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Virología

Cultivo de Virus 3/16

 Unidad de Capacitación a
Entidades Civiles
 Curso Básico de Virología para Civiles

 Rough Cibernus
 Supervisor: Tte.1: Arturo Martínez

 2 Z.M. Tegucigalpa 1996


Curso Básico de Virología para Civiles
Cubierta de Proteinas

RNA

Nucleo

Cubierta Viral
Human Immunodeficency Virus
Curso Básico de Virología para Civiles
Curso Básico de Virología para Civiles
CULTIVO DE LOS VIRUS

 ANIMALES EXPERIMENTALES

 TÉCNICAS DE CULTIVO EN EMBRIÓN


DE POLLO.

 TÉCNICAS DE CULTIVO CELULAR

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CULTIVO DE LOS VIRUS

1. ANIMALES EXPERIMENTALES
a) Siempre ha sido importante en virología
b) Es un medio para aislar y desarrollar a muchos de los virus
c) Pero….. La etica sobre el buen trato hacia los animales ha sido un
problema (financiamiento, aceptación de artículos en las
publicaciones etc etc)

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CULTIVO DE LOS VIRUS
1. ANIMALES EXPERIMENTALES
d) Solo bajo las siguientes circunstancias:
i. Virus que no puedan replicarse en embriones de pollo o en cultivos
celulares.
ii. Para el estudio de la patogénesis de la enfermedad y es aquí donde
es de gran utilidad.
iii. En casos de investigaciones epidemiológicas.
iv. Para atenuar virus de humanos: Virus de la fiebre amarilla, virus
Vaccinia.
v. Para pruebas de seguridad y antigenicidad de vacunas para
obtener las licencias.
vi. Para probar agentes antivirales quimioterapeúticos
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CULTIVO DE LOS VIRUS
1. ANIMALES EXPERIMENTALES
d) Solo bajo las siguientes circunstancias:
vii. En la producción de anticuerpos policlonales y monoclonales.
viii. Son fuente de órganos para los cultivos celulares.
ix. Son fuente de sangre (eritrocitos y PMN) para muchas pruebas.
EJEMPLOS:

PICORNAVIRUS RABDOVIRUS
Virus de la Fiebre aftosa Virus de la Rabia
RATÓN LACTANTE. RATÓN LACTANTE

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CULTIVO DE LOS VIRUS
1. ANIMALES EXPERIMENTALES
EJEMPLOS:

ADENOVIRUS CANINO
Virus de la Hepatitis Infecciosa Canina (IHC)
CUYES en altas dosis.
PERROS, ZORROS por las vías subcutánea (S/C);
intraperitoneal (I/P);
oral; intravenosa (I/V)

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CULTIVO DE LOS VIRUS
1. ANIMALES EXPERIMENTALES
EJEMPLOS:

CORONAVIRUS
Virus de la Bronquitis Infecciosa Aviaria (BIA)
EMBRIONES DE POLLO

Gastroenteritis Transmisible del Cerdo ((GET)


LECHONES de lactantes a varios días

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CULTIVO DE LOS VIRUS
1. ANIMALES EXPERIMENTALES
EJEMPLOS:

HERPESVIRUS
Virus de la Rinotraqueitis Infecciosa Bovina (IBR)
CUYES recién nacidos

Rinoneumonitis Equina (ER)


LECHONES de lactantes a varios días

HAMSTERS recién nacidos

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CULTIVO DE LOS VIRUS
1. ANIMALES EXPERIMENTALES
EJEMPLOS:

HERPESVIRUS
Virus de la Enfermedad de Aujeszky (VEA)
CONEJOS; CUYES; RATONES, CABRAS; CABALLOS; PERROS; Y MUCHOS
ANIMALES MAS LOS MAS SUSCEPTIBLES LOS GATOS

ORBIVIRUS.
Virus de la Lengua Azul
CORDEROS; RATONES Y HAMSTERS lactantes a varios días

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CULTIVO DE LOS VIRUS
1. ANIMALES EXPERIMENTALES
EJEMPLOS:

ORTHOMYXOVIRUS
Virus de la Influenza
PORCINA: RATONES Y HURONES: neumonía
EQUINA: RATONES Y HURONES: neumonía
AVIARIA: POLLUELOS, PATOS: signos respiratorios y muerte

PAPOVAVIRUS
Virus del Papiloma oral del Conejo: CONEJOS
Virus del Papiloma de Shope: CONEJO COLA DE
ALGODÓN
Virus del Papiloma Bovino: BECERROS
Virus del Papiloma Genital Porcino: CERDOS

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CULTIVO DE LOS VIRUS

2. TECNICAS DE CULTIVO EN EMBRION


DE POLLO.

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CULTIVO DE LOS VIRUS
2. TECNICAS DE CULTIVO EN EMBRION DE POLLO.

CARACTERISTICAS DEL HUEVO FERTIL:

1. Raza o línea de Gallina de postura (huevo fértil)


a) Plymonth Rock
b) Rhode Island
c) New Hamshire
d) Wyandotte

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CULTIVO DE LOS VIRUS
2. TECNICAS DE CULTIVO EN EMBRION DE POLLO.

CARACTERISTICAS DEL HUEVO FERTIL:

Al
2. Huevo fértil golpear
a) Cascarón

delgado
¡NO¡ malformado
defectos, Resonancia (+) BUENOS
protuberancias, Resonancia (-) MALOS

áspero Curso Básico de Virología para Civiles


CULTIVO DE LOS VIRUS
2. TECNICAS DE CULTIVO EN EMBRION DE POLLO.

CARACTERISTICAS DEL HUEVO FERTIL:

2. Huevo fértil
HACIA ARRIBA
b) Tiempo de puestos A 13°C
HUMEDAD 40%

- Máximo 5 días
CAMARA DE
- Se almacenan AIRE

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CULTIVO DE LOS VIRUS
2. TECNICAS DE CULTIVO EN EMBRION DE POLLO.

CARACTERISTICAS DEL HUEVO FERTIL:


A LAS 3 HORAS DE FERTILIZADO EN EL
OVIDUCTO LA YEMA PRESENTA ENTRE 2
Y 4 CELULAS, EL DISCO DELGADO (GASTRULACION)
SE FORMAN DOS CAPAS:
EXTERNA=ECTODERMO HACIA ARRIBA
DE 16 A 20°C
INTERNA=ENDODERMO
SE INICIA LA
EL BLASTODERMO APARECE COMO UNA INCUBACION
MEMBRANA FORMADA POR SEGMENTACIONES VOLTEO DIARIO
SUCESIVAS
SE FORMA UNA AREA CENTRAL= “ZONA PELUCIDA”
Y BORDES GRUESOS= AREA OPACA”
DE AQUÍ A LA POSTURA= ES AQUÍ DONDE SE DETIENE EL PROCESO DE DIVISION

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CULTIVO DE LOS VIRUS
2. TECNICAS DE CULTIVO EN EMBRION DE POLLO.

CARACTERISTICAS DEL HUEVO FERTIL:

2. Huevo fértil
HACIA ARRIBA
C) Selección A 13°C
HUMEDAD 40%

- Tamaño: UNIFORME
CAMARA DE
- Forma: UNIFORME AIRE
- Peso: 56 a 65g

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CULTIVO DE LOS VIRUS
2. TECNICAS DE CULTIVO EN EMBRION DE POLLO.

CARACTERISTICAS DEL HUEVO FERTIL:

2. Huevo fértil
HACIA ARRIBA
d) Manejo A 13°C
HUMEDAD 40%

- Adecuado
CAMARA DE
- Con mucho cuidado AIRE
- Movimientos bruscos
la cámara de aire
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CULTIVO DE LOS VIRUS
2. TECNICAS DE CULTIVO EN EMBRION DE POLLO.

CONDICIONES DE INCUBACION DEL HUEVO FERTIL:


1. Colocación con la cámara de aire hacia arriba

2. Limpieza: solo mecánica, no Con trapos húmedos ni lavarlos

3. Temperatura: 37.7°C +/-1

4. Humedad relativa: 50 a 60°C

5. Voltea varias veces al día: de 2 a 8 veces en un ángulo de 45°

6. Ventilación:. Relación optima: O2 del 21% y CO2 del 0.5%


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Inoculación en huevo
embrionado
1 embrión 2 cavidad amniótica
3 Yema 4 Albúmina
5 cavidad alantoidea
6 cavidad corioalantoidea
5 Membrana corioalantoidea
6 cascarón
9 cámara de aire

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CULTIVO DE LOS VIRUS
RUTAS DE INOCULACION EN EMBRION DE POLLO

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CULTIVO DE LOS VIRUS
RUTAS DE INOCULACION EN EMBRION DE POLLO

1. CAVIDAD ALANTOIDEA
Edad del embrión: 9 a 11 días
Vol. 0.1 a 0.2 ml

VIRUS: Virus de la Enfermedad de Newcastle


Virus de la Bronquitis Infecciosa
Virus de Influenza
Virus de las Paperas
Virus de la Encefalitis Equina del Oeste
Virus de la Encefalitis Equina del Eeste
Virus de la Encefalitis Equina de Venezuela

EFECTO: Muerte embrionaria

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CULTIVO DE LOS VIRUS
RUTAS DE INOCULACION EN
EMBRION DE POLLO

2. CAVIDAD AMNIOTICA
Edad del embrión: 7 a 10 días
Vol. 0.1 a 0.2 ml

VIRUS: Virus de la Enfermedad de


Newcastle
Virus de la Bronquitis
Infecciosa
Virus de Influenza
Virus de las Paperas
Virus de la Encefalitis
Equina del Oeste
Virus de la Encefalitis
Equina del Este
Virus de la Encefalitis
Equina de Venezuela

EFECTO: Muerte embrionaria Curso Básico de Virología para Civiles


CULTIVO DE LOS VIRUS
RUTAS DE INOCULACION
EN EMBRION DE
POLLO
3. MEMBRANA
CORIOALANTOIDEA
Edad del embrión: 11
a 13 días
Vol. 0.1 a 0.5 ml

VIRUS: Virus de la
Enfermedad de
Aujeszky
Virus de la
Laringotraquetis
Infecciosa
Virus de la
Viruela aviaria
EFECTO: Pústulas en la
membrana

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CULTIVO DE LOS VIRUS
RUTAS DE
INOCULACION
EN EMBRION DE
POLLO

4. CAVIDAD O SACO
VITELINO
Edad del
embrión: 6 a 8
días
Vol. 0.1 a 1.0 ml

BACTERIA:
Chlamidias

Rickettsias
EFECTO: Muerte
embrionaria
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CULTIVO DE LOS VIRUS

3. TECNICAS DE CULTIVO CELULAR

El termino de “cultivo de tejidos” es hoy en día sinonimo


de “cultivo celular”.

Es el crecimiento y mantenimiento del tejido o células


vivas “in vitro”.

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Cultivo celular:
Tipos de cultivo celular
 Cultivo celular primario
 Cultivo celular secundario
 Cultivo células diploides
 Establecimiento de línea celular
 Origen del cultivo celular
 humanos
 animales
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Tipos de clasificación
del cultivo celular

Estacionario

Rotatorio

Suspensión

Perfunsión

Explante o cultivo de
órganos
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Monocapa de cultivo celular

Células epiteliales Células fibroblásticas


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CULTIVO DE LOS VIRUS
3. TECNICAS DE CULTIVO CELULAR

Los “Cultivos de organos” es el mantenimiento de piezas


de tejidos organizados (explantes traqueales
membrana sinovial) in vitro.

Esta técnica es muy útil para el aislamiento de


infecciones persistentes tales como el virus de la
Artritis-Encefalitis-Caprina (Retroviridae:
Género:Lentivirus): Co-cultivos de leucocitos o PMN
de la sangre o la leche con células de la membrana
sinovial.
O explantes traqueales como los Coronavirus
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CULTIVO DE LOS VIRUS
3. TECNICAS DE CULTIVO CELULAR

Los “Cultivos de tejidos” es el mantenimiento de piezas de


tejidos desorganizados embebidos en coagulos y
plasma in vitro.

A partir de estos cultivos, las células en forma individual


se pegaban en el fondo del cristal o plástico y
empezaban a desarrollarse hasta formar un
monoestrato celular.

Hoy en día es una técnica obsoleta.


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CULTIVO DE LOS VIRUS
3. TECNICAS DE CULTIVO
CELULAR
Los “Cultivos de células” es el
mantenimiento de células in vitro.

Es un tejido disociado en una suspensión


de células en forma individual, por un
tratamiento enzimático como lo es la
TRIPSINA
Las células se lavan con medio de cultivo
celular; se cuentan y se mantienen en
ese medio para células.
Se colocan en botellas de vidrio o de
plástico y estas se pegaban en el
fondo y empiezan a desarrollarse
hasta formar un monoestrato celular.

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CULTIVO DE LOS VIRUS
Medio de cultivo celular para
crecimiento:
Nutrientes requeridos para el crecimiento celular.

1. Es una solución salina isotónica

2. Glucosa

3. Vitaminas, coenzimas; aminoácidos

4. Sol. “bufferada” a pH 7.2 a 7.4 o con


bicarbonato, ambos buffer a base de fosfatos
pueden sustituirse con HEPES: ácido N-2-
hidroxietilpiperazina-N´-2-etanosulfonico ó TES
ácido N-tris-(hidroximetil)metil-2-
aminometanosulfonico; proven mejor estabilidad
del pH y reducen lo requerimentos de CO2.

5. Además contiene antibioticos para inhibir el


crecimiento bacteriano

6. Suero fetal bovino máximo 10 %.

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CULTIVO DE LOS VIRUS
Medio de cultivo celular para mantenimiento:

El medio contiene los nutrientes requeridos para el


crecimiento celular.

1. Es una solución salina isotónica

2. Glucosa

3. Vitaminas, coenzimas; aminoacidos

4. Sol. tamponada o “bufferada” a pH 7.2 a 7.4 o un


sistema tamponado con bicarbonato, ambos buffer a
base de fosfatos pueden sustituirse con HEPES: ácido N-
2-hidroxietilpiperazina-N´-2-etanosulfonico ó TES ácido
N-tris-(hidroximetil)metil-2-aminometanosulfonico;
prooven mejor estabilidad del pH y reducen lo
requerimentos de CO2.

5. Además contiene antibioticos para inhibir el crecimiento


bacteriano

6. Suero fetal bovino al 2 al 5 %.

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CULTIVO DE LOS VIRUS
Cultivo celular primario:
 Tejidos de fetos o de jóvenes se
colectan asépticamente.

A) Riñón de mono verde


B) Riñón de embrión humano
C) Tejido amniótico
D) Embriones de ratón, pollo

2. Células epiteliales y fibroblastos

3. Se parten en pequeñas piezas de cerca de


2 mm3.

4. Se incuba en presencia de tripsina durante


30 minutos.
5. Se produce una suspensión de células.

6. Se centrifuga a baja velocidad para


remover el exceso de tripsina.
7. Se suspenden en medio de cultivo celular,
8. Se incuban a 37°C en tubos con tapan

9. Durante varios días de forma un capa


continua ó confluente
10. Solo se mantienen durante 5 a 10
generaciones
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CULTIVO DE LOS VIRUS
Cultivo celular primario:
4. Tejidos de fetos o de jóvenes se
colectan asépticamente.
A) Riñón de mono verde
B) Riñón de embrión humano
C) Tejido amniótico
D) Embriones de ratón, pollo
2. Células epiteliales y fibroblastos
3. Se parten en pequeñas piezas de cerca de
2 mm3.
4. Se incuba en presencia de tripsina durante
30 minutos.
5. Se produce una suspensión de células.
6. Se centrifuga a baja velocidad para
remover el exceso de tripsina.
7. Se suspenden en medio de cultivo celular,
8. Se incuban a 37°C en tubos con tapan de
vaquelita o de plástico.
9. Durante varios días de forma un capa
continua ó confluente
10. Solo se mantienen durante 5 a 10
generaciones
11. Se utilizan mucho para la elaboración de
vacunas

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CULTIVO DE LOS VIRUS
Cultivo de células diploides:

1. Células de los mismos tejidos de


fetos o de jóvenes.

A) Riñón de embrión humano


B) Tejido amniótico
C) Embriones de ratón, pollo

2. Células de tipo fibroblástico y


epiteliales

3. Solo se mantienen durante 100


generaciones

4. Se utilizan mucho para la


elaboración de vacunas o para
estudios experimentales

5. Se almacenan en Nitrógeno
liquido a -70 a -196°C
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CULTIVO DE LOS VIRUS
Cultivo de líneas celulares
continuas:

1. Células inmortales originadas de


células cancerigenas o bien
transformadas
A) Riñón de embrión humano
B) Tejido amniótico
C) Embriones de ratón, pollo

2. Son células epiteliales de origen tanto


del ectodermo como del
endodermo indiferenciables

3. Son células fibroblásticas de origen


mesodérmico indiferenciables

4. Se almacenan en Nitrógeno liquido a


-70 a -196°C

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Cultivo de líneas celulares continuas

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Efecto citopático
Células Infección con
poliovirus RhMK cells
normales

HEp-2 cells

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Cultivo de líneas celulares continuas

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Hemadsoción:

Eritrocitos de
cuye adsorbidos
en células de
riñón infectadas
con virus de las
paperas

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TIPOS DE CULTIVOS CELULARES
Líneas celulares continuas:
Cell Culture Collection Committe, CCCC

LINEA CELULAR ESPECIE ORIGEN TEJIDO ORIGEN MORFOLOGIA


HeLa HUMANA CARCINOMA CERVIX EPITELIAL
DETROIT-6 HUMANA MEDULA OSEA ESTERNAL EPITELIAL
L-132 HUMANA PULMON EMBRIONARIO EPITELIAL
KB HUMANA CARCINOMA ORAL EPITELIAL
AV3 HUMANA AMNION EPITELIAL
Hep-2 HUMANA CARCINOMA LARINGE EPITELIAL
CHO HAMSTER CHINO PULMON, OVARIO FIBROBLASTO
B14-FAF-G3 HAMSTER CHINO RIÑON FIBROBLASTO
NCTC, Clona 2555 RATON TEJIDO CONECTIVO FIBROBLASTO
CCRF-S-180II RATON SARCOMA 180 FIBROBLASTO
BHK-21 HAMSTER RIÑON FIBROBLASTO

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Cuerpos de inclusión

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Cuerpos de inclusión

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Cultivo de líneas celulares continuas
EFECTO CITOPATICO POR INFECCION VIRAL: ECP

FECCIÓN POR UN ENTEROVIRUS EN UNA LINEA CONTINUA DE CÉLULAS


MBRIONARIAS DE PULMÓN HUMANO (HEL): Áreas de células redondeada
secas” entre islotes de células normales (ver flecha)
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Cultivo de líneas celulares continuas
EFECTO CITOPATICO POR INFECCION VIRAL: ECP

INFECCION POR HERPES SIMPLEX TIPO 2 EN CELULAS RENALES:


Células en contraste de fase en donde las células afectadas (ver
flecha) están agrupadas y refráctiles
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Cultivo celular de líneas celulares
continuas
EFECTO CITOPATICO POR INFECCION VIRAL: ECP

ELULAS INFECTADAS CON EL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO. En la líne


continua de células epiteliales humanas
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Cultivo de líneas celulares continuas
EFECTO CITOPATICO POR INFECCION VIRAL: ECP

CELULAS INFECTADAS CON EL VIRUS SICITIAL RESPIRATORIO.


A MAYOR AUMENTO). En la línea continua de células epiteliales humana
Se observan células gigantes multinucleadas
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Cultivo de líneas celulares continuas
EFECTO CITOPATICO POR INFECCION VIRAL: ECP

INFECCION CON EL VIRUS HVI-1 EN LA LINEA DE LINFOCITOS HUMANOS


Células gigantes multinucleadas, además de espacios sin células.
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Efecto de los virus sobre los cultivos
celulares
VIRUS EFECTO
EFECTO CITOPATICO

Picornavirus Células redondeadas, muerte y destrucción


de la monocapa celular
Herpesvirus Englobamiento celular, mas con el tipo 2
que con el tipo 1
Adenovirus Agrupación de células redondeadas
parecidos a racimos de uvas
Paramyxovirus Células gigantes multinucledas SINCITIOS
(fusión celular)
NO EFECTO CITOPATICO

Orthomyxovirus Células afectadas capaces de adsorber a


los eritrocitos HEMOADSORCION
Togavirus Interferencia viral, previene ECP de otros
virus
Rhinovirus Interferencia viral, previene ECP de otros
virus tales como ECHOvirus

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Usos del cultivo celular

Diagnóstico

Produ cción de An tí gen os

Produ cción de biol ógi cos

Produ cción de anti cuer pos m onoc lon ale s

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Anticuerpos monoclonales

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