del Primer Congreso Argentino de Floricultura y del V Simposio de Redbio Argentina 2002 muestra que en nuestro país son muy pocos los laboratorios que trabajan en biotecnología de ornamentales.) obtenidos a en la micropropagación de partir de un diploide (der. en el IBONE se efectúan estudios de crioconservación. rosa.). D) Planta tetraploide florecida.) tratado con colchicina en condiciones in vitro. Nierembergia. En el Laboratorio de Propagación y Pro. de Agronomía de la Universidad Nacional del Sur y en el Centro de Recursos Naturales Renovables de la Zona A B Semiárida (CERZOS) se trabaja en multiplicación in vitro de Lilium. B). La lista alcanza a 5 instituciones trabajando en el área.) y control (der. etc. Gerbera. futuro Instituto de Floricultura de INTA-Castelar. Pelargonium. Poinsetia. La Tabla 2 resume algunos avances logrados en el mejoramiento de ornamentales por ingeniería genética. A) Individuos tetraploides del género Scoparia (izq. en Berberis sp. Dentro del mismo Instituto y en el marco del proyecto INTA-JICA: «Desarrollo de la Floricultura Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 263 . se han logrado interesantes resultados en la micropropagación de J. En el Dpto. comparados con el correspondiente control. Calibrachoa. Lupinus . tetraploide (izq. orquídeas. En el CETEFFHO.) y de la planta control (ab. Comparación entre las flores paraíso (Melia azaderach). se trabaja desde hace algunos años en micropropagación de especies ornamentales como. alstroemeria. de ambas plantas.2).nativa de importancia ornamental. Además de importantes avances en el (CEPRoVe) de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de La Plata se establecimiento in vitro de Tabebuia y está trabajando en la micropropagación de Tecoma. Jasminum mensyi y Gerbera. En el laboratorio de Cultivo de Tejidos del Instituto de Botánica del Noreste (IBONE) y Universidad Nacional del Noreste (UNNE) se multiplican orquídeas in vitro.en relación al producto no transgénico). Este Instituto en colaboración con el Dpto. Tecoma. Jacaranda. En el Centro de Producción Vegetal Bougainvillea y Scoparia (Fig. En la Cátedra de Producción Vegetal de la Facultad de Agronomía de la UBA se han realizado experiencias en la micropropagación de Pelargonium . C) Hojas de la planta Sobre esta misma especie tetraploide (arr.en la Argentina» se está trabajando en flora ducción Vegetal del Centro Austral de Inves. entre tigaciones Científicas de Usuahia se trabaja otros con los géneros: Tabebuia. clavel.

Buenos Aires. por Callaway. Calibrachoa sp y Scoparia spp. en el funcionamiento de los meristemas (en especial de las flores).: 20. N. J. BOURGOIN. De esta revisión se desprende que en nuestro país la herramienta biotecnológica de aplicación en cultivos de interés ornamental es la multiplicación in vitro. 2000. 1994. siendo la primera vez que se informa un resultado de esta índole para el género. G. GILL. Capitulo 1. M. ARUS. Timber Press Portland. J. selección y uso de la variabilidad genética. En: Biotechnology in Agriculture and Forestry. D. . 264 ESCANDÓN. Callaway. M. A. 508: 91-98. 546. BAJAJ. Multiplicación in vit ro de S. S. Capítulo V. Springer. SOTO.). ESCANDÓN. A. Nro 20. En: Breeding Ornamental Plants. J. en especial a través de la identificación de genes involucrados en estrés abiótico. Los estudios sobre el genoma de Arabidopsis facilitarán la comprensión de la estructura y función del genoma de los cultivos ornamentales.. A.. 2000. M. de los individuos que se obtienen por mejoramiento. S. 37-38. montevidiensis. M. Se espera que la incorporación de nuevas variedades al mercado incidirá en forma positiva sobre el desarrollo de la industria local y permitirá el ingreso de la Argentina en el mercado florícola mundial como generador de germoplasma mejorado. Bougainvillea sp. 2002. P. Estos dos aspectos son fundamentales para que el país pueda intervenir en el mercado mundial de ornamentales. Molecular Markers for ornamental breeding. B. Ed.. las herramientas del oficio. Alejandro S. Se han obtenido resultados promisorios en la aplicación de microsatélites anclados en la caracterización molecular de clones de Jacarandá. M. B. Si bien a partir del desarrollo del proyecto INTA-JICA «Desarrollo de la Floricultura en la Argentina» se dieron pasos sustanciales en la formación de recursos humanos. Acta Hort. 1992. CALLAWAY. 7 Lecturas Recomendadas ARNAU. Argentina.. BRACALENTI. Los avances efectuados en fotobiología y en el conocimiento de los ritmos circadianos vegetales permitirán ajustar finamente el control de procesos tan importantes como la floración. Genetic and its applications. Hightech and Micropropagation IV. Flores.. J.. para aplicar mutagénesis in vitro. También se abren nuevas y muy interesantes perspectivas para la creación. P. 2000. A. Genetic engineering for resistance. a los cultivos ornamentales a fin de lograr un mejoramiento sustancial que involucre todos los aspectos del cultivo. S. As.. Cadic.. CALLAWAY. una herbácea con potencial ornamental como planta en maceta o para borduras. 2000. o en los componentes de la resistencia a enfermedades. KOBAYASHI. 6 Perspectivas El advenimiento de la genómica y proteómica y el desarrollo de la bioinformática han aportado herramientas de utilidad que podrían aplicarse en el mejoramiento de especies ornamentales.mimosifolia. BARNES. SIDHU. Proc.. P. S. G. Libro de Resúmenes del I Congreso Argentino de Floricultura y Plantas Ornamentales. Vol. Flower Colour is Major Target in Genetic Engineering of Cut Flowers. (Ed. Lilium sp. XIX International Symposium Improvement Ornamental Plants. Y. P. Acta Hort. CURTIS. En Biología (Ed. nuestro país debería potenciar el desarrollo y aplicación de las nuevas tecnologías en el área del mejoramiento de cultivos ornamentales. Cadic. por Schnek.) Editorial Médica Panamericana. S. vía transgénesis. vía «fingerprinting» (fenotipeado). DNA recombinante. D. A. & Development Monitor. S. Ed. etc. Y.. La identificación y el aislamiento de estos genes posibilitará su incorporación. BIJMAN. p10. P. También será sustancial el aporte que se haga acerca de los mecanis- mos que intervienen en el establecimiento de la arquitectura de la planta. USA. síntesis de hormonas. International Symposium on Molecular Markers for characterizing genotypes and identifying cultivars in horticulture. aprovechando los inmensos e interesante recursos naturales de los cuales dispone. H. 19th Int. J. Bs. DE JONG. y en otros. resistencia a patógenos. ISHS. Bajaj. Biotec. Are AFLP markers the best alternative for cultivar identification? (abstract). I Symposium Improvement Ornamental Plants. Otra de las áreas en las que se trabaja en el CETEFFHO es la puesta a punto de técnicas de marcadores moleculares para la identificación. Acta Hort. quality and plant habit. LALLEMAND. Micropropagation of Chrysantemum. Oregon. En algunos casos con el objetivo de micropropagación en sí misma.. Ed.

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Esto representa un recurso potencialmente disponible para ser explotado por los insectos fitófagos. del desarrollo del cultivo en un área nueva permitiendo así que las especies nativas de insectos se alimenten de éste y se conviertan en plagas. en algunos casos. La producción primaria neta de las 300. Gentileza del Prof. Introducción La categorización de un organismo como peste o plaga está determinada por el hombre. del cultivo en áreas donde no existen enemigos naturales de la plaga.-Capítulo 10 Estrategias para el control de insectos plaga Ferrero. Reviriego. que Figura 1: Principales destinos de la agricultura mundial. El hábito de alimentarse de plantas parece.000 especies de plantas vasculares. existiendo alrededor de 160 millones de insectos por hectárea. que actúan como vectores de agentes patógenos en los vegetales o que alteran la salud humana son considerados plagas. En la actualidad. considerándose éste como el factor principal en el sistema. malezas y enfermedades habitan las zonas secas de la que reducen el rendimiento de los cultivos. Se supone que las formas más primitivas de insectos conocidas eran consumidores de detritus. Lilian. María 1. En los agroecosistemas modernos la evidencia experimental sugiere que la biodiversidad puede ser utilizada para mejo- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 335 . Adriana A. La población humana está sumergida en un mar de insectos. El impacto de los insectos sobre las cosechas es conocido desde los tiempos bíblicos. 9 estimada en unas 115 x10 toneladas por año. cuando las plagas de langostas se extendieron por el territorio egipcio. Sin embargo. haber evolucionado independientemente. El hombre debe competir por las cosechas con insectos plaga. los insectos plaga y los organismos patógenos (hongos. insectos que se alimentan de plantas y granos. tiene carácter antropocéntrico. el estudio global de la interacción y del impacto de los insectos sobre la vegetación natural se ha desarrollado en los últimos cien años.VIII. siendo el 1% de ellos los que caen en la categoría de plagas. Basados en su biomasa y abundancia. del uso de fertilizantes y herbicidas. los insectos son los organismos más exitosos en la tierra. Los insectos han atravesado un largo y variado período de coevolución y coadaptación con sus plantas huéspedes estableciendo modelos de asociación con distintas estrategias en el ciclo biológico y en los mecanismos alimentarios necesarios para la explotación de éstas. Si se considera su número solamente. Descamps. generando adaptación a éste y posibilitando la aparición de resistencia. bacterias y virus) son responsables del 14 % de las pérdidas en cosechas en el mundo (Fig. la tasa estimada de insectos en relación con los humanos en nuestro planeta es de 200 millones a 1.. ha sido Spangenberg. es decir. Así. 1). de la eliminación de los enemigos naturales de la plaga por cambios en el manejo del cultivo y del uso continuo del mismo producto químico. Germán superficie de la tierra. Las actividades agrícolas incrementan las oportunidades para el surgimiento de las plagas a través del desarrollo de monocultivos.

ocasionalmente. Los carbamatos son insecsumado al costo de los herbicidas represen. que demopérdidas en cosechas debidas a los insectos ran meses o años. en que éstos se aplican. Entre 1970 y 1980 sición química. la dosis y el modo de las inversiones realizadas. no sólo destruyendo a la plaga sino también a otros insectos que actúan como enemigos naturales o favoreciendo el resurgimiento de plagas secundarias. se acumulan en grasas y dan origen al conocido fenómeno de biomagnificación. los compuestos sintéticos mencionados son los más potentes para el control de las plagas. A menudo. Adriana A. dos del ácido crisantémico.a los organofosforados. fotodegradación es rápida y en la actualidad Los organoclorados constituyen el grupo son los más utilizados por ser más seguros más antiguo y más utilizado de insecticidas para la vida silvestre y el ambiente. Los organofosforados se desarrollaron en Alemania durante la Segunda Guerra Mun2 Insecticidas dial. derivason los organoclorados.puestos se produce en horas o días en comtiosas inversiones económicas (Fig. Debido a su amplio espectro de acción en la naturaleza. Los grupos más importantes siguieron los insecticidas piretroides. organofosforados. María . Su carbamatos y piretroides.2). el medio ambiente y la salud humana están muy bien documentados en el libro La primavera silenciosa. Varios estudios muestran que es posible estabilizar las comunidades de insectos en un agroecosistema constituyendo arquitecturas vegetales que soporten a las poblaciones de enemigos naturales y/o inhiban el ataque de las plagas. rar el manejo de las plagas. ción Geigy. pueden resultar perjudiciales al hombre tanto en los agroecosistemas como en los ecosistemas naturales. adquiriendo particular relevancia dentro de este grupo los insecticidas destinados a combatir y/o reducir una población de insectos plaga.orgánicos. estables y persistentes. Las paración con los organoclorados.. Son derivados del ácido carbámico El método más preciso de clasificación de y similares en la persistencia en el ambiente los insecticidas es de acuerdo con su compo. químicamente derivan del ácido fosfórico. hidrógeno y carbono en su molécula y. La ruptura de estos comlos cultivos libres de insectos representa cuan. Sus efectos sobre la vida silvestre. escrito en el año 1962 por la bióloga Raquel Carlson.ticidas de amplio espectro muy utilizados en tan una inversión mundial de unos 3 billones la agricultura. REVIRIEGO. Aunque son muy efectivos. algunas de las causas de estos efectos indeseables están relacionadas con la elección del Figura 2: Uso de insecticidas en los principales cultivos agrícolas y el monto producto. A partir de 1950/1960 los organoclorados fueron reemplazados por los organofosforados y los carbamatos. Lilian. desarrollados por la corporade dólares anuales. Como grupo. Estos contienen cloro. Es difícil imaginar una tecnología que produzca la cantidad necesaria de alimento para la humanidad y el mantenimiento adecuado de la salud pública sin recurrir al uso de plaguicidas. oxígeno y azufre. son menos estables en presencia de la El uso de insecticidas en el mundo es muy luz y se descomponen rápidamente en comgeneralizado. DESCAMPS. Su aplicación para mantener a puestos no tóxicos. 336 FERRERO.

Es necesario destacar que en la última década se han investigado intensamente las posibilidades de aplicar comercialmente las feromonas con fines de control. buena cobertura de las superficies a tratar y facilidad en su formulación. En este grupo se encuentran los llamados reguladores del crecimiento. Sin embargo. Los insecticidas botánicos son derivados de las plantas o de parte de ellas y han sido utilizados durante mucho tiempo antes que cualquier otro insecticida. muchos son considerados como agentes antimicrobianos que protegen las plantas de posibles enfermedades. y a los que se conoce con el nombre de metabolitos secundarios. Dado su modo de acción su uso es seguro. En la práctica sólo el 5% de las mismas se ha logrado sintetizar. que pueden actuar interrumpiendo su ciclo biológico. comportamiento y desarrollo del insecto. Muchos insecticidas convencionales afectan el sistema nervioso del insecto. Los semioquímicos incluyen a las feromonas. baja estabilidad relativa y compatibilidad con otras tácticas. Además de éstos. que serán efectivos contra sucesivos ataques. Estos genes pueden tener diversos orígenes y constituyen una herramienta importante en el desarrollo de variedades resistentes. También existen proteínas. Sin embargo. Esta comunicación se realiza mediante compuestos conocidos como semioquímicos. Se los ha utilizado como coadyuvantes de otros insecticidas y son seguros para el ambiente. Además.Continuamente se buscan compuestos más selectivos. es difícil demostrar esta afirmación. Actualmente es posible introducir en plantas genes que confieren resistencia a insectos para reducir su susceptibilidad a los mis- mos. De todas maneras existen ejemplos que demuestran que durante la alimentación de los insectos con una planta puede inducirse en la misma un incremento en la concentración de algunos metabolitos secundarios. que tiene funciones similares a las del hombre o al de otros animales. son inestables en almacenaje. que pueden ser aceites minerales obtenidos del refinamiento del petróleo o botánicos. selectividad contra la plaga. dependiendo de las circunstancias y de la cantidad ingerida. existen análogos químicos de las hormonas de los insectos. La relación entre el estímulo químico de la planta y la respuesta del insecto es una forma de comunicación química entre estos organismos. Su importancia radica en su efectividad. Hasta el momento no se encuentran en la bibliografía casos instalados de resistencia a feromonas. que permiten la comunicación entre individuos de diferentes especies. Las barreras químicas de las plantas pueden ser interpretadas como un mecanismo de defensa contra los insectos que se alimentan de ellas y que la planta ha adquirido por selección natural. Las plantas producen una diversidad de compuestos. inefectivos contra ciertas plagas y algunos insectos presentan resistencia a los mismos. que se caracterizan por causar muerte prematura y metamorfosis anormales. Sin embargo. el tiempo requerido para su desarrollo. sustancias producidas por insectos que permiten la comunicación entre individuos de la misma especie y a los aleloquímicos. que suelen llamarse agentes antiinsectos y que pertenecen al grupo de los biorracionales. Los aceites refinados de petróleo presentan ventajas como bajo costo. Esto hace que el interés en ellos se reduzca por los potenciales riesgos para la salud humana y animal. con la misma función. sin un rol aparente en los procesos fisiológicos básicos de las mismas. Otro grupo de insecticidas son los naturales. Los aleloquímicos pueden subdividirse en Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 337 . dentro de las cuales están incluidas enzimas tales como quitinasas. los problemas de biotipos y que. Los más conocidos son los alcaloides. lectinas e inhibidores de enzimas digestivas. las características agronómicas de un cultivar puedan ser beneficiosas para otra plaga son algunas de sus desventajas. Un considerable número de ellos son tóxicos para los insectos ocasionándoles lesiones o la muerte. a veces. pero poco uso se ha hecho de ellas. más específicos y con blancos para accionar específicos de los insectos. En las últimas tres décadas se han logrado avances tecnológicos significativos que han permitido descubrir. Los metabolitos secundarios tienen funciones alternativas. identificar y sintetizar químicos específicos que regulan o median el crecimiento. las variedades resistentes pueden ser introducidas fácilmente y en forma económica resultando en ganancias en corto tiempo.

Las kairomonas provocan respuestas positivas en el insecto favoreciendo la localización del huesped. en la actualidad en algodón tienen dos orígenes. Los productos basados en Bacillus thuringiensis (Bt) son los más difundidos entre los llamados «insecticidas biológicos» porque poseen bajo riesgo ambiental y humano. En la actualidad. Otro gen dual es el CryAc/ Cry1F. y cyt (toxinas citolíticas). debido a los avances logrados en su formulación y a la biotecnología se han descubierto cepas de Bt. cesa la alimentación y muere rápidamente. en el futuro. donde se libera la llamada delta endotoxina. DESCAMPS. Se trata de un gen Cry1Ab/Cry1Ac. su aplicación ha sido muy restringida. María . Adriana A. Se identificaron y clasificaron numerosos genes que las codifican. también conocidas como Bt. REVIRIEGO. excitantes y estimulantes. Los cristales de las diferentes cepas de Bt contienen más de un tipo de proteína con poder insecticida. En la actualidad se han informado 1. Estas moléculas se sintetizan durante el ciclo vegetativo de las bacterias y actúan como exotoxina que al ser ingerida por la plaga. durante la esporulación. Entre los segundos se encuentran las endotoxinas de Bacillus thuringiensis. Cabe mencionar que las toxinas expresadas en la plantas Bt son idénticas o similares a las encontradas en la naturaleza y a las que se encuentran en el microorganismo que se 338 FERRERO. Ya hay más de 100 genes identificados pertenecientes a estas familias.326 especies de insectos que atacan al algodón. CAAS). Streptomyces avermectilis. Entre los primeros se encuentran las avermectinas. Las avermectinas actuarían en los mismos receptores específicos para GABA provocando la parálisis y muerte del insecto. El modelo actualmente vigente para el mecanismo de acción sugiere que por unión de la toxina a su receptor específico se induce la formación de poros en la membrana celular que generan un desbalance iónico que conduce finalmente a la muerte del insecto. una inclusión cristalina parasporal proteica. Son bioactivas frente a lepidópteros. Entre ellas se encuentran los repelentes y los compuestos que alteran la oviposición y la alimentación. Gracias a los avances de la tecnología del ADN recombinante se pudieron aislar los genes de las deltas endotoxinas de Bacillus thuringiensis y expresarlos en plantas y bacterias del suelo. Existe otro gen CpTi («cowpea trypsyn gene») que se emplea unido a Bt en alguna variedades chinas. Dentro del grupo de los biorracionales también resultan de interés los productos de fermentación bacteriana y las proteínas cristalinas. Lilian. produciendo respuestas negativas en los insectos y reduciendo el contacto y la utilización de la planta. de los cuáles 10 producen pérdidas importantes desde el punto de vista económico. Una nueva clase de insecticidas que surgieron a partir de las bacterias mencionadas es la que corresponde a la llamada clase VIP (vegetative insecticidal protein). que son una mezcla de productos naturales producidos por un actinomicete del suelo. la oviposición y la alimentación. que es una neurohormona del sistema nervioso de los invertebrados. dípteros o coleópteros. Este moderno insecticida y también acaricida debe su mecanismo de acción a la actividad como agonista del ácido gama amino butírico (GABA). uno es el CryAc utilizado por Monsanto en sus variedades Bollgard y el otro es un gen híbrido que fue desarrollado por el sector público (Academia de Ciencias Agrarias de China. La estructura de las delta endotoxinas varía según el gen que las codifica.. Las dos toxinas juntas resultan en un control redundante que conferiría una resistencia más duradera e incrementa el espectro de insectos que permite controlar. Estas incluyen atractantes. Esta inclusión es disuelta por ingestión en el intestino medio de los insectos. No obstante. que son de dos tipos.allomonas y kairomonas. El estudio de la interacción entre la plaga y los compuestos presentes en las plantas ofrecen un potencial importante para mejorar. con mayor potencia y espectro de acción. Las allomonas cumplen función defensiva. denominados cry (por cristal). La utilización de dos genes simultáneamente es una importante herramienta para demorar el comienzo de la resistencia. Esta biotecnología condujo a nuevas formas de liberación de las toxinas para controlar insectos plaga. Los genes Bt que más comúnmente se utilizan. la mayoría de los cuales son lepidópteros. Las Bt son bacterias Gram positivas que producen. el control de las plagas en muchos cultivos.

Los niveles de reducción de fumonisinas en maices protegidos del daño de los insectos (que constituyen vías de entrada del hongo).12). alcanzando los 14 millones de has. Argentina. (Gentileza Monsanto Argentina). Estas micotoxinas son toxicas y cancerigenas para un número de especies animales y se han relacionado con los altos indices de cancer esofágico observados en agricultores de Africa y China.6 millones de has (4%) Este tipo de biotecnología tiene mucha importancia en los países en vías de desarrollo. España. protección de los enemigos naturales. También se han registrado incrementos en el rendimiento y menores costos de producción. En un año la superficie sembrada aumentó de 9. Honduras. Portugal.3 y 4).2 millones de has representa el 5 % de la superficie y el algodon Bt tiene una superficie equivalente. Canadá. que. no existe riesgo de lavado por la lluvia ni pérdida de actividad debida a la luz del sol. Canadá. Esta toxina es inocua para insectos que naturalmente no son sensibles al Bt. Francia. Figura 3: Cañas de maíz convencional (arriba) y protegido de insectos (abajo) con el gen cry 1Ab específico para el barrenador del tallo. El maíz tolerante a herbicidas e insectos (eventos combinados por cruzamiento convencional) con 3. En primer plano. El volumen de agua utilizada en una Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 339 . como se sabe es uno de los recursos más limitantes del planeta (ver VIII. Otra ventaja es el ahorro en consumo de agua que implica la menor utilización de insecticidas. comenzó en 1996 y se incrementó rápidamente. como sucede cuando se aplican las formulaciones derivadas del microorganismo directamente. para aves. mejor control natural de la plaga. entre los que se incluye el hombre. Los beneficios que otorgan estos productos son la reducción en el uso de insecticidas convencionales. peces y mamíferos. algodón y papa fueron plantadas en 5 millones de hectáreas en EE. ya que el gen se expresa en todos los estadios de crecimiento y en todos los órganos de la planta. varían entre 3 y 8 veces en diferentes países y años. con una superficie de 12. El cultivo a gran escala de variedades Bt. México. China. Diatraea saccharalis.. Sudáfrica. Australia. se ha podido determinar una reducción en la presencia de fumonisinas (micotoxinas producidas por diferentes especies de Fusarium sp ). en el 2002. El algodón tolerante a herbicidas e insectos ocupa 2.3 millones de has. Filipinas. el incremento del valor del cultivo. variedad convencional (Gentileza Monsanto Argentina). reducción en la contaminación ambiental y posibilidad de combinar esta tecnología con otras tácticas para el control de la plaga. Rumania y Ucrania En el 2003 el maíz Bt ocupó el segundo lugar en importancia en el mundo.2 y 3. Sudafrica. (Fig. Figura 4: Ensayo experimental de soja tolerante a insectos lepidópteros. España.7 millones de has).9 millones de has a 12.3 millones. en algunos casos de más del 50 %.UU. Argentina. Como un efecto indirecto de la protección contra insectos del maiz Bt. En cuanto a la evaluación del impacto ambiental ver IX. En el 2001 variedades comerciales de maíz. Uruguay y Alemania.utiliza en las aplicaciones convencionales de Bt. evitando tener que aplicar insecticida en tiempos determinados. lo que equivale al 13 % del área total de cultivos transgénicos (67. Los países que lo han adoptado son Estados Unidos.

simple aplicación de insecticida es de 40 a 80 litros por ha. También significa una reducción de 5. basada en la teoría desarrollada en docenas de publicaciones durante los últimos 25 años y en la limitada experiencia de trabajos experimentales a pequeña escala. Dados los recientes avances en biotecnología. El monitoreo constante y las estrategias biotecnológicas en continuo desarrollo serán fundamentales para conservar este recurso de control biológico.5 millones de has. no ha evolucionado una plaga que exprese a campo resistencia a los cultivos Bt. el Bt aplicado como «spray» ha generado moderados a elevados niveles de resistencia en poblaciones de polilla de las coles y en algunos ensayos se observó resistencia a plantas Bt en experimentación. la resistencia podría evolucionar rápidamente en algunas situaciones a pesar de la presencia de refugios. De esta manera.. Cuando se evalúa el riesgo o la seguridad de cualquier plaguicida se debe recordar que 1) la toxicidad es una función de 340 FERRERO.1. a un promedio de 0. La importancia relativa de estos factores varía entre los sistemas de las plagas y los cultivos Bt. los ex- perimentos muestran que pueden ocurrir algunas violaciones a algunas de las asunciones clave (baja frecuencia de alelos de resistencia y herencia recesiva de la resistencia a Bt) en algunos sistemas. la teoría predice que la aparición de resistencia se verá demorada sustancialmente. es decir 6. Hasta donde se conoce. 2. pero no previene los problemas de resistencia en el futuro. fumigadas. dependiendo del insecticida natural o sintético que se esté comparando. DESCAMPS. 81 millones de kg de insecticidas fueron aplicados en el cultivo de algodón en el mundo. El éxito de los cultivos Bt hasta la fecha excede las expectativas de muchos.6 millones de litros de combustible y de un millón de kg de deshechos industriales generados en la fabricación de insecticidas convencionales. No obstante.6 billones de litros.45 kg/ha/ aplicación en el 2001. no se han documentado hasta la fecha incrementos en la frecuencia de resistencia a las toxinas Bt en poblaciones de insectos a campo a causa de la exposición a cultivos comerciales que expresan Bt. Se trata de plantar refugios de plantas no Bt en áreas próximas a los cultivos Bt para permitir la supervivencia de los insectos susceptibles. la resistencia es conferida por alelos raros. la herencia recesiva de la misma. Lilian. Contrariamente a esto. Aunque no existen informes detallados acerca de las evaluaciones a gran escala de esta estrategia de refugio. De manera ideal. lo que es consistente con un promedio global de 5. Existen al menos 7 cepas resistentes de 3 insectos plaga que sobreviven sobre cultivos Bt. Insecticidas naturales vs insecticidas sintéticos La pregunta que nos deberíamos hacer es: ¿son los insecticidas naturales más seguros que los sintéticos? Los científicos responden que puede ser que sean. A fin de contrarrestar la aparición de resistencia se desarrolló la estrategia de refugio.3 billones de litros anuales.5 aplicaciones sobre 33. Si esto es así. Adriana A. recesivos y los adultos más resistentes de los cultivos Bt se aparearán con los adultos susceptibles de los refugios. El ahorro en consumo de agua debido a la utilización de tecnologías como Bt puede estimarse de la siguiente manera: durante 2001. se podría esperar que las plantas transgénicas resistentes jueguen a futuro un importante rol en el control de insectos plaga. dado el difundido uso de los cultivos Bt contra varios insectos plaga. los costos asociados con el desarrollo de la resistencia. María . que reducen la aptitud de los individuos resistentes en relación a los individuos susceptibles sobre los cultivos Bt y las desventajas sufridas por las cepas resistentes sobre los huéspedes Bt en relación a su desempeño sobre cultivos no Bt. Los factores clave para la demora en la aparición de resistencia son probablemente: los refugios. El ahorro en consumo de agua con esta tecnología podría ser del 50%. como por ejemplo a plantas transgénicas de bróccoli. La cantidad de agua utilizada para aplicar 81 millones de kg de insecticida es de 12. Esto representa 180 millones de has. REVIRIEGO. Una lección que nos brindan estos pocos años de cultivos Bt es que debemos ser cautelosos y reconocer que la habilidad para predecir tasas de evolución de la resistencia en el campo es limitada. las bajas frecuencias iniciales de los genes de resistencia.

43: 1-16.L. PAUL. Rev. manteniendo la población de la plaga debajo del nivel de daño económico. RUSSELL. FRANCO. distribución.J. J. Chrispeels. Ciencia y Desenvolvimiento: 3640. J. 1994. MATTAR DA SILVA. BENEDICT. M. CARDINEAU. In: Plants. en una conferencia relacionada con la resistencia a insecticidas: «El hombre contemporáneo debería comprender que las tácticas químicas eficaces para controlar las plagas como asimismo los blancos sensibles y viables deben protegerse como ‘patrimonio de la humanidad’.. El primer gran paso ya está dado: el no desconocer el fenómeno. Resistência de Plantas a Insetos.E. 2) la seguridad de un plaguicida depende del tiempo y frecuencia con que el individuo estuvo expuesto y de la dosis de exposición y que 3) la percepción del riesgo a veces no es coincidente con el riesgo real o actual de un plaguicida. y Sadava. M. World Health Expert Committee on Insecticide. Decía el Dr. Lecturas Recomendadas ALTIERI. present or future?. New York. el fenómeno de resistencia consiste en la habilidad desarrollada en una cepa de insectos para tolerar dosis de tóxicos que serían letales para la mayoría de los individuos de una población normal de la misma especie. KNUTH. Estas etapas dependen críticamente de las propiedades fisicoquímicas de los compuestos antiinsectos. biotransformación y excreción en el insecto. biopesticidas o nuevos cultivos transgénicos. G. O. 949 pp. K.H. G. Inc.. Entomol. Entomol: 39: 489-515. 1957. Jones y Bartlett Publishers. G. El mecanismo más común por el cual una cepa resulta resistente a un insecticida es por la modificación de la toxicocinética o toxicodinámica. J. varias tácticas pueden ser implementadas para evitar la pérdida de las cosechas por acción de los insectos plaga. London. Ann. 2002. E..E. 2003. Strategies for Controlling Insect. Y QUISTAD. SCHWAB. H. 562pp. Según una definición. y NARVA.. CASIDA.. R. Golden age of insecticide research: past. Edgardo Wood. Control Biológico de las Plagas de Insectos y Malas Hierbas.. Ed:TheHaworth Press. Risks from Natural versus Synthetic Insecticides. 7 th Report. 185 pp. Así programas de Manejo Integrado de la Plaga (MIP) deben ser desarrollados para cada cultivo y en cada región. M. D. Biotecnologia. ANÓNIMO. 1999. 3. Massachusets. SCHNEPF. DE BACH.A..A. Los insecticidas crean una presión de selección que elimina progresivamente los individuos sensibles dejando un nicho vacío que pasan a ocupar los individuos resistentes. 1998. siendo esta habilidad de carácter genético y heredable. En algunas plagas. México. Ed: Lycsa Impresores.la estructura química y no de su origen. Novel Bacillus thuringiensis binary insecticidal Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 341 . La resistencia en insectos es un caso de toxicidad selectiva intraespecie. J.E. RODRIGUES MELO. F. N.. y GROSSI DE SÁ.S. Consideraciones finales Sin duda.E. 1994. Ed. Who Technical Report Series Nª 125. Ann. Entretanto la esperanza radica en el conocimiento cada vez mayor del problema y su potencialidad para ser cuidadosos en el aporte y utilización de las soluciones. Sudbury. Los insecticidas naturales y/o sintéticos no inducen sino que seleccionan cepas resistentes. Se debe entender al MIP como una filosofía y una metodología que enfatizan la necesidad de utilizar estrategias de manejo de la plaga para minimizar el resurgimiento de la misma. COATS. M. los insecticidas han sido y probablemente continuarán siendo los métodos más efectivos para controlar el desarrollo de las plagas.G. porque de la irracionalidad en el uso de la química contra la naturaleza podrá sobrevenir una crisis debida a resistencia generalizada en la que no contaremos con moléculas naturales o sintéticas efectivas ni con blancos viables. ELLIS. T.» 4. La resistencia es un caso de evolución preadaptativa .C. R. A pesar de todo. Mite and Nematode Pests. L. STOCKHOFF. Rev. 1992. La llegada al sitio de acción se denomina toxicodinámica y tiene que ver con la reacción fundamental del insecticida o su metabolito activado con una enzima o receptor vital. F. Biodiversity and Pest Management in Agroecosystems. acumulación. La toxicocinética de los insecticidas naturales o sintéticos tienen que ver con las etapas de penetración. no se puede detener la aparición de resistencia a insecticidas convencionales. Norwood (Australia). Genes and Crop Biotechnology.

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. Entre ellas se encontrarían una alta dispersión por semillas u otros disemínulos. que les asegura una asociación cercana a hábitat manejados por el hombre. son los siguientes: .Interfieren con el manejo del agua en sistemas de agricultura bajo riego.VIII. Los principales inconvenientes ocasionados por las malezas a los agricultores. las malezas constituyen plantas nocivas que deben ser eliminadas de los campos en producción. existen algunas especies que de acuerdo con el lugar donde crecen pueden ser consideradas cultivos o malezas. . la vía asexual (propágulos vegetativos) les permite perpetuarse en los ambientes ya colonizados. En agroecosistemas.-Capítulo 11 Estrategias para el manejo integrado de malezas: problemática. bulbos) que originan plantas genéticamente idénticas a las plantas madres. características y daños ocasionados por las malezas Se define a las malezas como plantas que crecen en sitios no deseados por el hombre. etc. M. El banco de semillas del suelo es la reserva de simientes que se encuentra enterrada en los suelos agrícolas y constituye la única fuente de reposición de las especies anuales. estolones. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 343 . rizomas. Las especies perennes presentan en el banco. y una alta capacidad de persistencia en el sitio.Compiten con los cultivos por nutrientes. en la provincia de Buenos Aires. fundamentalmente a través de comportarse como hábiles competidoras frente a los cultivos y presentar un banco de semillas o propágulos abundante y longevo.Causan toxicidad directa al ganado y disminuyen la calidad de las pasturas. dominar y persistir. J. Vernavá. debido a que en la mayoría de los cultivos y pasturas su presencia ocasiona perjuicios económicos de mayor o menor grado de severidad. la mayoría de las malezas tienen algunas características claves que aseguran su éxito y les otorgan la habilidad de invadir. ya que en realidad no existe ninguna característica morfológica o fisiológica que permita caracterizar a una especie vegetal como maleza.000 especies de angiospermas. 1 Definiciones. Un buen ejemplo de ello lo constituye el «raigrás» ( Lolium multiflorum). enfermedades y otras plagas de la agricultura.R. El concepto de maleza tiene por ello un origen antropocéntrico.. además de semillas. . por lo que puede ser considerada maleza toda planta que disminuye el rendimiento de un cultivo. resulta tóxica para el ganado. frutos. Así.). un alto potencial de colonización que les permite incrementar la población rápidamente e integrarse a la comunidad vegetal. por ejemplo. Sabbatini. sólo cerca de 30. que es una maleza importante del cultivo de trigo pero paralelamente es una forrajera ganadera muy deseable. .Interfieren en las labores de cosecha y disminuyen la calidad de los productos cosechados. Este concepto de maleza o de planta indeseable causa por lo general un rechazo especialmente por parte de botánicos que no admiten que se catalogue de esta manera a una especie vegetal. tubérculos. Irigoyen. La eficiencia reproductiva a través de la vía sexual (semillas) permite la formación de nuevos genotipos capaces de colonizar y dominar nuevos ambientes. en España se las denomina «malas hierbas» y en Brasil «plantas dañinas». para un productor agropecuario. Por otro lado. resistencia a herbicidas y aportes de la biotecnología. invade el césped de un jardín o la que crece en el techo de una casa dificultando el desagüe de sus tuberías.000 se comportan como malezas y no más de 250 representan serios problemas para las actividades humanas.H. propágulos vegetativos (tubérculos. que son aquellas que se reproducen únicamente por semillas. agua y luz. así. Las malezas conforman una pequeña proporción del mundo vegetal: de las 200. La referencia negativa a estas plantas se traslada a otros países.. que se traducen generalmente en un perjuicio económico. disminuyendo el rendimiento de los productos cosechados (granos.Actúan como huéspedes de insectos. M.N. Contrariamente.

requieren de un programa a largo plazo que combine diferentes medidas de control previo y durante el desarrollo del cultivo. Las malezas perennes. J. b) Los controles manual y mecánico implican la remoción de las malezas emergidas directamente por el hombre o mediante la utilización de diferentes implementos como cultivadores. El problema no es menor. El problema lo podríamos cuantificar indicando que es mayor la inversión que realizan los agricultores para controlar dichas malezas (labores mecánicas. predación o herbivoría. que afectan el normal desarrollo de los cultivos. la profundidad de la napa freática. la siembra de un cultivo con semillas de adecuada sanidad. Es una de las prácticas de control más utilizada debido fundamentalmente a su practicidad. valor cultural y vigor. que cuentan con sistemas de propagación vegetativa. Así. El manejo de las especies consideradas maleza puede ser enfocado a través de diferentes estrategias. ya que limitan la posibilidad de producir determinados cultivos. aunque cierto grado de éxito también pueda alcanzarse en el estadio de floración. Otro ejemplo lo constituye la zona bajo riego del valle inferior del Río Negro. Por ejemplo. tasa de crecimiento y otros atributos de las malezas.H.. en la cual algunas chacras no son cultivadas cuando existe la presencia en abundancia de Centaurea repens. aplicaciones de herbicidas) que la que realizan para controlar otras plagas como insectos. IRIGOYEN. por ejemplo. el control mecánico sustituyó dichas prácticas hasta que a mediados del siglo XX. acción patogénica. se ha calculado que cerca del 50% del mercado mundial de plaguicidas corresponde a herbicidas. ya que es necesario implementar un intenso y costoso programa de control si se deseara implantar la mayoría de los cultivos primavero-estivales. hongos. alelopatía) afectan negativamente el desarrollo de una población de malezas. nematodos. Posteriormente. y M. etc. una maleza perenne de muy difícil erradicación y que impide la producción rentable de cultivos hortícolas. Por miles de años el control manual y el uso de cultivadores arrastrados por animales constituyeron la principal práctica disponible para solucionar el problema de las malezas. se puede aseverar que las especies anuales son vulnerables a los métodos de control en los estadios de plántula y vegetativo. M. agentes biológicos o enemigos naturales que se encuentran en el ambiente y que a través de su interacción (parasitismo. etc. Debemos por ejemplo considerar que algunas malezas disminuyen el valor de la tierra. Esta táctica de control representa la máxima aspiración en el manejo de malezas. el tipo de maleza y el estadio fenológico del cultivo son factores determinantes de su factibilidad de implementación.N. escarificadores. de forma tal que el manejo y control de malezas es tan antiguo como el desarrollo mismo de la agricultura.. Como regla general. Una condición necesaria en el control biológico es la especificidad que debe 344 SABBATINI. Así.R. producidos normalmente en esa zona. arados. comenzó a generalizarse el uso de compuestos químicos (herbicidas) para el control de malezas. La topografía y el tipo de suelo. fundamentalmente en términos ecológicos y de preservación del ambiente. c) El control biológico de malezas consiste en la utilización de organismos. El enfoque táctico es diferente si se trata de malezas de ciclo anual o perenne . rastras.Liberan sustancias alelopáticas. puede generar condiciones para el rápido establecimiento y desarrollo del cultivo en relación con las malezas. Existen cuatro estrategias básicas de control relacionadas con la problemática de las malezas: a) El control cultural involucra todas las medidas tendientes a generar condiciones favorables o ventajas competitivas que beneficien al cultivo frente a las malezas. la abundancia de malezas invasoras perennes como el «gramón» (Cynodon dactylon) o el «sorgo de alepo» (Sorghum halepense) reducen el valor de los campos en la provincia de Buenos Aires. Todo programa de control deberá inexorablemente responder con tácticas de manejo en concordancia con los ciclos de vida. VERNAVÁ . 2 Estrategias en el manejo de las malezas Desde que el hombre comenzó a cultivar vegetales necesitó extirpar las plantas no deseadas que crecían junto a ellos.

La selectividad es la propiedad que presentan algunos herbicidas de ejercer su acción fitotóxica sobre algunas especies vegetales (malezas) pero sin afectar a otras plan- tas (cultivos). para evitar que afecte a los cultivos o la flora natural. que permiten controlar malezas sin afectar a los cultivos y herbicidas no selectivos o de acción total . además. Además. Asimismo. Una de las propiedades más relevantes de algunos herbicidas llamados sistémicos lo constituye su capacidad de transportarse dentro de los sistemas de conducción de las plantas hasta alcanzar el sitio o blanco de acción biológica. Para que un herbicida sea efectivo debe tomar contacto con la maleza. mediante la liberación del ácaro exótico (Eriophyes chondrillae) que forma agallas en los tallos de la maleza reduciendo su producción de flores y semillas. Como contrapartida. el carácter de selectividad generalmente se restringe a determinados estadios fenológicos dentro del ciclo de desarrollo del cultivo y a una dosis determinada del herbicida. avena. los mismos pueden ser aplicados sobre la canopia de malezas emergidas denominándose herbicidas postemergentes. en mayor medida. ser absorbido. Un ejemplo en desarrollo en nuestro país es el del control de «yuyo esqueleto» (Chondrilla juncea) en la zona del sudoeste de la provincia de Buenos Aires. El herbicida puede ser pulverizado en cobertura total o en forma parcial (sobre las bandas del cultivo) por lo que se adapta a diferentes tecnologías de aplicación. Así. su operatividad potencial se ve restringida debido a la diversidad de la flora de malezas generalmente presente. Existen algunos herbicidas postemergentes cuya movilidad es reducida o nula. Las principales ventajas son su rápida acción.). ya que controla malezas de hoja ancha o latifoliadas.tener el agente controlador. previo a la implantación del cultivo. acuíferos y alimentos. Se puede definir como modo de acción de un herbicida a la secuencia de eventos que ocurren en la planta desde que la sustancia herbicida es absorbida hasta la ocurrencia de la muerte del vegetal. o pueden ejercer su acción desde el suelo. etc. Así. ejerciendo su acción solamente en las áreas que alcanza cuando es pulverizado. denominándose entonces preemergentes. por ejemplo.4-D pierde su selectividad en el cultivo de trigo cuando se lo aplica fuera del estadio de macollaje del cultivo (período en que emite tallos secundarios) y también cuando se aplica en dosis superiores a las recomendadas. A su vez. d) El control químico constituye en la actualidad la estrategia más difundida en el manejo de malezas. se define como mecanismo de acción a la interferencia bioquímica o biofísica primaria impuesta por la presencia de moléculas del herbicida que conduce al efecto letal en el vegetal. Estos herbicidas se denominan de contacto.4-D (ácido 2. De esta forma. a situaciones donde una especie de maleza constituye el problema dominante. existen herbicidas selectivos o específicos. Sin embargo. maíz. herbicida desecante de contacto que ejerce su acción sólo sobre el sistema aéreo de la planta.4-dicloro-fenoxi-acético) es un herbicida selectivo para cultivos de cereales o gramíneas en general (trigo. Reemplazan las tareas de labranza tradicional y constituyen la herramienta fundamental de manejo en los cultivos resistentes a herbicidas. como se verá más adelante. Efectivamente. afectar organismos benéficos. su versatilidad y adaptación a diferentes equipos de aplicación y sistemas de cultivo y su potencialidad de aplicación en grandes extensiones. conduciendo al reemplazo de malezas susceptibles por tolerantes y. sin afectar el sistema subterráneo del vegetal. causar cambios en las comunidades de malezas. Un ejemplo lo constituye el paraquat. el 2. el aislamiento y comercialización de organismos de control biológico específicos frente a un amplio espectro de malezas determina que esta táctica se adapte. 3 Características de los herbicidas y su modo de acción Los herbicidas son sustancias químicas que ocasionan la muerte de plantas o que inhiben su normal crecimiento. que se utilizan generalmente en los barbechos. disminuir la biodiversidad. desencadenar problemas de resistencia. Algunas plantas son capaces de desactivar o degradar rápidamen- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 345 . transportarse hacia el sitio de acción sin ser desactivado y alcanzar niveles tóxicos en el sitio de acción biológica. el 2. pueden contaminar suelos.

que los acondicionan para su mejor desempeño biológico. coadyuvantes. que nunca había sido aplicado antes. Para ello se han diseñado equipos de aplicación muy precisos y la industria química ha perfeccionado la formulación de los principios activos con el agregado de distintos vehículos. El maíz. Este fenómeno se observa frecuentemente con herbicidas que pertenecen a una misma familia y que pueden tener o no el mismo sitio de acción. etc. y M. trigo.se vuelven mayoritarios. Por ejemplo. IRIGOYEN. Estos compuestos protectores actúan únicamente sobre el cultivo.R. como por ejemplo el trigo o el maíz.te a un determinado herbicida. Así. El desarrollo de esta tecnología se inició con la aparición del NA (1. 4 Resistencia de las malezas a los herbicidas El desarrollo de resistencia a herbicidas en malezas es un proceso evolutivo. o sea la dosis normalmente utilizada a campo para el control de malezas.. un biotipo que desarrolló resistencia a un herbicida A es tratado con un her- 346 SABBATINI. La resistencia de malezas a herbicidas es un proceso por el cual. Una de las vías de desarrollo del control químico es el continuo mejoramiento de técnicas de aplicación de los herbicidas. debe destacarse el importante avance en el uso de protectores de herbicidas. convirtiéndose la población en resistente. sorgo y otros cereales. Algunas plantas (ya sean cultivadas o malezas) son «naturalmente» resistentes a algunos herbicidas aplicados en la dosis agronómica. El reiterado uso de herbicidas en un mismo predio hace que la presión de selección actúe como un filtro que elimina a las plantas susceptibles.. se daría resistencia cruzada cuando luego de un intenso empleo del herbicida A en un lote se encuentra que los biotipos resistentes a este herbicida lo son también a un herbicida B. Se dice que existe resistencia cruzada cuando un biotipo ha desarrollado uno o varios mecanismos de resistencia a un herbicida que le permite ser también resistente a otros herbicidas.H. En la actualidad existe más de una decena de protectores disponibles para uso comercial en cultivos de maíz. dejando que sobrevivan sólo las resistentes. arroz. para uso en tratamientos de semillas de maíz con el objeto de protegerlo de los daños ocasionados por los herbicidas tiocarbamatos y actualmente se encuentran registrados protectores para un gran número de herbicidas disponibles en el mercado. donde ejercerá su efecto letal. Un protector de herbicidas es un compuesto que protege a las plantas de un cultivo de los daños de una sustancia herbicida dirigida al control de malezas. actualmente se comercializan aproximadamente 100 ingredientes activos. es tolerante a los herbicidas de la familia de las triazinas debido a que puede conjugar o enlazar dichas sustancias tóxicas con compuestos químicos naturales dentro de la planta de maíz. Para ejemplificar lo anterior. patentado en 1971. La resistencia múltiple se refiere a biotipos que evolutivamente han desarrollado resistencia a varios herbicidas por procesos diferentes de selección. J. M. por ejemplo. para que una sustancia alcance su máxima potencialidad biológica debe garantizarse su traslado desde el equipo aplicador hasta el sitio de acción en el vegetal.N. diluyentes. a través de una alta intensidad de selección. logrando sobrevivir a su efecto tóxico. escasos biotipos resistentes -presentes en una población susceptible. reduciendo la habilidad de las sustancias herbicidas para alcanzar o interferir el sitio de acción donde actúan. Lo anterior implica que no hubo selección o manipulación genética para hacer tolerante a la especie. que a su vez pueden asociarse de acuerdo con su mecanismo de acción (Tabla 1). mal denominados antídotos. El alcance de estos protectores ha permitido que herbicidas de acción específica sobre malezas de la familia de las gramíneas puedan ser utilizados selectivamente en cultivos de gramíneas. VERNAVÁ . Se define como resistencia a herbicidas a la habilidad hereditaria de una población de malezas de sobrevivir y reproducirse luego de ser expuesta a una dosis de herbicida a la cual era originalmente susceptible.8-naftalen-anhídrico). Se asume que la existencia o no de resistencia en una maleza se limita a la «dosis agronómica». Existe un gran número de herbicidas en el mercado. agrupados en familias de herbicidas. En los últimos años. En la Argentina. característica denominada tolerancia a herbicidas.

frecuentemente utilizadas en el control de malezas en la República Argentina y su riesgo potencial de ocasionar resistencia en las especies de malezas controladas. por lo cual ahora es resistente a ambos herbicidas. hacia el cual es inicialmente susceptible. bicida B. Los mecanismos más comunes de resistencia son: (i) Modificaciones en los sitios de acción. Cuando el herbicida actúa sobre un solo sitio de acción.Tabla 1. o sea en los sitios bioquímicos dentro de la planta con los cuales el herbicida interactúa directamente. este tipo de mecanismo normalmente deriva en una resistencia completa. es decir que el biotipo resistente no manifestará ningún síntoma como consecuencia de la aplicación del herbicida. Mecanismo y sitio de acción de las principales familias de herbicidas. luego de un tiempo de intenso uso del herbicida B la población se torna resistente a éste. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 347 .

las mutaciones que confieren resistencia al afectar la proteína D1 quinona del fotosistema II (por ejemplo las triazinas) se heredan recesivamente y ocurren en el genoma de los cloroplastos. especialmente en cultivos extensivos como trigo. seguido por Australia y Canadá. generalmente la resistencia es parcial (no completa). por ejemplo) aparecen con una frecuencia de uno en un millón. Entre los factores que conducen a acelerar el proceso de resistencia se encuentran: a) Frecuencia inicial de mutaciones en el pool génico: las mutaciones siempre ocurren. ya que permite controlar un amplio espectro de malezas. y como consecuencia de un uso continuo y a gran escala de herbicidas de dicha familia. Se han identificado aproximadamente 260 biotipos de malezas resistentes a herbicidas. referido al proceso bioquímico dentro de la planta que generalmente modifica los herbicidas hacia compuestos menos tóxicos. Varios herbicidas incluidos en dichas familias son intensamente utilizados en la actualidad en la Argentina. Debido a que las mutaciones en los cloroplastos ocurren a frecuencias muy inferiores a las nucleares. Así. las resistentes a triazinas lo hacen entre 7 a 10 años. que incluyen 160 especies diferentes. conduciendo a un control poco efectivo del biotipo resistente. La frecuencia de los genes que confieren a la planta resistencia a varios herbicidas es variable en la naturaleza. por lo que la resistencia representa una amenaza para los agricultores en el corto plazo.N. IRIGOYEN. El desarrollo de cultivos resistentes a herbicidas (CRH) se ha basado principalmente en el uso de este herbicida. aunque en el centro y norte del país se han aislado biotipos de la maleza Amaranthus quitensis («yuyo colorado»). la resistencia a ALS evoluciona más rápidamente que la resistencia a la proteína D1 quinona. Contrariamente. de herbicidas que actúan en un único sitio de acción. El país con mayores casos registrados es Estados Unidos. pero la de malezas a herbicidas fue considerada hasta principios de los ’90 más como una curiosidad que un problema que afecte la producción agrícola. Sin embargo. es de bajo costo y reducido impacto ambiental.(ii) Cambios en el metabolismo de los herbicidas. El grupo de los herbicidas que presentan un riesgo mediano a adquirir resistencia incluye algunos productos muy utilizados en nuestro país. y M. mediano o bajo de desarrollar poblaciones de malezas resistentes. como por ejemplo atrazina.. En la Argentina no se ha informado acerca de regiones severamente afectadas con poblaciones de malezas resistentes. b) Presión de selección: cuanto mayor sea el efecto letal del herbicida sobre el 348 SABBATINI. soja. dominantes. En este caso. se usen o no herbicidas. se heredan a través del núcleo y se comportan fenotípicamente como dominantes en la mayoría de las dosis de aplicación del herbicida. resistentes a herbicidas de la familia de las imidazolinonas. siendo letales la mayoría de los genes mutantes. VERNAVÁ . La Tabla 1 indica con cuáles familias de herbicidas existe un riesgo alto. los alelos que confieren resistencia a los herbicidas con sitio de acción en la enzima ALS (caso de las sulfonilureas. J. la aparición en el mercado agropecuario. La resistencia de insectos a insecticidas es un hecho ampliamente documentado desde mediados del siglo XX. Diferencias en la tasa de metabolización de herbicidas entre malezas y cultivos es la causa principal de selectividad de los cultivos. Por ejemplo. trifluralina y paraquat. respectivamente. herbicida intensamente utilizado en los planos tanto nacional como internacional. girasol y maíz. mientras que las malezas resistentes a sulfonilureas se hacen evidentes a campo en un período medio de tres a cinco años.R. Las familias que en la actualidad ocasionan mayores perjuicios en la agricultura son aquellas cuyo modo de acción se basa en la inhibición de la enzima ALS (acetolactato sintetasa) y ACCasa (acetil coenzima A carboxilasa). condujo a que la resistencia de malezas a herbicidas sea actualmente el tema de mayor interés en el manejo de malezas en todo el mundo.H. Entre los que tienen bajo riesgo a adquirir resistencia se incluye el glifosato. que afectan en las plantas la biosíntesis de aminoácidos y de lípidos. M. Los que no son letales se encuentran en bajas frecuencias porque son competidores débiles frente a los tipos salvajes. entre 1980 y 1990.

Cuanto mayor sea el éxito reproductivo del biotipo resistente. la combinación en lo posible del control químico con métodos mecánicos y/o biológicos de control de malezas. como por ejemplo un aumento en las poblaciones de malezas gramíneas anuales en detrimento de las latifoliadas y una notable disminución de la riqueza florística natural. Además. baja calidad en las aplicaciones. existen casos recientes de malezas que han desarrollado resistencia multigénica. constituyéndose en un claro ejemplo de la teoría Darwiniana de la selección natural. Contrariamente. De esta forma. c) Adaptación del biotipo resistente: si bien en ausencia del herbicida los individuos resistentes poseen en general una capacidad adaptativa menor que los individuos susceptibles. etc. En este último caso la resistencia se desarrolla como consecuencia de muchas y diferentes mutaciones en los alelos. mayor será su potencial para dominar en la población. Si bien en estos últimos años se ha acrecentado la importancia de la resistencia monogénica. Este tipo de resistencia se ha encontrado recientemente en Lolium rigidum en Australia al aplicarse en forma reiterada el herbicida diclofop-metil y se produce como consecuencia del mal uso del herbicida (bajas dosis. actualmente muchas especies de malezas presentan morfología muy similar a la de los cultivos. derivada de herbicidas que actúan en un solo sitio de acción. La evolución de las malezas dentro de los hábitat creados por el hombre fue lograda por diferentes vías: a partir de formas silvestres colonizadoras que se adaptaron al disturbio continuo del ambiente debido a las actividades del hombre. Retomando el ejemplo anterior. cuya acumulación en la población por repetida selección confiere cada vez mayores niveles de resistencia. y. La reciente introducción del sistema de siembra directa en la pampa húmeda de la Argentina es un buen ejemplo de cómo modificaciones introducidas en el ambiente se traducen en cambios en la comunidad de malezas. lo que implica una rápida vuelta a la situación previa (es decir. aunque menos frecuente. existe una notable variación de acuerdo con el herbicida. los biotipos resistentes a las triazinas se adaptan bastante menos al ambiente que los biotipos susceptibles. con larga acción residual en el suelo. Como consecuencia. Asimismo. en pocos años se han producido cambios importantes en predios cultivados con soja. el tamaño del banco de semillas será crucial para retardar la aparición de resistencia al «diluir» las semillas resistentes entre las semillas producidas por las plantas susceptibles. más rápido será el proceso. su desarrollo es prácticamente inevitable. mayoría de biotipos susceptibles en la población) una vez que el herbicida deja de aplicarse. La siembra directa es un tipo de labranza conservacionista que acumula residuos de cosecha en superficie e implica una menor remoción del suelo que el sistema de labranza convencional. lo que implica un problema mucho más prolongado en los cultivos enmalezados. especialmente cuando la dosis es gradualmente incrementada. herbicidas adulterados. a partir de cultivos que se convirtieron en malezas. las diferencias de adaptación entre biotipos resistentes y susceptibles a las sulfonilureas son mínimas. como consecuencia de la hibridación natural entre formas silvestres y cultivadas.biotipo susceptible y mayor la supervivencia de los biotipos resistentes. la rotación y mezcla de herbicidas con diferentes sitios de acción y la rotación de cultivos de verano e invierno. la presión de selección será máxima con herbicidas persistentes.). mimetizándose con ellos de tal manera que en muchas ocasiones plantas cultivadas y malezas presen- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 349 . Como estrategia general para demorar la aparición de resistencia podría recomendarse el empleo de los herbicidas en las situaciones en las que sea estrictamente necesario. De lo expuesto se desprende que el tema de la resistencia de las malezas a los herbicidas es realmente complejo y si bien la resis- tencia puede ser demorada. 5 La biotecnología y su inserción en el manejo de malezas Las malezas han ido adaptándose a los cambios impuestos por el hombre desde los inicios de la agricultura. que permitirán ampliar el espectro de malezas controladas y las medidas de control utilizadas.

Sin embargo.H. el gen incorporado codifica una enzima (fosfinotricin-N-acetil transferasa) que es la responsable de convertir al glufosinato en un metabolito inocuo para maíz.N.. Posteriormente. en este caso particular. 1). El accionar del hombre ha acelerado este proceso de transferencia genética. que crece junto a malezas del mismo género. cultivos trans- Figura 1: Soja «RR»(surcos a derecha e izquierda) y convencional (surco central) en ensayos de eficacia de aplicación de herbicida a base de glifosato. ha sido clave en la evolución de las malezas. En este último ejemplo. resistente al herbicida imazapir (Clearsol®). Esto implica un riesgo potencial por la posible hibridación entre ambas.R. herbicida no selectivo conocido comercialmente como Liberty®. El desarrollo de cultivos resistentes a herbicidas (CRH) es otra de las vías que contribuyó en el avance del control químico de las malezas. Un ejemplo del primer proceso es la obtención de CRH de la familia de las imidazolinonas como el girasol Clearfield®. que determinaron la creación de nuevos nichos para la sobrevivencia. El flujo génico. VERNAVÁ . principalmente como consecuencia de la aproximación de especies distantes geográficamente y de las modificaciones producidas en el hábitat. generando el híbrido de maíz RR (maíz Roundup Ready®). génicos. debido a que ha generado una nueva estrategia de manejo. también resistente a glifosato.tan los mismos requerimientos fisiológicos y nutricionales. muchas malezas consideradas como altamente nocivas no son necesariamente las más exitosas desde el punto de vista evolutivo. M. dicho gen también fue introducido en el maíz. productos de hibridación. como por ejemplo Brassica campestris. persistencia y diseminación de nuevos genotipos. Cultivos resistentes obtenidos por las dos vías mencionadas se emplean comercialmente en la Argentina. J. La selección de esta variedad se produjo en Kansas. Un CRH es una variedad o biotipo de un cultivo que es resistente a la acción de un herbicida que normalmente resulta letal para las variedades tradicionales del mismo cultivo. La obtención de CRH ha sido lograda a través de procesos de selección o a través de la inserción de genes en el genoma del vegetal que le confieren la propiedad de alterar o bloquear el sitio de acción donde actúa el herbicida. El segundo proceso implica la obtención de organismos genéticamente modificados. donde los girasoles con tolerancia al herbicida fueron descubiertos bajo condiciones naturales del cultivo. Este proceso de transferencia génica dio como resultado la obtención de la denominada soja RR (soja Roundup Ready®) resistente a la acción herbicida del glifosato (Fig. Su carácter nocivo está asociado a una dificultad para su manejo o control y a una fuerte tendencia a deprimir el crecimiento y la producción de los cultivos. y M. que codifica para un producto que inhibe la actividad de la enzima EPSP sintetasa (Tabla 1). en sus variadas formas. resistente a glufosinato de amonio. Un ejemplo lo constituye la colza cultivada (Brassica napus). En este cultivo se ha obtenido también la variedad Liberty Link®. Un ejemplo lo constituye la obtención de resistencia al glifosato por la transferencia de un gen. El desarrollo de CRH ha generado un impacto económico y biológico de magnitud sobre la producción agrícola. Estados Unidos. desde una especie de Agrobacterium al genoma de la soja. pudiéndose 350 SABBATINI. IRIGOYEN.

por polinización cruzada. La producción de plantas transgénicas acelera en ciertos aspectos la evolución de las malezas. que permiten el control de un extenso espectro de malezas. Ejemplos de cultivos considerados con riesgo de hibridarse con malezas cercanas son: el sorgo cultivado (Sorghum saccharatum) con la maleza «sorgo de alepo» ( Sorghum halepense) y el girasol (Helianthus annus) con el «girasol silvestre» (Helianthus petiolaris). . . ya que disminuyen la diversidad genética de la comunidad (erosión genética). Un ejemplo de ello es la prolongación del período crítico para la aplicación del herbicida en comparación al de los herbicidas selectivos frecuentemente empleados en cultivos no resistentes. Si bien tanto el glifosato como el glufosinato de amonio tienen bajo riesgo de seleccionar biotipos de malezas resistentes (Tabla 1). ya que tanto el glifosato como el glufosinato de amonio evitan el empleo de otros herbicidas de alto riesgo. tanto anuales como perennes. existen casos probados en el mundo de la aparición de resistencia.Las malezas controladas tienen bajo riesgo de adquirir resistencia. dada su alta tolerancia a estos herbicidas y al no uso de otros herbicidas normalmente utilizados en cultivos no resistentes. las especies naturalmente tolerantes encuentran nuevos nichos para su crecimiento y desarrollo y por lo tanto incrementan su frecuencia y abundancia. no es raro en la naturaleza y la probabilidad resulta mayor para las especies emparentadas. No obstante. ellos son: . . así como cambios en las poblaciones de malezas por el incremento de especies naturalmente tolerantes al herbicida. El problema grave radica en su resistencia al herbicida empleado para el control. como glifosato y glufosinato de amonio. ya que la hibridación representa un riesgo potencial de transferencia de la resistencia a herbicidas desde el cultivo hacia la maleza. Un ejemplo de esto último lo constituye la maleza «iresine» (Iresine difusa) informada por el INTA Oliveros como tolerante a glifosato y que surge como un nuevo problema en esta zona. y además baja toxicidad para el hombre y animales. por lo que presentan escasas restricciones para la rotación de cultivos. que pueden ocasionar fitotoxicidad.Un menor costo.10 %) de algunas variedades o híbridos de CRH Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 351 . en el que dicho período suele ser muy limitado. existen riesgos o amenazas potenciales que es importante considerar en el momento de decidir acerca del uso de los CRH. previas o durante el ciclo de crecimiento del cultivo. El uso de este cultivo resistente permite realizar tres o cuatro aplicaciones por año del herbicida.Simplifican y flexibilizan el manejo del cultivo.La aparición de las denominadas «supermalezas» por la transferencia de los genes de resistencia desde los CRH a sus especies salvajes emparentadas a través del polen.destacar los siguientes beneficios: .Los herbicidas utilizados tienen baja residualidad en suelos y aguas. La aparición de CRH ‘voluntarios’ en un predio donde no fueron sembrados y que. ya que se utilizan herbicidas no selectivos. . se comportan como una maleza.Amplían el espectro de malezas controladas. . La tecnología asociada a los CRH no requiere de un entrenamiento especial por parte del productor y asimismo facilitan algunas de las prácticas relacionadas con el cultivo. El fenómeno de hibridación.Reducción en el rendimiento (5 . debido al bajo precio de los herbicidas empleados y a la reducción en el número de labores culturales y mecánicas. por lo tanto. como por ejemplo los inhibidores de ALS (Tabla 1). lo cual elimina casi por completo la competencia de las malezas.La aparición de especies de malezas resistentes como consecuencia del uso conti- nuo y repetido de un mismo herbicida.El uso de CRH y de los herbicidas asociados a ellos implica un impacto significativo sobre la composición florística de las malezas. Una prueba de las ventajas de esta técnica la constituye el hecho de que el 92% de la totalidad de soja cultivada en la Argentina corresponde a soja RR. Asimismo. .Reducen los daños al cultivo. Aquí es importante destacar que la transferencia horizontal de genes entre organismos taxonómicamente muy distantes es poco frecuente en la naturaleza pero muy relevante en términos evolutivos. . .

un 5 % de la superficie total y son maíz tolerante a herbicidas e insectos (3.Riesgos ambientales por la persistencia de algunos de los herbicidas utilizados. ya que debemos enfatizar que todas estas técnicas son sólo herramientas de las que puede valerse el hombre en su afán y esfuerzo para controlar las malezas y que no existe una única y fácil solución. Argentina no ha tenido ninguna dificultad de acceso a los mercados de destino para sus exportaciones de soja transgénica y a pesar de las percepciones negativas de algunos consumidores. utilizando todas las tácticas y estrategias de control (técnicas adecuadas y conocimientos existentes) con el objeto de reducir una población de plantas indeseables a niveles tales que los perjuicios económicos producidos se hallen por debajo de un umbral económico aceptable para el sistema general de producción. siendo los CRH la más importante.6 millones de has (4%) y el algodón tolerante a herbicidas 1.3 millones de has (13 % del área total).7 millones de has. Le sigue el maíz Bt con 12. Tanto la teoría ecológica como la experiencia práctica acumulada durante más de 50 años de intentar disminuir los daños ocasionados por las plagas indican que una única herramienta de control (por ejemplo los CRH) es una solución sólo temporal para el problema de las malezas. lo que representa el 61 % del área total ocupada por cultivos transgénicos que comprende 67. México. . que pueden acumularse en el ambiente y afectar la productividad y sustentabilidad del sistema agrícola. .4 millones de has en el mundo. Canadá y Estados Unidos.R. Un programa de Manejo Integrado de Malezas es un sistema de manejo que enfoca el problema de las malezas de una manera compatible con la preservación de la calidad del ambiente. 352 SABBATINI. los diferenciales de precios entre la soja convencional y transgénica en el mercado mundial no penalizan a esta última. El tercer cultivo de mayor importancia es la canola tolerante a herbicidas. Este programa puede involucrar. genéticos y biológicos juntamente con medidas preventivas y estudios básicos sobre la biología y ecología de malezas. ya que no consiste simplemente en la aplicación de una o dos medidas de control sino que abarca estrategias de control provenientes de varias disciplinas así como también involucra el entrenamiento de técnicos y la extensión a los productores. tolerante a herbicidas e insectos.H. en muchos casos. .La contaminación de cultivos por flujo génico. sería un grave error suponer que esta técnica permitirá anular el problema de las malezas en el futuro. Si consideramos los principales cultivos transgénicos en el mundo encontramos que en la actualidad la soja transgénica resistente a herbicidas es el mayoritario en 7 países (Estados Unidos. Rumania. Esto ha sido informado en algunos casos puntuales. 6 Manejo Integrado de Malezas: única solución sustentable Debido a que las malezas continuarán adaptándose a las diferentes metodologías de control. Un manejo integrado de malezas. IRIGOYEN. Sin embargo. La biotecnología ha realizado un valioso aporte al suministrar nuevas herramientas para el control de malezas. Otros tres cultivos ocupan.. químicos. J. especialmente los orgánicos. Hasta el momento. es la única solución en el marco de un manejo sustentable del sistema productivo.1 millones de has).5 millón (2%). M.Riesgo de reducción en la exportación de productos de origen transgénico como consecuencia del sentimiento antibiotecnología que existe en los consumidores de varios países de Europa.como consecuencia fundamentalmente de la adición de genes extraños. en el que múltiples estrategias son implementadas de una manera racional. como por ejemplo los pertenecientes a la familia de las imidazolinonas. Uruguay y Sudáfrica). y M. métodos de control físicos. ocupa 2. Canadá.N. Es un sistema interdisciplinario. ocupando una superficie de 41. los agricultores siempre necesitarán de nuevas tácticas y estrategias. cada uno.6 millones de has (5 % del área total) y se siembra en dos países. maíz tolerante a herbicidas (3.2 millones de has). mecánicos. VERNAVÁ . que se encuentran en predios aledaños mediante la polinización cruzada desde los cultivos transgénicos a los no transgénicos. por lo que no es sorprendente que prácticamente toda la soja cultivada en el país sea transgénica. El algodón. Argentina.2 millones de has) y algodón Bt (3. con 3.

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11). el precio del arroz incrementaría en un 40%. Para alimentar a una población futura de plantas resistentes a sequía. que al menos diez de incremento de un 12 % en la cantidad de tierra cultivables. el agua y los consume el 70 % de toda el agua utilizada nutrientes son factores del medio ambiente por el hombre. Andrea F. como por ejemplo. Se estima que sinérgicos (Bohnert y col. 2). Estas dos últimas estrategias también reducen el riesla densidad demográfica esperada. uno de Los genes inducidos bajo condiciones de los recursos más limitantes para el futuro. Los estreses ambientales provocan en las plantas respuestas complejas y constituyen un problema fundamental para la agricultura.. La distribución de las implementación de prácticas agrícolas que plantas sobre la tierra depende.gico contra insectos (ver VIII.. codifican nuyendo a medida que los consumos han ido proteínas que tienen funciones de señalizaaumentado con el crecimiento de la humanición. Las estreses abióticos. de la existencia e intensidad de estos fac. transducción de señales y protección dad y las prácticas agrícolas (Fig. se requeriría de un citogenéticos. go de contaminación de las fuentes de agua potable disponibles Levitt (1980) define a los estreses ambientales como cambios en las condiciones del medio que reducen o cambian desfavorablemente el crecimiento o desarrollo de las plantas. 1995). 1: La cantidad de tierra destinada a la agricultura. ya que influyen sobre la supervivencia y la productividad de los cultivos. Florencia más de la producción actual de Estados Unidos. tales como las bajas temreservas de agua del planeta han ido dismiperaturas.tiendan a reducir el consumo. Gentileza los veintiún pares cromosómicos en Prof. resulta obvio que la mejor que afectan el crecimiento y el desarrollo de forma de ahorrar agua es a través de la las especies vegetales. lo cual será imposible dada tolerantes a herbicidas (ver VIII. controlados por un importante número de Fig. 1980) y son caracteres de variación continua («cuantitativos»). Se para alimentar a una población futura de 8 billones de habitantes. lo cual representa un poco Puebla. 1). por ejemplo. Germán Spangenberg. en estudios con las tecnologías actualmente en uso. Estas respuestas se manifiestan a nivel celular. consumidora de agua en el mundo. el trigo están comprometidos en la respuesta a las bajas temperaturas (Sutka y Por otro lado la agricultura es la principal Vesz. otra es la disde 8 billones de habitantes con las prácticas minución en el uso de insecticidas mediante agrícolas actuales se requeriría de un incre. 1988). Un inforcelular. Dado que la agricultura La radiación.la utilización de estrategias de control biolómento del 12 % en la cantidad de tierras cul. ha visto. proteínas constime reciente de IIPRI (2002) «Global Water tuyentes de canales de agua que alteran el Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 355 .10) y plantas tivables (Fig.VIII. el del trigo en un 1 Introducción 80% y el del maíz en un 120 % si se considera la demanda actual. Del Viso. Como resultado. cabría esperar para el 2025 una reducción de 350 Tolerancia a factores abióticos millones de toneladas métricas en la producción de granos. fisiológico y del desarrollo (Levitt. la temperatura.la reducción del riego mediante la creación tores. Una forma es to. la salinidad y la sequía. calculada en genes aditivos y probablemente acres/persona ha ido disminuyendo paulativamente.-Capítulo 12 Outlook to 2005: an impending crisis» predice que si la crisis del agua continúa. por lo tan.

la hormona rela.indica que los receptores con características de proteín-kinasas y las histidin-kinasas de dos componentes serían buenos candidatos para cumplir la función de sensores potenciales de estas señales de estrés (Xiong y Zhu.La concentración intracelular de Ca2+ se encionada al estrés). prolina y betaína). en una respuesta regulatoria que se acopla a una cascada de2 Señales para la respuesta a estreses pendiente de MAP kinasas ( Mitogen abióticos activated). o de ABA (ácido abscísico. chaperonas. cripción nucleares. desaturasas (como las respuestas a inositol-P y Ca 2+) cuanlipídicas para modificar la composición de las do las plantas son expuestas a un estrés membranas celulares. Receptores tipo proteínkinasas (RTK): se encuentran tanto en animales como en plantas y están estructuralmente compuestos por un dominio extracelular. enzimas requeridas tas kinasas deberían ser constitutivas.. Las RTK de plantas son tamhan ido aumentado con el crecimiento de la humanidad y las prácticas bién responsables de respuestas agrícolas. siendo la agricultura la principal consumidora de agua en el mundo. a patógenos estando además involucradas en el desarrollo. Suzuki y col. por un dominio transmembrana y por un dominio kinasa intraceFig.(Murata y Los. Espotencial agua celular.1 Segundos mensajeros Una forma común de señal de iniciación es la fosforilación de proteínas acoplada a Numerosos estudios sugieren que el Ca2+ receptores. o por fosforilación directa de blancos específicos que inician la respuesta celuLa hipótesis de señalización actual postu. 2001).lar. a un aspartato aceptor.. proteínas protectoras (Hong y col. proteínas anticonge. Örvar y col. 2000). de los receptores de respuesta al frío. Gentileza Prof. Sangwan y col. 200. 1997.. 2. en muchos casos. Aunque todavía no se han de. que funciona por unión a un ligando o por interacción proteína-proteína. sequía 1999. Se ha demostrado que. en cianobacterias. 1997). la que las señales ambientales son percibidas la fluidez de la membrana podría actuar como primero por receptores específicos.. como las de tipo LEA («Late Embryogenesis Sistema de dos componentes tipo Abundant» o proteínas abundantes en la histidin-kinasas: en estos sistemas cuando el embriogénesis tardía). 2001). DEL VISO.sensor extracelular percibe la señal. Andrea F. una lantes. activan factores de trans. consipara la síntesis de sustancias protectoras derando las rápidas respuestas celulares (azúcares. que con el primer sensor para las bajas temperaturas su activación inician o suprimen una cascada y es el disparador de histidin-kinasas que mode transducción de señales intracelulares dulan la expresión de genes de desaturasas y. Los consumos lular. proteasas y enzimas histidina del dominio citoplasmático se detoxificantes como la catalasa y la ascorbato autofosforila y el residuo fosfato es pasado peroxidasa. el conocimiento reciente cuentra firmemente controlada: el Ca 2+ de una vía de señalización de estrés salino citosólico se encuentra en bajas concentra- 356 PUEBLA.forma parte de varios procesos de señalizaterminado con certeza en plantas ninguno ción intracelular (revisión de Sanders y col.. Germán Spangengenberg. 2: Las reservas de agua del planeta son limitadas.. Florencia . que inducen la expresión de grupos específicos de genes.

El Ca 2+ intracelular puede liberarse a través de canales sensibles a mensajeros ligandos o a segundos mensajeros. Los primeros son inducidos en pocos minutos y a menudo transitoriamente. En contraste. 3). ya que estos componentes de señalización serían constitutivos. La vía II involucra la producción de diferentes tipos de proteínas (tipo LEA y otras) y está mediada por CDPK. Sequía y Salinidad). entre los que se incluyen a los inositol polifosfatos y la ADP-ribosa cíclica (cADPR) (Fig. No se detallan las moléculas de señalización o segundos mensajeros. El Ca2+ extracelular puede entrar en la célula por cambios de voltaje. específica del estrés iónico. aunque luego de la estimulación se libera de las reservas intracelulares o entra en la célula a través de varios canales. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 357 . La vía III involucra a la vía SOS.ciones. La vía I de señalización involucra la producción de antioxidantes y osmolitos involucrando la transducción de señales a través de MAP kinasas. que constituyen la vasta mayoría de los genes inducidos por estrés (Figura 3). 3 Inducción de genes en respuesta al estrés Los genes inducidos por estrés incluyen genes de respuesta temprana y genes de respuesta tardía. o a través de canales específicos. Los genes tempranos codifican factores de transcripción que activan a los genes de respuesta tardía. Figura 3: Vías principales de señalización en plantas en respuesta a estreses abióticos (Frío. Su inducción no requiere de síntesis de nuevas proteínas. operado por receptores. los genes de respuestas tardías son activados más lentamente (en horas) y su expresión es generalmente sostenida durante el tiempo en que el estrés se encuentra actuando.

1 Tolerancia a las bajas temperaturas Las especies vegetales adaptadas a regiones templadas del planeta varían durante transcurso del año en su habilidad para sobrevivir a las bajas temperaturas. por las diferencias en este locus (Storlie y col... 2002b). 2001. 1994. En sorgo se construyeron varios mapas de ligamiento utilizando RFLP y otros marcadores moleculares (Xu y col... 1995)... de temperaturas de congelamiento (Thomashow. Andrea F. 1997.. mientras que una región del cromosoma 7 es crucial en la tolerancia a la sequía (Cattivelli y col... Las plantas capaces de aclimatarse al frío perciben las bajas temperaturas sobre cero durante el avance del invierno y disparan procesos bioquímicos específicos que resultan en la tolerancia. facilitando así la construcción de los microarreglos y el análisis de las secuencias obtenidas. 358 PUEBLA.. y son más tolerantes a las bajas temperaturas que las variedades de primavera que poseen el alelo Vrn1. Se demostró que el grupo de cromosomas 5 en trigo contiene la concentración más alta de loci que controlan la adaptación de la planta al ambiente. sequía. 2001. La mayor parte de estos estudios se realizaron en Arabidopsis debido al hecho. Utilizando tanto macro como microarreglos de ADN (Lin y col. de variación continua.. la tolerancia a estreses ambientales no depende de un único gen sino que es un carácter poligénico. los cuales están directamente involucrados en la respuesta a la vernalización en el trigo diploide (Triticum monoccocum) (Law y col. aumentando así las posibilidades de mejoras genéticas en los cultivos. 1999). 2002). 2000). que tiene un importante efecto en la tolerancia a las heladas (Galiba y col. Kawasaki y col. Los resultados de estos trabajos indicarían la existencia de una mayor intersección entre las vías de señalización de ABA. en algunos casos. Seki y col. 2002b.. 2000) y se identifica- ron también varios QTLs con efectos significativos en la tolerancia a la sequía (Tunistra y col. aún. 1998: Tranquilli y col. entre otros factores. Como se mencionó anteriormente. Estos nuevos conocimientos posibilitarán modificar la forma de seleccionar en el mejoramiento de cultivos importantes. También se demostró que las diferencias en la tolerancia a las bajas temperaturas encontradas entre distintas variedades de invierno pueden ser explicadas. Recientemente se construyeron mapas que contienen los determinantes que afectan la tolerancia a estreses abióticos en las Triticeae (Cattivelli y col.. Kong y col. VRN1 y VRN2 presentes en este intervalo. 2003) se estudiaron genes inducidos o suprimidos en condiciones de estrés abiótico (frío. 2002a.. 2003. A partir de estos estudios también se identificaron numerosos genes que son inducidos por uno solo de los tratamientos. los cuales se clasificaron como específicos de cada respuesta. QTL.. DEL VISO. Vrn-Fr1.. Florencia . Las variedades de invierno poseen el alelo vrn1. para el estudio de perfiles generales de expresión tejido-específico ante distintas condiciones de estrés abiótico y también para la identificación de genes y potenciales elementos en cis de factores de transcripción. 1998)..4 Genómica de la tolerancia a estreses ambientales Los recientes avances en el estudio molecular y genético de las respuestas a estreses abióticos llevaron a la identificación de un gran número de loci cualitativos únicos. yendo desde estudios de un solo gen a estudios que abarcan todo el genoma. particularmente los relacionados con la tolerancia a las heladas y a la salinidad. Oono y col. 1975. Dubcovsky y col. salinidad). Actualmente se conocen dos genes. y genes relacionados con la tolerancia a estreses abióticos. de que su genoma ha sido completamente secuenciado. 2002). desde una selección fenotípica a una genotípica (a través de selección asistida por marcadores). 4. Los resultados obtenidos hasta el momento permiten sugerir que la tecnología de microarreglos será de mucha utilidad para el aislamiento de nuevos genes. Se identificó un locus en el cromosoma 5A de trigo. 1997). genética directa y reversa) produjeron una revolución en el análisis genético de las especies y permitieron cambiar el enfoque en el análisis. Las nuevas tecnologías para el análisis genómico (microarreglos de ADN. sequía y salinidad. comparada con las vías en común entre ABA y frío (Seki y col. Taramino y col.

de función desconocida. Anchordoguy y col. Sin embargo. muchos genes inducidos durante la aclimatación a bajas temperaturas codifican proteínas de función desconocida. El incremento en el contenido de estos polímeros parece estar relacionado al proceso de aclimatación a las bajas temperaturas (Pontis. fue posible estudiar la función de estos azúcares en la tolerancia a frío (Puebla y col. Arabidopsis. por ejemplo. También se conocen genes de chaperonas en espinaca y Brassica napus que responden a las bajas temperaturas y genes regulados por frío que intervienen en la transducción de señales (Fig. Tognetti y col. Santoiani y col. Muchas de éstas presentan homología con las proteínas LEA. las transiciones de los lípidos de membrana (de laminares a fase hexagonal II) y las lesiones por fracturas.. incluyendo alfalfa. ya mencionadas. Los mecanismos que contribuyen a la tolerancia incluyen la prevención de la desnaturalización de proteínas inducida por bajas temperaturas. 1989. el gen de Arabidopsis FAD8 codifica una desaturasa de ácidos grasos que alteraría la composición lipídica de las membranas. Estas moléculas demostraron proteger in vitro a las membranas durante el congelamiento (Strauss y Hauser. donde las bajas temperaturas imperan en la mayoría de los días del año (la temperatura media en julio es de 1. polímeros de fructosa. Puebla y col... Los polipéptidos LEA son sintetizados en la semilla durante la embriogénesis tardía antes de la desecación y también en plántulas.9ºC) y las precipitaciones promedio sólo llegan a los 168 mm anuales. 1999b). la prevención de la precipitación de moléculas y la atenuación de las consecuencias de la formación de hielo intercelular. 3). es una especie distribuida en las estepas áridas de la meseta patagónica. 1993. Una gran parte de estos genes codifican proteínas de función conocida.1999a). Por ejemplo. Otras proteínas. Entre estos daños se incluyen la lisis celular inducida por expansión. 1987). cuando las plantas son tratadas con bajas temperaturas. Los mecanismos involucrados en la estabilización de las membranas celulares en respuesta al frío son múltiples. 1986. Los genes que codifican estas enzimas fueron aislados recientemente y. cebada y trigo.1. síntesis de proteínas y varios cambios fisiológicos (Guy.. Steponkus. 1989. parece contribuir a la estabilización de las membranas. En la Argentina existen especies nativas que están adaptadas a ambientes de climas rigu- rosos y son tolerantes a condiciones severas de estrés abióticos. 4. aunque también se ha observado la acumulación de solutos compatibles (moléculas que pueden acumularse en la célula sin modificar el metabolismo central) en células de plantas sometidas tanto a estrés por frío como por sequía. Muchos estudios indican que en las plantas los sistemas de membranas de la célula son los primeros sitios dañados por el congelamiento (Levitt.La aclimatación al frío está asociada a la expresión de novo de genes. Estas proteínas son altamente hidrofílicas. El metabolismo de los fructanos en gramíneas ha sido estudiado en su mayor parte en cereales de importancia agronómica y se lo ha señalado como uno de los mecanismos de tolerancia a bajas temperaturas. 1997. En muchas especies de gramíneas de clima templado se ha observado la acumulación de fructanos. 1984). 1990). a través de la transformación de tejidos heterólogos con los mismos. Los más importantes serían los cambios en la composición de lípidos. 1980. tienen una composición simple de aminoácidos y en muchas se predicen regiones capaces de formar α-hélices anfipáticas.1 Identificación y caracterización de genes de tolerancia a frío Numerosos genes inducibles por bajas temperaturas y sus promotores han sido aislados y caracterizados en varias especies vegetales. que típicamente ocurre en plantas tolerantes durante la aclimatación. cuando las plantas son expuestas a bajas temperaturas sobre cero. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 359 . que contribuyen a la tolerancia a las bajas temperaturas. enzimas responsables de la síntesis de estos azúcares. La acumulación de sacarosa y otros azúcares. que no se encuentran agrupadas con las LEA. en respuesta a la deshidratación. Esta especie contiene elevados niveles de fructanos en sus tejidos y una creciente actividad de fructosil-transferasas.. Bromus pictus.

Estas proteínas también presentan regiones con capacidad para formar α -hélices anfipáticas que podrían tener roles en la estabilización de las membranas durante las bajas temperaturas. no sólo durante la sequía o las altas concentraciones de sales sino también durante condiciones de bajas temperaturas. KIN. La formación de hielo lleva a una rápida concentración de los solutos extracelulares y el cambio de potencial químico y osmótico provoca que el agua líquida se mueva hacia fuera de la célula. Tanto la sequía como la salinidad afectan virtualmente cada aspecto de la fisiología de una planta y su metabolismo. Los resultados sugieren que la tolerancia a bajas temperaturas depende de varios genes de tolerancia y no de un gen particular. Se identificaron poco después activadores transcripcionales que se unen a estos elementos CRT/DRE. bajo promotores constitutivos (35S CaMV). a la sequía y a la salinidad. La señal de homeostasis regula negativamente la respuesta de detoxificación y estas dos inducen la tolerancia al estrés. en su sentido más amplio. Las proteínas que codifican contienen un dominio de unión al ADN tipo AP2/EREBP y están codificadas por genes que se encuentran en tandem sobre el cromosoma 4 de esta especie. no es sorprendente que una gran proporción del genoma esté sujeto a regulación. que regula negativamente la inhibición del crecimiento provocada por la aparición de las condiciones ambientales adversas. también designados LT1. la tolerancia a estrés salino afecta aproximadamente al 8% de los genes de todo el genoma (Posas y col. han sido utilizados para transformar plantas susceptibles a frío y se han realizado estudios de adquisición de tolerancia a estrés con las plantas transgénicas obtenidas. c) El control del crecimiento. DEL VISO. en la levadura unicelular Saccharomyces cerevisiae. La señal de 360 PUEBLA. Andrea F. Por ejemplo. 5 Tolerancia al estrés hídrico La disponibilidad de agua es el factor abiótico más importante que modela la evolución de las plantas.son las codificadas por genes COR («cold resistant» o resistente a frío). El estrés hídrico generalmente inhibe el crecimiento celular y las evidencias indirectas sugieren que existen señales de división celular y expansión relacionadas con las kinasas dependientes de ciclinas (CDPK) (Zhu. Durante la exposición de las plantas a temperaturas de congelamiento la formación de hielo extracelular impone una fuerza deshidratadora a la solución no congelada intracelular. junto al frío.. El estrés hídrico. sin mediar ningún estímulo de frío. La expresión constitutiva de estos activadores transcripcionales bajo el promotor 35S del CaMV en plantas transgénicas de Arabidopsis induce la expresión de múltiples genes regulados por bajas temperaturas que poseen los elementos CRT/DRE. 2000). Los análisis posteriores determinaron que en Arabidopsis existen elementos regulatorios en los promotores de estos genes: las repeticiones C (CRT) en el elemento DRE (elemento que responde a sequía) que estimulan la expresión de genes en respuesta a las bajas temperaturas. b)El control del daño y la reparación o detoxificación. Algunos de estos genes. Las plantas sufren deshidratación o estrés hídrico... de Arabidopsis. La respuesta de las plantas a la alta salinidad se dispara cuando se produce un aumento intracelular de Na+. que incluye homeostasis iónica y la osmótica. incluye tanto a la sequía como a la salinidad. ya que impiden a los cultivos desarrollar su máximo potencial genético. Rep y col. 4.2 Regulación de la respuesta a la aclimatación: el regulón CBF Los estudios iniciales de la expresión de genes regulados por frío establecieron que algunos promotores de estos genes eran activados en respuesta a bajas temperaturas y sequía. Estos estreses. 2002). 2000. como lo demuestran algunos trabajos de microarreglos de ADN. constituyen problemas cruciales para la agricultura. Las respuestas adaptativas al estrés pueden clasificarse de la siguiente manera: a) El control de la homeostasis. RD y ERD. Considerando la complejidad de las respuestas encontradas bajo estos estreses. Florencia .

El clonado y la caracterización bioquímica de varios genes y productos de genes SOS (Salt Overly Sensitive) ha permitido establecer recientemente una vía de señalización para la regulación de la homeostasis iónica y la tolerancia a la salinidad en Arabidopsis. K+ y H+. SOS1 es un cotransportador de sentido contrario («antiporter») Na+/H+ de la membrana plasmática con una larga cola que estaría inmersa en el lado citoplasmático y que podría funcionar como sensor de los solutos que transporta. de chaperonas moleculares y proteasas que remueven las proteínas desnaturalizadas. de antiporters de Na+/H+ para la compartimentalización de Na+ en la vacuola y de transportadores de K+ con alta afinidad para la adquisición de K+. 7 El ácido abscísico (ABA) y la tolerancia a estrés El ABA posee muchas funciones durante el crecimiento y desarrollo de las plantas. La vía contiene tres genes principales llamados SOS1.estrés hídrico incluiría posiblemente un cambio de turgencia que provoca el cierre de los estomas. La señal de detoxificación se dispararía ante la desnaturalización proteica y la presencia de especies reactivas de oxígeno. donde se encuentran ubicados sus transportadores blanco. algunos genes inducibles por estreses abióticos que no responden a esta hormona. Esta vía se dispara por un aumento intra o extracelular de Na + y provoca una señal citoplasmática de calcio que induce la expresión y cambios de actividad de transportadores de iones como el Na+. 2 y 3 (Zhu. un efector de la tolerancia a la salinidad. 2000) (Fig. Aunque nada se sabe de la señalización entre la percepción del estrés y la inducción de los genes de biosíntesis. SOS2 representa una nueva familia de proteín-kinasas sólo encontradas en plantas que contienen un dominio catalítico y otro regulatorio que interactúa con SOS3. pero la principal función es la de regular el balance de agua y la tolerancia a estrés osmótico. 6 La vía SOS (Salt Overly Sensitive o sensible al exceso de salinidad) de tolerancia a la salinidad El estrés salino quiebra la homeostasis iónica de las plantas provocando un exceso tóxico de Na+ en el citoplasma y una deficiencia de iones esenciales como el K+. cambios en la expresión de proteínas tipo LEA/dehidrinas. En girasol fue descripta una familia de factores de transcripción característicos de plan- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 361 . salinidad o estrés por frío y la expresión de genes específicos existen cascadas de señales de transducción dependientes e independientes de ABA. de proteínas relacionadas con la ubiquitinación y de otras proteínas detoxificantes. La acumulación de ABA inducida por estrés osmótico es una combinación de la activación de su síntesis y de la inhibición en su degradación. Los patrones de expresión de los genes inducibles por estreses abióticos son complejos y muchos de ellos son inducidos también por la aplicación exógena de ABA. lo que facilita que ésta y sus proteínas asociadas (tipo SOS2) interactúen con la membrana. Esto sugiere que entre la señal inicial de sequía. SOS3 es una proteína miristoilada. Una proteína que se une a Ca 2+ . los genes de enzimas de biosíntesis de osmolitos. así como la activación de enzimas responsables de la remoción de especies reactivas de oxígeno. la expresión y/o activación de enzimas de síntesis de osmolitos y la de sistemas transportadores de éstos y de agua. codificada por SOS3 percibe presumiblemente esta señal y desencadena la respuesta. de cotransportadores de sentido contrario («antiporters») de Na+/H+ asociados a membrana plasmática para la extrusión de Na+. SOS3 también parece interactuar con proteínas que median la inducción de la biosíntesis de ABA. SOS3 interactúa y activa a SOS2. Los genes involucrados en la homeostasis hídrica incluyen los genes de acuaporinas. que codifica un cotransportador de sentido contrario («antiporter») Na+/H+ de la membrana plasmática. El estrés salino provoca una señal citosólica de Ca 2+. una serin-treonin kinasa y estas dos a su vez regulan la expresión y la actividad de SOS1. 3). sin embargo. el conocimiento actual sugiere que están involucradas señales de Ca 2+ y cascadas de fosforilación de proteínas (Zhu. Existen. La respuesta incluye la hidrólisis de fosfolípidos. 2003).

Florencia . Metabolism of the raffinose family oligosaccharides in leaves of Ajuga reptans L. Pakistán.org/biotech/inventory_admin/dep/default. 1997). Estudios de la expresión de genes inducidos por frío en mutantes de Arabidopsis deficientes en ABA (aba) e insensibles a ABA (abi) demostraron que la expresión de genes de frío se encuentra mediada por vías dependientes e independientes de ABA (Ingam y Bartels. se determinaron muchos de sus mecanismos de acción y se avanzó en el conocimiento de cómo se desencadenan y activan las respuestas de las células vegetales ante estos estreses y sus interrelaciones. 1997). salinidad) en etapa de experimentación o de pruebas experimentales a campo en países en vías de desarrollo. fundamentales para entender cómo las especies vegetales son capaces de adaptarse a un ambiente siempre cambiante. conocida como homeodominio. 1994. 105: 1335-1345 . y CROWE J. muchas de las cuales ya se encuentran en etapa de experimentación a campo (Tabla 1).. que se encuentra en muchos genes de eucariotas que se expresan durante el desarrollo (Valle y col. Lecturas Recomendadas ANCHORDOGUY T. transformación genética de plantas) prometen brindar nuevos descubrimientos. India. Los genes que contienen los elementos CRT/DRE estan relacionados con la vía independiente de ABA. comunicación personal).. Chan y col. Estos genes se expresan en respuesta a ABA. Estas proteínas pueden unirse al ADN debido a la presencia de una secuencia altamente conservada.. sugiriendo que este gen funciona en la cascada de señalización que controla en girasol la respuesta al estrés hídrico mediada por ABA (Gago. BACHMAN M. 1994. sequía. Plantas de Arabidopsis transformadas con este gen mostraron un aumento importante en la tolerancia a estrés hídrico (Chan. 9 Conclusiones finales Tabla 1: Plantas transgénicas conteniendo genes de tolerancia a estreses abióticos (frío.S.. 1987. RUDOLPH A. China. demostrando que las vías regulatorias de frío y las dependientes de ABA se cruzan en algún punto de la señal de transducción (Shinozaki y YamaguchiShinozaki. Tailandia Indonesia Croacia Salinidad Sequía involucradas en el desarrollo temprano de las plántulas y otras que participan en la respuesta a sequía. Algunos de los genes que responden a bajas tempe- Las investigaciones en el campo de la tolerancia a factores ambientales adversos tuvieron un desarrollo importante en la última década.. 8 Plantas transgénicas tolerantes a estreses abióticos En muchos países se investiga activamente la adquisición de tolerancia a factores ambientales adversos en especies agronómicamente importantes transformadas con genes que codifican para proteínas de tolerancia a estreses abióticos. Se identificaron genes y proteínas con roles en la tolerancia a frío. 2002). Modes of interaction of cryoprotectans with membrane phospholipids during freezing. MATILE P.asp) Tolerancia a estreses abióticos Especie Bajas temperaturas Papa Tomate Trigo Arroz Maíz Sorgo Tabaco Trigo Arroz Caña de azúcar Trigo Países Bolivia China India Bangladesh. 362 PUEBLA. – Plant Physiol. CARPENTER J.tas que contienen un homeodominio «leucine-zipper» (cremallera de leucina) (Chan y González. La región promotora de Hahb-4 contiene secuencias consenso presentes en elementos de respuesta a ABA (ABRE).fao..H. y KELLER F. Andrea F. Las nuevas tecnologías (micro y macroarreglos de ADN. La familia de factores de transcripción descripta en girasol incluye proteínas raturas revelaron la presencia de un elemento ABRE. 1997).J. 1998). Sudáfrica. Brasil. Tailandia China China Argentina Egipto China. 1996. Hahb-4 es un gen de esta familia que mostró estar fuerte y reversiblemente inducido por estrés hídrico y por ABA. Shinozaki y YamaguchiShinozaki.F. (fuente:http:// www. Indonesia. DEL VISO. Cryobilogy 24: 324-331. sequía y salinidad.

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.

Gustavo Martínez Zamora. Su cultivo involucra dos actividades agronómicas bien diferenciadas: la producción de frutas y la viverística. en Buenos Aires). El objetivo general del Pro\Frutilla es obtener cultivares argentinos adaptados a por lo menos dos agroecosistemas o ambientes de selección (el subtropical de Lules en Tucumán y el templado del cinturón hortícola del Gran La Plata. Graciela Terada. respectivamente) y de la cultivada F. 1) delimitado por tres niveles de domesticación: 1) Poblaciones Comerciales. Sergio Miguel. Nadia Chalfoun. Potentilla tucumanensis (2n=2x=14). 1 Mejoramiento genético El Pro\Frutilla se basa en un esquema de selección recurrente (Fig.. Duchesnea indica: serie poliploide 2n=8x y 10x=56 y 70. las cuales generan una gran demanda de mano de obra (alrededor de 500 jornales /Ha /año). chiloensis: 2n=8x=56. en Gante. Europa y Norte América. donde se intenta llevar a cabo hibridaciones interespecíficas. virginiana: 2n=8x=56). En una primera etapa. 2) Poblaciones Intermedias o Tampones. Gabriela García. por lo cual en muchos países es considerado también como un cultivo social. morfológicos y anatómicos pudo identificarse una nueva especie silvestre. En Argentina. Elsa Camadro. Cecilia Lemme. Estudiando caracteres citogenéticos. Una de estas frutillas es originaria del sur (F. 3) Poblaciones Silvestres. F. con resistencia incrementada a estrés de origen biótico que permita evolucionar hacia una agronomía menos reñida con la salud humana y ambiental (principalmente sin bromuro de metilo) y para que empresas viveristas locales puedan aprovechar las ventajas comparativas de exportación de plantines de genética nacional en contraestación con los países del hemisferio norte. Paula Filippone. que en 1999 representó a nuestro país en la exposición «Flanders Technology InternationalTechnoland». Marta Ontivero. Juan Carlos Díaz Ricci. Esta especie fue clasificada de manera errónea a principios del siglo XX como Potentilla Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 367 . Luis Mroginski. el mercado de variedades está dominado por empresas estadounidenses. a partir de 1996 comenzó a funcionar. Atilio Pedro.VIII. Bélgica. La x en el nombre científico hace referencia a su condición de híbrido. representadas en la Figura 1. Salazar. en forma organizada. además de los autores. Juan Carlos Introducción La frutilla cultivada (Fragaria x ananassa: 2n=8x=56) es un poliploide con 56 cromosomas resultante de la hibridación interespecífica entre dos especies de frutillas silvestres. Alicia Inés Mamaní. Zembo.Capítulo 13 Aproximación biotecnológica integrada para un manejo sustentable del estrés biótico en frutilla Castagnaro. el Programa Nacional de Mejoramiento Genético de la Frutilla (Pro\Frutilla) a través de una iniciativa interinstitucional (sectores público y privado) e interdisciplinaria (combina el mejoramiento genético convencional con los métodos surgidos de la biotecnología molecular). x ananassa. Si bien se realiza mejoramiento genético en distintos lugares de Asia. que es endémica del Noroeste Argentino y se encuentra en peligro de extinción. se realizaron recolecciones y se estableció un Banco de Germoplasma activo. Ursula Tonello y Gabriel Vellicce. en las cuales se realizan cruzamientos dentro de cada especie y/o nivel de ploidía. Hugo Lázaro. participaron los siguientes investigadores (en orden alfabético): Marta Arias. Se trata de un importante fruto que se consume en fresco o industrializado y que es muy apreciado en prácticamente todo el mundo. también octoploides. chiloensis: 2n=8x=56) y la otra del norte de América (F. Reconocimientos En este capítulo se describen en forma resumida los trabajos realizados y los logros obtenidos con este programa donde. constituido por genotipos de especies silvestres ( Fragaria vesca : 2n=2x=14.

donde el número anterior a la barra. micropropagación y evaluación de la variación somaclonal Debido a que el cultivo de meristemas posibilitaría sanear la mayor parte de las virosis. 368 CASTAGNARO.. A. Oso Grande) y el último número es arbitrario y responde a un ordenamiento interno del programa. Este mismo razonamiento podría aplicarse para la enfermedad sistémica (bacteriosis) provocada por Xanthomonas fragariae. llamados 96/ Figura1. S. 2 Cultivo in vitro de meristemas. 2) y se realizaron estudios histológicos de aquenios. . 6-5 y 96/6-6. SALAZAR. Paralelamente a la caracterización botá- En la actualidad. A fin de conocer la naturaleza de las barreras.C. se investigó el crecimiento del tubo polínico en el pistilo utilizando microscopia de fluorescencia (Fig. en este caso cv. Medianamente compatible: Sólo unos pocos granos de polen atraviesan el estilo (dcha. A su vez y mediante caracteri- Figura 2. x ananassa. especie decaploide típica de los países nórdicos. Compatibilidad del cruzamiento. en el marco de las mencionadas Poblaciones Intermedias (2) y siguiendo un esquema dialélico incompleto.). entre ellos el cultivar Camarosa.. Compatible: varios granos de polen crecen a través del estilo (centro). Incompatible: el grano permanece sin germinar en el estigma (izda.. Este conocimiento permitirá diseñar estrategias que posibiliten la transferencia de genes de interés agronómico desde los genotipos silvestres a los domesticados. Potentilla tucumanensis y 9 genotipos de la cultivada F. el que le sigue indica la familia o cruza.).norvegica. Duchesnea indica. Esquema de selección recurrente seguido en las poblaciones comerciales (mayor nivel de domesticación) nica. Este estudio permitió detectar barreras pre y poscigóticas de aislamiento reproductivo entre estas especies. J. se dispone de dos genotipos promisorios en etapas avanzadas de evaluación y selección clonal. Chandler x cv.ZEMBO J.C.M.P. que es la variedad más cultivada en el mundo. Se estudiaron las condiciones de cultivo in vitro para sanear y multiplicar diferentes genotipos de frutilla. indica el año de cruzamiento (en este caso 1996). no se ha profundizado demasiado en el estudio y caracterización de los virus que afectan a la frutilla y desde un punto de vista agronómico estas enfermedades no están dentro de los principales problemas del cultivo. se realizaron 500 cruzamientos interespecíficos entre accesiones silvestres de Fragaria vesca.DÍAZ RICCI.

La mejor tasa de multiplicación se obtuvo en el medio N30K suplementado con 0.28 0.00 8. la práctica agronómica deberá evolucionar. un incremento en la síntesis de almidón (activi- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 369 . hacia nuevos sistemas productivos que minimicen la utilización de agroquímicos sintéticos.).95 3. se investigó la eventual inducción de variación somaclonal en ciclos sucesivos de multiplicación de este cultivar. Esto permitió detectar una respuesta sistémica de protección cruzada desencadenada por un patógeno avirulento. El manejo de estas enfermedades. donde una de las más importantes es la antracnosis (Colletotrichum sp.12 0.75 mg/L).5 y 0.25. lo que implica que no pueden llevar residuos de pesticidas. La previa inoculación con un patógeno avirulento desencadena una respuesta defensiva de protección cruzada contra el patógeno virulento (izda. las hortalizas se consumen mayoritariamente en fresco.).) y se optimizaron metodologías de infección controlada que posibilitaron la evaluación fenotípica certera de la resistencia/ susceptibilidad de los materiales fitotécnicos del Banco de Germoplasma del Pro\Frutilla. Micophaerella.20 0. Xanthomonas.25 4. se aislaron los agentes etiológicos locales de las enfermedades más importantes (especies pertenecientes a los géneros: Colletotrichum. sin que se detectara variación somaclonal después de tres ciclos sucesivos multiplicación.92 7. Para ello: 1) En primer lugar. Figura 3. etc. y cuya eliminación ya fue pautada desde Naciones Unidas. que además puede ser inducida por el microorganismo (patógeno) inactivado y/o por extractos del mismo.25 mg/L de cinetina.06 0. que además de ser tóxico destruye la capa de ozono.91 9. Los estudios histopatológicos Tabla1: ESPECIE EC50 (uM) Bacterias Gram positivas Clavibacter michiganensis Staphylus aureus Enterococcum faescium CRL 35 Bacillus subtilis Listeria monocytogenes Gram negativas Xanthomonas fragariae Xanthomonas axonopodis pv citri Pseudomona auruginosa Pseudomona siringae pv. x ananassa. 3 Interacción planta-patógeno A diferencia de otros productos agroalimentarios. Botrytis. involucra el uso masivo de pesticidas contaminantes como el bromuro de metilo.37 EC50 = concentración efectiva para el 50 % de inhibición en plantas que manifiestan la respuesta de defensa revelaron la presencia de cristales no característicos de la especie F. Por otro lado. 2) Se caracterizaron los hongos patógenos del género Colletotrichum relacionados con la enfermedad de la antracnosis.zación fenotípica y marcadores genotípicos del tipo RAPD (del inglés Randomly Amplified Polymorphic DNA). En este contexto el Pro\Frutilla está llevando a cabo una investigación básica que permita desarrollar estrategias de biocontrol. gladiolii Erwinia carotovora Salmonella newport E. 3).25 0. El problema principal del cultivo de la frutilla son las enfermedades fúngicas.14 0. Este resultado nos permitió proponer por primera vez el uso de un procedimiento para el saneamiento y la micropropagación comercial de la variedad Camarosa. La tasa de multiplicación de las plantas in vitro fue evaluada utilizando dos formulaciones salinas en el medio de cultivo (N30K y MS) y diferentes concentraciones de cinetina (0. 0.). indefectiblemente.27 0.coli D21 Hongos Colletotrichum fragariae Colletotricum acutatum Colletotrichum gloeosporioides 0.07 0. lo que puede tener tanto implicancias conceptuales como biotecnológicas (Fig. Planta control infectada con un patógeno virulento (dcha.07 0.

4 Marcadores moleculares Aprovechando la versatilidad de la técnica de RAPD lo primero que se planteó fue investigar la similitud genética entre las especies silvestres relacionadas con la frutilla cultivada y se desarrollaron los primeros marcadores moleculares específicos de especie. .P. J. se generaron 37 marcadores genotípicos actualmente disponibles para la identificación inequívoca de las 8 principales variedades de frutilla cultivadas en la Argentina. confirmando la importancia del análisis del ADN para evitar errores en la identificación de cultivares (Fig. la antracnosis. 370 CASTAGNARO. con el que se conseguía que el 70% de los explantos cultivados regeneraran plantas de frutilla. desencadena además una respuesta defensiva en la planta. Utilizando esta aproximación pudieron diferenciarse tres accesiones distintas del cultivar Pájaro. Uno de éstos.. presente en Progenitor (PR) e híbridos resistentes (HR) y ausente en progenitor (PS) e híbridos susceptibles (HS). Esto implicaría que más allá de su efecto como antibiótico (Tabla 1). 4a). acutatum. llamado Fragarina 1. 5 Transgénesis En virtud de las ventajas que ofrece la transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens.dad metabólica). para la principal enfermedad del cultivo. S. Mediante BSA (del inglés Bulked Segregant Analysis) se detectaron marcadores AFLP (del inglés A mplification F ragment L ength P olymorphisms) ligados a la resistencia que pueden contribuir a hacer más eficiente la selección en el Pro\Frutilla (Fig. que habían sido multiplicadas en forma independiente. estaría de alguna manera participando en la señalización de la respuesta de defensa. se diseñaron cruzamientos para obtener poblaciones segregantes que posibilitaran investigar el control genético de la resistencia.M. B. Así. que permitieran la detección de híbridos interespecíficos putativos.. se analiza la potencialidad de extractos o compuestos de este tipo como principios activos en la formulación de agroquímicos naturales de bajo impacto ambiental. pero usando electroforesis en geles de poliacrilamida de alta resolución. Marcadores moleculares. Sobre la base de la información obtenida en los experimentos donde se evaluó la resistencia/ susceptibilidad de los genotipos del Banco de Germoplasma frente a diversos patógenos fúngicos. se propuso un modelo basado en una interacción gen a gen en un fondo genético octoploide. A. Actualmente. que permeabiliza la membrana plasmática. Marcador AFLP asociado a la resistencia a C. donde la susceptibilidad es parcialmente dominante sobre la resistencia y la respuesta defensiva sería modulada por la dosis alélica y por otros genes que interactuarían epistáticamente con el gen R. preliminarmente se desarrolló un protocolo de regeneración de brotes a partir de discos de hojas. Perfiles diferenciales de RAPD indican diversidad genética entre distintas accesiones de un mismo cultivar de frutilla. cuando es aplicado en forma exógena. lo que contribuye a aumentar el espesor de la semilámina. A. Figura 4. Del mismo modo..ZEMBO J.DÍAZ RICCI. un mayor número de cloroplastos y un engrosamiento de las paredes celulares.C.C. cuya formación en la planta es inducida por un microorganismo) que fueron llamados Fragarinas. 4b). para diferenciarlos de las fitoalexinas . Este sistema de regeneración fue utilizado para optimizar una metodología de transformación con la cepa de Agrobac-terium tumefaciens LBA 4404. portadora del plásmido binario pBI121. Por otra parte. que asume que la resistencia está determinada por diferentes variantes alélicas de un gen R. SALAZAR. se purificaron y caracterizaron compuestos antimicrobianos preformados (fitoanticipinas.

de gran incidencia en agrosistemas subtropicales). aunque ninguna de las 16 evidenció cambios en su comportamiento frente a Colletotrichum acutatum. un patógeno para el cual todavía no se han encontrado fuentes de resistencia genética en la especie F. incompatibilidad y de protección cruzada caracterizados. si- guiendo al menos dos aproximaciones distintas: i) Mediante la técnica de visualización de la expresión diferencial de ARNms y la construcción (y posterior análisis) de genotecas de ADNc por hibridación sustractiva.). Construcciones génicas portadoras de genes que codifican proteínas antifúngicas (quitinasa. 5b). tabaco y lino. tanto de los materiales fitotécnicos como de los sistemas de compatibilidad. De este modo.6 plantas transgénicas por cada 100 discos de hojas infectados con la bacteria. mostraron resistencia incrementada a la enfermedad del moho gris (causada por Botrytis cinerea . Transgénesis: A. Hojas desprendidas de frutilla no transgénica (izda. queda demostrada la utilidad del gen ch5B para introducir resistencia a Botrytis en frutilla (Fig. En el primer caso (i). Respecto de la segunda aproximación (ii).) y transgénica resistente a Botrytis (dcha. para aislar genes implicados en los mecanismos defensivos. lográndose una eficiencia del 6. ii) El clonado y caracterización de análogos de genes de resistencia (RGA). Se identificaron al menos siete familias distintas de RGAs. etc. Basados en este procedimiento. en Arabidopsis presenta miembros que sólo se expresan en interacciones planta /patógeno de tipo incompatibles (cuando no se produce enfermedad). reguladores transcripcionales con dominios homeóticos. 6 Caracterización molecular de genes de interés Actualmente se está aprovechando el conocimiento que se tiene. Solamente dos de estas líneas transgénicas. miembros de la familia de las enoil-CoA-hidratasa /isomerasa. De estos genes que están siendo analizados al momento de escribir este capítulo. para amplificar por PCR. similares a los ya caracterizados en Arabidopsis.Figura 5. análogos de genes de resistencia en genotipos silvestres y cultivados de frutilla. x ananassa. se utilizaron oligonucleótidos cebadores degenerados diseñados a partir de secuencias conservadas de la región NBS (del inglés «Nucleotide Binding Site») de genes de resistencia (R) clonados de otras plantas. una de las especies más agresivas causante de la antracnosis. 5a) que codifican proteínas antifúngicas del grupo de las PR (proteínas relacionadas con la patogénesis vegetal): ch 5B (codifica para una quitinasa de Phaseolus vulgaris). se destaca uno que presenta una alta homología con una glutation S tranferasa (GST) de zapallo (Cucurbita maxima). ambas portadoras de una copia simple del gen ch5B. glucanasa y Ap24). de las cuales la mayoría pertenecía a genes R de tipo TIR (del inglés «Toll Interleukin Receptor»). proteínas quinasas con un dominio de unión a calcio. se obtuvieron 16 líneas transgénicas de frutilla cv Pájaro. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 371 . que expresaban uno o una combinación de dos de los siguientes genes heterólogos (Fig. Esta familia génica que actúa en la detoxificación de compuestos altamente oxidantes (especies reactivas de oxígeno) generados durante estrés tanto biótico como abiótico. B. gln2 (codifica para una glucanasa de Nicotiana tabacum) y ap24 (codifica para una proteína del tipo de las taumatinas de Nicotiana tabacum ). se clonaron numerosos fragmentos de ADNc que codifican proteínas relacionadas con la defensa vegetal como quitinasas de tipo III o PR 8.

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metabolitos secundarios. Germán 1 Introducción La agricultura de pastizales depende en gran medida de la disponibilidad de fuentes adecuadas de forraje como base primaria para la alimentación del ganado. Si bien algunos aspectos de la genética. Forster et al.VIII. ya sean gramíneas o leguminosas (Fig.1 Calidad del forraje El mejoramiento molecular basado en transgénesis para sortear limitaciones en la calidad del forraje está dirigido al tratamiento de los subcaracteres involucrados. la producción de plantas forrajeras transgénicas utilizando Agrobacterium y biolística. 2 Transgénesis La tecnología génica y la obtención de plantas transgénicas brindan la posibilidad de generar variación genética cuando esta es inexistente o tiene una heredabilidad muy baja. La mayoría de los parámetros de calidad están aso- Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 267 . alcaloides. etc. En consecuencia. 2000). resistencia a plagas y enfermedades. Entre estas técnicas cabe mencionar el establecimiento de sistemas eficientes de regeneración de plantas a partir de células competentes para la transformación genética. contenido de proteínas. la manipulación genética del contenido de fructanos para incrementar el contenido de carbohidratos no estructurales. y el establecimiento de sistemas altamente informativos de marcadores moleculares codominantes para ser utilizados en el proceso de selección y en el desarrollo de mapas genéticos. 1. El enfoque molecular puede incluir la modificación del perfil de ligninas para mejorar la digestibilidad de la materia seca. En los últimos años se han desarrollado numerosas técnicas biotecnológicas y moleculares para el mejoramiento de gramíneas y leguminosas forrajeras (Spangenberg 1999. Esto incrementa la fuente de genes útiles para el desarrollo de nuevos cultivares. de la síntesis de taninos condensados para desarrollar forrajeras libres de meteorismo y la expresión de proteínas resistentes al rumen («rumen by-pass») para mejorar el aporte de proteínas y aminoácidos esenciales.-Capítulo 2 Mejoramiento de Plantas Forrajeras en la Era Genómica Spangenberg.9). estando en la etapa de evaluación a campo las primeras plantas forrajeras transgénicas con caracteres simples modificados.la tecnología génica es una poderosa herramienta para ampliar los conocimientos en genética molecular. ver pág. En este capítulo se describen las aplicaciones actuales y futuras y el impacto de la biotecnología en el mejoramiento de especies forrajeras. El mejoramiento convencional se basa en el uso de la variación genética natural existente entre ecotipos o aquella creada a través de recombinación sexual. La biotecnología permite generar nueva variabilidad y utilizar de manera más eficiente la variabilidad genética existente. las aplicaciones de la transgénesis en el mejoramiento de especies forrajeras están orientadas hacia el desarrollo de eventos de transformación con variación genética única y a la disección genética de vías metabólicas y procesos de desarrollo relevantes para la producción de forrajes. Los mejores candidatos en cuanto a caracteres para la aplicación de transgénesis en plantas forrajeras son: calidad del forraje. En la actualidad se dispone de metodologías eficientes para la transformación de forrajeras. a saber: digestibilidad de la materia seca. acelerando los programas de mejoramiento genético. fisiología y bioquímica de muchos procesos vegetales complejos no han sido aún completamente dilucidados -lo cual podría demorar algunas de las aplicaciones de la transgénesis en el mejoramiento vegetal. contenido de carbohidratos solubles. la combinación total o parcial de genomas por hibridación somática y cibridación a través de la fusión de protoplastos. 2. En la mayoría de las regiones agrícolas del planeta la producción de forraje es un sistema de baja inversión donde el mejoramiento genético de plantas es la forma más económica de aportar tecnología de avanzada a los productores. tolerancia a estreses abióticos y la manipulación del crecimiento y desarrollo.

CCR y CAD de L. En algunos de estos casos la lignina resultó más fácil de extraer químicamente. A fin de producir cultivares con mayor digestibilidad. Incrementos del 1% en la digestibilidad de la materia seca in vitro conducen a incrementos promedio del 3. Los efectos observados en plantas con regulación negativa de alguna de estas enzimas son similares a aquellos encontrados en la naturaleza en un tipo particular de mutantes de maíz llamados «brown midrib» (bmr).2 A). Estudios tendientes a mejorar la calidad del forraje por esta tecnología están siendo explorados en leguminosas como Stylosanthes humilis y Medicago sativa y gramíneas como Lolium perenne y Festuca arundinacea. secuenciados. realizar ensayos a campo de estas plantas. Los genes correspondientes han sido mapeados en raigrás perenne (Fig. Estos han sido aislados. 2. la 4-cumarato: CoA ligasa (4CL). cinamoil CoA reductasa (CCR) y cinamil alcohol deshidrogenasa (CAD)(Fig. cuyos genes codifican para enzimas menos activas. perenne. en sentido o anti-sentido . 2 A). en otros esta tecnología trajo aparejadas alteraciones en el desarrollo de la planta. evaluando particularmente el 268 SPANGENBERG. composición de monómeros y grupos funcionales y del grado de entrecruzamiento con los polisacáridos de la pared celular. La lignificación es un proceso altamente coordinado y regulado por un conjunto de eventos metabólicos que resultan en la biosíntesis de precursores de la lignina (monolignoles). No obstante ello. la cual declina marcadamente (> 10%) a medida que estas crecen y maduran. el potencial para un mejoramiento rápido por métodos tradicionales es reducido.1 Manipulación de la biosíntesis de lignina El principal objetivo tendiente mejorar el valor nutritivo de las gramíneas forrajeras para la industria lechera es el incremento de la digestibilidad de la materia seca. 4CL. Los efectos negativos de la lignina sobre la digestibilidad dependen de su contenido. Dado que la heredabilidad de este caracter es baja y el mismo está controlado por un gran número de genes. Se cuenta con los genes (ADNc y clones genómicos) que codifican para COMT. en la producción animal. Las principales enzimas blanco para la aplicación de esta tecnología son la O-metiltransferasa del ácido cafeico (COMT). Germán . logrando una mayor variedad de fenotipos que la existente en la naturaleza.1. a través de la regulación negativa de varias enzimas y a la utilización de promotores específicos. es necesario contar con varios eventos de transformación con regulación negativa para enzimas individuales o múltiples enzimas involucradas en el metabolismo de los monolignoles. aptos para el mercado.2% en ganancia media de peso vivo. reduciendo el valor nutritivo del forraje. El enfoque transgénico brinda la posibilidad de obtener plantas con ligninas diferentes. Se calcula que pequeños incrementos en la digestibilidad tendrán un efecto significativo en la calidad del forraje y concomitantemente. CAD y 4CL conduce a una alteración en la composición de la lignina o a una disminución de su contenido con incrementos significativos en la digestibilidad de la materia seca. estos resultados indican que la introducción de genes de esta vía metabólica en sentido o antisentido permite mejorar la digestibilidad de la materia seca sin alterar el desarrollo normal de la planta.ciados con vías metabólicas o con la producción de proteínas específicas. de las enzimas involucradas en la biosíntesis de monolignoles en plantas transgénicas. el aislamiento de los genes correspondientes y la manipulación de su expresión en plantas transgénicas. La tecnología génica permite identificar las proteínas involucradas y las enzimas clave a ser manipuladas. caracterizados y utilizados para la disección genética de esta vía biosintética en gramíneas (Fig. Las investigaciones realizadas utilizando plantas modelo como tabaco y álamo demostraron que la regulación negativa de la expresión de COMT. El principal factor involucrado en la disminución de la digestibilidad de los tejidos a medida que maduran es la lignificación de las paredes celulares. 2 B). como reducido tamaño y colapso de las células del xilema. Una de las estrategias exploradas para mejorar la digestibilidad de la lignina es la regulación negativa.

1 fructosiltransferasa (6-SFT) que sintetizan e40t50334 10 cM la mezcla más comLpCAD1 e40t49173. provistas de frucvigor. 4CL = dos.2 e41t50144 Xbcd1823 (1-SST). CCR = cinamoil CoA reductasa.1 fructano 1-fructosilLpOMT1 e33t62760 e38t50244 transferasa (1-FFT) y Lp CCR1 e33t62620 e41t47520 sacarosa: fructano 6Xpsr540. el 6G-FFT de O-metil transferasa. Varios de los B genes involucrados en esta vía metabólica han sido Figura 2: A) Disección de la vía metabólica de la biosíntesis de monolignoles.PAL ácido cinámico lubles indicaron que alanine estas no sufren dismiC4H nuciones en la TAL C3H ácido OMT ácido F5H 5-hidroxi. conduPER LAC ciendo a incrementos LIGNINA A en el peso vivo. Xpsr690 Xbcd135. Xcdo36 pleja de fructa-nos liXpsr546 Xpsr1316 gados que se encuenXc472 Xr738 tra en pastos y cereaXc556. cebolla y el 1-SST de Las flechas punteadas indican reacciones que no han sido experimentalmente alcaucil. Xc600. COMT = O-metil transferasa del ácido cafeico.1 e33t62340 Xpsr154. concomi(H) (G) (S) tantemen-te. debido a ácido ferúlico PAL 4CL 4CL 4CL 4CL 4CL que estos carbohiCCoA-3H CCoA-OMT CCoA-OMT dratos parecen con? p-cumaroilcafeoilferuloil5-hydroxysinapoiltrarrestar las disminuCoA CoA CoA feruloyl-CoA CoA ciones en digestiCCR CCR CCR CCR bilidad debidas a lignificación.Los fructanos son moléculas de polifructosa producidas por varias especies de gramíneas para las cuales constituyen la principal forma de almacenamiento de carbohidratos solubles. Observaciones reali2. Xc498. Las aislados y caracterizaenzimas son: PAL = fenilalanina amonio liasa. La síntesis de fructosa en gramíLG2 LG7 neas involucra la acción concertada de al menos tres enzimas: sacarosa:sacarosa 1Xc30. F5H = ferulato-5-hidroxilasa. como el 6-SFT de hidroxicinamato:CoA ligasa. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 269 . fructosil-transferasa Xbcd147 e41t50240. la tolerancia a estreses y por último llevar a cabo la hibridación y selección para obtener germoplasma elite. Xpsr10 ( Gli-2) Xc847 les. Xcdo1417 LpCAD2.1. CAD = cinamil alcohol deshidrogenasa.cebada. C4H = 4-cumarato-3-hidroxilasa. B) Mapeo de los genes correspondientes a la vía en los grupos de ligamento ción en plantas desLG2 y LG7 de raigrás perenne. Su introducverificadas. favorep-cumaraldehído coniferaldehyde 5-hidroxisinapaldehído coniferaldehído ciendo además la asiCAD CAD CAD milación del forraje y de proteínas en el alcohol p-cumarílico alcohol coniferílico Alcohol sinapílicol rumen y. CC3H = cumaroil CoA hidroxilasa. fructano: e33t50120 LpCAD2. CCOMT = Cafeoil CoA 3.2 Manipulación del metabolismo de zadas en líneas de raigrás que almacenan confructanos centraciones elevadas de carbohidratos soL-fenil.OMT ácido ácido digestibilidad durante L-tirosina p-cumárico cafeico ferúlico Á sinápico el verano.1.

La introducción de un gen microbiano para la fructosiltransferasa (gen SacB ) de Bacilus subtilis en plantas de tabaco y papa que carecen de fructanos y acumulan almidón condujo a la acumulación de cantidades considerables de fructanos de elevado peso molecular. La disección molecular de la biosíntesis de fructanos en forrajeras clave incrementará nuestro conocimiento del metabolismo de los fructanos y de la distribución de los carbohidratos en gramíneas. sintetizados por la vía metabólica de los flavonoides.3 Expresión transgénica de proteínas rumen by-pass Los aminoácidos azufrados metionina y cisteína son los más limitantes en la nutrición animal. del tipo de los levanos.1. que les confierieron un mejor rendimiento en situaciones de estrés. incrementará el aporte de aminoácidos esenciales para la nutrición de los rumiantes. donde han redundado en una mayor producción de leche y una mayor tasa de crecimiento en animales para carne. por lo tanto. Germán . multiflorum con alteraciones en el metabolismo de fructanos por la introducción de genes quiméricos de levansucrasa bacteriana. La manipulación de la biosíntesis de fructanos en plantas transgénicas para mejorar la calidad del forraje y la tolerancia a estreses abióticos está siendo explorada en leguminosas como Trifolium repens y Medicago sativa y gramíneas como Lolium perenne y Festuca arundinacea. A esto se suma el problema de la fermentación en el rumen. Actualmente se dispone de ADNc de genes de homólogos de la fructosiltransferasa de raigrás perenne. 2. Desde el punto de vista agronómico son importantes en las leguminosas forrajeras donde pueden considerarse beneficiosos o per- 270 SPANGENBERG. particularmente en lo que a lana se refiere. Por lo tanto la ingestión de forrajeras que contengan proteínas ricas en aminoácidos azufrados. conduciendo a una mayor producción animal. Estos han sido aislados. resistentes a la acción del rumen. También se han aislado y caracterizado otros genes de la vía que han sido introducidos y expresados en leguminosas y gramíneas. En trabajos previos se obtuvieron plantas de L.tanos nativos conduce a la acumulación de oligofructanos. 2.2% del total de proteína soluble. Estos efectos positivos también se han observado en bovinos. Se ha informado la obtención de plantas forrajeras transgénicas que expresan genes que codifican para diferentes proteínas ricas en aminoácidos azufrados. relativamente estables en el rumen. Desde el punto de vista nutricional los valores obtenidos aún están lejos del óptimo. Estos influyen en el crecimiento de la lana de las ovejas y su aporte es reducido en condiciones naturales de pastoreo. Los suplementos postruminales de metionina y cisteína resultan en incrementos del 16 al 130% en la tasa de crecimiento de la lana.1. aportando información acerca de su rol funcional en la tolerancia al frío y la sequía. caracterizados y utilizados para la disección genética de la biosíntesis de fructanos en gramíneas transgénicas. como la ovoalbúmina de gallina y la albúmina de arveja y de semilla de girasol. desarrollar estrategias que permitan alcanzar estos niveles a fin de explotar el máximo potencial de la técnica. Esto demuestra que la sacarosa. puede ser redireccionada en especies que no acumulan fructanos. que deberá ser del 2 al 5 % del total de proteína soluble. a la acumulación de nuevas variedades de los mismos. Estas plantas expresan el transcripto esperado y acumulan la proteína SFA8 a niveles superiores al 0. ya que la microflora degrada las proteínas y en algunas circunstancias resintetiza proteínas de menor valor nutritivo. y en plantas que los producen. Como ejemplo puede citarse el caso de plantas transgénicas de Festuca arundinacea (Festuca alta) que expresan genes quiméricos constituídos por secuencias de ADNc de la albúmina de girasol (SFA8) con la señal KDEL del retículo endoplásmico bajo el control de diferentes promotores.4 Manipulación de la biosíntesis de taninos condensados Los taninos condensados (proantocianas) son compuestos poliméricos derivados del metabolismo fenilpropanoide. Es crucial. el sustrato para la fructosiltransferasa. Este conocimiento es clave para el diseño de experimentos tendientes a la obtención de plantas transgénicas con mejor calidad de forraje y tolerancia a estreses abióticos.

glucanasas. La identificación y aislamiento de los genes involucrados en la biosíntesis de taninos en semillas de alfalfa permitirían manipular su expresión en hojas. disminución en el rendimiento y calidad y una limitada persistencia. la persistencia. Las estrategias moleculares utilizadas para la manipulación de la biosíntesis de taninos se han orientado hacia la introducción de taninos condensados en alfalfa y trébol blanco y a su reducción en leguminosas que tienen altos contenidos (ver Morris y Robbins 1997 y Gruber et al. toxinas Bt . El análisis de los promotores de algunos genes estructurales de esta vía demostró la presencia de motivos de secuencia específicos para la interacción con factores de transcripción de tipo MYB.. El pastoreo directo de alfalfa presenta el riego de causar meteorismo en los rumiantes que la consumen debido a la ausencia de taninos condensados en hojas y tallos. La expresión constitutiva en plantas transgénicas -específica de órgano o inducida por el patógeno. Un ejemplo de esto lo constituye la transformación de plantas de Lotus corniculatus con el gen regulatorio Sn de maíz. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 271 . de los genes CHS. que parece ser específico de la vía de biosíntesis de los taninos.de genes que codifican para proteínas antifúngicas (AFPs). Candidatos adecuados podrían ser los genes de leucoantocianina-4 reductasa (LAR) y de CHS. CHI. Estas se basan en la disponibilidad de genes involucrados en la biosíntesis de antocianas. que podría hacerlas resistentes al ataque de Rhizoctonia solani y Sclerotium rolfsii. Niveles de taninos condensados superiores al 4-5% del peso seco son perjudiciales. ya que reducen el meteorismo («empaste») por disrupción de la espuma causada por las proteínas en el rumen. la presencia de estos flavonoides en las semillas demuestra que esta especie contiene todos los genes necesarios para la síntesis de taninos condensados. fitoalexinas. 2000).2 Resistencia a plagas y enfermedades Los patógenos y las plagas pueden disminuir considerablemente la producción. En los últimos diez años se han desarrollado varias estrategias para manipular la resistencia a los mismos. Esto permitió el clonado. Se identificó y clonó también el gen BAN (BANYULS). Sin embargo. proteínas inactivadoras del ribosoma. 2. proteína del movimiento viral. inhibidores de proteasas e inhibidores de α-amilasa. que afectan las etapas comunes en la biosíntesis de flavonoides y la suposición de que estos funcionarán en la biosíntesis de taninos. Como ejemplo puede citarse la obtención de plantas de alfalfa que expresan una quitinasa I de arroz. entre otros. o la activación de la ruta biosintética mediante la expresión de genes reguladores apropiados que gobiernen la vía a través de un accionar pleiotrópico (con efectos a varios niveles fenotípicos). Se ha intentado la regulación negativa o positiva de enzimas clave en la biosíntesis. se han intentado principalmente en leguminosas. que resultó en una disminución del contenido de taninos en hojas. defensinas. Estas estrategias. 2. como es el caso de chalcona sintetasa (CHS) y leucoantocianina-4 reductasa (LAR) respectivamente. puede conferir nuevas formas de resistencia a enfermedades fúngicas. el valor nutritivo y la palatabilidad de las plantas forrajeras. actuando como factores antinutritivos y generando rechazo por parte del animal. proteínas de la cápside viral.2.1 Transgénesis para incrementar la resistencia a enfermedades fúngicas El ataque de hongos a las hojas y sistemas radicales de las plantas provocan daños que resultan en un pobre establecimiento. Estas incluyen la expresión de quitinasas. F3H y DFR. El estudio de mutantes de la vía metabólica de los flavonoides en Arabidopsis ha proporcionado abundante información acerca de la identidad de las enzimas involucradas en la síntesis de taninos en esta especie. como alfalfa y trébol blanco.judiciales de acuerdo a los niveles encontrados en la planta. replicasa viral. utilizando genes que actúan individual o concertadamente. conjuntamente con un aumento del nivel de los mismos en raíz. disminuyen la pérdida de proteínas debidas a desaminación microbiana y reduciendo la carga de parásitos en el animal. bZIP y bHLH. En cantidades moderadas (13%) mejoran la calidad del forraje.

2. La infección con RMV también reduce la competitividad del raigrás perenne como resultado de un mal establecimiento y una reducida persistencia. (2000). La estrategia utilizada fue la de expresión de proteínas de la cápside viral u otras propias del patógeno como versiones mutadas de distintas proteínas. efectiva y durable que pueda ser incorporada a cultivares de leguminosas forrajeras. La tecnología génica es una opción atractiva para lograr este objetivo. Germán . causando pérdidas significativas en leguminosas utilizadas para distintos fines.2 Transgénesis para incrementar la resistencia a enfermedades virales Virus tales como el del mosaico de la alfalfa (alfamovirus. Uno de ellos es la utilización de la proteína cristalina e inhibidores de proteasas de Bacillus thuringiensis (Bt). ya que permite sortear barreras interespecíficas. Rhizoctonia solani y Fusarium spp.2. Cada uno de ellos infecta individualmente a un gran número de especies distribuidas por todo el mundo. La mayoría de los métodos clásicos utilizados para prevenir las infecciones virales son laboriosos y económicamente inviables. Se han identificado cuatro proteínas antifúngicas diferentes que en ensayos in vitro demostraron ser efectivas contra estos patógenos y se han utilizado los correspondientes genes quiméricos que las expresan para producir plantas fenotípicamente normales de trébol subterráneo. el del mosaico del trébol blanco (potexvirus. Strizhov et al. Kabatiella caulivora. Para una revisión del tema pueden consultarse a Voisey et al.. Mientras se trata de determinar la resistencia lograda utilizando estos genes AFPs de manera individual también se intenta «piramidizar» diferentes transgenes a fin de brindar una mayor protección contra un amplio espectro de hongos patógenos. (ver VIII. Sitona spp. donde no existen fuentes de resistencia natural. Coleophora spp . En este sentido se han utilizado resistencias derivadas de distintos patógenos para la obtención de leguminosas transgénicas con resistencia a AMV. El control de estos tres virus podría incrementar la rentabilidad de las industrias rurales australianas en más de 860 millones de dólares. En pasturas infectadas por densas poblaciones de insectos plaga se producen disminuciones en la producción de materia seca que van del 20 al 40%. WCMV y CYVV. La alimentación de larvas de Wiseana con hojas de estas plantas promueve una inhibición en la ingesta. Sminthurus viridis. provocan cuantiosas pérdidas económicas en Australia. En las gramíneas forrajeras dos virus que se encuentran con frecuencia son el del enanismo y amarillamiento de la cebada (BIDV) y el del mosaico del raigrás (RMV). que atacan a varias especies de tréboles. (1996) y Voisey et al. (1994). Costelytra zealandica .Hongos como Phytophthora clandestina. reducción en el crecimien- 272 SPANGENBERG. 2. por consumo del follaje y raíces o indirectamente. desarrollar resistencias multigénicas y manipular niveles y sitios de expresión. Inopus rubriceps y Acyrthosiphon spp pueden causar daños significativos a leguminosas y gramíneas.AMV). Estos provocan disminuciones en el rendimiento del raigrás de hasta un 24% (BIDV) y de un 5 al 50% (RMV).WCMV) y el del amarillamiento de las nervaduras (potyvirus. por transmisión de patógenos a estas durante su accionar sobre la planta.3 Transgénesis para incrementar la resistencia a plagas Las plagas pueden dañar a las plantas directamente. A fin de incrementar la resistencia a los mismos se han utilizado distintos enfoques transgénicos. La transgénesis se ha usado exitosamente para desarrollar resistencia efectiva y durable en un amplio rango de es- pecies vegetales.1% de proteína soluble. Varios insectos como Wiseana spp . pero no existe una resistencia natural a estos virus que sea transferible. Teleogryllus commodus.CYVV) afectan negativamente el crecimiento y desarrollo de las leguminosas.2. Como ejemplo cabe citar la obtención de plantas de trébol blanco que expresan un gen quimérico Bt cry1Ba modificado y acumulan en las hojas la delta-endotoxina Cry1Ba a niveles del 0.4). Se han identificado fuentes potenciales de tolerancia o resistencia en alfalfa y en unas pocas especies de Trifolium.

como se ha observado en plantas transgénicas de álamo. que son poco digeribles. como Neotyphodium. Recientemente fue aislado y caracterizado un ADNc de plantas de raigrás perenne homólogo de este gen.to de la larva y una mayor mortalidad de estas cuando se la compara en la misma situación utilizando plantas control . Este gen desempeña un rol importante en el control de la iniciación floral y en el mantenimiento de un estado floral determinado en maíz. Otro blanco para la manipulación del desarrollo reproductivo en forrajeras es el gen INDETERMINATE1 (ID1). donde la expresión en hoja de aprotinina a niveles de 0. tales como el inhibidor de tripsina pancreática bovina o aprotinina en trébol blanco.1 Manipulación de alérgenos del polen La fiebre del heno y el asma alérgico estacional debido al polen de las gramíneas son enfermedades ambientales que afectan hasta el 25% de la población en climas templado-fríos. tales como los ortólogos (genes que tienen la misma estructura y función y un origen común) de LEAFY o APETALA1. thaliana. Se han informado modificaciones en el tiempo de floración en plantas transgénicas a través de la regulación de la expresión de genes involucrados en la iniciación del meristema floral. la floración y la senescencia. Esto ha llevado a pensar en la posibilidad de controlar o inhibir la floración en forrajeras transgénicas regulando negativamente la expresión de este tipo de genes. Lolp2 y Lolp5. que expresen y secreten proteínas insecticidas tales como toxinas Bt e inhibidores de proteasas que protejan a las gramíneas forrajeras de las plagas. Otra estrategia para proteger contra insectos plaga sería la transformación indirecta en gramíneas. Su mutación es la única conocida en monocotiledóneas que bloquea específica y severamente la transición hacia un crecimiento reproductivo. inhibiendo la producción de cañas florales. 2.3. 2. En 1997 se obtuvieron las primeras plantas transgénicas de raigrás perenne (Lolium perenne) y de raigrás Italiano (Lolium multiflorum) que llevan genes para Lolp1 y Lolp2 en antisentido. por lo tanto. La calidad del forraje podría mejorarse. siendo el principal alérgeno para el 49-67% de los pacientes alérgicos. mutaciones en uno o más de los genes involucrados en la determinación de identidad del meristema floral conducen a un desarrollo floral incompleto o nulo. utilizando un endófito (microorganismo que vive y se desarrolla dentro de los tejidos de la planta) transformado. Se espera que la inhibición de la transición de un estado vegetativo a la formación de cañas florales e inflorescencias en gramíneas incremente la Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 273 . Esto permitiría obtener cepas del endófito seguras para los rumiantes que las consuman. En A.2 Manipulación de cambio de fase y floración La disminución del valor nutritivo en algunas forrajeras perennes se encuentra asociada con el comienzo del crecimiento de las cañas florales. Al menos una proteína de cada una de estas clases ha sido aislada y caracterizada en detalle. bajo el control de un promotor específico del polen a fin de regular negativamente los alérgenos del mismo. El polen de raigrás es uno de los más abundantes en estas regiones.07% de proteína soluble reduce el ataque por las larvas de Wiseana. La expresión constitutiva de genes de Arabidopsis thaliana como LEAFY o APETALA1 conducen a un desarrollo precoz.3. Estas plantas permitirán estudiar el rol funcional in planta de es- tos alérgenos y permitirán explorar el potencial para la obtención de cultivares de raigrás hipoalergénico. cada una de las cuales está constituída por múltiples isoformas inmunológicamente indistinguibles que involucran 17 alérgenos que tienen un tamaño que va de 12 a 89 kDa.3 Crecimiento y desarrollo 2. Otro ejemplo lo constituye la utilización de inhibidores de proteasas. Este polen contiene por lo menos 4 clases principales de proteínas alergénicas. Se han aislado clones de ADNc para el principal alérgeno del raigras Lolp1. o retardando la senescencia. Más recientemente se obtuvieron plantas de raigrás anual (Lolium rigidum) que portan en antisentido un gen quimérico Lolp5.

bajo el control de promotores regulados por desarrollo. Este sistema se basa en la utilización de un promotor específico de senescencia de A. ya que la dispersión del polen es un factor importante en la evaluación de riesgo de las gramíneas genéticamente modificadas.calidad del forraje y. 2. Para la producción de semilla este bloqueo de la floración debería ser revertido. por ejemplo. existiendo además la tecnología adecuada para extraer las proteínas de interés dejando un residuo utilizable para la alimentación del ganado. La alfalfa tiene ciertas características que la convierten en un interesante biorreactor. la producción potencial de biomasa. En trébol blanco genes análogos de ipt quiméricos. mediada por el viento. que además posibilitarían el mantenimiento de los transgenes. Esto es de particular importancia para forrajeras transgénicas de polinización abierta. Germán . ver VIII. representaría una vía para la contención de transgenes. Se han utilizado diferentes enfoques para la manipulación del desarrollo reproductivo que podrían conducir a un bloqueo de la floración.5 Evaluación a campo de plantas forrajeras transgénicas A fin de determinar la estabilidad en la expresión de los transgenes. las hace atractivas para este fin.3) y a la androesterilidad (esterilidad de la parte masculina de la planta). vacunas. 2.3 Manipulación de la senescencia Se ha observado en plantas transgénicas que la producción autorregulada de citocininas conduce a la inhibición de la senescencia foliar (envejecimiento de la hoja que culmina en la muerte de la misma). 2. en consecuencia también disminuya la cantidad de alergenos del polen.3. al desarrollo de la apomixis (tipo de reproducción agámica común en ciertas especies de gramíneas. Por otro lado. en principio en pequeña escala. la capacidad de fijar el nitrógeno biológico y la habilidad para crecer en áreas marginales que poseen las forrajeras. Entre ellas se destacan la perennidad y la capacidad de producir dos ó tres cosechas en el año. La perennidad. que controla la expresión transgénica de un gen para la isopentenil transferasa ( ipt ) de Agrobacterium tumefaciens. La disponibilidad de tecnologías que permitan elevados niveles de expresión y contención de los transgenes permitirían utilizar a las forrajeras como biorreactores para la obtención de enzimas industriales. productos farmacéuticos. que controlara la supresión de ortólogos de estos genes. Se han desarrollado y evaluado plantas de alfalfa transgénicas productoras de enzimas microbianas involucradas en la degradación industrial de lignina y celulosa. anticuerpos y plásticos biodegradables. Este cultivo también ha sido utilizado para la producción de polímeros biodegradables como el polihidroxibutirato (PHB) mediante la introducción de tres genes de Ralstonia eutropha. provocan un retardo significativos en la senescencia y su aspecto es completamente normal. Las plantas que expresan este gen presentan un retraso en la senescencia foliar y no presentan anomalías de ningún tipo. el SAG12. que cataliza un paso en la biosíntesis de citocininas. La inhibición o el control de la floración en forrajeras transgénicas a través de la supresión antisentido de ortólogos de ID1 o LEAFY y APETALA1 podría conducir a incrementos en la calidad y a una mejora en los patrones de crecimiento estacional. evaluar los nuevos fenotipos e identificar los eventos de transformación adecuados para el desarrollo de germoplasma y cultivares transgénicos es necesario realizar ensayos de campo planificados. thaliana. en particular las leguminosas. Solo después de haber realizado estas evaluaciones se pueden integrar estos materiales en programas de mejoramiento molecular para el desarrollo de cultivares 274 SPANGENBERG.4 Agricultura molecular Las plantas transgénicas pueden ser utilizadas para expresar proteínas recombinantes heterólogas. asociados a senescencia. Una posibilidad para lograr este fin sería la utilización de un promotor inducible por cobre. entre otros. siendo esta una alternativa atractiva para la producción de biomoléculas en reemplazo de los sistemas microbianos.

En este ensayo se tuvieron en cuenta importantes características de bioseguridad. L) Análisis por el método de Southern utilizando el gen wcmv4 como sonda.transgénicos. como por ejemplo la presencia de una zona de dos hectáreas sembradas con leguminosas forrajeras que se sabe que no se cruzan con el trébol blanco. Las dimensiones de esta zona «buffer» Figura 1: Transformación de trébol blanco para resistencia virus. I) T-ADN del vector binario conteniendo el gen quimérico npt2 y el gen de la proteína de la cápside del wcmv4 (wcmv4) J) Análisis por PCR para la identificación preliminar de las plantas transformadas utilizando cebadores (primers) para el gen npt2. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal 275 . Un ejemplo ilustrativo de un diseño para ensayos de campo en escala reducida es el de plantas transgénicas de trébol blanco inmunes al virus del mosaico de la alfalfa. sembradas en bandas alternadas. trébol de Persia y alfalfa en esta zona «buffer». A-H) Sistema prolífico de regeneración de plantas resistentes al virus del mosaico de la alfalfa (AMV) y al virus del mosaico del trébol blanco (WCMV) a partir de explantos cotiledonales. K) Idem anterior pero utilizando cebadores para el gen wcmv. M) Análisis por el método de Northern de plantas transgénicas de trébol blanco expresando el gen quimérico wcmv4. La transformación se llevó a cabo utilizando Agrobacterium tumefaciens. El uso de leguminosas forrajeras como el trébol rojo. asegura que haya un elevado número de leguminosas no transgénicas floreciendo en el ensayo en el período crítico en que están floreciendo las plantas transgénicas motivo del experimento. utilizando npt2 como marcador de selección.

de plantas transgénicas de trébol blanco inmunes a AMV. A fin de determinar el flujo génico. la dispersión del polen. 3 A).Figura 3: A) Esquema de la liberación a campo. 276 SPANGENBERG. dos hileras de trébol blanco no transgénico se incluyeron en el diseño rodeando el perímetro del ensayo y las parcelas centrales con las plantas transgénicas. B) Estrategia para el desarrollo de germoplasma elite transgénico de trébol blanco inmune a AMV. denominado Feathermark. fueron diseñadas teniendo en cuenta consideraciones tales como la conducta de las abejas como polinizadoras del trébol blanco. basada en la utilización de PCR cuantitativa para detectar las plantas homocigotas para los transgenes (npt2 y AMV4). a pequeña escala. Germán . y determinaciones de flujo génico utilizando un gen marcador de fácil trazabilidad. Las semi- llas cosechadas de las plantas de trébol blanco no transgénico de estas dos hileras se analizaron utilizando una combinación de resistencia a antibiótico (resistencia a G418 mediada por un gen npt2 ubicado en el ADNT integrado en el genoma de las plantas transgénicas) y PCR para detectar la presencia del gen marcador de selección. Los resultados de este análisis confirmaron que este diseño de campo es adecuado para la evaluación de plantas transgénicas (Fig.

seguido por cruzas dialélicas entre la progenie T1 (