MEDIOS DE CULTIVO. TIPOS, CLASIFICACIN, ENUMERACIN, ELABORACIN GENERAL Y UTILIZACIN DE LOS MISMOS.

TECNICAS DE INOCULACION, INCUBACION Y RECUENTO DE LA MUESTRA BIOLOGICAS. 1.- INTRODUCCION 2.- MEDIOS DE CULTIVO 2.1.- CONDICIONES GENERALES PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS 2.1.1.- DISPONIBILIDAD DE NUTRIENTES ADECUADOS 2.1.2.- CONSISTENCIA ADECUADA DEL MEDIO 2.1.3.- ESTERILIDAD DEL MEDIO 2.2.- CLASIFICACION 2.2.1.- SEGN SU ESTADO FISICO 2.2.2.- SEGN SU COMPOSICION 2.2.3.- SEGN AL USO AL QUE SE DESTINEN 2.3.- COMPOSICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO 2.4.- CONTROL DE CALIDAD 3.- PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO 3.1.- MODELO ESTANDAR DE PREPARACION 4.- MEDIOS DE USO COMUN EN EL LABORATORIO. 4.1.- AGAR SANGRE. 4.2.- AGARCHOCOLATE 4.3.- AGAR MCCONKEY 4.4.- CALDO TIOGLICOLATO 4.5.- AGAR SCHAEDLER 4.6.- AGAR KANA-VANCO 4.7.- AGAR BBE 4.8.- AGAR SALMONELLA-SHIGELLA 4.9.- KLIEGER (KIA) 4.10.-AGAR SABOREUAD 4.11.- AGAR MUELLER-HINTON 4.12.- AGAR THAYER-MARTIN 4.13.- AGAR CLED 5.- INCUBACION 6.- INOCULACION. 6.1.- SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO LQUIDO 6.2.- SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO SLIDO 6.2.1.- TUBO. 6.2.2.- PLACA PETRI.

1.- INTRODUCCION Koch realiz sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata como soporte nutritivo slido, pero no tard en recurrir al caldo de carne lquido, diseado por Loeffler, al que, en 1881, aadi gelatina, logrando un medio slido transparente ideal para la observacin de la morfologa macroscpica de las colonias microbianas. En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clsicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces. Actualmente se han preparado ms de 10.000 medios de cultivo diferentes. Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuadas, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. 2.- MEDIOS DE CULTIVO La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusin de estractos de carne y Peptona a la que se aadirn otros ingredientes 2.1.- CONDICIONES MICROORGANISMOS GENERALES PARA EL CULTIVO DE

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio. 2.1.1.- DISPONIBILIDAD DE NUTRIENTES ADECUADOS Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias 2

ciertas vitaminas y otras sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustacnias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones qumicas que tengan lugar. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparacin de estas sustancias para su aplicacin a los medios de cultivo provocaban la prdida de los factores nutritivos lbiles. Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, adems, representa una fuente fcilmente asequible de nitrgeno y carbn ya que la mayora de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las protenas naturales, tienen capacidad de atacar los aminocidos y otros compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la peptona. Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que se aade a muchos medios sustancias como suero, sangre, lquido asctico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamnica. Muy a menudo se aaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metablicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos. 2.1.2.- CONSISTENCIA ADECUADA DEL MEDIO Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo productos como albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en estado semislido o slido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusin de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay tambin gran cantidad de medios lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en el laboratorio. 2.1.3.- ESTERILIDAD DEL MEDIO Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la aparicin de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clsico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presin como agente esterilizante)

2.2.- CLASIFICACION Se pueden realizar distintas clasificaciones atendiendo a su estado fsico, composicin, el uso al que se destinan: 2.2.1.- SEGN SU ESTADO FISICO Se dividen en slidos, semislidos y lquidos: Slidos, presentan en su composicin una agente solidificante (AGAR) en proporcin de 12 a 15 gramos por litro. Semislidos, presentan AGAR en su composicin, pero a una concentracin mucho menor, entre 2,5 a 4 gramos del agente solidificante Lquidos, no presenta ningn agente solidificante 2.2.2.- SEGN SU COMPOSICION Se dividen en empricos, sintticos y semisintticos; empricos, en su composicin aparecen sustancias orgnicas sintticos, en su composicin aparecen sustancias qumicas definidas semisintticos, en su composicin aparecen molculas de naturales hidrolizadas 2.2.3.- SEGN AL USO AL QUE SE DESTINEN Se dividen en: enriquecidos, diferenciales o aislamiento, selectivos e inhibidores, transporte y mantenimiento, uso general, para filtros de membrana. enriquecidos, suelen ser medios con un nutriente simple que presentan enriquecedores, tales como sangre de caballo, etc. diferenciales o de aislamiento, contienen colorantes, azucares e indicadores para provocar la respuesta bioqumica conocida selectivos e inhibidores, adems de los componentes de los medios diferenciales, contienen en su composicin una serie de agentes que sirven para inhibir la flora acompaante de la muestra a estudiar, y aislar, de esta forma, el microorganismo que se busca. transporte y mantenimiento, se utilizan en la recogida, transporte y conservacin de muestras biolgicas. son medios muy reductores que inhiben las reacciones enzimticas autodestructivas dentro de las clulas evitando los efectos destructivos de la oxidacin. uso general, son medios que soportan el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos fastidiosos. filtros de membrana, son medios que permiten el examen de grandes volmenes con un baja concentracin de 4

microorganismos, la separacin de los microorganismos del medio de cultivo e incluso su cambio de un medio de cultivo a otro, permite el crecimiento sin interrupcin del microorganismo. 2.3.- COMPOSICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Los constituyentes mas utilizados en la composicin de los medios de cultivo son: agar, peptona, extracto de carne, extracto de levadura, sangre, plasma, suero, bilis, sales biliares, gelatina, carbohidratos, indicadores, Agar, comercialmente se presenta en grnulos y polvos, la concentracin en la que se encuentra en los medios de cultivo, depender del uso que quiera darse al medio. Peptona, es un producto de composicin variable, obtenido generalmente de la hidrlisis cida o enzimtica de las protenas vegetales o animales. Extracto de carne, contiene bases orgnicas solubles, productos de degradacin de las protenas, vitaminas y minerales. Extracto de levadura, se consigue a partir de levadura de pan o de cerveza y es una fuente de aminocidos y vitaminas del complejo B. Sangre, las mas utilizada es la de sangre o carnero, tiene que estar libre de agentes antimicrobianos para evitar la inhibicin el crecimiento de los microorganismos. Se debe de comprobar siempre la esterilidad, as como la ausencia de citratos ya que inhiben el crecimiento de estafilococos. Plasma, se utiliza para emplear la actividad coagulasa de las bacterias, se emplea plasma humano o de conejo. Suero, se prepara a partir de sangre recolectada sin adicin de anticoagulante, eliminando el lquido que se separa cuando se contrae el cogulo. Bilis, contiene varios cidos biliares, como compuestos conjugados con aminocidos, bilirrubina y biliverdina. Sales biliares, inhiben el crecimiento de bacterias grampositivas y bacilos en forma de esporas, sin afectar el desarrollo de los bacilos entricos gramnegativos. Gelatina, protena obtenida mediante extraccin de material colgeno a partir de tejidos animales... Es un agente solidificante pero se emplea poco ya que bastantes bacterias provocan su licuacin. Carbohidratos se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. 5

Indicadores, para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayora de las bacterias Gram-positivas). 2.4.- CONTROL DE CALIDAD Los medios de cultivo pueden prepararse en el laboratorio a partir de diferentes ingredientes qumicos o a partir de productos en polvo deshidratados comerciales, pero tambin pueden adquirirse medios listos para su uso. El laboratorio debe asegurarse de que la calidad de los medios de cultivo y reactivos es apropiada para los ensayos realizados. Se recomienda que provengan de empresas certificadas segn ISO 9000. El laboratorio debe asegurarse de que la certificacin cubre todas las operaciones relevantes, entre ellas las de suministro y entrega, cuando estas influyan en la calidad de los productos, deber solicitar tambin, una copia del certificado de registro ISO 9000 a los proveedores de los productos. El fabricante debera aportar, inicialmente, una "especificacin de calidad" que incluya el mayor nmero posible de los puntos siguientes: caducidad del producto condiciones de almacenamiento control de esterilidad, incluyendo criterios de aceptabilidad controles de la eficacia, incluyendo el microorganismo usado, referencia de la coleccin de cultivos y criterios de aceptabilidad fecha de emisin de la especificacin, plan y frecuencia de muestreo Se recomienda realizar controles adicionales con carcter aleatorio, para asegurarse de que los productos siguen cumpliendo las especificaciones requeridas. Estos controles pueden incluirse en el programa interno de control de calidad. Los medios de cultivo, productos en polvo deshidratados y reactivos comerciales deben consumirse antes de la fecha de caducidad. El laboratorio debe registrar la fecha de recepcin, la fecha de caducidad y la fecha de apertura del envase. El almacenamiento debe realizarse en las condiciones apropiadas. Todos los envases, especialmente los que contengan medios deshidratados, deben estar hermticamente cerrados. No deben utilizarse medios deshidratados que presenten apelmazamiento o un cambio de color. Los lotes de medios preparados segn formula en el laboratorio deben verificarse para comprobar que facilitan el crecimiento de determinados cultivos microbianos procedentes de una coleccin 6

reconocida y debe verificarse que los medios selectivos inhiben el crecimiento de microorganismos no deseados, as como demostrar su esterilidad. Si se dispone de aislados bien caracterizados y reconocidos por otros laboratorios, pueden tambin ser utilizados como cepas para el control de calidad de los medios. En lugar de utilizar el mtodo frecuente de cultivo en lnea, se recomienda utilizar un procedimiento cuantitativo que consiste en inocular en el medio un nmero conocido, normalmente pequeo, de microorganismos y evaluar el nmero de microorganismos recuperados. Este mtodo puede utilizarse para establecer el nivel de recuperacin por debajo del cual se rechaza un lote. Atendiendo a los factores que hemos comentado el control de calidad se puede clasificar atendiendo, a su presentacin y almacenamiento: Atendiendo a su presentacin: Placa Petri : 2,5meses Tubo: 6 meses Vial : 6 meses Frasco : 8 meses Laminocultivos: 6 meses: Almacenamiento, encamaras fras a una temperatura entre 4-8 C

3.- PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO La preparacin de los medios de cultivo deshidratados, es en esencia, una simple manipulacin que pone especial atencin en la calidad del medio y en la esterilidad del proceso. Si se utiliza un medio comercializado, las instrucciones de uso vienen detalladas en cada envase y debe seguirse de forma estricta. La preparacin de los medios de cultivo, consta de tres partes, medios deshidratados (seguir instrucciones del fabricante), material (agua y esterilizacin). Respecto al agua, esta debe de ser destilada y no debe de contener cloro, adems debe de presentar una conductividad adecuada y un contenido inico tal como indican las especificaciones de agua purificadas de la USP 3.1.- MODELO ESTANDAR DE PREPARACION En la preparacin de los medios de cultivo en un laboratorio de Microbiologa, se siguen los siguientes pasos: Paso 1, se disuelve la cantidad de medio que aconsejan los manuales de microbiologa del medio que se va a fabricar en el volumen de agua destilada o desionizada que se nos indique. La disolucin se debe hacer calentando y agitando al mismo tiempo, cuando se trata de un medio de cultivo slido o semislido, hasta que se disuelva por completo. Si el medio de cultivo es lquido con una fuerte agitacin e suficiente. Paso 2, se esteriliza el medio de cultivo, ya disuelto, en autoclave. Despus de permanecer en el autoclave el tiempo requerido, (1litro de medio necesita 15 minutos de autoclave a 121C, ciclo de esterilizacin), se abre lentamente y se deja que se atempere. Paso 3, los medios se trasladan a una zona estril, para irlos enfriando lentamente y aadirles, si procede, los suplementos requeridos para cada medio (sangre, antibiticos, vitamins,etc). Paso 4, se dosifica el medio de cultivo, la temperatura oscila entre 45-50C, en el tipo de envase que se vaya a requerir en condiciones totalmente aspticas.

4.- MEDIOS DE USO COMUN EN EL LABORATORIO. A continuacin se exponen los medios mas utilizados en el laboratorio de Microbiologa con sus caractersticas. 4.1.- AGAR SANGRE. El AS al 5% con base de Tripticasa-Soja es un medio de uso general que permite el crecimiento tanto de microorganismos exigentes como no exigentes, que incluyen bacterias aerobias y anaerobias, aunque no es medio de eleccin para anaerobios. Permite visualizar reacciones hemolticas que producen muchas especies bacterianas. Tiene por base una fuente proteica (digeridos trpticos, digeridos proteicos de soja) con una pequea cantidad de hidratos de carbono naturales, cloruro sdico y 5% de sangre. La aportacin de casena y peptonas de soja al agar de Tripticasa-soja hace el medio en muy nutritivo por el suministro de nitrgeno orgnico, particularmente aminocidos y ppticos de cadena ms larga. La presencia de estas peptonas en el medio permite el cultivo de una gran variedad de grmenes aerobios y anaerobios que crecen rpidamente, as como los del gnero Cndida. Tambin permite el crecimiento de algunos grmenes exigentes como estreptococos, pneumococos, Brucella, corinebacterias, Erysipelothrix y Pasteurella. Permite as mismo determinar la capacidad de algunas bacterias de producir enzimas extracelulares que actan sobre los glbulos rojos, ya sea por lisis completa (hemlisis beta, produce un halo transparente alrededor de la colonia hemoltica), parcial (hemlisis alfa, coloracin verdosa alrededor de la colonia) o por ausencia de alteracin (hemlisis gamma). La produccin de hemolisinas por las bacterias depende de muchos factores ambientales como pH o atmsfera de incubacin. Las muestras que puedan contener Brucella o Neisseria deben incubarse en atmsfera enriquecida en CO2. Las muestras que puedan contener Brucella o Neisseria deben incubarse en atmsfera enriquecida en CO2. 4.2.- AGAR CHOCOLATE Este medio utiliza la misma base que el Agar Sangre. Antiguamente se aadan los hemates a la base fundida y se elevaba la temperatura para lisarlos parcialmente y que soltasen al medio sus componentes. Esto daba al medio su habitual color pardo chocolate. El Agar chocolate es un medio destinado principalmente al aislamiento de gonococos y meningococos, pero en el que pueden 9

crecer muchos otros microorganismos exigentes. Con un medio anlogo a ste es con el que Thayer y Martin han hecho sus primeros asilamientos selectivos de gonococos, despus de aadir antibiticos. El Agar chocolate lleva Hemoglobina que aporta al medio otros factores, en particular el factor V (nicotn-adenina nucletido) termosensible, que no se encuentran en el Agar chocolate pueden aportarse en una mezcla qumicamente definida: el PolyViteX. El Agar chocolate con PolyViteX permite el cultivo de la mayor parte de los grmenes encontrados en patologa humana o veterinaria. La siembra de lquidos cefalorraqudeos, pus, resiembra de hemocultivos, etc., es favorable en este medio, pero est particularmente indicado para aislamiento de las Neisserias patgenas y de los Haemophilus. 4.3.- AGAR MCCONKEY El agar MacConkey II es una medio selectivo y diferencial para la deteccin de organismos coliformes y patgenos entricos. Actualmente existen una gran cantidad de medios diseados para el aislamiento, cultivo e identificacin de bacterias entricas. El artculo base sobre el agar MacConkey, uno de los primeros que se desarrollaron, fue publicado en 1905 y contena una descripcin detallada de su composicin y de los diferentes patrones de crecimiento obtenidos. Su composicin se ha modificado en numerosas ocasiones Actualmente existen una gran cantidad de medios diseados para el aislamiento, cultivo e identificacin de bacterias entricas. El artculo base sobre el agar MacConkey, uno de los primeros que se desarrollaron, fue publicado en 1905 y contena una descripcin detallada de su composicin y de los diferentes patrones de crecimiento obtenidos. Su composicin se ha modificado en numerosas ocasiones. La frmula del agar MacConkey II es de 1983 y se dise especialmente para mejorar su capacidad de inhibir el swarming de Proteus spp y para alcanzar una definitiva diferenciacin entre fermentadores y no fermentadores de la Lactosa. Este medio es ligeramente selectivo ya que la concentracin de sales Biliares, que inhiben el crecimiento de los microorganismos Gram positivos, es baja en relacin con otros medios similares. Se incluye tambin cristal violeta para inhibir el crecimiento de las bacterias Gram positivas, especialmente estafilococos y enterococos.

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La diferenciacin de organismos entricos se lleva a cabo con la combinacin de Lactosa con el indicador Rojo neutro. Se producen colonias rosas a rojas si el aislado es capaz de fermentar la Lactosa y colonias sin color en caso contrario. colonias lactosa (-): incoloras (= no hay fermentacin de la Lactosa). Salmonella, Shigella, Pseudomonas colonias lactosa (+): rosa/rojo ladrillo rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas. E. coli (rosa/roja), E. aerogenes (rosa y mucosa) 4.4.- CALDO TIOGLICOLATO Es el caldo de enriquecimiento ms utilizado en Microbiologa. Contiene 0,075 % de Agar para evitar que las corrientes de conveccin transporten el oxgeno de la superficie a toda la masa del caldo. El cido tiogliclico acta como agente reductor, disminuyendo aun ms el potencial de xido-reduccin del medio. Con el agregado de muchos factores nutrientes (Casena, extractos de Levadura y Carne, Vitaminas, etc.), el medio permite el desarrollo de la mayor parte de las bacterias patgenas. Hay distintas frmulas modificadas en las que se han incluido otros componentes: un indicador de xido-reduccin (Resazurina), Glucosa, Vitamina K1 y Hemina. 4.5.- AGAR SCHAEDLER Schaedler + 5% sangre de cordero es un medio reductor est particularmente adaptado al cultivo de los grmenes anaerobios. La presencia de factores de crecimiento tales como el extracto de levadura, la hemina y la vitamina K3, as como la adicin de la sangre de cordero, permiten el crecimiento de especies exigentes. Debido al elevado contenido en glucosa de este medio, la intensidad de la hemlisis de los estreptococos puede disminuir. Sembrar lo ms rpidamente posible la muestra a su llegada al laboratorio. Las muestras deben ser transportadas en un medio que garantice la anaerobiosis (Portagerm tubo o frasco). Despus de sembrar, colocar inmediatamente las placas en la jarra de anaerobiosis o bien en sistema individual. 4.6.- AGAR KANA-VANCO Se utiliza para el aislamiento rpido de Bacteroides sp. Contiene 75 g/ml de Kanamicina, que inhibe a la mayora de los bacilos aerobios, facultativos y anaerobios excepto Bacteroides, y 7,5 g/ml de Vancomicina, que inhibe a la mayora de los microorganismos 11

grampositivos. Contiene tambin sangre "lacada" de conejo que permite la pigmentacin precoz de los Bacteroides sp pigmentados. Muchas cepas de B. assaccharolyticus y B. gingivalis no crecern en este medio debido a su sensibilidad a la Vancomicina. Las levaduras y otros microorganismos resistentes a la Kanamicina pueden crecer en este medio, en consecuencia, debe realizarse una tincin Gram y confirmar la tolerancia al aire de todos los organismos aislados. 4.7.- AGAR BBE ( Bacteroides Bilis Esculina) El medio BBE es un medio selectivo para el aislamiento e identificacin presuntiva de bacterias del grupo Bacteroides fragilis. Fue presentado en 1978 por Livingston y sus colaboradores. La mayor parte de las infecciones humanas producidas por bacterias anaerobias son debidas a grmenes pertenecientes al grupo Bacteroides fragilis (B. fragilis, B. thetaiotaomicron, B. ovatus, B. distasonis y B. vulgatus). Es importante una rpida deteccin e identificacin de estos microorganismos ya que se ha observado un incremento de la resistencia a antibiticos mayor que en otros grupos de anaerobios. El agar BBE permite una inhibicin selectiva de microorganismos anaerobios facultativos y de la mayor parte de los anaerobios Gram negativos debido a que contiene amikacina y oxgall. La diferenciacin del grupo Bacteroides fragilis se basa en la hidrlisis de la esculina con produccin de esculetina y dextrosa. La esculetina reacciona con la sal de hiero presente en el medio (citrato frrico amnico) produciendo una coloracin marrn oscuro-negro rodeando a las colonias de de las cepas del grupo Bacteroides fragilis. Contiene Amikacina que inhibe el desarrollo de los microorganismos aerobios, Bilis que inhibe a la mayora de anaerobios excepto los del grupo B. fragilis y otras pocas especies, y Esculina que es til para la deteccin de este grupo de microorganismos ya que por lo general son Esculina positivos. Tambin pueden crecer en este medio: Fusobacterium mortiferum, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus sp, levaduras y algunos otros microorganismos. 4.8.- AGAR SALMONELLA-SHIGELLA Agar altamente selectivo que se utiliza para el aislamiento de Salmonella y de alguna especies de Shigella. Se dise para diferenciar fermentadores de lactosa de los que no la fermentan, proporcionando buena inhibicin de coliformes sin restringir el crecimiento de otros bacilos Gram-negativos (BGN) patgenos. 12

Salmonella y Shigella (y otros no fermentadores de lactosa) producen colonias transparentes, translcidas, mientras los pocos fermentadores de lactosa que se desarrollan dan colonias mucosas, rojizas. Bacteria Salmonella enteritidis Proteus mirabilis Shigella flexneri Enterococcus faecalis Enterobacter aerogenes 4.9.- AGAR KLIEGER (KIA) Se recomienda para la identificacin de bacilos entricos gramnegativos. Se basa en la fermentacin de dextrosa y lactosa y en la produccin de cido sulfhdrico (H2S). Se recomienda para identificar posteriores cultivos de colonia tomados de medios primarios (Agar McConkey, Agar SS, etc). El rojo de fenol es el indicador de la produccin de cido y el sultafo ferroso es de la produccin de H2S Bacteria E .coli P.vulgaris S. eneteritidis Crecimiento Pendiente bacteriano Buena Amarilla (*) Buena Rojo (**) Buena Rojo Base Amarilla Amarilla Amarilla Gas Si No Si H2S No Si Si Crecimiento bacterias bueno aceptable regular escaso regular Color incolora incolora incolora incolora crema/rosa

(*) Amarillo: ambiente cido (**) Rojo: ambiente rojo 4.10.- AGAR SABOREUAD Es un medio diferencial, recomendado para el cultivo y crecimiento de hongos. Para que ocurra el crecimiento selectivo de hongos sobre bacterias en las muestras a analizar, este medio tan solo depende de la reaccin cida (pH 5,6) Hongo Candida albicans Saccharomyces cerevisae Apergillus Nger Crecimiento Bueno Bueno Bueno

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4.11.- AGAR MUELLER-HINTON Especfico para la realizacin de antibiogramas, existen dos variantes, Agar Mueller-Hinton/Sangre y Agar MuellerHinton/Chocolate , estas variaciones se realizan para obtener la sensibilidad antimicrobiana de ciertos microorganimos, St. Pneumoniae y Haemophilus spp. Respectivamente. 4.12.- AGAR THAYER-MARTIN Es un medio empleado para el crecimiento de Neisseria spp, de muestras que contengan flora acompaante (bacterias y hongos). Bsicamente, el medio es un Agar Chocolate con los factores V y X, al que se aaden cuatro antibiticos para que acten de inhibidores (Vancomicina, Colistina, Anfotericina, Trimetopin) Bacteria N. gonorrhoeae N. meningitidis C.albicans 4.13.- AGAR CLED Utilizado como medio diferencial para el aislamiento, enumeracin e identificacin de microorganismos en orina. Al tener deficiencia electroltica, este medio inhibe la aglomeracin de Proteus spp al no formar el sobrecrecimiento en lmina. El medio incluye lactosa, para detectar contaminantes coniformes que fermenten la lactosa, que hace que el medio en torno a la colonia vire a color amarillo. Bacteria E. coli P. mirabilis S. aureus Crecimiento Bueno Bueno Bueno Color Transparente Transparente Amarillo Crecimiento Bueno Bueno Inhibido

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5.- INCUBACION A la hora del crecimiento bacteriano, existen una serie de factores que pueden modificar dicho desarrollo, para la cual debemos de utilizar unos parmetros correctos de incubacin para que posteriormente permita realizar una buena identificacin. 5.1.- CONDICIONES ADECUADAS DE HUMEDAD Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mnimas en las estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar as que se deseque el medio.

5.2.- PRESENCIA (O AUSENCIA) DE OXGENO Y OTROS GASES Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de oxgeno normal (aerobios estrictos). Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de variados sustratos (anaerobios facultativos) Pero los microorganismos anaerobios estrictos slo se desarrollarn adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerfilos crecen mejor en condiciones atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones. 5.3.- HUMEDAD Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mnimas en las estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar as que se deseque el medio. 5.4.- LUZ AMBIENTAL La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sera el caso de los microorganismos fotosintticos.

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5.5.- pH La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios ms o menos cidos. No se debe olvidar que la presencia de cidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metablicos normales. 5.6. TEMPERATURA Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre 15 y 43C. Otros como los psicrfilos crecen a 0C y los termfilos a 80C o incluso a temperaturas superiores (hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C, y los saprofitos tienen rangos ms amplios.

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6.- SIEMBRA E INOCULACION. La siembra consiste en disponer las bacterias que queremos estudiar en un medio de cultivo de una forma adecuada, La siembra puede ser: Para aislamiento, para poder llevar a trmino el estudio de un microorganismo es condicin necesaria aislarle del resto de microorganismos acompaantes. Otras tcnicas, son pruebas que no permiten aislamento, en este caso se pueden utilizar tantos medios slidos como lquidos. 6.1.- SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO LQUIDO Se puede realizar atendiendo al instrumento con que siembre, bien asa de siembra, pipeta o hisopo. Asa de siembra, los tubos, del que se a va a sembrar y el que contiene el medio, se toman con la mano izquierda, colocando las bocas a la misma altura. Con la mano derecha se toma el asa de siembra, se esteriliza en la llama en posicin vertical hasta que se ponga incandascente. Se destapan los tubos, tomando se esterilizan las bocas de los tubos pasndolos por la llama, se introduce el asa en el material y se introduce en el medio de cultivo hasta el borde de lquido. Por ultimo se esteriliza el asa y el tubo se agita para una buena homogenizacin del inculo. Tubo, se puede utilizar cualquier pipeta, pero generalmente se utiliza la pipeta PASTEUR, se utiliza la tcnica expuesta anteriormente, pero esta vez el inculo el liquido. Hisopo, el hisopo o torunda debe de ser estril y viene protegido dentro de un tubo de plstico 6.2.- SIEMBRA EN TUBO EN MEDIO SLIDO Atendiendo al tipo de medio slido, nos podemos encontrar que sean en tubo, placa PETRI 6.2.1.- TUBO. El agar tiene que estar en posicion inclinada, dejando una lengeta en la parte superior y en la parte inferior una parte ms ancha. Se pueden realizar dos tcnicas, por estra y picadura, en ambos casos nos dice las caractersticas bioqumicas de la bacteria a estudiar (fermentacin de azucares, movilidad, reduccin de metales, etc.) 6.2.2.- PLACA PETRI. Se realiza en agar, se emplea para aislamiento de bacterias y para la realizacin de antibiogramas. En este ltimo caso, previamente se tiene que realizar una dilucin de la muestra (con la bacteria totalmente aislada) y se siembra con el hisopo en el medio 17

en el cual se va a realizar el antibiograma, generalmente MuellerHinton, aunque atendiendo al tipo de bacterias podemos emplear agar sangre (hemlisis) y agar chocolate (factores X y V).

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