Universidad de Carabobo Facultad de Ciencias de la Salud Escuela de Ciencias Biomdicas y Tecnolgicas Departamento de Ciencias Morfolgicas y Forenses Asignatura: Histologa

y Embriologa

Prof. Sofa Douaihi

Unidad I. Introduccin al Estudio de la Histologa y Morfologa Celular

Objetivo General: Especificar las herramientas que utiliza la histologa para el estudio ultraestructural de tejidos y de la clula como unidad morfolgica y funcional del organismo.

Contenido:
Histologa. Concepto y aplicaciones cientficas y clnicas. Tcnica Histolgica. Etapas en la preparacin de tejidos para su estudio al microscopio ptico y electrnico. Histoqumica y Citoqumica. Aplicacin, tipos, fundamentos qumicos de la coloracin.

Microscopa. Tipos de microscopios y aplicacin. Microscopio ptico: partes y funcionamiento. Microscopio electrnico: de transmisin y de barrido.

Qu es la Histologa?
Etimolgicamente: histo: tejido logos: estudio
Cuello uterino: Exocervix: Epitelio plano estratificado

Es la rama de la biologa encargada del anlisis microscpico de la anatoma celular y tisular de los tejidos biolgicos.

Marcello Malpighi es reconocido como el fundador de la Histologa

Las primeras investigaciones histolgicas se hicieron en el siglo XVII gracias a la invencin del microscopio ptico por Antonio Van Leeuwenhoek

Qu es la Anatoma?
Es el estudio de la forma y la estructura de los organismos vivos organizados

Anatoma Macroscpica: estudio de las estructuras observables a simple vista. Anatoma Microscpica: es aquella que requiere de auxiliares pticos.

Qu es la Citologa o Biologa Celular? Es una disciplina acadmica que se encarga del estudio de las propiedades, estructura, funciones y organelos que contienen las clulas, as como su interaccin con el ambiente y su ciclo vital.

Sistema de rganos: conjunto de rganos con funciones relacionadas

Tejido: agrupacin de clulas con la misma funcin

Clula: Unidad morfolgica y funcional de todo ser vivo. Es el elemento de menor tamao que puede considerarse vivo.

rgano: unidad funcional mayor compuesto por distintos tipos de tejido

FISIOLOGA BIOQUMICA

ANATOMA

GENTICA
PATOLOGA CLNICA

Obtencin de la muestra de material humano:

El material humano puede provenir de tres fuentes:

Las necropsias o autopsia

Las biopsias Las piezas operadas.

Necropsias: Se obtienen piezas de un cadver. Para histologa normal es necesario que se trate de un cadver fresco y que no haya sido atacado por ninguna lesin, al menos el rgano que se quiere estudiar.

Biopsias: Son trozos de tejido que se obtienen de un sujeto con vida con el objeto de estudiarlos al microscopio y efectuar un diagnstico histopatolgico.

Piezas operadas: Los tejidos que han sido extrados de las intervenciones quirrgicas, generalmente tumores u rganos inflamados, tambin pueden darnos material de investigacin.

TECNICA HISTOLOGICA Fundamentos generales de la preparacin de los tejidos para su estudio al microscopio (ptico y electrnico)

1.- Obtencin de la muestra: mediante extirpacin de pequeos fragmentos de tejido (humano o animal)

2.- Fijacin: Su propsito es mantener la morfologa del tejido lo ms parecida posible a lo que sta tena antes de hacer la extraccin. (formaldehdo al 37%)
Mtodos: Qumico inmersin Fsico: congelacin
La formalina no preserva todos los componentes de la clula y los tejidos

3.- Deshidratacin: proceso por el cual se elimina completamente el agua de la muestra para que se pueda embeber (impregnar, empapar) adecuadamente el tejido en aquellos medios de inclusin que no sean hidrosolubles. (Alcohol etilco en concentraciones crecientes)

4.- Aclaramiento: proceso por el cual se consigue la sustitucin del agente deshidratante por una sustancia miscible (mezclable) con el medio de inclusin. (Xilol)

5.- Infiltracin (Impregnacin o Inclusin) Proceso que tiene por objeto rellenar o infiltrar completamente la muestra histolgica con el medio que se va a usar para la imbibicin (absorcin) del tejido. (Bao de parafina fundida)

6.- Encastramiento del tejido y confeccin de los bloques: consiste en la obtencin de un bloque slido de tejido ms medio de inclusin, mediante el enfriamiento lento a 1015C: El bloque slido se llama TACO

7.- Orientacin de la pieza: para realizar el corte del tejido se monta el taco en el microtomo (aparato equipado con una hoja de acero) y se obtienen cortes sumamente delgados cuyo grosor para microscopa ptica vara entre 5 10 micrmetros 1milmetro = 1000 micrmetros

8.- Montaje: los cortes se colocan sobre lminas portaobjetos cubiertos previamente con capa de albmina o gelatina

9.- Aclaramiento: Extraccin de la parafina con xilol (Desparafinacin)

TOMADO DE: Histologa y Embriologa del ser humano. Eynard-Valentich-Rovasio.

TOMADO DE: Histologa y Embriologa del ser humano. Eynard-Valentich-Rovasio.

7. Orientacin (Microtomo)

10.- Rehidratacin: desplazar el xilol por agua. Alcohol con agua en concentraciones decrecientes.

11.- Tincin o Coloracin: con colorantes histolgicos en su mayora en solucin acuosa.

Muestra fijada en formol al 10%

Gasa e identificacin de la muestra.

FOTOGRAFA: LABORATORIO-HISTOTECNOLOGA. DPTO CS. MORFOLGICAS Y FORENSES.

Tejido fijado

Bistur

Corte del tejido (hoja de bistur)

FOTOGRAFA: LABORATORIO-HISTOTECNOLOGA. DPTO CS. MORFOLGICAS Y FORENSES.

Batera de Deshidratacin

FOTOGRAFA: LABORATORIO-HISTOTECNOLOGA. DPTO CS. MORFOLGICAS Y FORENSES.

Batera de Aclaramiento
FOTOGRAFA: LABORATORIO-HISTOTECNOLOGA. DPTO CS. MORFOLGICAS Y FORENSES.

Estufa

Inclusin en parafina fundida

FOTOGRAFA: LABORATORIO-HISTOTECNOLOGA. DPTO CS. MORFOLGICAS Y FORENSES.

Estufa con el tejido a ser incluido

FOTOGRAFA: LABORATORIO-HISTOTECNOLOGA. DPTO CS. MORFOLGICAS Y FORENSES.

Cajas de papel para preparar el bloque

FOTOGRAFA: LABORATORIO-HISTOTECNOLOGA. DPTO CS. MORFOLGICAS Y FORENSES.

Preparacin del Bloque

FOTOGRAFA: LABORATORIO-HISTOTECNOLOGA. DPTO CS. MORFOLGICAS Y FORENSES.

Tejido incluido en parafina

FOTOGRAFA: LABORATORIO-HISTOTECNOLOGA. DPTO CS. MORFOLGICAS Y FORENSES.

Bloque terminado

FOTOGRAFA: LABORATORIO-HISTOTECNOLOGA. DPTO CS. MORFOLGICAS Y FORENSES.

Microtomo
FOTOGRAFA: LABORATORIO-HISTOTECNOLOGA. DPTO CS. MORFOLGICAS Y FORENSES.

Bloque de Tejido

Cuchilla del Microtomo

Corte del tejido en el Microtomo

FOTOGRAFA: LABORATORIO-HISTOTECNOLOGA. DPTO CS. MORFOLGICAS Y FORENSES.

Bloque de Tejido

Tejido Cortado

Tejido Cortado
FOTOGRAFA: LABORATORIO-HISTOTECNOLOGA. DPTO CS. MORFOLGICAS Y FORENSES.

Tejido Cortado
(3-8 m de grosor).

Tejido Cortado en el Bao de flotacin

FOTOGRAFA: LABORATORIO-HISTOTECNOLOGA. DPTO CS. MORFOLGICAS Y FORENSES.

Tejido

Lmina Portaobjeto Montaje del tejido en el portaobjeto para su desparafinacin

FOTOGRAFA: LABORATORIO-HISTOTECNOLOGA. DPTO CS. MORFOLGICAS Y FORENSES.

Baos (para inclusin)

Tiempo de procesamiento Manual Automtico

Formol 10% Etanol 70% Etanol 95% Etanol 100% Etanol 100% Etanol 100% Alcohol-Xilol Xilol I Xilol II Parafina Lquida Parafina Lquida Parafina Lquida

2 horas 2-4 horas 2-4 horas 1-2 horas 1-2 horas 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora 2 horas

30 minutos 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora 30 minutos 45 minutos 45 minutos 1 hora 1 hora 1-2 horas

Investigar: Diferencias entre microtomo y ultramicrotomo

Preparacin de Tejidos para Microscopa Electrnica

1. 2. 3. 4. 5. Fijacin: Glutaraldehdo o Tetrxido de osmio. Deshidratacin: Etanol y/o acetona en concentraciones crecientes. Aclaramiento: xido de propileno (1-2 epoxipropano). Inclusin: plstico (resinas). Epoxirresinas (araldite, resina epon y resina de Spurr) Cortes de los bloques: con un ultramicrotomo con cuchilla de vidrio o diamante (20-100 nm). El corte se controla con un microscopio y se aumenta el contraste mediante el pasaje rpido por una solucin de acetato de uranilo. No es necesario eliminar el plstico de inclusin. Montaje: Los cortes ultrafinos se montan sobre un reticulado de cobre (grilla) cubierto por una pelcula plstica de sostn delgada.

6.

Correlacin Clnica: Biopsias por congelacin

Evaluar de inmediato el tejido obtenido. durante el acto quirrgico y el diagnstico instantneo determina el paso siguiente en la ciruga. Para identificar hallazgos intraoperatorios inesperados. Para saber si se ha extirpado toda la masa patolgica y si el borde de la reseccin quirrgica est libre de tejido enfermo. Se congelan fragmentos de tejido usando anhdrido carbnico comprimido o un lquido fro (isopentano) a una temp de -50C. Corte del tejido congelado en un criostato (cmara refrigerada que contiene un microtomo) Montaje del corte en un portaobjetos. Tincin del corte: HE, azul de metileno y PAS. El proceso puede tardar 10 minutos y el resultado se comunica al cirujano inmediatamente

HISTOQUMICA
Conjunto de tcnicas que permiten la identificacin, localizacin y cuantificacin de una sustancia o molculas en un tejido.

Se pueden detectar glcidos, protenas y nucletidos.

La tcnica histoqumica ms empleada es la reaccin de PAS (Periodic Acid Schiff).

HISTOQUMICA
Este mtodo provee datos acerca de la funcin de las clulas y de los componentes extracelulares de los tejidos.

Tincin con hematoxilina-eosina (imagen de la izquierda) y PAS-hematoxilina (imagen de la derecha) de las vellosidades del intestino de humano cortadas transversalmente. Se puede apreciar a las clulas caliciformes teidas de rosado con la tnica de PAS por su alto contenido en mucopolisacridos, mientras que en una ticin general aparecen transparentes, sin teir.

HISTOQUMICA Y CITOQUMICA
Se ocupan de investigar la actividad qumica que tiene lugar en las clulas y los tejidos.

Se fundamentan en:
La unin especfica de un colorante. El uso de anticuerpos marcados con un colorante fluorescente (INMUNOHISTOQUMICA) La actividad enzimtica inherente de un elemento constitutivo de las clulas.

Composicin qumica de las muestras histolgicas

La composicin qumica de un tejido listo para una coloracin de rutina es diferente de la del tejido vivo.
Los componentes que perduran son molculas grandes que no se disuelven con facilidad con el fijador. Entre ellas: nucleoprotenas, protenas intracelulares del citoesqueleto, protenas extracelulares, complejos de fosfolpidos y protenas o carbohidratos en las membranas.

Composicin qumica de las muestras histolgicas

Muchos componentes de los tejidos desaparecen durante la preparacin de los cortes teidos con H-E.

Los solventes disuelven los lpidos neutros.

Las macromolculas que se pierden durante la fijacin de rutina son: Glucgeno, Proteoglucanos y glucosaminoglucanos.

Los componentes solubles, los iones y las molculas pequeas tambin desaparecen durante la preparacin de las muestras includas en parafina: glucosa, sodio, cloro y sustancias similares.
Estos iones y pequeas molculas solubles no constituyen elementos morfognicos hsticos sino que participan en los procesos de sntesis o en las reacciones celulares.

Colorantes Utilizados en Microscopa ptica

Piel

Fundamento: Radica en la propiedad que tienen todos los tejidos para incorporar y fijar de modo variable diversas sustancias coloreadas. Segn su afinidad tisular:

 Colorantes Bsicos: poseen una carga global positiva (catinicos), reaccionan con los componentes aninicos de las clulas. Ejemplo: Hematoxilina. Colorantes cidos: poseen una carga global negativa (aninicos), reaccionan con los componentes catinicos de las clulas. Ejemplo: Eosina.

Colorantes Neutros: su carga global es neutra. Propiedad de colorear junta o separadamente diversas estructuras. Ejemplo: Giemsa.

Colorantes Metacromticos: Colorantes bsicos. Producen tonos de color totalmente distintos al que se espera por el colorante empleado. Ejemplo: Azul de Toluidina.

Colorantes Indiferentes: no poseen carcter cido, bsico o salino definido. Colorean mediante impregnacin. Ejemplo: Plata
Fibras Reticulares

COLORACIONES MS UTILIZADAS
Coloracin Hematoxilina-Eosina (H.E).
Utiliza dos tipos de colorantes. La hematoxilina que es un colorante bsico, colorea los componentes cidos de la clula (ncleo) de color morado; y la eosina que es un colorante cido se une a estructuras bsicas de la clula (citoplasma) otorgndole una tonalidad rosada Testculo

Coloraciones Tricrmicas:

1.- AZAN

Se obtiene tres colores diferentes: Azul oscuro en los ncleos de la clula. Rojo en el msculo, la queratina y citoplasma celular. Azul Claro en el tejido conjuntivo

2.- MALLORY

 Coloracin con metales (ejemplo: Plata) Actan impregnando a ciertos componentes celulares.

Ejemplo: se usan para demostrar aparato de Golgi y las neurofibrillas.

 Coloracin con Hematoxilina Frrica: Coloracin diferencial til para estudiar detalles celulares finos. Ejemplo: las mitocondrias presentes en el citoplasma de las clulas renales.

Tricrmico de Cajal y Gallego: Implica el uso de tres colorantes. Para demostracin diferencial y selectiva de las fibras colgenas y del msculo.

 La Orcena y la Fucsina Resorcina: son colorantes para fibras elsticas. Se observan entre bordeau y castao oscuro.

Carmn de Best: para tincin nuclear y deteccin de Glucgeno.

Elementos celulares que presentan BASOFILIA, que representan los estructuras cidas y se ven de color morado al microscopio ptico - Heterocromatina y nuclolos del ncleo - Algunos componentes citoplasmticos - Material extracelular Elementos celulares que presentan ACIDOFILIA, que representan las estructuras bsicas y se ven de color rosado al microscopio ptico -La mayora de los filamentos citoplasmticos -La mayora de los componentes membranosos intracelulares -La mayora de las fibras extracelulares

Receso!!!

MICROSCOPA
El conocimiento detallado moderno de la arquitectura celular se basa sobre varios tipos de observacin por diferentes tipos de microscopios Qu es un Microscopio? Es un Instrumento que aumenta el tamao de una imgen y permite ver mayores detalles. El Microscopio ms sencillo: lupa, lentes de correccin.

M. ptico compuesto

Campo claro Campo oscuro Contraste de fase Fluorescencia Luz U.V.

M. Electrnico

Transmisin (MET)

Barrido (MEB)

d= 0.61/An

MICROSCOPA
PODER DE RESOLUCIN AUMENTO
Es la relacin entre el tamao de la imagen y el del objeto en medidas lineales. El Aumento de un microscopio es: Am= Alente objetivo x ALente ocular Ej: Ocular: 10X Objetivo: 40X Cuanto es el aumento del microscopio?

Es la capacidad de distinguir por separado, dos objetos muy cercanos entre si, numricamente equivale a 1/d, siendo d la distancia mnima entre dos objetos distinguibles. Ojo humano: d = 0.2 mm Depende de: ndice de Refraccin (n): Aire =1 Apertura numrica (An) del sistema ptico. An= n x sen u Longitud de onda de la luz incidente () d= 0.61/An Poder de Resolucin mximo de un microscopio ptico = 0.2um

1 cm : 10 mm (milmetro) 1 mm : 1.000 mm (micra) 1 mm: 1.000 nm (nanmetro) 1 nm: 10 A (Armstrong)

PODER DE RESOLUCIN Ojo humano: 0.2 mm Microscopios pticos: 0.2 mm Microscopios electrnicos: 0.2 nm

Microscopio ptico de Campo Claro

Usa Luz Visible. D = 0.2 mm (micromtro)
La luz atraviesa el objeto examinado y el objetivo capta la luz directa proveniente de la fuente luminosa. Utilidad: Acadmico, Diagnstico clnico (Lab. Bioanlisis, Patolgico), Investigacin.

Componentes Principales: - Fuente Luminosa - Lente Condensadora: para enfocar el haz de luz a la altura de la muestra - Platina: sobre la que se coloca la muestra. - Lente Objetivo: para recoger la luz que ha atravesado la muestra - Lente Ocular: a travs de la cual se puede examinar directamente la imgen formada por la lente objetivo.

MICROSCOPA
PARTES DE UN MICROSCOPIO PTICO Mecnicas Cabezal Brazo Revolver pticas Lmpara Condensador /Diafragma

Platina
Carro Tornillos macromtrico y micromtrico Base

Objetivos
Oculares

 Los rganos son tridimensionales, mientras que los cortes histolgicos tienen slo dos dimensiones Al examinar un corte hay que reconstruir mentalmente la organizacin de la estructura y sus partes constitutivas

Examen de un Preparado Histolgico con el Microscopio ptico Los artefactos o artificios son elementos que representan un error en el proceso de preparacin (partculas de polvo, fragmentos de vidrio, agregados de colorante, filamentos de gasa etc.)

OTROS SISTEMAS PTICOS

Microscopio de Contraste de Fases

Aprovecha las pequeas diferencias en el ndice de refraccin que hay en diferentes partes de una muestra de clulas o tejidos.
Se emplean objetivos de fase y condensadores especiales.

Las partes oscuras corresponden a las regiones densas y las partes claras corresponde a las regiones menos densas.

Utilidad: Permite observar las clulas en accin y estudiar los movimientos implicados en procesos como la mitosis o la migracin celular. Estudiar cortes semifinos no teidos.

Microscopio de Campo Oscuro

-La lente objetivo no capta la luz directa proveniente de la fuente luminosa. -El principio se consigue gracias a un condensador especial que ilumina el preparado con mucha intensidad pero en forma oblicua. - Con esto se logra que el fondo de la muestra aparezca negro y los especmenes brillantes. -Utilidad: En la prctica clnica para la deteccin de cristales en la orina y la identificacin de espiroquetas. Observar microorganismos que muestran alguna caracterstica morfolgica en estado vivo y en suspensin, por ejemplo: flagelos.
Glbulos rojos
Espiroquetas

Microscopio de Fluorescencia
-Aprovecha la capacidad de algunas molculas de fluorescer bajo la luz UV, emiten luz de una longitud de onda diferente a la luz que la hizo fluorescer. -Utilidad: Deteccin de molculas con autofluorescencia como la vitamina A y algunos neurotransmisores (fluorescencia natural). En tcnicas de inmunocitoqumica utilizan sustancias qumicas que absorben la energa de la luz ultravioleta y emiten radiaciones que pueden ser vistas, colorantes fluorescentes. (fluorescencia secundaria).

En la investigacin del trayecto de fibras nerviosas.

Se detectan molculas ms pequeas que el poder de resolucin del microscopio

Microscopio Confocal

- Permite la visualizacin de una muestra biolgica en tres dimensiones.

- Combina componentes de un microscopio ptico de campo claro con un sistema de barrido para disecar pticamente una muestra.

Fotografa microscpica que ilustra la cabeza de un pez cebra de 5 das de edad, aumentada 20 veces tal y como se observa en un microscopio confocal

Microscopio de Luz Ultravioleta (UV)

-Utiliza lentes de cuarzo con una fuente de luz ultravioleta. -Tiene mayor poder de resolucin. - La imagen depende de la absorcin de la luz UV por las molculas de la muestra. -La muestra no puede inspeccionarse directamente a travs del ocular porque la luz UV no es visible y lesiona el ojo. -Las imgenes se registran en una pelcula fotogrfica. Utilidad: Detectar cidos nuclicos, en especial las purinas y pirimidinas. Detectar protenas que tienen ciertos aminocidos en la prctica clnica para evaluar el grado de ploidia en cortes de tumores.

MICROSCOPA ELECTRNICA
Representa un gran adelanto respecto a la microscopa ptica ya que el poder de resolucin muy elevado :

La longitud de onda del haz de electrones es 2.000 veces menor que la del haz de luz, por lo que aumenta la resolucin por un factor de 10. Los electrones no pueden atravesar el vidrio, por lo que deben remplazarse por bobinas o lentes electromagnticas Existen dos tipos: MET y el MEB

Microscopio Electrnico de Transmisin

-Utiliza un haz de electrones en lugar de un haz de luz. -La fuente es un filamento de tungsteno calentado que emite electrones (ctodo), son atrados hacia
el nodo producindose una aceleracin de estos y por lo tanto un haz.

-El haz de electrones atraviesa una serie de lentes electromagnticas que cumplen la misma funcin que las lentes cristal de un microscopio ptico. -La imagen final se observa en una pantalla Fosforescente
-La parte de la muestra atravesada por los electrones aparecen claras y las que han absorbido y dispersado a los electrones aparecen oscuras.

Microscopio Electrnico de Barrido

-El haz de electrones no atraviesa la muestra sino que explora (barre) su superficie.
- Forma una imagen de tipo tridimensional en un tubo de rayos catdicos de alta resolucin.

Microscopio de Fuerza Atmica

Con las tcnicas de AFM es posible trabajar a escala nanomtrica, 0'000000001 m, eso nos permite ver estructuras 1.000 veces ms pequeas que una bacteria, y 10.000 veces ms pequeas que las clulas del epitelio bucal. Esto supone poder ver las molculas, incluso los tomos, y ms sorprendente an "pescar" molculas en una muestra y extraerlas de su entorno. Las tcnicas de AFM permiten trabajar en medio lquido o fisiolgico y por lo tanto observar la interaccin de la muestra con otras molculas. Ahora podemos ver en detalle cmo interaccionan un antgeno y un anticuerpo; en un futuro se podr ver paso a paso cmo interacciona un medicamento con una clula enferma.

Gracias!