P. 1
Pemurnian Dan Karakterisasi Shiga Toksin 2f

Pemurnian Dan Karakterisasi Shiga Toksin 2f

|Views: 13|Likes:
Published by Yulia Darsih

More info:

Published by: Yulia Darsih on May 07, 2013
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOCX, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

11/14/2013

pdf

text

original

Pemurnian dan Karakterisasi Shiga Toksin 2f, sebuah Subtipe imunologis yang tidak berhubungan Shiga Toksin 2 Abstrak Latar

Belakang: Shiga-like toxin 2 (Stx2) merupakan salah satu faktor virulensi yang paling penting dalam Enterohaemorrhagic Escherichia coli (E. coli) strain seperti O157H7. Subtipe Stx2 beragam sehubungan dengan urutan mereka, toksisitas, dan distribusi. Itu paling beragam Stx2 subtipe, Stx2f, sulit untuk mendeteksi secara imunologis, tetapi menjadi lebih sering dikaitkan dengan penyakit manusia. Metode dan Temuan: Sebuah rejimen pemurnian dikembangkan untuk pemurnian Stx2f melibatkan pertukaran kation, interaksi hidrofobik, pertukaran anion, dan filtrasi gel. Berat molekul Stx2f B-subunit adalah sekitar 5 kDa, yang muncul secara signifikan lebih kecil dari Stx2a (6 kDa) pada gel SDS-PAGE, meskipun ukuran subunit A mirip dengan Stx2a (30 kDa). Stx2f ditunjukkan untuk menjadi aktif dalam tes sel-bebas dan berbasis sel. 50% dosis sitotoksik dalam Sel Vero adalah 3,4 atau 1,7 pg (tergantung pada kondisi uji), sekitar 3-5 kali lebih tinggi dari Stx2a archetypical, sedangkan aktivitas Stx2f dan Stx2a dalam sistem retikulosit kelinci bebas sel adalah serupa. Stx2f terikat untuk kedua globotrioselipopolysaccharide (Gb3-LPS) dan globotetraose-LPS (GB4-LPS, meniru untuk globotriaosylceramide dan globotetraosylceramide, masing-masing), namun kemampuannya untuk mengikat GB4-LPS jauh lebih kuat dari Stx2a. Stx2f juga jauh lebih stabil pada rendah pH dan suhu tinggi dibandingkan dengan Stx2a, menunjukkan racun itu sendiri dapat bertahan praktik penyiapan makanan keras. Kesimpulan: Di sini, kami detail pemurnian, sifat biokimia, dan toksisitas Stx2f, dari E. coli galur terisolasi dari merpati liar. Informasi yang diperoleh dalam penelitian ini akan berharga untuk karakteristik Stx2f dan menjelaskan perbedaan Stx2a dan Stx2f dalam host kekhususan dan sitotoksisitas. Pengantar Sekelompok kontaminan bakteri utama dan berpotensi mematikan, enterohemorrhagic Escherichia coli (E. coli) subtipe bertanggung jawab bagi banyak wabah penyakit karena makanan terakhir. Sebuah subset dari patogen, toksin Shiga yang menghasilkan E. coli (STEC), dapat menghasilkan gejala dari diare berdarah yang berpotensi mengancam nyawa sindrom uremik hemolitik (HUS) [1]. Yang paling terkenal serotipe STEC adalah E.coli O157: H7, tetapi banyak non-O157 serotipe dapat menyebabkan penyakit parah dan kontaminasi makanan wabah, termasuk mematikan 2011 wabah O104: H4 di Jerman [2-4]. Strain STEC memperoleh banyak virulensi mereka dari pelepasan Shiga-seperti racun (Stxs), yang ada banyak varian dan subtipe yang berbeda [5,6]. Proliferasi non-Serotipe O157 memproduksi Stx menunjukkan bahwa STEC yang menjadi kelompok yang sangat beragam dan heterogen patogen [7]. Stxs sendiri tampaknya tumbuh dalam keragaman juga, menyoroti pentingnya terus meningkatkan metode untuk mereka deteksi dan karakterisasi. Stxs terdiri dari katalitik Sebuah subunit dengan pentameric B subunit protein kompleks untuk penargetan dan mengikat host reseptor. Oleh karena itu mereka jatuh ke dalam kategori AB5 dari bakteri racun, bersama dengan kolera dan pertusis toksin [8]. Internalisasi dari Stx ke dalam sel target dimediasi oleh B-subunit pentamer, yang melekat pada globotriaosylceramide lipid membran (Gb3Cer) atau globotetraosylceramide (Gb4Cer) [9]. Sebagian besar toksisitas Stx dimediasi oleh katalitik A subunit, yang merupakan rRNA N-glikosidase yang memotong satu adenosine residu dari 28S rRNA dan 28S inactivates subunit ribosom [10]. Dua kelas utama Stxs di E. Coli adalah Stx1, yang hampir identik dengan toksin dari Shigella genus, dan Stx2. Stx1 dan Stx2 dapat ditemukan mandiri atau bersama-sama dalam O157: H7 dan serotipe lain STEC [11]. Urutan Stxs biasanya dilakukan pada lambdoid bakteriofag, membuat mereka

. Stx1 dan Stx2a juga memiliki toksisitas yang berbeda pada jenis sel yang berbeda: Stx1 adalah lebih (10 kali) beracun dari Stx2a ke makrovaskular otak manusia sel endotel. bagaimanapun.13]. Meskipun Stx1 telah terbukti lebih beracun bagi Vero (hijau monyet ginjal) sel dibandingkan Stx2a. Ia telah mengemukakan bahwa strain yang mengekspresikan Stx1 dan Stx2a kurang beracun daripada yang hanya mengungkapkan Stx2. sementara Stx2a jauh lebih mematikan (1000 kali) untuk sel endotel mikrovaskuler [20]. 2c. Dalam studi ini. sedangkan Stx2e lebih divergen baik di tingkat asam amino dan genom. Sementara produksi dan pemurnian rekombinan Stx dan yang subunit telah terdokumentasi dengan baik. Pada babi. coli dalam usus yang terinfeksi [12]. meskipun perbedaan serotipe atau host latar belakang juga dapat menjelaskan ini. dan rilis toksin terjadi pada bagian ketika E. Produksi Stx2 diprakarsai oleh fag promotor akhir-fase. Stx2f untuk mengembangkan antibodi Stx2f-spesifik untuk imunodiagnose dan menyelidiki peran Stx2f dalam patogenesis manusia penyakit. ada perbedaan besar di antara toksisitas Stx varian dan subtipe. Stx2a. Itu pertama kali diisolasi pada merpati [24] dan awalnya dianggap tidak terlibat dalam penyakit manusia. Antibiotik yang menginduksi respon SOS bakteri. Penelitian kami sebelumnya menunjukkan bahwa sebagian antibodi terhadap Stx2a tidak bereaksi silang dengan Stx2e dan 2f [26]. atau setidaknya sebagian murni. produksi Stx2e bisa mengakibatkan penyakit edema mematikan [23]. coli tetapi juga untuk nonpathogenic E. prognosis untuk individu yang terinfeksi STEC yang memiliki telah diobati dengan antibiotik tertentu (misalnya ciprofloxacin) adalah sebenarnya lebih buruk daripada mereka yang tidak menerima antibiotik pengobatan sama sekali [16]. bagaimanapun. dan karena itu membebaskan jumlah yang cukup toksin [14. ini akan dipertahankan. mungkin karena kompetisi untuk reseptor sel inang yang sama [21]. coli. Nomenklatur baru yang diusulkan oleh Scheutz et al dalam 2012 digunakan dalam penelitian ini [17]. tetapi umumnya hanya menyebabkan gastroenteritis ringan [22]. Purifikasi Stx2e dan Stx2f rumit karena kurangnya alat pelacakan. Stx2f adalah yang paling berbeda (dengan genomik dan urutan asam amino) yang dikenal Stx2 subtipe. penyebab lisis dari STEC oleh bakteriofag. mungkin menjelaskan peningkatan toksisitas pada manusia. Stx2e ditemukan dalam strain STEC manusia. Fag gen promotor-driven akhir-fase seperti sebagai Stx2 juga responsif terhadap respon SOS. Untuk ini alasan. Sekarang harapan kami bahwa mendapatkan Stx2f murni dapat membuka jalan arah memproduksi antibodi Stx2fspesifik. Namun. Asosiasi antara berbagai Stx2 subtipe tidak diketahui. mungkin telah dikurangi toksisitas. dan pengembangan metode deteksi peningkatan dan perawatan untuk penyakit yang disebabkan oleh Stx2f-mengekspresikan STEC. dan memiliki jauh lebih parah konsekuensi klinis dari Stx1 [18]. Jika ada modifikasi yang terjadi toksin sementara ia keluar dari E. ada tambahan manfaat untuk memperoleh toksin alami dirilis langsung dari alam liar ketik kultur bakteri. Ini menekankan kebutuhan untuk memiliki murni. studi terbaru dan kemajuan dalam deteksi Stx2f telah menentukan bahwa Kehadiran Stx2f di STEC manusia terus meningkat [25]. Strain STEC yang memiliki lebih dari satu jenis Stx. dan Stx2g subtipe sebelumnya telah menunjukkan [26]. coli terkait gastroenteritis. Stx2a adalah 100 kali lebih beracun daripada tikus Stx1 [18. dan saat ini tidak ada antibodi efektif terhadap subtipe ini tersedia. seperti mitomycin C dan ciprofloxacin. kami detail empat langkah skema pemurnian untuk subtipe Stx2f dan membandingkan sifat Stx2f dengan Stx2a relatif lebih dipahami. Meskipun setiap Stx dapat memperburuk E. Setiap faktor bakteri lainnya yang mengasosiasikan dengan Stx mungkin juga bertahan selama rejimen pemurnian. Stx2d.mudah transduced tidak hanya antara serotipe yang berbeda dari E. tetapi pemurnian dan karakterisasi dari subtipe Stx2e dan 2f tetap dilaporkan.15]. coli segaris oleh fag [9. dan 2d terkait dengan perkembangan HUS.19]. Stx2c dan 2g sangat mirip dengan Stx2a prototipikal. Pemurnian prototipe Stx2a dan erat terkait Stx2c.

Amonium Sulfat endapan Stx2a diendapkan dari 250 mL supernatan sel dengan menambahkan padat saturasi NH4SO4 sampai 70%. Interaksi hidrofobik Chromatography (HIC) Berdasarkan hasil ELISA. pada 3 mL / min. Campuran itu kemudian disentrifugasi (5 kG. Bakteri kemudian tumbuh selama 24 jam pada 37uC dengan agitasi. PH ini 4 supernatan sel ditambahkan langsung ke 5 mL SPHP kolom tukar kation pada A ¨ kta FPLC (GE Life Sciences) yang sebelumnya diseimbangkan dengan 50 mM natrium asetat (NaOAc). toksin dielusi dengan 20 ml NaCl gradien (0 sampai 0. 20 mL kultur starter mengandung LB broth (Fisher) ditumbuhkan semalam di 37uC dengan agitasi. pada 3 mL / menit.2 mm). dan dikumpulkan dalam 1 mL fraksi. coli yang digunakan termasuk dalam Tabel 1. menggunakan 4 mL kolom desalting Zeba. Stx2a dan Stx2fmengekspresikan strain RM10638 (Stx2a) dan RM7007 (Stx2f) digunakan untuk produksi toksin [26]. Sekitar 3 mL sebagian (kation exchange) dimurnikan toksin demikian diinjeksikan kedalam 5 ml Phenyl HP kolom. pada 1 mL / menit.5 mL fraksi. Fraksi yang mengandung toksin murni (oleh Coomassie pewarnaan) yang dikumpulkan. Toksin adalah dielusi dengan 10 mLNaCl gradien (0 hingga 1 M) dalam 20 mM 13DAP.6 M) dalam 50 mM NaOAc. 20 NaPO4 mM. dan pelet itu resuspended fosfat buffered saline (PBS.3 di persiapan kromatografi penukar kation. dan menengah adalah steril disaring (PVDF. pH 9. coli Strain dan Kondisi Pertumbuhan Semua strain E. The Stx2a mengandung pelet kemudian penyangga dipertukarkan menggunakan 4 mL Zeba desalting kolom (Thermo Ilmiah) sampai 50 mM natrium asetat (NaOAc) pH 4. kemudian diencerkan 1/50 dalam 500 mL LB ditambah dengan 50 ng / mL mitomycin C (Sigma-Aldrich) bila diindikasikan.4). pada 4uC). 150 mM NaCl. kemudian disentrifugasi pada 5 kG selama 15 menit. terkonsentrasi . Toksin kemudian dielusi dengan 25 mL NH4SO4 gradien (1-0 M) di 50 NaPO4 mM. Kolom dielusi pada 0. Setelah mencuci dengan 50 mM NaOAc. dan dikumpulkan dalam 0. pH Memperbaiki dan kation Kromatografi Pertukaran (CEC) Budaya Stx2f supernatan pH ditetapkan untuk 4 menggunakan asetat glasial Asam (sekitar 10 mL 14. dan sekitar 0. fraksi dari CEC mengandung Stx2f dikumpulkan. 0.3-diaminopropane (13DAP). dikelantang. dan dibuang. pada A ¨ kta FPLC. pH 7. pH 5.3 gantinya pH 5.7 mL disuntikkan ke sebuah Sephacryl 100 16/60 kolom filtrasi gel pra-disetimbangkan dengan PBS pada A ¨ kta FPLC.) dan steril disaring (PVDF. Sekitar 3 mL yang dimuat pada 1 mL Q HP anion pertukaran kolom. pH 7 menggunakan 4 mL Zeba desalting kolom. pH 7. dan buffer ditukar dengan 50 mM natrium fosfat (NaPO4) +1 M NH4SO4. pH 5. diseimbangkan dengan 20 13DAP mM.2 mm) untuk kejelasan. Pelet sel yang diautoklaf.5 mL / menit. K12 E. tapi tanpa pH-memperbaiki dan menggunakan 50 mM NaOAc. pH 9. Protein Stx2a dimurnikan dengan cara yang sama.Bahan dan Metode E.3. pH 4. pH 5. fraksi dari HIC mengandung Stx2f dikumpulkan. 15 min. 15 min.3 M asam asetat). Anion Kromatografi Pertukaran (AEC) Berdasarkan hasil ELISA. fraksi dari AEC yang mengandung Stx2f dikumpulkan. 0. maka Campuran disentrifugasi (5 kG. dan buffer ditukar dengan 20 mM 1. pH 7. dan dikumpulkan dalam 1 mL fraksi. Gel Filtrasi Berdasarkan hasil ELISA. coli strain digunakan sebagai kontrol non-toksin yang memproduksi untuk kurva pertumbuhan. diseimbangkan dengan 50 mM NaPO4 +1 M NH4SO4.

2 mm PVDF filter. Sifin Institute. 0. Absorbansi diukur pada 450 nm pada Victor II plate reader (Perkin Elmer).). dengan Lightning-Link HRP Konjugasi Kit. Berlin. Western Regional Research Center (USDA ACUC Protokol # 09-J-10).05%) (PBST).3 N H2SO4. diikuti dengan penambahan 100 ml 0. Gel SDS-poliakrilamida elektroforesis (SDS-PAGE). Ketika menghitung pI toksin kompleks. dan Blots Barat Semua sampel untuk analisis SDS-PAGE diinkubasi selama 5 menit pada 75uC sebelum loading ke gel. Kedua antibodi diencerkan 1/10. tikus poliklonal serum untuk Stx2f. Untuk bercak Barat. dengan pengecualian dari sel pelet (95uC selama 10 menit. Amersham Hybond-P). setelah HALAMAN. Gb3-LPS dan GB4-LPS Binding Pengujian . Jerman) untuk Stx2a.org / compute_pi /). Membran adalah diblokir dengan 2% ECL Perdana memblokir agen (GE Healthcare) di PBS-Tween-20 (0. atau kelinci anti-Stx2a-HRP konjugat (dihasilkan dari antibodi disiapkan sebagai bawah. sebuah Stx2f Nya-tag A subunit konstruk dikembangkan menggunakan pTrcHis2 TOPO kloning kit (Invitrogen). Setelah memblokir piring dengan 200 ml susu 5% dalam PBS-Tween 20 (0. dan disterilkan dengan 0. Produksi Poliklonal a-Stx2f dan-Stx2a Sera Untuk mengembangkan antibodi poliklonal Stx2f. Goat antiIgG-HRP (Promega) digunakan sebagai antibodi sekunder. ELISAs ELISAs untuk pemantauan Stx2a dan 2f pemurnian yang directwell tes mengikat. Untuk mengembangkan Stx2a antibodi poliklonal. 000 di memblokir penyangga selama 1 jam pada RT. sera dikumpulkan menggunakan ekor berdarah vena. Gel (4% -12% NuPAGE Novex Bis-Tris Mini gel dari Invitrogen) dijalankan setelah produsen spesifikasi dan diwarnai dengan SimplyBlue Aman Stain (Invitrogen) untuk visualisasi protein. Berat Molekul dan Perhitungan titik isoelektrik Perkiraan berat molekul dan titik isoelektrik (pI) adalah dihitung dengan menggunakan ExPASy Compute pI / MW tool (http://web.45 mm. Stx pada membran yang terdeteksi dengan baik tikus antibodi anti-Stx2f (disiapkan sebagai ditunjukkan di bawah) dan anti-IgG-HRP (Promega). Innova Biosciences) dan kemudian dikembangkan dengan Lumigen TMA-6 (Lumigen) substrat. Fraksi dikumpulkan diencerkan 1/25 di final volume 100 ml dalam PBS dan terikat langsung ke Nunc datar baik piring maxisorp bermalam di 4uC.05%) (PBST). Antara setiap langkah pelatdicuci 3 kali dengan 200 ml PBST.expasy.oleh Amicon Ultra filter (10 ukuran pori kD) (Millipore). mereka kemudian diinkubasi dengan 100 ml antibodi primer: Sifin 2A (clone VT135 / 6-B9. Satu minggu setelah injeksi ke-3. Bercak Barat divisualisasikan dengan eksposur 2 menit menggunakan FluorChem HD2 (Alpha Innotech). 5 mg Stx2f di 2 mL PBS digunakan untuk menyusun kembali botol MPL-TDM (Sigma) intraperitoneal ajuvan dan disuntikkan ke dalam Balb / c tikus 3 kali pada 2 minggu interval. dan plat dikembangkan dengan TMB substrat (Pierce). Coomassie Pewarnaan. kelinci diimunisasi dengan katalitis aktif Stx2a toksoid (E167Q mutasi) dan serum dikumpulkan dengan pungsi jantung dengan exsanguination (prosedur yang dilakukanoleh Pacific Imunologi). protein yang electroblotted ke membran PVDF (Ukuran pori. Pernyataan Etika Semua prosedur dengan hewan dilakukan sesuai dengan pedoman kelembagaan untuk peternakan disetujui oleh Animal Perawatan dan Penggunaan Komite Departemen Pertanian AS. urutan asam amino dari subunit A diikuti oleh lima mengulangi urutan subunit B digunakan sebagai input. Nya-tag Stx2f Sebuah subunit dinyatakan dalam TOP10 sel (Invitrogen) diinduksi dengan IPTG 1 mM dan dimurnikan menggunakan Ni-NTA afinitas kolom (Qiagen).

000) dan diinkubasi selama 1 jam di RT. dan kemudian didistribusikan ke piring kultur sel yang diobati 96-. Perhitungan Koefisien Kepunahan Absorbansi Stx2f murni pada 280 nm pada 200. 5% CO2). Sinyal dideteksi dengan 100 ml SuperSignal Barat Pico chemiluminescent Substrat (Thermo Scientific) dan membaca II plate reader Victor (Perkin Elmer). Nilai-nilai yang diplot dan.The Gb3/Gb4-LPS binding assay dilakukan mirip dengan tradisional Sandwich ELISA. sel-sel menerima racun dan diencerkan dalam DMEM +10% FBS (100 ml / volume baik akhir) di salah satu dari dua formulasi. dan CWG308 ctrl. dan 50 mg / mL dianalisis dengan Nanodrop (Thermo Scientific) di rangkap tiga. Untuk memanaskan mengobati Stx2f dan Stx2a. sebuah Gb3 meniru) atau globotetraose-LPS (Pglycan. Vero Pengujian Sitotoksisitas your Vero (hijau Afrika monyet ginjal) sel [30] dikultur dalam Dulbecco itu Modified Elang Menengah (DMEM. dengan menggunakan berbagai pengenceran Stx2f dan Stx2a untuk menentukan penghambatan 50%.05 OD600 dalam buffer karbonat (0. 500 ng /mL toksin diinkubasi dalam buffer NaOAc pada suhu yang ditunjukkan selama 1 jam. CWG308 pJCP-lgtCDE. 000 dilusi dalam menghalangi penyangga 1/5 dan diinkubasi selama 1 jam di RT. dimaksud dalam penelitian ini sebagai'' GB4-LPS''.72 (0. Pada bagian pertama. dan pemecahan untuk 50% (0. 100. pH dan Panas Perawatan Untuk pH mengobati Stx2f dan Stx2a. Antara setiap langkah pelat dicuci 3 kali dengan 200 ml PBST. di mana a dan b ditentukan oleh plot. pH 9. Sel E. In vitro Assay Terjemahan Tes terjemahan bebas sel dilakukan dengan sebelumnya dijelaskan kelinci retikulosit protokol lisat [29]. Dalam kedua. 500 ng / mL toksin diencerkan dalam NaOAc penyangga (250 mM) pada berbagai nilai pH dan dibiarkan menetaskan di RT selama 1 jam.28] diencerkan menjadi 0. Semua foto diambil menggunakan Leica DM IL mikroskop di 200x pembesaran. 24 jam kemudian. coli Formaldehyde-fixed mengekspresikan globotriose-lipopolisakarida (Id glycan. GB4 meniru) atau Kontrol sel E. dan tumbuh dalam sel dilembabkan budaya inkubator (37uC. Stx2f atau Stx2a racun kemudian diencerkan dalam menghalangi penyangga ditunjukkan konsentrasi dan diinkubasi di piring selama 1 jam pada RT.5). sebagaimana dimaksud dalam penelitian ini sebagai'' Gb3-LPS''.52a) / b untuk semi-log. Dosis sitotoksik 50% (CD50) merupakan jumlah racun yang diperlukan untuk membunuh 50% dari monolayer terpasang sel dalam sumur. Anti. dan pendaran diukur menggunakan II piring pembaca Victor. coli (CWG308 pJCP-Gb3. Wells adalah kemudian diblokir dengan 200 ml susu 5% / PBST selama 1 jam pada RT.lipat dengan DMEM / media kultur FBS. ekstrapolasi untuk memperkirakan koefisien kepunahan Stx2f pada 1 mg / mL.1 M NaCO3. Sel-sel kemudian segaris menggunakan 100 ml / sumur 1/5 pengenceran CellTitre-Glo reagen (Promega). masing-masing) [27. dan sel dikembalikan ke inkubator untuk tumbuh selama 24 jam. Setelah pengobatan. 100 ml / sumur toxincontaining Media telah dihapus dan diganti dengan media yang segar. Sel diinkubasi pada 4uC selama 1 jam. campuran tersebut diencerkan 100 . dan diinkubasi 100 ml / sumur . Invitrogen) ditambah dengan 10% serum janin sapi (FBS) (Invitrogen). dengan menggunakan standar yang linear kurva. racun itu hanya ditambahkan ke sel dan diinkubasi selama 24 jam. diencerkan sampai 105 sel / mL. Kambing anti-IgG HRP atau kambing anti-kelinci IgG HRP (Promega) kemudian ditambahkan (100 ml di 1/5. Itu sel trypsinized.Stx2f mouse atau anti-Stx2a kelinci poliklonal serum kemudian ditambahkan pada. CD50 yang didekati dengan memplot tiga poin dalam bagian linear dari grafik.6) dan 100 ml terikat ke sumur dari 96-Nunc Maxisorp plat hitam oleh inkubasi pada 50uC sampai semua cairan telah menguap. Ini biasanya 2.

Jumlah Stx di media adalah jauh lebih besar daripada di lisat sel (Gambar 1C). 9. sehingga Stx2f dan Stx2a dimurnikan eksklusif dari media disaring. Reseptor-pengikatan Stx2f Untuk membandingkan interaksi Stx2f dengan Gb3Cer dan Gb4Cer reseptor. kemudian kromatografi penukar anion (AEC) (Gambar 2C). Ini sesuai dengan fase diam dalam budaya ini. tetapi MW band yang lebih rendah jelas lebih kecil dari subunit B dari Stx2a. GF. Agar memperoleh Stx2f murni. pengikatan dimurnikan Stx2f ke sel-globotriose atau globotetraose-lipopolisakarida (LPS-Gb3 atau GB4LPS) pada permukaan diukur dengan'' roti'' ELISA.1). 1C. Elusi toksin tersebut dipantau oleh ELISA menggunakan anti-Stx2f A subunit antibodi poliklonal tikus yang dikembangkan dalam penelitian ini.5 NaOAc di DMEM / FBS kontrol memiliki toksisitas diabaikan (data tidak ditampilkan). Skema pemurnian sebelumnya dikembangkan untuk melibatkan Stx2a beberapa langkah menggunakan kromatografi ukuran dan berbasis biaya [31] atau kolom afinitas antibodi [26. Skema ini pemurnian diproduksi 5.6 kDa untuk A. Berdasarkan estimasi menggunakan ExPASy Compute pI / Alat MW. kita difokuskan pada pengembangan pemurnian berbasis kolom semi-otomatis rejimen menggunakan A ¨ kta FPLC (GE Biosciences). Karena tidak ada secara komersial antibodi monoklonal yang tersedia mengikat Stx2f dengan afinitas tinggi.5 mM. Setelah final pemurnian langkah.9 kDa untuk subunit B. Ekspresi maksimal dan pembebasan Stx2f racun ke dalam media kultur dicapai setelah 24 jam pertumbuhan bakteri dengan 50 ng / mL mitomycin C (Gambar 1C). untuk Stx2a dan Stx2f bervariasi secara dramatis (Stx2a pI: 6.3. masing-masing).6 kDa untuk B). Stx2f pI: 9. 9.8 kDa untuk subunit A. dan mirip dengan ekspresi Stx2a. jalur 5). Atas Band memiliki berat molekul mirip dengan A subunit dari Stx2a (seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2E. Produksi racun dan lisis sel di kedua strain sangat meningkat pengobatan dengan mitomycin C (Gambar 1B. Meskipun Stx2f . pH 1.dengan sel Vero selama 1 jam pada 4uC. coli strain (Tabel 1) mengungkapkan Stx2f atau berbagi Stx2a serupa Pertumbuhan kinetika (Gambar 1A). para MW dari Stx2f dan Stx2a sangat mirip (Stx2a: 35. Stx2f: 35. Coli sel. diikuti dengan kromatografi interaksi hidrofobik (HIC) (Gambar 2B). Coli mengekspresikan Gb3-LPS atau GB4-LPS yang bergerak pada 96 . Ditemukan bahwa Stx2f terikat untuk kedua Gb3-LPS dan GB4-LPS yang mengandung E. dan akhirnya gel filtrasi (GF) (Gambar 2D). meskipun strain Stx2a tumbuh lebih kokoh dan mencapai densitas optik maksimum yang lebih tinggi (OD). Sel E. Tidak jelas mengapa Stx2f B subunit muncul kecil pada SDS-PAGE. persiapan yang dimurnikan 4524 kali lipat dengan pemulihan 2% (yang diukur dengan toksisitas sel Vero) adalah diperoleh (Tabel 2) (Gambar S1).piring baik dan mengikat Stx2f diamati menggunakan mouse antibodi poliklonal terhadap Stx2f untuk deteksi. Perkiraan titik isoelektrik (pI). dan kemudian media digantikan dengan 100 ml segar DMEM / FBS selama 24 jam. Kepunahan koefisien dimurnikan Stx2f protein toksin kami adalah 0. seperti di atas. Sel-sel segaris dan pendaran diukur dengan menggunakan 1/5 pengenceran 100 ml / sumur CellTitreGlo reagen dan II piring pembaca Victor. sebuah protokol empat langkah didirikan: media pHfixed kromatografi tukar kation (KTK) (Gambar 2A). menggunakan alat yang sama. Hanya dua band yang terlihat pada gel (Gambar 2E. jalur 6). Mengobati sel Vero dengan 2. Sifat biokimia dari Subtipe Stx2f Kemurnian dan molekul bobot untuk subunit Stx2f setelah GF langkah dianalisis menggunakan SDS-PAGE diikuti oleh Coomassie pewarnaan. Hasil Ekspresi dan Pemurnian Subtipe Stx2f E.32].2 mg dimurnikan Stx2f dari 450 mL kultur bakteri supernatan (Tabel 2).60 mL mg21 CM21 pada 280 nm.

dan menetralkan Stxs. yang dikenal untuk mengikat Gb4Cer lemah dalam tes lainnya [33]. toksisitas dieliminasi [34]. Informasi ini menunjukkan bahwa. Karena Stx2f lebih stabil pada pH rendah. Namun.37]. dan semua yang terdeteksi oleh PCR dan immunoassays. Untuk alasan ini. sehingga penghentian sintesis protein (Gambar 3C). Ini adalah masalah rumit. R170. Konsentrasi titik tengah (IC50) untuk penghambatan penerjemahan adalah 3. Ketujuh dominan Stx2 subtipe (Stx2a ke 2g) telah dikaitkan dengan penyakit manusia [39]. Dalam kondisi eksperimental kami. kita mendalilkan bahwa Stx2f mungkin lebih termo-toleran juga. karakteristik. dan dipamerkan luar biasa preferensi mengikat terhadap sel-Gb3 LPS (Gambar 3B). sedangkan Stx2f tetap sangat ampuh (Gambar 4A. STEC serotipe dan Stxs sendiri sangat beragam. termasuk N75. Y77. Aktivitas enzimatik dan sitotoksisitas Stx2f Sebagian besar situs aktif Stx2f adalah identik dengan Stx2a. sementara Stx2f kurang beracun dari Stx2a dalam kultur sel. itu dipamerkan mengikat relatif kuat untuk GB4-LPS sel bila dibandingkan dengan Stx2a. STECs bertanggung jawab untuk beberapa yang paling wabah penyakit yang ditularkan melalui makanan luas dan mematikan di akhir sejarah.atau 5 kali lipat lebih tinggi. Kami mengamati bahwa kedua metode ini tidak setara. khususnya Stx2s. Sel Vero dirawat oleh dua metode yang berbeda dan 50% dosis sitotoksik (CD50) dari Stx2f ditunjukkan untuk menjadi 3 . menginkubasi sel dengan racun selama satu jam di 4uC. tetapi . tetapi belum tentu seluruh studi. Metode (1) adalah sebanyak 5 kali lebih sensitif dibandingkan metode (2). toksisitas Stx2f dan Stx2a benar-benar dihilangkan. dengan selisih yang cukup (Gambar 4B). Meskipun dimurnikan Stx2f efektif membunuh Sel Vero (Gambar 3D-a). dan mengganti racun terikat dengan media segar. Oleh karena itu. kemurnian asli racun. umumnya tampaknya menjadi lebih stabil. Selain itu. Setelah inkubasi selama satu jam di 250 mM natrium asetat pada pH 1. menunjukkan Stx2f yang cukup kurang beracun dibandingkan dengan Stx2a (Tabel 3). Stx2fcontaining Media menghambat terjemahan dalam in vitro assay [35].5. adalah kunci untuk mencegah dan mengobati wabah masa depan. setelah pH 2 pengobatan. Berbeda CD50 nilai telah dilaporkan untuk Stx2a [36. Perbedaan antara kedua metode adalah (1) menambahkan racun ke sel Vero dan menginkubasi sel-sel pada 37uC semalam atau (2) menambahkan toksin. Stabilitas Subtipe Stx2f Asetat diproduksi oleh mikroorganisme komensal mungkin bertanggung jawab untuk menghasilkan pH usus rendah yang menghambat untuk Stxs serta Stx ekspresi [38]. sedikit lebih tinggi daripada bahwa Stx2a (2. dan penelitian mendeteksi. memiliki situs katalitik terbuka untuk aktivitas N-glikosidase. sebuah inkubasi 72uC diberikan Stx2f lebih beracun dari Stx2a. namun. R176 dan posisi itu. Oleh karena itu kami berasumsi bahwa Stx2f.5 mg / mL). ketika bermutasi. Diskusi STECs dan Stxs mewakili serius dan terus berkembang kesehatan masyarakat keprihatinan. Stx2a telah kehilangan sebagian besar toksisitas. Sebuah dalam uji terjemahan vitro dilakukan pada kelinci retikulosit lisat (Promega) menegaskan bahwa utuh (A + B pentamer) dimurnikan Stx2f adalah mampu menonaktifkan ribosom. perbedaan ini mungkin disebabkan metode Vero sel pengobatan. uji viabilitas sel. Stx2a tidak mengikat sel GB4-LPS. perbandingan nilai absolut yang berlaku dalam studi. seperti subtipe lain dari Stx2. kami meneliti efek dari pH rendah dalam buffer asetat pada Stx2a dan toksisitas Stx2f dalam sel Vero. baik pada pH rendah dan panas. Meskipun inkubasi pada 95uC benar-benar tidak aktif baik Stx2f dan Stx2a.5 mg / mL. maka menginkubasi sel-sel pada 37uC semalam.memiliki preferensi ringan untuk Gb3-LPS (Gambar 3A). dan protokol pemurnian. E167. itu kurang beracun dari Stx2a (Gambar 3D-b). Gambar S2). dibandingkan Stx2a.

tidak seperti Stx2a. Stx2f yang tidak terdeteksi oleh semua tapi a immunoassays beberapa komersial (assay VTEC-RPLA menjadi salah satu pengecualian) [6]. Secara khusus. Kekhususan atau afinitas reseptor tampaknya menjadi penentu toksisitas [40]. mungkin hanya soal waktu sebelum Stx2f isolat menjadi manusia yang serius patogen. Stx2f memiliki telah ditunjukkan dalam studi ini dan sebelumnya untuk secara efektif membunuh sel-sel Vero dalam budaya [24]. tetapi murni Stx2f B subunit jelas fungsional (secara efektif membunuh sel Vero dalam budaya). prosedur pemurnian Stx2f yang sangat murni rinci di sini agak terlibat dan menghasilkan hasil yang rendah dari toksin. Fenomena ini (Stx2f B lebih kecil dari Stx2a B. toksisitas pada sel Vero. Namun. Ketika Q64E / K66Q mutasi ganda dimasukkan ke dalam Stx2e B subunit. afinitas reseptor. Karena katalitik kegiatan Stx2f dan Stx2a tampaknya setara. satu atau dua langkah afinitas pemurnian harus menjadi rutin dan kuat. Antigen digunakan adalah versi His-tag dari Stx2f A subunit. dan mengikat kedua Gb3-LPS dan GB4-LPS. dan diperkirakan bahwa ini adalah mengapa Stx2e. preferensi reseptor berubah dari Gb3/Gb4 ke Gb3 [41]. kami melaporkan bahwa Stx2f memiliki afinitas terhadap kedua Gb3-LPS dan GB4LPS. Stx2f. Stx2f tikus anti-serum disiapkan. Jika hal ini terjadi. seperti Stx2e. diduga menjadi lebih subunit epitop yang kaya. dan berbeda hanya dua asam amino. meskipun mekanismenya . sejak dimurnikan Stx2f belum terbukti. Untuk antibodi poliklonal masa depan persiapan. B subunit jawab tidak hanya untuk mengikat reseptor. kehadiran Stx2f dalam E. dengan sedikit preferensi terhadap Gb3-LPS (dalam tes kami melakukan). Dalam kasus apapun. Meskipun baru. Menggunakan antigen ini. kedua subunit A dan B harus terdeteksi. yang merakit sebagai AB5 tidak beracun toksoid. dan telah menghindari sebagian besar upaya karakterisasi sejauh ini. kita detail skema pemurnian untuk Stx2f. The Stx2f B subunit dapat dikenakan proteolitik yang tidak diinginkan kadang-kadang selama proses pemurnian. dan sangat mirip dengan Stx2a dalam hal katalitik Kegiatan (Gambar 3C). memperoleh toksin murni sangat menyederhanakan produksi toksin spesifik antibodi monoklonal. Hal ini dapat ditentukan oleh massa analisis spektrometri dari dimurnikan Stx2f (dalam persiapan). toksoid rekombinan katalitis aktif kompleks seperti E167Q mutan akan membuat antigen yang lebih baik [26]. Menggunakan murni Toksin Stx2f. masing-masing) identitas urutan asam amino untuk Stx2a [35]. tetapi juga reseptor preferensi. Setelah afinitas tinggi monoklonal antibodi untuk Stx2f tersedia. perbedaan preferensi reseptor. biasanya hanya menyebabkan gastroenteritis ringan pada manusia. coli saat ini tidak terkait dengan HUS.masing-masing metode deteksi tampaknya memiliki tertentu subtipe kekhususan. dan kehadiran 6xHis tag membuatnya mudah untuk memurnikan. bagaimanapun. Dalam rangka untuk memantau toksin Stx2f saat melakukan nya pemurnian. yang dapat mematikan bagi babi. meskipun juga mengikat dengan baik untuk Gb3 [33]. Jika Stx2f a toksoid yang tersedia untuk perbandingan. Meskipun menunjukkan hanya 71% dan 82% (A dan B subunit. Stx2f kurang beracun untuk sel Vero dari Stx2a. Gambar 2E) sulit untuk menjelaskan. memiliki Q64/K66. baik untuk kemudahan dan menghasilkan. Di sini. Di studi ini. juga akan menarik untuk catatan jika subunit B dari toksoid lebih kecil daripada Stx2a. seperti yang digambarkan oleh mutasi Stx2e. ada kemungkinan bahwa Stx2f tidak manjur sebagai Stx2a dalam sel Vero karena pengenceran'''' antara kedua Gb3 dan GB4 reseptor. coli galur yang mampu patogenisitas manusia. Ini tidak mengherankan. dan stabilitas di lingkungan itu mungkin temui dalam persiapan makanan atau selama perjalanan ke usus. kami menilai ligan mengikat disukai. karena subunit B dari Stx2e dan Stx2f hampir identik. Frekuensi rendah isolat Stx2f dalam penyakit manusia mungkin karena kemungkinan bahwa fag Stx2f belum memantapkan dirinya dalam E. Meskipun kita tidak tahu bagaimana beracun Stx2f murni in vivo. katalitik aktivitas. Pilihan reseptor untuk Stx2e adalah GB4. Namun. atau stabilitas antara Stx2a dan Stx2f subtipe mungkin bertanggung jawab untuk perbedaan toksisitas.

yang konsisten dengan hasil kami [30]. coli strain menyimpan Stx2a dan Stx2f mungkin terkena set berbeda protozoa predator. Menariknya. Stxs adalah biasanya dihasilkan dari usus. di mana Stx2f kehilangan hanya setengah toksisitas dan Stx2a hampir sepenuhnya tidak beracun. Ini telah ditunjukkan sebelumnya yang Stx2a tetap stabil sampai pH di bawah 3 ketika diinkubasi dengan pH-tetap PBS. hal ini menjadi jelas bahwa infeksi Stx2f lebih umum daripada yang kita sadari [25]. AB subunit chimera antara Stx2f dan Stx2a dapat membantu dalam menentukan subunit bertanggung jawab atas toksisitas dilemahkan.5 bahkan bisa menghambat Stx2f. tetapi asetat yang dihasilkan oleh bakteri komensal seperti Lactobacillus dan Bifidobacterium adalah mungkin untuk pH usus yang lebih rendah ke tingkat itu: Bifidobacterium menimbulkan konsentrasi asetat usus 56 mM dan menurunkan pH usus hanya 6. sehingga stabilitas pH Stx2f mungkin tidak relevan pada tingkat fisiologis patogenisitas manusia. Stx2f. Yang relatif rendah stabilitas termal diukur aktivitas toksin Stx2a juga mungkin karena penonaktifan dari subunit B untuk permukaan sel reseptor yang mengikat. Namun. Perbandingan antara toksisitas mouse dan toksisitas sel Vero bisa sangat mengungkapkan juga. Namun. dan lebih besar toksisitas. sehingga bahan makanan terkontaminasi dengan Stx2f mengandung STEC dapat dengan mudah diidentifikasi dan dihapus. Pada pH 2 dapat menghambat Stx2a.75 [42]. Stx2f-encoding STEC strain belum dianggap sebagai masalah kesehatan utama karena kurangnya keparahan dan kelangkaan infeksi. terutama aktivitas katalitik. Penelitian ini harus menyoroti kebutuhan untuk sistem deteksi kuat untuk Stx2f. karena kebanyakan Stx immunoassays miskin dalam mendeteksi Stx2f. atau pelepasan sitoplasma. dan dapat bertahan lebih mudah selama persiapan makanan. studi ini akan menjadi fokus futurework. mengurangi toksisitas Stx2f juga bisa dimediasi oleh penurunan pengikatan reseptor. yang resistensi terhadap sangat asam vakuola endolisomal akan menjadi aset berharga [43]. Hasil penelitian kami sebelumnya menunjukkan bahwa stabilitas termal Stx2a. dengan mengikat promiscuous nya. fenomena serupa jelas untuk pH 2 pengobatan (Gambar 4A). Kemungkinan lain adalah bahwa. bisa berubah tergantung pada asal-usulnya dan kemurnian [29]. lebih stabil untuk kedua pH rendah dan perlakuan termal. Ini akan memberikan alasan untuk stabilitas asam umum dan Stx2a Stx2f dan menunjukkan bahwa E. meskipun toksisitas relatif rendah dibandingkan dengan Stx2a. dan konsentrasi tinggi Stx2 dalam vesikula akan menghasilkan sebuah pulsa yang kuat racun. Tentu saja. dan membutuhkan kondisi yang lebih keras untuk menyebabkannya menjadi berantakan. Meskipun umum dalam vektor hewan di mana-mana (merpati). Meskipun kurang beracun dari dalam sel Vero Stx2a. Namun.tidak jelas. Murni Stx2f mempertahankan toksisitas setelah pH 2 atau 72uC pengobatan secara signifikan lebih baik daripada Stx2a (Gambar 4A dan 4B). Stx2f tidak muncul untuk menjadi umumnya lebih stabil. menunjukkan bahwa Stx2f mungkin memiliki struktur molekul yang lebih stabil termal. Kami telah disebutkan dalam studi ini bahwa asetat dihasilkan oleh mikrobiota usus mungkin tidak hanya menghambat ekspresi toksin Stx2 [38] tetapi juga aktif racun itu sendiri. Penelitian lain telah tersirat bahwa Stx berevolusi untuk pertahanan terhadap protozoa predasi. Tentu saja. pH 2 dekat dengan pH lambung asam. lebih eksperimen akan diperlukan untuk menentukan apakah toksisitas rendah Stx2a 72uC diobati sebenarnya karena berkurangnya aktivitas katalitik A subunit atau faktor lainnya. internalisasi. . beberapa faktor lainnya. Namun. sesuatu yang dibuat lebih terjangkau oleh dimurnikan toksin Stx2f. dan pada pH 1. Ada kemungkinan bahwa Stx2f AB5 kompleks itu sendiri mungkin akan lebih stabil. Stx2f lebih merata di seluruh permukaan sel dan terinternalisasi dalam vesikel pada konsentrasi yang lebih rendah. Stabilitas Stxs juga tampaknya berbeda antara subtipe yang ditandai. Stx2a dan Stx2f dimurnikan menggunakan protokol mirip dengan kemurnian yang sama dalam penelitian ini. dan menakutkan menunjukkan bahwa Stx2f bisa bertahan perjalanan dari mulut ke usus lebih baik dari Stx2a.

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->