Proiect culturi "in vitro

"
Efectul stresului osmotic asupra creşterii şi acumulării alcaloizilor

Pruteanu Vasilica Boghiu Corina Anul III – Biologie

unde se operează cu seminţe sau porţiuni mari de plantă. precum si regenerarea plantelor intregi. Spre deosebire de multiplicarea tradiţională. substantele antibiotice. În agricultură. Culturile "in vitro" constituie modele experimentale in cercetarile moderne de biologie vegetala. notiune adoptata din limba latina. explante care în condiţii normale de cultură nu ar reuşi să crească opunând rezistenţă agenţilor patogeni şi sintetizându-şi singure substanţele nutritive necesare. industria uşoară. etc. industria alimentară. pentru conservarea germoplasmei horticole sau pentru obţinerea de metaboliţi secundari (produsi intermediari sau finali ai metabolismului). pentru ameliorarea speciilor cultivate.Efectul stresului osmotic asupra creşterii şi acumulării alcaloizilor I. a aparut ca urmare a initierii unor tehnici de cultivare a celulelor si tesuturilor pe medii nutritive artificial. cu sensul de viata in recipient de sticla. Studii privind reactia si evolutia explantelor presupun abordarea multidisciplinara a proceselor de crestere si dezvoltare a plantelor. Viata "in vitro". alcaloizii. pe un mediu nutritiv artificial. Datorită spectrului larg de aplicabilitate. Inca de la debutul cercetarilor din domeniul culturilor "in vitro" s-a urmarit posibilitatea utilizarii lor pentru multiplicarea unor soiuri sau chiar a unor indivizi. cu calitati productive de exceptie. multiplicarea lor. silvicola. aceasta presupune mentinerea in viata a celulelor si tesuturilor in afara organismului vegetal. farmaceutica. de ordinul milimetrilor sau chiar microscopice. glicozidele. în general şi în horticultură în special. ligninele. Introducere : Culturile de celule. culturile de ţesuturi şi celule sunt folosite pentru multiplicarea unor specii. prin stoparea sau declansarea fazelor de diferentiere. culturile "in vitro" sunt utilizate în prezent în industria agricola. la multiplicarea in vitro se folosesc explante mici. taninurile. prin interventia la nivelul informatiei genetice. oferind posibilitatea monitorizarii acestora. 2 . soiuri sau clone valoroase. In categoria acestor metaboliti secundari se incadreaza: pigmentii vegetali. insecticidele vegetale. tesuturi si organe vegetale reprezinta un ansamblu de tehnici care presupun cultivarea in conditii aseptice a oricarei parti dintr-o planta.

- Obtinerea de linii mutagene inalt producatoare. pentru stabilirea concentratiei produsului natural. stabile. Ameliorarea producerii de metaboliti secundari. Utilizarea eficientă a culturilor celulare în scopul producerii de compuşi secundari. inalt producatoare pentru donari unicelulare. Deoarece sinteza lor nu constituie o parte indispensabilă a programului expresiei genice şi dezvoltării. În plus o serie de reglementări elaborate în multe ţări limitează utilizarea produselor sintetice în special ca aditivi alimentari sau medicamente. industrială. implică satisfacerea următoarelor condiţii: 3 . De regulă speciile vegetale producătoare de astfel de compuşi secundari cresc numai în anumite zone climatice. iar sinteza acestor metaboliţi cu structură complexă pe cale artificială este neeconomică. presupune parcurgerea urmatoarelor etape: - Testarea si selectia unor plante initiale. ca rezultat al variabilitatii somatoclonale sau al unor tratamente mutagene. de la plantele donatoare selectate. pentru producerea comercială a metabitilor secundari. aceasta poate fi modelată atât prin modificări ale materialului genetic cât şi prin modificări ale mediului sau prin utilizarea unor substanţe cu rol de semnal pentru declanşarea căii biosintetice respective. la nivelul liniilor celulare in suspensie. numeroase cercetări au fost dedicate producerii de compuşi utili prin culturi de celule si ţesuturi vegetale. caracterizate prin capacitate crescuta de acumulare a compusului natural urmarit. dificultăţi care conduc la fluctuaţii considerabile ale materiei prime şi implicit ale preţului de cost.Efectul stresului osmotic asupra creşterii şi acumulării alcaloizilor În ultimii ani. fizici si chimici. astfel că în prezent studiile bazate pe culturi de celule şi ţesuturi se desfăşoară atât la nivel fundamental cât şi sub forma cercetărilor aplicative care utilizează culturi la scară largă. - Stabilirea culturilor de calus. prin culturi de celule. - Analize chimice. in culturile de callus. Ca urmare s-au înregistrat progrese tehnologice remarcabile. Analize chimice. in bioreactor. prin optimizarea parametrilor de cultura. O strategie menita sa contribuie la obtinerea in cantitati crescute a metabolitilor secundari. Selectia de linii celulare.

In culturile de celule vegetale. cresterea şi producţia de alcaloid. la speciile de importanta agricola sau horticola. asadar informatii cu privire la natura generala a raspunsului de stres. ce pot interveni la modificarea procesului de formare a metabolitului secundar dorit. deoarece este bine documentat. in scopul de a induce toleranta la seceta. insa. Toate acestea au fost realizate pe un alt aspect de stres osmotic. majoritatea cercetatorilor s-au concentrat pe impunerea de stres osmotic. suplimentate cu o medie de la 0.stabil pentru multi ani. in special. cel puţin în plante întregi. preţul producţiei. odata cu utilizarea condiiilor artificiale de cultura a celulelor si a tesuturilor vegetale.5 M manitol. ca având efecte ambiţioase asupra metabolismului primar. metaboliţii să se acumuleze în celule fără a fi catabolizaţi rapid sau. 4 . Stresul osmotic a fost ales pentru această anchetă. la schimbarile de mediu. si care subliniaza.Efectul stresului osmotic asupra creşterii şi acumulării alcaloizilor rata creşterii celulare şi a biosintezei trebuie să fie suficient de ridicată pentru a se obţine o cantitate semnificativă de produs final într-o perioadă de timp. să fie suficient de scăzut pentru a fi profitabil Cu toate acestea.1 Creşterea iniţială şi acumularea de produs Într-un studiu preliminar. au fost urmate cu celule cultivate în manitol. cum ar fi efectele asupra diferenţierii calusului şi acidificarea de celule. 1. asupra celulelor vegetale cultivate.05 până la 1. Studii privind efectele stresului asupra cresterii celulelor vegetale. preferabil. precursorii şi extracţia chimică. sensibilitatea metabolitului secundar produs. este posibil sa apara si unele tensiuni. incluzând costul mediului de cultură. culturile trebuie să fie stabile genetic pentru a produce cantităţi ridicate de metaboliţi secundari în mod constant. să fie eliberaţi în mediu lichid. poate furniza. Printre aceste tensiuni care pot interveni in modificarea procesului de formare a metabolitului secundar se numara si stresul osmotic.

 HPLC – metoda analitica utilizata in scopul separarii. comparativ cu celulele de control. celula a crescut mai repede decât celulele controlate(martore). de obicei. Alcaloizi au fost masurati prin HPLC după extracţia metanolului. comparabile cu greutatea uscată. Celule de criză. mult timp după utilizarea de amidon şi extinderea celulelor a avut loc în celulele neaccentuat. insa totalul maxim acumulat este mic. cu 0.6 M manitol a fost ales ca nivel standard pentru investigaţiile suplimentare. Cu toate acestea.6 M . identificarii si dozarii substantelor organice si anorganice aflate in solutie. Rezultatele din aceasta investigatie initiala.25% în greutate uscată in 25 de zile. au indicat trei categorii de raspuns de stres. Viabilitatea celulelor a fost crescut în celule de criză.2M). de la 1. greutate uscata. În ultimul grup de celule cultivate. Din aceste rezultate.celule încă pe deplin viabile la recolta finală de 41 de zile. cu o creştere de la 0. Nivelurile de serpentina au fost similare la controale. care au scăzut la 25%. ajungând la 0. pe un mediu de producţie.0 la 1. în timp ce inhibarea nu afectează nivelurile de alcaloizi. au rămas mici şi cu un continut dens de granule de amidon. nivel de stres de 0. Al doilea grup de celule. care dau o dată ulterioară. ceea ce conduce la o uscare precoce.6 M manitol. viabilitate de 25 de zile.5M manitol. şi la un declin mai rapid în viabilitatea. serpentina a atins o rata de producţie similară cu celulele controlate(martore). deoarece acest degres de stres pare a fi utilizarea de carbohidraţi. menţinut. deşi de vârf. de asemenea. Cu o pondere de 0. având în vedere perioada scurtă de creştere a celulelor de stres.3 la 0. 5 .Efectul stresului osmotic asupra creşterii şi acumulării alcaloizilor alcaloidul produce linii celulare de Catharanthus roseus ce a fost folosit. au arătat o rata de creştere mai lenta decat celulele controlate(martore). La niveluri scăzute de manitol (de la 0.05 la 0.1% . atât creşterea economică cat si nivelul de productie au fost grav inhibate de gradul de stres osmotic impus.

este faptul că nivelul total de aminoacizi este similar atunci când. Pe culturi de celule rosii. atât în rata de diviziune cat si in populaţia totala de celule. Celulele de control(martore) au avut un timp de dublare de 1. mai degrabă decât o bază de substanţa uscată. detaliat. Acest lucru este în acord cu schimbările morfologice aparente. a fi crescut de cinci ori atunci când sunt exprimate per celulă. fiind non-inhibitor de enzime. în comparaţie cu molecula /g greutate uscată. în legătură cu greutăţile maxime similare uscate. a gasit prolina si alti aminoacizi ce au crescut ca răspuns la o creştere a nivelului extern de NaCl.Efectul stresului osmotic asupra creşterii şi acumulării alcaloizilor 1. Handa et al (1983). Un astfel de exemplu v-a fi discutat in continuare. este clar că o mai bună reflectie de evenimente celulare este data atunci când rezultatele sunt exprimate pe baza numărului de celule.3 x 106 celule / ml pentru celulele tratate. 1. a aratat diviziunii celulare care trebuiesc inhibate în 0. Prolina a fost frecvent raportata ca o soluţie incompatibila. dar poate fi dovedit. această diferenţă de trei ori în celula.3 Aminoacizi liberi Nivelurile intracelulare de prolina au fost măsurate cu ajutorul metodei de Bates et al (1973).2 x 106 celule / ml.15 de zile şi 1. chiar si la concentraţii mari. numărul finală indică o mai mică sau o mai mare populaţie de celule stresate. comparativ cu 5. 6 .6M manitol. preferential acumulata. celule stresate. Atunci când se consideră. cu analiza totala de aminoacizi pe eşantionul selectat. atingând la final o concentraţie de 4.2 Diviziunea celulara Determinarea numărului de celule.42 zile. Ca o consecinţă a numărului de celule diferite in final şi greutatea per celula.

1982). Ei sunt produsi finali ai metabolismului azotat. cu ajmalicine.greutate uscată de control şi.6 mannitol/celula prolina a crescut cu timpul. se pare ca serpentina este un alcaloid major in ambele tipuri de celule. Cu toate acestea. o planta contine mai multi alcaloizi. acest lucru ofera un nivel de amidon de 58 şi 727µg/10 6 /celula de control şi.Efectul stresului osmotic asupra creşterii şi acumulării alcaloizilor În Catharanthus roseus. Analizand in continuare alcaloidul. stresul osmotic a crescut nivelul de aminoacizi liberi de la 0. o creştere de cinci ori şi este posibil ca un rol osmoreglator. folosind control şi 0. dar cu stresul osmotic s-a cauzat o scadere cu 25% a nivelului de serina si mici ajustari severe in nivelurile ridicate de alti aminoacizi. celulele tratate. un rezultat în concordanţă cu datele anterioare. o analiză mai atentă a probelor vechi de 20 de zile au arătat ca prolină să nu este predominanta de aminoacizi.86 moles /106 celule. a fost atat serina . respectiv. continutul depinde de varsta plantei. celulele stresate. 1. respectiv. Rezultatele au aratat acest lucru.55 la 2. de clima si de anotimp. Luând în considerare numărul de celule mai mic pentru celulele stresate . 1. mai pot fi atribuit la aceste molecule.4 Amidonul de acumulare Nivelurile de amidon au fost masurate cu ajutorul unui test aminoglucosid (Kerr et al. In general. Cu toate acestea. de o importanţă mai redusă. In ansamblu.5 Producerea de alcaloizi Alcaloizii sunt substante organice azotate complexe. ajungand la 23 şi 29 µmol / g . în oricare tip de celule. de regiunea in care creste. în comparaţie pe o scară de mai mult 7 . Această creştere măsoară un nivel de amidon ce este de acord cu modificările constatate morfologic. Aminoacidul major. cu un conţinut de amidon maxim de patru ori mai mare în celulele de criză.

Nivelurile de Ajmalicine au fost. ţinând seama de viabilitatea extinsa a celulelor de criză. de asemenea.Efectul stresului osmotic asupra creşterii şi acumulării alcaloizilor timp. o crestere de 10 ori. afectate în celule tratate cu manitol.5 mg/10 6 celula martor şi celula stresata. deşi mai puţin datorita serpentinei.43 mg/10 6 celule / zi pentru celula stresata. fiind 0.13 mg/106 celule / zi pentru celule martor şi de 1. de asemenea. Rata de producţie. Concluzii: 8 . difera. celulele tratate cu mannitol au crescut nivelurile maxime de serpentina Atunci când s-a reexprimat pe baza de per/celula . aceasta ofera un nivel final de 1.4 şi 21. II.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful